JP4896301B2

JP4896301B2 - Scanning optical microscope

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Publication number: JP4896301B2
Application number: JP2001083703A
Authority: JP
Inventors: 満雄原田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2021-03-22
Also published as: JP2002287034A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の波長の励起光を多重染色蛍光標本に照射して当該標本を露光し、この多重染色蛍光標本から発せられた蛍光を検出して多重染色観察を行なう走査型光学顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば共焦点レーザ走査型光学顕微鏡を用いて多重染色蛍光標本を観察する場合には、標本を多重染色した複数の試薬に対応する複数波長の蛍光が発せられるので、これら波長の蛍光をそれぞれ検出するために複数の光検出器が備えられている。
【０００３】
ところが、励起光の波長に対する蛍光の発光波長帯域が広い試薬に対しては、各蛍光波長毎に別れている複数の光検出器によって同時にその試薬により発せられる蛍光が検出されてしまい、多重染色してその標本を観察する意味をなさなくなってしまう。
【０００４】
このようなことを回避するために、波長帯域が隣接する各光検出器により上記蛍光の発光波長帯域が広い試薬の蛍光を検出しないように、一画面の標本に対する画像取得毎に励起波長を切り換え、当該励起波長に応じた波長の蛍光を発せさせ、画像を取得するシーケンシャルスキャン方法が行われている。この方法において、各光検出器は、その蛍光波長に応じた特性のチャンネルに割当てられており、励起波長の種類と同じ数の光検出器が用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記レーザ走査型光学顕微鏡のようにそれぞれ異なる励起波長の励起光を順次スキャンし、それぞれの蛍光波長に応じたチャンネルに用意された各光検出器によって蛍光を検出して多重染色蛍光標本の画像を取得する方法では、励起波長の種類に応じた数だけ光検出器が必要であり、そのうえに各チャンネルごとに最適な共焦点開口、分光フィルタ、励起光カットフィルタなどが必要となり、顕微鏡が大型化すると共に高価になっていた。
【０００６】
通常、生物標本の蛍光観察においては、励起光による標本に対する光毒性の影響を少なくするために励起光の露光を最小限にすることが要求されている。ところが、一画面の画像を取得するのに励起露光を励起波長の種類だけ複数回行なうため、これら励起露光を行なうだけでも時間がかかっている。
【０００７】
そこで本発明は、励起波長の種類よりも少ない数の光検出器を用いて小型化、低価格化を図り、かつ短時間での画像取得ができる走査型光学顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載による本発明は、複数の波長の励起光を多重染色蛍光標本に照射して当該標本の多重染色観察を行なう走査型光学顕微鏡において、前記励起光の複数の波長のうち前記多重染色蛍光標本に照射する励起波長を選択する励起波長選択手段と、前記選択された励起波長に対応して前記多重染色蛍光標本から発せられた蛍光を受光してその蛍光強度を検出する光検出器であって、その数が前記励起波長選択手段で選択される前記励起波長の総数よりも少ない光検出器と、前記光検出器の少なくとも一つの前に配置され、前記励起波長選択手段により選択される励起波長の全てを遮断し、かつ前記多重染色蛍光標本から発せられる前記蛍光の波長を透過するバリアフィルタと、前記励起波長選択手段により前記光検出器の数と同じ数の前記励起波長を選択して第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、次に、前記励起波長選択手段により異なる励起波長を選択して第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した標本画像を取得し、取得された前記励起波長ごとの前記各標本画像を合成して前記多重染色蛍光標本の画像を取得する画像形成手段とを具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡である。
【０００９】
請求項２記載による本発明は、請求項１記載の走査型光学顕微鏡において、前記選択される励起波長の総数が３以上でかつ前記光検出器の数が２つであり、前記複数の励起波長に対応して発せられる蛍光を、夫々の励起波長に対応した蛍光に分岐して前記各光検出器に導く分光手段を更に備え、前記画像形成手段は、前記励起波長選択手段により２つの前記励起波長を選択して前記第１の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を前記各光検出器を介して取得し、次に、前回と異なる励起波長を選択して前記第２の標本走査を行なうことにより、前記選択された各励起波長に対応した前記標本画像を取得することを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（１）以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１４】
図１は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。複数の試薬により染色された多重染色蛍光標本１の励起に必要なそれぞれ異なる複数の波長のレーザ光（励起光）を出力する各レーザ光源２、３、４が備えられている。これらレーザ光源２、３、４は、３重染色した多重染色蛍光標本１を観察するためのものである。これらレーザ光源２、３、４は、それぞれ励起波長λ_１、λ_２、λ_３の各レーザ光を出力するもので、これら励起波長λ_１、λ_２、λ_３の長さはλ_１＜λ_２＜λ_３の関係となっており、これら励起波長λ_１、λ_２、λ_３の中心波長は具体的にλ_１は４８８ｎｍ、λ_２は５４３ｎｍ、λ_３は６３３ｎｍとなっている。
【００１５】
これらレーザ光源２、３、４の出力光路上には、それぞれ各シャッタ５、６、７を介して各ダイクロイックミラー８、９とミラー１０が配置されている。このうち各シャッタ５、６、７は、シャッタ制御装置１１により１画面取得毎に順次開閉制御されて各励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光を順次切り替えて顕微鏡本体１２に導入させるものとなっている。
【００１６】
各ダイクロイックミラー８、９とミラー１０は、上記の如く各レーザ光源２、３、４の出力光路上に配置され、かつミラー１０の反射光路上に各ダイクロイックミラー８、９が配置されている。
【００１７】
このうちミラー１０は励起波長λ_３のレーザ光を反射する特性を有し、ダイクロイックミラー９は励起波長λ_３のレーザ光を透過しかつ励起波長λ_２のレーザ光を励起波長λ_３のレーザ光の透過方向と同一方向に反射する特性を有し、ダイクロイックミラー８は励起波長λ_３及びλ_２のレーザ光を反射しかつ励起波長λ_１のレーザ光を励起波長λ_３及びλ_２のレーザ光の反射方向と同一方向に透過する特性を有している。
【００１８】
顕微鏡本体１２内には、当該顕微鏡本体１２内に導入されるレーザ光の光路上にダイクロイックミラー１３が配置されている。このダイクロイックミラー１３は、当該顕微鏡本体１２内に導入される励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光を反射し、かつ多重染色蛍光標本１から発した蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を透過する特性を有している。
【００１９】
このダイクロイックミラー１３の反射光路上には、互いに直交する２つの偏向素子１４、１５が配置されている。これら偏向素子１４、１５は、例えばガルバノミラーが用いられ、励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光をそれぞれ多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射して当該標本１を励起するものである。
【００２０】
多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過するものとなる。
【００２１】
このダイクロイックミラー１３の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ１７が配置されている。このバリアフィルタ１７は、励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を透過する波長特性を有している。図２はかかるバリアフィルタ１７の波長特性図である。この波長特性図は、縦軸に分光透過率Ｔ、横軸に波長λを示している。蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の中心波長は、それぞれ具体的に５２０ｎｍ、５９０ｎｍ、６６０ｎｍである。このバリアフィルタ１７の波長特性は、各励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光に対して透過率を０．０１％以下に設定し、検出すべき蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光に対しては透過率８０％以上の製造できうる最大限の透過率に設定されている。このバリアフィルタ１７は、１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を組み（重ね）合わせて形成してもよい。
【００２２】
光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光をそれぞれ受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力するもので、例えば１つのフォトマルが用いられている。
【００２３】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ_１、λ_２、λ_３ごとの２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００２４】
この画像形成装置１９は、取得した多重染色蛍光標本１の画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりするものとなっている。
【００２５】
なお、この画像形成装置１９は、コンピュータを備え、画像処理等を実行するプログラムやシャッタ制御装置１１に指令を発するためのプログラム、各偏向素子１４、１５を駆動するためのプログラムを記憶し、これらプログラムを実行して多重染色蛍光標本１の画像を取得する一連の動作制御を行なう機能を有している。
【００２６】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００２７】
画像形成装置１９は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７を順次切り替えて開閉する指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査照射させる指令を発する。
【００２８】
先ず、シャッタ５が開放され、他の各シャッタ６、７が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ_１のレーザ光は、シャッタ５からダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、さらに当該顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起される。
【００２９】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、さらに共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ１７に入射する。
【００３０】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ_１のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００３１】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ_１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００３２】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_１の２次元画像を形成する。
【００３３】
次に、シャッタ６が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽される。レーザ光源３から出力された励起波長λ_２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射され、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、さらに当該顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起される。
【００３４】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_２’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、さらに共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ１７に入射する。
【００３５】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ_２のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_２’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_２’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００３６】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ_２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００３７】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_２の２次元画像を形成する。
