JP4782237B2

JP4782237B2 - 神経変性疾患の治療薬

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Publication number: JP4782237B2
Application number: JP2010180888A
Authority: JP
Inventors: 修本望; 和夫端; 廷治上出
Original assignee: Hitachi Ltd; Aska Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd; Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2021-06-26
Also published as: US10640749B2; US20120237946A1; EP2292735A1; US20120230961A1; EP1302534A4; KR20030032973A; WO2002000849A1; KR100947576B1; JP2010260873A; AU2001274624A1; US20120237487A1; US20110158967A1; JP4621410B2; CA2413910A1; KR20090131682A; EP2295539A1; KR100947577B1; CN1449439A; US20130195808A1; JPWO2002000849A1

Description

本発明は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝臓細胞由来の、神経系細胞へ分化しうる細胞および該細胞を含む細胞分画に関する。該細胞および細胞分画は、神経系疾患の治療、特に、自家移植治療への応用が期待される。

稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）（ＡｒｃｈｅｒＤＲ，ｅｔａｌ．１９９４．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ１２５：２６８−７７．、ＢｌａｋｅｍｏｒｅＷＦ，ＣｒａｎｇＡＪ．１９８８．ＤｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ１０：１−１１．、ＧｕｍｐｅｌＭ，ｅｔａｌ．１９８７．ＡｎｎＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄＳｃｉ４９５：７１−８５．）、またはシュワン細胞（ＢｌａｋｅｍｏｒｅＷＦ．１９７７．Ｎａｔｕｒｅ２６６：６８−９．、ＢｌａｋｅｍｏｒｅＷＦ，ＣｒａｎｇＡＪ．１９８８．ＤｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ１０：１−１１．、ＨｏｎｍｏｕＯ，ｅｔａｌ．１９９６．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１６：３１９９−２０８．）もしくはオルファクトリーエンシーティング細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｔｉｎｇｃｅｌｌｓ）（ＦｒａｎｋｌｉｎＲＪ，ｅｔａｌ．１９９６．Ｇｌｉａ１７：２１７−２４．、ＩｍａｉｚｕｍｉＴ，ｅｔａｌ．１９９８．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１８（１６）：６１７６−６１８５．、ＫａｔｏＴ，ｅｔａｌ．２０００．Ｇｌｉａ３０：２０９−２１８．）などの髄鞘形成細胞を移植すると、動物モデルにおいて再有髄化が誘発され、電気生理学機能を回復させることができる（ＵｔｚｓｃｈｎｅｉｄｅｒＤＡ，ｅｔａｌ．１９９４．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１：５３−７．、ＨｏｎｍｏｕＯ，ｅｔａｌ．１９９６．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ１６：３１９９−２０８．）。このような細胞を患者若しくは他人から調製して、細胞治療法に用いることも不可能ではないが、組織材料を脳または神経から採取しなければならないため問題が多い。

脳から得られる神経前駆細胞または幹細胞には、自己複製能力があり、さまざまな細胞系譜の神経細胞や膠細胞に分化することが知られている（ＧａｇｅＦＨ，ｅｔａｌ．１９９５．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：１１８７９−８３．、ＬｏｉｓＣ，Ａｌｖａｒｅｚ−ＢｕｙｌｌａＡ．１９９３．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｅｉＵＳＡ９０：２０７４−７．、ＭｏｒｓｈｅａｄＣＭ，ｅｔａｌ．１９９４．Ｎｅｕｒｏｎ１３：１０７１−８２．、ＲｅｙｎｏｌｄｓＢＡ，ＷｅｉｓｓＳ．１９９２．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１７０７−１０．）。胎児組織から採取したヒト神経幹細胞を新生仔マウスの脳に移植すると、神経細胞と星状細胞に分化したり（Ｃｈａｌｍｅｒｓ−ＲｅｄｍａｎＲＭ，ｅｔａｌ．１９９７．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７６：１１２１−８．、ＭｏｙｅｒＭＰ，ｅｔａｌ．１９９７．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｃ２９：２０４０−１．、ＳｖｅｎｄｓｅｎＣＮ，ｅｔａｌ．１９９７．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ１４８：１３５−４６．）、また再有髄化させることもできる（ＦｌａｘＪＤ，ｅｔａｌ．１９９８．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６：１０３３−９．）。脱髄化した齧歯類の脊髄に成人脳由来の神経前駆細胞を移植すると、再有髄化が行なわれて、インパルスの伝導を回復したことが報告されている（ＡｋｉｙａｍａＹ，ｅｔａｌ．２００１．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ．）。

