JP4798801B2 - 循環する癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のレベルの上昇の検出および処置 - Google Patents

Description

（発明の背景）
現在、乳癌患者の２５〜３０％しか、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療を受けていない。このＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療は、原発性腫瘍の生検におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＨＥＲ２；ｃ−ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ２とも呼ばれる）タンパク質もしくはＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の上昇したレベルの知見にに基づく。文献におけるデータは、その原発性生検においてＨｅｒ２／ｎｅｕについて陰性の結果を有する有意な数（試験した２６人中１１人）の女性が、その循環する癌細胞においてＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性性を発症するようになることを示唆する（非特許文献１；非特許文献２）。また、乳癌を有する女性の考慮すべき人数は、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ状態について検査するために容易に利用可能である生検材料を有さない。Ｈａｙｅｓらによる論文（非特許文献１）およびＭｅｎｇらによる論文（非特許文献２）において使用されるアプローチは、面倒でありかつ時間がかかり、迅速でありかつより簡便な検査（特に、医師のオフィスにおいて行われ得る検査）が、必要とされている。Ｈａｙｅｓらの方法は、フローサイトメトリーアッセイを必要とし、そしてＭｅｎｇらの方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を必要とする。これらは、本発明において記載されるようなＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の（例えば、ＥＣＬによる）直接検出よりもよりも複雑であり、かつ時間がかかる。

（Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ処置）
Ｈｅｒ２／ｎｅｕオンコジーンの過剰発現は、乳癌を有する女性由来の生検サンプルの約２５％において観察され、そして予後の不良に関係している。トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を指向し、そしてこのレセプターを過剰発現するヒト乳癌細胞の増殖を阻害する、ヒト化モノクローナル抗体である（最近の概説については、非特許文献３を参照されたい）。乳癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕのタンパク質発現は、ＳＫ−ＢＲ−３と呼ばれるＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現ヒト乳癌細胞株の場合と同様に、細胞１個あたり５００，０００分子以上のレベルに容易に達し得る。Ｈｅｒ２／ｎｅｕについての現行の検査は、このタンパク質の過剰発現についてまたは遺伝子増幅についての患者生検の組織切片の検査に基づく。遺伝子増幅もしくはタンパク質についての少なくとも２＋の免疫染色を有する女性において、１種の薬剤トラスツズマブ、またはパクリタキセルのような化学治療剤と組み合わせたトラスツズマブによる、有意な反応が実証されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的化し得る他の薬剤は、開発中であり、そして本発明について、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮと類似する適用性を有する。これらの薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されているＯＭＮＩＴＡＲＧ（ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ））；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（非特許文献４）によって開発されているＧＷ−５７２０１６；Ｐｆｉｚｅｒによって開発されているＣＰ−６５４５７７（非特許文献５）；Ｗｙｅｔｈによって開発されているＨＫＩ−２７２（非特許文献６）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを含む他の抗癌剤の間の特異性は、ＪａｎｍａａｔおよびＧｉａｃｃｏｎｅ，２００３年（非特許文献７）において記載される。乳癌に加えて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、卵巣癌腫を含む他の癌腫において過剰発現される。

（ＥＣＬ）
電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、電気化学的に刺激される際に光を発するように設計されている標識を用いるプロセスである（ＥＣＬの概説については非特許文献８を参照のこと；また、非特許文献９も参照のこと）。これらの標識は、適切な装置（例えば、ＢｉｏＶｅｒｉｓによって開発された装置）と共に、種々の生物学的分子（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ）を検出する非常に感度の高い方法を提供する。Ｍａｒｔｉｎら（２００３年，特許文献１）は、ＥＣＬベースの酵素イムノアッセイを記載する；しかし、血液中の循環する癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕのようなタンパク質の検出への適用は、記載されていない。

（ＥＣＬおよび真核生物細胞全体）
真核生物細胞全体を用いるＥＣＬ方法は、Ｃｈｉｎｎら（特許文献２）によって開示されている。しかし、Ｃｈｉｎｎらによる方法は、細胞表面上のレセプター分子の相対数の検出よりもむしろ、細胞表面抗体の結合親和性を測定するための方法である。また、Ｃｈｉｎｎらによる方法は、多数（１ｍｌあたり１６７，０００個の細胞）の細胞の精製細胞集団で開始される。このことは、全血において見出される不純物の混合物から最初に選択された細胞集団を単離することとは対照的である。ここでこの選択された細胞集団は、少数（代表的に、１ｍｌあたり１〜２００個の細胞；非特許文献１）であってもよい。

（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕもしくは関連分子についてのアッセイ）
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）を用いる処置について患者を選択するための、現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されているアッセイは、以下である：（１）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質過剰発現についての免疫組織化学（ＤＡＫＯによるＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ）、および（２）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅についてのＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）アッセイ（ＶＹＳＩＳによるＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮキット）。これらの検査は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮに反応し、これによって利益を得る患者を予測することが示されている（非特許文献１０）。しかし、これらのアッセイはどちらも、以下の４つの制限を有する：
（１）これらのアッセイは、生検組織を必要とする。全ての患者が、検査のために容易に利用可能な保存された材料を有するわけではない。このような場合、唯一の選択肢は、腫瘍生検を得ることである。血液のサンプルのアッセイは、よりずっと簡便であり、実施がより容易であり、かつより迅速な答えを提供する可能性を有する。
（２）非常に多くの場合、乳癌の最初の診断の時点で採取された生検サンプルが、何年も後になって、患者がこの疾患を再発した際に使用される。したがって、古い組織材料を検査するアッセイを用いると、患者のＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する腫瘍状態は、この患者をＨＥＲＣＥＰＴＩＮで処置するか否かの臨床的決定を行う時点の何年も前の時点において決定される。文献におけるデータは、その原発性生検においてＨｅｒ２／ｎｅｕについて陰性の結果を有する女性の有意な数（試験した２６人中１１人）が、その循環する癌細胞においてＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性性を発症するようになる（したがって、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ処置の候補である）ことを示唆する（非特許文献１；非特許文献２）。血液サンプルからのこのような循環する乳癌細胞に対するそのＨｅｒ−２／ｎｅｕ状態のアッセイは、現行のＨｅｒ−２／ｎｅｕ状態のより実際的かつより迅速な決定を提供する。
（３）これらのアッセイにおけるスコアリングの主観性に起因して、両方の型のアッセイについて、近年、地方の研究室対中央研究室で、結果についての有意な量の不一致が示されており、そして２５％もの高い擬陽性率が生じ得、いくつかの地方研究室において見出されている（非特許文献１０）。より一般的な免疫組織化学検査を用いると、ＦＩＳＨと比較して推定１４％〜１７％の擬陰性率が存在する（非特許文献１０；非特許文献１１）。免疫組織化学を用いた１４％〜１７％の擬陰性率は、米国で年間数千人ものこのような女性が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療のさらなる候補であることを示す。
（４）最後に、これらの方法は、（ａ）採取された場所における保管から回収されるべき組織ブロック（ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｃｋ）、（ｂ）薄切されるべき切片、（ｃ）広範囲の処理、および最も多くの場合（ｄ）訓練された人材による時間がかかりかつ主観的なスコアリング、を必要とするので、遅い。サンプルをスコアリングするために必要である、免疫組織化学による細胞染色の程度を示すため、または陽性ＦＩＳＨ位置の数を示すために使用される、これらの手動分析は、面倒である。処置する医師へのより速いフィードバックを提供するより迅速なアッセイが、望ましい。さらに、ＦＩＳＨは、非常に高価であり、かつ広範に利用可能なわけではない（非特許文献１０）。