【００３８】
次に、シャッタ７が開放され、他の各シャッタ５、６が遮蔽される。レーザ光源３から出力された励起波長λ_３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を通過してダイクロイックミラー８で反射され、顕微鏡本体１２内に導入され、ダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射され、多重染色蛍光標本１を励起する。
【００３９】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_３’の蛍光は、各偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過し、共焦点開口部１６を通過してバリアフィルタ１７に入射する。
【００４０】
このバリアフィルタ１７は、上記図２に示す波長特性図に示すように励起波長λ_３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発した蛍光波長λ_３’の蛍光を透過する波長特性を有しているので、多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ_３’の蛍光は、バリアフィルタ１７を透過し、光検出器１８に入射する。
【００４１】
この光検出器１８は、バリアフィルタ１７を透過した蛍光波長λ_３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００４２】
画像形成装置１９は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_３の２次元画像を形成する。
【００４３】
そして、画像形成装置１９は、各励起波長λ_１、λ_２、λ_３の３枚の２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【００４４】
このように上記第１の実施の形態においては、励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光を遮断し、かつ多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を透過する特性を有する１つのバリアフィルタ１７を用い、このバリアフィルタ１７を透過した蛍光を１つの光検出器１８により検出し、この光検出器１８から出力される蛍光強度信号に基づいて励起波長λ_１、λ_２、λ_３ごとの画像を形成し、これら画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、３つの励起波長λ_１、λ_２、λ_３の種類よりも少ない１つの光検出器１８を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して３重染色観察をすることができ、そのうえ顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができる。
【００４５】
又、励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光を順次多重染色蛍光標本１に照射して励起し、このとき発せられた各蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を順次検出してその画像を形成し、これら画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するので、短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【００４６】
なお、当該共焦点レーザ走査型光学顕微鏡では、多重染色蛍光標本１をこの標本１の厚さ方向に一定間隔で送りながら画像を取得して、多重染色蛍光標本１の３次元画像を構築したり、３画面像取得を連続又は間欠取得して時間経過と共に観察、解析を行なうこともできる。
【００４７】
（２）次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００４８】
図３は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。この共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の上記第１の実施の形態と相違するところは、光検出器３０を設けて２つの光検出器１８、３０を用いている点である。
【００４９】
顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３の透過光路上には、分光ダイクロイックミラー３１が配置されている。この分光ダイクロイックミラー３１は、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ_１’＜λｓ＜λ_３’でかつλｓ＜λ_２’の関係である波長λｓ、例えば波長λｓ＝５６０ｎｍを境として分光する光分光手段としての波長特性を有するもので、図４及び図５に示すように波長λｓよりも短い波長の光を反射し、かつ波長λｓよりも長い波長の光を透過するものとなっている。
【００５０】
この分光ダイクロイックミラー３１の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ３２が配置されている。このバリアフィルタ３２は、上記境の波長λｓよりも長い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図４に示すように少なくとも不要な励起波長λ_１、λ_２、λ_３を遮断し、かつ蛍光波長λ_２’、λ_３’の蛍光を透過するものとなっている。すなわち、バリアフィルタ３２は、各励起波長λ_１、λ_２、λ_３の近傍において透過率０．０１％以下に設定され、かつ励起波長λ_１−λ_２の間では特に規定せず、さらに蛍光波長λ_２’、λ_３’の帯域の透過率をできるだけ高く設定されている。
【００５１】
一方、分光ダイクロイックミラー３１の反射光路上には、共焦点開口３３を介してバリアフィルタ３４が配置されている。このバリアフィルタ３４は、上記境の波長λｓよりも短い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図５に示すように少なくとも不要な励起波長λ_１、λ_３を遮断し、かつ蛍光波長λ_１’の蛍光を透過するものとなっている。すなわち、バリアフィルタ３４は、各励起波長λ_１、λ_３の近傍において透過率０．０１％以下に設定され、かつ励起波長λ_１以下は特に規定せず、さらに蛍光波長λ_１’の帯域の透過率をできるだけ高く設定されている。
【００５２】
なお、各バリアフィルタ３２、３４は、それぞれ１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を組み（重ね）合わせて形成してもよい。
【００５３】
光検出器３０は、バリアフィルタ３４を透過した蛍光波長λ_１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力するもので、例えば１つのフォトマルが用いられている。
【００５４】
画像形成装置３５は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ_１、λ_２、λ_３ごとの２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００５５】
この画像形成装置３５は、シャッタ制御装置１１に対して、先ずは２つのシャッタ５と７とを開放して各励起波長λ_１、λ_３により多重染色蛍光標本１を励起（１回目励起露光）し、次にシャッタ６を開放して励起波長λ_２により多重染色蛍光標本１を励起（２回目励起露光）させる機能を有している。
【００５６】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００５７】
画像形成装置１９は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７を開放する組み合わせを選択的に順次切り替える指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射させる指令を発する。
【００５８】
先ず、シャッタ５と７とが開放され、シャッタ６が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ_１のレーザ光は、シャッタ５からダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４から出力された励起波長λ_３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を透過してダイクロイックミラー８で反射され、顕微鏡本体１２内に導入される。
【００５９】
これら励起波長λ_１、λ_３の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ_１、λ_３の各レーザ光により励起される。
【００６０】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_１’、λ_３’の各蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００６１】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ_１’、λ_３’の各蛍光が入射すると、λ_１’＜λｓ＜λ_３’の関係から上記図４及び図５に示すように境とする波長λｓよりも長い波長すなわち蛍光波長λ_３’の蛍光を透過し、かつ波長λｓよりも短い波長すなわち蛍光波長λ_１’の蛍光を反射する。
【００６２】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ_３’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ３２を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ３２を透過した蛍光波長λ_３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６３】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射された蛍光波長λ_１’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ３４を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ３４を透過した蛍光波長λ_１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６４】
画像形成装置３５は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ_１、λ_３ごとの２次元画像を形成する。
【００６５】
次に、シャッタ６が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽されている。レーザ光源３から出力された励起波長λ_２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射された後、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、さらに顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射し、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１の全面に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ_２のレーザ光により励起される。
【００６６】
この多重染色蛍光標本１から発せられた蛍光波長λ_２’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００６７】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ_２’の蛍光が入射すると、λｓ＜λ_２’の関係から上記図４及び図５に示すように境とする波長λｓよりも長い波長すなわち蛍光波長λ_２’の蛍光を透過する。
【００６８】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ_２’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ３２を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ３２を透過した蛍光波長λ_２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００６９】
画像形成装置３５は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_２の２次元画像を形成する。
【００７０】
そして、画像形成装置３５は、各励起波長λ_１、λ_３の２次元画像と励起波長λ_２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【００７１】
このように上記第２の実施の形態においては、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ_１’＜λｓ＜λ_３’でかつλｓ＜λ_２’の関係である波長λｓを境として分光する分光ダイクロイックミラー３１を設け、先ずは多重染色蛍光標本１を各励起波長λ_１、λ_３のレーザ光により励起してその２次元画像を形成し、次に多重染色蛍光標本１を励起波長λ_２のレーザ光により励起してその２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、上記第１の実施の形態と同様に、３つの励起波長λ_１、λ_２、λ_３の種類よりも少ない１つの光検出器１８、３０を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して３重染色観察ができるうえに顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができ、さらに短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【００７２】