これらの研究は、上記細胞が、神経系疾患の修復術に利用できるかもしれないことを示唆しているため、大きな関心を引いている。（ＡｋｉｙａｍａＹ，ｅｔａｌ．２００１．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ，．、Ｃｈａｌｍｅｒｓ−ＲｅｄｍａｎＲＭ，ｅｔａｌ．１９９７．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７６：１１２１−８．、ＭｏｙｅｒＭＰ，ｅｔａｌ．１９９７．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｃ２９：２０４０−１．、ＳｖｅｎｄｓｅｎＣＮ，ｅｔａｌ．１９９７．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ１４８：１３５−４６．、ＹａｎｄａｖａＢＤ，ｅｔａｌ．１９９９．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６：７０２９−３４．）。しかし、これらの細胞は、採取方法の確立や栄養因子を用いて細胞増殖させる必要があるなど、細胞移植療法（自家移植を含む）の確立には、まだ問題が残っている。
最近の研究によって、神経幹細胞が、インビボで造血細胞を発生させうることが明らかになり、神経前駆細胞は神経細胞系譜には限定されないことが示された（ＢｊｏｒｎｓｏｎＣＲ，ｅｔａｌ．１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３：５３４−７．）。さらに、骨髄間質細胞を新生仔マウスの側脳質に注入すると星細胞へ分化したり（ＫｏｐｅｎＧＣ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６：１０７１１−６．）、または、適当な細胞培養条件下では、インビトロで神経細胞に分化することが報告されている（ＷｏｏｄｂｕｒｙＤ，ｅｔａｌ．２０００．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ６１：３６４−７０．）。

ところで、本発明者は、これまでにヒト成人由来の神経細胞を、脳より抽出・培養し、セルライン化し、その機能を検討したところ、当該神経細胞には、自己複製機能と多分化機能が存在することを新規に見出している。すなわち、脳より得た神経細胞の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）を単一細胞展開（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ）し、セルライン化したものをｉｎｖｉｔｒｏの系でクローン分析を行ったところ、自己複製能（すなわち、増殖能）と、多分化能［すなわち、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、膠星状細胞（アストログリア；ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア；ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）への分化］が認められ、したがって、この細胞には神経幹細胞の性質があることを確認している。

実際に、この細胞をラット虚血モデル、外傷モデルを用いて移植実験を行ったところ、極めて良好な生着率、遊走、分化を示した。また、当該細胞を脊髄脱髄モデルラットへ移植したところ、機能的な髄鞘が形成されることを認めている。すなわち、脊髄脱髄モデルラットにおいて、脱髄された神経軸索が再有髄化され、神経機能が回復するものであり、当該細胞の移植治療法の効果を、組織学的、電気生理学的、行動科学的に確認している。
上記の事実から判断すれば、自己の大脳より少量の神経組織を採取して、神経幹細胞を抽出・培養し、得られた神経幹細胞を、自己の脊髄の損傷部位に移植することは、自家移植療法として、極めて応用性の高い治療法となるものと考えられる。

しかしながら、大脳より神経幹細胞を含んだ組織を採取することは、採取にあたって神経脱落症状が発生しないとはいえ、容易なことではない。したがって、より安全で、かつ簡便な自家移植療法を確立することは、今日の複雑な各種疾患に対する治療法の確立という点から、極めて重要なことといえる。

そこで、本発明は、安全かつ簡便に調製することができ、神経系疾患の治療に有効な細胞材料を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該細胞材料を利用した神経系疾患の治療法、好ましくは自家移植療法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の現状を鑑み、ドナー細胞の獲得のために、神経幹細胞の採取技術より容易であり、今日の医療の現場で日常的に行なわれている、骨髄より骨髄細胞を採取する技術に着目した。そこで、まず、マウスの骨髄より骨髄細胞を採取して、単核細胞分画だけを分離し、これをドナー細胞としてラット脊髄脱髄モデルへ移植した。その結果、驚くべきことに、脱髄された神経軸索が再有髄化されることを見出した。すなわち、本発明者らは、骨髄細胞より調製した単核細胞分画が神経系細胞への分化能を有するものであることを新規に見出した。さらに、本発明者らは、該単核細胞分画から分離した、中胚葉幹細胞を含む細胞分画、間質細胞を含む細胞分画、およびＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画が神経系細胞への分化能を有することを見出した。これら細胞分画は、骨髄細胞のみならず、臍帯血細胞から調製することも可能である。また、ＡＣ１３３陽性細胞は、胎児肝細胞から調製することも可能である。

