JP4880182B2 - ヒドラジド結合部分を有する巨大分子およびそれらの製造用試剤 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、巨大分子を基材表面または他の連結標的に結合させるための結合化学に関する。さらに詳しくは、本発明は、巨大分子を基材表面に結合させるために、または他の連結反応のために１個または２個以上のヒドラジド結合部分を有する分枝構造または線状構造を必要とする結合化学に関する。保護されたヒドラジド結合部分またはこのようなヒドラジドの前駆体形を、単一のヒドラジドかまたは複数のヒドラジドのいずれかとして巨大分子に導入するための新規な修飾剤が提供される。
【０００２】
発明の背景
次の説明は、本発明に関連した情報の概要となるものである。本明細書中に与えられる情報のいずれもが現在特許請求されている発明に対する従来技術であることも、或いはまた明確にまたは暗に参照される刊行物のいずれもが本発明に対する従来技術であることも容認するものではない。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの基材に対する固定化は、DNAチップ技術、表面プラズモン共鳴実験、または他のバイオセンサー用途のような多くの用途に重要かつ必要な工程である。伝統的には、オリゴヌクレオチドは１つの反応性基による３’−または５’−末端の修飾によって基材上に固定化される。オリゴヌクレオチドは、末端のアミン、チオール若しくはアルデヒド（共有結合用）、または安定な錯体、例えばビオチン、フェニルボロン酸（phenylboronic acid）等を形成し得る基（非共有結合用）で修飾されていた。この修飾オリゴヌクレオチドは、次に、固定化が望まれる場所に置かれ、そして基材上のアルデヒド、マレイミド等々のような適切な官能基と反応せしめられるか、またはストレプトアビジン等々のような結合用分子と錯体を形成する。基材上の特定の場所に置くのは、機械的な斑点発生法または噴霧法（ピンまたは滴下付着法）で、電子的にアドレス指定して（electronic addressing）、または色々な他の方法で行うことができる。ある場合には、固定化の反応は遅く、従ってオリゴヌクレオチドの基材上における長い（一晩）インキュベーションが必要とされる。これらの固定化反応は可逆的であることもあり、その結果経時的に巨大分子が開放される可能性がある。
【０００４】
他の文脈においてであるが、巨大分子上におけるデンドリマー構造が説明されている（例えば、ＷＯ９９／１０３６２、ＷＯ９６／１９２４０およびＷＯ９９／４３２８７）。しかし、これらのデンドリマー構造の使用は、検出のためのような信号部位を提供することに焦点を合わせたものであって、巨大分子自体は、古典的な手段を用いることにより、存在する何らかの基材に単に結合されているだけである。
【０００５】
発明の概要
上記の情報に対して、本発明は、巨大分子、特に複数の反応部位を含むオリゴ類、即ち求核試薬、求電子試薬およびルイス酸または同塩基の改善された固定化法を述べるものである。このアプローチの利点は、固定化の速度がいっそう速いこと、結合の安定性がいっそう高いこと、および基材表面上により短い時間でより多量の固定化オリゴが得られる可能性があることである。これらの利点は固定化に用いられるアプローチとは無関係である。共有結合および非共有結合の両化学により複数の結合部分を有するオリゴを得ることができる。しかし、以下において説明されるように、本発明の方法および組成物における使用には、オリゴまたは巨大分子を、（透過層または他の検定固定化フォーマットのような）表面に共有結合させるためのヒドラジド結合化学が好ましい。
【０００６】
さらに、本発明は、表面結合用部分に対する連結（conjugation）に、または他の巨大分子、標識付け用部分等々との溶液連結に利用できる１種または２種以上のヒドラジドを含んでいるオリゴ類の製造について説明する。ヒドラジド類は、図１８に示されるように、広範囲の連結反応に使用できる求核反応性基である。それらは、例えば（還元によりさらに安定化され得る）ヒドラゾン類を形成する求電子性アルデヒド類と、および安定な共有結合を形成する活性エステルと反応することができる；図１８を参照されたい。この化学は、蛍光体、蛋白質またはペプチド、レポーター基（reporter groups）、その他のオリゴマーをオリゴ類に結合させるために利用することができる。ヒドラジド類の反応は、実施例で証明されるように、巨大分子を基材上に固定化するのに有利に利用できる。ヒドラジド類によるオリゴ類の固定化は、試剤１モル当たりの固定化分子に、より旧式のアミノ修飾と比較して顕著な増加を示す。このようなヒドラジド修飾オリゴ類は以前に述べられていない。
【０００７】
本発明のこれら面の利点は数多くある。例えば、マルチ部位結合部分で修飾された巨大分子は、固定化に要する反応時間が短く、結合実体１個当たりの結合用部位が複数であることを許し、比較的広いｐＨ範囲にわたって安定性となし、そして無水および水性の両条件下で結合する能力を与え、これらによって任意の適用可能な用途のための任意の固相表面に対して分子を結合させる改善された方法を提供する。
【０００８】
本発明の方法および組成物は、固相合成および／または、限定されるものではないが、DNA、RNA、PNA、p-RNA（ピラノシル−RNA）およびペプチドを含めて巨大分子のような小さい分子ライブラリーの合成との関連において有用である。好ましい態様は、旧来のホスホロアミダイト（phosphoramidite）化学合成技術との関連において特に有用である。
【０００９】
本発明は、また、複数の結合部分を有するオリゴヌクレオチドのような固定化された試剤を必要とする分析技術用の固定化された巨大分子成分を製造するのにも有用であり、および／またはヒドラジド修飾が本発明により容易になされ得、核酸ハイブリダイゼーション（hybridization）に基づく検定法、SNP検定法、STR検定法、遺伝子配列定量、同定法等のような検定法が、本発明で製造される固定化された試剤を容易に組み込むことができる。さらに、説明される方法および化合物は、抗原または抗体診断法用の固定化された試剤の製造に容易に適合させることができる。
【００１０】
本発明の第一の態様においては、官能性または反応性の結合部分を巨大分子に接続している分枝構造またはデンドリマー構造を有する巨大分子が提供される。巨大分子のこれらの修飾は、その巨大分子上の結合部分と反応できるか、またはそれら結合部分に非共有結合できる結合用基を含む基材表面に結合させるのに理想的である。
【００１１】
１つのオリゴ内に複数の反応性部位または錯体形成剤を有するオリゴ類の使用は、固定化に重要な利点を提供する。第一に、それは固定化プロセスの速度を高める。この効果の１つの理由は、結合相手間の拡散による初期生成性接触の可能性が、１つの巨大分子、例えばオリゴが複数の反応性部位を有しているときより高いと言うことである。さらに、オリゴは、一次結合後（または一次結合と同時）に形成される、二次の複数の共有または非共有結合によって固定化することができる。これら二次結合の一次結合後における形成は、分子間一次結合の形成後は反応関与物質の近接度（局所濃度）が高まっているために動力学的に有利である分子内の過程である。
【００１２】
第二に、結合の総合的な安定性は、オリゴと基材との間に複数の結合が形成されるにつれて高まる。簡単に言えば、固定化オリゴを基材から完全に解離させるのに必要なエネルギーは、切断しなければならない各結合（共有結合または非共有結合）と共に増加する。この効果は巨大分子を基材と接触させるために用いられるアプローチとは無関係である。しかし、可逆的共有結合、即ちヒドラジドとアルデヒドとの間でのヒドラゾンの形成に対する効果は、実施例において全く劇的に証明されている。
【００１３】
複数の非共有結合錯体の形成は、その結果としてオリゴと基材との間の錯体の総合安定性をいっそう高め、安定な固定化をもたらすために比較的低い親和性の錯体形成部分を使用できるようにする。オリゴ類にしばしば適用される固定化化学のあるものは水溶液中で可逆的であって（例えば、アミンとアルデヒドとの間におけるシッフ塩基の形成）、例えばNaCNBH₃による還元による後続の安定化工程を必要とする。これらの可逆反応の場合、安定化反応前に形成される中間体の安定性がより高いために、複数の結合による固定化が有益である。ある場合には、安定性の増加が安定化反応が不要になるほど充分に大きい。実際、これは、実施例で、色々なアルデヒド部分含有基材上に固定化されたヒドラジド試剤について証明されている。
【００１４】
第三に、複数の結合部位を有するオリゴの使用は、オリゴ付加（loading）がより高い基材の製造を可能にする。通常、基材上の反応性の結合用部分はオリゴに比較してモル大過剰となっており、そして複数の結合部分に起因する改善された結合は、より効率的で安定なオリゴ−基材間相互作用を通じて基材上の利用可能部位をより良好に利用できるようにする。
【００１５】
かくして、本発明のもう１つの面では、巨大分子上に与えられたその複数の反応性結合部分がその巨大分子が共有結合様式か非共有結合様式のいずれかで基材表面に結合できるようにする方法が提供される。本発明のもう１つの面であるが、これら方法の生成物として、巨大分子が複数の結合部分を介して結合されている新規な基材が提供される。これらの新規な修飾された基材は、一般構造式：
【００１６】
【化３１】

【００１７】
を有する：但し、上記の式において、基材（Sub）は、この基材に対して、結合部分Ａ₂に（共有または非共有）結合されている複数の結合部分Ａ₁を共有結合しており、その結合部分Ａ₂は分枝したリンカー部分Ｌ_bを介して巨大分子Ｍ_aに共有結合されている。Ａ₁はＡ₂に共有結合で結合されているのが好ましく、ジアシルヒドラジン結合で結合されているのがさらに好ましい。
【００１８】
非共有結合が利用される態様では、その複数の結合部分はビオチン、ストレプトアビジン、フェニルボロン酸（PBA）およびサリチルヒドロキサム酸（SHA）のような化学的部分から成ることができる。共有結合を利用する態様では、任意の適当な反応性部分、例えば表１に挙げられるものが利用できる。使用に好ましい１つの部分はヒドラジド部分である。このような構造は分枝していても、或いは分枝していなくてもいずれでもよく、それによって利用できる可能な結合部分のレベルに大きな融通性が許される。従って、巨大分子は樹枝状（dendritic）分枝構造を備えているだけでなく、それら反応性結合部分自体も各枝が巨大分子を基材表面に結合させる際に使用するための反応性ヒドラジド要素を有するように分枝されていることができる。
【００１９】
本発明の固定化された巨大分子面のもう１つの態様において、巨大分子上のその複数の結合部分は、電子的にアドレス指定可能な（electronically addressable）マイクロチップを含む基材表面に結合されている巨大分子がマイクロチップ上の結合部位から意図的でなく除去されるのを防ぐ手段を提供する。このような除去は、マイクロチップの電極の電子がバイアスされることの結果としてもたらされる高局在化電圧および電流に由来することがある。従って、１つの好ましい態様では、本発明の多重結合反応図式が、その固定化が少なくとも４ｍＡ／ｃｍ²の電流密度に耐え得るように巨大分子を基材に結合させるようにする。
【００２０】
さらにもう１つの態様において、本発明は、巨大分子に結合されている樹枝状構造または巨大分子自体に対して反応性結合部分を付加させる方法を提供する。これらの反応は、例えば複数のエステル前駆体からのヒドラジン処理によるヒドラジドの現場生成、または複数の保護されたヒドラジンを含んでいる分枝ホスホロアミダイトの付加によるような単一の反応工程で起こり得る。
【００２１】
さらに他の面において、本発明はオリゴ類を含めて巨大分子のヒドラジン結合用部分を付加させる修飾のための新規な組成物を提供する。これらの新規な修飾試剤は、一般に、脂肪族または芳香族のリンカー部分に共有結合され、そのリンカー部分が１種または２種以上の保護されたヒドラジド部分またはヒドラジド前駆体エステルにさらに共有結合されている生体分子合成用のホスフェート保有反応性基を含む。本発明のこの面の一組の態様では、これらの修飾試剤は少なくとも１種の保護された芳香族ヒドラジドを含み、そして一般構造式：
【００２２】
【化３２】

【００２３】
を有する：但し、上記の式において、
Ｂｚはベンゼン環であり；
Ｌ_aは炭素１〜１２個の分枝または非分枝炭化水素であり、そしてＬ_aは場合によりそれらの炭素間に、さらに好ましくは (CH₂)_n（但し、ｎは１〜１２の整数である）間に１〜４個のエーテル結合またはアミド結合を含んでいることができ；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００２４】
【化３３】

【００２５】
であり；
Ｒ_aおよびＲ_bは１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；
各Ｐ_Gaは独立に合成および脱保護の工程中にヒドラジドを保護するのに適した任意の保護基であり、さらに好ましくはトリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルより成る群から選ばれ；そして
ｍは１、２または３である。好ましい態様では、ｍは１または２である。
【００２６】
この組の好ましい態様は：
【００２７】
【化３４】

【００２８】
特にＰ_Gaがモノメトキシトリチルである場合の上記化合物を包含する。
この面のもう１つの態様の組において、上記試剤は１種または２種以上の保護された脂肪族ヒドラジドを含み、そして一般式：
【００２９】
【化３５】

【００３０】
を有する：但し、上記の式において、
Ｌ_aは炭素１〜１２個の分枝または非分枝炭化水素であり、さらにＬ_aはｍ＞１であるならば分枝しており、そしてＬ_aは場合によりそれらの炭素間に１〜４個のエーテル結合またはアミド結合を含んでいることができ；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００３１】
【化３６】

【００３２】
であり；
Ｒ_aおよびＲ_bは１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；
各Ｐ_Gaは独立に合成および脱保護の工程中にヒドラジドを保護するのに適した任意の保護基であり、さらに好ましくはトリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルより成る群から選ばれ；そして最も好ましくはトリチルであり；そして
ｍは１、２、３または４である。好ましい態様では、ｍは１である。他の好ましい態様では、ｍ＞１である。
【００３３】
この組の好ましい態様は、
【００３４】
【化３７】

【００３５】
特にＰ_Gaがトリチルである場合の上記化合物を包含する。
この面の態様のもう１つの組において、上記試剤は３個または４個以上の保護された芳香族ヒドラジドを有し、一般式：
【００３６】
【化３８】

【００３７】
を持つ：但し、上記の式において、
Ｂ_rは分枝用部分、好ましくは炭素、窒素またはベンゼン環であり；
Ｂｚはベンゼン環であり；
Ｆ₁は官能性結合、好ましくはエーテル結合またはアミド結合であり；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００３８】
【化３９】

【００３９】
であり；
Ｒ_aおよびＲ_bは１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；
各Ｐ_Gaは独立に合成および脱保護の工程中にヒドラジドを保護するのに適した任意の保護基であり、さらに好ましくはトリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルより成る群から選ばれ、そして最も好ましくはトリチルであり；
ｎおよびｐは独立に０〜１２の整数であり；
ｍは独立に１、２または３であり；そして
ｑは１、２または３である。
【００４０】
この組からの好ましい態様は：
【００４１】
【化４０】