又、３つの励起波長λ_１、λ_２、λ_３による３重染色観察を１回目励起露光と２回目励起露光とで取得された各画像を合成して３重染色蛍光標本１の画像を取得するので、クロストークの無い、３波長励起分の蛍光画像を得ることができる。
【００７３】
（３）次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図３と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００７４】
図６は共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の構成図である。この共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の上記第２の実施の形態と相違するところは、励起波長（中心波長）λ_４＝３５１ｎｍのレーザ光を出力するレーザ光源４０を加えて４波長とした点である。
【００７５】
このレーザ光源４０から出力されたレーザ光の光路上には、シャッタ４１が配置されている。このシャッタ４１は、上記シャッタ制御装置１１により開閉制御されるもので、他のシャッタ５、６、７との組み合わせて選択的に開閉、例えば各シャッタ５と７、各シャッタ３と４１が同時に開放されるようになっている。
【００７６】
レーザ光源４０から出力されたレーザ光は、ミラー４２で反射し、ダイクロイックミラー４３で反射して、上記励起波長λ_１、λ_２、λ_３のレーザ光と同一の光軸、傾きとなるように導入されるようになっている。
【００７７】
上記分光ダイクロイックミラー３１は、多重染色蛍光標本１から発せられた各蛍光波長λ_１’、λ_２’、λ_３’、λ_４’の蛍光を所定の波長λｓ、例えばλ_４’＜λ_１’＜λｓ＜λ_２’＜λ_３’の関係である波長λｓを境として分光する波長特性を有するもので、図７及び図８に示すように波長λｓよりも短い波長の光を反射し、かつ波長λｓよりも長い波長の光を透過するものとなっている。
【００７８】
この分光ダイクロイックミラー３１の透過光路上には、共焦点開口部１６を介してバリアフィルタ４４が配置されている。このバリアフィルタ４４は、上記境の波長λｓよりも長い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図７に示すように不要な励起波長λ_４、λ_１、λ_２、λ_３の近傍では透過率を０．０１％以下にし、かつ励起波長λ_２以下は透過率５％以下とし、蛍光波長λ_２’、λ_３’帯域の蛍光の透過率をできるだけ高く設定したものである。
【００７９】
一方、分光ダイクロイックミラー３１の反射光路上には、共焦点開口３３を介してバリアフィルタ４５が配置されている。このバリアフィルタ４５は、上記境の波長λｓよりも短い波長帯域の蛍光波長を透過する特性を有するもので、図８に示すように不要な励起波長λ_４、λ_１、λ_２の近傍及び励起波長λ_３以上では透過率を０．０１％以下にし、かつ励起波長λ_４以下は特に規定せず、蛍光波長λ_４’、λ_１’帯域の透過率ができるだけ高くなるように設定されている。
【００８０】
なお、これらバリアフィルタ４４、４５は、それぞれ１枚の基板上に形成してもよいし、又は複数の基板に形成した波長特性の異なる基板を重ね合わせて形成してもよい。
【００８１】
画像形成装置４６は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_１とλ_３、励起波長λ_４、λ_２ごとの各２次元画像を形成し、これら２次元画像を合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得する機能を有している。
【００８２】
この画像形成装置４６は、シャッタ制御装置１１に対して、先ずは２つのシャッタ５と７とを開放して各励起波長λ_１、λ_３により多重染色蛍光標本１を励起（１回目励起露光）し、次にシャッタ６と４１を開放して励起波長λ_４、λ_２により多重染色蛍光標本１を励起（２回目励起露光）させる機能を有している。
【００８３】
次に、上記の如く構成された顕微鏡の作用について説明する。
【００８４】
画像形成装置４６は、シャッタ制御装置１１に対して一画面の画像が作成されるごとに各シャッタ５、６、７、４１を開放する組み合わせを選択的に順次切り替える指令を発し、かつ各偏向素子１４、１５に対してレーザ光を多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射させる指令を発する。
【００８５】
先ず、シャッタ５と７とが開放され、他の各シャッタ６、４１が遮蔽されている。レーザ光源２から出力された励起波長λ_１のレーザ光は、シャッタ５を通過してダイクロイックミラー８を透過して顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４から出力された励起波長λ_３のレーザ光は、シャッタ７を通過してミラー１０で反射された後、ダイクロイックミラー９を透過し、ダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入される。
【００８６】
これら励起波長λ_１、λ_３の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ_１、λ_３の各レーザ光により励起される。
【００８７】
この多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ_１’、λ_３’の各蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００８８】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ_１’、λ_３’の各蛍光が入射すると、λ_１’＜λｓ＜λ_３’の関係から上記図７及び図８に示すように蛍光波長λ_３’の蛍光を透過し、かつ蛍光波長λ_１’の蛍光の光を反射する。
【００８９】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ_３’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ４４を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ_３’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９０】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射された蛍光波長λ_１’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ４５を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ_１’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９１】
画像形成装置４６は、２つの光検出器１８、３０から出力された各蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、これら蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して各励起波長λ_１、λ_３の２次元画像を形成する。
【００９２】
次に、シャッタ６と４１が開放され、他の各シャッタ５、７が遮蔽されている。レーザ光源３から出力された励起波長λ_２のレーザ光は、シャッタ６を通過してダイクロイックミラー９で反射され、さらにダイクロイックミラー８で反射されて顕微鏡本体１２内に導入され、これと共にレーザ光源４０から出力された励起波長λ_４のレーザ光は、シャッタ４１を通過してミラー４２、ダイクロイックミラー４３で反射されて顕微鏡本体１２内に導入される。
【００９３】
これら励起波長λ_２、λ_４の各レーザ光は、顕微鏡本体１２内のダイクロイックミラー１３で反射され、各偏向素子１４、１５により多重染色蛍光標本１に対して走査（スキャン）照射される。これにより、多重染色蛍光標本１は、励起波長λ_２、λ_４の各レーザ光により励起される。
【００９４】
この多重染色蛍光標本１で発した蛍光波長λ_２’、λ_４’の蛍光は、戻り光として偏向素子１５、１４を経由し、ダイクロイックミラー１３を透過して分光ダイクロイックミラー３１に入射する。
【００９５】
この分光ダイクロイックミラー３１は、蛍光波長λ_２’、λ_４’の各蛍光が入射すると、λ_４’＜λｓ＜λ_２’の関係から上記図７及び図８に示すように蛍光波長λ_２’の蛍光を透過し、かつ蛍光波長λ_４’の蛍光の光を反射する。
【００９６】
この分光ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光波長λ_２’の蛍光は、共焦点開口部１６に集光されてこの共焦点開口部１６を通過し、バリアフィルタ４４を透過して光検出器１８に入射する。この光検出器１８は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ_２’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９７】
一方、分光ダイクロイックミラー３１で反射した蛍光波長λ_４’の蛍光は、共焦点開口部３３に集光されてこの共焦点開口部３３を通過し、バリアフィルタ４５を透過して光検出器３０に入射する。この光検出器３０は、バリアフィルタ４４を透過した蛍光波長λ_４’の蛍光を受光して蛍光強度を検出し、その蛍光強度信号を出力する。
【００９８】
画像形成装置４６は、光検出器１８から出力された蛍光強度信号を取り込んで蓄積し、この蛍光強度信号を各偏向素子１４、１５の駆動信号に同期して内部に設定された直交座標上に配置して励起波長λ_４、λ_２の２次元画像を形成する。
【００９９】
そして、画像形成装置３５は、各励起波長λ_１、λ_３の２次元画像と励起波長λ_４、λ_２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得し、同画像を表示装置２０に表示したり、図示しない印刷装置等により印字出力させたりする。
【０１００】
このように上記第３の実施の形態においては、先ずは励起波長λ_１、λ_３により多重染色蛍光標本１を励起し、次に励起波長λ_４、λ_２により多重染色蛍光標本１を励起し、これら励起波長λ_１、λ_３の２次元画像と励起波長λ_４、λ_２の２次元画像とを合成して多重染色蛍光標本１の画像を取得するようにしたので、上記第２の実施の形態と同様に、４つの励起波長λ_１、λ_２、λ_３、λ_４の種類よりも少ない２つの光検出器１８、３０を用いて多重染色蛍光標本１の画像を取得して４重染色観察ができるうえに顕微鏡の小型化、低価格化を図ることができ、さらに短時間での多重染色蛍光標本１の画像を取得できる。
【０１０１】
又、４つの励起波長λ_１、λ_２、λ_３、λ_４による４重染色観察を１回目励起露光と２回目励起露光とで取得された各画像を合成して４重染色蛍光標本１の画像を取得するので、クロストークの無い、４波長励起分の蛍光画像を得ることができる。
【０１０２】
なお、本発明は、上記第１乃至第３の実施の形態に限定されるものでなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。
【０１０３】
さらに、上記実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１０４】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明によれば、励起波長の種類よりも少ない数の光検出器を用いて小型化、低価格化を図り、かつ短時間での画像取得ができる走査型光学顕微鏡を提供できる。
【０１０５】
又、本発明によれば、クロストークのノイズを防止して多重染色蛍光標本の蛍光画像を得ることができる走査型光学顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第１の実施の形態におけるバリアフィルタの波長特性図。
【図３】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図４】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態における一方のバリアフィルタの波長特性図。
【図５】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第２の実施の形態における他方のバリアフィルタの波長特性図。
【図６】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【図７】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態における一方のバリアフィルタの波長特性図。
【図８】本発明に係わる共焦点レーザ走査型光学顕微鏡の第３の実施の形態における他方のバリアフィルタの波長特性図。
【符号の説明】
１：多重染色蛍光標本
２，３，４：レーザ光源
５，６，７：シャッタ
８，９：ダイクロイックミラー
１０：ミラー
１１：シャッタ制御装置
１２：顕微鏡本体
１３：ダイクロイックミラー
１４，１５：偏向素子
１６：共焦点開口部
１７：バリアフィルタ
１８：光検出器
１９：画像形成装置
２０：表示装置
３０：光検出器
３１：分光ダイクロイックミラー
３２：バリアフィルタ
３３：共焦点開口部
３４：バリアフィルタ
３５：画像形成装置
４０：レーザ光源
４１：シャッタ
４２：ミラー
４３：ダイクロイックミラー
４４：バリアフィルタ
４５：バリアフィルタ
４６：画像形成装置[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a scanning optical microscope that irradiates a multiple-stained fluorescent specimen with excitation light having a plurality of wavelengths, exposes the specimen, detects fluorescence emitted from the multiple-stained fluorescent specimen, and performs multiple-stain observation.
