JP4761838B2 - タンパク質溶液の析出物を判定する方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質溶液におけるタンパク質結晶生成を自動化するための方法及びシステムに関し、特に、タンパク質溶液の析出物がＸ線構造解析法により解析可能な状態であるか否かを判定する方法及びシステムに関する。

近年、構造ゲノム科学においては、創薬や生命活動の理解のためにタンパク質の構造と機能を解明することが主要な課題となっている。そこで、大量のタンパク質の結晶構造を、高速で解析することが望まれる。従来より、タンパク質の結晶構造を解析するためにＸ線結晶構造解析法が用いられている。かかる構造解析法においては、構造解析対象のサンプルとなるタンパク質の良質な結晶を得るために、構造解析サンプル作成の準備として、タンパク質の水溶液から水分を蒸発させて結晶を生成する方法（結晶化法）が用いられている。この際、タンパク質溶液から結晶がえられているかどうかを判定（観察）する作業が行われている。

従来のこの判定作業では、結晶状態を顕微鏡画像から人の目で逐次検討し、そのサンプルの結晶生成の様子を判定している。この判定においては、サンプルのタンパク質溶液が、溶液のままであるか、沈殿を起こしているか、微結晶が得られているか、あるいは、結晶が得られているかが判定される。表１に、このスクリーニングにおいて用いられる判定基準を示す。

表１において、「透明」とは、タンパク質溶液が何らの結晶も生成しない様子を表している。また、「沈殿」は、４つに分類される。即ち、粒が見られず黒ずんでいたり褐色を示すもの（沈殿（i））、点状の組織が観察されるもので白色にみえ、少し点々があるもの（沈殿（ii））、アモルファス様の組織で透明に見えることがあるもの（沈殿（iii））、大きなアモルファス様の組織で粒子が見えることがあるもの（沈殿（iv））に分類される。また、結晶が生成されているものは、５つに分類される。即ち、５０μm程度以下の結晶で頂点が観察されるもの（微結晶）、針状結晶が観察されるもの（結晶（i））、板状結晶が観察されるもの（結晶（ii））、重なり合った結晶が観察されるもの（結晶（iii））、良質な結晶が観察されるもの（結晶（iv））というように分類される。便宜的に、各分類に対してスコアとなる数字が割り当てられて分類されることもある。ただし、タンパク質の結晶の成長過程に従ってこのスコアが順次増してゆくように変化するものとは限らない。このように分類される画像の様式図を、スコアごとに図１に示す。タンパク質溶液の結晶化実験においてサンプル数は多数であるため、これらに分類することは、大変有用な手段となる。

従来の人の観察を基礎とする判定作業では、観察者はトレーニングによって養成されて、経験的にこのような分類を行うことができるようになる。そして、養成された観察者が多数のサンプルについて得た顕微鏡画像を観察して選別を行なう。このときに判定された分類は、それ自体も、Ｘ線構造解析向けのサンプルについての有用な情報であり、タンパク質の構造解析や性質の決定に際して重要な指標となっている。

この結晶を得るための手法においては、例えば、沈殿剤を加えた微量のタンパク質溶液をオイル層中に静置させて蒸発を行う手法（マイクロバッチ法）、タンパク質溶液をカバーガラスの下面に下垂させて蒸発を行う手法(ハンギングドロップ蒸気拡散法)、タンパク質溶液を蒸発容器の上に載置させて蒸発を行う手法（シッティングドロップ蒸気拡散法）等が用いられる。

表１に示した透明、沈殿（i）、沈殿（ii）、沈殿（iii）に未知タンパク質溶液のサンプルが分類されることが多いが、これ等に分類されるサンプルは、いまだ結晶が生成されておらず、観察者がこれらを全て観察するのは、効率が悪い。ここで、顕微鏡画像に対してテクスチャ解析の手法を用いて、機械化したタンパク質溶液の結晶化状態判定方法が、本願発明者の一部により見出されている。（特許文献１を参照）しかし、依然として、結晶が生成された、沈殿（iv）、微結晶、結晶（i）、結晶（ii）、結晶（iii）、及び結晶（iv）については、それぞれの判別が困難である。
特開２００５−９９４９号公報

上記従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法では、人の目による分類が欠かせず、判定作業で処理できるサンプルの数に限界がある。また、その分類基準についても、観察者ごとに判定が異なる場合があり、同じ観察者であっても繰り返し同じ判定が行えない場合がある。ここでは、多数のサンプルの判定を行なうために、自動分注等がしやすく、１つのサンプルに必要な試料の容量が少量でよい手法が望まれる。

