JP4634304B2 - 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム - Google Patents

Description

この発明は、試料中に含まれる蛍光色素の濃度の定量に関する。

試料中に含まれる蛍光色素の濃度を定量する一つの方法が、Ｗ．Ｔ．Ｍａｓｏｎ編、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、米国、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年、２０４〜２１５頁のＧａｒｙ Ｒ．Ｂｒｉｇｈｔ、「Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」に記載されている。この方法では、ダイクロイックフィルタを用いて白色光から蛍光色素の励起に必要な波長成分を抽出し、その波長成分を試料に照射して蛍光を発生させる。この蛍光をバンドパスフィルタを介してモノクロカメラで検出し、その強度を測定する。バンドパスフィルタは、試料中に含まれる蛍光色素に対応する波長成分のみをカメラで受光するために使用される。試料中の蛍光色素から発する蛍光の強度はその蛍光色素の濃度に比例するため、こうして測定された蛍光強度が蛍光色素の濃度として扱われる。

この方法では、蛍光色素に応じたダイクロイックフィルタおよびバンドパスフィルタからなるフィルタセットが使用される。試料に含まれる蛍光色素が一種類のときは、一つのフィルタセットを固定的に使用することができる。しかし、蛍光色素が２種類以上のときは、試料の測定中に複数のフィルタセットを取り替えて使用する必要がある。フィルタセットの取り替えは光学系をわずかに変化させるため、定量の精度に影響を与える。また、フィルタセットの取り替えによって、異なる蛍光色素間で測定時間に差が生じる。これは、生きている試料の測定には好ましくない。

上記の方法は、定量精度の面でも改善すべき点がある。試料に含まれる複数の蛍光色素のピーク波長が接近している場合、複数の蛍光スペクトルの裾同士が重なり合う。この場合、バンドパスフィルタを使用しても単一の蛍光色素に応じた波長成分のみを蛍光から抽出することができず、フィルタを通過した蛍光には別の蛍光色素の波長成分が混入してしまう。これは、蛍光色素の定量の精度を低下させる。

本発明は、複数の蛍光色素の濃度を精度良く定量することを目的とする。

一つの側面において、本発明は、試料中の蛍光色素の濃度を定量する方法に関する。この方法は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。この方法では、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得する。また、撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。この後、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する。

ここで、Ｏ_１〜Ｏ_ｋは、第１〜第ｋ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。Ｊはｋ行ｍ列からなる行列であり、Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｋ以下の整数、ｊは１以上ｍ以下の整数）は、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎ（ｎは２以上の整数）における、前記第１〜第ｍ基準試料から発する蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ （ｔは１〜ｎの整数）を、該分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎにおいて第１〜第ｋの検出波長帯に感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を有する撮像装置を用いて測定し、感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を成分とするｋ行ｎ列の行列と、蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ を成分とするｎ行ｍ列の行列とを掛け合わせ、全波長λ１〜λｎにわたって積分することにより算出される。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。

上記の撮像装置は、第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでいてもよい。基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度の取得は、そのマルチバンドカメラを用いて各基準試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像し、各基準試料中の蛍光を発する部位を表示する画素の値を各蛍光画像から取得してもよい。第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍの算出は、第ｉ検出波長帯で撮像された第ｊ基準試料の蛍光画像から取得された画素の値を行列Ｊの成分Ｊ_ｉｊとして使用してもよい。この場合、基準試料およびターゲット試料の双方の蛍光強度を同じマルチバンドカメラを用いて測定できる。したがって、蛍光色素の濃度を簡易に定量できる。

撮像装置は、第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでいてもよい。基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得することは、各基準試料から発する蛍光の分光強度を分光器を用いて測定し、分光強度とマルチバンドカメラの各検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を算出してもよい。このように、基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度は、撮像装置を使用して直接取得する代わりに、分光器を使用して取得することも可能である。

別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を撮像装置を用いて定量する方法に関する。撮像装置は、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯と、撮像装置の異なる感度特性を設定する第１〜第ｑ（ｑは２以上の整数）の感度モードとを有している。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。この方法では、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯および各感度モードでの測定強度を取得する。また、撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯および各感度モードで撮像する。この後、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する。

ここで、Ｐ_ｖ（ｖは１以上ｑ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｐ_ｖの第ｉ行成分Ｐ_ｉｖ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、撮像装置を用いて第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードで撮像されたターゲット試料の蛍光画像において部位に対応する画素の値である。Ｊ_１は（ｋ・ｑ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_１の成分行列Ｌ_ｖｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｌ_ｉｖｊは、第ｊ基準試料から発する蛍光の第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードでの測定強度である。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、この方法によって定量可能な蛍光色素の数は（検出波長帯の数）×（感度モードの数）である。したがって、感度モードの数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。

さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法に関する。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。この方法では、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、異なる波長スペクトルを有し第１〜第ｍ蛍光色素をすべて励起する第１〜第ｒ（ｒは２以上の整数）の励起光の各々を第１〜第ｍ基準試料に照射し、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得する。また、各励起光をターゲット試料に照射し、撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。この後、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する。