【００４２】
を包含する。
本発明のこの面の態様のもう１つの組において、上記試剤は芳香族ヒドラジド−前駆体エステルを含み、そして一般構造式：
【００４３】
【化４１】

【００４４】
を有する：但し、上記の式において、
Ｂｚはベンゼン環であり；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００４５】
【化４２】

【００４６】
であり；
Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_eは、独立に、１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはベンジル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；そして
ｎは１〜１２の整数である。
【００４７】
この組の好ましい態様は：
【００４８】
【化４３】

【００４９】
特にＲ_eがメチルである場合のものを包含する。
この局面の態様のもう１つの組において、上記試剤は３個または４個以上の芳香族ヒドラジド前駆体エステルを有し、そして一般式：
【００５０】
【化４４】

【００５１】
を持つ：但し、上記の式において、
Ｂ_rは分枝用部分、好ましくは炭素、窒素またはベンゼン環であり；
Ｂｚはベンゼン環であり；
Ｆ₁は官能性結合、好ましくはエーテル結合またはアミド結合であり；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００５２】
【化４５】

【００５３】
であり；
Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_eは、独立に、１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはベンジル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；
ｎおよびｐは独立に０〜１２の整数であり；
ｍは独立に１、２または３であり；そして
ｑは１、２または３である。
【００５４】
この組の好ましい態様は、
【００５５】
【化４６】

【００５６】
特にＲ_eがメチルである場合のものを包含する。
この局面の態様のもう１つの組において、上記試剤は、少なくとも１種の芳香族ヒドラジド前駆体エステル、並びに固相ホスホロアミダイト化学によるさらなる付加に使用できる保護されたアルコール部分を含み、そして一般式：
【００５７】
【化４７】

【００５８】
を有する：但し、上記の式において、
Ｂ_rは分枝用部分、好ましくは炭素、窒素またはベンゼン環であり；
Ｆ₁は官能性結合、好ましくはエーテル結合またはアミド結合であり；
Ｐ_rは生体分子合成用のリン保有反応性基、好ましくは
【００５９】
【化４８】

【００６０】
であり；
Ｒ_a、Ｒ_bおよびＲ_eは、独立に、１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり、さらに好ましくはベンジル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から独立に選ばれ；
Ｒ_cは２−シアノエチル、アリル、メチル、エチルおよび他のアルキル部分より成る群から選ばれ；
Ｐ_Gaは合成および脱保護の工程中にアルコールを保護するのに適した任意の保護基であり、さらに好ましくはトリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルより成る群から選ばれ；
ｎ、ｐおよびｒは独立に０〜１２の整数であり；そして
ｍは１、２または３である。
【００６１】
もう１つの局面において、本発明は、また、上記試剤のいずれかで修飾されて１個または２個以上のヒドラジドまたはヒドラジド前駆体エステルを含むようにされた新規な巨大分子、好ましくはオリゴ類も提供する。これらのヒドラジドは反応性基を含み、蛍光体若しくは他の小分子、ペプチド、蛋白質若しくは抗体、または基材表面に対するオリゴ類の連結に使用できる。
【００６２】
かくして、本発明のさらにもう１つの態様では、修飾された巨大分子であって、それらのヒドラジド結合部分を介して基材表面に結合されたそのような修飾巨大分子が本発明により提供される。これらの新規な修飾された基材は、一般構造式：
【００６３】
【化４９】

【００６４】
を有する：但し、上記の式において、基材（Sub）はこの基材にヒドラジド反応性中心を含む結合部分Ｒ_Hを共有結合している。
好ましい態様において、Ｒ_Hはカルボニル（-CO-）、-CH₂-、-CH=、-CHOH-および
【００６５】
【化５０】

【００６６】
より成る群から選ばれる、ヒドラジドに共有結合した反応性中心を含む。さらに好ましい態様では、Ｒ_Hはカルボニル反応性中心を含む。Ｒ_Hは少なくとも１個のヒドラジドに共有結合されており、この場合ヒドラジドがＲ_Hに２つの結合で結合されているならばｎ＝０であり、またヒドラジドがＲ_Hに単結合で結合されているならばｎ＝１である。ヒドラジドは分枝または非分枝リンカー部分Ｌ_Hに共有結合されている。Ｌ_Hは、１〜５０個の炭素原子を含む、そして場合によって官能性結合中に１〜１０個のヘテロ原子を含む、分枝しまたは分枝していない、置換されまたは置換されていない、芳香族または脂肪族の炭化水素リンカー部分であり、この場合ヘテロ原子はＯ、Ｎ、ＳおよびＰより成る群から選ばれ、そしてＬ_Hはｍ＞１ならば分枝している。Ｌ_Hは、（帯電していても、していなくてもよい、またはアルキルオキシ基若しくはシアノアルキルオキシ基含んでいても、いなくてもよいホスフェートである）ホスフェート−リンカー基Ｐ_Lに共有結合されており、そのＰ_Lは修飾された巨大分子Ｍ_a、好ましくはオリゴに共有結合されている。
【００６７】
本発明のなおもう１つの局面において、その結合方式は、巨大分子の表面合成、および化合物の表面固定化を必要とする分析用途に適用することができる。
好ましい態様の詳細な説明
今度は本発明の特定の態様を参照して説明すると、複数の基材表面結合部分を有する巨大分子が提供される。
【００６８】
「巨大分子（macromolecule）」とは比較的大きい有機分子を意味する。これら巨大分子には、試験試料中で分子的実体を接触させるのに使用される生物関連分子、即ち、例えば核酸、抗原、抗体および酵素のような生物学的試料源から誘導される他の巨大分子と相互作用することができるものが含まれる。これらは、一般に、少なくとも一部は、オリゴヌクレオチド類およびポリヌクレオチド類を含めて核酸類、DNA類、RNA類、またはp-MeNA類（メチルまたはメトキシホスフェート核酸類）、ペプチド核酸類（PNA類）および閉じ込め核酸類（locked nucleic acids：LNA類）のような化学的に修飾された核酸類似物のような分子がある。巨大分子には、また、CAN類（シクロヘキシル核酸類）、p-RNA類（ピラノシルRNA類）、p-DNA類（ピラノシルDNA類）、および生物学的に誘導された核酸類または他の分子と相互作用せず、共に構造的複雑さを有する複雑な高分子構造物である他の分子のような天然産分子から構造的に誘導された非天然または合成分子もある。便宜上、天然／生物活性オリゴヌクレオチド類（例えば、DNA、RNA、PNA等々）、並びにp-RNA、p-DNAおよびCNAのような非生物学的活性分子を含めて、糖の環に共有結合されている塩基より成る、化学結合した単量体単位を含む上記のような高分子タイプの分子が、全て、本発明で使用される用語「オリゴ（oligo）」に包含される。これは、合成巨大分子の単量体単位は技術的にはヌクレオシドではないので、「オリゴヌクレオチド」の短縮形としての一般的な語法の修正である。オリゴ類は巨大分子を基材表面に結合させるための結合部分により有利に修飾することができる。
【００６９】
巨大分子として蛋白質、ペプチド、酵素および抗体も挙げられ、これらもまたその巨大分子を基材表面に結合させるための結合部分により修飾することができる。
【００７０】
このような結合部分を有するとき、巨大分子は「誘導体化された（derivatized）」または「修飾された（modified）」巨大分子と称することもできる。このような巨大分子は、従って、酸化されたリボース、アミン末端部（amine terminations）、またはここで参照することにより本明細書に含められるHermanson（Hermanson, G. T.著・Bioconjugate Techniques、版権・１９９６年、Academic Press社、San Diego市、CA州）が概説する周知のバイオコンジュゲート対（bioconjugate pairs）のいかなる実存物も、および／またはpRNA類（ここで参照することにより含められる、１９９９年８月１３日に出願された出願中の米国特許出願第０９／３７４，３３８号明細書に記載されるpRNA類を参照）のような別の非核酸構造物を包含する。
【００７１】
一般的には、この化学的部分の巨大分子に対する結合は共有結合から成る。誘導体化巨大分子の基材表面に対する結合に関し、そのような結合は共有結合或いは非共有結合のいずれを利用してもよい。本発明の開示から明らかである、本明細書で明示的に説明される本発明の結合部分は、ホスホロアミダイト結合化学を利用して共有結合されるのが好ましい。かくして、DNA、RNA、p-MeNA類等々のようなホスフェート骨格の核酸、並びにpRNAおよびpDNAのようなホスフェート骨格の非核酸高分子構造物が、開示される結合部分で修飾するための巨大分子としての使用に、ホスホロアミダイト結合をそれらの標準固相合成技術に容易に組み込むことができるので幾らか好ましい。しかし、他の生体分子および合成構造物の（特に第一アルコールによる）修飾にホスホロアミダイト試剤を利用する方法は周知であって、当業者であれば、開示された手法に小さい修正を加えることにより、開示されたホスホロアミダイト結合部分を非ホスフェート骨格タイプの巨大分子（例えば、PNA、CNA、ペプチド等々）にカップリングさせることができるだろう。
【００７２】
「結合部分（attachment moiety）」とは、一般に、巨大分子の基材表面に対する結合において利用される任意の化学的部分を意味する。結合部分は巨大分子上に含まれていてもよいし、或いは基材表面に含まれていてもよい。表１：結合部分は、使用される結合部分のリストを与えるものである。
【００７３】
【表１】