本発明は、従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法を、顕微鏡画像に対して機械化することを課題とし、より具体的には、タンパク質溶液内に何らかの結晶状のものが析出した際に、Ｘ線構造解析法により解析可能なものであるか否かを判定する方法及びシステムを提供する。また、機械化されて自動撮影される顕微鏡画像においても良好に判定が行なえる判定方法を提供し、撮影から判定までを機械化することができるような効率の高い安定したタンパク質の結晶化状態の判定を可能にする方法やシステムを提供することを課題とする。

上記目的を達成するために、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定方法は、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと、前記原画像における析出物の輪郭線を抽出し、２値エッジ検出画像を作成する前処理ステップと、前記２値エッジ検出画像の画素の状態を、ある角度で走査して順次決定し、該角度を変化させて走査と決定を繰り返し、それぞれの角度に対して前記輪郭線の一部となる線分に関するデータを求めて、該データから前記析出物の結晶化状態を反映する特徴量を求める特徴量抽出ステップと、前記特徴量に基づいて、タンパク質溶液の前記電子画像を判別する判別ステップとを含むものである。また、前記特徴量抽出ステップは、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線に含まれる線分の本数とそれらの線分のもつ最大長とを求めることを含むことができる。さらに、前記特徴量抽出ステップは、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線を抽出し、該輪郭線をある間隔で区切ることによって複数の線分にし、該線分間がなす角度を計測することによって、該輪郭線に対して、直線状に接続された区間の割合を求めることを含むこともできる。

さらに、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定方法は、予め、学習用画像より判定基準を設定する。つまり、判別すべきカテゴリがわかっている複数の学習用画像よりタンパク質溶液の析出物の結晶状態を反映する特徴量を予め抽出し、特徴量の分布を取得するステップと、前記学習用画像の特徴量の分布に基づいて、タンパク質溶液の析出物の結晶状態を複数のカテゴリに判別する識別境界を設定するステップとを含むことが好適である。ここで、識別境界の設定ステップは、各カテゴリの学習用画像の特徴量の分布に対して、マハラノビス距離が等しくなる特徴量空間における線又は面を求めて前記識別境界とするステップであることがさらに好適である。また、本発明では、コンピュータ装置がモニター上に前記識別境界を表示する、又は、コンピュータ装置が前記識別境界より析出物の結晶構造解析可能性を判定する。

また、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定方法は、前記前処理ステップが、カラー画像である前記原画像をグレースケール画像に変換するステップと、前記グレースケール化された画像に対して、タンパク質溶液部の領域を切り出すステップと、前記タンパク質溶液部の領域の画像をＳｏｂｅｌ変換して析出物の輪郭線画像を得るステップと、前記輪郭線画像を２値化して２値エッジ検出画像を得るステップとを含むことが好適である。

上記目的を達成するために、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定システムは、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、前記原画像における析出物の輪郭線を抽出し、２値エッジ検出画像を作成する前処理手段と、前記２値エッジ検出画像の画素の状態を、ある角度で走査して順次決定し、該角度を変化させて走査と決定を繰り返し、それぞれの角度に対して前記輪郭線の一部となる線分に関するデータを求めて、該データから前記析出物の結晶化状態を反映する特徴量を求める特徴量抽出手段と、前記特徴量に基づいて、タンパク質溶液の前記電子画像を判別する判別手段とを含むものである。また、前記特徴量抽出手段は、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線に含まれる線分の本数とそれらの線分のもつ最大長とを求める処理を行うことができる。さらに、前記特徴量抽出手段は、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線を抽出し、該輪郭線をある間隔で区切ることによって複数の線分にし、該線分間がなす角度を計測することによって、該輪郭線に対して、直線状に接続された区間の割合を求める処理を行うことができる。

さらに、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定システムは、予め、学習用画像より判定基準を設定する。つまり、判別すべきカテゴリがわかっている複数の学習用画像よりタンパク質溶液の析出物の結晶状態を反映する特徴量を予め抽出し、特徴量の分布を取得する手段と、前記学習用画像の特徴量の分布に基づいて、タンパク質溶液の析出物の結晶状態を複数のカテゴリに判別する識別境界を設定する手段とを含むことが好適である。ここで、識別境界の設定手段は、各カテゴリの学習用画像の特徴量の分布に対して、マハラノビス距離が等しくなる特徴量空間における線又は面を求めて前記識別境界とする手段であることがさらに好適である。また、本発明では、コンピュータ装置がモニター上に前記識別境界を表示する、又は、コンピュータ装置が前記識別境界より析出物の結晶構造解析可能性を判定する。