Ｋｏｓｋｉ（１９９８年，特許文献３）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の特異的部分の変性したエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いる、乳癌細胞および乳癌組織のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質についての免疫組織化学アッセイを記載する。しかし、これらのアッセイは、乳癌細胞の純粋な集団の設定における、または乳癌組織におけるような、非常に高い割合の乳癌細胞におけるアッセイである。Ｋｏｓｋｉは、血液のような複合マトリックス中の少数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現性乳癌細胞の検出の場合を指向しない。

Ｓｌａｍｏｎら（１９９０年，特許文献４）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅についてのアッセイおよび患者のスクリーニングにおいての使用を記載する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するためのアッセイの例は、与えられていない。さらに、この特許は、血液のような複合マトリックス中の少数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現性乳癌細胞の検出の場合を指向しない。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対するモノクローナル抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）による乳癌患者の処置のための患者の同定のための適用は、示されていない。

Ｃａｒｎｅｙら（１９９５年，特許文献５）は、ｎｅｕ関連タンパク質であるｐ１００（ヒトｎｅｕ遺伝子産物の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなる全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の短縮型からなる）の検出のためのヒト血清もしくはヒト血漿のイムノアッセイを記載する。このＣａｒｎｅｙ特許は、細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質もしくは全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の、特に全血のような複合混合物中の検出を指向しない。Ｃａｒｎｅｙに基づく、（オンコジーンに由来する）市販ベースのアッセイは、存在し得る少数（ｐｇ量）のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するために使用されるためには感度が低すぎる（血清１ｍＬあたり１．５ｎｇの短縮型Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）。存在し得る少数（ｐｇ量）のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質が、本発明に従って検出され得、そして本発明に従う検出のために必要とされる。本発明におけるように、細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてのアッセイは、非常に有利である。なぜなら、患者生検組織の免疫組織化学は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ処置への反応についての、細胞関連発現の予測性を示しているからである。Ｂｕｒｓｔｅｉｎらによる最近の報告（非特許文献１２）は、短縮型ｐ１００タンパク質（ＨＥＲ２ ＥＣＤ）についての血清アッセイの有用性の制限を示している。Ｂｕｒｓｔｅｉｎらは、「ＨＥＲ２ ＥＣＤの基線レベルも、治療によるＨＥＲ２ ＥＣＤにおける減少も、１サイクル後のトラスツズマブに対する臨床的反応を予測しない」ことを報告している。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮで処置された乳癌患者の研究において、Ｃｏｂｌｅｉｇｈら（非特許文献１３）は、血清ＥＣＤレベルとＨＥＲＣＥＰＴＩＮ反応状態との間に実証可能な有意な相関は存在しないという、同様の結論に達している。

Ｃａｒｎｅｙら（１９９７年，特許文献６）は、細胞溶解物中の全長ｐ１８５ Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するためのイムノアッセイを記載する。しかし、Ｃａｒｎｅｙに基づく市販ベースのＥＬＩＳＡアッセイは、本明細書中で記載される適用のために必要とされる少数（ｐｇ量）のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するために使用するには低すぎる規模の感度を有する。上述のように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の定量のためのこのアッセイは、血清１ｍＬあたり１．５ｎｇの短縮型Ｈｅｒ−２／ｎｅｕであると報告されている。この感度は、全血のような複合混合物中ではより悪いと推定される。さらに、Ｃａｒｎｅｙらは、全血を用いるＨｅｒ−２／ｎｅｕアッセイを指向していない。それどころか、短縮型Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ｐ１００と呼ばれる）のレベルは、細胞関連成分中ではなく、血液の血漿成分中で検出されている。短縮型タンパク質の血漿レベルを測定するアッセイよりも、本発明におけるアッセイのような細胞関連全長タンパク質を測定するアッセイの方が好ましい理由は、上で考察されている。また、Ｃａｒｎｅｙらは、細胞全体の使用を示さず、細胞溶解物の使用を示している。

Ｈｕｄｚｉａｋら（１９９８年，特許文献７）は、哺乳動物の体内で細胞をモノクローナル抗体に曝すことによって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現を決定するインビボアッセイを特許請求する。しかし、身体の外で腫瘍細胞をアッセイする方法は、記載されていない。

（血液中の循環する癌細胞の単離）
Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎら（２００２年，特許文献８）は、患者血液サンプルからの乳癌細胞の単離のための、上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体を有する免疫磁気ビーズの使用を記載する。Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎアッセイは、免疫磁気濃縮とフローサイトメトリー分析および免疫サイトメトリー分析（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）とを組み合わせる。しかし、フローサイトメトリーおよび免疫サイトメトリーは、面倒でありかつ時間のかかる技術であるという問題がある。
米国特許第６，５２４，８６５号明細書 米国特許第６，３００，１４３号明細書 米国特許第５，７８３，４０４号明細書 米国特許第４，９６８，６０３号明細書 米国特許第５，４０１，６３８号明細書 米国特許第５，６０４，１０７号明細書 米国特許第５，７２０，９３７号明細書 米国特許第６，３６５，３６２号明細書 Ｈａｙｅｓ ＤＦ，ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２００２年，第２１巻，ｐ．１１１１−７ Ｍｅｎｇ Ｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４年，第１０１巻，ｐ．９３９３−９８ Ｅｓｔｅｖｅ ＦＪ，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００４年，第９巻（第３補遺），ｐ．４−９ Ｘｉａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４年，第２３巻，ｐ．６４６−６５３ Ｂａｒｂａｃｃｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００３年，第６３巻，ｐ．４４５０−４４５９ Ｒａｂｉｎｄｒａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４年，第６４巻，ｐ．３９５８−６５ ＪａｎｍａａｔおよびＧｉａｃｃｏｎｅ，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００３年，第８巻，ｐ．５７６−８６ Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４年，第１２巻，ｐ．１９３−１９４ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，１９９１年，第３７巻，ｐ．１５３４−１５３９ Ｆｏｒｎｉｅｒ Ｍ，ら，「ＨＥＲ２ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ．」，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００２年，第１６巻，ｐ．１３４０−５８ Ｓｅｉｄｍａｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００１年，第１９巻，ｐ．２５８７−９５ Ｂｕｒｓｔｅｉｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００３年，第２１巻，ｐ．２８８９−２８９５ Ｃｏｂｌｅｉｇｈら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１９９９年，第９巻，ｐ．２６３９