【００７４】

【００７５】

【００７６】
「ルイス塩基」とは、一般に、一対の電子を電子不足中心に供与することができる任意の化学的部分を意味する。１つの好ましい態様において、ルイス塩基はさらに特定的には求核試薬と称されるが、この求核試薬においては、この技術分野の当業者が認めているように、反応中心が一対の電子を炭素に供与し、その結果としてその反応中心と炭素との間に共有結合をもたらす。（拡張された定義については、Smith, M. B.著・Organic Synthesis、版権・１９９４年、McGraw Hill Inc.、New York市、NY州、または有機化学に関する何らかの教科書を参照されたい。）
「ルイス酸」とは、一般に、一対の電子を受け取ることができる任意の電子不足の化学的部分を意味する。１つの好ましい態様において、ルイス酸はさらに特定的には求電子試薬と称されるが、それは、この技術分野の当業者が認めるように、求核試薬から一対の電子を受け取ることができる反応中心である。（拡張された定義については、Smith, M. B.著・Organic Synthesis、版権・１９９４年、McGraw Hill Inc.、New York市、NY州、または有機化学に関する何らかの教科書を参照されたい。）１つの好ましい態様において、例としてであるが、サリチリックヒドロキサム酸（salicylic hydroxamic acid）は、ルイス酸である、フェニルボロン酸のホウ素に一対の電子を供与して非共有結合をもたらすルイス塩基として作用することができる。さらにもう１つの好ましい態様において、例としてであるが、ヒドラジド部分は、求電子試薬であるNHSエステルの反応性炭素中心に一対の電子を供与し、その炭素中心に対して共有結合を形成する求核試薬として作用することができる。
【００７７】
「分枝結合用部分（branched linking moiety）」とは、一般に、特定の反応性部分を介して巨大分子にカップリングすることができ、かつまたもう１つ別の反応中心を介して２個以上の分子にさらに結合することができる任意の化学的種を意味する。１つの好ましい態様において、分枝結合用部分はホスホロアミダイトであって、その例が表２の記載Ｎｏ．１−４に示されている。これらの例において、リンが反応部分として作用し、一方記載Ｎｏ．１、２および３のエステル並びにＮｏ．４の保護されたアルコールがもう１つ別の反応中心である。
【００７８】
「分枝結合用構造物（branched linking structure）」とは、一般に、分枝結合用部分を持つ巨大分子の処理により得られる巨大分子を意味する。分枝結合用部分のもう１つ別の反応中心が、今や分枝結合用構造物内に含まれる。１つの典型的態様において、分枝結合用構造物は表２の記載Ｎｏ．５で表されるもので、ここでＮｏ．５に示される巨大分子はある１つの巨大分子を分枝結合用部分、具体的には表２の記載Ｎｏ．４に示される化合物により処理した結果である。もう１つの好ましい態様において、分枝結合用構造物は同種（homogeneous）系列において化合することができ、その同種系列においては、巨大分子は分枝結合用部分により修飾され、それがまた得られた分枝結合用構造物のもう１つ別の反応中心を介して同じ分枝結合用部分によってさらに修飾され、新しい分枝結合用構造物を生成させる。分枝結合用部分の一連の結合によるより大きい分枝結合用構造物のこの組み立ては、表２の記載Ｎｏ．６−８に示されるようにさらに続けることができる。さらにもう１つの態様において、分枝結合用部分は同種系列において化合することができ、その同種系列においては、巨大分子は分枝結合用部分により修飾され、それがまた初めの分枝結合用部分のもう１つ別の反応中心を介して異なる分枝結合用部分によってさらに修飾され、新しい分枝結合用構造物を生成させる。分枝結合用部分の一連の結合によるより大きい分枝結合用構造物のこの組み立ては、表２の記載Ｎｏ．９−１２に示されるようにさらに続けることができる。
【００７９】
【表２】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】
「基材（substrate）」とは、一般に、表面が巨大分子の反応性結合部分（例えば単一のまたは複数のヒドラジド結合部分）がカップリングできる部分を含む任意の材料を意味する。基材は、平面の表面、マイクロウエル（microwell）、ディップスティック、ビーズ等々を含めて任意の有用な形状をしていることができる。かくして、基材は、とりわけ、ガラススライド、官能化ガラススライド、化学的に活性化されたマイクロチップ表面、単一もしくは複数の反応性分子層で被覆された表面、または巨大分子の複数の反応性結合部分が反応できる部分を有する重合体またはヒドロゲル（合成重合体または天然重合体）で被覆された表面であることができる。巨大分子が結合される（即ち、基材の表面において結合される）基材材料は任意の適当な材料であることができるが、それは固定化される巨大分子に対する使用に主として依存する。典型的な基材材料を挙げると、ケイ素系材料（例えばケイ素、ガラス、官能化ガラス、窒化ケイ素、セラミック、ゾル−ゲル等々）、金属および金属シリシリド（metal silicilides）（例えば白金、金、チタン、アルミニウム、タングステン、それらの合金等々）、重合体およびプラスチック（例えばポリカーボネート、ポリアルキレン（例えばポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリエステル、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ナイロン、ポリハロゲン化ビニル、それらの共重合体等々）、ヒドロゲル（例えばポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミド、ポリエポキシド、ポリアルキレングリコールのような合成ヒドロゲル；またはアガロースのような炭水化物系ヒドロゲル等）、或いはキトサン、セルロース、または実にコラーゲンマトリックスのような天然誘導材料がある。１つの好ましい態様において、基材表面は電子的にアドレス指定可能なマイクロチップの透過層である。１つの特に好ましい態様では、透過層は、ヒドロゲル上および／またはヒドロゲル内に反応性部分を含むように修飾されたそのようなヒドロゲルから成る。好ましいヒドロゲルに、ポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミドのような合成重合体のヒドロゲルがある。もう１つの好ましい群はアガロースのような炭水化物のヒドロゲルである。１つの好ましい態様において、基材の官能性の化学的に活性な、即ち反応性の部分は、（限定されないが）表１に記載される官能基から選ばれる。特に好ましい態様では、基材の反応性部分は、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、スルホン化されたＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、カルボン酸およびアシルハリドから選ばれる。これらの基は、図１８に示されるヒドラジド部分との反応に特に有用である。
【００８４】
「前駆体」とは、一般に、１種または２種以上の化学試剤の処理によりもう１つ別の反応性部分に変換され得る任意の反応性部分を意味する。１つの好ましい態様において、例としてであるが、１ｄ（表２の記載Ｎｏ．３）の３個のエステル部分はヒドラジドに対する前駆体である。それらはヒドラジンの処理によりヒドラジド部分に変換される。
【００８５】
「保護された」とは、一般に、反応性部分の反応性を１種または２種以上の試剤で封鎖するが、同時に、同じ化合物の別の反応部位で、初めの反応性部分による妨害または複雑化なしに化学反応を行うことができることを意味する。上記の別の反応性部位での変換が終わると、その反応性部分の保護基を取り除いて反応中心の封鎖を解くことができる。好ましい保護性部分に、トリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルがある。特に好ましい態様においては、例えばジメトキシトリチルよりもトリチルの方がむしろ使用される。発明者等は、トリチルが合成および精製工程中に他の保護基よりも安定であることを見いだした。１つの好ましい態様において、保護された部分は特定のタイプの前駆体である。さらにもう１つの好ましい態様では、例としてであるが、図９Ａの１ａのヒドラジド部分がトリチル基で保護される。１ａが巨大分子に付加されると、そのトリチル基は化学的に除去され、そのヒドラジド官能基を脱保護する。
【００８６】
「活性化性」とは、一般に、１種または２種以上の化学試剤で処理されるときに反応性部分に変換を受ける能力がある任意の官能基を意味する。「活性化された」とは、反応性部分にこのような変換を受けた官能基を意味する。１つの好ましい態様において、活性化性部分は保護された部分または前駆体であることができる。さらにもう１つの好ましい態様では、この官能基は、一般に、穏やかであるか、非反応性であるか、または基材若しくは巨大分子に結合することができないと考えられる。１種または２種以上の試剤で処理すると、この官能基は基材または巨大分子に結合し得る部分に変換される。１つの好ましい態様において、例としてであるが、表２、記載Ｎｏ．１−３に記載される化合物のエステル基はヒドラジンによる処理でヒドラジドに変換される。さらにもう１つの好ましい態様では、例としてであるが、アセタール基を含んでいる基材は一般に非反応性であると考えられる。酸性試剤源で処理すると、そのアセタールは、ヒドラジド修飾巨大分子に結合することができるアルデヒドに変換される。
【００８７】
「マイクロアレイ（microarray）」とは、一般に、定義された巨大分子を含む複数の場所の幾何学的配置を意味するもので、このような個々の場所は１ｍｍまたはそれ以下の直線寸法まで制限される。マイクロアレイには、「APEXチップ」または「NanoChip（登録商標）」と称されるアレイ、およびここで参照することにより全体が本明細書に含められる米国特許第５，６３２，９５７号、同第６，２５４，８２７号、同第６，２４５，５０８号および同第６，２３８，６２４号明細書に記載される構造物のような、電子的に処理できるマイクロアレイがある。
【００８８】
概観
図２は本発明の固定化された巨大分子の基本的模式図を示し、この場合巨大分子は基材表面に複数の結合部分を介して結合される。この複数の結合部分は、巨大分子に次の方法を用いて与えることができる。これらの方法は、各々、オリゴ類の標準固相合成に、特にホスホロアミダイト化学技術を用いると適合する。
【００８９】
１．複数の結合部位を有するオリゴ類の製造
１．１ 分枝用ホスホロアミダイトによるオリゴ合成
分枝したホスホロアミダイトは商業的に入手でき（Chemgenes社、Ashland、MA州；Glenn Research社、Sterling、VA州）、またオリゴヌクレオチド（DNA、RNAおよびそれらの化学修飾された変種）は、商業的供給源から３’または５’末端に結合された分枝ホスホロアミダイトを用いて注文製造することができる。固相オリゴ合成におけるこのような分枝用アミダイトの１回または２回以上の連続カップリング（図５ＡおよびＢ）後に、２個または３個以上の末端ヒドロキシル基を有するオリゴが生成する。ここで、枝をオリゴに導入する追加のホスホロアミダイト構成単位（building block）は同様の様式で適用することができ、またはこれらのヒドロキシル基はこれらを第二のタイプのホスホロアミダイトと反応させて、基材に対する巨大分子の結合用の反応性基（即ち、結合部分）を生成させることができる。このホスホロアミダイトは、ビオチンアミダイト類（例えば、Glenn Research社、Cat No. 10595002）、アミノ修飾剤（例えば、Glenn Research社、Cat No. 10190602）、チオール修飾剤（例えば、Glenn Research社、Cat No. 10192602）、フェニルボロン酸アミダイト類（Prolinx社、Bothell、WA州）、その他のような数種の入手可能なアミダイト類から選ぶことができる。
【００９０】
好ましい態様において、ヒドラジド、特に本発明で説明される新規なヒドラジドまたはヒドラジド前駆体ホスホロアミダイト試剤を含んでいるホスホロアミダイト（図９Ａ）が使用できる。結果は、分枝用ホスホロアミダイトの数および使用される結合部分ホスホロアミダイトのタイプに依存するが、２個または３個以上（好ましくは２〜８個）の反応性基を有するオリゴである。単一ヒドラジドまたは前駆体を導入するのに有用なホスホロアミダイトに次のものがあるが、但し前記で一般的に説明した単一の保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体エステルがいずれも使用できる：
【００９１】
【化５１】

【００９２】
もう１つ別の態様では、固相法で合成される巨大分子またはオリゴは、単一ヒドラジドまたはヒドラジド前駆体エステル試剤と反応して、脱保護またはヒドラジン処理の後に、モノヒドラジド修飾巨大分子を生成させることができる。オリゴ類を含めてこれらの修飾巨大分子は、非基材連結反応において（例えば、［例えば蛍光体、発色性部分、化学ルミネッセンス部分、消光剤、放射性部分、可視色素または粒子部分、磁性または常磁性粒子、およびあまり好ましくないが標識付け用酵素等々のような］標識付け用部分が巨大分子に結合されるべきとき）使用するのに望ましい。
【００９３】
上記で議論したように、これらの方法は、ホスフェート骨格タイプのオリゴ類の合成において使用すべく特に適応させることができるが、しかしそれら方法は、遊離ヒドロキシル基を有する任意の巨大分子に対する反応性ホスフェート基試剤の付加にも容易に適応させることができる。
【００９４】
１．２ 結合用反応性基を２つ以上有するオリゴ類の製造
分枝用ホスホロアミダイト試剤を用いて上記の分枝用構造物を製造する方法は順応性が非常に高く、複雑な、広がったデンドリマー構造物の製造を可能にするけれども、この方法には商業的製造に関してある種の欠点がある。構造発展の各レベルで、その合成プロセスにもう１ラウンドのホスホロアミダイト付加および脱保護が必要とされるのである。加えて、使用される分枝用ホスホロアミダイト試剤は大量合成にはかなり高価である。複数の結合部位を有する巨大分子は、また、基材における固定化のための２個以上の反応性基を、保護されたまたは前駆体の形で有する特別なホスホロアミダイトのカップリングによっても得ることができる。分枝アミダイト中の反応性基は、この場合もまた、アミノ基、チオール基、アルデヒド基またはヒドラジド基のような既知の官能基の１つであることができ、そして好ましくは保護されたヒドラジド基である。
【００９５】
１回のカップリングで複数（２個、３個）のヒドラジドを導入できる、説明した構成単位試剤の内の幾つかは、ヒドラジド前駆体エステル試剤である。これらの生体分子は、活性なヒドラジド部分を生成させるためにヒドラジンで脱保護されなければならない。有用なヒドラジド前駆体エステル試剤に：
【００９６】
【化５２】

【００９７】
並びに上記で一般的に説明したヒドラジド前駆体エステル試剤がある。
これらの試剤は、複数のヒドラジド前駆体部分を巨大分子またはオリゴに単一の合成工程で付加させるのに非常に有効であるけれども、ヒドラジン脱保護はオリゴ合成の標準的な手法ではない。また、ヒドラジドのこの現場生成は、脱保護されたヒドラジドを有するオリゴを生成させる。これらは、逆相HPLCにおける、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル等々のような非極性保護基により引き起こされる保持時間のシフトを通常利用する、オリゴ合成で使用される標準的な手法で精製することは幾らか困難である。かくして、適切な保護基で保護される複数の前もって形成されたヒドラジドを付加させることができる試剤構成単位が、標準的な合成手法による使用に有利である。
【００９８】
複数の保護されたヒドラジドを付加させるのに有効なホスホロアミダイト試剤に：
【００９９】
【化５３】

【０１００】
並びに上記で一般的に説明した他の複数の保護されたヒドラジド試剤がある。これら試剤で修飾されたオリゴ類は、標準のHPLC法を用いて容易に精製される。
１．３ 複合方法
複数の反応性基を有する巨大分子合成の第三のアプローチは、前に説明した（図８Ａ−Ｃ）ように、分枝用アミダイトと複数の反応性部位を持つアミダイトとのカップリングの組み合わせである。
【０１０１】
１．４ 非末端結合部分ホスホロアミダイト
別法として、複数の結合部分を、巨大分子またはオリゴに、１個または２個以上の保護された結合部分または前駆体結合部分、並びにさらなる反応性ホスフェート試剤の付加用の保護されたアルコール部分の両者を含む試剤を利用することによって、直線形式で付加させることができる。例えば、保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体エステルの外に（ジメトキシトリチル保護ヒドロキシル基のような）保護された官能基を含む修飾剤構成単位は、修飾用構成単位のカップリング後も生体分子合成の継続を可能にする。このような方法で有効な典型的なホスホロアミダイト試剤は、
【０１０２】
【化５４】

【０１０３】
並びに上記で一般的に説明した他の保護されたアルコール試剤である。この構成単位は、合成プロセス中にｎ回カップリングせしめられるとき、２ｎ個のヒドラジドを持つ巨大分子を生成させるように、連続的にカップリングすることができる。さらに、この種の構成単位試剤は、巨大分子またはオリゴに生成物のHPLC精製を容易にするための非極性保護基を有せしめる方法を、ヒドラジンを有する生体分子を精製後に脱保護することにより、反応性ヒドラジド部分を現場生成させるアプローチと結びつける。
【０１０４】
線状マルチヒドラジド修飾をもたらすことに加えて、この種の試剤は、また、オリゴ合成の継続も可能にする。かくして、標準的オリゴ合成の追加のラウンドによって、基材に対するオリゴの固定化用マルチヒドラジド部位の両側に２個のオリゴを持つ巨大分子を製造することができる。
【０１０５】
２．０ 結合部分として使用するための好ましい官能基としてのヒドラジド
特に好ましい態様において、基材表面に共有結合によって結合させるための１個または２個以上のヒドラジド部分を有する巨大分子が提供される。オリゴ類を含めてこれらの巨大分子は、基材にまたは他の分子に、ヒドラジドと反応する、NHSおよびスルホ−NHSエステル、その他の部分のような官能基を用いてカップリングすることができる。図１８に描かれるように、広範囲の反応がヒドラジドのカップリングに利用できる。
【０１０６】
本発明において、説明されたヒドラジドの結合法は、基材に対する巨大分子の結合を行わせることができる新規な手段となる。説明されるヒドラジドカップリング化学は、電子マイクロチップの電子的アドレス指定に関連した極端な局所環境条件によるコンジュゲート結合の分解によって引き起こされることがある、束縛された巨大分子の基材からの解離に対して抵抗性を与える。かくして、本発明のヒドラジド化学および多重結合図式は、巨大分子の水溶性、固定化用基材上の巨大分子とそのカップリング対の水性条件に対する安定性、および約ｐＨ４のｐＨまでの官能性の必要を含めて、電子システムの環境における残存性（survivability）の要件を満たす。
【０１０７】
２．１ 脂肪族および芳香族ヒドラジド
脂肪族ヒドラジドと芳香族ヒドラジドは、固定化および連結の反応に関して反応性が異なるということに留意すべきである。かくして、本発明においては脂肪族ヒドラジドのみならず芳香族ヒドラジドの付加用試剤が提供され、そしてそれらは固定化／連結巨大分子の収率を高めるために有利に用いることができる。
【０１０８】
２．２ 基材に対するヒドラジドのカップリング法
ヒドラジド結合部分を付加し、そして本発明で利用する方法が次の実施例で例証される。これらの実施例は、結合が電子的アドレス指定可能なマイクロアレイの上にあるＮ−ヒドロキシスクシニミジル（NHS）修飾ポリアクリルアミド透過層上へのヒドラジド修飾オリゴの電子的濃縮によって、または物理的堆積によって成し遂げられる、オリゴから成る巨大分子の部位特異性共有結合を示すものである。このオリゴマーのヒドラジド部分はそのNHSエステルに取って代わり、ジアシルヒドラジン結合を形成する。
【０１０９】
これらの実施例は、従って、１．）新規な保護されたヒドラジドおよびヒドラジド前駆体ホスホロアミダイト類の合成、および標準合成手法を用いてのこれらアミダイトの合成オリゴマーに対する好結果の組み込み；２．）Ｎ−ヒドロキシ−またはＮ−ヒドロキシスルホ−スクシニミジル修飾透過層の製造；３．）活性化された単量体が上面層だけに組み込まれる電子的にアドレス指定可能なマイクロアレイの上の２層透過層；４．）ヒドラジド修飾オリゴのガラススライドのような非透過層基材上へのカップリング；および５．）色々な結合部分および条件の幾つかの比較を示す。
【０１１０】
実施例
特に指示されない限りは、全ての反応混合物は磁気攪拌された。試剤はAldrich Chemical Company（Milwaukee、WI州）からの分析等級であり、また溶媒はRiedel社から得られた。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル６０（Merck社、２３０−４００メッシュ）を用いて成し遂げられる。融点は無補正である。ＩＲスペクトルはGraseby Specac 10500 ATR装置を備えるPerkin Elmer Paragon 1000 FT-IRで測定される。¹H-NMRスペクトルは５００MHzで；¹³Ｃスペクトルは１２５MHzで；そして³¹Ｐは２０２MHzでBruker DMX 500分光計で記録された。¹Ｈ、¹³Ｃ、³¹Ｐの化学シフトは内部標準としてTMSを用いるδの単位で報告され、そしてカップリング定数はHz単位で報告される。ESI質量スペクトルはFinnigan LCQ測定器で正のイオン化モードで記録される。「痕跡量」とは０．１〜０．０５％の濃度を意味する。
【０１１１】
実施例１：ヒドラジン結合部分を巨大分子に付加させるための
色々なホスホロアミダイト試剤の合成
実験１．１ Ｎ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキシカプロン酸ヒドラジド、化合物５の合成（図９Ａ）
６．２ｇ（２０ミリモル）のトリチルヒドラジン塩酸塩のTHF２００ｍＬ溶液に２．２２ｇ（２２ミリモル、１．１当量）のトリエチルアミンを加えた。この溶液を室温（ｒｔ）で１５分間攪拌し、濾過し、濃縮して３を与え、次いで２．２９ｇ（２０ミリモル、１当量）のε−カプロラクトン（４）で処理した。この混合物を６５℃まで５時間昇温、加熱し、そして室温まで１８時間降温、冷却した。その沈殿を濾過し、そして酢酸エチルから再結晶化して３．５５ｇ（４５％）の白色粉末５を与えた：
【０１１２】
【化５５】