[0002]
[Prior art]
For example, when observing multiple stained fluorescent specimens using a confocal laser scanning optical microscope, multiple wavelengths of fluorescence corresponding to multiple reagents that multiple-stained the specimen are emitted. For this purpose, a plurality of photodetectors are provided.
[0003]
However, for a reagent having a broad fluorescence emission wavelength band with respect to the wavelength of the excitation light, the fluorescence emitted by the reagent is simultaneously detected by a plurality of photodetectors separated for each fluorescence wavelength, and multiple staining is performed. It makes no sense to observe the specimen.
[0004]
In order to avoid such a situation, the excitation wavelength is switched every time an image is acquired for a sample of one screen so that the fluorescence of the reagent having a wide emission wavelength band is not detected by each photodetector adjacent to the wavelength band. A sequential scanning method for obtaining an image by emitting fluorescence having a wavelength corresponding to the excitation wavelength is performed. In this method, each photodetector is assigned to a channel having a characteristic corresponding to the fluorescence wavelength, and the same number of photodetectors as the types of excitation wavelengths are used.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, as in the above laser scanning optical microscope, the excitation light having different excitation wavelengths is sequentially scanned, and the fluorescence is detected by each photodetector prepared in the channel corresponding to each fluorescence wavelength, so that the multiple stained fluorescent specimen In the method of acquiring images, the number of photodetectors required for the type of excitation wavelength is required, and in addition, the optimum confocal aperture, spectral filter, excitation light cut filter, etc. are required for each channel, and the microscope is large. It became expensive as it changed.
[0006]
Usually, in fluorescence observation of biological specimens, it is required to minimize the exposure of excitation light in order to reduce the influence of phototoxicity on the specimen by excitation light. However, since the excitation exposure is performed a plurality of times for the type of the excitation wavelength in order to acquire an image of one screen, it takes time to perform only these excitation exposures.
[0007]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a scanning optical microscope that can be reduced in size and cost by using a smaller number of photodetectors than the number of types of excitation wavelengths, and can acquire an image in a short time. .
[0008]
[Means for Solving the Problems]
According to the first aspect of the present invention, there is provided a scanning optical microscope that irradiates a multiple-stained fluorescent specimen with excitation light having a plurality of wavelengths and performs multiple-stain observation of the specimen, out of the plurality of wavelengths of the excitation light. The multiple staining fluorescence Select the excitation wavelength to irradiate the specimen Excitation wavelength selection And a photodetector for receiving fluorescence emitted from the multiple-stained fluorescent sample corresponding to the selected excitation wavelength and detecting the fluorescence intensity, the number of which is selected by the excitation wavelength selection means Be done Above A photodetector that is less than the total number of excitation wavelengths; A barrier filter disposed in front of at least one of the photodetectors, blocking all of the excitation wavelengths selected by the excitation wavelength selection means, and transmitting the wavelengths of the fluorescence emitted from the multiple-stained fluorescent specimen; As many as the number of the photodetectors by the excitation wavelength selection means. Above By selecting the excitation wavelength and performing the first sample scan, Above By obtaining a sample image corresponding to each selected excitation wavelength, and then performing a second sample scan by selecting a different excitation wavelength by the excitation wavelength selection means, Above A sample image corresponding to each selected excitation wavelength was acquired and acquired. Above Per excitation wavelength Each An scanning optical microscope comprising image forming means for synthesizing sample images to obtain an image of the multiple-stained fluorescent sample.
[0009]
The present invention according to claim 2 is the scanning optical microscope according to claim 1, The total number of selected excitation wavelengths is 3 or more and the number of the photodetectors is two, and the fluorescence emitted corresponding to the plurality of excitation wavelengths is branched into fluorescence corresponding to the respective excitation wavelengths. And the image forming unit selects the two excitation wavelengths by the excitation wavelength selection unit and performs the first sample scanning to select the selected one. The sample images corresponding to the respective excitation wavelengths are acquired through the respective photodetectors, and then the second sample scan is performed by selecting an excitation wavelength different from the previous one, whereby each of the selected excitations is performed. Acquire the sample image corresponding to the wavelength It is characterized by that.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Hereinafter, a first embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0014]
FIG. 1 is a configuration diagram of a confocal laser scanning optical microscope. Laser light sources 2, 3, and 4 that output laser beams (excitation light) having a plurality of different wavelengths necessary for excitation of the multiple-stained fluorescent specimen 1 stained with a plurality of reagents are provided. These laser light sources 2, 3, and 4 are for observing the multiple-stained fluorescent specimen 1 that has been triple-stained. These laser light sources 2, 3, and 4 have an excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ These laser beams are output at these excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Is the length of λ ₁ <Λ ₂ <Λ ₃ These excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ The center wavelength of ₁ Is 488 nm, λ ₂ Is 543 nm, λ ₃ Is 633 nm.