したがって、循環する乳癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現を有する（したがって例えばトラスツズマブのようなＨｅｒ−２／ｎｅｕ標的化治療から利益を得る可能性の高い）乳癌を有する女性を全血サンプルによって同定するために使用するために十分に感度の高い、迅速かつ簡便なアッセイの医学的実施の需要が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、血液サンプル中の循環する癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法を提供する。この方法は、癌細胞を血液サンプルから単離し、その後、この単離された癌細胞において癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であるイムノアッセイを実施する工程であって、この工程において、陽性のイムノアッセイ結果は、この癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す工程を包含する。本発明に従うアッセイは、以下：（ａ）癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを、この血液サンプル１ｍｌあたりＨｅｒ−２／ｎｅｕの１／１０ｐｇと２０ｐｇとの間のレベルで検出可能であること；または（ｂ）血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個もしくは１００個未満の濃度で血液中にスパイクする場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能であること、によって規定される感度を有する。

本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的化する抗癌剤による処置から利益を得る可能性が高い癌患者を同定する方法を提供し、この方法は、上述の検出方法を包含する。このような患者を同定するために使用される場合、この癌細胞含有血液サンプルは、この患者から取り出される。本発明は、このようにして同定された癌患者を処置する方法を提供し、この方法は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標的化抗癌剤をこの患者に投与する工程を包含する。

（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、自由に変更可能である。この用語を用いる特許請求の範囲は、その特許請求の範囲に挙げられている要素に加えて、要素を含み得る。したがって、例えば、特許請求の範囲は、挙げられた要素またはその均等物が存在する限り、その特許請求の範囲に特定に挙げられていない他の工程をも含む方法を言及し得る。

本発明は、血液サンプル中の循環する乳癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のレベルを定量するために十分な感度を有する方法を提供し、そしてＨＥＲＣＥＰＴＩＮもしくはＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的化する他の薬剤を使用する治療から利益を受ける可能性が高い乳癌を有する女性を同定するための方法を提供する。血液サンプルを検査して、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療から利益を受けるさらなる患者を同定するための、簡便で、非常に感度が高くかつ迅速な手段は、乳癌処置分野における重要な進歩である。以下で示されるように、循環する乳癌細胞の表面におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するための、迅速かつ非常に感度の高い免疫学的アッセイ（例えば電気化学発光（ＥＣＬ）検出）は、これを達成するために好ましい手段である。

本発明は、血液からの循環する癌腫細胞を単離するために使用される高い特異性の手順と、高い感度の特定の免疫学的ベースアッセイ（例えば、ＥＣＬ）とを組み合わせることに基づく。好ましくは、そして有利にも、免疫磁気ビーズが、本発明の両局面のために使用され、したがって、新規な二重の機能を果たす：免疫磁気ビーズは、血液からの循環する癌細胞を単離しそして精製するために使用され、そして、異なるビーズであっても同じビーズであっても、ＥＣＬを実施するための支持相として使用され得、磁石にこれらのビーズを捕獲させ、そして標的抗原をタグ化抗体（例えば、ルテニウムタグ標識化抗体）と共に濃縮することを可能にする。

本発明の検出方法の実施形態において、感度レベルは、（ａ）血液サンプル１ｍｌあたり、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの、１ｐｇと２０ｐｇとの間より上、１ｐｇと１０ｐｇとの間より上、または１ｐｇと５ｐｇとの間より上である。本発明の検出方法の別の実施形態において、感度レベルは、（ｂ）血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１０個もしくは１０個未満の濃度で血液中にスパイクする場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能であることより上である。本発明の検出方法のさらなる実施形態において、感度レベルは、（ｂ）血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞３個もしくは３個未満の濃度で、および血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１個もしくは１個未満の濃度で、血液中にスパイクする場合でさえ、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能であることより上である。

癌（特に乳癌）を有する患者由来の血液のサンプル（通常、約８〜２０ｍｌの範囲）が、採取される。工程としては、以下に説明されるようなものが挙げられる：
１．赤血球の除去
２．正常な白血球のさらなる枯渇のための必要に応じたネガティブ選択。好ましい実施形態は、この工程を包含する。

３．循環する癌腫細胞についてのポジティブ選択
４．循環する癌腫細胞からのＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の検出および定量
（１．赤血球の除去。）
赤血球を除去するために種々の方法が使用可能であり、これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：密度に基づく分離（例えば、ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管への血液の直接的な収集およびその後の遠心分離）、ならびに市販の溶解緩衝液（例えばＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ ＲＢＣ溶解緩衝液（ＧＥＮＴＲＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤＩＳ）、ＩＭＭＵＮＯＬＹＳＥ（ＣＯＵＬＴＥＲ）、ＯＰＴＩＬＹＳＥ Ｂ （ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ）、およびＡＣＫ溶解緩衝液（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。

好ましい方法は、抗凝固薬（ＥＤＴＡもしくはクエン酸塩）と共に、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管を用いる。これらの管は、材料を含み、正確な遠心分離（１，１００×ｇ、１０分間、スイングアウトバケットローター（ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ））にかけられる。この遠心分離は、赤血球および好中球の排除を可能にする。遠心分離後、この管の底は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）および好中球の細胞ペレットを含む。細胞ペレットの上は、ゲル境界（ｇｅｌ ｂａｒｒｉｅｒ）であり、そしてこのゲル境界の上は、血漿の底にある腫瘍細胞、リンパ球および単球のバンドである。次いで、腫瘍細胞、リンパ球および単球は、ゲル境界の上から容易に回収され得る。この方法は、赤血球のみならず、好中球をも除去するので、好ましい。