【０１１３】
実験１．２ ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジド化合物１ａの合成（図９Ａ）
３．０ｇ（７．７ミリモル）のＮ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキシカプロン酸ヒドラジド（５）の乾燥ジクロロメタン５０ｍＬ中溶液に、室温において４．０ｇ（３１ミリモル、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび２．０１ｇ（８．５ミリモル、１．１当量）のクロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（６）を１５分間にわたってゆっくり加えた。完全に添加し終わったとき、その反応混合物を１時間攪拌し、濃縮し、そしてクロマトグラフィー（痕跡量のトリエチルアミンを有する酢酸エチル／ｎ−ヘプタン２／３）で精製して、３．１９ｇ（７０％）の１ａを淡黄色の発泡物として与えた。
【０１１４】
【化５６】

【０１１５】
実験１．３ エチル ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサノエート化合物１ｂの合成（図９Ｂ、反応図式２）
１．６５ｇ（１０ミリモル）のエチル ６−ヒドロキシヘキサノエート（７）のジクロロメタン３０ｍＬ中溶液に、室温において５．１７ｇ（４０ミリモル、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび２．６ｇ（１１ミリモル、１．１当量）の６を１５分間にわたってゆっくり加える。完全に添加し終わったとき、その反応混合物を１５分間さらに攪拌し、濃縮し、そしてクロマトグラフィー（痕跡量のトリエチルアミンを有する酢酸エチル／ｎ−ヘプタン１／４）で精製して２．４７ｇ（６９％）の１ｂを透明な油として与えた：
【０１１６】
【化５７】

【０１１７】
実験１．４ ジエチル ５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタレート化合物１ｃの合成（図６Ｂ）
１．２９ｇ（５ミリモル）のジエチル ５−（ヒドロキシメチル）イソフタレートの乾燥ジクロロメタン２０ｍＬ中溶液に、室温において２．５９ｇ（４０ミリモル、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび１．３ｇ（１１ミリモル、１．１当量）の２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロ−ホスホロアミダイトを１５分間にわたって加える。この混合物を濃縮し、ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（３／２）で希釈し、そして濾過した。その濾液を濃縮し、そしてｎ−ヘプタン／酢酸エチル（４／１）および痕跡量のトリエチルアミンを用いてクロマトグラフィーで精製、溶離して１．６ｇ（７０％）の１ｃを無色の油として与えた：
【０１１８】
【化５８】

【０１１９】
実験１．５ ジメチル ３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオネート、化合物１ｄの合成（図８Ｂ）
３００ｍｇ（０．７６０ミリモル）のトリス−２，２，２−｛［（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝エタノール（Coutts, S.; Jones, D.S.; Livingston, D.A.; Yu, L., 1995, 欧州特許出願ＥＰ第０６４２７９８Ａ２号明細書）の乾燥ジクロロメタン２ｍＬ中溶液に、０．４５Ｍの１Ｈ−テトラゾールの乾燥アセトニトリル中０．４Ｍ溶液２滴および２７４ｍｇ（０．９１ミリモル、１．１当量）の２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加え、そしてTLCが出発物質の完全消費を示すまで（３時間）室温において攪拌する。この混合物を濃縮し、そしてクロマトグラフィー（痕跡量のトリエチルアミンを有するｎ−ヘプタン／酢酸エチル３／２）で精製して２４０ｍｇ（５３％）の１ｄを無色の油として与えた：
【０１２０】
【化５９】

【０１２１】
実験１．６ ５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド）化合物６の合成（図３０ａ）
５−ヒドロキシメチルイソフタル酸ジヒドラジド２の合成
２．０ｇ（７．９ミリモル）のジエチル ５−ヒドロキシメチルイソフタレート（１）のエタノール３０ｍＬ中溶液に、４．０ｇ（８０ミリモル）のヒドラジン水和物を加えた。１．５時間攪拌した後に４．０ｇの追加のヒドラジン水和物を加え、そしてその混合物を一晩放置した。沈殿を濾過し、エタノールで２回洗浄し、そして減圧下で乾燥して１．７５ｇ（９９％）の白色粉末状の２を生成させた：
【０１２２】
【化６０】

【０１２３】
５−ヒドロキシメチルイソフタル酸 ビス（Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド）５
２．０ｇ（８．９２ミリモル）のジヒドラジド２のDMF２０ｍＬ中溶液に、６．９２ｇ（５３．５ミリモル、６当量）のジイソプロピルエチルアミンおよび６．２５ｇ（１９．６ミリモル、２．２当量）のモノメトキシトリチルクロリドをゆっくり加えた。この混合物を２．５時間攪拌し、濃縮し、酢酸エチルで希釈して１００ｍＬとし、２ｘ１００ｍＬの水および２ｘ１００ｍＬの飽和NaHCO₃で洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、そして勾配溶離（痕跡量のトリエチルアミンを有する１／１〜１／３のヘキサン／酢酸エチル）でクロマトグラフィー精製して６．５２ｇ（９５％）の白色粉末状の５を与えた：
【０１２４】
【化６１】

【０１２５】
５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド）：６
１．０ｇ（１．３ミリモル）のアルコール５の、１５ｍＬのジクロロメタン、１．５ｍＬのDMFおよび数滴のジイソプロピルエチルアミン中の溶液に、アセトニトリル中に０．６５ｍＬ（３．９ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン、２．９ｍＬ（１．１ミリモル）の０．４５Ｍテトラゾールおよび０．５１ｇ（１．６９ミリモル）のビス−（ジイソプロピルアミン）−（２−シアノエトキシ）−ホスフィンを含んでいる溶液を滴下した。この混合物を３．５時間攪拌し、２０ｇの脱酸シリカゲルを加え、続いて溶媒を除去した。その残分を勾配溶離（痕跡量のトリエチルアミンを含む１／１〜１／２のヘキサン／酢酸エチル）でクロマトグラフィー精製して０．５９ｇ（４７％）の白色粉末状の６を与えた：
【０１２６】
【化６２】

【０１２７】
実験１．７ ５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−トリチルヒドラジド）、化合物４の合成（図３０ａ）
５−ヒドロキシメチルイソフタル酸 ビス（Ｎ’−トリチルヒドラジド）３の合成
２．０ｇ（８．９２ミリモル）のジヒドラジド２のDMF２０ｍＬ中溶液に、９．１ｍＬ（５３．５ミリモル）のジイソプロピルアミンおよび５．６ｇ（１９．６ミリモル）のトリチルクロリドを加えた。この混合物を２．５時間攪拌し、濃縮し、そして１００ｍＬの酢酸エチル中で結晶化させた。この生成物を濾過し、冷エタノールで洗浄し、低真空度の下で４０℃において１８時間乾燥して５．２ｇ（８２％）の３を生成させた：
【０１２８】
【化６３】

【０１２９】
５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−トリチルヒドラジド）、４の合成
１．３ｍＬ（７．８ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンのジクロロメタン２０ｍＬ中溶液に、１．０２ｇ（３．３８ミリモル）のビス−（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）ホスフィンを加え、続いてアセトニトリル／DMF（１／１）中に１．８４ｇ（２．６ミリモル）のアルコール３および５．８ｍＬ（２．６ミリモル）の０．４５Ｍテトラゾールを含んでいる溶液をゆっくり加えた。この混合物を２時間攪拌し、１２ｇの脱酸シリカゲルで処理し、濃縮し、そして勾配溶離（ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘプタン／酢酸エチル２／３）でクロマトグラフィー精製して０．３６ｇ（１６％）の無色の油４を与えた：
【０１３０】
【化６４】

【０１３１】
実験１．８ ４−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−安息香酸メチルエステル、化合物１１の合成（図３１ａ）
３．７３ｇ（２２ミリモル）の４−ヒドロキシメチル安息香酸メチルエステル（１０）および０．１６ｇ（２．２ミリモル）のテトラゾールのジクロロメタン５０ｍＬ中溶液に、７．４ｇ（２４．６ミリモル）のビス−（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）−ホスフィンのジクロロメタン２０ｍＬ中溶液を２０分間にわたって加えた。完全に加え終わったとき、その混合物を室温において１．５時間攪拌し、濃縮し、そしてクロマトグラフィー（痕跡量のトリエチルアミンを有するヘプタン／酢酸エチル４／１）により精製して５．０６ｇ（６３％）の１１を与えた：
【０１３２】
【化６５】

【０１３３】
実験１．９ １，３−ビス−［３’，５’−ビス（エチルオキシカルボニル）フェニルカルボニルアミド］−２−［（２’’−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）−ホスファニルオキシ］−プロパン、化合物９の合成（図３０ｂ）
１，３−ビス−［３’，５’−ビス（エチルオキシカルボニル）フェニルカルボニルアミド］−プロパン−２−オール、８の合成
トルエン１００ｍＬ中に懸濁された９．０ｇ（３４ミリモル）のジエチル−１，３，５−ベンゼントリカルボキシレート（７）および２滴のDMFの溶液に、５．６ｇ（３．８ｍＬ、４４ミリモル）のオキサリルクロリドをゆっくり加えた。この混合物を５．５時間攪拌し、水で中性になるまで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮し、そして減圧下で乾燥して９．６ｇの粗製酸クロリドを淡黄色の油として与えた。
【０１３４】
上記酸クロリドを２０ｍＬのクロロホルムに溶解し、そして１．４３ｇ（１５．７ミリモル）の１，３−ジアミノ−２−プロパノールおよび６．６ｍＬ（４７．７ミリモル）のトリエチルアミンのクロロホルム２０ｍＬおよびDMF５ｍＬ中の、０℃においてアルゴン下にある溶液にゆっくり加えた。完全に加え終わったとき、その混合物を室温まで加温し、２．５時間攪拌し、２ｘ５０ｍＬで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。その残分を４０ｇのシリカゲルと混合し、乾燥状態になるまで蒸発させ、そして勾配溶離（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル１／１乃至酢酸エチル）でクロマトグラフィー精製して４．２ｇ（３７％）の白色粉末状の８を与えた：
【０１３５】
【化６６】

【０１３６】
１，３−ビス−［３’，５’−ビス（エチルオキシカルボニル）フェニルカルボニルアミド］−２−［（２’’−シアノエチルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）−ホスファニルオキシ］−プロパン、化合物９の合成
１５．２ｍＬ（６．８２ミリモル）の０．４５Ｍテトラゾールのアセトニトリル中溶液に、２．６５ｇ（３．５７ｍＬ、２０．５ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンおよび２．６７ｇ（８．８７ミリモル）のビス（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエチルオキシ）ホスファン（phosphan）のアセトニトリル５ｍＬ中溶液を加えた。この混合物を１５分間攪拌し、次いで４．０ｇ（６．２８ミリモル）のアルコール８のジクロロメタン３０ｍＬおよびDMF５ｍＬ中懸濁液に加えた。この混合物を３時間攪拌し、１１ｇのシリカゲルで処理し、濃縮し、そして勾配溶離（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル４／１〜２／３）でクロマトグラフィー精製して３．１７ｇ（５９％）の９を淡黄色の発泡物として与えた：
【０１３７】
【化６７】

【０１３８】
実験１．１０ ４−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−安息香酸 Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド、化合物２２の合成（図３１ｄ）
４−ヒドロキシメチル安息香酸ヒドラジド、２０の合成
１．６６ｇ（１０．０ミリモル）のメチル ４−ヒドロキシメチルベンゾエート（１９）のエタノール２０ｍＬ中溶液に、３．０ｇ（６０ミリモル）のヒドラジン水和物を加えた。この混合物を２時間攪拌し、３．０ｇの追加のヒドラジン水和物を加え、そしてその混合物を一晩放置した。その沈殿を濾過し、エタノールで２回洗浄し、そして真空乾燥して２０を白色粉末として生成させた。（化合物についての文献：Yaroshenko, V.V.; Grekov, A.P.; Tkach, V.P.; Yakovenko, A.G.のIns. Khim. Vysokomol. Soedin. Sint. Fiz.-Khim. Palm., 1975, 1797；およびGaliano, R.; Joaquin, A.; Soria, A. (Instituto de Investigacion y Desarrollo Quimico Biologico, S.A., Spain). Span. (1993), 24pp. CODEN: SPXXAD ES 2039161 A1 19930816）。
【０１３９】
４−ヒドロキシメチル安息香酸 Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド、２１
１．４０ｇ（８．４ミリモル）のジヒドラジド２０のDMF２０ｍＬ中溶液に、４．９５ｇ（３８．４ミリモル、６当量）のジイソプロピルエチルアミンおよび５．５８ｇ（１８．５ミリモル、２．２当量）のモノメトキシトリフェニルメチルクロリドをゆっくり加えた。この混合物を２．５時間攪拌し、濃縮し、１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、２ｘ１００ｍＬの水および１００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして勾配溶離（痕跡量のトリエチルアミンを有するヘキサン／酢酸エチル１／１〜１／３）でクロマトグラフィー精製して白色粉末２１を与えた。
【０１４０】
４−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−安息香酸 Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド２２
１０ｍＬのジクロロメタン、１．０ｍＬのDMFおよび痕跡量のジイソプロピルエチルアミンの混合物中における０．５７ｇ（１．３ミリモル）のアルコール２１の溶液に、３．０ｍＬ（１．３ミリモル）の０．４５モル濃度テトラゾール、およびアセトニトリル５ｍＬ中のビス−（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキシ）−ホスフィン０．５５ｇ（１．６６ミリモル）で処理された、０．６５ｍＬ（３．９ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンのアセトニトリル３ｍＬ中溶液をゆっくり加えた。この混合物を３時間攪拌し、１５ｇの脱酸シリカゲルを加え、そしてそのスラリーを濃縮した。その残分を勾配溶離（痕跡量のトリエチルアミンを有するヘキサン／酢酸エチル１／１〜１／２）でクロマトグラフィー精製して２２を無色の粉末として与えた。
【０１４１】
実験１．１１ １，３−ビス−［３’，５’−ビス（エトキシカルボニル）−ベンジルオキシ］−５−［（２’−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−ベンゼン、化合物１５の合成（図３１ｂ）
０．５２ｇ（０．８５ミリモル）のアルコール１４（文献 prep.：J. Am. Chem. Soc., 1996, 118,8847）および０．３３ｇ（２．５５ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンのジクロロメタン５ｍＬ中溶液に、０．２３ｇ（０．９３ミリモル）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロ−ホスホロアミダイトを滴下した。この混合物を室温において１時間攪拌し、そして直ちに勾配溶離（ヘプタン〜ヘプタン／酢酸エチル１／１）でクロマトグラフィー精製して０．５１ｇ（７４％）の１５を淡黄色の油として与えた：
【０１４２】
【化６８】