従って、本発明は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た細胞の一分画であって、神経系細胞へ分化し得る細胞を含む細胞分画を提供する。

他の一つの態様において、該細胞分画は、ＳＨ２（＋），ＳＨ３（＋），ＳＨ４（＋），ＣＤ２９（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ１４（−），ＣＤ３４（−），ＣＤ４５（−）の特徴を有する中胚葉幹細胞を含む細胞分画である。

他の一つの態様において、該細胞分画は、Ｌｉｎ（−），Ｓｃａ−１（＋），ＣＤ１０（＋），ＣＤ１１Ｄ（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ４５（＋），ＣＤ７１（＋），ＣＤ９０（＋），ＣＤ１０５（＋），ＣＤＷ１２３（＋），ＣＤ１２７（＋），ＣＤ１６４（＋），フィブロネクチン（＋），ＡＬＰＨ（＋），コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する間質細胞を含む細胞分画である。

他の一つの態様において、該細胞分画は、ＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。

また、本発明は、上記細胞分画に含まれる、神経系細胞へ分化し得る細胞を提供する。

さらに本発明は、上記単核細胞分画または上記細胞を含む神経系疾患の治療のための組成物を提供する。好ましい態様において、神経系疾患は、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中、脳腫瘍、高次機能障害、精神疾患、痴呆、てんかん、外傷性の神経系疾患、並びに脊髄梗塞からなる群より選択される疾患である。

さらに本発明は、上記単核細胞分画、上記細胞、または上記組成物を移植することによる神経系疾患に対する治療方法を提供する。好ましい態様において、該ドナー細胞は、レシピエントに由来している。

本発明は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうることを特徴とする細胞を含む細胞分画を提供する。本発明が提供する細胞分画に含まれる細胞の神経系細胞への分化は、いわゆる血液系細胞の神経系細胞への形質転換により生じるのか、それとも骨髄細胞などの中に存在する神経細胞に分化できる未熟な細胞の分化によるものであるかは明確ではないが、神経系細胞へ分化する細胞は、主として、幹細胞、即ち、自己増殖能と多分化能を有する細胞であると考えられる。また、神経系細胞へ分化する細胞は、ある程度他の胚葉へ分化している幹細胞でありうる。

本発明の細胞分画に含まれる細胞は、栄養因子によって増殖することは要せず（栄養因子によって増殖することは可能である）、神経自己移植技術の開発という点では簡便で、かつ現実性の高いものであり、その医療産業上の有益性は多大なものであるといえる。本発明の細胞分画は、一般的には、脊椎動物に由来する。好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ヒトなど）由来である。

本発明の細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞または臍帯血細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇ／ｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液（５−１０μｌ）を溶液（１Ｌ−１５を２ｍｌ＋Ｆｉｃｏｌを３ｍｌ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）し、単核細胞分画（約１ｍｌ）を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（ＮＰＢＭ２ｍｌ）に混合して、再度、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。本発明の細胞分画の採取源としては、大腿骨以外にも、胸骨や、骨盤を形成している腸骨から採取することもできる。これらの骨以外でも大きい骨であれば採取可能である。また、骨髄バンクに保存してある骨髄液や臍帯血から採取することも可能である。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞または臍帯血細胞より単離・精製して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞を含む細胞分画である。「中胚葉幹細胞」とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（分裂、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。中胚葉幹細胞は、例えば、ＳＨ２（＋），ＳＨ３（＋），ＳＨ４（＋），ＣＤ２９（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ１４（−），ＣＤ３４（−），ＣＤ４５（−）の特徴を有する細胞である。中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞または臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＳＨ２等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、神経系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞または臍帯血細胞を、９００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス）により変動しうる。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（２５ｍｌ）または臍帯血を同量のＰＢＳ溶液に混合し、遠心（９００ｇで１０分間）し、沈降細胞をＰＢＳに混合して回収（細胞密度は４×１０⁷細胞／ｍｌ程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち５ｍｌをＰｅｒｃｏｌ液（１．０７３ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（９００ｇで３０分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を培養溶液（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ₂ ｉｎａｉｒ）。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞または臍帯血細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうる間質細胞を含む細胞分画である。間質細胞は、例えば、Ｌｉｎ（−），Ｓｃａ−１（＋），ＣＤ１０（＋），ＣＤ１１Ｄ（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ４５（＋），ＣＤ７１（＋），ＣＤ９０（＋），ＣＤ１０５（＋），ＣＤＷ１２３（＋），ＣＤ１２７（＋），ＣＤ１６４（＋），フィブロネクチン（＋），ＡＬＰＨ（＋），コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する細胞である。間質細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞または臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記Ｌｉｎ等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、脊椎動物から採取した骨髄細胞または臍帯血細胞を、８００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を同量の溶液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．６％クエン酸ナトリウム＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）溶液に混合し、そのうちの５ｍｌをＦｉｃｏｌ＋Ｐａｑｕｅ液（１．０７７ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（８００ｇで２０分間）し、単核細胞分画を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（ＡｌｆａＭＥＭ，１２．５％ＦＢＳ，１２．５％ウマ血清，０．２％ｉ−イノシトール，２０ｍＭ葉酸，０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール，２ｍＭＬ−グルタミン，１μＭヒドロコルチゾン，１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転、１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ₂ ｉｎａｉｒ）。