ここで、Ｑ_ｕ（ｕは１以上ｒ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｑ_ｕの第ｉ行成分Ｑ_ｉｕ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、第ｕ励起光の照射に応じて第ｉ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。Ｊ_２は（ｋ・ｒ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_２の成分行列Ｔ_ｕｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｔ_ｉｕｊは、第ｕ励起光の照射に応じて第ｊ基準試料から発する蛍光の第ｉ検出波長帯での測定強度である。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、この方法によって定量可能な蛍光色素の数は（検出波長帯の数）×（励起光の種類の数）である。したがって、励起光の種類の数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。

本発明の定量方法において、撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を第１〜第ｋ検出波長帯で撮像して第１〜第ｋの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、第１〜第ｋの画像信号が入力される演算回路とを含んでいてもよい。第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍの算出は、演算回路が第１〜第ｋの画像信号を用いて演算を実行する処理を含んでいてもよい。この定量方法は、演算回路に、ターゲット試料の複数の部位における濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出させ、第１〜第ｍの蛍光色素の濃度分布を表す第１〜第ｍの画像信号を生成させることを更に備えていてもよい。この定量方法では、撮像装置が、自身の取得したターゲット試料の蛍光画像信号を用いて蛍光色素の濃度を算出し、濃度分布を表す画像信号を生成する。したがって、この定量方法は、定量結果を迅速に提示することができる。

別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光検出器、撮像装置および演算装置を備えている。光検出器は、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有し、ターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。演算装置は、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する

ここで、Ｏ_１〜Ｏ_ｋは、第１〜第ｋ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。Ｊはｋ行ｍ列からなる行列であり、Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｋ以下の整数、ｊは１以上ｍ以下の整数）は、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎ（ｎは２以上の整数）における、前記第１〜第ｍ基準試料から発する蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ （ｔは１〜ｎの整数）を、該分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎにおいて第１〜第ｋの検出波長帯に感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を有する撮像装置を用いて測定し、感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を成分とするｋ行ｎ列の行列と、蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ を成分とするｎ行ｍ列の行列とを掛け合わせ、全波長λ１〜λｎにわたって積分することにより算出される。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。

光検出器および撮像装置は、第１〜第ｋ（ｋは２以上の整数）検出波長帯を有するマルチバンドカメラであってもよい。光検出器は、各検出波長帯にて各基準試料の蛍光画像を撮像し、各基準試料中の蛍光を発する部位を表示する画素の値を各蛍光画像から取得してもよい。演算装置は、第ｉ検出波長帯で撮像された第ｊ基準試料の蛍光画像から取得された前記画素の値を行列Ｊの成分Ｊ_ｉｊとして使用してもよい。この場合、基準試料およびターゲット試料の双方の蛍光強度を同じマルチバンドカメラを用いて測定できる。したがって、蛍光色素の濃度を簡易に定量できる。

光検出器は、各基準試料から発する蛍光の分光強度を測定する分光器を含んでいてもよい。撮像装置は、第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでいてもよい。演算装置は、分光器によって測定される分光強度とマルチバンドカメラの各検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での強度を算出し、算出された強度を行列Ｊの各成分として使用してもよい。このように、基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度は、撮像装置を使用して直接取得する代わりに、分光器を使用して取得することも可能である。

さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光検出器、撮像装置および演算装置を備えている。光検出器は、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯と、撮像装置の異なる感度特性を設定する第１〜第ｑ（ｑは２以上の整数）の感度モードとを有している。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。この撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯および各感度特性で撮像する。演算装置は、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する。

ここで、Ｐ_ｖ（ｖは１以上ｑ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｐ_ｖの第ｉ行成分Ｐ_ｉｖ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードで撮像されたターゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。Ｊ_１は（ｋ・ｑ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_１の成分行列Ｌ_ｖｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｌ_ｉｖｊは、第ｊ基準試料から発する蛍光の第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードで測定された強度である。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、このシステムによって定量可能な蛍光色素の数は（検出波長帯の数）×（感度モードの数）である。したがって、感度モードの数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。

さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光源、光検出器、撮像装置および演算装置を備えている。光源は、異なる波長スペクトルを有し第１〜第ｍ蛍光色素をすべて励起する第１〜第ｒ（ｒは２以上の整数）の励起光を生成する。光検出器は、第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料への各励起光の照射に応じて各基準試料から発する蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有している。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。撮像装置は、ターゲット試料への各励起光の照射に応じてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。演算装置は、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する。

ここで、Ｑ_ｕ（ｕは１以上ｒ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｑ_ｕの第ｉ行成分Ｑ_ｉｕ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、第ｕ励起光の照射に応じて第ｉ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。Ｊ_２は（ｋ・ｒ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_２の成分行列Ｔ_ｕｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｔ_ｉｕｊは、第ｕ励起光の第ｊ基準試料への照射に応じて第ｉ検出波長帯で測定された蛍光の強度である。

上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、このシステムによって定量可能な蛍光色素の数は（検出波長帯の数）×（励起光の種類の数）である。したがって、励起光の種類の数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。

本発明の定量システムにおいて、撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を第１〜第ｋ検出波長帯で撮像して第１〜第ｋの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、上記の演算装置としての演算回路と、を含んでいてもよい。第１〜第ｋの画像信号は、この演算回路に入力される。演算回路は、第１〜第ｋの画像信号を用いて演算を実行し、ターゲット試料の複数の部位における濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出して、第１〜第ｍの蛍光色素の濃度分布を表す第１〜第ｍの画像信号を生成してもよい。この定量システムでは、撮像装置が、自身の取得したターゲット試料の蛍光画像信号を用いて蛍光色素の濃度を算出し、濃度分布を表す画像信号を生成する。したがって、この定量システムは、定量結果を迅速に提示することができる。