【０１４３】
実施例２：保護されたヒドラジドホスホロ
アミダイト類を使用するオリゴ類の合成
概要：トリチル／ MMT ／ DMT 保護ヒドラジドアミダイト類（例えば、化合物１ａ、４、６、２２）を有するオリゴ類の合成：
オリゴ類（例えばDNA、RNA、PNA等々）は、自動化オリゴ合成装置で固相ホスホロアミダイト化学を用いて合成される。保護されたヒドラジドを有するホスホロアミダイトをアセトニトリル中０．１Ｍ溶液として適用し、そして標準的な活性化試剤およびカップリング時間を用いて配列中の所望とされる場所でカップリングさせる。
【０１４４】
上記のCPG結合オリゴ（１ミリモル）を１．５ｍＬの試験管に入れ、そして２．０ｍＬの濃NH₄OHで処理する。５５℃において２時間後に、そのアンモニア溶液を取り除き、減圧下で乾燥状態になるまで蒸発させる。その残分を１ｍＬの水に溶解させ、そして０．４５μｍのシリンジフィルターを通して濾過する。このトリチル保護ヒドラジドオリゴを前記実験について説明した逆相HPLCで精製する。生成物上にトリチルを含んでいる画分をプールし、そして乾燥状態になるまで蒸発させる。
【０１４５】
トリチル保護基の除去のために、上記オリゴを８０％酢酸で室温において３０分間処理する。その酸を真空中で除去し、そして残分を水に溶解させ、次いで酢酸エチルで２回抽出する。その水性層を再び乾燥し、再溶解させる。分析用HPLCは、通常、単一種の生成物（ある場合には二重ピークとして）示し、それは精製することなくさらなる反応に使用することができる。別法として、HPLC精製は前記の溶媒系を用いて行うことができる。
【０１４６】
便宜上、合成されたオリゴマーはそれらのオリゴ番号、例えば０１と称することにする。以下に記載される“dp”は脱保護ヒドラジドホスホロアミダイトであることを示す。
【０１４７】
実験２．１ オリゴ０９：ヒドラジド−１５ mer ：（ dp 1a-TTT TTT TTT TTT TTT-3' ）の合成
合成および脱保護をアミダイト化合物１ａに関して説明したように行った。そのトリチル保護ヒドラジドオリゴを、緩衝液Ａとして０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中７５％のアセトニトリルを使用するMerck LiChrospher RP 18カラム、１０μＭ（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）を用いて逆相HPLCにより精製した。分析分離および調製分離に１００分で０％Ｂ〜１００％Ｂの勾配を用いた。トリチルＯＮ生成物は記載した条件下で４２．２分に溶離する。オリゴ９は２５．６分に溶離する（二重ピーク）。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：４７０９．１５、実測値：４７０９．５。
【０１４８】
実験２．２ オリゴ１０：ヒドラジド１９ mer ：（ dp-1a-dGA TGA GCA GTT CTA CGT GG-3' ）
合成および脱保護をアミダイト化合物１ａに関して説明したように行った。HPLCを実験２．１におけるように行った。トリチルＯＮ生成物は、記載した条件下で４１．５分に溶離する。オリゴ１０は２５．１分に溶離する（単一ピーク）。HRMS（ESI）：Ｍ計算値：６０９２、実測値：６０９２。
【０１４９】
実験２．３ オリゴ３１（ dp-1a- TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１ａを用いて上に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを上記で概説したように処理した。トリチル保護ヒドラジドオリゴを、緩衝液Ａとして０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液中９５％のアセトニトリルを使用するPhenomex Luna Phenyl Hexyl RP 18カラム、１０μｍ（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）を用いて逆相HPLCにより精製する。勾配は８０分で２０％Ｂ…１００％Ｂであった。ヒドラジドオリゴは１６．８８分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５２１７、実測値：５２１４。
【０１５０】
実験２．４ オリゴ３２（ dp-6-ACA ACA ATT TGA AGC TTC TGT AAT TTT G-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物６を用いて、上に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを上記で概説したように処理した。トリチル保護ヒドラジドオリゴを、緩衝液Ａとして０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液中９５％のアセトニトリルを使用するPhenomex Luna Phenyl Hexyl RP 18カラム、１０μｍ（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）を用いて逆相HPLCにより精製する。勾配は１００分で０％Ｂ…１００％Ｂであった。ヒドラジドオリゴは３６．５８分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５４３９、トリチルを有する、実測値：５８３７。
【０１５１】
実施例３：ヒドラジドエステル前駆体
ホスホロアミダイト類を用いるオリゴの合成
概要：前駆体形（例えば、図９Ｂ、反応式２の化合物１ｂのようなエステル：図１７Ｂも参照されたい）を含むホスホロアミダイト類を用いるオリゴ類のヒドラジド官能基を合成する現場生成：
オリゴ類は自動化オリゴ合成装置で固相ホスホロアミダイト化学を用いて合成される。ヒドラジドの前駆体形を有するホスホロアミダイトを、アセトニトリル中０．１Ｍ溶液として適用し、そして標準的な活性化試剤およびカップリング時間を用いて、配列中の所望とされる場所でカップリングさせる。ヒドラジド前駆体のみならず、酸に不安定な保護基で標識されたヒドロキシル基を含んでいるホスホロアミダイトの使用は、ヒドラジドの前駆体形がオリゴ合成の条件に対して安定であり、同時に反応性ヒドラジドは、ヒドラジンとのインキュベーションまで形成されないので、オリゴの任意の位置におけるヒドラジドの導入を可能にする。
【０１５２】
上記のCPG結合オリゴ（１ミリモル）を５０ｍｇのジエチルアミンのジクロロメタン３．５ｍＬ中溶液で処理する。一晩インキュベートした後（暗中）、その上澄み液を除去し、そして支持体結合オリゴをジクロロメタンで数回洗浄し、そして真空乾燥する。
【０１５３】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の開裂、オリゴの５’−末端におけるエステルのヒドラジドへの転化、およびオリゴの支持体からの開裂（図１７Ｂ）のために、結合オリゴを有するCPGを１ｍＬの２４％ヒドラジン水和物で処理する。４℃において一定攪拌下で１８時間後に反応は完了する。オリゴのヒドラジン溶液からの単離は、逆相抽出（例えば、Sep-PakまたはHPLC）により達成することができる。
【０１５４】
C18 Sep-Pakカートリッジ（０．５ｇのWaters、Ｎｏ．２０５１５）を、１０ｍＬのアセトニトリルで、次いで１０ｍＬの０．１Ｍトリエチルアンモニウム・ビカーボネート緩衝液、ｐＨ７．０（TEAB）で洗浄することによって活性化する。ヒドラジン溶液を５倍容量のTEABで希釈し、そしてカートリッジに適用する。オリゴをSep-Pakカラムに結合させた後、残留ヒドラジンを１０ｍＬのTEABで洗い落とす。次に、オリゴをカラムからTEAB／アセトニトリル（１：２）を用いて溶離させる。オリゴ含有画分をプールし、そして乾燥状態になるまで蒸発させる。生成物のRP-HPLCキャラクタライゼーションおよび精製には、上記の２．１または２．３に記載された同じ条件を適用することができる。
【０１５５】
以下に記載される“hz”は、ヒドラジン処理されたヒドラジド前駆体ホスホロアミダイトであることを示す。
実験３．１ オリゴ１１（ hz-1b-GA TGA GCA GTT CTA CGT GG-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１ｂを用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを上記で概説したように処理し、そして生成物をRP-HPLCにより精製した。ヒドラジドオリゴは実施例２．１で説明されたHPLC条件下で３１．８分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：６５９９．７、実測値：６５９８±２。
【０１５６】
次の実験について、CPG結合オリゴ（１μモル）を５０ｍｇのジエチルアミンのジクロロメタン３．５ｍＬ中溶液で処理する。一晩（暗中）インキュベートした後、上澄み液を除去し、そして支持体結合オリゴをジクロロメタンで数回洗浄し、そして真空乾燥する。
【０１５７】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の開裂、ヒドラジド前駆体（例えばエステル）のヒドラジドへの転化、およびオリゴの支持体からの開裂のために、結合オリゴを有するCPGを１ｍＬの２４％ヒドラジン水和物で処理する。４℃において一定攪拌下で１８時間後に反応は完了する。オリゴのヒドラジン溶液からの単離は逆相抽出（例えば、Sep-PakまたはHPLC）により達成することができる。
【０１５８】
C18 Sep-Pakカートリッジ（０．５ｇのWaters、Ｎｏ．２０５１５）を、１０ｍＬのアセトニトリルで、次いで１０ｍＬの０．１Ｍトリエチルアンモニウム・ビカーボネート緩衝液、ｐＨ７．０（TEAB）で洗浄することによって活性化する。ヒドラジン溶液を５倍容量のTEABで希釈し、そしてカートリッジに適用する。オリゴをSep-Pakカラムに結合させた後、残留ヒドラジンを１０ｍＬのTEABで洗い落とす。次に、オリゴをカラムからTEAB／アセトニトリル（１：２）を用いて溶離させる。オリゴ含有画分をプールし、そして乾燥状態になるまで蒸発させる。生成物のRP-HPLCキャラクタライゼーションおよび精製には、実施例２．３に記載された同じ条件が適用された。
【０１５９】
実験３．２ オリゴ３３（ hz-11-TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１１を用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを６０分で１０％Ｂ…７０％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは２６．６０分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５２３６、実測値：５２３４。
【０１６０】
実験３．３ オリゴ３４（ hz-1c-TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１ｃを用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを４５分で２５％Ｂ…７０％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは１６．８７分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５２９５、実測値：５２９３。
【０１６１】
実験３．４ オリゴ３７（ hz-9-TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物９を用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを４５分で２５％Ｂ…７０％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは１１．１５分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５６０１、実測値：５５９９。
【０１６２】
実験３．５ オリゴ３８（ hz-9-ACA ACA ATT TGA AGC TTC TGT AAT TTT -Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物９を用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを６０分で１０％Ｂ…７０％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは２３．５５分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：９６７７、実測値：９６７４。
【０１６３】
実験３．６ オリゴ３９（ hz-15-TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１５を用いて、前に説明したように行った。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを４５分で２５％Ｂ…７０％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは１６．８７分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５２９５、実測値：５２９３。
【０１６４】
実施例４：核酸オリゴ用の分枝用構造結合部分の製造
概要：分枝用オリゴの合成
複数のヒドラジドをオリゴに導入するために、分枝用ホスホロアミダイト類、ヒドラジドに転化される２個以上のエステル基を有するホスホロアミダイト類、並びに両アプローチの組み合わせを用いた。ヒドラジド前駆体ホスホロアミダイト類は、実施例３で説明されたようにヒドラジドに転化される。この柔軟性のある方策は、１個〜数十個（〜４０個）の間のヒドラジド類の規定された数を有するオリゴの合成を可能にする。以下の実施例５の実験はp-RNAオリゴについての方法を説明するもので、DNAのような他のオリゴにも適用可能である。
【０１６５】
実験４．１ オリゴ３５（ hz-(1c) ₂ SBA-TTT TTT TTT TTT TTT-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１ｃをヒドラジド前駆体として用いて、上記の一般的手法において説明したように行い、そして表２の化合物４である合成分枝用アミダイト（SBA）を分枝用構成単位として用いた。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを８０分で２０％Ｂ…１００％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは１６．５７分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：５７３３、実測値：５７３２。
【０１６６】
実験４．２ オリゴ３６（ hz-(1c) ₂ SBA-ACA ACA ATT TGA AGC TTC TGT ATT TTT G-Cy3 ）の生成
オリゴの合成を、化合物１ｃをヒドラジド前駆体として用いて、上記の概要法において説明したように行い、そして表２の記載Ｎｏ．４の化合物である合成分枝用アミダイト（SBA）を分枝用構成単位として用いた。Cy3色素を付加したCPG支持体を用いて、オリゴの３’末端に蛍光体を標識として付けた。CPG結合オリゴを前記で概説したように処理した。RP-HPLCを８０分で２０％Ｂ…１００％Ｂの勾配で行った。ヒドラジドオリゴは１３．４３分に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：９８０９、実測値：９８０７。
【０１６７】
実施例５：分枝および非分枝結合部分を有するpRNAオリゴの製造
実験５．１ p-RNA オリゴの合成
p-RNAオリゴの合成を、次の点を除外および修正して、Miculka, C.; Windhab, N.; Brandstetter, T.; Burdinski, G.のPCT特許出願第ＷＯ９９／１５５４０号（１９９９年）に記載されるように行う：ペントピラノシルヌクレオシド類のホスホロアミダイト類をKOH上で真空乾燥し、そして乾燥アセトニトリルに溶解して０．１Ｍ溶液を与える。この溶液を新しく活性化した分子篩（３Å）上で３時間乾燥し、次いでPE Biosystems Expedite 8905 DNA合成装置での固相オリゴ合成に使用する。他のホスホロアミダイト類を乾燥アセトニトリルに０．１Ｍで溶解し、そしてそれ以上処理せずに使用する。モノメトキシトリチル保護Cy3（CAS：182873-80-9、AP-Biotech社、Freiburg、ドイツ）が装填された特注CPG支持体を用いての２’−末端にCy3色素を有するp-RNAオリゴ類には、無水塩酸ピリジニウムの乾燥アセトニトリル中０．１Ｍ溶液を活性化剤として用いる。ペントピラノシルヌクレオシド類の脱トリチル化時間を１０分に延ばし、またカップリング時間を２５分に延ばす。他の全ての試剤と溶液および手法は器械メーカーの推奨による。
【０１６８】
実験５．２ p-RNA オリゴの脱保護
β−シアノエチル保護基の開裂のために、オリゴをジエチルアミンのジクロロメタン中１．５％（重量／容量）溶液で室温において一晩処理する（暗中）。その上澄み液を除去し、そして支持体結合オリゴをジクロロメタンで数回洗浄し、そして真空乾燥する。
【０１６９】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の開裂、オリゴの５’−末端におけるエステルのヒドラジドへの転化、およびオリゴの支持体からの開裂のために、結合オリゴを有するCPGを１ｍＬの２４％ヒドラジン水和物で処理する。４℃において一定攪拌下で１８時間後に反応は完了する。オリゴのヒドラジン溶液からの単離は、逆相抽出（例えば、Sep-PakまたはHPLC）により達成することができる。
【０１７０】
C18 Sep-Pakカートリッジ（０．５ｇのWaters、Ｎｏ．２０５１５）を、１０ｍＬのアセトニトリルで、次いで１０ｍＬの０．１Ｍトリエチルアンモニウム・ビカーボネート緩衝液、ｐＨ７．０（TEAB）で洗浄することによって活性化する。ヒドラジン溶液を５倍容量のTEABで希釈し、そしてカートリッジに適用する。オリゴをSep-Pakカラムに結合させた後、残留ヒドラジンを１０ｍＬのTEABで洗い落とす。次に、オリゴをカラムからTEAB／アセトニトリル（１：２）を用いて溶離させる。オリゴ含有画分をプールし、そして乾燥状態になるまで蒸発させる。生成物のキャラクタライゼーションおよび精製は、緩衝液Ａとして０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中７５％のアセトニトリルを使用するMerck LiChrospher RP 18カラム、１０μＭ（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）を用いて逆相HPLCにより達成される。分析分離および調製分離に１００分（HPLC法Ａ）または３０分（HPLC法Ｂ）で０％Ｂ〜１００％Ｂの勾配を用いる。
【０１７１】
実験５．２．１ オリゴ１２：１個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-hz-1b-TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護をアミダイト化合物１ｂに関して説明したように行った。
【０１７２】
実験５．２．２ オリゴ１３：３個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-hz-1b-TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護をアミダイト化合物１ｄに関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で３７．９分（HPLC法Ａ）に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：３５１６．６、実測値：３５１５。
【０１７３】
実験５．２．３ オリゴ１４：４個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-hz-(1c) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、アミダイト化合物１ｃに関して、および対称分枝用ホスホロアミダイト（SBA；Clontech社、Ｎｏ．５２５２−２）に関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で３７．３分（HPLC法Ａ）に溶離する。LRMS（MALDI）：Ｍ計算値：３７８４．７、実測値：３７８４。
【０１７４】
実験５．２．４ オリゴ１５：８個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-hz-(1c) ₄ (SBA) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、アミダイト化合物１ｃに関して、および対称分枝用ホスホロアミダイト（SBA；Clontech社、Ｎｏ．５２５２−２）に関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で３６．９分（HPLC法Ａ）に溶離する。LRMS（MALDI）：Ｍ計算値：４６６１．１、実測値：４４６４。