（２．正常な白血球のさらなる枯渇のためのネガティブ選択。）
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍細胞の単離のためのネガティブ選択工程を使用する。ネガティブ選択は、白血球（特にリンパ球および単球）のさらなる枯渇を可能にする。この工程は、白血球抗原（特に共通の白血球抗原であるＣＤ４５）と赤血球抗原（例えばグリコホリンＡ）との両方に対して二重特異的である抗体の使用を包含する。市販されているこのような二重特異性抗体のカクテルは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入可能である（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐカタログ番号１５１２７およびカタログ番号１５１６７）。このカクテルは、グリコホリンＡとヒト造血細胞上の種々の細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｂ）とに対する二重特異性抗体を含む。これらの二重特異性抗体の１種以上が、血液収集の前に、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管に添加される。好ましい実施形態において、１種より多い白血球関連ＣＤ分子に対する二重特異性抗体のカクテルが、使用される。血液がＣＰＴ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管内に導入される場合、この二重特異性抗体は、イムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅ）を形成し、このイムノロゼットの各々は、白血球および多くの赤血球を含む。これらのイムノロゼットは、およそ赤血球の密度の密度を有し、そして遠心分離される際、赤血球細胞ペレット中に見出される。したがって、細胞ペレットおよびゲル境界より上に見出される腫瘍細分画分からさらに白血球を除去する。血漿中に腫瘍細胞を含む画分が、さらなる処理のために収集される。

（３．循環する癌腫細胞についてのポジティブ選択。）
循環する癌腫細胞を単離する好ましい方法は、免疫磁気ビーズを使用する。循環する癌細胞の単離の他の方法は、濾過を包含する（Ｖｏｎａ Ｇら，２０００，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ １５６：５７−６３）。好ましい実施形態において、免疫磁気ビーズは、癌腫細胞の表面上に選択的に見出される抗原（例えば、上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）、サイトケラチン（例えばサイトケラチン−１９）、および特に、サイトケラチンに対する抗体と他の表面マーカーとのカクテル）に対する抗体を有する。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する抗体を有する免疫磁気ビーズもまた、使用され得る。この免疫磁気ビーズは、種々の大きさ（５０μｍから２００ｎｍ未満まで）のビーズであり得、ＥｐＣＡＭに対する抗体（市販されている）またはＨｅｒ２／ｎｅｕに対する抗体を有するＤＹＮＡＬビーズ（１．５μｍより大きく、約５０μｍまで）を含み得る。好ましい実施形態において、ナノ粒子ビーズが使用され、それによって、ビーズへの腫瘍細胞のより迅速かつより効率的な結合が可能になる。本発明の実施形態において、ＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭヒトＥｐＣＡＭポジティブ選択カクテルおよびＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭ磁気ナノ粒子（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）が、上記工程からの血漿中に腫瘍細胞を有する画分に添加される。次いで、磁石が使用されて腫瘍細胞を他の材料から分離し、そしてこの腫瘍細胞を、水溶液で洗浄する。このようにして、精製腫瘍細胞が、次の工程で抗原の検出のために準備される。

（４．循環する癌腫細胞からのＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の検出および定量）
次いで、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が、検出分子に連結されたＨＥＲＣＥＰＴＩＮもしくはｍＡｂ １９１９２４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ １１２９）のようなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体（例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのヤギポリクローナル抗体、カタログ番号ＡＦ１１２９）の使用によって達成され得る。電気化学発光（ＥＣＬ）の場合において、この検出分子は、ルテニウムである。ルテニウムを抗体に連結させ（例えば、Ｌｅｅら，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ２００１，６５：１−９）、その後、トリプロピルアミンを含有する溶液中の磁気ビーズ上の抗原のＥＣＬ検出を行うための十分に有用な方法を提供する、十分な文献が、パブリックドメインに存在する。電位の適用により、ルテニウム標識は励起し、そして光が発され、そしてＥＣＬ検出装置（例えば、ＯＲＩＧＥＮアナライザーまたはＢＩＯＶＥＲＩＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤからのＭ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４のような市販の装置）を用いて検出される。

本発明にしたがって使用されるイムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、このモノクローナル抗体は、ヒト化マウスモノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ）である。トラスツズマブは、本発明に従うイムノアッセイおよび処置方法のために、好ましい。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出の目的のために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する種々のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに細胞外ドメインに対する抗体および細胞質ドメインに対する抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような供給源から市販されている。ウサギポリクローナル抗体はまた、ＡＢＶＩＳＩＯＮ Ｃｏｒｐ，Ｆｒｅｍｏｎｔ．ＣＡ；例えばｎｅｕ Ａｂ−２１）およびＵＰＳＴＡＴＥ ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ；例えばカタログ番号０６−５６２）から得られる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕからの細胞外ドメインに対するヤギポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＦ１１２９）から得られる。全長組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するヤギポリクローナル抗体は、ＥＸＡＬＰＨＡ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ（Ｒｏｓｅｄａｌｅ，ＭＡ；カタログ番号Ｍ１００Ｐ）から得られる。全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するこのようなポリクローナル抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインおよび細胞質ドメインに結合し得、細胞外ドメインに特異的ではないことが予測される。モノクローナル抗体は、細胞外ドメイン（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ１１２９）および細胞質ドメイン（例えば、ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ ｎｅｕＡＢ−８）の両方に対して得られ得る（Ｃ末端ペプチド（例えば、ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ ｎｅｕＡＢ−１５）に対する抗体を含む）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体はまた、Ｈｕｄｚｉａｋら（１９９７年，米国特許第５，６７７，１７１号）において開示されている。１つの改善された実施形態は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮを用いる。なぜなら、この抗体による結合は、患者における処置としてのＨＥＲＣＥＰＴＩＮの結合を最も予測可能だからである。別の有利な実施形態は、ウサギポリクローナル抗体もしくはＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質上の多くのエピトープに結合する抗体のカクテルを使用し、より高い感度を可能にする。

本発明の１つの実施形態において、この意味のアッセイは、インタクトな癌細胞上で、そしてＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインに選択的に結合する抗体を使用して実施される。あるいは、単離された癌細胞は、イムノアッセイの前に溶解され、そしてこのイムノアッセイは、細胞溶解物上で実施される。この場合、イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメインもしくは細胞質ドメインのどちらかに選択的に結合する抗体を使用し得る。本発明のより特定の実施形態において、このイムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質ドメインに選択的に結合する、１種もしくは２種の抗体を使用する。

本発明のイムノアッセイは、より迅速であり、そしてＨｅｒ−２／ｎｅｕについての任意の以前に開発されたイムノアッセイよりもかなり高い感度を有する。本発明のイムノアッセイは、癌を有さないヒト志願者由来の血液１ｍｌあたり１００個以下のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現を検出可能である。本発明のイムノアッセイは、血液サンプル１ｍｌあたり、２０ｐｇ以下のＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルで癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能である。

電気化学発光に加えて、本出願のための高い感度を生じ得る他のイムノアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）Ｌｉｕ Ｙら，２００３（Ｊ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ６６：５１２−７）によって記載されるような化学発光。