図１は蛍光色素定量システムの一例の構成を示すブロック図である。 図２は蛍光色素の濃度を定量する手順を示すフローチャートである。 図３は定量の第２段階を説明するための図である。 図４は定量結果の表現方法の例を示す図である。 図５は定量結果の表現方法の例を示す図である。 図６は定量結果の表現方法の例を示す図である。 図７は蛍光色素定量システムの他の例の構成を示すブロック図である。 図８はＣａ^２＋の濃度と蛍光強度比との関係を示す図である。 図９は３バンドカメラの感度特性を示す図である。 図１０はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを混合したターゲット試料から取得した分光データを示す図である。 図１１はＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅＹｅｌｌｏｗを混合したターゲット試料から取得した分光データを示す図である。 図１２はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを混合したターゲット試料からバンドパスフィルタを通して測定した分光データを示す図である。 図１３はＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅＹｅｌｌｏｗを混合したターゲット試料からバンドパスフィルタを通して取得した分光データを示す図である。 図１４は第１および第２実施例で算出されたＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示す図である。 図１５は第３実施例および比較例で算出されたＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示す図である。 図１６は第１および第２実施例で算出されたＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示す図である。 図１７は第３実施例および比較例で算出されたＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示す図である。 図１８は基準試料およびターゲット試料の実測の蛍光スペクトルを示す図である。 図１９は第１実施例で得られた蛍光色素の濃度を用いて算出されたターゲット試料の蛍光スペクトルを示す図である。 図２０は第２実施例で得られた蛍光色素の濃度を用いて算出されたターゲット試料の蛍光スペクトルを示す図である。 図２１は蛍光色素定量システムの他の例の構成を示すブロック図である。 図２２は蛍光色素の定量に関する種々のデータを示す図である。 図２３はマルチバンドカメラに搭載された電子回路を示すブロック図である。 図２４は第８実施形態で取得した画像を示す写真である。 図２５は比較例で取得した画像を示す写真である。 図２６は４バンドカメラの感度特性を示す図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

第１実施形態
図１は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。定量システム１００は、光源１０、蛍光顕微鏡２０、マルチバンドカメラ３０およびパーソナルコンピュータ４０を有する。コンピュータ４０には、ディスプレイ装置４２およびプリンタ４４が接続されている。定量システム１００は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素の濃度を定量する。定量システム１００は、３種類までの蛍光色素の濃度を定量できる。なお、本実施形態では、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が何であるかはあらかじめ分かっている。

光源１０は、試料１を励起するための光を生成し、試料１に照射する。光源１０は、白色光を発するＸｅランプ１０ａおよび多色発光型のＬＥＤ１０ｂを有しており、いずれか一方が選択的に使用される。Ｘｅランプ１０ａおよびＬＥＤ１０ｂのいずれを使用するかは、コンピュータ４０によって制御される。本実施形態では、Ｘｅランプ１０ａが使用される。

蛍光顕微鏡２０は、光源１０からの光の照射によって試料１から発する蛍光の光学像を所定の倍率で取得し、それをマルチバンドカメラ３０に送る。蛍光顕微鏡２０は、光源１０からの光を受け取るバンドパスフィルタ２２と、試料１から発する蛍光を受け取るバンドパスフィルタ２４とを有している。バンドパスフィルタ２２は、試料１に含まれる蛍光色素の励起に不要な波長成分を光源１０の光から除去するために使用される。バンドパスフィルタ２４は、試料１に含まれる蛍光色素から発する蛍光と異なる波長の光を遮断するために使用される。これら一対のフィルタ２２および２４は、フィルタセットと呼ばれることがある。

マルチバンドカメラ３０は、蛍光顕微鏡２０から蛍光の光学像を受け取り、その電気的な画像データを生成する撮像装置である。本実施形態では、マルチバンドカメラ３０は、異なる三つの検出波長帯を有しており、これらの検出波長帯に感度を有している。これらの検出波長帯は、通常、Ｒ（赤）、Ｇ（緑）およびＢ（青）に対応している。以下では、これらの検出波長帯をＲ波長帯、Ｇ波長帯およびＢ波長帯と呼ぶ。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。すなわち、Ｒ波長帯とＧ波長帯は部分的に重なっており、Ｇ波長帯とＢ波長帯も部分的に重なっている。マルチバンドカメラ３０は、これらの検出波長帯に対応する三つの撮像素子（例えばＣＣＤ）と、入力光の波長成分を三つの検出波長帯に分離して、対応する撮像素子に送る色分解プリズムを含んでいる。このほかに、マルチバンドカメラ３０は、カラーモザイクフィルタ等が印刷された一つの撮像素子（例えばＣＣＤ）を含んでいてもよい。マルチバンドカメラ３０は、Ｒ、ＧおよびＢ波長帯の各々で蛍光像を検出し、それらの波長帯に対応したＲ、ＧおよびＢ出力を生成する。Ｒ、ＧおよびＢ出力は、それぞれＲ、ＧおよびＢ波長帯で検出された蛍光像の画像データである。この画像データは、蛍光の強度を示す値を各画素において有している。各画素は、試料１の一つの部位に対応する。

