JP4774989B2 - 胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚様体を形成する際に用いる胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、試験管内でも様々な細胞に分化する能力をもつ。ＥＳ細胞を試験管内で分化させる方法としては、浮遊培養によって胚様体と呼ばれる擬似的な胚を形成させる方法、ストローマ細胞のように分化と増殖を支持する細胞と共培養する方法が利用されている。ＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病阻止因子：ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を加えずに高密度になるまで培養し、シャーレ等の培養容器に接着しないように浮遊培養させて細胞塊を形成すると、その後、様々な種類の細胞に分化することが知られている。浮遊培養で形成された細胞塊は、胚様体（ＥＢ）と呼ばれ、浮遊培養は、ＥＳ細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる方法である。
胚様体は、二重の細胞層から成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、内層は胚体外胚葉にあたる。２つの胚葉は、基底膜によって隔てられている。該構造は、マウスの６日胚である円筒胚によく似ており、その限りにおいて胚の正常な発生段階に近い。胚様体においては、中胚葉の誘導も起き、心筋細胞、血液細胞、更には原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させて培養を続けると様々な種類の細胞に分化する。この中には、神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、脂肪細胞等が含まれる。胚様体の形成を経て分化する細胞は、体細胞に限らず、最近では生殖細胞系譜への分化も起きることが確認されている。このように胚様体の形成はＥＳ細胞の多分化能を示すのに都合がよい。
【０００３】
胚様体を形成させる為には、ES細胞を培養容器に接着しないように工夫した「ハンギング・ドロップ法」が広く用いられている。ガラス容器のふたから垂れ下がった水滴の中にES細胞を入れて培養するハンギング・ドロップ法１、又は培養容器に予めミネラルオイルを入れておき、その上にES細胞を重層し培養するハンギング・ドロップ法２が知られている。しかし、ハンギング・ドロップ法１は、垂れ下がった水滴が落ちないようにする必要があり、培養時の調製及び扱いが非常に煩雑であった。また、ミネラルオイルを用いたハンギング・ドロップ法２では、重層したミネラルオイルと細胞懸濁液の界面が乱れないようにする必要があり、更に、胚様体の形成後に、胚様体を別の培養容器に移すまで検鏡することができず、胚様体の形成過程における研究開発が非常に困難であった。
【０００４】
ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされ、当該機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。例えば、特許文献１には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰ／Ｃと略記）の製造方法とその重合体が優れた生体適合性を有することが、特許文献２には、ＭＰ／Ｃとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着・凝集や血漿蛋白質の付着が起こりにくく、医療用材料として有用であることが、特許文献３には、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する共重合体を用いた医療用材料が、特許文献４及び５には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生体適合性が得られることが、特許文献６には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体をポリエチレンテレフタレートにコーティングして、血球細胞、株細胞、初代培養細胞を分離・回収する分離剤及び分離・回収方法がそれぞれ開示されている。
しかし、ＥＳ細胞を浮遊培養するにあたり、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を被覆した容器を使用することについては知られていない。
【特許文献１】
特開昭５４−３６０２５号公報
【特許文献２】
特開平３−３９３０９号公報
【特許文献３】
特開平９−１８３８１９号公報
【特許文献４】
持表平６−５０２２００号公報
【特許文献５】
特表平７−５０２０５３号公報
【特許文献６】
特開２００２−０９８６７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
［０００５］
本発明の目的は、煩雑な手法を用いることなく、容易にＥＳ細胞より胚様体を形成するために使用する胚様体形成用容器を提供することにある。
本発明の別の目的は、煩雑な手法を用いることなく、容易にＥＳ細胞を培養し、胚様体を形成できる胚様体の形成方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
【０００６】
本発明によれば、胚性幹細胞(ES細胞)を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器であって、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器が提供される。
また本発明によれば、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するためにES細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む胚様体の形成方法が提供される。
【０００７】
本発明の胚様体の形成方法は、本発明の胚様体形成用容器を用いて培養するので、従来のハンギング・ドロップ法のES細胞の培養における、煩雑な手法を用いることなく、容易にES細胞より胚様体を効率良く形成することができる。また本発明の胚様体形成用容器は、所望表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備えるので、ES細胞より胚様体を形成する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例２−１で形成した胚様体の位相差額微鏡写真の写しである。