[0015]
On the output optical paths of these laser light sources 2, 3, 4, dichroic mirrors 8, 9 and a mirror 10 are arranged via shutters 5, 6, 7, respectively. Of these, the shutters 5, 6, and 7 are sequentially opened and closed every time one screen is acquired by the shutter controller 11, so that each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ These laser beams are sequentially switched and introduced into the microscope main body 12.
[0016]
The dichroic mirrors 8 and 9 and the mirror 10 are arranged on the output optical paths of the laser light sources 2, 3, and 4 as described above, and the dichroic mirrors 8 and 9 are arranged on the reflected optical path of the mirror 10.
[0017]
Among these, the mirror 10 has an excitation wavelength λ. ₃ The dichroic mirror 9 has an excitation wavelength λ. ₃ Of laser light and excitation wavelength λ ₂ The laser wavelength of the excitation wavelength λ ₃ The dichroic mirror 8 has a characteristic of reflecting in the same direction as the transmission direction of the laser beam of ₃ And λ ₂ Of the laser beam and the excitation wavelength λ ₁ The laser wavelength of the excitation wavelength λ ₃ And λ ₂ The laser beam transmits in the same direction as the reflection direction of the laser beam.
[0018]
In the microscope main body 12, a dichroic mirror 13 is disposed on the optical path of laser light introduced into the microscope main body 12. The dichroic mirror 13 has an excitation wavelength λ introduced into the microscope body 12. ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Wavelength λ reflected from the multiple-stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ It has the property of transmitting 'fluorescence'.
[0019]
On the reflected light path of the dichroic mirror 13, two deflection elements 14 and 15 that are orthogonal to each other are arranged. For example, galvanometer mirrors are used as these deflecting elements 14 and 15, and the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ The sample 1 is excited by scanning (scanning) the entire surface of the multiple-stained fluorescent sample 1 with the laser beam.
[0020]
Fluorescence wavelength λ emitted from multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ The fluorescence of 'passes through the dichroic mirror 13 via the deflecting elements 15 and 14 as return light.
[0021]
On the transmitted light path of the dichroic mirror 13, a barrier filter 17 is disposed via a confocal opening 16. This barrier filter 17 has an excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ It has a wavelength characteristic that transmits' fluorescence. FIG. 2 is a wavelength characteristic diagram of the barrier filter 17. In this wavelength characteristic diagram, the vertical axis indicates the spectral transmittance T and the horizontal axis indicates the wavelength λ. Fluorescence wavelength λ ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ Specifically, the center wavelengths of ′ are 520 nm, 590 nm, and 660 nm, respectively. The wavelength characteristic of the barrier filter 17 is determined by each excitation wavelength λ. ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Fluorescence wavelength λ to be detected by setting the transmittance to 0.01% or less for the laser beam of ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ The maximum transmittance that can be produced with a transmittance of 80% or more is set for the fluorescence of '. The barrier filter 17 may be formed on a single substrate, or may be formed by combining (overlapping) substrates having different wavelength characteristics formed on a plurality of substrates.
[0022]
The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 17. ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ 'Is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output. For example, one photomultiplier is used.
[0023]
The image forming apparatus 19 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ 2D images are formed, and the two-dimensional images are synthesized to obtain an image of the multiple stained fluorescent specimen 1.
[0024]
The image forming apparatus 19 displays the acquired image of the multiple stained fluorescent specimen 1 on the display device 20 or prints it out by a printing device (not shown).
[0025]
The image forming apparatus 19 includes a computer and stores a program for executing image processing and the like, a program for issuing a command to the shutter control device 11, and a program for driving the deflection elements 14 and 15. It has a function of executing a program and performing a series of operation controls for acquiring an image of the multiple stained fluorescent specimen 1.
[0026]
Next, the operation of the microscope configured as described above will be described.
[0027]
The image forming apparatus 19 issues a command to sequentially open and close the shutters 5, 6, and 7 each time an image of one screen is created, and to the deflection elements 14 and 15. A command for scanning and irradiating the multiple stained fluorescent specimen 1 with laser light is issued.
[0028]
First, the shutter 5 is opened and the other shutters 6 and 7 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 2 ₁ Is transmitted through the dichroic mirror 8 from the shutter 5 and introduced into the microscope main body 12, is further reflected by the dichroic mirror 13 in the microscope main body 12, and is deflected by the deflecting elements 14 and 15. The entire surface is scanned and irradiated. Thereby, the multiple-stained fluorescent specimen 1 is excited.
[0029]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ′ 'Fluorescence passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, is further collected at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, and enters the barrier filter 17. To do.
[0030]
The barrier filter 17 has an excitation wavelength λ as shown in the wavelength characteristic diagram of FIG. ₁ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ The 'fluorescence passes through the barrier filter 17 and enters the photodetector 18.
[0031]
The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 17. ₁ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0032]
The image forming apparatus 19 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place the excitation wavelength λ ₁ The two-dimensional image is formed.
[0033]
Next, the shutter 6 is opened and the other shutters 5 and 7 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 3 ₂ Is reflected by the dichroic mirror 9, is reflected by the dichroic mirror 8, is introduced into the microscope main body 12, and is further reflected by the dichroic mirror 13 in the microscope main body 12. 14 and 15 irradiate the entire surface of the multiple stained fluorescent specimen 1 with scanning. Thereby, the multiple-stained fluorescent specimen 1 is excited.
[0034]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₂ ′ 'Fluorescence passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, is further collected at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, and enters the barrier filter 17. To do.
[0035]
The barrier filter 17 has an excitation wavelength λ as shown in the wavelength characteristic diagram of FIG. ₂ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₂ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₂ The 'fluorescence passes through the barrier filter 17 and enters the photodetector 18.
[0036]
The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 17. ₂ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0037]
The image forming apparatus 19 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place the excitation wavelength λ ₂ The two-dimensional image is formed.
[0038]
Next, the shutter 7 is opened and the other shutters 5 and 6 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 3 ₃ After passing through the shutter 7 and reflected by the mirror 10, the laser light passes through the dichroic mirror 9, is reflected by the dichroic mirror 8, is introduced into the microscope body 12, is reflected by the dichroic mirror 13, and is deflected. The multiple staining fluorescent specimen 1 is scanned and irradiated by the elements 14 and 15 to excite the multiple staining fluorescent specimen 1.
[0039]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₃ The 'fluorescence passes through the deflecting elements 15 and 14, passes through the dichroic mirror 13, passes through the confocal opening 16, and enters the barrier filter 17.
[0040]
The barrier filter 17 has an excitation wavelength λ as shown in the wavelength characteristic diagram of FIG. ₃ Wavelength λ emitted from multiple stained fluorescent specimen 1 ₃ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₃ The 'fluorescence passes through the barrier filter 17 and enters the photodetector 18.
[0041]
The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 17. ₃ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0042]
The image forming apparatus 19 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place the excitation wavelength λ ₃ The two-dimensional image is formed.
[0043]
Then, the image forming apparatus 19 uses each excitation wavelength λ. ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ These two two-dimensional images are synthesized to obtain an image of the multiple stained fluorescent specimen 1 and displayed on the display device 20 or printed out by a printing device (not shown).
[0044]
Thus, in the first embodiment, the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ Using one barrier filter 17 having the characteristic of transmitting the fluorescence of ', the fluorescence transmitted through the barrier filter 17 is detected by one photodetector 18, and based on the fluorescence intensity signal output from this photodetector 18. Excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Since the images of the multiple stained fluorescent specimens 1 are obtained by synthesizing these images, the three excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ It is possible to obtain an image of the multi-stained fluorescent specimen 1 by using a single photodetector 18 that is smaller than the number of types, and to perform the triple staining observation, and it is possible to reduce the size and cost of the microscope.