後で詳細に説明するように、マルチバンドカメラ３０は、二つの動作モードを有する。一つは、標準の感度特性を有するＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードであり、もう一つは、全感度が標準よりもわずかに高いＬｏｗ Ｌｉｇｈｔモードである。本実施形態では、カメラ３０はＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードでのみ動作する。

コンピュータ４０は、定量システム１００による蛍光色素の定量を制御する装置である。コンピュータ４０は、光源１０に光源切替信号を送信し、Ｘｅランプ１０ａとＬＥＤ１０ｂのいずれを使用するかを制御する。また、コンピュータ４０は、マルチバンドカメラ３０によって取得されたターゲット試料の蛍光画像データを用いてターゲット試料中の各蛍光色素の濃度を算出する演算装置としても機能する。コンピュータ４０は、この制御および演算のためのソフトウェアを格納する記憶装置を有している。このソフトウェアは、記録媒体４６から記憶装置に読み込まれてもよい。コンピュータ４０は、このソフトウェアにしたがって上記の制御および演算を実行する。

以下では、図２を参照しながら、定量システム１００を用いてターゲット試料中の蛍光色素の濃度を定量する方法を説明する。図２は、定量の手順を示すフローチャートである。この定量方法は、大きく２段階に分かれている。第１の段階にはステップＳ２０２およびＳ２０４が該当し、第２の段階にはステップＳ２０６〜Ｓ２１２が該当する。

第１段階では、定量の基礎となるデータを取得する。まず、この基礎データを取得するために基準試料を作成する（ステップＳ２０２）。基準試料は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の各々を単独で含む試料である。したがって、基準試料は、ターゲット試料中の蛍光色素と同数だけ作成される。各基準試料は、各蛍光色素を所定の濃度で含んでいる。以下では、この濃度を単位濃度と呼ぶ。単位濃度は、基準試料ごとに異なっていてもよい。

次に、定量システム１００を用いて各基準試料の蛍光画像データを取得する（ステップＳ２０４）。Ｘｅランプ１０ａから白色光が放出され、バンドパスフィルタ２２を透過して基準試料に照射される。これにより、基準試料中の蛍光色素が励起され、蛍光が発する。バンドパスフィルタ２２を透過した光は、すべての基準試料を励起することの可能な波長スペクトルを有している。

マルチバンドカメラ３０は、蛍光顕微鏡２０を介して基準試料の蛍光像を受け取り、それを画像データに変換する。蛍光像はマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ波長帯の各々で検出される。したがって、マルチバンドカメラ３０は、一つの基準試料に対して、三つの検出波長帯で取得された三つの画像データを生成する。これらの画像データは、コンピュータ４０に送られ、コンピュータ４０内の記憶装置に保存される。これが一つの基準試料について取得された基礎データである。すべての基準試料について同様の測定が行われ、基礎データが保存される。こうして定量の第１段階が終了する。

各基礎データの各画素は、マルチバンドカメラ３０を用いて測定された蛍光強度を示す値を有している。Ｒ、ＧおよびＢ波長帯で取得された画素値は、それぞれＲ値、Ｇ値およびＢ値と呼ばれることがある。

以下では、図３を参照しながら定量の第２段階を説明する。第２段階では、基礎データを用いてターゲット試料中の各蛍光色素の濃度を算出する。まず、Ｘｅランプ１０ａからバンドパスフィルタ２２を介してターゲット試料に光を照射してターゲット試料中のすべての蛍光色素を励起し、ターゲット試料の蛍光画像を取得する（ステップＳ２０６）。このステップは、ターゲット試料が生きている細胞の場合など、ターゲット試料の活動状態に応じて蛍光色素の濃度が時々刻々と変化するような場合には、その変化を測定するために連続的に複数回行ってもよい。Ｘｅランプ１０ａから発する光の強度は、基準データの取得のために基準試料を励起するときと同じである。マルチバンドカメラ３０は、試料１から発する蛍光像を蛍光顕微鏡２０を介して受け取り、画像データに変換する。蛍光像はマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ波長帯の各々で検出される。したがって、図３に示されるように、マルチバンドカメラ３０は、ターゲット試料に対して三つの検出波長帯で取得された三つの画像データ５１〜５３を生成する。これらの画像データはコンピュータ４０に送られる。以下では、これらの画像データをターゲットデータと呼ぶことがある。

次に、コンピュータ４０は、ステップＳ２０６で取得したターゲットデータとステップＳ２０４で取得した基礎データとを用いて、蛍光色素の濃度を画素ごとに算出する（ステップＳ２０８）。以下では、この定量計算の理解を容易にするため、ターゲット試料の一部位における蛍光色素の濃度の定量を説明する。ターゲット試料の一部位は、蛍光画像中の一画素に対応する。ターゲット試料には、２種類の蛍光色素が含まれているものとする。この場合、ステップＳ２０２において基準試料も２種類用意される。