（ｂ）Ｙｕ Ｈら，２０００（Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １４：８２９−４０）によって記載される蛍光発生化学発光（ＦＣＬ）
（ｃ）蛍光偏光イムノアッセイ（Ｈｏｗａｎｉｔｚ ＪＨ，１９８８ Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １１２：７７５−９参照）
（ｄ）時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｂｕｔｃｈｅｒ Ｈら，２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７２：２４７−５６；Ｓｏｕｋｋａら，２００１，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４７：１２６９−７８；Ｈｏｗａｎｉｔｚ ＪＨ，１９８８ Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １１２：７７５−９）
好ましい実施形態において、アッセイにおいて使用される乳癌細胞の相対量が、推定される。この相対量は、１細胞あたりの全Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の割合を得ることを可能にし、そしてこの相対量は、１細胞あたりの高レベル、中程度のレベルおよび低レベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を有する乳癌細胞のコントロール標準と比較され得る。これは、好ましい実施形態である。なぜなら、この実施形態は、擬陽性の状況を排除するからである。この擬陽性の状況において、低レベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質発現を有する多くの循環する乳癌細胞が存在し、これらの細胞は、高レベルの発現を有する少数の乳癌細胞から得られたシグナルを模倣するシグナルを生じ得る。この実施形態において、種々のアプローチが、相対的細胞数を推定するために使用され得、これらのアプローチとしては、フローサイトメトリー分析、溶解細胞からの全ＤＮＡもしくはＤＮＡ関連抗原（例えば、ヒストン）の定量（二倍体細胞あたり６ｐｇのＤＮＡが存在する）、および混濁度測定もしくは吸光度測定が挙げられる。

その感度に起因して、本発明に従う、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的化する抗癌剤による処置から利益を得る可能性が高い患者を同定するための方法が、腫瘍生検組織が以前にＨｅｒ−２／ｎｅｕについての組織アッセイによってＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現についてネガティブであることが決定されている患者に対して、有効に適用され得る。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解される。これらの実施例は、例示であり、本明細書中に記載される本発明を限定しない。

（実施例１）
転移性乳癌を有する患者がオフィスを訪れる。そして血液サンプル（８〜４０ｍＬ）を、抗凝集剤（例えばクエン酸）および添加したネガティブ選択産物であるＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳより）を含むＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管内に直接取り出される。ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰは、赤血球抗原を指向し、かつ白血球表面抗原を指向する、二重特異性抗体を含む。この材料を、１５００〜１８００ＲＣＦ（相対遠心力）で２０分間遠心分離する。ゲル境界より上の細胞層を、除去する。ＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭヒトＥｐＣＡＭポジティブ選択カクテルおよびＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭ磁気ナノ粒子（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、そして腫瘍細胞を単離し、そして磁場を用いて洗浄する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するルテニウム標識化ポリクローナル抗体を、トリプロピルアミンの溶液と共に、電極に結合した磁気ビーズに結合した腫瘍細胞に加える。抗体をルテニウム標識する慣用的方法は、当該分野で記載されている（例えば、Ｌｅｅら，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ２００１，６５：１−９）。電流を加え、そして電気化学発光（ＥＣＬ）を、市販のＥＣＬ検出デバイス（ＢＩＯＶＥＲＩＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のようなＥＣＬ検出デバイスを用いて検出する。これらの装置において、光電子増倍管（ＰＭＴ）は、効率的な光捕獲のために作動電極のすぐ上に配置される。作動電極の下には、磁石が、標的抗原でコーティングされたビーズを捕獲するために配置される。このシグナルは、循環する腫瘍細胞の表面上に結合して見出されるＨｅｒ−２／ｎｅｕの量に比例する。

（実施例２）
Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕに対するポリクローナル抗体ではなくＨｅｒ−２／Ｎｅｕに対するモノクローナル抗体を検出のために用いるほかは、実施例１で使用した方法と同じ方法を、提供する。

（実施例３）
単離した乳癌細胞を、磁気ビーズに結合したＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体を添加する前のいずれかで溶解する。溶解を、当該分野で記載されている任意の数の細胞溶解試薬によって達成し得る。これらの試薬は、例えば、溶解溶液Ａ［１％ ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン］およびＲＩＰＡ緩衝液（ＰａｐｅｔｔｉおよびＨｅｒｍａｎ，２００１，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５９：１６５−１７８）であるが、これらに限定されない。このサンドイッチ型のＥＣＬ（Ｙａｎｇら，１９９４，ＥＣＬを用いた「サンドイッチ」イムノアッセイの例について）において、２組のＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体を使用する：１種の抗体は、ビオチン化され、そしてストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）コーティングした磁気ビーズに結合するが、第２の抗体は、ルテニウム標識される。

（実施例４）
患者が、原発性腫瘍の分析に基づいてＨｅｒ２／ｎｅｕについて以前に陰性の結果を有するか、または分析のために容易に使用可能である腫瘍組織を有さないことを除いて、実施例１〜実施例３において使用される方法と同一の方法を、提供する。

（実施例５）
分析において使用される乳癌細胞の相対数を定量する工程を追加して、実施例１〜実施例４において使用される方法と同一の方法を、提供する。ＤＮＡ含量によって細胞を定量するＥＬＩＳＡ（二倍体の核１つあたり６ｐｇのＤＮＡが存在する（ｗｗｗ．ｇｅｎｔｒａ．ｃｏｍ／ｃａｌｃｕｌａｒｉｎｇ．ａｓｐ））が、Ｆｒｉｉｓらによって記載されている（２００３；ＡＰＭＩＳ １１１：６５８−６８）が、本発明のために必要な感度は有さない。本発明に必要な少数の数の検出のためのより感度の高いアッセイを、高度に感度の高いイムノアッセイを用いて達成する。これらのイムノアッセイは、例えば、ＥＣＬを用いることによるアッセイであり、そして同じ装置を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを定量するために使用する。