本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうるＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。この細胞分画は、例えば、骨髄細胞または臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＡＣ１３３（＋）の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。

また、脊椎動物から採取した胎児肝細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる細胞分画を回収し、この細胞分画から、ＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。

具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した肝臓組織をＬ−１５溶液内で洗浄し、酵素処理（Ｌ−１５＋０．０１％ＤｎａｓｅＩ、０．２５％トリプシン，０．１％コラゲナーゼを含む溶液中で、３７度で３０分間）し、ピペッティングにより単一細胞にする。この単一細胞となった胎児肝細胞から、実施例１（１）において大腿骨から単核細胞分画を調製したのと同様に、遠心分離を行なう。これにより得られた細胞を洗浄し、洗浄後の細胞からＡＣ１３３抗体を利用してＡＣ１３３（＋）細胞を回収する。これにより胎児肝細胞から神経系細胞へ分化しうる細胞を調製することができる。抗体を利用したＡＣ１３３（＋）細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（ＦＡＣＳなど）を利用して行なうことができる。

これら中胚葉幹細胞、間質細胞、あるいはＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画は、脊髄脱髄領域への移植後に、効率よく再有髄化する。特に、上記中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、脳梗塞モデルへの移植に用いても、良好に生着し、神経系細胞あるいはグリア細胞に分化することができる。

本発明は、また、上記細胞分画に含まれる、神経系細胞に分化し得る細胞を提供する。該細胞には、例えば、上記細胞分画に含まれる神経幹細胞、中胚葉幹細胞、および間質細胞、ＡＣ１３３陽性細胞が含まれるが、神経系細胞に分化し得る限り、これらに制限されない。

本発明は、また、本発明の細胞分画または細胞を含む、神経系疾患の治療ための組成物を提供する。本発明の細胞分画や細胞はそのまま移植に用いることも可能であるが、移植による治療効率を向上させるために、種々の薬剤を添加した、あるいは遺伝子導入した組成物として、移植することも考えられる。本発明の組成物の調製においては、例えば、（１）本発明の細胞分画に含まれる細胞の増殖率を向上させるまたは神経系細胞への分化を促進する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（２）本発明の細胞分画に含まれる細胞の損傷神経組織内での生存率を向上させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（３）本発明の細胞分画に含まれる細胞が、損傷神経組織から受ける悪影響を阻止する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（４）ドナー細胞の寿命を延長させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（５）細胞周期を調節する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（６）免疫反応の抑制を目的とした物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（７）エネルギー代謝を活発にする物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（８）ドナー細胞のホスト組織内での遊走能を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、（９）血流を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入（血管新生誘導も含む）、を行なうことが考えられるが、これらに制限されるものではない。

本発明の細胞分画、細胞、および組成物は、神経系疾患の治療に用いることができる。治療の対象となる神経系疾患としては、例えば、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、並びに脊髄梗塞が挙げられるが、これらに制限されない。

本発明によれば、レシピエント由来の骨髄細胞から分離して得た細胞をドナー細胞として移植することができる（自家移植療法）。この事は、移植による拒絶反応の危険性も少なく、免疫抑制剤を併用しなければならない困難性がない点で好ましい。自家移植療法が困難な場合には、他人または他の動物由来の細胞を利用することも可能である。細胞は冷凍保存したものであってもよい。ドナー細胞は、臍帯血由来であってもよい。