コンピュータ４０は、以下の式で示される演算によりターゲット試料中の一部位における第１および第２蛍光色素の濃度ｃ_１およびｃ_２を求める。なお、この濃度ｃ_１およびｃ_２は、上述した単位濃度、すなわち第１および第２基準試料における第１および第２蛍光色素の濃度を単位としている。したがって、第１蛍光色素の実際の濃度は、第１蛍光色素の単位濃度にｃ_１を乗算した値であり、第２蛍光色素の実際の濃度は、第２蛍光色素の単位濃度にｃ_２を乗算した値である。このことは、後述する他の実施形態でも同じである。

ここで、行列ＪはステップＳ２０４で取得した基礎データを示す。行列Ｊの第１列におけるＲｆ_１、Ｇｆ_１およびＢｆ_１は、第１蛍光色素のみを含む第１の基準試料についてステップＳ２０４にて取得されたＲ、ＧおよびＢ値である。行列Ｊの第２列におけるＲｆ_２、Ｇｆ_２およびＢｆ_２は、第２蛍光色素のみを含む第２の基準試料についてステップＳ２０４にて取得されたＲ、ＧおよびＢ値である。Ｒ_ｔｇｔ、Ｇ_ｔｇｔおよびＢ_ｔｇｔは、ターゲット試料についてステップＳ２０６にて取得されたＲ、ＧおよびＢ値である。（１）式においてＪ^Ｔは行列Ｊの転置行列を表す。上記の式は後で詳しく説明する。

コンピュータ４０は、すべての画素について（１）式の演算を実行し、第１および第２蛍光色素の濃度を画素ごとに求める。これにより、図３に示されるように、二つの蛍光色素の濃度分布データ６１および６２が得られる。

次に、コンピュータ４０は、これらの濃度分布データ６１および６２を用いて定量結果表示用の画像データを生成する（ステップＳ２１０）。この画像データは、二つの蛍光色素のターゲット試料上における濃度分布を示す。この画像データは、ディスプレイ装置４２に送られる。これにより、図３に示されるように、蛍光色素のターゲット試料上における濃度分布を示す画像６３がカラーバー６４とともにディスプレイ装置４２上に表示される（ステップＳ２１２）。なお、コンピュータ４０は、この濃度分布画像６３およびカラーバー６４をプリンタ４４を用いて印刷することもできる。

以下では、上記（１）および（２）式を詳しく説明する。ターゲット試料中の蛍光色素から発する蛍光の強度は、その蛍光色素の濃度に比例して増加する。これらの色素から発する蛍光については、加法定理が成り立つ。したがって、ある一つの画素においてマルチバンドカメラ３０によって取得されるＲ、ＧおよびＢ値は、次の式で表される。

ここで、ｆ_１およびｆ_２は単位濃度の第１および第２蛍光色素から発する蛍光の強度であり、ｃ_１およびｃ_２は第１および第２蛍光色素のターゲット試料中の濃度である。Ｒ_ｔｇｔ、Ｇ_ｔｇｔおよびＢ_ｔｇｔは、ターゲット試料の一部位に対するマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ値である。ｒ、ｇおよびｂは、Ｒ、ＧおよびＢ波長帯におけるマルチバンドカメラ３０の感度特性である。パラメータｆ_１およびｆ_２ならびにｒ、ｇおよびｂに付された添字λは、これらのパラメータが波長の関数であることを示す。

ｆ_１λ・ｃ_１λは、ターゲット試料中の第１蛍光色素から発する、ある一つの波長を有する蛍光の強度である。同様に、ｆ_２λ・ｃ_２λは、ターゲット試料中の第２蛍光色素から発する、ある一つの波長を有する蛍光の強度である。加法定理が成立することから、ある一つの波長を有する蛍光の強度の合計は（ｆ_１λ・ｃ_１λ＋ｆ_２λ・ｃ_２λ）である。マルチバンドカメラ３０は、この蛍光強度をＲ、ＧおよびＢ波長帯の各々で検出する。（３．１）式に示されるように、ターゲット試料から取得されたＲ値は、各波長における総蛍光強度（ｆ_１λ・ｃ_１λ＋ｆ_２λ・ｃ_２λ）にＲ波長帯の感度特性ｒ_λを乗算し、それを全波長にわたって積分したものである。同様に、ターゲット試料から取得されたＧ値またはＢ値は、総蛍光強度（ｆ_１λ・ｃ_１λ＋ｆ_２λ・ｃ_２λ）にＧ波長帯またはＢ波長帯の感度特性ｇ_λまたはｂ_λを乗算し、それを全波長にわたって積分したものである。このように、ターゲット試料からの蛍光のＲ、ＧおよびＢ値は、各波長での蛍光強度とその波長に対応するカメラ３０の感度とを掛け合わせ、それを全波長にわたって積分した値である。マルチバンドカメラ３０の感度特性の一例は、図９に示されている。この図については後述する。