【０１７５】
実験５．２．５ オリゴ１６：スペーサーおよび８個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-hz-(1c) ₄ (SBA) ₂ (SBA)(S18) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、アミダイト化合物１ｃに関して、および対称分枝用ホスホロアミダイト（SBA；Clontech社、Ｎｏ．５２５２−２）およびスペーサー１８（Ｓ１８、Glen research社、No. 10-1918-02）に関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で３８．７分（HPLC法Ａ）に溶離する。
【０１７６】
実験５．２．６ オリゴ１７：１６個のヒドラジドを有する Cy3 標識 p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'(1c) ₈ (SBA) ₄ (SBA) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、アミダイト化合物１ｃに関して、および対称分枝用ホスホロアミダイト（SBA；Clontech社、Ｎｏ．５２５２−２）に関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で３８．７分（HPLC法Ａ）に溶離する。
【０１７７】
実験５．２．７ オリゴ１８：４個のヒドラジドを有する p-RNA オリゴ（ Cy3 色素なし）： p-RNA オリゴ 4'-(1c) ₂ (BSA) TAG GCA TT-2'
合成および脱保護をアミダイト化合物１ｃに関して説明したように行った。生成物は説明した条件下で１２．７５分（HPLC法Ｂ）に溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：３２７５．１、実測値：３２７５．４。
【０１７８】
実験５．３ オリゴ２６：保護ヒドラジドホスホロアミダイトを用いるモノヒ ドラジド pRNA の製造： pRNA オリゴ 4'-dp-6-AGA CGT AGA G-Cy3-2'
β−シアノエチル保護基の開裂のために、オリゴをジエチルアミンのジクロロメタン中１．５％（重量／容量）溶液により室温において一晩処理した（暗中）。その上澄み液を除去し、そして支持体結合オリゴヌクレオチドをジクロロメタンで数回洗浄し、そして真空乾燥した。
【０１７９】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の開裂およびオリゴの支持体からの開裂のために、結合オリゴを有するCPGを１ｍＬの２４％ヒドラジン水和物で処理した。４℃において一定攪拌下で１８時間後に反応は完了した。オリゴのヒドラジン溶液からの単離を、逆相抽出（例えば、Sep-PakまたはHPLC）により達成した。
【０１８０】
C18 Sep-Pakカートリッジ（０．５ｇのWaters、Ｎｏ．２０５１５）を、１０ｍＬのアセトニトリルで、次いで１０ｍＬの０．１Ｍトリエチルアンモニウム・ビカーボネート緩衝液、ｐＨ７．０（TEAB）で洗浄することによって活性化した。ヒドラジン溶液を５倍容量のTEABで希釈し、そしてカートリッジに適用した。オリゴをSep-Pakカラムに結合させた後、残留ヒドラジンを１０ｍＬのTEABで洗い落とした。次に、オリゴをカラムからTEAB／アセトニトリル（１：２）を用いて溶離させた。オリゴ含有画分をプールし、そして乾燥状態になるまで蒸発させる。生成物のキャラクタライゼーションおよび精製を、緩衝液Ａとして０．１Ｍ、ｐＨ＝７．０のトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中７５％のアセトニトリルを使用するPhenomex Luna Phenyl Hexyl RP 18カラム、１０μＭ（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）を用いて逆相HPLCにより達成した。
【０１８１】
トリチル保護基の除去のために、オリゴを８０％酢酸で室温において３０分間処理した。その酸を真空中で除去し、そしてその残分を水に溶解させ、次いで酢酸エチルで２回抽出した。その水性層を再び乾燥し、そして再溶解させた。分析用HPLCは、通常、単一種の生成物を（ある場合には二重ピークとして）示し、それは精製することなくさらなる反応に使用することができる。８０分で２０％Ｂ…１００％Ｂの勾配を用いると、生成物は１６．８３分で溶離する。LRMS（ESI）：Ｍ計算値：４０５５、実測値：４０５３。
【０１８２】
実施例６：ヒドラジドオリゴのボロネートオリゴへの転化
概要：ヒドラジドオリゴのボロネートオリゴへの転化手法
５０ミリモルのヒドラジドオリゴを２００μＬのｐＨ４．０、１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に溶解し、そしてヒドラジド１当量につき１５当量の４−ホルミルフェニルボロン酸（Aldrich社、No. C43,196-6；CAS: 87199-17-5）を加える。例えば４個のヒドラジドを含んでいるオリゴでは、４−ホルミルフェニルボロン酸のDMSO（３μモル）中０．１Ｍ溶液３０μＬを使用する。この混合物を室温で１時間インキュベートし、４−ホルミルフェニルボロン酸１当量当たり２０当量のNaCNBH₃を加え、そしてインキュベーションを室温でもう１時間続ける。例えば４個のヒドラジドを有するオリゴでは、NaCNBH₃の、ｐＨ４の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中１Ｍ溶液（１ｍＬに６．３ｍｇ溶解）１５０μＬ（１５０μモル）が必要である。
【０１８３】
過剰の４−ホルミルフェニルボロン酸およびナトリウム・シアノボロヒドリドの除去は、HPLC、ゲル濾過（Pharmacia PD１０カラム）または固相抽出（Merck LiChroluteカラム）によって行われる。ボロネート（boronate）修飾オリゴについては、端部キャップ付きHPLCカラムを用いることが非常に重要である。典型的な条件は、緩衝液ＡとしてｐＨ＝７．０の０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）を、緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中７５％のアセトニトリルを使用する５μＬのPhenomenex Luna Phenyl Hexylカラム（分析用：４．６ｘ２５０ｍｍ、流量＝１．０ｍＬ／分；調製用：１０ｘ２５０ｍｍ、流量＝３．０ｍＬ／分）である。分析分離および調製分離に１００分（HPLC法Ａ）または３０分（HPLC法Ｂ）で０％Ｂ〜１００％Ｂの勾配を用いる。生成物含有画分をプールし、そして乾燥状態まで蒸発させる。
【０１８４】
実験６．１ オリゴ１９：１個のボロネートを有する p-RNA ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１２を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。
【０１８５】
実験６．２ オリゴ２０：３個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) ₃ TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１３を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。
【０１８６】
実験６．３ オリゴ２１：４個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) ₄ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１４を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。
【０１８７】
実験６．４ オリゴ２２：８個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) ₈ (SBA) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１５を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。生成物は記載した条件下で４６．３分（HPLC法Ａ）に溶離する。
【０１８８】
実験６．５ オリゴ２３：スペーサー１８および８個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) ₈ (SBA) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１６を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。
【０１８９】
実験６．６ オリゴ２４：１６個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) ₁₆ (SBA) ₄ (SBA) ₂ (SBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１７を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。生成物は記載した条件下で４９．０分（HPLC法Ａ）に溶離する。
【０１９０】
実験６．７ オリゴ２５：１個のボロネートを有する p-RNA オリゴ： p-RNA オリゴ 4'-(PBA) TAG GCA TT(Cy3)-2'
合成および脱保護を、出発物質としてオリゴ１８を用いて、上記の一般的プロトコルで説明されるように行った。
【０１９１】
実施例７：HPLC分析
ヒドラジドオリゴの合成が終わったとき、実験の第一の組みでNHSエステルまたはスルホ−NHSエステルを有するヒドラジド標識オリゴの溶液反応動力学が調べられた。５μＬの１３２μＭヒドラジドATA5の５０ｍＭヒスチジン３０μＬ中溶液に、５μＬの１０ｍＭ NHSアクリレートを加えた。この溶液を室温で短時間攪拌し、次いでHPLC装置系に注入した。その溶液中の化合物類のHPLCトレースは、反応混合物中に所定反応時間の間存在するヒドラジドATA5およびＮ’アクリロ−ATA5ジヒドラジドの量であることを示した。出発ATA5ヒドラジドおよび修飾されたATA5ヒドラジドの保持時間は、明瞭かつ分離可能であった。
【０１９２】
図１０Ａ−Ｃは反応混合物の３つの別個のトレースを示す。第一のトレース（Ａ）は、無修飾ATA5ヒドラジドＡから得られたものであり、そして第三のトレース（Ｃ）は、NHSアクリレートとの５分の反応時間後の完全修飾ATA5ヒドラジド（Ｂ）を表す。中央のトレース（Ｂ）は、反応に１分捕獲された不完全修飾のものを表す。ATA5ヒドラジドの近似消費を仮定すれば、疑一次反応速度は１２００Ｍ^-1秒^-1となる。
【０１９３】
用いられた他の結合系に対するこの速度の比較が図１１に示される。NHSエステルについての、水性環境におけるヒドラジドとの反応速度は、例外的に効率的な反応であることを表している。さらに、ヒドラジド修飾のｐＨ依存性を決定するために反応のｐＨが変えられた。実験は、HClでｐＨ＝６、５．５、５．０、４．５および４に調整された５０ｍＭヒスチジンの緩衝系を用いて行われた。しかし、ｐＨ＝４ではヒドラジドオリゴは影響を受けず、形質転換を構成せず、従ってｐＨの下限は約４．５である。
【０１９４】
実施例８：電子的に処理できるマイクロチップ
ディバイスに対するヒドラジドオリゴの結合
概要：電子的にアドレス指定可能なマイクロチップの製造
電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ［Nanogen, Inc., La Jolla, CA州］を含むマイクロアレイをアルゴン下で５分プラズマ洗浄する。次に、１ｃｍｘ１ｃｍの２５サイトチップ（25 site chips）を気相堆積法を用いてシラン化する。このマイクロアレイの中央に、０．３％のDaracur 4265をＵＶ開始剤として有する、９：１（モル比）のアクリルアミド／ビアクリルアミドの１：１DMSO／H₂O中２０％（質量）溶液０．１０μＬを加える。そのチップを、そのマイクロアレイサイトが４平方μｍのキャビティを含んでいる一辺３ｍｍのＵＶ窓に押しつけられるマイクロ反応（microreaction）成形装置系に入れる。上記溶液にＵＶ光を２０秒間照射し、それを成形装置系から取り外し、水で洗浄し、そして風乾する。そのウエル（well）はマイクロアレイを覆う四角のヒドロゲル層をなす。そのモールドのパラメーターを超える過剰の重合を除く。
【０１９５】
存在する透過層に１０／８３／７（モル比）のNHSまたはスルホ-NHS/Am/Bisを２０％（質量）単量体濃度で含んでいる溶液０．８０μＬを加え、そして存在する重合体を１分間飽和させる。そのチップをマイクロ反応成形装置系上に載せ、そして直径４．６ｍｍおよびウエルの深さ５μｍを有する環状モールドを用いて上記のように重合させる。この第二のモールドは存在する四角の層を完全に包囲し、かつその層を越えて広がっている。第二の層の付着は重合体鎖の差し込みによって成し遂げられ、シランを結合する。それらチップを水で洗浄し、そして圧縮空気で乾燥し、続いて次の実験で試験する。
【０１９６】
実験８．１：活性エステル濃度および標識捕獲手段処理
０、１、２および４％のスルホ-NHSを含んでいる上記の２重透過層で修飾されたチップに、５００ヒドラジド-T12-BTR（Bodipy Texas Red）を特異性標識捕獲手段（specific labeled capture）として電子的に装填し、一方５０ｍＭ ｎＭビオチン-T12-BTRを非特異性標識捕獲手段として用いた。溶液を全て５ｍＭヒスチジンで緩衝剤処理した。捕獲手段を、５００ｎＡ／パッドの電流において、１２０秒間、一度に４パッドずつ処理した。各チップを１％SDS、０．２ｘSTEで洗浄し、そして１％SDS中に２０分間浸漬した。これらのチップを１秒間画像形成させ、そして平均MFI値を記録した。
【０１９７】
図１２に見ることができるように、標識されたヒドラジドオリゴの共有結合は透過層中の活性エステルに依存し、濃度が高まるにつれて増加する。ビオチン標識されたオリゴの非特異性結合もかなり低く、この実験の場合平均４０MFI／秒である。
【０１９８】
実験８．２：電子的条件および透過層の結合
１０％のNHFまたはスルホ-NHSを含んでいる上記の２重透過層で修飾されたチップに、５００および５ｎＭヒドラジド-T12-BTRを特異性標識捕獲手段として電子的にローディングした。５００ｍＭ ｎＭビオチン-T12-BTRを非特異性標識捕獲手段として用いた。溶液を全て５ｍＭヒスチジンで緩衝剤処理した。捕獲手段を、４００、５００、６００、７００および８００ｎＡ／パッドの電流において、１２０秒間、一度に３パッドずつ処理した。非特異性捕獲手段は８００ｎＡ／パッドで装填された。各チップを１％SDS、０．２ｘSTEで洗浄し、そして１％SDS中に２０分間浸漬した。これらのチップに１秒間画像形成させ、そして平均MFI値を記録した。
【０１９９】
図１３に見ることができるように、NHD修飾透過層に対する特異性捕獲手段の結合は６００ｎＡにおいて劇的に増加し、一方スルホ-NHS修飾ヒドロゲルは最大結合について僅かに高い電流を必要とする（図１４）。
【０２００】
実験８．３：複数の結合部分のオリゴに及ぼす効果
１０％のNHFを含んでいる上記の２重透過層で修飾されたチップに、１、２、４または８個のヒドラジド部分を含んでいるCy3標識ATA5オリゴをローディングした。この４種のオリゴマーを、５００ｎＭにおいて、７００か８００ｎＡ／パッドのいずれかの電流を用いて１２０秒間電子的にアドレス指定化処理をし、５０ｍＭヒスチジンで緩衝剤処理した。完了したとき、これらのチップを洗浄し、そして結合レベルを測定した。
【０２０１】
記録されたMFI／秒値は図１５に示される。オリゴマー１個当たりの、結合に有効なヒドラジド部分の数の与えられた等しい電流における比較は、オリゴマー上のヒドラジド数の増加と共に結合レベルが高くなることを示している。
【０２０２】
実験８．４：リバースドット−ブロット（ reverse dot-blot ）電子ハイブリダイゼーション
１５％のNHFを含んでいる上記の２重透過層で修飾されたチップに、Cy3標識を特異性捕獲手段として有するオクタヒドラジドATA5オリゴマーをローディングした。この特異性捕獲手段は、５００ｎＭにおいて、６００か７００ｎＡ／パッドのいずれかの電流を用いて１２０秒間ローディングされ、５０ｍＭヒスチジンで緩衝剤処理された。電子ハイブリダイゼーションは、５ｎＭのRCA5-T12-Cy5を特異性標的として用いて行われ、一方５ｎＭのRCA4-Cy5の溶液が非特異性標的として用いられた。これらの標的を４００ｎＡ／パッドにおいて６０秒間ローディングし、それらチップを標準のプロトコルに従って洗浄し、そして画像形成した。
【０２０３】
図１６に与えられるデータは、特異性標的の非特異性標的に対する優先ハイブリダイゼーションを示している。上記で記録されたデータに一致して、捕獲手段の電子装填について６００から７００ｎＡまでの電流増加は、ハイブリダイゼーションの増加をもたらすことにも留意されるべきである。
【０２０４】
実施例９：非共有結合部分を有する巨大分子の合成
図４並びに図５ＡおよびＢは、複数の結合部分を含んでいるオリゴの合成を描くものである。図４には、オリゴ合成が描かれており、この場合２個のPBAを含んでいる単一の分枝したホスホロアミダイトが付加されている。図５ＡおよびＢは、４個のPBAを有する２個の枝、および８個のPBAを有する３個の枝をそれぞれ示している。描かれた合成はABI394 DNA合成装置で行われた。分枝ホスホロアミダイトの段階的カップリング収率は通例のヌクレオチドホスホロアミダイト類と同様で、約９６−９８％であった。PBAホスホロアミダイトは最後の工程で適用された。オリゴ類の固体支持体からの開裂および保護基の除去は、この技術分野の当業者によく知られている通例のオリゴ類の処理と同じであった。オリゴ上でヒドラジド部分からPBA部分を現場生成させる代替法についての前記実施例６を参照されたい。
【０２０５】
PBAを含む分枝オリゴはHPLCで精製および分析された。PBA含有オリゴのHPLCは、通例のオリゴのピークよりも広いピークを示した。
実験９．１：非共有結合部分を介してのオリゴの電子的ローディング
２０ｎＭの非分枝および分枝PBA含有ATA5捕獲プローブを、ヒドロゲル基材上に電子的にローディングした。これらの捕獲プローブを５０ｍＭのヒスチジン中に一度に１０パッドずつ１２０秒間ローディングした。２０ｎＭのRCA5-BTRを５分間受動的に（passively）ローディングした。これら基材を洗浄し、そして画像形成した。分析は、分枝および非分枝の両捕獲プローブが所望のとおり透過層に固定されたことを示した。
【０２０６】
実験９．２：非共有結合部分を有する電子的ローディング巨大分子の安定性
オリゴ２０、２１および２２（３、４および８個のPBA結合部位を含むp-RNA）を、SHA修飾ヒドロゲルチップに対して電子的にアドレス指定化処理をした。完了したときに、前記の標準洗浄手順の後に初期画像を記録した。次に、これらのチップアレイを１０μＬの５０ｍＭヒスチジンでの反復洗浄による規則的洗浄に付した。５回の洗浄後に画像を記録した。図２１に示される結果は２つ特長を含む。第一に、オリゴ１個当たりより多数の結合部位を有するより高次のデンドリマーに記録された信号は明確により高い。また、この信号は２５回の洗浄サイクルにわたってかなり安定で、デンドリマー結合系使用の改善された安定性を例証している。オリゴ２２はその初期信号の約１４％を失い、一方オリゴ２０および２１はそれぞれ２５％および３５％減少した。
【０２０７】
実施例６：複数ヒドラゾン形成による共有結合
単一のアミンまたはヒドラジドにより修飾されたオリゴ類は、アルデヒド修飾ヒドロゲル類上に電子的にローディングすることができる。アルデヒドとアミンまたはヒドラジドとの相互作用の結果として、アミン（窒素に二重結合を有する炭素）またはヒドラゾンがそれぞれ形成される。これらの反応は水性条件下で可逆的であって、安定な不可逆性共有結合を形成させるにはNaBH₃CNによるさらなる還元が必要とされる。実際、単一のヒドラジドを含むオリゴマーの電子濃度は、オリゴマーをヒドラゾン形成によって表面に結合させた。還元工程をなくすことは、結合したオリゴがアレイの多くの用途に関連する時間内に拡散で離散してしまう、比較的容易に加水分解される不安定な結合をもたらした。
【０２０８】
デンドリマーヒドラジドの使用は、オリゴ１個につき形成されるヒドラゾンが十分な数であるとすれば、さらなる還元を必要としない幾らか不安定な結合による共有結合の手段となる。可逆的なヒドラゾン形成は一部の結合部位により起こり得、一方他の結合部位はそのままになっている（図２２）。そのヒドラジドは拡散することができず、アルデヒドリッチの環境内に閉じ込められ、容易に再形成可能である。この平衡は、オリゴ１個当たりの増加した結合部位数を利用して、全ての結合が一度には加水分解しないとの条件で、安定な結合系を与えようとするものである。アルデヒドリッチの透過層はグリオキシルアガロースにおけるように直接製造することもできるし、或いはアセタール修飾透過層から得ることもできる。後者では、アセタール部分は酸の存在下で容易に加水分解されてアルデヒドをもたらす。アセタールは保護基として働き、アルデヒド官能基を活性化が望まれるまで保存する。加水分解は酸性条件に対する１時間の暴露により、または希薄塩溶液で緩衝剤処理された緩和な電流に付すことによって完了させることができる。後者の方法は、陰極で生成した酸を利用することによって部位特異性加水分解をさせる。