骨髄液の採取は、例えば、採取源となる動物（ヒトを含む）を麻酔し（局所または全身麻酔）、胸骨若しくは腸骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより行なうことができる。また、出生時に臍帯に直接針を刺し、注射器で吸引して、臍帯血を採取保存しておくことは確立された技術となっている。

患者への細胞の移植は、例えば、移植する細胞を、人工脳脊髄液や生理食塩水などを用いて浮遊させた状態で注射器に溜め、手術により損傷した神経組織を露出し、この損傷部位に注射針で直接注入することにより行なうことができる。本発明の細胞分画に含まれる細胞は、遊走能が高いため、神経系組織内を移動することができる。したがって、損傷部位の近傍へ移植してもよい。また、脳脊髄液中への注入でも効果が期待できる。この場合、通常の腰椎突刺で細胞を注入することができるため、患者の手術の必要はなく、局所麻酔のみで済むため、病室で患者を処置できる点で好適である。さらに、静脈内への注入でも効果が期待できる。従って、通常の輸血の要領での移植が可能となり、病棟での移植操作が可能である点で好適である。

また、本発明の細胞分画に含まれる細胞は、その遊走能の高さから、遺伝子の運び屋（ベクター）として利用することも考えられる。例えば、脳腫瘍などの各種神経疾患に対する遺伝子治療用ベクターとしてに利用が期待される。

図１は、１ｍｍ間隔で試験した背面カラム横断面の光学顕微鏡写真である；（Ａ）正常、および（Ｃ）損傷をおこした脱髄軸索。背面カラムを高倍率で観察したものが、（Ｂ）正常軸索、および（Ｄ）脱髄軸索である。スケールバーは２５０μｍ（Ａ，Ｃ）および１０μｍ（Ｂ，Ｄ）を表す。図２は、（Ａ）成体マウスの骨髄細胞移植後、および（Ｃ）シュワン細胞移植後のラット脊髄の再有髄化を示す写真である。（Ｂ）骨髄細胞移植後、および（Ｄ）シュワン細胞移植後の再有髄化軸索を高倍率で観察した写真である。スケールバーは、２５０μｍ（Ａ，Ｃ）および１０μｍ（Ｂ，Ｄ）を表す。図３は、骨髄移植後の脊髄後索における再有髄化軸索を電子顕微鏡で観察した写真である。基質Ｘ−Ｇａｌで組識を処理し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つ骨髄移植細胞（反応生成物を矢印で表す）を損傷中に検出した。高倍率試験により、繊維の周りに基底板（ｂａｓａｌｌａｍｉｎａ）が観察された（くさび；スケールバー１μｍ）。移植細胞に存在する大きな細胞質領域と核領域、および基底板は、末梢の髄鞘形成の特徴を示す。

以下に本発明を、具体的試験例に基づく実施例を説明しながら、さらに詳細に説明していく。
［実施例１］骨髄細胞およびシュワン細胞の調製
（１）骨髄単核細胞
マウス骨髄細胞（１０μｌ）を、ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子）トランスジェニックマウス（ジャクソン研究所）の大腿骨より採取した。採取した細胞サンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ３ｍｌを含有するＬ−１５培地（２ｍｌ）中に希釈して、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１５分間）した。単核球画分から細胞を集め、２ｍｌの無血清培地（前駆神経細胞維持培地（ＮｅｕｒａｌＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅＭｅｄｉｕｍ）：ＮＰＭＭ）中に懸濁し、さらに遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１５分間）して、上澄みを除去し、沈降した細胞を回収した。この細胞を再びＮＰＭＭに懸濁した。

（２）シュワン細胞
本望らの方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６（１０）：３１９９−３２０８，１９９６）に従い、新生児マウス（Ｐ１−３）の坐骨神経からシュワン細胞の初代培養細胞を樹立した。すなわち、坐骨神経から酵素的および物理的処理によって細胞を解離させて、１プレートあたり８×１０⁵個の細胞を、ポリ（Ｌ−リジン）コートした１００−ｍｍ²の組織培養皿に接種し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清入りのダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。