[0045]
Also, the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Are sequentially irradiated to the multiple-stained fluorescent specimen 1 and excited, and each fluorescence wavelength λ emitted at this time is excited. ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ The fluorescence of 'is sequentially detected to form an image thereof, and these images are combined to acquire the image of the multiple stained fluorescent sample 1. Therefore, the image of the multiple stained fluorescent sample 1 can be acquired in a short time.
[0046]
In the confocal laser scanning optical microscope, an image is acquired while feeding the multiple stained fluorescent specimen 1 at regular intervals in the thickness direction of the specimen 1, and a three-dimensional image of the multiple stained fluorescent specimen 1 is constructed. Three-screen image acquisition can be performed continuously or intermittently, and observation and analysis can be performed over time.
[0047]
(2) Next, a second embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. The same parts as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
[0048]
FIG. 3 is a configuration diagram of a confocal laser scanning optical microscope. The difference from the first embodiment of the confocal laser scanning optical microscope is that a photodetector 30 is provided and two photodetectors 18 and 30 are used.
[0049]
A spectral dichroic mirror 31 is arranged on the transmission optical path of the dichroic mirror 13 in the microscope body 12. The spectroscopic dichroic mirror 31 has each fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1. ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ 'Fluorescence of a given wavelength λs, eg λ ₁ '<Λs <λ ₃ 'And λs <λ ₂ As shown in FIGS. 4 and 5, it reflects light having a wavelength shorter than the wavelength λs as shown in FIG. 4 and FIG. In addition, light having a wavelength longer than the wavelength λs is transmitted.
[0050]
On the transmitted light path of the spectral dichroic mirror 31, a barrier filter 32 is disposed via the confocal aperture 16. The barrier filter 32 has a characteristic of transmitting a fluorescence wavelength in a wavelength band longer than the boundary wavelength λs, and at least an unnecessary excitation wavelength λ as shown in FIG. ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ And the fluorescence wavelength λ ₂ ', Λ ₃ It is designed to transmit 'fluorescence. That is, the barrier filter 32 has each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Is set at a transmittance of 0.01% or less near the excitation wavelength λ ₁ −λ ₂ In particular, the fluorescence wavelength λ ₂ ', Λ ₃ 'Transmittance of' band is set as high as possible.
[0051]
On the other hand, a barrier filter 34 is disposed on the reflected light path of the spectral dichroic mirror 31 through a confocal aperture 33. The barrier filter 34 has a characteristic of transmitting a fluorescence wavelength in a wavelength band shorter than the wavelength λs of the boundary, and at least an unnecessary excitation wavelength λ as shown in FIG. ₁ , Λ ₃ And the fluorescence wavelength λ ₁ It is designed to transmit 'fluorescence. That is, the barrier filter 34 has each excitation wavelength λ. ₁ , Λ ₃ Is set at a transmittance of 0.01% or less near the excitation wavelength λ ₁ The following is not specified, and the fluorescence wavelength λ ₁ 'Transmittance of' band is set as high as possible.
[0052]
Each barrier filter 32, 34 may be formed on a single substrate, or may be formed by combining (overlapping) substrates having different wavelength characteristics formed on a plurality of substrates.
[0053]
The photodetector 30 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 34. ₁ 'Is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output. For example, one photomultiplier is used.
[0054]
The image forming apparatus 35 takes in and accumulates the fluorescence intensity signals output from the two photodetectors 18 and 30, and these fluorescence intensity signals are set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ 2D images are formed, and the two-dimensional images are synthesized to obtain an image of the multiple stained fluorescent specimen 1.
[0055]
The image forming apparatus 35 first opens the two shutters 5 and 7 with respect to the shutter control apparatus 11 so that each excitation wavelength λ is open. ₁ , Λ ₃ Is used to excite the multiple-stained fluorescent specimen 1 (first excitation exposure), and then the shutter 6 is opened to the excitation wavelength λ ₂ Thus, the multiple-stained fluorescent specimen 1 is excited (second excitation exposure).
[0056]
Next, the operation of the microscope configured as described above will be described.
[0057]
The image forming apparatus 19 issues a command to selectively switch the combination for opening the shutters 5, 6, and 7 each time an image of one screen is created to the shutter control apparatus 11, and the deflection elements 14, A command to scan and irradiate the multiple-stained fluorescent specimen 1 with laser light is issued to 15.
[0058]
First, the shutters 5 and 7 are opened, and the shutter 6 is shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 2 ₁ Of the laser light is transmitted from the shutter 5 through the dichroic mirror 8 and introduced into the microscope main body 12, and the excitation wavelength λ output from the laser light source 4 together with the laser light. ₃ The laser light passes through the shutter 7 and is reflected by the mirror 10, then passes through the dichroic mirror 9, is reflected by the dichroic mirror 8, and is introduced into the microscope body 12.
[0059]
These excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₃ Each of the laser beams is reflected by a dichroic mirror 13 in the microscope main body 12, and is scanned and applied to the entire surface of the multiple stained fluorescent specimen 1 by the deflection elements 14 and 15. As a result, the multiple-stained fluorescent specimen 1 has an excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ It is excited by each laser beam.
[0060]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₃ Each fluorescence of 'passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, and enters the spectroscopic dichroic mirror 31.
[0061]
This spectral dichroic mirror 31 has a fluorescence wavelength λ ₁ ', Λ ₃ When each fluorescence of 'is incident, λ ₁ '<Λs <λ ₃ 4 and FIG. 5, the wavelength longer than the wavelength λs at the boundary, that is, the fluorescence wavelength λ ₃ A wavelength that transmits the fluorescence of 'and is shorter than the wavelength λs, that is, the fluorescence wavelength λ ₁ 'Reflect fluorescence.
[0062]
Fluorescence wavelength λ transmitted through the spectral dichroic mirror 31 ₃ The 'fluorescence is condensed at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, passes through the barrier filter 32, and enters the photodetector 18. The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 32. ₃ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0063]
On the other hand, the fluorescence wavelength λ reflected by the spectroscopic dichroic mirror 31 ₁ The 'fluorescence is condensed at the confocal opening 33, passes through the confocal opening 33, passes through the barrier filter 34, and enters the photodetector 30. This photodetector 30 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 34. ₁ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0064]
The image forming apparatus 35 takes in and accumulates the fluorescence intensity signals output from the two photodetectors 18 and 30, and these fluorescence intensity signals are set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ Each two-dimensional image is formed.
[0065]
Next, the shutter 6 is opened and the other shutters 5 and 7 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 3 ₂ After passing through the shutter 6 and reflected by the dichroic mirror 9, the laser beam is reflected by the dichroic mirror 8 and introduced into the microscope main body 12, and further reflected by the dichroic mirror 13 in the microscope main body 12 to be deflected. The entire surface of the multiple-stained fluorescent specimen 1 is scanned and irradiated by the elements 14 and 15. As a result, the multiple-stained fluorescent specimen 1 has an excitation wavelength λ ₂ It is excited by the laser beam.
[0066]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₂ The fluorescence of 'passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, and enters the spectroscopic dichroic mirror 31.
[0067]
This spectral dichroic mirror 31 has a fluorescence wavelength λ ₂ When '' fluorescence is incident, λs <λ ₂ 4 and FIG. 5, the wavelength longer than the wavelength λs at the boundary, that is, the fluorescence wavelength λ ₂ Transmits' fluorescence.
[0068]
Fluorescence wavelength λ transmitted through the spectral dichroic mirror 31 ₂ The 'fluorescence is condensed at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, passes through the barrier filter 32, and enters the photodetector 18. The photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 32. ₂ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0069]
The image forming apparatus 35 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place the excitation wavelength λ ₂ The two-dimensional image is formed.
