JP4842751B2 - Recombinant microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism used for producing a useful protein or polypeptide, and a method for producing a protein or polypeptide.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its use has been extended to a wide range of fields from daily necessities such as foods, medicines, detergents and cosmetics to various chemical raw materials.
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではない。 In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues, and breeding of produced bacteria by genetic techniques such as mutation has been performed as a technique. Particularly recently, with the development of microbial genetics and biotechnology, more efficient breeding of production bacteria using genetic recombination techniques has been carried out. Furthermore, in response to the rapid development of genome analysis technology in recent years, attempts have been made to decode genome information of target microorganisms and actively apply them to industry. Industrially useful host microorganisms whose genome information has been disclosed include Bacillus subtilis Marburg No. 168 (Non-patent Document 1), Escherichia coli K-12 MG1655 (Non-patent Document 2), Corynebacterium Corynebacterium glutamicum ATCC132032 and the like are mentioned, and strains with improved information have been developed using these genomic information. However, despite the above efforts, production efficiency is not always satisfactory.
prsA遺伝子は、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。そして、自身のプロモーター領域を含む枯草菌のprsA遺伝子を挿入したプラスミドを導入し、微生物中に複数のprsA遺伝子を持たせることにより、目的タンパク質の生産性が向上した微生物が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、かかる微生物では、１菌体当たりに導入される複数個のプラスミドの個数を制御するのが困難であり、また生産培養中にプラスミドの脱落がしばしば起こるという問題があり、実用的ではない。更に前記報告において、prsA遺伝子断片を挿入したクローニングベクターpHP13は枯草菌プラスミドpTA1060の複製機能を含んでおり（非特許文献４）、pTA1060の枯草菌1ゲノム当たり、つまり1菌体当たりにおけるコピー数は平均5.2であることが報告されている（非特許文献５）。すなわち、前記報告における目的タンパク質の増加量は野生株の生産量の１〜５倍であることから、導入したprsA遺伝子1個あたりの生産増加量は野生株生産量の約０．２〜１倍であり、充分な効果が得られているとは言えない。 The prsA gene was found in Bacillus subtilis as a protein involved in the protein secretion process, and previous studies have shown that PrsA is a chaperone-like protein that facilitates protein folding after it has been transported out of the cytoplasm across the cell membrane. It is presumed to have the function of Then, a microorganism in which the productivity of the target protein has been improved by introducing a plasmid into which the prsA gene of Bacillus subtilis containing its own promoter region is introduced and having a plurality of prsA genes in the microorganism has been reported (Non-Non- patent document) Patent Document 3). However, such a microorganism is not practical because it is difficult to control the number of a plurality of plasmids introduced per cell, and the plasmids are often dropped during production culture. Furthermore, in the above report, the cloning vector pHP13 into which the prsA gene fragment has been inserted contains the replication function of the Bacillus subtilis plasmid pTA1060 (Non-patent Document 4). It is reported that the average is 5.2 (Non-Patent Document 5). That is, since the increase in the target protein in the above report is 1 to 5 times the production of the wild strain, the increase in production per introduced prsA gene is about 0.2 to 1 times the production of the wild strain. Therefore, it cannot be said that a sufficient effect is obtained.
cspB遺伝子は、枯草菌において低温環境下で誘導されるコールドショックタンパク質CspBをコードする遺伝子である。低温環境下において、細胞内の多くのメッセンジャーRNA（mRNA）分子は安定な二次構造を形成する為、リボソームが接近し難くなりその翻訳効率は著しく低下する。CspBは低温環境下において発現が必要な遺伝子のmRNAに結合して二次構造形成を抑制するRNAシャペロンとして機能し、リボソームの接近を容易にして翻訳を促進する役割を果たすと考えられている。またcspC遺伝子とcspD遺伝子がコードするCspCとCspDは、CspBと高いアミノ酸配列同一性を示し、CspB同様、低温環境下で蓄積しRNAシャペロンとして機能するコールドショックタンパク質である（非特許文献６、非特許文献７）。
しかしながら、prsA遺伝子を過剰発現しており、且つ、斯かるコールドショックタンパク質に関与する遺伝子を改変した微生物はこれまで知られておらず、特にその様な微生物がprsA遺伝子を過剰発現している微生物に比べ、有用なタンパク質又はポリペプチドの優れた生産性を示すことは予想すらされていない。
However, a microorganism that overexpresses the prsA gene and has modified a gene involved in such a cold shock protein has not been known so far, especially a microorganism in which such a microorganism overexpresses the prsA gene. Compared to, it is not even expected to show superior productivity of useful proteins or polypeptides.