【図２】図２は、未処理プレートを用いた比較例２−１で培養した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。
【図３】図３は、比較例２−２で実施したハンギング・ドロップ法で形成した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明の胚様体形成容器は、ES細胞を浮遊培養させ胚様体を形成させるために使用する容器である。該容器は、ES細胞を浮遊培養する領域を形成する表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備えることを特徴とする。
【００１０】
前記容器表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて被覆層を形成するには、例えば、該共重合体を含む反応試薬を、容器の所望表面に化学修飾法により固定する方法、該共重合体を容器の所望表面にコーティング法により固定する方法、該共重合体を容器の所望表面に化学結合法により固定する方法が挙げられる。特に、前記コーティング法は、簡便に、該共重合体による均一な被覆層を形成できるので好ましい。
【００１６】
前記共重合体において、ブチルメタクリレートに由来する構成単位は、共重合体の構成単位中９０モル％以下が好ましく、特に２０〜９０モル％が好ましい。ブチルメタクリレートに由来する構成単位を有する共重合体は、耐溶出性が向上するが、ブチルメタクリレートに由来する構成単位が９０モル％を超えると、容器表面における２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの被覆量が少なくなり、被覆の効果が十分に発揮できなくなる恐れがあるので好ましくない。
グリシジル(メタ)アクリレートを用いた共重合体は、容器表面のアミノ基、カルボキシル基等と反応させることができ、該共重合体を、所望表面に化学的に結合させることができる。
前記共重合体において、ブチルメタクリレート以外の単量体に由来する構成単位の割合は、７０モル％以下が好ましい。
【００１７】
上記共重合体の分子量は、重量平均分子量で通常５０００〜５００００００であり、ES細胞の培養容器への接着を有効に防止でき、胚様体形成能を発現させ、重合体の耐溶出性を向上させる点から１０００００〜２００００００が好ましい。
【００１８】
本発明において前記被覆層の被覆量は、表面分析方法により評価できる。具体的には、Ｘ線光電子分光分析によって測定したスペクトルに基づいて、リンのピーク面積Ｐと炭素のピーク面積Ｃの比、即ちＰ／Ｃ値で評価できる。胚様体形成能を発現させるためのＰ／Ｃ値は、０．００２〜０．３の範囲が好ましく、０．０１〜０．２の範囲がより好ましい。
【００１９】
本発明の胚様体形成用容器は特に限定されないが、例えば、細胞培養用ディッシュ、細胞培養用マルチディッシュ、細胞培養用プレート、細胞培養用バック、細胞培養用フラスコ等の既存の細胞培養容器が挙げられる。適度な大きさの胚様体を得るために、更に望ましくは、細胞培養用ディッシュ又は細胞培養用プレートが好ましい。
胚様体形成用容器の材質は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ガラス、金属等が挙げられる。また、前記被覆層を形成する容器表面は、コロナ処理等の表面加工を施した表面であることが好ましい。
【００２０】
前記共重合体の少なくとも１種を用いて容器表面の所望箇所に被覆層を形成するには、例えば、前記共重合体を、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール等に単独に溶解あるいは、水とエタノール、エタノールとイソプロパノール等の混合溶剤に溶解した後に、容器を浸漬あるいは、容器に重合体溶液をスプレーする方法等によりコーティングすることで実施できる。
また、前記共重合体が、エポキシ基、イソシアネート基、スクシンイミド基、アミノ基、カルボキシル基又は水酸基等の化学結合可能な官能基を有する場合には、容器表面のアミノ基、カルボキシル基又は水酸基と化学反応させるために、共重合体を含む溶液を化学結合可能な官能基が反応しない溶剤に溶解し、容器表面と化学結合させ被覆層を形成した後に、未反応の重合体を洗浄除去する方法によっても胚様体形成用容器を得ることができる。
【００２１】
本発明の胚様体の形成方法は、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、前記共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するためにES細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む。
工程(A)において準備する容器は、上述の本発明の胚様体形成用容器が挙げられ、上述した例示した容器は全て工程(A)で準備する容器に適用することができる。
【００２２】
工程(B)においてES細胞を浮遊培養するには、例えば、フィーダー細胞上で培養した未分化状態のES細胞を、前記胚様体形成用容器内で公知の方法や条件等に従って浮遊培養することにより行なうことができる。この際、胚様体形成用容器内の培養液は、静置状態でも、緩やかに振とうしても良い。
前記培養液を構成する培地としては、従来のハンギング・ドロップ法等に用いられている各種成長因子を含む、例えば、Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM培地)等を用いることができる。
前記培養液中のES細胞の濃度は、工程(A)により準備する胚様体形成用容器の大きさや形態等によって異なるが、通常１．０×１０2〜１．０×１０6cells／mLである。特に、胚様体形成用容器として、９６穴プレートを用いる場合の前記ES細胞の濃度は、１．０×１０3〜１．０×１０5cells／mLであることが、再現性良く胚様体を形成できるので好ましい。
【００２３】
以下、実施列及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。尚、例中の容器表面におけるＰ／Ｃ値は以下の方法に従って算出した。
＜胚様体形成用容器表面のＰ／Ｃ値の測定方法＞
Ｘ線光電子分光分析器（商品名「ＥＳＣＡ−３３００」、島津製作所製）を用いて、Ｘ線照射角が９００の各元素のスペクトルを測定し、リン元素及び炭素元素のピーク面積から、下記式によりＰ／Ｃ値を算出した。
Ｐ／Ｃ＝Ａｐ（リン元素のピーク面積）／Ａｃ（炭素元素のピーク面積）
【００２４】
合成例１