[0070]
Then, the image forming apparatus 35 has each excitation wavelength λ. ₁ , Λ ₃ 2D image and excitation wavelength λ ₂ The two-dimensional image is synthesized to obtain an image of the multiple-stained fluorescent specimen 1, and the image is displayed on the display device 20 or printed out by a printing device (not shown).
[0071]
Thus, in the second embodiment, each fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ 'Fluorescence of a given wavelength λs, eg λ ₁ '<Λs <λ ₃ 'And λs <λ ₂ A spectroscopic dichroic mirror 31 is provided for separating the light at the wavelength λs, which is the relationship of '. ₁ , Λ ₃ The two-dimensional image is formed by excitation with the laser beam of the laser, and then the multiple stained fluorescent specimen 1 is excited with the excitation wavelength λ ₂ Since the two-dimensional image is formed by excitation with the laser beam and the two-dimensional image is synthesized to obtain the image of the multiple-stained fluorescent specimen 1, the same as in the first embodiment, 3 Two excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ The image of the multiple stained fluorescent specimen 1 can be obtained by using one photodetector 18 and 30 fewer than the number of types, and the three-stained observation can be performed, and further, the microscope can be reduced in size and price can be reduced. An image of the multiple stained fluorescent specimen 1 can be acquired in a short time.
[0072]
Three excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Since the images of the triple-stained fluorescent specimen 1 are obtained by synthesizing the images acquired by the first and second excitation exposures in the triple-stained observation according to the above, the fluorescence for the three-wavelength excitation without crosstalk is obtained. An image can be obtained.
[0073]
(3) Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. The same parts as those in FIG. 3 are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
[0074]
FIG. 6 is a configuration diagram of a confocal laser scanning optical microscope. What is different from the second embodiment of the confocal laser scanning optical microscope is that the excitation wavelength (center wavelength) λ ₄ = Laser light source 40 that outputs laser light of 351 nm is added to obtain four wavelengths.
[0075]
A shutter 41 is disposed on the optical path of the laser light output from the laser light source 40. The shutter 41 is controlled to be opened and closed by the shutter control device 11, and is selectively opened and closed in combination with the other shutters 5, 6, and 7, for example, the shutters 5 and 7 and the shutters 3 and 41 are simultaneously opened. It has come to be.
[0076]
The laser light output from the laser light source 40 is reflected by the mirror 42, reflected by the dichroic mirror 43, and the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ The laser beam is introduced so as to have the same optical axis and inclination as the laser beam.
[0077]
The spectroscopic dichroic mirror 31 has each fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1. ₁ ', Λ ₂ ', Λ ₃ ', Λ ₄ 'Fluorescence of a given wavelength λs, eg λ ₄ '<Λ ₁ '<Λs <λ ₂ '<Λ ₃ It has a wavelength characteristic that separates at the wavelength λs as a boundary, and reflects light having a wavelength shorter than the wavelength λs and reflects light having a wavelength longer than the wavelength λs as shown in FIGS. It is transparent.
[0078]
On the transmitted light path of the spectral dichroic mirror 31, a barrier filter 44 is disposed via the confocal opening 16. The barrier filter 44 has a characteristic of transmitting a fluorescence wavelength in a wavelength band longer than the wavelength λs of the boundary, and an unnecessary excitation wavelength λ as shown in FIG. ₄ , Λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ Near the transmittance of 0.01% or less and the excitation wavelength λ ₂ The following is the transmittance 5% or less, the fluorescence wavelength λ ₂ ', Λ ₃ 'The fluorescence transmission of the band is set as high as possible.
[0079]
On the other hand, a barrier filter 45 is disposed on the reflected light path of the spectral dichroic mirror 31 through the confocal aperture 33. The barrier filter 45 has a characteristic of transmitting a fluorescence wavelength in a wavelength band shorter than the wavelength λs of the boundary, and an unnecessary excitation wavelength λ as shown in FIG. ₄ , Λ ₁ , Λ ₂ And the excitation wavelength λ ₃ Above, the transmittance is 0.01% or less and the excitation wavelength λ ₄ The following is not specified, and the fluorescence wavelength λ ₄ ', Λ ₁ 'The bandwidth is set to be as high as possible.
[0080]
Each of these barrier filters 44 and 45 may be formed on a single substrate, or may be formed by superposing substrates having different wavelength characteristics formed on a plurality of substrates.
[0081]
The image forming apparatus 46 takes in and accumulates the fluorescence intensity signals output from the two photodetectors 18 and 30, and these fluorescence intensity signals are set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. The excitation wavelength λ ₁ And λ ₃ , Excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ Each two-dimensional image is formed, and the two-dimensional image is synthesized to obtain an image of the multiple stained fluorescent specimen 1.
[0082]
The image forming apparatus 46 first opens the two shutters 5 and 7 with respect to the shutter control apparatus 11 so that each excitation wavelength λ is open. ₁ , Λ ₃ Is used to excite the multiple-stained fluorescent specimen 1 (first excitation exposure), and then the shutters 6 and 41 are opened to obtain the excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ Thus, the multiple-stained fluorescent specimen 1 is excited (second excitation exposure).
[0083]
Next, the operation of the microscope configured as described above will be described.
[0084]
The image forming apparatus 46 issues a command to selectively switch the combination of opening the shutters 5, 6, 7, and 41 each time an image of one screen is created to the shutter control apparatus 11, and each deflection element A command to scan and irradiate the multi-stained fluorescent specimen 1 with laser light is issued to 14 and 15.
[0085]
First, the shutters 5 and 7 are opened, and the other shutters 6 and 41 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 2 ₁ The laser light passes through the shutter 5 and passes through the dichroic mirror 8 and is introduced into the microscope main body 12, and the excitation wavelength λ output from the laser light source 4 together with the laser light. ₃ After passing through the shutter 7 and reflected by the mirror 10, the laser light passes through the dichroic mirror 9, is reflected by the dichroic mirror 8, and is introduced into the microscope body 12.
[0086]
These excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₃ Are reflected by the dichroic mirror 13 in the microscope main body 12, and are scanned and irradiated to the multiple-stained fluorescent specimen 1 by the deflecting elements 14 and 15. As a result, the multiple-stained fluorescent specimen 1 has an excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ It is excited by each laser beam.
[0087]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₁ ', Λ ₃ Each fluorescence of 'passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, and enters the spectroscopic dichroic mirror 31.
[0088]
This spectral dichroic mirror 31 has a fluorescence wavelength λ ₁ ', Λ ₃ When each fluorescence of 'is incident, λ ₁ '<Λs <λ ₃ From the relationship ', the fluorescence wavelength λ as shown in FIGS. ₃ 'Transmission of fluorescence and fluorescence wavelength λ ₁ 'Reflect fluorescent light.
[0089]
Fluorescence wavelength λ transmitted through the spectral dichroic mirror 31 ₃ The 'fluorescence is condensed at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, passes through the barrier filter 44, and enters the photodetector 18. This photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 44. ₃ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0090]
On the other hand, the fluorescence wavelength λ reflected by the spectroscopic dichroic mirror 31 ₁ The fluorescence of 'is condensed on the confocal opening 33, passes through the confocal opening 33, passes through the barrier filter 45, and enters the photodetector 30. The photodetector 30 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 44. ₁ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0091]
The image forming apparatus 46 takes in and accumulates the fluorescence intensity signals output from the two photodetectors 18 and 30, and these fluorescence intensity signals are set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Each excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ The two-dimensional image is formed.
[0092]
Next, the shutters 6 and 41 are opened, and the other shutters 5 and 7 are shielded. Excitation wavelength λ output from the laser light source 3 ₂ The laser light passes through the shutter 6, is reflected by the dichroic mirror 9, is further reflected by the dichroic mirror 8, is introduced into the microscope main body 12, and is output from the laser light source 40 together with the excitation wavelength λ. ₄ The laser light passes through the shutter 41, is reflected by the mirror 42 and the dichroic mirror 43, and is introduced into the microscope main body 12.