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。 The present invention relates to a microorganism in which productivity of a protein or polypeptide is further improved, and a method for producing a target protein or polypeptide using the microorganism.
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌prsA遺伝子を強化して枯草菌PrsAを過剰に発現させると共に、コールドショックタンパク質に関与する特定の遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が当該遺伝子の改変前と比較して向上することを見出した。 The present inventors searched for genes that affect the production of useful proteins or polypeptides in various genes encoded on the microbial genome, and overexpressed Bacillus subtilis PrsA by enhancing the Bacillus subtilis prsA gene. In addition, when a gene encoding a target protein or polypeptide is introduced into a microorganism strain in which a specific gene involved in cold shock protein is deleted or inactivated, the productivity of the target protein or polypeptide is increased. It has been found that it is improved as compared with that before the modification of the gene.
すなわち本発明は、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入し、且つcspB遺伝子、cspC遺伝子若しくはcspD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に係るものである。 That is, the present invention is a transcription initiation control region having a function in a microorganism or a transcription initiation control region and a ribosome binding site introduced upstream in the genome of a Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene, or a microorganism A transcription initiation control region or a transcription initiation control region and a ribosome binding site having a function in B. subtilis prsA gene or a gene fragment linked upstream of the gene corresponding to the gene, and cspB gene, cspC gene or cspD gene or The present invention relates to a recombinant microorganism in which a gene encoding a target protein or polypeptide is introduced into a microorganism strain obtained by deleting or inactivating a gene corresponding to the gene.
また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に係るものである。 The present invention also relates to a method for producing a target protein or polypeptide using the recombinant microorganism.
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。 The recombinant microorganism of the present invention has high productivity of the target protein or polypeptide. Therefore, when the target protein or target polypeptide is produced using this, the time and cost required for production of the substance can be reduced.
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present invention, the identity of the amino acid sequence and the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to compare (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。 In the present specification, the transcription initiation control region is a region including a promoter and a transcription initiation point, and the ribosome binding site is a Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc. Natl. Acad) that forms a translation initiation control region together with the initiation codon. Sci. USA 74, 5463 (1974)).
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、cspB遺伝子、cspC遺伝子若しくはcspD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。 The parent microorganism for constructing the microorganism of the present invention, cspB gene, as long as it has a gene corresponding to cspC gene or cspD gene or the gene, also these were subjected to even mutations that of wild-type Good. Specific examples include bacteria belonging to the genus Bacillus, bacteria belonging to the genus Clostridium , yeast, etc. Among them, bacteria belonging to the genus Bacillus are preferable. Furthermore, Bacillus subtilis is particularly preferred from the viewpoint that whole genome information has been clarified, genetic engineering and genome engineering techniques have been established, and that it has the ability to secrete and produce proteins outside the cells.
本発明の枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子が挙げられる。また枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。 The Bacillus subtilis prsA gene of the present invention refers to a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene refers to a gene having a Bacillus subtilis prsA gene substantially the same function, for example, Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacillus cereus (Bacillus cereus), In Bacillus thuringiensis , Oceanobacillus iheyensis, etc., each prsA gene identified mainly by genome analysis can be mentioned. Examples of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene include any of the following genes (1) to (4).
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (1) A protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。 (2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding. Here, examples of the “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC. (Composition of 1 × SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. for 8 The conditions are such that the temperature is kept constant for 16 hours and hybridized.
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (3) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA that codes for various proteins.
Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
なお、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、prsA遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有するタンパク質をいう。 A protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has substantially the same function as the protein encoded by the prsA gene and is transported out of the cytoplasm through the cell membrane. It refers to a protein having a chaperone-like function that facilitates subsequent protein folding.
本発明の微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２１０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域としての機能を有する領域が挙げられる。また、枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２３０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有する領域が挙げられる。 The transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site that function in the microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it is a transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site that functions in the host microorganism. For example, a Bacillus subtilis spoVG gene or aprE gene or a transcription initiation control region or a transcription initiation control region located upstream of a gene corresponding to these genes and a ribosome binding site are preferred. As an example of the transcription initiation control region of the Bacillus subtilis spoVG gene, a region comprising the nucleotide sequence of base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9, or a region comprising a sequence homologous to these sequences and having a function as a transcription initiation control region Is mentioned. In addition, as an example of the transcription initiation control region and the ribosome binding site of the Bacillus subtilis spoVG gene, a region comprising the nucleotide sequence of base numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 9, or a transcription initiation control region comprising a sequence homologous to these sequences And a region having a function as a ribosome binding site.
prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流への当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の導入には、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。 Introducing the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site upstream of the prsA gene or the gene corresponding to the gene into the genome, the original prsA gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene In addition to those that replace part or all of the transcription initiation control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the original transcription initiation control region, or those that are inserted with the transcription initiation control region and the ribosome binding site left intact included.