また、本発明に係るタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定システムは、前記前処理ステップが、カラー画像である前記原画像をグレースケール画像に変換するステップと、前記グレースケール化された画像に対して、タンパク質溶液部の領域を切り出すステップと、前記タンパク質溶液部の領域の画像をＳｏｂｅｌ変換して析出物の輪郭線画像を得るステップと、前記輪郭線画像を２値化して２値エッジ検出画像を得るステップとを含むことが好適である。

本発明では、タンパク質溶液の原画像より特徴量を抽出し、該特徴量より析出物のカテゴリを判別することによって、タンパク質溶液の析出物がＸ線構造解析によって解析可能であるか否かを良好に判定することができる。さらに本発明の解析システムに、タンパク質溶液の析出物の自動観察手段を組み合わせれば、タンパク質の観察とそのタンパク質の析出物の判定とを連続して自動で行なうタンパク質結晶状態観察解析システムを構築することができる。

具体的には、本発明は、析出した結晶状のものが、沈殿（iv）及び微結晶である状態と、結晶（i）、結晶（ii）、結晶（iii）及び結晶（iv）である状態とに判別することができる。

本発明は、コンピュータ装置を用いて実施される。このコンピュータには、適当な画像入力手段が接続されている。その画像入力手段は、例えば顕微鏡に備えられたＣＣＤ（電荷結合デバイス）などの撮像装置、Ａ／Ｄコンバータ、適当なメモリなどによって電子的な画像を取得し、コンピュータに入力する。また、コンピュータには、演算装置、記憶装置、表示装置、通信装置などの通常の装置が備えられる。本発明の各ステップや各手段は、演算装置に実現された機能ブロックとして処理が行われ、機能が実現される。例えば、判定ステップや判定手段は、演算装置において、記憶装置から読み込まれたプログラムが必要なレジスタやメモリによって構成される記憶動作と演算処理動作によって判定を行なう機能として実現される。本発明は、このようなコンピュータを用いて、画像処理及び画像の分類を用いて、タンパク質溶液の析出物が、構造解析により結晶構造が解析可能であるか否かを判定する方法と手段とを提供するものである。

［実施形態１］
以下、図面を参照して、本発明の第１の実施の形態について説明する。図２は、本発明において観察対象の溶液においてタンパク質の結晶化（析出）をさせるための説明図である。本実施形態においては、タンパク質の結晶を得るためにマイクロバッチ法を用いた。
まず、沈殿剤を加えた微量のタンパク質溶液１を、オイル層中２に静置させる（図２（a））。続いて、沈殿剤を加えた微量のタンパク質溶液１内において、タンパク質の結晶３の有無を確認する。マイクロバッチ法は、図２（ｂ）に示すように、微量試料でも適用可能なように改良されたバッチ法のバッチ効果４だけでなく、沈殿剤を加えた微量のタンパク質溶液１のオイル層への水分拡散効果５も生じさせ、溶解度曲線6の上側においてタンパク質の結晶３を得る方法である。

このようなサンプルでは、数日から数ヶ月の時間をかけて、溶液中の水分が減少してゆき、タンパク質の飽和溶解度に達すると、徐々にタンパク質の結晶が成長してゆくことがある。タンパク質の種類によっては、全く結晶を生成しない場合や、沈殿を生じる場合もある。

図３は、本実施形態の結晶化状態判定システム１００の構成を説明する構成図である。本システムには、原画像取得部４２、前処理部１０、特徴量抽出部２０、及び判別部３０が備えられている。さらに、前処理部１０には、グレースケール化部１２、画像切り出し部１４、Ｓｏｂｅｌ変換部１６、及び２値化部１８が備えられており、特徴量抽出部２０には、全方向線分計測部２２、及び抽出部２６が備えられており、判別部３０には、判別作業部３２が備えられている。さらに本システムは、学習データの特徴量分布の取得部４４、識別面の設定部４５、及び判定基準格納部４６を備えている。本システムは、タンパク質溶液の画像について、外部にある撮影装置４０から電子画像のデータ４１を取得し、そのタンパク質溶液の析出物がいずれのカテゴリであるかを判別し、その析出物状態のデータ４７を出力する。