細胞をＥＣＬによって定量するために、これらを、まず（例えば、これに限定されないが、上述の溶解緩衝液Ａのような溶解緩衝液によって）溶解し、次いで、二本鎖ＤＮＡを指向する２種の異なる抗体（例えば、ＳＴＡＴＥＮＳ ＳＥＲＵＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能であるマウスモノクローナル抗体ＨＹＢ ３３−０１；ＣＨＥＭＩＣＯＮ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能であるマウスモノクローナル抗体ＭＡＢ３０３２；ＡＬＰＨＡ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）から入手可能であるマウスモノクローナル抗体、カタログ番号ＤＮＡ１１−Ｍを添加する；そのうちの１種は、ルテニウムで標識化されており（抗体をルテニウム標識化する慣用的方法は、当該分野で記載されている。例えば、Ｌｅｅら，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ２００１，６５：１−９）、そして他は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）コーティングされた磁気ビーズへの結合のために、ビオチンで標識されている。抗原（この場合、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ））の定量を、トリプロピルアミンおよび磁場の使用によって電極に結合させた磁気ビーズを用いるＥＣＬによって達成する。電流を加え、そして電気化学発光（ＥＣＬ）を、市販のＥＣＬ検出デバイス（ＢＩＯＶＥＲＩＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のようなＥＣＬ検出デバイスを用いて検出する。これらの装置において、光電子増倍管（ＰＭＴ）は、効率的な光捕獲のために作動電極のすぐ上に配置される。作動電極の下には、磁石が、標的抗原でコーティングされたビーズを捕獲するために配置される。このシグナルは、ｄｓＤＮＡの量に比例し、したがって、細胞数に比例する。次いで、これは、細胞数あたりのＨｅｒ−２／ｎｅｕの割合を得ることを可能にする。この割合は、血液１ｍｌあたりの腫瘍細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの絶対数よりも、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ処置に対する患者の感受性を決定するために、本発明において有利である。

（実施例６）
実施例１〜実施例５において示されるように、コントロールサンプルより高いＨｅｒ−２／ｎｅｕレベルを有する患者は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについて陽性である腫瘍細胞を有すると考えられ、したがって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）を含むレジメンによる処置に対して陽性であると考えられる。好ましい処置は、９０分間の注入によって投与される４ｍｇ／ｋｇの初回負荷投与量、および３０分間の注入としての２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持投与量からなる。

（実施例７）
本実施例において、精製組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ（細胞外ドメイン）を、電気化学発光を用いるサンドイッチイムノアッセイの感度を試験するための標準として使用した。

４種の異なるＰＢＳアッセイ緩衝液を、調製した：
●アッセイ緩衝液１：ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中の０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
●アッセイ緩衝液２：ＰＢＳ中の１．０％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ ＢＳＡ
●アッセイ緩衝液３：ＰＢＳ中の０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１．０％ ＢＳＡ
●アッセイ緩衝液４：ＰＢＳ中の１．０％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１．０％ ＢＳＡ
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標準（組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメイン）を、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ ９３０１３ ＵＳＡ；製品ＥＬ５４１）から得た。ヤギ抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕポリクローナル抗体を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ５５４１３ ＵＳＡ）から、ビオチン化形態および非ビオチン化形態で得た（それぞれ、カタログ番号ＢＡＦ１１２９およびカタログ番号ＡＦ１１２９）。モノクローナル抗体ＭＡＢ１１２９も、同様に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから得た（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１９１９２４）。ポリクローナル抗体ＡＦ１１２９およびモノクローナル抗体ＭＡＢ１１２９を、以下のようにルテニウム標識化（「ＴＡＧ標識化」）した：
●１．５μｇ／μｌのルテニウム標識（ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ，カタログ番号１１００３４；ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、ＤＭＳＯ中で調製した。
●５００μｌのモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）について、１８．８μｌ ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを添加し、そして、２００μｌのポリクローナル抗体（０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）について、３．８μｌのＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを、添加した。各々の場合において、溶液を１時間インキュベートし、そして反応を、２０μｌの２Ｍグリシンの添加によって停止した。
●各反応混合物中の未結合ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒを、ＰＢＳ（０．０８％アジ化ナトリウム含有）で事前平衡化したＰＤ−１０ゲル濾過カラムによって除去し、このＰＢＳを溶出にも使用した。各抗体について、各画分中のタンパク質濃度を、タンパク質アッセイによって決定し、そして高タンパク質含量の画分を、この後の実施例において使用した。

ルテニウム標識化ポリクローナル抗体ＡＦ１１２９およびビオチン化ポリクローナル抗体ＢＡＦ１１２９を、本明細書中の本実施例中で以後、「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」と呼ぶ。ルテニウム標識化モノクローナル抗体ＭＡＢ１１２９を、本明細書中の本実施例中で以後、「ＴＡＧ−ｍＡｂ」と呼ぶ。

電気化学発光アッセイを、以下のように実施した：
●連続的に、２５μｌ／ウェル中のＨｅｒ−２／ｎｅｕ標準、次いで５０μｌ／ウェルのＴＡＧ−Ａｂとビオチン−Ａｂとの混合物（例えば、各１μｇ／ｍｌの濃度；４ ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈した）を、９６−ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに加え、そして室温で継続的に撹拌しながら（例えば、２時間）インキュベートした。
●２５μｌ中１０μｇの磁気ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，カタログ番号１１００２８，ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、各ウェルに添加し、そして継続的に撹拌しながら、（例えば、３０分間）インキュベートした。
●ＰＢＳアッセイ緩衝液を、各ウェルに添加し、１ウェルあたりの最終容量を２５０μｌにした。アッセイ中の分析物（組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメイン）の量を、１ウェルあたり１６〜１６００ｐｇで変えた。分析物非含有のコントロールウェルもまた、含めた。全ての条件を、少なくとも２連のウェルで試験した。次いで、９６ウェルプレートを、Ｍ８ Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（カタログ番号３１０８００，ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて分析した。

結果は、ＴＡＧ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂによるサンドイッチイムノアッセイを用いて、全ての試験した組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインのレベル（１６、１６０および１６００ｐｇ／ウェル）が、検出可能であり、かつ４種全ての異なるアッセイ緩衝液を用いた基線よりも上であったことを示した（表１）。組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインはまた、ＡＧ−ｍＡｂおよびビオチン−ｐＡｂによるサンドイッチイムノアッセイを用いても検出可能であった（表２）。

表１．ルテニウム標識化ポリクローナル抗体（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン化ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を用いるイムノアッセイによる、組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕの電気化学発光（ＥＣＬ）検出。

＊抗原非含有のコントロールウェルからの平均シグナルより上の平均ＥＣＬシグナル。

表２．ルテニウム標識化モノクローナル抗体（ＴＡＧ−ｍＡｂ）およびビオチン化ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を用いるイムノアッセイによる、組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕの電気化学発光（ＥＣＬ）検出。

＊抗原非含有のコントロールウェルからの平均シグナルより上の平均ＥＣＬシグナル。
＊＊抗原非含有のコントロールウェルからの平均シグナルより上ではないシグナル。

（実施例８）
以下を除き、実施例７において使用した方法を使用した：
●本実施例を通して使用したＰＢＳアッセイ緩衝液は、ＰＢＳアッセイ緩衝液１であった。
●ルテニウム標識化抗体は、Ｔａｇ−ｐＡｂのみを使用した。添加したＴａｇ−ｐＡｂの濃度は、１μｇ／ｍｌの代わりに、５０μｌ中２μｇ／ｍｌであった。
●組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ（細胞外ドメイン）の量を、４〜６４ｐｇ／ｍｌで変えた。