当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。 The transcription initiation control region, or the substitution to the transcription initiation control region and the ribosome binding site can be performed using, for example, a known method by homologous recombination. That is, first, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene and a drug resistance gene fragment upstream of the transcription initiation control region or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, , Downstream of the prsA gene translation initiation control region and part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene , 77, 61, 1989). In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene, a drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the prsA gene A DNA fragment is obtained in which a translation initiation control region and a part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene are joined in this order.
次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のprsA遺伝子上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93,1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
Next, by incorporating such a DNA fragment into the parent microbial cell by a known method, the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene of the parent microbial genome, and the translation initiation control region and structural gene of the prsA gene Double crossover homologous recombination occurs in two places of the region including part or all of the region or part or all of the structural gene region of the prsA gene. As a result, the original transcription initiation control region, or a transformant in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are replaced with the transcription initiation control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, is used as an indicator of the drug resistance gene. Can be separated as Thereby, the transcription initiation control region introduced upstream of the prsA gene on the genome, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are genetically stably maintained. In addition, as a known method for specifically introducing a DNA fragment for introduction into a host microorganism, a competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (
In particular, when Bacillus subtilis is used as the host of the microorganism of the present invention, the transcription initiation control region of the spoVG gene, or the transcription initiation control region and the ribosome from the transcription initiation control region of the prsA gene, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site. Substitution by homologous recombination to the binding site can be performed using the method described in Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, or the like.
また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。 In addition, for the insertion of the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site, appropriately select the transcription initiation control region to be inserted or the sequence of the DNA fragment added to both ends of the transcription initiation control region and the ribosome binding site. For example, it can be carried out by the same method as the above-described substitution method. For example, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region and a drug resistance gene fragment are linked upstream of the transcription initiation control region, and a DNA containing a part or all of the original transcription initiation control region downstream. Combine the fragments. In this way, the DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region, the drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, and the DNA fragment containing part or all of the original transcription initiation control region were combined in this order. Obtain a DNA fragment. Next, after inserting such a DNA fragment into a host microorganism, a transformant can be isolated using a drug resistance gene as an index. On the genome of the transformant thus separated, the original transcription initiation control region and the transcription initiation control region are stably maintained in a state where they are adjacent to each other without any gap.
本発明において当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。 In the present invention, the transcription initiation control region or the upstream in the genome where the transcription initiation control region and the ribosome binding site are introduced is not particularly limited as long as it is upstream of the start codon of the prsA gene, but within 2000 base pairs adjacent to each other. This region is preferable, a region within 500 base pairs is more preferable, a region within 100 base pairs is more preferable, and a region within 50 base pairs is particularly preferable.
また、本発明における転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、及びprsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結することにより得ることができる。かかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができ、また、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。 In addition, the transcription initiation control region in the present invention or the gene fragment in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene can be obtained by a known cloning method such as PCR using the genome of Bacillus subtilis or other microorganisms as a template. Based on the obtained transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site fragment, and prsA gene fragment, restriction enzyme method, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), etc. It can obtain by connecting by a well-known method. Such a fragment can be introduced into the cytoplasm by a vector such as a plasmid, and homologous recombination is performed between the nucleic acid fragment introduced into the cell and the chromosome by a known transformation method. Can be introduced.
なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。 The chromosomal region to be introduced in the host is preferably a non-essential gene or a non-essential gene non-gene region upstream, for example, aprE gene, sacB gene, nprE gene, amyE gene, ybxG gene internal, or while the interior of the non-gene region of the gene upstream and the like, inside the amyE gene, or the interior of the non-gene region of ybxG gene upstream preferred. Here, a non-essential gene means a gene that allows a host to survive at least under certain conditions even if it is destroyed. In addition, no problem arises even when a part or all of a non-essential gene upstream or a non-gene region upstream of a non-essential gene is involved in introduction.
以下、具体、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いた当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による親微生物ゲノム上への導入方法について説明する。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（２））の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。
この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
In the following, the transcription initiation control region using a DNA fragment prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are designated as the prsA gene. A method of introducing the gene fragment linked upstream of the parent microorganism genome by double crossing will be described.