［実施例２］実験動物の作製と細胞移植
（１）脱髄モデルラットの調製
１２週齢のウイスター（ｗｉｓｔａｒ）系ラットを用いて実験を行なった。脊髄後索にＸ−線を照射した後、臭化エチジウムを注射して（ＥＢ−Ｘ処理）、局所的な脱髄傷害を生じさせた。すなわち、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）をラットの腹腔内に投与して麻酔し、鉛製遮蔽板（４ｍｍ厚）中に設けた２ｘ４ｃｍの開口部を通して、第１０胸椎レベル（Ｔ−１０）から尾部に向かう脊髄部分に対し、ＳｏｆｔｘＭ−１５０ＷＺ放射線治療機（１００ｋＶ，１．１５ｍＡ，ＳＳＤ２０ｃｍ，照射量２００ｃグレイ／分）を使用して表面線量４０グレイのＸ−線を照射した。Ｘ−線照射後３日目にラットを上記と同様に麻酔してから、無菌条件下で第１１胸椎部位（Ｔ−１１）の脊弓を切除した。先端を長く延ばしたガラスマイクロピペットにより、後索部位に臭化エチジウム（ＥＢ）を直接注射して、脱髄損傷部位を生じさせた。すなわち、深さ０．７ｍｍと０．４ｍｍの位置に０．３ｍｇ／ｍｌＥＢ含有生理食塩水０．５μｌを注射した。

（２）前駆神経細胞の移植
ＥＢ注射を行なってから３日後に、上記ＥＢ−Ｘ傷害部位の中央に、実施例１で得た細胞懸濁液１μｌ（１ｘ１０⁴ ｃｅｌｌｓ／μｌ）を注射により移植した。移植処理を施したラットには、シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与して免疫抑制した。

［実施例３］組織学的試験
ラットの腹腔内にペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与して深麻酔し、心臓カニューレを通して、最初にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を灌流し、次いで、０．１４ＭＳｏｒｅｎｓｅｎ’ｓ（セーレンセン）リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中２％グルタールアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドを含有する固定液を灌流した。インサイチューで１０分間固定した後、脊髄を慎重に切り出し、１ｍｍの長さに切り分けてから、新しい固定液中に保存した。この組織を、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓリン酸緩衝液で数回洗浄し、２５℃にて２時間、１％オスミウム酸（ＯｓＯ₄）中で後固定した後、エタノール溶液の濃度を上げながら脱水し、プロピレンオキサイドに通してからＥＰＯＮ中に包理した。切片を１μｍ厚に切り出して、０．５％メチレンブルーおよび０．５％アズールＩＩを含有する０．５％ホウ酸溶液で対比染色し、光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製：ＡｘｉｏｓｋｏｐＦＳ）を用いて観察した。また、薄片をウラニルおよび鉛塩で対比染色し、ＪＥＯＬＪＥＭ１２００ＥＸ電子顕微鏡（日本電子社製）を６０ｋＶで操作しながら観察を行なった。

細胞を最初に注射した部位近傍にある後索中核内の領域５０×５０μｍを標準化して、形態計測を行なった。この領域内における再有髄化軸索と軸索に結合している細胞体数とを数え、密度を１平方ミリメートル当たりにして計算した。この標準化領域内における軸索と細胞体の直径、多小葉核をもつ細胞の数、および軸索の有髄化を示す細胞の数も調べた。核実験条件毎に、５匹のラットを解析し（ｎ＝５）、ラット１匹当たり５つの切片を調製して、計測を行なった。計測値の変動は標準誤差で示す（±ＳＥＭ）。

脊髄後索は、ほとんどが有髄軸索からできている（図１Ａ、Ｂ）。腰椎脊髄の後索にＸ−線を照射すると内生グリア細胞の増殖が阻害され、さらに、その部位に核キレート剤である臭化エチジウムを投与すると、稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）などのグリア細胞（ｇｌｉａｌｃｅｌｌ：神経膠細胞）が損傷して局所的な脱髄化が生じた。このようにして生じた損傷部位では、神経軸索は保存されていたが、内因性グリア細胞［膠星状細胞（アストログリア：ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）および稀突起膠細胞］は、ほぼ完全に欠失していた（図１Ｃ）。光学顕微鏡の倍率を上げて観察すると、この損傷部位では、脱髄軸索からなる密集部が、髄鞘の破片が存在する領域とマクロファージが存在する領域とによって隔てられながらも、近接して並んでいるのが分かる（図１Ｄ）。損傷部位は、後索の背腹側ほぼ全領域にわたって、５−７ｍｍの長さで見られた。シュワン細胞または膠星状細胞による内因性浸潤は、６週ないし８週後になるまではほとんど見られないが、浸潤が始まると、これらのグリア細胞が周縁部から侵入してくる。このことから、脱髄およびグリア細胞の欠失した状態が、少なくとも６週間はｉｎｖｉｖｏで継続することが分かる。