原画像取得部４２は、例えば顕微鏡に備えられた撮影装置４０によって撮影され、デジタル化された電子画像のデータ４１を取得して、その電子画像を調整して原画像データ４３とする。ここでの調整とは、デジタル化されたデータの明度等を適切な範囲に調整したり、計算に十分な範囲で階調の削減を行ったり、必要な領域を切り出す処理などの一般的な処理を指している。

本発明では、前処理部１０により、高い精度の判別結果を得るために、原画像データ４３を予め調節する。この前処理部１０によって、さらに、原画像取得部４２から原画像データ４３を取得した後、グレースケール化部１２、画像切り出し部１４、Ｓｏｂｅｌ変換部１６、及び２値化部１８を用いて、析出物の輪郭線の２値エッジ検出画像を作成する。以下では、前処理部１０の構成要素を順次説明していく。

［グレースケール化］
本発明は、計算処理過程において、原画像データ４３の色情報を必要としない。グレースケール化部１２は、例えば、ＲＧＢ各色が２５６階調である原画像データ４３を、２５６階調のグレースケール画像に変換する。

［画像の切り出し］
本発明のタンパク質結晶状態を判定する方法及びシステムは、グレースケール化を行った画像データに対して、処理対象の領域、すなわち、画像中のタンパク質溶液部分のみを切り出す。画像切り出し部１４は、例えば、画像サイズが１３９２×１０４０画素である画像データを、処理対象の領域として４５０×４５０画素の画像サイズに切り出す。

［Ｓｏｂｅｌ変換］
次に、前処理部１０は、画像の切り出しを行った画像データに対して画像中の析出物の輪郭線を検出する代表的な手法の一つであるＳｏｂｅｌ変換を行なう。Ｓｏｂｅｌ変換部１６は、図４（ａ）に示すように、画像の各画素値を、処理前の画像の対応するスターで示す画素５２の画素値とその周囲の近傍にある８つの黒丸で示す画素５４の画素値との総合的な差（勾配の大きさを表わす）に置き換えることができる。従って、図４（ｂ）に示すように、処理前の画像中にある析出物と背景の境界といったような、急激に画素値が変化する部分５６において勾配は大きな値となり、その部分の画素値も大きくなる。なお、勾配の大きさが、グレースケール画像で表現できる最大階調値である２５５以上の値となった場合には、勾配の大きさは２５５とする。

［２値化］
次に、前処理部１０により、その２値化部１８を用いて、Ｓｏｂｅｌ変換を行った画像を２値エッジ検出画像とする。具体的には、２値化部１８では、ある閾値を設けることで、閾値以上の値をもつ画素を白画素、閾値未満の値をもつ画素を黒画素とし、処理前の画素において析出物の輪郭線を示す画素（エッジ画素）を白、背景を示す画素（背景画素）を黒とする。

クリア（スコア０）はタンパク質溶液に析出物が何も存在していない状態を示すものである。しかし、Ｓｏｂｅｌ変換を行なうと、溶液の部分的な濃度差等も微小な勾配として検出されてしまう。このような計測対象とすべきでない微小な勾配は、その後の処理におけるノイズとなる。そこで、クリア（スコア０）の１００枚程度の多くのサンプル画像に対する勾配の大きさの分布を前もって調べ、この分布より微小な勾配を遮断するために十分な閾値を求める。前処理部１０においては、例えば、２値化閾値を勾配の大きさを示す値として２９とすることができる。

さらに、特徴量抽出部２０は、前処理部１０で得た２値エッジ検出画像を取り込み、析出物の輪郭の一部となる線分の最大長Ｌ_maxとその線分の総本数Ｎ_allとを求める。この場合、特徴量抽出部２０は、全方向線分計測部２２と抽出部２６とで構成される。

［全方向線分計測］
２値エッジ検出画像における線分の方向がランダムであるため、全方向線分計測部２２は、画像を構成する画素の状態を、一定の角度で一画素ずつ順次に決定していく。次に、全方向線分計測部２２は、例えば、前記一定の角度を１度ずつ変化させ、それぞれの角度に対して輪郭線の一部となる線分の長さと各長さの線分の本数とを求める。図５に示すように対象画像に対して０〜１７９度の範囲で１度ずつずらしながらラスタ走査を行っていく。つまり、一般にラスタ走査では、対象画像の左上端から水平右方向に走査して行き、画素の右端に行き着いた場合には、一段下がった行の左端から、再び水平右方向に走査して行く。