【０２０９】
実験９．１：グリオキシルアガロースに結合されたデンドリマーヒドラジドオリゴマー
標準の２５サイトチップにグリオキシルアガロース（FMC社、Princeton、NJ州）を回転塗布した。１、２、４および８個のヒドラジドを含む５００ｎＭのヒドラジドCy3標識オリゴを、５０ｍＭのヒスチジンで緩衝剤処理して５００ｎＡ／パッドにおいて各々２分間電子的にローディングした。これらチップを確立された手順により洗浄し、そして画像形成した。記録されたMFI／秒が図２３に示される。１個または２個のヒドラジドを有するオリゴはかなり不安定で、予想されるように、バックグランドノイズ以上の検出可能な蛍光をほとんど与えなかった。それより多い数のヒドラジドを有するオリゴは、アルデヒド修飾表面と安定な共有結合を形成することができる。
【０２１０】
実験９．２：アセタール修飾ヒドロゲルに結合されたデンドリマーヒドラジドオリゴマー：脱保護および共有結合
電子的にアドレス指定可能な２５アレイサイトマイクロチップを、１５：２：３比のアクリルアミド、ビスアクリルアミドおよびビニルアセタールより構成される単一層ヒドロゲルで修飾した。選択した部位を、５０ｍＭのNaCl溶液中で、３００ｎＡ／パッドの電流において２分間活性化してアセタール官能基を加水分解し、アルデヒドを露出させた。オリゴ１個につき８個のヒドラジドを含むデンドリマーヒドラジドオリゴマーを、５０ｍＭのヒスチジンで緩衝剤処理して、活性化済みパッドおよび活性化されていないパッドに、５００ｎＡ／パッドで２分間電子的にローディングした。非特異性オリゴもアセタールおよびアルデヒド修飾された両部位上に電子的にローディングした。標準洗浄サイクル後に、それらチップを画像形成させた。記録されたMFI／秒データは図２４に示される。
【０２１１】
図２４に見ることができるように、電子的に活性化され、次いでデンドリマー標識オリゴマーが電子的にローディングされたパッドは最高の蛍光信号を示す。興味深いことに、予備処理されず、アセタールとして留まっているそのようなパッドもヒドラジド修飾オリゴマーのある種の結合を示す。多分、オリゴマーを濃縮するために適用された電流が、局所的にヒスチジンの緩衝能力を超えるに十分なほど酸を生成させ、従って有意な量のアセタール部分を加水分解することができた。
【０２１２】
実施例１０：非基材表面カップリング反応における
ヒドラジド修飾オリゴの使用：標識付け等々
実験１０．１：ヒドラジド− 15mer ９とベンジルオキシアセトアルデヒドとの反応；図１９
１０μモルのヒドラジドオリゴ９を、６０μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解させた。１滴のベンジルオキシアセトアルデヒド（CAS：6065-87-2；C9H10O2 [150.1760]; Aldrich社、No. 28,218-3）を加え、その混合物を室温で１時間放置した。その溶媒と過剰のアルデヒドを真空中で除去し、そして生成物をHPLC（カラム：Merck LiChrospher RP 18；１０μＭ、４ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ＝７．０、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中７５％アセトニトリル；流量＝１．０ｍＬ／分；勾配：１００分で０％Ｂ〜１００％Ｂ）で分析した。この生成物の保持時間は３０．７分で、オリゴ９は２５．５分で溶離する。
【０２１３】
実験１０．２：オリゴ１０とペプチドとの連結反応、図２０
４．４ｎモルのオリゴ１０を６０μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解させた。１５μＬの緩衝液中における４４ｎモル（１０当量）のアンチパイン塩酸塩（CAS:37682-72-7; C27H44N10O6・2HCl;[677.6304]; Calbio社、No. F 178220）を加え、そして室温において３時間攪拌した。この中間体生成物をNaBH₃CN（１００当量）で室温において１時間還元した。生成物をHPLC（カラム：Merck LiChrospher RP 18；１０μＭ、４ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ＝７．０、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中７５％アセトニトリル；流量＝１．０ｍＬ／分；勾配：６０分で１０％Ｂ〜８５％Ｂ）で単離した。この生成物（オリゴペプチドコンジュゲート）の保持時間は１６．５分で、オリゴ１０は１３．９分で溶離する。MS（ESI）：計算値：６６８０．６；実測値：６６７９．６。
【０２１４】
実施例１１：ヒドラジド修飾巨大分子の
スライド表面上への受動的適用
ヒドラジド修飾オリゴの商業的に入手できるスライドに対する結合のために、１〜１６個のヒドラジドを含むp-RNAオリゴを使用した。オリゴ１２、１３および１４と共に、１ｄから製造された３個および６個のヒドラジドを有するオリゴマーを使用した。さらに、アミン末端基付きオリゴマー（５’アミノ修飾剤Ｃ６；Glenn Research社）および修飾のないオリゴを非特異性対照として使用する。全オリゴマーをその２’末端においてCy3で標識し、そして同じヌクレオチド配列を保持させる。
【０２１５】
実験１１．１：アミン結合用スライドである Surmodics 3D Link （商標）に対する結合
オリゴを、１０μＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有するｐＨ＝８．５の3D Link（商標）プリント緩衝液（Surmodics, Inc.、Eden Prairie、ミネソタ州）に溶解させる。各溶液から、０．５μＬをスライド表面に直接適用し、そして飽和NaCl溶液の上のシールされたチャンバー中で、暗所、室温において一晩インキュベートした。これらスライドを、次に、3D Link（商標）封鎖用緩衝液により５０℃で１５分間処理して未処理表面部位を封鎖した。これらスライドを水で２回洗浄し、続いて５０℃において０．２％SDSで３０分間洗浄し、最後に２回の水洗浄を行い、次いで風乾した。蛍光の検出はPhamacisスキャナーで２０秒の積分時間を用いて行った。画像および強度分布は図２５に示される。
【０２１６】
非特異性オリゴは、１０μＭにおいて１０ｘ１０³〜２５ｘ１０³相対単位の間の信号を与えた。この信号は、単一のアミノ基を含んでいるオリゴについて観察された信号の強度比較である。これに対して、ヒドラジド修飾オリゴは、３５〜４０ｘ１０³蛍光単位という上記よりもはるかに高いローディング量をもたらす。さらに、ヒドラジド修飾オリゴは、検出下限が５μＭであるアミン修飾オリゴマーと比較して、検出下限が１．２５μＭであるより低い濃度でより高い蛍光信号を有する。
【０２１７】
実験１１．２：SuperAldehyde スライドに対する結合
オリゴを、１０μＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有するｐＨ＝８．５のSurmodics 3D Link（商標）プリント緩衝液またはｐＨ＝４．０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液のいずれにも溶解させた。各溶液から、０．５μＭをSuperAldehydeスライド（Telechem International, Inc.、Sunnyvale、CA州）の表面に適用し、そして室温において一晩インキュベートする。これらスライドを、次に、０．２％SDSで２回処理し、そして水で４回（各２分）洗浄した。次に、その表面を１３３ｍＬのエタノールと共にｐＨ＝７のPBS緩衝液中０．３％のNaBH₃CN溶液で処理して泡立ちを除いた。この後に０．２％SDS および水で洗浄を１分ずつ３回行った。蛍光の検出をPhamacisスキャナーで２０秒の積分時間を用いて行った。画像および強度分布は図２６に示される。
【０２１８】
図２６に見ることができるように、ｐＨ＝８．５および４．０の両ｐＨにおいて、ヒドラジドオリゴはアミン末端基付きオリゴマーと比較してそれよりはるかに高い信号強度を与え、それはｐＨの変化によって影響されない。さらに、濃度が同じだとすれば、ヒドラジド修飾オリゴマーがアミン修飾オリゴマーよりもはるかに高い信号強度を与える。アミンオリゴは２．５μＭ未満ではもはや検出できないが、一方ヒドラジドオリゴマーは１．２５μＭもの低濃度で検出される。
【０２１９】
実施例１２：活性エステル表面上における
ヒドラジン結合部分とアミン結合部分との比較
比較のために、アミノ−C6−修飾およびCy3標識オリゴヌクレオチドＴ₁₅（５’−アミノC6-TTT TTT TTT TTT TTT Cy3）をBiospring GmbH、Frankfurt／Main、ドイツから購入した。このオリゴおよび次のオリゴ、即ちＯ３１、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３７、Ｏ３９を用いて、５０ｍＭヒスチジン緩衝液中２０μＭおよび１００μＭの溶液を調製し、そしてMillipore ULTRAFREE-MC ０．２２μｍフィルターユニットを通して濾過した。得られたこれら溶液を、２つのパッドを２．２Ｖにおいて１８０秒間、各プローブについて同時に処理することによって、活性エステルNHS透過層Nanogen Chip上で処理した。Cy3を低利得（low gain）において６４μ秒間記録した。同時に処理されたパッドからの信号を平均した。このデータは図２９に示される。この実験におけるオリゴＯ３９の精製、および透過層における活性エステルの徐分解に関する問題が、このデータ点を他のデータと相容れないものとし、そのためそのデータ点をグラフから省いた。しかし、Ｏ３９は、依然として、その未知の有効濃度において、単一ヒドラジド修飾オリゴに匹敵する結合を明らかにした。
【０２２０】
得られたデータは、ヒドラジド修飾全てが、活性エステル表面上での固定化に関してアミノ修飾オリゴヌクレオチド類より優れた性能を有することを証明している。かくして、単一ヒドラジドオリゴでさえも、現在広く使用されているアミノ修飾オリゴよりも改善された性能を証明している。
【０２２１】
さらに、１つの合成工程で４個のヒドラジド基の導入を許す新規なアミダイト化合物９を用いて製造されたオリゴ３７は、固定化に関してオリゴ３５と同様の挙動を示す。
【０２２２】
以上の説明は本発明の諸態様を例証しようとするものであって、いかなる意味でも本発明を限定しようとするものではない。本発明を特定の修飾に関して説明したけれども、それらの細部は限定と解されるべきではなく、それについて、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、色々な均等物、変更および修正に頼ることができることは明白であり、かつそのような均等な態様は本発明に含められるべきであることが分かる。全ての刊行物および特許出願は、ここで参照することにより、個々の刊行物および特許出願が、各々、あたかも、具体的かつ個別に参照されて含められていると示されているかのごとく、本明細書に同程度に含められるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、オリゴ類を平らな基材上に固定化するための典型的なアプローチを描いている模式図である。一般に、オリゴマーを基材表面に結合させるのに単一の反応性基が用いられる。
【図２】 図２は、巨大分子が基材に対するその巨大分子の共有または非共有結合に関与することができる複数の結合または結合部分を有する、本発明の固定化アプローチの模式図である。
【図３】 図３は、基材表面に結合させるための複数の反応性部分に結合されている核酸鎖の１例のより詳細な図である。この例においては、分枝ホスホロアミダイト類の化学構造が多重様式で付加されて、巨大分子に結合されたデンドリマー構造をもたらしている。
【図４】 図４は、フェニルボロン酸（PBA）結合部分を含んでいるデンドリマー構造を有する構造物を生成させる一連の化学的工程を示す。
【図５】 図５ＡおよびＢは、オリゴ巨大分子を基材表面に非共有結合させるための、４個（Ａ）か８個（Ｂ）のいずれかの結合部分を有するオリゴ巨大分子を含む化学構造をもたらす一連の化学的工程を示す。
【図６】 図６Ａ−Ｃは、ホスホロアミダイト類を用いて複数の反応部位を有する巨大分子を生成させる合成工程を図解する。これらの部分は、オリゴ類のヒドラジンによる脱保護中にヒドラジドに転化されるエステル基を含む。
【図７】 図７は、共有結合による巨大分子の基材に対する固定化で使用するためのヒドラジド部分の直接結合を有する巨大分子を含む化学構造ＡおよびＢを示す。
【図８】 図８Ａ−Ｄは、複数の結合部分を有する構造物を生成させる化学合成を示す。（Ａ）において、分枝ホスホロアミダイトがオリゴに付加され、そのオリゴが二官能性ホスホロアミダイトで修飾され、続いてジエチルアミン／CH₂Cl₂およびヒドラジンにより脱保護されて基材に結合するための４個のヒドラジド基を有する結合部分を生成させる。（Ｂ）においては（Ａ）と同様の反応図式が与えられ、その結果６個のヒドラジド結合部分がもたらされる。（Ｃ）においては、２種の異なる分枝ホスホロアミダイトの逐次使用の結果、巨大分子１個当たり１６個のヒドラジド結合部分がもたらされる。（Ｄ）では、分枝ホスホロアミダイトがデンドリマー構造を形成するために２つの工程で使用され、続いてホスホロアミダイトおよびヒドラジン処理が行われて、巨大分子１個当たり４個のヒドラジド結合部分がもたらされる。
【図９】 図９Ａ−Ｃは、３つの反応図式を示すもので、その内ＡおよびＢはオリゴ巨大分子に組み込むための新規なホスホロアミダイトを製造する工程を示す。図９Ｃは、ヒドラジドで標識されたオリゴは活性エステル単量体と反応することができ、従って巨大分子の固定化用基材を形成するのに使用できる反応図式を示す。
【図１０】 図１０Ａ−Ｃは、ヒドラジド標識オリゴを図９の反応図式３に示されるもののような活性エステル単量体にカップリングさせるための反応混合物の３つの別々のHPLCトレースのグラフである。
【図１１】 図１１は、マルチ標識巨大分子の結合の反応速度を示すグラフである。ヒドラジド／Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル（NHS）エステル結合は、このアミン／NHSエステル結合系を含めて他の共有結合系の速度よりもかなり高いく、そして２つの非共有結合系の速度に近い速度で生じた。
【図１２】 図１２は、標識されたヒドラジドオリゴの共有結合が、基材表面中における活性エステルの量に依存することを示すグラフである。
【図１３】 図１３は、NHSエステルかＮ−ヒドロキシ−スルホスクシニミジル（スルホ−NHS）エステルのいずれかで修飾された基材表面の共有結合の増強（proficiency）をそれぞれ示しているグラフである。これらのグラフは、ある印加電流範囲にわたる電極に結合された標識されたオリゴマーからの特異性および非特異性蛍光強度を示す。
【図１４】 図１４は、NHSエステルかＮ−ヒドロキシ−スルホスクシニミジル（スルホ−NHS）エステルのいずれかで修飾された基材表面の共有結合の増強（proficiency）をそれぞれ示しているグラフである。これらのグラフは、ある印加電流範囲にわたる電極に結合された標識されたオリゴマーからの特異性および非特異性蛍光強度を示す。
【図１５】 図１５は、ヒドラジド部分の多重結合が基材上で巨大分子をより高いレベルで検出できるようにすることを示すグラフである。
【図１６】 図１６は、ハイブリダイゼーションがヒドラジド修飾オリゴ（ATA5）を含んでいるそれら部位上だけで完了された電子リバースドット−ブロットの結果を示すグラフである。捕獲プローブは、適切な電子条件下では活性エステル含有基材に特定的に結合された。ヒドラジドを有しない非特異性捕獲手段は活性エステルと反応せず、従ってハイブリダイゼーションには利用できない。
【図１７】 図１７は、２つの別個のプロトコルＡおよびＢに従って進むヒドラジド修飾オリゴの合成を示す。Ａにおいて、オリゴマーを修飾するのに、保護されたヒドラジドホスホロアミダイトが用いられ、それが次いで脱保護される。Ｂでは、オリゴマーを修飾するのにエステルホスホロアミダイトが用いられ、それが次いでヒドラジンと反応せしめられる。
【図１８】 図１８は、ヒドラジド修飾オリゴマーと反応し得る色々な官能基を例示している模式図を示す。
【図１９】 図１９は、アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２０】 図２０は、アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２１】 図２１は、オリゴ１個当たり３個、４個および８個のフェニルボロン酸により標識されたオリゴマーについての記録された平均蛍光強度（mean fluorescent intensity:MFI）を示す。結合系の安定性をモニターするために、結合されたオリゴマーは激しい洗浄条件に付された。
【図２２】 図２２は、アルデヒドリッチの透過層上へのデンドリマーヒドラジドの動的平衡および安定性を例証している模式図である。４個のヒドラジド部分と共に示されているオリゴマーがアルデヒドリッチ透過層上に電子的にローディングされ、その結果複数のヒドラゾン結合がもたらされる。この特定の例では、結合は個々に加水分解を受けやすい。複数の結合部位の利用により得られる安定性は、一部のヒドラゾンを他のヒドラゾンはそのままにしておきながら加水分解させるのを可能にする。隣接したヒドラゾン結合部位により束縛されているヒドラジドは拡散する能力がなく、従って結合を再確立し得るそのアルデヒドリッチ透過層内に保持される。
【図２３】 図２３は、ヒドラゾン結合（１個または２個以上）を介してカップリングされているグリオキサールアガロース透過層上への、１個、２個、４個および８個のヒドラジドを有するデンドリマーオリゴマーの結合を示しているグラフである。
【図２４】 図２４は、アセタール修飾ヒドロゲル上へのデンドリマーオリゴマーの結合を示しているグラフである。アセタール部分は、共有結合能力のためのアルデヒドを生成させるための酸による加水分解を必要とする。
【図２５】 図２５は、Surmodics 3D Link（商標）アミン結合用スライド上でのヒドラジドオリゴマーの色々な濃度における使用とそれらオリゴマーの改善された結合を図示する。図２５Ｂはガラススライドに結合されたオリゴマーの実際の蛍光写真画像であって、それらの結合レベルは図２５Ａにグラフとして示されている。
【図２６】 図２６は、図２５で使用されているSurmodicsスライドに対する非特異性結合レベルを示す。図２６Ｂはガラススライドに結合されたオリゴマーの実際の蛍光写真画像であって、それらの結合レベルは図２６Ａにグラフとして示されている。
【図２７】 図２７Ａは、ヒドラジドオリゴマーが固体支持体に効果的に固定化され得る適用可能なｐＨ範囲を示し；図２７Ｂは、標準アミン修飾オリゴマーよりも、より低い濃度で検出可能であるヒドラジドオリゴマーの改善された感受性を示す。
【図２８】 図２８は、分枝したまたは分枝していないヒドラジド修飾オリゴマーが、どのようにすればそれに代わる別の結合系に容易に修飾され得るかの１例を図示する。この特定の例においては、６個のヒドラジドを有する分枝オリゴマーがｐ−ホルミルフェニルボロン酸で修飾されて分枝PBA結合プローブをもたらしている。
【図２９】 図２９は、バイオ電子アレイディバイス（bioelectronic array device）（NanoChip（商標）カートリッジ）上のNHS活性エステルに対する数種のヒドラジド修飾オリゴ（具体的には、-T₁₅-Cy3オリゴ類）の結合の比較をグラフとして示す。単一のヒドラジド修飾オリゴＯ３１が、使用された両濃度においてアミノ修飾オリゴよりも＞７倍以上固定化されたオリゴを生成させ、またテトラヒドラジド修飾オリゴＯ３５およびＯ３７は、アミノ修飾オリゴの約１２〜１５倍もの多量の固定化オリゴを生成させた。
【図３０】 図３０ａは、一対の保護された芳香族ヒドラジド部分を含む２種のホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。
図３０ｂは、二対の芳香族ヒドラジド前駆体エステル部分を含むアミド−分枝ホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。
【図３１】 図３１ａは、単一の芳香族ヒドラジド前駆体エステル部分を含むホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。
図３１ｂは、二対の保護された芳香族ヒドラジド部分を含むエーテル−分枝ホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。
図３１ｃは、一対の芳香族ヒドラジド前駆体エステル部分および１つの保護されたアルコール部分を含む、さらなる固相合成に標準のホスホロアミダイト化学技術により利用することができるホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。
図３１ｄは、単一の保護された芳香族ヒドラジド部分を含むホスホロアミダイト化合物の合成反応図式を示す。