MPC ３５．７g及びｎ−ブチルメタクリレート(BMA)４．３g(MPC／BMA＝８０／２０(モル比))をエタノール１６０gに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．８２gを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２９．６gを得た。以下に示す条件のGPCにより測定した重量平均分子量は１５３０００であった。1H-NMRにて組成分析した結果、MPC／BMA＝８０／２０(モル比)であった。これを共重合体(A)とする。
＜GPCの測定条件＞
(１)試料：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール(６／４(体積比))混合溶媒に試料を溶解し、０．５重量％の重合体溶液を調製した。試料溶液の使用量は２０Lである。
(２)カラム：PLgel ５μm MIXED-C、２本直列(ポリマー・ラボラトリー社製)、カラム温度は４０℃、東ソー社製のインテグレーター内蔵分子量計算プログラム(SC-8020用GPCプログラム)を用いた。
(３)溶出溶媒：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール(６／４(体積％))混合溶媒、流速は１．０mL／分である。
(４)検出：示差屈折計、
(５)標準物質：ポリメチルメタクリレート(PMMA)(ポリマー・ラボラトリー社製)。
【００２５】
合成例２
ＭＰＣ３８．０ｇ及びグリシジルメタクリレート２．０ｇ（ＧＭＡ）（ＭＰＣ／ＧＭＡ＝９０／１０（モル比））をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４．８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＧＭＡは９０／１０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は５３０００であった。これを共重合体（Ｂ）とする。
【００２６】
合成例３
ＭＰＣ１２．６ｇ、ＢＭＡ８．６ｇ及びＧＭＡ６．０ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／４０／３０（モル比））をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果は、ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／４０／３０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は４２０００であった。これを共重合体（Ｃ）とする。
【００２７】
実施例１−１
合成例１で合成した共重合体（Ａ）０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。Ｕ底ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルに前記共重合体溶液０．３ｍＬを入れた後、各ウェルから共重合体溶液を吸引し除去した。５０℃で５時間減圧下で乾燥することにより胚様体形成用容器（Ａ）を作製した。
胚様体形成容器（Ａ）における共重合体（Ａ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００２８】
実施例１−２
Ｕ底ポリスチレン製９６穴プレートを空気中で、照射エネルギー１Ｊ／ｃｍ２の条件においてコロナ処理して表面にカルボキシル基を生成させた。合成例２により合成した共重合体（Ｂ）０．５ｇをイソプロパノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。コロナ処理したＵ底９６穴プレートの各ウェルに前記共重合体溶液０．３ｍＬを入れた後、各ウェルから共重合体溶液を吸引し除去した。６０℃で３時間、プレート表面のカルボキシル基と共重合体中のエポキシ基とを反応させた。０．２Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液を、各ウェルに０．３ｍＬ入れて、２５℃、２４時間の条件で未反応のエポキシを開環させた。蒸留水で各ウェルを３回洗浄した後、５０℃で５時間減圧下で乾燥することにより胚様体形成用容器（Ｂ）を作製した。
胚様体形成容器（Ｂ）における共重合体（Ｂ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００２９】
実施例１−３
共重合体（Ｂ）の代わりに合成例３により合成した共重合体（Ｃ）を用いた以外は実施例１−２と同様に行い、胚様体形成用容器（Ｃ）を作製した。
胚様体形成容器（Ｃ）における共重合体（Ｃ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
比較例１
未処理のＵ底ポリスチレン製９６穴プレートのウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【００３２】
実施例２−１
下記調製法で調製した２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を、実施例１−１で作製した胚様体形成用容器（Ａ）に各ウェル０．２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した後に、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡写真の写しを図１に示す。
表２における胚様体形成の評価は、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成された場合をＡ、胚様体は形成されたが大きさが十分でない場合をＢ、胚様体が形成されなかった場合をＣとした。
【００３３】
＜マウスＥＳ細胞の懸濁液の調製法＞
（１）フィーダー細胞の培養
フィーダー細胞としてＳＩＭマウスの繊維芽細胞（以下、ＳＴＯ細胞と略記）を用いた。ＳＴＯ細胞は、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、２５ｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０体積％非動化処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ培地と略記、Ｇｉｂｃｏ社製）を用い培養した。培養したＳＴＯ細胞を１０ｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）で３時間処理した後、細胞懸濁液とした。ＳＴＯ細胞の懸濁液を各ウェルに５×１０５ｃｅｌｌｓになるように６穴マルチディッシュに播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１６時間培養してフィーダー細胞を調製した。