次に、全方向線分計測部２２は、走査線上においてエッジ画素６４を発見した場合、その画素を線分ｎの始点Ｓ_n（ｘ_sn,ｙ_sn）とする。さらに、全方向線分計測部２２は、線分ｎに対するエッジ画素の連結性をみてゆき、エッジ画素が途切れた場合、最後のエッジ画素を線分ｎの終点Ｅ_n（ｘ_en,ｙ_en）とする。そして全方向線分計測部２２は、始点と終点より長さＬを計算し、長さ別に線分の本数をカウントする（図６）。なお線分の長さＬは、

とする。以上より、図７に示す２値エッジ検出画像の線分の長さの分布を示すヒストグラムを作成することができる。

［特徴量抽出］
抽出部２６は、求めたヒストグラムより、特徴量である最大長と総本数とを求める。最大長と総本数は、それぞれ、

により求められる。

さらに、本発明では、学習データの特徴量分布の取得部４４と識別面の設定部４５とを用いて、予め識別面６８を設定する。

［学習データの特徴量分布の取得］
学習データの特徴量分布の取得部４４では、Ｘ線構造解析法により解析可能であることがわかっている析出物の複数の画像(学習データ)に対して、特徴量である最大長と総本数とを予め求める。次に、求めた特徴量を、図８に示すように、横軸を最大長、縦軸を総本数として空間（特徴量空間）にプロットする。

［識別面の設定］
続いて、識別面の設定部４５では、学習データの特徴量分布の取得部４４で求めた学習データの特徴量群に対して、マハラノビスの汎距離による判別分析を行なう。マハラノビスの汎距離による判別分析とは、判別したい２つのカテゴリ分布が特徴量空間にある場合、どちらかのカテゴリに属する新しいデータに対して誤判別される確立率を出来る限り小さくするための識別面６８を、特徴量空間に設定するものである。例えば、判別器を構成するために用いるカテゴリＡとカテゴリＢに属する学習データについて、カテゴリＡに属する学習データは、最大長の平均を

とし、総本数の平均を

とし、最大長・総本数の分散共分散行列を

とする。同様に、カテゴリＢに属する学習データは、最大長の平均を

とし、総本数の平均を

とし、最大長・総本数の分散共分散行列を

とする。ここで、正解カテゴリ未知のデータＸの最大長をＬ_max,x、総本数をＮ_all,xとすると、データＸとカテゴリＡとのマハラノビスの汎距離は、

で求めることができ、同様に、データＸとカテゴリＢとのマハラノビスの汎距離は、

で求めることができる。ここで、マハラノビスの汎距離による判別分析が、Ｄ_A ²＜Ｄ_B ²である場合、データＸはカテゴリＡに属すると判別でき、Ｄ_A ²＞Ｄ_B ²である場合は、データＸはカテゴリＢに属すると判別できる。さらに、Ｄ_A ²＝Ｄ_B ²である場合は、データＸは、カテゴリＡとカテゴリＢとを分ける識別面上にあると判別することができる。図９に示すように、特徴量空間に設定された識別面６８が、カテゴリを判別する境界線である。

判別部３０は、判別作業部３２を含み、正解未知の画素データを入力として受けとり、Ｘ線構造解析法により解析可能であるか否かを判定する。

［判別作業］
判別作業部３２は、正解未知である画像データの特徴量を、特徴量空間にブロットし、判別されたカテゴリよりＸ線構造解析法により解析可能であるか否かの判別を行なうことができる。

次に、本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムの学習時の処理のフローチャートを図１２に示す。本発明の実施の形態では、まず、タンパク質溶液の画像を取得して原画像とする（ステップ７０）。次に、原画像をグレースケール画像に変換し（ステップ７１）、前記グレースケール画像に対して、タンパク質溶液部の領域を切り出し（ステップ７２）、続いてタンパク質溶液部の領域の画像をＳｏｂｅｌ変換する（ステップ７３）。さらに、Ｓｏｂｅｌ変換の画像から２値エッジ検出画像を得る（ステップ７４）。次いで、前記２値エッジ検出画像より、析出物の特徴量を抽出する（ステップ７５）。そして、その特徴量をプロットし、特徴量の分布を作成する（ステップ７７）。続いて、特徴量の分布に基づいて、識別境界を設定する（ステップ７８）。以上の処理を、複数の学習用画像に対して行う。

また、本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムを用いて、タンパク質溶液を分類する処理のフローチャートを図１３に示す。まず、学習によって得た識別境界を読み込む（ステップ８０）。次のステップ８１〜８６は、先に説明した学習時の処理のステップ７０〜７５と同様であり、これらのステップにより、タンパク質溶液の画像から、析出物の特徴量を抽出する。続いて、抽出した特徴量と既に設定した識別境界とを用いて、タンパク質溶液の画像を判別する（ステップ８７）。