（３．１）〜（３．３）式を一つの行列式に書き直すと、次のようになる。

（４）式をさらに書き直すと、次のようになる。

（５）式に示されるように、ターゲット試料の蛍光のＲ、ＧおよびＢ値は、以下に示す行列Ｊに蛍光色素の濃度行列を掛けることにより算出される。

行列Ｊの第１列における三つの成分は、第１蛍光色素の単位濃度下における蛍光強度をマルチバンドカメラ３０を用いて測定することにより得られるＲ、ＧおよびＢ値である。これは、第１基準試料の測定により得られる上述のＲｆ_１、Ｇｆ_１およびＢｆ_１に等しい。同様に、行列Ｊの第２列における三つの成分は、第２蛍光色素の単位濃度下における蛍光強度をマルチバンドカメラ３０を用いて測定することにより得られるＲ、ＧおよびＢ値であり、これは、第２基準試料の測定により得られる上述のＲｆ_２、Ｇｆ_２およびＢｆ_２に等しい。したがって、行列Ｊのすべての成分は、これらの基準試料から発する蛍光をマルチバンドカメラ３０で測定することにより求めることができる。つまり、行列ＪはステップＳ２０４で取得される基礎データと等価である。

（５）式を変形すると、上記の（１）式が得られる。コンピュータ４０は、基礎データＪを用いて上記（１）式の演算を実行し、各画素における蛍光色素の濃度ｃ_１およびｃ_２を算出する。ターゲット試料の一部位に含まれる蛍光色素の濃度は、このようにして定量される。

上記（１）および（２）式をより一般的な形に書き直すと、次のようになる。

ここで、ターゲット試料には、第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）の蛍光色素が含まれており、マルチバンドカメラは、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上の整数）の検出波長帯を有しているものとする。Ｏ_１〜Ｏ_ｋは、マルチバンドカメラを用いて第１〜第ｋ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像中のある一画素の値である。Ｊはｋ×ｍの行列であり、Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｋ以下の整数、ｊは１以上ｍ以下の整数）は、第ｊ基準試料から発する蛍光の第ｉ検出波長帯での測定強度である。

本実施形態では、Ｊ_ｉｊは、マルチバンドカメラを用いて第ｉ検出波長帯で撮像された第ｊ基準試料の蛍光画像においてＯ_１〜Ｏ_ｋと同じ画素の値である。ただし、Ｊ_ｉｊがＯ_１〜Ｏ_ｋと同じ画素の値である必要は必ずしもない。例えば、基準試料が特定の部位でのみ蛍光を発する場合は、その部位に対応する任意の一つの画素の値をＪ_ｉｊとし、すべての画素に対する定量演算においてこのＪ_ｉｊを共通に使用してもよい。この場合、Ｊ_ｉｊの画素はＯ_１〜Ｏ_ｋの画素と必ずしも一致しない。

次に、定量結果の表現方法について説明する。定量結果の表現方法はさまざまであるが、以下では具体例をいくつか挙げる。図４は、表現方法の一例を示している。この方法は、ターゲット試料に含まれる二つの蛍光色素の濃度分布をモノクロ画像７１および７２として表現する。画像７１および７２では、蛍光色素の濃度が輝度によって表される。各画像内には、濃度分布のほかにモノクロバー７３も表示される。また、図５に示されるように、各蛍光色素の濃度分布を偽カラーを用いて表示してもよい。図５については、後でより詳細に説明する。二つの蛍光色素の分布の違いを明示したいときは、これらの蛍光色素の濃度の比を算出し、濃度比分布をモノクロ画像として表示し、あるいは偽カラーを用いて表示してもよい。

このほかに、すべての画素における蛍光色素の濃度を色彩３次元空間内にプロットすることにより定量結果を表現してもよい。図６は、色彩３次元空間を利用する表現方法の一例を示している。この例では、均等色空間であるＬ＊ａ＊ｂ＊空間内に蛍光色素濃度がプロットされる。図６においてａ＊軸は第１の蛍光色素に対応した色味を示し、ｂ＊軸は第２の蛍光色素に対応した色味を示す。また、Ｌ＊軸は明るさを示す。図６における２次元位置は、二つの蛍光色素の濃度比を示す。

以下では、本実施形態の利点を従来技術との対比により説明する。従来技術では、光源の出力光から一つの蛍光色素の励起に使用する波長成分を抽出するフィルタと、試料から発する蛍光からその蛍光色素に対応する波長成分を抽出するフィルタの組み合わせ、すなわちフィルタセットを使用する。このフィルタセットは、各蛍光色素に対して用意され、蛍光顕微鏡内に設置される。例えば、紫外励起で主に青色蛍光を観察するためのフィルタセット、青色励起で主に緑色蛍光を観察するためのフィルタセット、および緑色励起で主に赤色蛍光を観察するためのフィルタセットが用意される。これらのフィルタセットを適宜切り替えながら、モノクロカメラで各蛍光色素からの蛍光画像を撮像する。各画素の値が蛍光色素の濃度を示すものとして扱われる。

しかし、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルが重なり合っている場合には、これらの色素からの蛍光をバンドパスフィルタで完全に分離することはできない。したがって、蛍光スペクトルの重なりが大きいときには、定量の精度が低い。また、フィルタセットを切り替えながら繰り返し蛍光画像を取得する必要がある。このため、複数の蛍光色素の濃度を同時に定量できない。これは、ターゲットが生物試料である場合に問題となる。さらに、フィルタセットの切り替えの際に光学系にわずかな変化が生じ、それにより複数の蛍光色素間で定量の精度に差が出るおそれがある。

これに対し、本実施形態は、蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されない計算式を用いて蛍光色素の濃度を算出する。このため、蛍光スペクトルの重なりの有無にかかわらず、蛍光色素の濃度を精度よく求めることができる。これは、後述する実施例を参照することにより、いっそう明らかとなる。