（２）マウスＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞として１２９ＶマウスＥＳ細胞を用いた。ＥＳ細胞の培地は、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｇｉｂｃｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ｎｏｎｅｓｓｅｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、２５ｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ｍＬＩＦ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地（以下ＥＳ培地と略記）とした。前記（１）で調製したフィーダー細胞上に２×１０５ｃｅｌｌ／ウェルのＥＳ細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間、マウスＥＳ細胞を培養した。
前記（２）で培養したマウスＥＳ細胞を０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで常法により剥がした後、１５％ＦＣＳ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン及び２５ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製、ｍＬＩＦを含まない）に懸濁して、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を調製した。
【００３４】
実施例２−２及び２−３
胚様体形成用容器(A)の代わりに、実施例１−２及び実施例１−３で調製した胚様体形成用容器(B)又は胚様体形成用容器(C)を用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３５】
比較例２−１
胚様体形成用容器(A)の代わりに、未処理のポリスチレン製９６穴プレートを用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。この位相差顕微鏡写真の写しを図２に示す。
【００３６】
比較例２−２
平底ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルにリン酸緩衝液１３０μＬ及びミネラルオイル２００μＬを予め入れておき、ここに前記調製した２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を５０μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した後に、形成された胚様体をＵ底ポリスチレン製９６穴プレートに移した。次いで、位相差顕微鏡にて実施例２−１と同様に観察を行なった。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡写真の写しを図３に示す。
【００３７】
比較例２−３
胚様体形成用容器（Ａ）の代わりに、スミロンセルタイトスフェロイド（９６穴プレート、登録商標、住友ベークライト社製）を用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３８】
【００３９】
実施例３−１〜実施例３−３
実施例２−１〜２−３で得られた胚様体を０．１ｍＬの培地ごと吸出し、下記調製法にて調製したゼラチンコートディッシュに移した。培地交換は３日毎に半量の交換を行った。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した後に位相差額微鏡にて観察した。結果を表
３に示す。
表３における心筋への分化評価は、拍動している心筋が観察された場合をＡ、拍動している心筋が僅かに観察された場合をＢ、作業が行えなかった場合をＣとした。
【００４０】
＜ゼラチンコートディッシュの調製法＞
１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を施した０．１重量％のゼラチン水溶液を培養用２４穴マルチディッシュに均一に加えた。冷蔵保存を行い、使用直前に、アスピレーターにてゼラチン溶液を吸引した。１５％ＦＣＳ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び２５ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製、ｍＬＩＦを含まない）を各ウェルに１ｍＬずつ加えた。
【００４１】
比較例３−１
比較例２−１のプレート底部に接着した細胞をゼラチンコートディッシュに移そうとしたが移せなかった。
【００４２】
比較例３−２及び比較例３−３
比較例２−２(比較例３−２)、比較例２−３(比較例３−３)で得られた胚様体を用いた以外は、実施例３−１と同様に実験を行った。結果を表３に示す。
【００４３】
【００４４】
表１より、実施例１−１〜１−３においてＰ／Ｃ値が０．０３８〜０．０７４であることから、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）は、ＰＣ類似基を有する重合体による被覆層により被覆されていることがわかった。表２より、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）でマウスＥＳ細胞を培養すると、良好に胚様体を形成できることがわかった。表３より、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）で形成された、マウスＥＳ細胞からの胚様体は、心筋への分化能が高いことががわかった。
また、図１より、本発明にかかる胚様体形成用容器を用いることにより、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成されることがわかった。図２より、未処理のポリスチレン製容器の場合は胚様体が形成されないことがわかった。図３より、ハンギング・ドロップ法で形成した胚様体は、大きさが十分でないことがわかった。
【０００１】
本発明は、胚様体を形成する際に用いる胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、試験管内でも様々な細胞に分化する能力をもつ。ＥＳ細胞を試験管内で分化させる方法としては、浮遊培養によって胚様体と呼ばれる擬似的な胚を形成させる方法、ストローマ細胞のように分化と増殖を支持する細胞と共培養する方法が利用されている。ＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病阻止因子：ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を加えずに高密度になるまで培養し、シャーレ等の培養容器に接着しないように浮遊培養させて細胞塊を形成すると、その後、様々な種類の細胞に分化することが知られている。浮遊培養で形成された細胞塊は、胚様体（ＥＢ）と呼ばれ、浮遊培養は、ＥＳ細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる方法である。