結果は、組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外の全ての試験したレベル（４、１６および６４ｐｇ／ウェル）は、明らかに検出可能であり、基線より上であったことを示す（図１参照）。

（実施例９）
以下を除き、実施例８において使用した方法を使用した：
●組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ（細胞外ドメイン）の量を、１６ｐｇ／ウェルから４０９６ｐｇ／ウェルまで変えた。

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを検出する能力を、０．０２μｌ／ウェルの細胞溶解緩衝液の存在下もしくは非存在下で試験した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ［Ｍ−ＰＥＲ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬからの製品番号７８５０１）］およびＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ［Ｓｉｇｍａ ＣｅｌＬｙｔｉｃ^ＴＭ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ ２９７８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１０３）］を、別々のウェルで試験した。

この結果を、表３に示す。この実験におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの全量（最低量１６ｐｇ／ウェルを含む）は、検出可能であり、かつ基線よりも上であった（表３）。この知見を、各細胞緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒもしくはＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）の存在下もしくは非存在下で観察した。

表３．組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕのＥＣＬイムノアッセイ。

（実施例１０）
イムノアッセイ方法は、以下を除き、実施例８で使用した通りであった：
●ＳＫ−ＢＲ−３乳癌腫細胞からの細胞抽出物を、分析した。

ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡより）を、６−ウェル組織培養プレート中でＡＴＣＣ推奨条件により増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてアリコートを、血球計を使用して計数した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒもしくはＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒのどちらかを用いて実施した。これらの２種の溶解緩衝液を、上記の実施例９において記載する。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を溶解させるために、１０００，０００個の細胞あたり２００μｌの溶解緩衝液を添加した。細胞溶解を、各製造業者の推奨の通りに、５分間の激しいボルテックスを細胞屑の除去の前に加えて、実施した。細胞屑を、細胞溶解物から、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）において、１４，０００ｒｐｍの３０分間の遠心分離によって除去した。１ウェルあたりの溶解物上清の量を、１０個〜１０００個のＳＫ−ＢＲ−３細胞からの抽出で変化させ、そしてＰＢＳアッセイ緩衝液１による実施例７に記載のイムノアッセイを用いて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについて分析した。

この実験からの結果を、表４に示す。この実験において、ＳＫ−ＢＲ−３細胞からの溶解物からのＨｅｒ−２／ｎｅｕは、この実験における最低量のＳＫ−ＢＲ−３溶解物を用いたウェルを含め、検出可能であり、かつ基線よりも上であった（１ウェルあたり、１０個の細胞からの溶解物を添加した；表４）。この結果は、使用した細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒもしくはＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）にかかわらず観察された。図２および図３は、それぞれＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒおよびＰｉｅｒｃｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いた、３種の最低量（１ウェルあたり１０個、３０個および１００個のＳＫ−ＢＲ−３細胞）のＳＫ−ＢＲ−３細胞からの溶解物についての結果のグラフ図であり、このイムノアッセイを用いる細胞からのＨｅｒ−２／ｎｅｕ検出の線形性を実証する。

表４．ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕのＥＣＬイムノアッセイ検出。

（実施例１１）
この実験において、イムノアッセイ方法は、以下の細胞からのＳｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いた溶解物を試験したことを除き、実施例１０において使用した方法と同様であった：
●ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌腫細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの高発現；Ｇｏｅｂｅｌ ＳＵ，ら，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：３７０２−１０）；調製については実施例１０を参照のこと。このＳＫ−ＢＲ−３細胞株は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の乳癌発現についての適切なポジティブコントロールである。
●ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌腫は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現についての、適切なネガティブコントロール乳癌細胞株である（Ｇｏｅｂｅｌ ＳＵ，ら，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２：３７０２−１０）。細胞増殖およびＳｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いた細胞溶解を、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞について、実施例１０でＳＫ−ＢＲ−３細胞について記載のように実施した。

この実験における結果を、図４に示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞からの溶解物（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのポジティブコントロール）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてのイムノアッセイにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのネガティブコントロール）からの溶解物よりも、ずっと高いシグナルを生じ、これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ検出についての結果の特異性を示す（図４）。

（実施例１２）
この実験において、イムノアッセイ方法は、以下を除き、実施例１１における方法と同様であった：５０μｌ中に添加したＴａｇ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂの両方についての濃度は、各１μｇ／ｍｌの代わりに、各０．５μｇ／ｍｌであった。再び、ＳＫ−ＢＲ−３細胞由来の細胞溶解物を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞由来の細胞溶解物と比較した。この実験における結果を、図５に示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞からの溶解物（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのポジティブコントロール）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてのイムノアッセイにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞からの溶解物（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのネガティブコントロール）よりもずっと高いシグナルを生じ、このことは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ検出の結果の特異性を示す（図５）。また、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、１ウェルあたり０．９個のＳＫ−ＢＲ−３細胞ほどの少量の溶解物材料から検出可能であった；１ウェルあたり０．９個のＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解物材料は、バックグラウンドより高いＥＣＬシグナルを生じ、そしてまた、１００ ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞からの溶解物材料からのシグナルよりも上であった（図５）。

（実施例１３）
この実験において、イムノアッセイ方法は、以下を除き、実施例１２における方法と同様であった：さらなる細胞溶解物（マウス抹消血単核細胞ＰＢＭＣ）を、Ｓｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて得た。ＰＭＢＣは、リンパ球および単球からなり、そして血液からの循環する乳癌細胞の単離をもたらす最初の工程の間に、同時精製され得る。

４ｍｌのマウス血液を、４ｍｌ ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ管中に収集し、そして３０００ｒｐｍで３０分間、Ｊｏｕａｎ ＣＲ４１２遠心分離機中で遠心分離した。ＰＢＭＣを、ゲルより上の細胞画分から収集し、そしてＰＢＳで４回洗浄した。計１０００，０００個のＰＢＭＣを、４ｍｌの血液から収集した。細胞溶解を、ＳＫ−ＢＲ−３細胞についてと同様に実施した。細胞屑を、１４，０００ｒｐｍで３０分間の、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ ５４１５Ｃ）中での遠心分離によって、細胞溶解物から除去した。次いで、上清を、この実験における分析のために使用した。