Claims (14)

1. 一般式：
   

   

   の化合物：但し、上記の式において、
   Ｂｚはベンゼン環であり；
   Ｌ_ａは炭素１〜１２個の分枝または非分枝炭化水素であり、そしてＬ_ａは場合によりそれらの炭素間に１〜４個のエーテル結合またはアミド結合を含んでいることができ；
   Ｐ_ｒは
   

   

   より成る群から選ばれるリン保有反応性基であり；
   Ｒ_ａ及びＲ_ｂは１〜１２個の炭素を有する分枝または非分枝炭化水素であり；
   Ｒ_ｃは２−シアノエチル、アリル、メチル、およびエチルより成る群から選ばれ；
   各Ｐ_Ｇａは独立にトリチル、メチルトリチル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルより成る群から選ばれ；そして
   ｍは１、２または３である。
2. Ｐ_Ｇａがモノメトキシトリチルである、請求項１に記載の化合物。
3. Ｌ_ａが (CH₂)_ｎ（式中、ｎは１〜１２の整数である）である、請求項１に記載の化合物。
4. ｍが１である、請求項１に記載の化合物。
5. ｍが２である、請求項１に記載の化合物。
6. Ｐ_ｒが
   

   

   である、請求項１に記載の化合物。
7. Ｒ_ａおよびＲ_ｂが、独立に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチルより成る群から選ばれる、請求項６に記載の化合物。
8. Ｒ_ｃが２−シアノエチルである、請求項６に記載の化合物。
9. Ｒ_ａおよびＲ_ｂがイソプロピルであり、そしてＲ_ｃが２−シアノエチルである、請求項６に記載の化合物。
10. 一般式：
    

    

    を有する、請求項１に記載の化合物。
11. 一般式：
    

    

    を有する、請求項１に記載の化合物。
12. ５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド）である、請求項１に記載の化合物。
13. ５−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−イソフタル酸 ビス（Ｎ’−トリチルヒドラジド）である、請求項１に記載の化合物。
14. ４−［（２−シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシメチル］−安息香酸 Ｎ’−モノメトキシトリチルヒドラジド）である、請求項１に記載の化合物。

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