また、本実施形態は、フィルタセットを切り替えることなくマルチバンドカメラ３０を用いてターゲット試料の蛍光画像を取得することにより定量を行う。このため、本実施形態の方法は、複数の蛍光色素の濃度を同時に求めることができ、したがって、ターゲットが生物試料である場合にも好適に使用できる。さらに、定量中に光学系を変更しないので、複数の蛍光色素の濃度を均一の精度で求めることができる。したがって、本実施形態の方法により得られる蛍光色素の濃度は信頼性が高い。

第２実施形態
図１に示されるように、本実施形態の蛍光色素定量システム２００は、上記の定量システム１００の構成に加えて分光器３５を有している。分光器３５は、蛍光顕微鏡２０によって取得された蛍光像を受光できるように配置されている。蛍光顕微鏡２０は、カメラ３０と分光器３５の双方に蛍光像を送るための光学素子、例えばハーフミラーを有していてもよい。あるいは、分光器３５は、カメラ３０との交換で設置されてもよい。

本実施形態は、上記のステップＳ２０４における基礎データの取得方法が第１実施形態と異なっている。すなわち、本実施形態では、マルチバンドカメラ３０ではなく分光器３５を用いて基礎データを取得する。この場合でも、第１実施形態と同様の利点が得られる。本実施形態における他の定量手順は第１実施形態と同様である。

マルチバンドカメラ３０を用いて取得される基礎データＪは、上記（２）式に示されるように、基準試料からの蛍光をマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ波長帯の各々で測定することにより得られる画素値である。上記（６）式に示されるように、これらの画素値は、単位濃度下における蛍光色素の各波長での蛍光強度とその波長に対応するカメラ３０の感度特性とを掛け合わせ、それを全波長にわたって積分した値である。この積分は近似的に次のように書き直せる。

ここで、λ１、λ２、…λｎは、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯を表す。ｎは２以上の整数であり、分光波長帯の数を表している。ｒ_λｔ、ｇ_λｔおよびｂ_λｔ（ｔは１〜ｎの整数）は、分光波長帯λｔでのマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ感度特性を示している。ｆ_１λｔおよびｆ_２λｔは、単位濃度の第１および第２蛍光色素から発する蛍光の分光波長帯λｔにおける強度を示している。（９）式では、Ｒ、ＧおよびＢ感度特性ならびに第１および第２蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度が、各分光波長帯において一定の値を有するものとみなされている。

これらの分光波長帯における第１および第２蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度は、分光器３５を用いて測定することができる。すなわち、第１および第２基準試料から発する蛍光を分光器３５を用いて検出すれば、分光波長帯λ１、λ２、…λｎにおける第１および第２蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度ｆ_１λ１、ｆ_１λ２、…ｆ_１λｎおよびｆ_２λ１、ｆ_２λ２、…ｆ_２λｎが取得される。これが（９）式の右辺第２項に示される分光データである。

本実施形態では、コンピュータ４０は、（９）式の右辺第１項に相当するマルチバンドカメラ３０の分光感度特性を記憶装置に格納している。コンピュータ４０は、分光器３５を用いて各基準試料から分光データを取得すると、上記（９）式の演算を実行し、（９）式に示される行列Ｊｓを算出する。

この行列Ｊｓと基礎データである行列Ｊとは、理想的には一致する。しかし、実際には、マルチバンドカメラ３０と分光器３５とを関係づけるためには、較正のための係数および関係の誤差を軽減するための係数が必要である。このため、行列ＪとＪｓにその係数の表記が必要となる。そのため、ＪとＪｓの関係は、次のように表される。

ここで、ａは補正用の定数である。定数ａは、Ｘｅランプ１０ａからの白色光をＮＤフィルタを介してマルチバンドカメラ３０および分光器３５の各々で検出し、測定された光強度の比を算出することにより決定される。

このように、コンピュータ４０は、分光器３５を用いて取得した分光データとマルチバンドカメラ３０の分光感度特性とを用いて（９）および（１０）式に示される演算を実行し、基礎データＪを算出する。この基礎データＪは、すべての画素における蛍光色素濃度の算出に共通して使用される。この場合でも良好な精度で蛍光色素濃度を定量することができる。

（９）式および（１０）式に示されるように、マルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ値は、分光器３５によって取得される分光データとマルチバンドカメラ３０の感度特性を用いて算出することができる。より一般的に述べると、マルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ値と分光器３５の分光データを用いて算出されるＲ、ＧおよびＢ値とは定数ａを用いて相互に変換することができる。したがって、基準試料だけでなくターゲット試料からの蛍光も分光器３５で測定して分光データを取得し、その分光データからＲ、ＧおよびＢ値を算出し、上記（１）式の計算を行えば、カメラ３０を使用せずとも蛍光色素の濃度を求めることができる。ただし、分光器３５は一度に試料中の一部位の分光データしか取得できない。このため、蛍光色素濃度の分布を求める場合は、マルチバンドカメラ３０のような撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を撮像するほうが効率がよい。