免疫抑制した脊髄脱髄モデルラットの損傷部位の中央部に、ＬａｃＺトランスジェニックマウス骨髄細胞（ＢＭ）を移植してから３週間後には、広範囲で脱髄軸索の再有髄化が見られた（図２Ａ、Ｂ）。後索の舌状領域全域にわたり、また、損傷部位の前後全領域にわたっても再有髄化が見られた。図２Ｃおよび図２Ｄは、同種異系シュワン細胞（ＳＣ）をＥＢ−Ｘ損傷モデルラットに移植したときに見られる再有髄化パターンを示している。骨髄細胞を移植した場合にも、シュワン細胞を移植した場合にも、再有髄化された軸索の周りに大きな核領域と細胞質領域ができ、末梢神経の髄鞘と同じ特徴を示したことが注目される。

［実施例４］ｉｎｖｉｖｏにおけるβ−ガラクトシダーゼ反応生成物の検出
移植してから３週間後に、β−ガラクトシダーゼを発現する髄鞘形成細胞をｉｎｖｉｖｏで観察した。脊髄を採取し、リン酸緩衝液中０．５％グルタールアルデヒドで１時間固定してから、ビブラトームを用いて１００μｍ厚の切片を切り出した。この切片を、Ｘ−Ｇａｌ発色液（３５ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆／３５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆・３Ｈ₂Ｏ／２ｍＭＭｇＣｌ₂−リン酸緩衝液）中最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼと反応し発色する基質）と共に３７℃で一晩インキュベートし、細胞内を青色に発色させて、β−ガラクトシダーゼを発現する髄鞘形成細胞を検出した。次に、この切片を３．６％（ｖ／ｖ）グルタールアルデヒド含有リン酸緩衝液（０．１４Ｍ）中でさらに３時間固定し、青色の反応生成物（β−ガラクトシダーゼ反応生成物）の存在を光学顕微鏡で観察した。１％オスミウム酸によって組織染色を行ない、エタノールの段階希釈液で脱水し、さらに、プロピレンオキサイドに短時間浸した後、ＥＰＯＮ中に包理した。そして、それ以上の染色は行なわずに、電子顕微鏡下で超薄切片を観察した。

電子顕微鏡で解析すると、ドナー細胞由来の髄鞘形成細胞の大半は基底膜を保持していた（図３：くさび印）。また、髄鞘形成細胞は比較的大きな細胞核と細胞質を保持していることから、末梢型の髄鞘を形成したことが分かる。

本実験で用いた損傷モデルでは、６週間以上経過しないと稀突起膠細胞またはシュワン細胞による内因性の再有髄化はほとんど起こらないことが確認された。さらに、電子顕微鏡レベルでは、ＬａｃＺをレポーター遺伝子としてもつドナー細胞、すなわちＸ−Ｇａｌ陽性細胞は、髄鞘を形成することが観察された（図３：矢印）。

骨髄細胞をＥＢ−Ｘ損傷部位に移植した後には、ニューロンおよびグリア細胞への分化が見られたが、これは、シュワン細胞を移植した後には見られなかった。ＥＢ−Ｘ損傷部位中のＬａｃＺ陽性細胞（骨髄移植細胞）の５％がニューロン特異的エノラーゼ（ＮｅｕｒｏｎＳｐｅｃｉｆｉｉｃＥｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ）に対して免疫応答性を示し、３．９％がグリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＡＰ）に対して免疫応答性を示したことは、骨髄細胞の一部は、それぞれ、インビボでニューロン様またはグリア細胞に分化しうることを示唆している。

さらに、本発明者らは、実施例１（１）で得られた細胞画分から、抗体を利用して細胞表面マーカーＳＨ２（＋），ＳＨ３（＋），ＣＤ２９（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ１４（−），ＣＤ３４（−），ＣＤ４５（−）の性質を示す中胚葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を単離した。これをラット脊髄脱髄領域に移植すると、さらに効率よく再有髄化されることを発見した。この細胞をラット脳梗塞モデルへの移植に用いても、良好に生着し、神経細胞やグリア細胞に分化することが分かった。