胚様体は、二重の細胞層から成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、内層は胚体外胚葉にあたる。２つの胚葉は、基底膜によって隔てられている。該構造は、マウスの６日胚である円筒胚によく似ており、その限りにおいて胚の正常な発生段階に近い。胚様体においては、中胚葉の誘導も起き、心筋細胞、血液細胞、更には原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させて培養を続けると様々な種類の細胞に分化する。この中には、神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、脂肪細胞等が含まれる。胚様体の形成を経て分化する細胞は、体細胞に限らず、最近では生殖細胞系譜への分化も起きることが確認されている。このように胚様体の形成はＥＳ細胞の多分化能を示すのに都合がよい。
【０００３】
胚様体を形成させる為には、ES細胞を培養容器に接着しないように工夫した「ハンギング・ドロップ法」が広く用いられている。ガラス容器のふたから垂れ下がった水滴の中にES細胞を入れて培養するハンギング・ドロップ法１、又は培養容器に予めミネラルオイルを入れておき、その上にES細胞を重層し培養するハンギング・ドロップ法２が知られている。しかし、ハンギング・ドロップ法１は、垂れ下がった水滴が落ちないようにする必要があり、培養時の調製及び扱いが非常に煩雑であった。また、ミネラルオイルを用いたハンギング・ドロップ法２では、重層したミネラルオイルと細胞懸濁液の界面が乱れないようにする必要があり、更に、胚様体の形成後に、胚様体を別の培養容器に移すまで検鏡することができず、胚様体の形成過程における研究開発が非常に困難であった。
【０００４】
ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかにされ、当該機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。例えば、特許文献１には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰ／Ｃと略記）の製造方法とその重合体が優れた生体適合性を有することが、特許文献２には、ＭＰ／Ｃとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着・凝集や血漿蛋白質の付着が起こりにくく、医療用材料として有用であることが、特許文献３には、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する共重合体を用いた医療用材料が、特許文献４及び５には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生体適合性が得られることが、特許文献６には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体をポリエチレンテレフタレートにコーティングして、血球細胞、株細胞、初代培養細胞を分離・回収する分離剤及び分離・回収方法がそれぞれ開示されている。
しかし、ＥＳ細胞を浮遊培養するにあたり、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を被覆した容器を使用することについては知られていない。
【特許文献１】
特開昭５４−３６０２５号公報
【特許文献２】
特開平３−３９３０９号公報
【特許文献３】
特開平９−１８３８１９号公報
【特許文献４】
持表平６−５０２２００号公報
【特許文献５】
特表平７−５０２０５３号公報
【特許文献６】
特開２００２−０９８６７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
［０００５］
本発明の目的は、煩雑な手法を用いることなく、容易にＥＳ細胞より胚様体を形成するために使用する胚様体形成用容器を提供することにある。
本発明の別の目的は、煩雑な手法を用いることなく、容易にＥＳ細胞を培養し、胚様体を形成できる胚様体の形成方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
【０００６】
本発明によれば、胚性幹細胞(ES細胞)を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器であって、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器が提供される。
また本発明によれば、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するためにES細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む胚様体の形成方法が提供される。
【０００７】
本発明の胚様体の形成方法は、本発明の胚様体形成用容器を用いて培養するので、従来のハンギング・ドロップ法のES細胞の培養における、煩雑な手法を用いることなく、容易にES細胞より胚様体を効率良く形成することができる。また本発明の胚様体形成用容器は、所望表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備えるので、ES細胞より胚様体を形成する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例２−１で形成した胚様体の位相差額微鏡写真の写しである。
【図２】図２は、未処理プレートを用いた比較例２−１で培養した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。
【図３】図３は、比較例２−２で実施したハンギング・ドロップ法で形成した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明の胚様体形成容器は、ES細胞を浮遊培養させ胚様体を形成させるために使用する容器である。該容器は、ES細胞を浮遊培養する領域を形成する表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備えることを特徴とする。
【００１０】