［実施形態２］
次に本発明の第２の実施形態について説明する。図１０に示すように、本実施形態の結晶化状態判定システムは、全方向線分計測部２２と、輪郭計測部２４と、抽出部２６とを用いて特徴量抽出部２０を構成することもできる。本実施形態の結晶化状態判定システムのそれ以外の構成は、実施形態１の構成と同様であるため省略する。ここで、特徴量抽出部２０は、全方向線分計測部２２と、輪郭計測部２４と、抽出部２６とを用いて構成されるため、析出物の輪郭の一部となる線分の最大長Ｌ_maxと、その線分の総本数Ｎ_allと、輪郭線における直線の割合Ｒ_lsecとを求めることができる。以下、輪郭計測部２４を含む第２の実施形態の結晶化状態判定システムについて説明する。

［輪郭計測］
輪郭計測部２４は、２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線を抽出し、ある一定間隔ｄで前記輪郭線を多数の区間に区切る。一定間隔ｄで区切られた区間ｓ_mを、始点画素をｐ₁ ^m、終点画素をｐ_d ^mとして、以下のように表す。

同様に、その他の区間ｓ_m+1と区間ｓ_m+2も以下のように表すことができる。

次に、輪郭計測部２４は、この区切られた輪郭線において、３つの区間がなす角度を計測する。まず、図１１に示すように、輪郭計測部２４は、始点を画素ｐ₁ ^m、終点を画素ｐ₁ ^m+1とした線分ｌ₁ ^mと、始点を画素ｐ₁ ^m+1、終点を画素ｐ₁ ^m+2とした線分ｌ₁ ^m+1とのなす角度θ₁ ^ｉを算出する。続いて、一定数の画素をずらして、始点を画素ｐ₂ ^m、終点を画素ｐ₂ ^m+1とした線分ｌ₂ ^mと、始点を画素ｐ₂ ^m+1、終点を画素ｐ₂ ^m+2とした線分ｌ₂ ^m+1とのなす角度θ₂ ^ｉを計測する。輪郭計測部２４は，区間ｓ_mの始点ｐ₁ ^mから終点ｐ_d ^mまで線分ｌ₁ ^mの始点を変更しながら、なす角度θを算出する。そして、算出したなす角度の平均値を３区間ｓ_m〜ｓ_m+2の平均角度とする。

ここで、３区間の平均角度が、例えば、１７０°≦θ≦１８０°である場合には、それぞれの区間を直線状区間とする。

さらに、図１２（ａ）に示すように、現在の評価対象区間に対して、区間を１つずらし、同様の算出を行っていく。このようにして、輪郭計測部２４は、すべての析出物において、輪郭線における直線状区間の数Ｌ_secと、輪郭線の長さＣとを算出して、輪郭線における直線状区間の割合Ｒ_lsecを次式によって算出する。

ここで、図１２（ｂ）に示すように、一定の間隔ｄで区切られた輪郭において、最終区間ｕが、一定の間隔ｄより小さい場合には、ｕ／ｄ個として計測する。さらに、この場合、最終区間ｕに、１番目の区間の画素が繋がっているものとする。

抽出部２６は、求めたヒストグラムより特徴量である線分の最大長と線分の総本数、及び輪郭線における直線状に接続された区間（直線状区間）の割合を取得する。

本実施の形態においても、実施の形態１と同様に、学習データの特徴量分布の取得部４４と識別面の設定部４５とを用いて、予め識別面６９を設定する。また、学習データの特徴量分布の取得部４４においては、実施形態１と同様に複数の画像（学習データ）に対して特徴量を予め求める。ここで、本実施の形態における特徴量は、最大長と総本数に加え、直線状区間の割合を有する３次元の量である。図１３では、主成分分析を用いて、求めた３変量の特徴量を２変量の特徴量に圧縮して、プロットしている。

続いて、実施形態１と同様に、識別面の設定部４５が、学習データの特徴量分布の取得部４４で求めた学習データの特徴量群に対して、マハラノビスの汎距離による判別分析を行なう。カテゴリＡに属する学習データは、最大長の平均を