さらに、本発明者らは、実施例１（１）で得られた細胞画分から、細胞表面マーカーＬｉｎ（−），Ｓｃａ−１（＋），ＣＤ１０（＋），ＣＤ１１Ｄ（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ４５（＋），ＣＤ７１（＋），ＣＤ９０（＋），ＣＤ１０５（＋），ＣＤＷ１２３（＋），ＣＤ１２７（＋），ＣＤ１６４（＋），フィブロネクチン（＋），ＡＬＰＨ（＋），コラーゲナーゼ−１（＋）の性質を示す間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ）を単離した。この細胞をラット脊髄脱髄領域に移植したときにも、効率よく再有髄化された。

さらに、本発明者らは、実施例１（１）で得られた細胞画分から、細胞表面マーカーＡＣ１３３（＋）の性質を示す細胞を単離した。この細胞をラット脊髄脱髄領域に移植したときにも、効率よく再有髄化された。

また、本発明者らは、以下の手法によりラット胎児肝細胞から神経系細胞へ分化し得るＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画を得た。即ち、まず、ラット胎児から採取した肝臓組織をＬ−１５溶液内で洗浄し、酵素処理（Ｌ−１５＋０．０１％Ｄｎａｓｅｌ，０．２５％トリプシン，０．１％コラゲナーゼを含む溶液中で、３７度で３０分間）し、数回ピペッティングして、組織を単一細胞にまで分離した。この単一細胞となった胎児肝細胞から、実施例１（１）において大腿骨から単核細胞分画を調製したのと同様に、遠心分離を行なうことにより単核細胞分画を得た。これを洗浄し、洗浄後の細胞分画からＡＣ１３３抗体を利用してＡＣ１３３（＋）細胞を回収した。ＡＣ１３３（＋）細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（ＦＡＣＳなど）を利用して行なうことができる。これにより得られたＡＣＴ３３陽性細胞をラット脊髄脱髄領域に移植したときにも、効率よく再有髄化された。

以上に記載したように、本発明は、骨髄由来の骨髄細胞、臍帯血由来の細胞、あるいは胎児肝臓由来の細胞を採取し、単離・精製して得た単核細胞分画を提供するものである。かかる単核細胞分画を脊髄脱髄モデル動物に移植したところ、脱髄された神経軸索が再有髄化されることが確認された。

移植に用いる細胞は、骨髄から吸引した少量の骨髄液から比較的簡単に単離することができ、細胞を採取してから数十分内に、移植用に調製することができる。したがって、これらの細胞は、脱髄疾患治療のための自家移植を行うための有効かつ再生可能な細胞材料となりうる。

この事実は、中枢神経系脱髄疾患の治療として、神経自家移植技術の開発にひとつの光明を与えるものである。また、本発明はより一般的で、広領域の脳神経損傷に対する神経移植・再生療法への応用も可能であると考えられる。すなわち、中枢神経系および末梢神経系の虚血性脳神経損傷、外傷性脳神経損傷、脳神経変性疾患、代謝性神経疾患への自家移植療法に光明を与えるものである。

本発明は、血球系細胞をドナー細胞として用いている。このため、神経系疾患に対する移植療法であるにもかかわらず、神経組織への直接移植のみならず、血管内への移植も可能である。即ち、血管内への移植により神経組織へドナー細胞が移行し、神経組織を再生する可能性がある。従って、本発明は、非侵襲的な移植治療法の開発に光明を与えるものである。

さらに、本発明は、血球系細胞から神経系細胞への分化の機序を解く糸口を提供している。このような分化を規定する遺伝子が同定・解析されれば、それら遺伝子を利用して体内に存在する血球系細胞を効率良く、また十分量、神経系細胞へ形質転換させることが期待できる。従って、本発明は、神経組織の再生を促すための”遺伝子治療”へ光明を与えるものである。

Claims

骨髄又は臍帯血由来の単離された、神経細胞又はグリア細胞へ分化しうる細胞であって、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、及びＣＤ４５（−）の性質で単離された細胞
からなる、神経変性疾患の治療薬。
骨髄又は臍帯血由来の単離された、神経細胞又はグリア細胞へ分化しうる細胞であって、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、及びＣＤ４５（−）の性質で単離された細胞
からなる、脱髄疾患の治療薬。
骨髄又は臍帯血由来の単離された、神経細胞又はグリア細胞へ分化しうる細胞であって、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、及びＣＤ４５（−）の性質で単離された細胞
からなる、脳腫瘍の治療薬。
骨髄又は臍帯血由来の単離された、神経細胞又はグリア細胞へ分化しうる細胞であって、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、及びＣＤ４５（−）の性質で単離された細胞
からなる、てんかんの治療薬。