前記容器表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて被覆層を形成するには、例えば、該共重合体を含む反応試薬を、容器の所望表面に化学修飾法により固定する方法、該共重合体を容器の所望表面にコーティング法により固定する方法、該共重合体を容器の所望表面に化学結合法により固定する方法が挙げられる。特に、前記コーティング法は、簡便に、該共重合体による均一な被覆層を形成できるので好ましい。
【００１６】
前記共重合体において、ブチルメタクリレートに由来する構成単位は、共重合体の構成単位中９０モル％以下が好ましく、特に２０〜９０モル％が好ましい。ブチルメタクリレートに由来する構成単位を有する共重合体は、耐溶出性が向上するが、ブチルメタクリレートに由来する構成単位が９０モル％を超えると、容器表面における２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの被覆量が少なくなり、被覆の効果が十分に発揮できなくなる恐れがあるので好ましくない。
グリシジル(メタ)アクリレートを用いた共重合体は、容器表面のアミノ基、カルボキシル基等と反応させることができ、該共重合体を、所望表面に化学的に結合させることができる。
前記共重合体において、ブチルメタクリレート以外の単量体に由来する構成単位の割合は、７０モル％以下が好ましい。
【００１７】
上記共重合体の分子量は、重量平均分子量で通常５０００〜５００００００であり、ES細胞の培養容器への接着を有効に防止でき、胚様体形成能を発現させ、重合体の耐溶出性を向上させる点から１０００００〜２００００００が好ましい。
【００１８】
本発明において前記被覆層の被覆量は、表面分析方法により評価できる。具体的には、Ｘ線光電子分光分析によって測定したスペクトルに基づいて、リンのピーク面積Ｐと炭素のピーク面積Ｃの比、即ちＰ／Ｃ値で評価できる。胚様体形成能を発現させるためのＰ／Ｃ値は、０．００２〜０．３の範囲が好ましく、０．０１〜０．２の範囲がより好ましい。
【００１９】
本発明の胚様体形成用容器は特に限定されないが、例えば、細胞培養用ディッシュ、細胞培養用マルチディッシュ、細胞培養用プレート、細胞培養用バック、細胞培養用フラスコ等の既存の細胞培養容器が挙げられる。適度な大きさの胚様体を得るために、更に望ましくは、細胞培養用ディッシュ又は細胞培養用プレートが好ましい。
胚様体形成用容器の材質は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ガラス、金属等が挙げられる。また、前記被覆層を形成する容器表面は、コロナ処理等の表面加工を施した表面であることが好ましい。
【００２０】
前記共重合体の少なくとも１種を用いて容器表面の所望箇所に被覆層を形成するには、例えば、前記共重合体を、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール等に単独に溶解あるいは、水とエタノール、エタノールとイソプロパノール等の混合溶剤に溶解した後に、容器を浸漬あるいは、容器に重合体溶液をスプレーする方法等によりコーティングすることで実施できる。
また、前記共重合体が、エポキシ基、イソシアネート基、スクシンイミド基、アミノ基、カルボキシル基又は水酸基等の化学結合可能な官能基を有する場合には、容器表面のアミノ基、カルボキシル基又は水酸基と化学反応させるために、共重合体を含む溶液を化学結合可能な官能基が反応しない溶剤に溶解し、容器表面と化学結合させ被覆層を形成した後に、未反応の重合体を洗浄除去する方法によっても胚様体形成用容器を得ることができる。
【００２１】
本発明の胚様体の形成方法は、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、前記共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するためにES細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む。
工程(A)において準備する容器は、上述の本発明の胚様体形成用容器が挙げられ、上述した例示した容器は全て工程(A)で準備する容器に適用することができる。
【００２２】
工程(B)においてES細胞を浮遊培養するには、例えば、フィーダー細胞上で培養した未分化状態のES細胞を、前記胚様体形成用容器内で公知の方法や条件等に従って浮遊培養することにより行なうことができる。この際、胚様体形成用容器内の培養液は、静置状態でも、緩やかに振とうしても良い。
前記培養液を構成する培地としては、従来のハンギング・ドロップ法等に用いられている各種成長因子を含む、例えば、Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM培地)等を用いることができる。
前記培養液中のES細胞の濃度は、工程(A)により準備する胚様体形成用容器の大きさや形態等によって異なるが、通常１．０×１０2〜１．０×１０6cells／mLである。特に、胚様体形成用容器として、９６穴プレートを用いる場合の前記ES細胞の濃度は、１．０×１０3〜１．０×１０5cells／mLであることが、再現性良く胚様体を形成できるので好ましい。
【００２３】
以下、実施列及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。尚、例中の容器表面におけるＰ／Ｃ値は以下の方法に従って算出した。
＜胚様体形成用容器表面のＰ／Ｃ値の測定方法＞
Ｘ線光電子分光分析器（商品名「ＥＳＣＡ−３３００」、島津製作所製）を用いて、Ｘ線照射角が９００の各元素のスペクトルを測定し、リン元素及び炭素元素のピーク面積から、下記式によりＰ／Ｃ値を算出した。
Ｐ／Ｃ＝Ａｐ（リン元素のピーク面積）／Ａｃ（炭素元素のピーク面積）
【００２４】
合成例１
MPC ３５．７g及びｎ−ブチルメタクリレート(BMA)４．３g(MPC／BMA＝８０／２０(モル比))をエタノール１６０gに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．８２gを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２９．６gを得た。以下に示す条件のGPCにより測定した重量平均分子量は１５３０００であった。1H-NMRにて組成分析した結果、MPC／BMA＝８０／２０(モル比)であった。これを共重合体(A)とする。
＜GPCの測定条件＞
(１)試料：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール(６／４(体積比))混合溶媒に試料を溶解し、０．５重量％の重合体溶液を調製した。試料溶液の使用量は２０Lである。