とし、総本数の平均を

とし、直線区間の平均割合を

とし、最大長・総本数の分散共分散行列を

とする。同様に、カテゴリＢに属する学習データは、最大長の平均を

とし、総本数の平均を

とし、直線区間の平均割合を

とし、最大長・総本数の分散共分散行列を

とする。ここで、正解カテゴリ未知のデータＸの最大長をＬ_max,x、総本数をＮ_all,x、直線区間の平均割合をＲ_lsec,Aとすると、データＸとカテゴリＡとのマハラノビスの汎距離Ｄ_A ³は、

で求めることができ、同様に、データＸとカテゴリＢとのマハラノビスの汎距離Ｄ_B ³は、

で求めることができる。ここで、マハラノビスの汎距離による判別分析が、Ｄ_A ³＜Ｄ_B ³である場合、データＸはカテゴリＡに属すると判別でき、Ｄ_A ³＞Ｄ_B ³である場合は、データＸはカテゴリＢに属すると判別できる。さらに、Ｄ_A ³＝Ｄ_B ³である場合は、データＸは、カテゴリＡとカテゴリＢとを分ける識別面上にあると判別することができる。図１４に示すように、特徴量空間に設定された識別面６９が、カテゴリを判別する境界線である。

本実施例は、実施形態１における結晶構造解析可能性判定システムの実施例である。学習用画像とテスト画像とを用いて、本発明のタンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定システムの性能を確認した。本実施例では、実施形態１に係るものであるため、特徴量抽出部２０は、方向線分計測部２２と抽出部２６とを用いて構成される。まず、学習用画像である、カテゴリＡに属する画像２００枚とカテゴリＢに属する画像１００に基づいて、取得部４４と設定部４５により特徴量空間に識別面を設定した。続いて、テストデータである、カテゴリＡに属する画像１６６枚とカテゴリＢに属する画像３００を判定したところ、本発明の判定システムは、正解率７８．０％であった。特徴量のプロットの結果を図１７に示す。

次に、実施例２として、輪郭計測部２４を備える実施形態２に係る結晶構造解析可能性の判定システムの性能を確認した。まず、実施例１とは異なる学習用画像２５０枚を準備した。この学習用画像に基づいて、取得部４４と設定部４５により特徴量空間に識別面を設定した。このときの正解率は、８３．１％であった。ここで、学習用画像により求めた識別面に対して、２５０枚のテスト画像から抽出した特徴量を特徴量空間にプロットした。本発明の判定システムの正解率は、７４．２％であった。特徴量のプロットの結果を図１８に示す。なお、実施例２に用いた学習用画像とテスト画像は、実施例１のものと異なるため、これらの学習用画像とテスト画像を用いて、実施形態１と同様に判定したところ、学習用画像に対しては７６．４％の正解率となり、テスト画像に対しては６４．８％の正解率となった。

タンパク質溶液の結晶状態の画像による分類を模式的に示す説明図である。 （ａ）本発明の実施の形態におけるサンプルの構成を示す説明図である。（ｂ）マイクロバッチ法におけるタンパク質の相変化を説明するグラフである。 本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムの構成を示す構成図である。 本発明の実施の形態におけるＳｏｂｅｌ変換を示す説明図である。 本発明の実施の形態における、０度から１７９度方向へのラスタ走査の態様を示す説明図である。 本発明の実施の形態において、線分の長さの算出方法を示す説明図である。 本発明の実施の形態における抽出された線分の長さの分布を示すヒストグラムである。 本発明の実施の形態における特徴量空間での学習データの分布を示すグラフである。 本発明の実施の形態における特徴量空間での学習データの分布の上に識別面を描いたグラフである。 本発明の実施の形態における輪郭計測部を含む結晶化状態判定システムの特徴量抽出部を示す構成図である。 本発明の実施の形態における線分間のなす角度の計測方法を説明する図である。 （ａ）本発明の実施の形態における対象区間の遷移方法を説明する図である。（ｂ）本発明の実施の形態における最終区間を決定する方法を説明する図である。 本発明の実施の形態における特徴量空間での学習データの分布を示すグラフである。 本発明の実施の形態における特徴量空間での学習データの分布の上に識別面を描いたグラフである。 本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムの識別面の設定に関するフローチャートである。 本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムのタンパク質溶液の画像の判別に関するフローチャートである。 本発明の実施例１におけるテスト画像の分布と識別面とを示すグラフである。 本発明の実施例２におけるテスト画像の分布と識別面とを示すグラフである。