The DNA fragment for introduction used here is about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (1)) adjacent to the upstream of the introduction site on the parent microorganism genome, and about 0.1 to 3 adjacent to the downstream. Preferably, the transcription initiation control region or a fragment comprising the transcription initiation control region and a ribosome binding site (hereinafter referred to as fragment (3)), between the 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (2)), prsA gene fragment ( Hereinafter, it is a DNA fragment into which a fragment (4)) and a drug resistance marker gene fragment (hereinafter referred to as fragment (5)) are inserted. First, five fragments of fragment (1) to fragment (5) are prepared by the first PCR.
At this time, for example, the upstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the downstream end of fragment (1), and the downstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the upstream end of fragment (4) Designed to add the 10-30 base pair sequence upstream of fragment (5) at the downstream end of (4), and the 10-30 base pair sequence downstream of fragment (5) upstream of fragment (2). Were used (FIG. 1).
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加した断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加した断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じる。PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。 Next, the second PCR is carried out using the five types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of fragment (1) and the downstream primer of fragment (2). This causes annealing with the fragment (3) in the sequence of the fragment (3) added to the downstream end of the fragment (1). Similarly, the sequence of the fragment (3) added to the upstream end of the fragment (4) Annealing with fragment (3) occurs in the sequence, annealing with fragment (5) occurs in the sequence of fragment (5) added to the downstream end of fragment (4), and upstream of fragment (2) Annealing with the fragment (5) occurs in the sequence of the fragment (5) added to. As a result of PCR amplification, a DNA fragment in which the five fragments (1) to (5) are bound in the order of (1), (3), (4), (5), and (2) can be obtained (FIG. 1).
薬剤マーカー遺伝子としては、エリスロマイシン耐性遺伝子等を用いることが出来る。また、ここで行うPCR反応は、後記表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。 As a drug marker gene, an erythromycin resistance gene or the like can be used. The PCR reaction carried out here uses the primer set shown in Table 2 below, and uses a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) and the like (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) and the like.
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、エリスロマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、エリスロマイシン耐性遺伝子の他には、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。 When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent method or the like, genetic recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the introduction site on the same genome. A cell into which a transcription initiation control region or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene can be isolated by selection with a drug resistance marker. Selection with a drug resistance marker can be performed, for example, by isolating colonies that grow on an agar medium containing erythromycin and then selecting those that are confirmed to be introduced onto the genome by PCR using the genome as a template. Good. The drug resistance marker gene is not particularly limited as long as it can be used for selection using commonly used antibiotics. In addition to the erythromycin resistance gene, the chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance And drug resistance marker genes such as genes, spectinomycin resistance genes, tetracycline resistance genes and blasticidin S resistance genes.
本発明の組換え微生物においては、上記のPrsAの過剰発現に加えて、枯草菌において低温環境下で誘導されるコールドショックタンパク質をコードする、cspB遺伝子、cspC遺伝子若しくはcspD遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化がなされる。斯かる欠失又は不活性化は、単独でもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。
各遺伝子の遺伝子番号、遺伝子機能は、表１に示すとおりである。
In the recombinant microorganism of the present invention, in addition to the above-described overexpression of PrsA, the gene corresponds to a cspB gene, a cspC gene or a cspD gene encoding a cold shock protein induced in a low temperature environment in Bacillus subtilis or the gene concerned. Gene deletion or inactivation is made. Such deletion or inactivation may be performed alone or in combination of two or more.
The gene number and gene function of each gene are as shown in Table 1.
なお、これら各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997)、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。 The names, numbers, functions, etc. of these genes were reported by Kunst et al. (Nature, 390, 249-256, 1997) and published online on the JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: // Bacillus.genome.ad.jp/, updated on March 10, 2004).
cspB遺伝子、cspC遺伝子又はcspD遺伝子に相当する遺伝子とは、当該各遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、これらの各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子が挙げられる。尚、ここで、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。 The gene corresponding to the cspB gene, the cspC gene or the cspD gene refers to a gene having substantially the same function as each of the genes, for example, 70% or more, preferably 80% or more in these each gene and nucleotide sequence, More preferred are genes derived from other microorganisms, preferably Bacillus bacteria, having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more. Here, the identity of the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985).
上記遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、当該遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。 As a procedure for the deletion or inactivation of the above-mentioned gene, in addition to a method of systematically deleting or inactivating the gene (target gene), a random gene deletion or inactivation mutation is given. And a method for evaluating protein productivity and performing gene analysis by an appropriate method.