[0093]
These excitation wavelengths λ ₂ , Λ ₄ Each of the laser beams is reflected by the dichroic mirror 13 in the microscope main body 12, and is scanned (scanned) by the deflecting elements 14 and 15 to the multiple-stained fluorescent specimen 1. As a result, the multiple-stained fluorescent specimen 1 has an excitation wavelength λ ₂ , Λ ₄ It is excited by each laser beam.
[0094]
Fluorescence wavelength λ emitted from the multiple stained fluorescent specimen 1 ₂ ', Λ ₄ The fluorescence of 'passes through the deflecting elements 15 and 14 as return light, passes through the dichroic mirror 13, and enters the spectroscopic dichroic mirror 31.
[0095]
This spectral dichroic mirror 31 has a fluorescence wavelength λ ₂ ', Λ ₄ When each fluorescence of 'is incident, λ ₄ '<Λs <λ ₂ From the relationship ', the fluorescence wavelength λ as shown in FIGS. ₂ 'Transmission of fluorescence and fluorescence wavelength λ ₄ 'Reflect fluorescent light.
[0096]
Fluorescence wavelength λ transmitted through the spectral dichroic mirror 31 ₂ The 'fluorescence is condensed at the confocal opening 16, passes through the confocal opening 16, passes through the barrier filter 44, and enters the photodetector 18. This photodetector 18 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 44. ₂ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0097]
On the other hand, the fluorescence wavelength λ reflected by the spectral dichroic mirror 31 ₄ The fluorescence of 'is condensed on the confocal opening 33, passes through the confocal opening 33, passes through the barrier filter 45, and enters the photodetector 30. The photodetector 30 has a fluorescence wavelength λ transmitted through the barrier filter 44. ₄ The fluorescence intensity of 'is received, the fluorescence intensity is detected, and the fluorescence intensity signal is output.
[0098]
The image forming apparatus 46 captures and accumulates the fluorescence intensity signal output from the light detector 18, and the fluorescence intensity signal is placed on orthogonal coordinates set inside in synchronization with the drive signals of the deflection elements 14 and 15. Place the excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ The two-dimensional image is formed.
[0099]
Then, the image forming apparatus 35 has each excitation wavelength λ. ₁ , Λ ₃ 2D image and excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ The two-dimensional image is synthesized to obtain an image of the multiple-stained fluorescent specimen 1, and the image is displayed on the display device 20 or printed out by a printing device (not shown).
[0100]
Thus, in the third embodiment, first, the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ Is used to excite the multi-stained fluorescent specimen 1, and then the excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ Is used to excite the multiple-stained fluorescent specimen 1 and the excitation wavelength λ ₁ , Λ ₃ 2D image and excitation wavelength λ ₄ , Λ ₂ Since the two-dimensional image is synthesized to obtain the image of the multi-stained fluorescent specimen 1, the four excitation wavelengths λ are obtained as in the second embodiment. ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ , Λ ₄ It is possible to obtain images of the multi-stained fluorescent specimen 1 by using two photodetectors 18 and 30 smaller than the number of types, and to perform four-stain observation and to reduce the size and cost of the microscope. An image of the multiple stained fluorescent specimen 1 can be acquired in a short time.
[0101]
The four excitation wavelengths λ ₁ , Λ ₂ , Λ ₃ , Λ ₄ Since the four-stained fluorescence specimen 1 is obtained by synthesizing the images acquired by the first excitation exposure and the second excitation exposure for the four-stained observation by the four-stained fluorescence specimen 1, the fluorescence for the four-wavelength excitation without crosstalk is obtained. An image can be obtained.
[0102]
The present invention is not limited to the first to third embodiments described above, and various modifications can be made without departing from the scope of the invention in the implementation stage.
[0103]
Furthermore, the above embodiments include inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent requirements. For example, even if some constituent elements are deleted from all the constituent elements shown in the embodiment, the problem described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and is described in the column of the effect of the invention. If the effect is obtained, a configuration from which this configuration requirement is deleted can be extracted as an invention.
[0104]
【Effect of the invention】
As described above in detail, according to the present invention, there is provided a scanning optical microscope that can be reduced in size and cost by using a smaller number of photodetectors than the types of excitation wavelengths and can acquire images in a short time. Can be provided.
[0105]
In addition, according to the present invention, it is possible to provide a scanning optical microscope capable of preventing crosstalk noise and obtaining a fluorescent image of a multiple stained fluorescent specimen.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a configuration diagram showing a first embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 2 is a wavelength characteristic diagram of a barrier filter in the first embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 3 is a configuration diagram showing a second embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 4 is a wavelength characteristic diagram of one barrier filter in a second embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 5 is a wavelength characteristic diagram of the other barrier filter in the second embodiment of the confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 6 is a configuration diagram showing a third embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 7 is a wavelength characteristic diagram of one barrier filter in a third embodiment of a confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
FIG. 8 is a wavelength characteristic diagram of the other barrier filter in the third embodiment of the confocal laser scanning optical microscope according to the present invention.
[Explanation of symbols]
1: Multiple stained fluorescent specimen
2, 3, 4: Laser light source
5, 6, 7: Shutter
8, 9: Dichroic mirror
10: Mirror
11: Shutter control device
12: Microscope body
13: Dichroic mirror
14, 15: Deflection element
16: Confocal opening
17: Barrier filter
18: Photodetector
19: Image forming apparatus
20: Display device
30: Photodetector
31: Spectral dichroic mirror
32: Barrier filter
33: Confocal opening
34: Barrier filter
35: Image forming apparatus
40: Laser light source
41: Shutter
42: Mirror
43: Dichroic mirror
44: Barrier filter
45: Barrier filter
46: Image forming apparatus

Claims

In a scanning optical microscope that irradiates multiple stained fluorescent specimens with multiple wavelengths of excitation light and observes multiple stained specimens,
An excitation wavelength selection means for selecting an excitation wavelength to irradiate the multiple-stained fluorescent specimen among a plurality of wavelengths of the excitation light;
A photodetector for detecting the fluorescence intensity by receiving fluorescence emitted from the multiple staining fluorescent specimen in response to the selected excitation wavelength, wherein that number is selected by the excitation wavelength selection means A photodetector that is less than the total number of excitation wavelengths;
A barrier filter disposed in front of at least one of the photodetectors, blocking all of the excitation wavelengths selected by the excitation wavelength selection means, and transmitting the wavelengths of the fluorescence emitted from the multiple-stained fluorescent specimen;
By performing the first sample scan by selecting the excitation wavelength of the same number as the number of the photodetector by the excitation wavelength selection means, and acquires the sample images corresponding to each excitation wavelength said selected next in the by performing a second sample scan by selecting different excitation wavelengths by an excitation wavelength selection means, and acquires the sample images corresponding to each excitation wavelength said selected the acquired for each of the excitation wavelength Image forming means for synthesizing each specimen image to obtain an image of the multiple stained fluorescent specimen;
A scanning optical microscope characterized by comprising:

The total number of excitation wavelengths selected is 3 or more and the number of photodetectors is two;
Spectroscopic means for branching fluorescence emitted corresponding to the plurality of excitation wavelengths into fluorescence corresponding to the respective excitation wavelengths and leading to the respective photodetectors;
Said image forming means, the excitation by select two of the excitation wavelength is performed the first sample scan by the wavelength selection means, the selected the sample image the respective photodetector corresponding to each excitation wavelength acquired through the vessel, then, by which to select the excitation wavelength different from the previous performing said second sample scanning, obtaining the specimen image corresponding to each excitation wavelength said selected
The scanning optical microscope according to claim 1.