符号の説明

１ 沈殿剤を加えた微量のタンパク質溶液
２ オイル層
３ タンパク質の結晶
４ バッチ効果
５ 水分拡散効果
６ 溶解度曲線
１００ 結晶化状態判定システム
１０ 前処理部
１２ グレースケール化部
１４ 画像切り出し部
１６ Ｓｏｂｅｌ変換部
１８ ２値化部
２０ 特徴量抽出部
２２ 全方向線分計測部
２４ 輪郭計測部
２６ 抽出部
３０ 判定部
３２ 判別作業部
４０ 撮影装置
４１ 電子画像のデータ
４２ 原画像取得部
４３ 原画像データ
４４ 取得部
４５ 設定部
４６ 判定基準格納部
４７ 析出物状態のデータ
５２ 処理前の画像の対応する画素
５４ 画素値とその周囲８近傍の画素
５６ 急激に画素値が変化する部分
６２ 走査線
６４ エッジ画素
６６ 背景画素
６８、６９ 識別面

Claims (10)

1. タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと、
   前記原画像における析出物の輪郭線を抽出し、２値エッジ検出画像を作成する前処理ステップと、
   前記２値エッジ検出画像の画素をそれぞれの角度で走査し、前記輪郭線の一部となる線分に関するデータを求めて、該データから前記析出物の結晶化状態を反映する特徴量を求める特徴量抽出ステップであって、前記特徴量は、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線に含まれる線分の本数と、それらの線分の最大長とを含む、ステップと、
   前記特徴量に基づいて、タンパク質溶液の前記電子画像を判別する判別ステップと
   を含む、タンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定方法。
2. 前記特徴量抽出ステップにおける特徴量は、前記輪郭線に含まれる直線部の割合をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 判別すべきカテゴリがわかっている複数の学習用画像よりタンパク質溶液の析出物の結晶状態を反映する特徴量を予め抽出し、特徴量の分布を取得するステップと、
   前記学習用画像の特徴量の分布に基づいて、タンパク質溶液の析出物の結晶状態を複数のカテゴリに判別する識別境界を設定するステップと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記識別境界の設定ステップは、各カテゴリの学習用画像の特徴量の分布に対して、マハラノビス距離が等しくなる特徴量空間における線又は面を求めて前記識別境界とするステップである、請求項３に記載の方法。
5. 前記前処理ステップは、
   カラー画像である前記原画像をグレースケール画像に変換するステップと、
   前記グレースケール化された画像に対して、タンパク質溶液部の領域を切り出すステップと、
   前記タンパク質溶液部の領域の画像をＳｏｂｅｌ変換して析出物の輪郭線画像を得るステップと、
   前記輪郭線画像を２値化して２値エッジ検出画像を得るステップと
   を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、
   前記原画像における析出物の輪郭線を抽出し、２値エッジ検出画像を作成する前処理手段と、
   前記２値エッジ検出画像の画素をそれぞれの角度で走査し、前記輪郭線の一部となる線分に関するデータを求めて、該データから前記析出物の結晶化状態を反映する特徴量を求める特徴量抽出手段であって、前記特徴量は、前記２値エッジ検出画像における析出物の輪郭線に含まれる線分の本数と、それらの線分の最大長とを含む、ステップと、
   前記特徴量に基づいて、タンパク質溶液の前記電子画像を判別する判別手段と
   を含む、タンパク質溶液の析出物の結晶構造解析可能性の判定システム。
7. 前記特徴量抽出手段における特徴量は、前記輪郭線に含まれる直線部の割合をさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 判別すべきカテゴリがわかっている複数の学習用画像よりタンパク質溶液の析出物の結晶状態を反映する特徴量を予め抽出し、特徴量の分布を取得する手段と、
   前記学習用画像の特徴量の分布に基づいて、タンパク質溶液の析出物の結晶状態を複数のカテゴリに判別する識別境界を設定する手段と
   をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
9. 前記識別境界の設定手段は、各カテゴリの学習用画像の特徴量の分布に対して、マハラノビス距離が等しくなる特徴量空間における線又は面を求めて前記識別境界とする手段である、請求項８に記載のシステム。
10. 前記前処理手段は、
    カラー画像である前記原画像をグレースケール画像に変換する手段と、
    前記グレースケール化された画像に対して、タンパク質溶液部の領域を切り出す手段と、
    前記タンパク質溶液部の領域の画像をＳｏｂｅｌ変換して析出物の輪郭線画像を得る手段と、
    前記輪郭線画像を２値化して２値エッジ検出画像を得る手段と
    を含む、請求項６から９のいずれかに記載のシステム。

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