標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図３のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。 In order to delete or inactivate the target gene, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is introduced into the parent microbial cell, and the parent gene is homologously recombined in a part of the target gene. It is possible to disrupt and inactivate target genes on the microbial genome. Alternatively, a target gene inactivated by mutation such as base substitution or base insertion, or a linear DNA fragment containing the upstream and downstream regions of the target gene but not the target gene as shown in FIG. Constructed by the method, this is incorporated into the parent microbial cells to cause two crossover homologous recombination at two locations outside the mutation site in the target gene of the parent microbial genome, or upstream and downstream of the target gene Thus, it is possible to replace the target gene on the genome with a deleted or inactivated gene fragment.
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。 In particular, when Bacillus subtilis is used as a parental microorganism for constructing the microorganism of the present invention, there have already been several reports on methods for deleting or inactivating a target gene by homologous recombination (Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, etc.), the host microorganism of the present invention can be obtained by repeating these methods.
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。 In addition, random gene deletion or inactivation can be achieved by a method of causing homologous recombination similar to the above method using a randomly cloned DNA fragment, or by irradiating a parental microorganism with γ rays, etc. Can also be implemented.
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される削除用DNA断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子削除方法は下記に限定されるものではない。 Hereinafter, the deletion method by the double crossing method using the DNA fragment for deletion prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) will be described. The gene deletion method in is not limited to the following.
本方法で用いる削除用DNA断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図３）。 The deletion DNA fragment used in this method is between about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment adjacent to the upstream of the gene to be deleted, and about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment adjacent to the downstream. A fragment into which a drug resistance marker gene fragment is inserted. First, an upstream fragment and a downstream fragment of the gene to be deleted and three fragments of a drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR. At this time, for example, at the downstream end of the upstream fragment, the upstream side of the drug resistance marker gene is prepared. A primer designed to add a 10-30 base pair sequence, and conversely, a 10-30 base pair sequence downstream of the drug resistance marker gene is used at the upstream end of the downstream fragment (FIG. 3).
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図３）。 Next, using the three types of PCR fragments prepared in the first round as templates, the second round PCR is performed using the upstream primer of the upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment. As a result, in the drug resistance marker gene sequence added to the downstream end of the upstream fragment and the upstream end of the downstream fragment, annealing with the drug resistance marker gene fragment occurs, and as a result of PCR amplification, the upstream fragment and the downstream fragment In the meantime, a DNA fragment into which a drug resistance marker gene is inserted can be obtained (FIG. 3).
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の削除用DNA断片が得られる。 When using a chloramphenicol resistance gene as a drug resistance marker gene, for example, using the primer set shown in Table 2, using a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc. Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) etc., by performing SOE-PCR under the usual conditions, DNA fragments for deletion of each gene can be obtained. can get.
かくして得られた削除用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある削除対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した削除用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。 When the DNA fragment for deletion thus obtained is introduced into the cell by a competent method or the like, gene recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the same gene to be deleted, and the target gene Can be isolated by selection with a drug resistance marker. That is, when a deletion DNA fragment prepared using the primer set shown in Table 2 is introduced, colonies growing on an agar medium containing chloramphenicol are isolated, and the genome is obtained by PCR or the like using the genome as a template. It is sufficient to confirm that the above target gene is replaced with a chloramphenicol resistance gene.
本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。 The microorganism of the present invention can be produced by introducing a gene encoding a target protein or polypeptide into the microorganism thus prepared. Here, the “target protein or polypeptide” refers to a protein or polypeptide whose production or purification is one of the purposes. In addition, in the “microorganism having a gene encoding the target protein or polypeptide”, the gene includes not only a gene originally possessed by the microorganism but also a gene that the microorganism originally does not have, that is, a foreign gene. is there.