試験するためのサンプルを、各ウェルに以下を添加することによって調製した：
●１２．５μｌ中１個〜１０個のＳＫ−ＢＲ−３細胞からの細胞溶解物。
● やはり１２．５μｌ中の、１００個〜１０，０００個のＰＢＭＣからの細胞溶解物もしくはコントロールＰＢＳアッセイ緩衝液１。
● Ｔａｇ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂ（５０μｌ中０．５μｇ／ｍｌの各抗体）を含有する５０μｌの溶液を、１ウェルあたりに添加し、そしてこの９６ウェルプレートを、継続して撹拌しながら、２時間室温でインキュベートした。
●２５μｌ中 １０μｇの磁気ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，カタログ番号１１００２８，ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、各ウェルに添加し、そして継続して撹拌しながら、３０分間インキュベートした。
●ＰＢＳアッセイ緩衝液−１を、各ウェルに添加し、１ウェルあたり２５０μｌの最終容量にした。全ての条件を、少なくとも３連のウェルで試験した。次いで、９６ウェルプレートを、Ｍ８ Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（カタログ番号３１０８００，ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いた電気化学発光について分析した。

この実験における結果を、表５および表６ならびに図６において示す。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、１００個、１０００個および１０，０００個のＰＢＭＣから検出不可能であった（表５）。対照的に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、使用した最少量のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞溶解物（１ウェルあたり１個のＳＫ−ＢＲ−３細胞；表６参照）からさえも検出可能であった。さらに、１００個、１０００個および１０，０００個のＰＢＭＣの細胞溶解物の添加でさえ、乳癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出に干渉しなかった（表６および図６）。ＰＭＢＣ（循環する乳癌細胞の単離をもたらす最初の工程の間に同時精製され得る）は、検出不可能なＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現を有し、また、Ｋ−ＢＲ−３細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出に干渉しなかった。

表５．ＥＣＬイムノアッセイによって決定される場合、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、大量（例えば１０，０００個）のＰＢＭＣにおいて検出不可能であった。

＊ネガティブ：ＥＣＬシグナルは、バックグラウンドレベルよりわずかに下であった。

表６．ＰＢＭＣからの溶解物の存在下もしくは非存在下における、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞溶解物におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕのＥＣＬイムノアッセイ検出。

ＮＴ：試験せず。

ＥＣＬイムノアッセイによる、組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ（４ｐｇ／ウェル、１６ｐｇ／ウェルおよび６４ｐｇ／ウェル）の検出。 ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌腫細胞の抽出物（１ウェルあたり１０個、３０個および１００個の細胞溶解物材料）からのＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出。使用した細胞溶解試薬は、Ｓｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒであった。 ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌腫細胞の抽出物（１ウェルあたり１０個、３０個および１００個の細胞溶解物材料）からのＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出。使用した細胞溶解試薬は、Ｓｉｇｍａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒであった。 ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（ｐＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのポジティブコントロール）対ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（ｐＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのネガティブコントロール）からの溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕのイムノアッセイ検出についてのＥＣＬシグナルの比較。各細胞株について、１ウェルあたり１０個、３０個および１００個の細胞からの溶解物材料を使用した。 ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（ｐＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのポジティブコントロール）（１ウェルあたり０．９個、３個および１０個の細胞からの溶解物材料を使用する）対ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（ｐＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのネガティブコントロール）（１ウェルあたり０．９個、３個および１０個の細胞からの溶解物材料を使用する）からの溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕのイムノアッセイ検出についてのＥＣＬシグナルの比較。 １ウェルあたり１個、３個および１０個のＳＫ−ＢＲ−３細胞からの溶解物材料を使用する、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（ｐＨｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現についてのポジティブコントロール）からの溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕのイムノアッセイ検出についての、ＰＢＭＣ（１ウェルあたり１００個〜１０，０００個の細胞）の溶解物による干渉の欠如。

Claims (18)

1. 血液サンプル中の循環する癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、該癌細胞を該血液サンプルから単離し、該単離された癌細胞を溶解し、その後、該単離され溶解された癌細胞において癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であるイムノアッセイを実施する工程であって、該工程において、陽性のイムノアッセイ結果は、該癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す工程を包含し、ここで、該イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに選択的に結合する２種の抗体を用い、そして電気化学発光の検出技術を用い、そして該工程において該イムノアッセイは、以下：
   （ａ）癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを、該血液サンプル１ｍｌあたりＨｅｒ−２／ｎｅｕの１／１０ｐｇと２０ｐｇとの間のレベルで検出可能であること；または
   （ｂ）血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞１００個もしくは１００個未満の濃度で血液中にスパイクする場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能であること
   によって規定される感度を有する、方法。
2. （ａ）における前記感度のレベルは、前記血液サンプル１ｍｌあたりＨｅｒ−２／ｎｅｕの１ｐｇと２０ｐｇとの間である、請求項１に記載の方法。
3. （ａ）における前記感度のレベルは、前記血液サンプル１ｍｌあたりＨｅｒ−２／ｎｅｕの１ｐｇと１０ｐｇとの間である、請求項２に記載の方法。
4. （ａ）における前記感度のレベルは、前記血液サンプル１ｍｌあたりＨｅｒ−２／ｎｅｕの１ｐｇと５ｐｇとの間である、請求項３に記載の方法。
5. （ｂ）における前記感度のレベルは、血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞１０個もしくは１０個未満の濃度である、請求項１に記載の方法。
6. （ｂ）における前記感度のレベルは、血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞３個もしくは３個未満の濃度である、請求項５に記載の方法。
7. （ｂ）における前記感度のレベルは、血液１ｍｌあたりＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞１個もしくは１個未満の濃度である、請求項６に記載の方法。
8. 前記イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質ドメインに選択的に結合する１種または２種の抗体を用いる、請求項１に記載の方法。
9. 前記イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質ドメインに選択的に結合する２種の抗体を用いる、請求項８に記載の方法。
10. 前記イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
11. 前記イムノアッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
12. 前記モノクローナル抗体は、ヒト化マウスモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記モノクローナル抗体は、トラスツズマブである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記癌細胞は、癌細胞に選択的に結合することが可能である免疫磁気ビーズと前記血液とを接触させる工程によって単離される、請求項１に記載の方法。
15. 前記免疫磁気ビーズは、上皮細胞に選択的に結合する、請求項１４に記載の方法。
16. Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的化する抗癌剤による処置から利益を得る可能性が高い癌患者を同定を支援する方法であって、該方法は、請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の方法を包含し、ここで、前記癌細胞含有血液サンプルは、該患者からのサンプルである、方法。
17. 前記患者からの腫瘍生検組織が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについての組織アッセイによって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現について陰性であることが以前に決定されている、請求項１６に記載の方法。
18. 前記組織アッセイは、免疫組織化学およびＦＩＳＨ分析からなる一覧より選択される、請求項１７に記載の方法。

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