(２)カラム：PLgel ５μm MIXED-C、２本直列(ポリマー・ラボラトリー社製)、カラム温度は４０℃、東ソー社製のインテグレーター内蔵分子量計算プログラム(SC-8020用GPCプログラム)を用いた。
(３)溶出溶媒：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール(６／４(体積％))混合溶媒、流速は１．０mL／分である。
(４)検出：示差屈折計、
(５)標準物質：ポリメチルメタクリレート(PMMA)(ポリマー・ラボラトリー社製)。
【００２５】
合成例２
ＭＰＣ３８．０ｇ及びグリシジルメタクリレート２．０ｇ（ＧＭＡ）（ＭＰＣ／ＧＭＡ＝９０／１０（モル比））をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４．８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＧＭＡは９０／１０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は５３０００であった。これを共重合体（Ｂ）とする。
【００２６】
合成例３
ＭＰＣ１２．６ｇ、ＢＭＡ８．６ｇ及びＧＭＡ６．０ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／４０／３０（モル比））をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果は、ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／４０／３０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は４２０００であった。これを共重合体（Ｃ）とする。
【００２７】
実施例１−１
合成例１で合成した共重合体（Ａ）０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。Ｕ底ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルに前記共重合体溶液０．３ｍＬを入れた後、各ウェルから共重合体溶液を吸引し除去した。５０℃で５時間減圧下で乾燥することにより胚様体形成用容器（Ａ）を作製した。
胚様体形成容器（Ａ）における共重合体（Ａ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００２８】
実施例１−２
Ｕ底ポリスチレン製９６穴プレートを空気中で、照射エネルギー１Ｊ／ｃｍ２の条件においてコロナ処理して表面にカルボキシル基を生成させた。合成例２により合成した共重合体（Ｂ）０．５ｇをイソプロパノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。コロナ処理したＵ底９６穴プレートの各ウェルに前記共重合体溶液０．３ｍＬを入れた後、各ウェルから共重合体溶液を吸引し除去した。６０℃で３時間、プレート表面のカルボキシル基と共重合体中のエポキシ基とを反応させた。０．２Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液を、各ウェルに０．３ｍＬ入れて、２５℃、２４時間の条件で未反応のエポキシを開環させた。蒸留水で各ウェルを３回洗浄した後、５０℃で５時間減圧下で乾燥することにより胚様体形成用容器（Ｂ）を作製した。
胚様体形成容器（Ｂ）における共重合体（Ｂ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００２９】
実施例１−３
共重合体（Ｂ）の代わりに合成例３により合成した共重合体（Ｃ）を用いた以外は実施例１−２と同様に行い、胚様体形成用容器（Ｃ）を作製した。
胚様体形成容器（Ｃ）における共重合体（Ｃ）被覆層を有するウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００３０】
比較例１
未処理のＵ底ポリスチレン製９６穴プレートのウェル内表面のＰ／Ｃ値を測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
実施例２−１
下記調製法で調製した２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を、実施例１−１で作製した胚様体形成用容器（Ａ）に各ウェル０．２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した後に、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡写真の写しを図１に示す。
表２における胚様体形成の評価は、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成された場合をＡ、胚様体は形成されたが大きさが十分でない場合をＢ、胚様体が形成されなかった場合をＣとした。
【００３３】
＜マウスＥＳ細胞の懸濁液の調製法＞
（１）フィーダー細胞の培養
フィーダー細胞としてＳＩＭマウスの繊維芽細胞（以下、ＳＴＯ細胞と略記）を用いた。ＳＴＯ細胞は、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、２５ｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０体積％非動化処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ培地と略記、Ｇｉｂｃｏ社製）を用い培養した。培養したＳＴＯ細胞を１０ｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）で３時間処理した後、細胞懸濁液とした。ＳＴＯ細胞の懸濁液を各ウェルに５×１０５ｃｅｌｌｓになるように６穴マルチディッシュに播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１６時間培養してフィーダー細胞を調製した。
（２）マウスＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞として１２９ＶマウスＥＳ細胞を用いた。ＥＳ細胞の培地は、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｇｉｂｃｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ｎｏｎｅｓｓｅｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、２５ｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ｍＬＩＦ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地（以下ＥＳ培地と略記）とした。前記（１）で調製したフィーダー細胞上に２×１０５ｃｅｌｌ／ウェルのＥＳ細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間、マウスＥＳ細胞を培養した。