目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。Bacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４のアミノ酸番号1〜480のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号８のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。また、プロテアーゼとしては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
The target protein or target polypeptide is not particularly limited, and includes, for example, various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medical treatments, and diagnostics, and bioactive peptides. Industrial enzymes are preferred. In addition, the functions of industrial enzymes are classified into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase / Synthetase). ) And the like, preferably hydrolyzing enzymes such as cellulase, α-amylase and protease. Examples of α-amylase include α-amylases derived from microorganisms, preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus , more preferably derived from Bacillus sp. KSM-K38. More specific examples of α-amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain include alkaline amylase derived from Bacillus genus bacteria consisting of amino acid sequences of
本発明の微生物に導入されるべき目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
The target protein or target polypeptide gene to be introduced into the microorganism of the present invention is upstream of the control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, the transcription initiation control region including the promoter and transcription start site, ribosome It is desirable that at least one region selected from a translation initiation control region including a binding site and an initiation codon and a secretory signal peptide region be bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a Bacillus bacterium, and the transcription initiation control region In addition, it is desirable that the translation initiation control region in the 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene is appropriately bound to the target protein or polypeptide gene. For example, the bacterium belonging to the genus Bacillus described in JP 2000-210081, JP 4-190793, etc., that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP-2886) It is desirable that the cellulase gene and the transcription initiation control region, translation initiation control region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene are appropriately combined with the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of
このような目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。 Such a gene encoding a target protein or polypeptide can be introduced by, for example, (1) introduction by a vector and (2) insertion into a genome. (1) When introduced by a vector, upstream of it, “a transcription initiation, including a control region related to transcription, translation and secretion of the gene, ie, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site and an initiation codon” Competent cell transformation method, protoplast transformation method, vector containing gene encoding target protein or target polypeptide to which one or more regions selected from control region and secretory signal peptide region are appropriately linked Alternatively, it may be introduced by an appropriate transformation method such as electroporation. Here, the vector is not particularly limited as long as it is an appropriate carrier nucleic acid molecule for introducing a target gene into a host, allowing it to proliferate and express, and not only a plasmid but also an artificial such as YAC or BAC. Examples include vectors using chromosome and transposon, and cosmids. Examples of plasmids include pUB110 and pHY300PLK.
また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。 In addition, (2) for insertion into the genome, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a DNA fragment in which a part of a chromosomal region that causes introduction into a gene encoding a target protein or polypeptide is combined is taken into a microbial cell, and homologous recombination occurs in a part of the chromosomal region. Can be integrated into the genome. Here, the chromosomal region causing the introduction is not particularly limited, but a non-essential gene region or a non-gene region upstream of the non-essential gene region is preferable.
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、上記遺伝子の改変をしていない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。 Production of the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention is carried out by inoculating the strain in a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components, and cultivating it by a normal microorganism culture method. Then, after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified. And as shown in the below-mentioned Example, the improvement of the productivity of the target protein or polypeptide is achieved compared with the case where the microorganisms which are not modifying the said gene are used.
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたアミラーゼの生産方法について具体的に説明する。 Below, the construction method of the recombinant microorganism of this invention and the production method of amylase using the said recombinant microorganism are demonstrated concretely.
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。 For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5'側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3'側に続く領域を示す。 Further, in the following examples, upstream and downstream of a gene are not positions from the replication start point, but upstream is a region continuing on the 5 ′ side of the start codon of the gene that is regarded as a target in each operation / step. On the other hand, “downstream” indicates a region continuing 3 ′ of the stop codon of the gene taken as a target in each operation / step.
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。 Furthermore, the names of the genes and gene regions in the following examples are reported in Nature, 390, 249-256, (1997), and published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: //bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。 Transformation of Bacillus subtilis was performed as follows. That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared. Next, 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) is added to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), and after shaking culture at 37 ° C. for 1 hour, an appropriate drug is obtained. LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing the whole amount was smeared. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.
実施例１ prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表２に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表２に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表２に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.3kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示すamyEfw2とprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.4kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。
Example 1 Construction of a prsA gene expression-enhanced strain A mutant strain with enhanced prsA gene expression was constructed as follows (see FIG. 2). Using the genomic DNA extracted from
実施例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−１
実施例１にて得られたprsA-Ka株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（I）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表２に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-1
Evaluation of heterologous protein productivity of the prsA-Ka strain obtained in Example 1 was carried out as follows using the productivity of alkaline amylase derived from Bacillus bacteria consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as an index.
Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, using the primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 2 PCR is performed to amplify a 1.5 kb DNA fragment (H) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 encoding alkaline amylase (JP 2000-184882, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) did. In addition, using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, the S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 2 were used. PCR was performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment (I) containing a transcription initiation control region, translation initiation control region, and a region encoding a secretory signal sequence of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081). Subsequently, the obtained 2 fragments of (H) (I) are mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 2 is performed. As a result, a 2.1 kb DNA fragment (J) in which the alkaline amylase gene was ligated downstream of the transcription initiation regulatory region, translation initiation regulatory region, and secretory signal sequence encoding the alkaline cellulase gene was obtained. The obtained 2.2 kb DNA fragment (J) was inserted into the Bam HI- Xba I restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
実施例１にて得られたprsA-Ka株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。この結果、表３に示した様に、宿主としてprsA-Ka株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはprsA-Ka株にてprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。
Plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating alkaline amylase productivity was introduced into the prsA-Ka strain obtained in Example 1 and
実施例３ ゲノム中cspB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
図３に基づいて、ゲノム中cspB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、cspB遺伝子は枯草菌において低温環境下にて特定のmRNAに結合してその翻訳促進に関与するRNAシャペロンCspBをコードする遺伝子である。またCspBと高いアミノ酸同一性を示し、低温環境下にて同様のRNAシャペロン様機能を果たすと考えられるタンパク質として枯草菌にはCspC及びCspDが存在し、それぞれcspC遺伝子とcspD遺伝子によりコードされる（Mol. Microbiol., 25:741 (1997)、J. Biol. Chem., 274:3407 (1999)）。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したcspB-FW及びcspB/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のcspB遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、cspB/Cm-F及びcspB-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のcspB遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
Based on substitution Figure 3 with a drug-resistant gene of Example 3 genome cspB gene, illustrating a replacement method according to the drug resistance gene of cspB gene in the genome. The cspB gene is a gene encoding an RNA chaperone CspB that binds to a specific mRNA in Bacillus subtilis under a low temperature environment and is involved in promoting translation thereof. In addition, CspC and CspD exist in Bacillus subtilis as proteins that exhibit high amino acid identity with CspB and are thought to perform similar RNA chaperone-like functions in low temperature environments, and are encoded by the cspC and cspD genes, respectively ( Mol. Microbiol., 25: 741 (1997), J. Biol. Chem., 274: 3407 (1999)).
Using a genomic DNA extracted from
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表２に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.85kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。 Further, a 0.85 kb chloramphenicol (Cm) resistance gene region (C) was prepared by PCR using the plasmid pC194 DNA as a template and the catf and catr primer sets shown in Table 2.
次に、図３に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表２に示したcspB-FW2及びcspB-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.8kbのDNA断片（D）を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
Next, as shown in FIG. 3, the obtained 1.0 kb fragment (A), 1.0 kb fragment (B), and Cm resistance gene region (C) 3 fragments were mixed and used as a template to prepare cspB shown in Table 2. -2.8 kb DNA containing 3 fragments in the order of 1.0 kb fragment (A), Cm resistance gene region (C), 1.0 kb fragment (B) by SOE-PCR method using primer set of -FW2 and cspB-RV2 Fragment (D) was obtained.
Furthermore, 168 strains were transformed using the obtained DNA fragment (D) by the competent cell transformation method. After transformation, colonies that grew on the LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) were isolated as transformants.
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってcspB遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、cspB遺伝子欠失株（ΔcspB株）を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例１にて構築したprsA-Ka株を用いることにより、prsA-Ka株ゲノム中のcspB遺伝子をCm耐性遺伝子にて置換した菌株（prsAKΔcspB株）を構築した。 The genomic DNA of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed by PCR that the cspB gene was replaced with the Cm resistance gene. A cspB gene deletion strain (ΔcspB strain) was constructed as described above. In addition, by using the prsA-Ka strain constructed in Example 1 instead of the 168 strain in the above transformation, a strain (prsAKΔcspB strain) in which the cspB gene in the prsA-Ka genome was replaced with a Cm resistance gene was constructed. did.
実施例４ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−２
実施例３にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図４に示した様に、prsAKΔcspB株においてprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、そのprsA-Ka株に対する生産量の増加（図４の斜線部分に相当）は、ΔcspB株で示された枯草菌168株に対する生産量増加（図４の黒塗りで示す部分に相当）より顕著であった。即ち、prsAKΔcspB株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。尚、prsA遺伝子とcspB遺伝子の機能、並びにcspB遺伝子と類似の機能を担うと考えられるcspC遺伝子及びcspD遺伝子は表１に示すとおりである。
Example 4 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-2
The alkaline amylase secretion productivity of the strain constructed in Example 3 was evaluated in the same manner as in Example 2. As control,
比較例１ desR遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上のdesR遺伝子を、実施例３に示したcspB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔdesR株を構築した。使用したプライマーを表２に示し、それぞれのプライマーとΔcspB株の構築に用いたプライマーとの対応を表４に示した。また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上のdesR遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔdesR株を構築した。
尚、desR遺伝子はDesK-DesR二成分制御系のうちレギュレータータンパク質DesRをコード遺伝子である。細胞膜上に存在するセンサータンパク質DesKが感知した低温刺激はDesRに伝達され、DesRはdes遺伝子の上流に結合してその転写を促進する。des遺伝子は細胞膜リン脂質の不飽和化酵素であるΔ5-脂質デサチュラーゼをコードしている（J. Bacteriol., 181:7028 (1999)）。
Comparative Example 1 Replacement of desR gene with drug resistance gene Replacement of desR gene on
The desR gene encodes the regulator protein DesR in the DesK-DesR binary control system. Cold stimulation detected by the sensor protein DesK present on the cell membrane is transmitted to DesR, which binds upstream of the des gene and promotes its transcription. The des gene encodes Δ5-lipid desaturase which is a desaturase of cell membrane phospholipid (J. Bacteriol., 181: 7028 (1999)).