前記（２）で培養したマウスＥＳ細胞を０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで常法により剥がした後、１５％ＦＣＳ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン及び２５ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製、ｍＬＩＦを含まない）に懸濁して、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を調製した。
【００３４】
実施例２−２及び２−３
胚様体形成用容器(A)の代わりに、実施例１−２及び実施例１−３で調製した胚様体形成用容器(B)又は胚様体形成用容器(C)を用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３５】
比較例２−１
胚様体形成用容器(A)の代わりに、未処理のポリスチレン製９６穴プレートを用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。この位相差顕微鏡写真の写しを図２に示す。
【００３６】
比較例２−２
平底ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルにリン酸緩衝液１３０μＬ及びミネラルオイル２００μＬを予め入れておき、ここに前記調製した２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウスＥＳ細胞の懸濁液を５０μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した後に、形成された胚様体をＵ底ポリスチレン製９６穴プレートに移した。次いで、位相差顕微鏡にて実施例２−１と同様に観察を行なった。結果を表２に示す。また、位相差顕微鏡写真の写しを図３に示す。
【００３７】
比較例２−３
胚様体形成用容器（Ａ）の代わりに、スミロンセルタイトスフェロイド（９６穴プレート、登録商標、住友ベークライト社製）を用いた以外は、実施例２−１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３８】
実施例３−１〜実施例３−３
実施例２−１〜２−３で得られた胚様体を０．１ｍＬの培地ごと吸出し、下記調製法にて調製したゼラチンコートディッシュに移した。培地交換は３日毎に半量の交換を行った。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した後に位相差額微鏡にて観察した。結果を表
３に示す。
表３における心筋への分化評価は、拍動している心筋が観察された場合をＡ、拍動している心筋が僅かに観察された場合をＢ、作業が行えなかった場合をＣとした。
【００４０】
＜ゼラチンコートディッシュの調製法＞
１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を施した０．１重量％のゼラチン水溶液を培養用２４穴マルチディッシュに均一に加えた。冷蔵保存を行い、使用直前に、アスピレーターにてゼラチン溶液を吸引した。１５％ＦＣＳ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び２５ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製、ｍＬＩＦを含まない）を各ウェルに１ｍＬずつ加えた。
【００４１】
比較例３−１
比較例２−１のプレート底部に接着した細胞をゼラチンコートディッシュに移そうとしたが移せなかった。
【００４２】
比較例３−２及び比較例３−３
比較例２−２(比較例３−２)、比較例２−３(比較例３−３)で得られた胚様体を用いた以外は、実施例３−１と同様に実験を行った。結果を表３に示す。
【００４３】
表１より、実施例１−１〜１−３においてＰ／Ｃ値が０．０３８〜０．０７４であることから、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）は、ＰＣ類似基を有する重合体による被覆層により被覆されていることがわかった。表２より、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）でマウスＥＳ細胞を培養すると、良好に胚様体を形成できることがわかった。表３より、胚様体形成用容器（Ａ）〜（Ｃ）で形成された、マウスＥＳ細胞からの胚様体は、心筋への分化能が高いことががわかった。
また、図１より、本発明にかかる胚様体形成用容器を用いることにより、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成されることがわかった。図２より、未処理のポリスチレン製容器の場合は胚様体が形成されないことがわかった。図３より、ハンギング・ドロップ法で形成した胚様体は、大きさが十分でないことがわかった。
Claims (4)
- 胚性幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器であって、
胚性幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器。 - 前記被覆層を形成した容器表面における、Ｘ線光電子分光分析によって測定したスペク
トルに基づくリン元素の量Ｐと炭素元素の量Ｃとの比(P／C)が、０．００２〜０．３である請求項１の胚様体形成容器。 - 胚性幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート及び／又はグリシジルメタクリレートとの共重合体を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、
胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するために胚性幹細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む胚様体の形成方法。 - 前記被覆層を形成した容器表面における、Ｘ線光電子分光分析によって測定したスペクトルに基づくリン元素の量Ｐと炭素元素の量Ｃとの比(P／C)が、０．００２〜０．３である請求項３の形成方法。
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