比較例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−３
比較例１にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表５に示した様に、ΔdesR株において野生株168株以上の生産性が認められているにも関わらず、prsA-Ka株に対してdesR遺伝子欠失を行った効果は認められなかった。即ち、低温環境下において転写後のmRNAに作用して翻訳調節に関わるCspBに対し、DesRは低温環境下における転写調節、或いは脂質の不飽和化に関与するが、同じく細胞内の低温環境応答に関与する遺伝子でありながらcspB遺伝子とは異なり、desR遺伝子の欠失をprsA遺伝子発現強化と組合せても酵素生産性に対する相乗効果は認められないことが確認された。
尚、desR遺伝子、desK遺伝子及びdes遺伝子の機能を表６に示した。
Comparative Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-3
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Comparative Example 1 was performed in the same manner as in Example 2. As control,
The functions of desR gene, desK gene and des gene are shown in Table 6.
実施例５ バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化とcspB遺伝子欠失との組み合わせにおけるアルカリアミラーゼ分泌生産評価
バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号４１）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例１の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表７に示したBce/PVG-FとBce/emf2-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Ka株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したamyEfw2とPVG-R、及びemf2とamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片（Ｂ）、及びエリスロマイシン耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3'側領域が連結した2.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表２に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にエリスロマイシン耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片（Ｄ）を得た。得られた4.3kbDNA断片（Ｄ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
次いで、実施例３と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりcspB遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔcspB株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株及びprsAbcKΔcspB株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株とΔcspB株についても評価を行った。その結果、図５に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められた。更にprsAbc-K株よりcspB遺伝子を欠失した菌株においては一層顕著な生産性向上が認められ、実施例５で見られたのと同様、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子発現強化とcspB遺伝子欠失との組み合わせがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
EXAMPLE 5 Bacillus cereus (Bacillus cereus) from prsA gene expression enhancement and alkaline amylase secretory production evaluation in combination with a cspB gene deletion Bacillus cereus (Bacillus cereus) derived prsA gene (SEQ ID NO: 41), the Bacillus subtilis prsA gene The corresponding gene. In the same manner as in Example 1, a mutant strain with enhanced expression of the Bacillus cereus- derived prsA gene was constructed. In other words, using the genomic DNA extracted from Bacillus cereus as a template and the Bce / PVG-F and Bce / emf2-R primer sets shown in Table 7, the Bacillus cereus- derived prsA gene is included. A 0.9 kb fragment (A) was amplified by PCR. In addition, using the genomic DNA extracted from the prsA-Ka strain constructed in the above comparative example as a template, using the amyEfw2 and PVG-R and emf2 and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 5 'region of the amyE gene A 1.2 kb fragment (B) in which the spoVG gene transcription initiation regulatory region and a region containing a ribosome binding site are linked downstream of the erythromycin resistance gene, and a 2.3 kb fragment (C) in which the 3 'region of the amyE gene is linked downstream of the erythromycin resistance gene Amplified by PCR. Subsequently, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 2 was performed to obtain 3 fragments (B ) (a) binding was as made in the order of (C), linked Bacillus cereus (Bacillus cereus) from prsA gene downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene, more erythromycin-resistant gene downstream thereof A DNA fragment (D) having a total base length of 4.3 kb in which the combined gene fragment was inserted in the center of the amyE gene was obtained. The obtained 4.3 kb DNA fragment (D) was used to transform
Subsequently, a prsAbcKΔcspB strain was constructed by replacing the cspB gene with a chloramphenicol resistance gene from the genome of the prsAbc-K strain in the same manner as in Example 3.
About the constructed prsAbc-K strain and prsAbcKΔcspB strain, alkaline amylase secretion production was evaluated in the same manner as in Example 2. As controls,
Claims (12)
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。(1) Consists of DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a nucleotide sequence having 90% or more identity, and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. gene.
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。(2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding.
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。(3) It consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. gene.
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Gene consisting of DNA encoding various proteins.
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