上記の説明では、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が何であるかはあらかじめ分かっているものとされている。しかし、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が分かっていなくても、蛍光色素の種類を特定し、そのうえで濃度を定量することが可能である。この場合は、基礎データとして、様々な既知の蛍光色素の分光スペクトルがあらかじめ測定され、あるいは公開されている分光スペクトルがあらかじめ取得される。この基礎データは、コンピュータ４０内の記憶装置に格納される。コンピュータ４０は、分光器を用いてターゲット試料の一部位から取得した分光データと一つ以上の任意の蛍光色素の基礎データを使用して、上記（１）式の計算を行う。次に、コンピュータ４０は、算出した濃度値を用いて、使用した基礎データに対応する蛍光色素をターゲット試料が含んでいるとしたときの分光スペクトルを算出する。コンピュータ４０は、こうしてシミュレートされた分光スペクトルを、分光器を用いて実際に測定されたターゲット試料の分光スペクトルと比較し、そのＦｉｔｔｉｎｇ度合いが所定のしきい値以上であるか否かを判定する。コンピュータ４０は、このような判定アルゴリズムにしたがって実測のスペクトルに十分に近いシミュレートスペクトルを与える蛍光色素を探すことにより、ターゲット試料に含まれる蛍光色素を特定する。また、蛍光色素が特定されれば、第１実施形態の方法によって、全画素上における蛍光色素の濃度を算出することが可能である。

また、基礎データとして、既知のスペクトルを用意しておかなくても、ターゲット試料群の測定系の中で、主成分分析を行い、その結果の主成分スペクトルを基準スペクトルとして計算し、濃度計算を行うこともできる。即ち、上記の様にあたりをつける目的の、前準備した基礎データを有さなくても、試料群のなかから、成分的に主成分と考えられる理想的な基準スペクトルを形づくり、それを基にした定量計算も可能である。このため、例えば、試料自身が有する蛍光発光物質の成分定量も可能である。また、これと上記との組み合わせ計算も可能である。

第３実施形態
本実施形態は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が４種類以上のときの定量に関する。蛍光色素が４種類以上の場合、マルチバンドカメラの検出波長帯の数を蛍光色素の数に応じて増やしていけば、検出波長帯と同数までの蛍光色素を定量できる。実際、「ＮＨＫ技研 Ｒ＆Ｄ」（Ｎｏ．５２、５３〜６０頁、１９９８年）に記載される光学系を使用すれば、４バンドのマルチカメラを得ることはできる。しかし、５バンドや６バンドのカメラを実現するための光学系を考案することは難しい。

そこで、本実施形態では、第１および第２実施形態と同様に３バンドのカメラ３０を使用して４種類以上の蛍光色素を定量する。上述のように、マルチバンドカメラ３０は、Ｌｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードという二つの感度モードを有する。Ｌｏｗ Ｌｉｇｈｔモードは各検出波長帯に標準の感度特性を設定し、Ｈｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードは各検出波長帯にＬｏｗ Ｌｉｇｈｔモードよりも全感度がわずかに高い感度特性を設定する。Ｌｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードの双方において、隣り合う検出波長帯は部分的に重なっている。このマルチバンドカメラ３０は、すべての検出波長帯において異なるゲインを有する二つのアナログ回路を有している。Ｈｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードでは全検出波長帯においてゲインの低い回路が使用され、Ｌｏｗ Ｌｉｇｈｔモードでは全検出波長帯においてゲインの高い回路が使用される。

マルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードでのＲ、ＧおよびＢ値をＲ_{ｔｇｔ−１}、Ｇ_{ｔｇｔ−１}およびＢ_{ｔｇｔ−１}とし、Ｈｉｇｈ ＬｉｇｈｔモードでのＲ、ＧおよびＢ値をＲ_{ｔｇｔ−ｈ}、Ｇ_{ｔｇｔ−ｈ}およびＢ_{ｔｇｔ−ｈ}とすると、次の式が成り立つ。

ここで、ｒ_１、ｇ_１およびｂ_１は、マルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードにおけるＲ、ＧおよびＢ波長帯の感度特性であり、ｒ_ｈ、ｇ_ｈおよびｂ_ｈは、マルチバンドカメラ３０のＨｉｇｈ ＬｉｇｈｔモードにおけるＲ、ＧおよびＢ波長帯の感度特性である。

（１１）式の右辺第１項の６×６行列が本実施形態における基礎データＪ_１である。すなわち、以下の式が成り立つ。

行列Ｊ_１の第１列における六つの成分は、第１蛍光色素の単位濃度下における蛍光強度をマルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードにて測定することにより得られるマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ値である。同様に、行列Ｊ_１の第２〜第５列における六つの成分は、第２〜第６蛍光色素の単位濃度下における蛍光強度をマルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードにて測定することにより得られるマルチバンドカメラ３０のＲ、ＧおよびＢ値である。したがって、行列Ｊ_１のすべての成分は、第１および第２基準試料から発する蛍光をマルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードの双方で検出することにより求めることができる。

（１１）式は、次のように書き直すことができる。

したがって、基準試料からの蛍光を測定することにより基礎データＪ_１を取得し、その後、ターゲット試料からの蛍光をマルチバンドカメラ３０のＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードおよびＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードの双方で検出し、得られるＲ、ＧおよびＢ値を（１３）式に代入することにより、６種類までの蛍光色素の濃度を算出することができる。

この実施形態では３バンドのカメラを使用して６種類までの蛍光色素を定量するが、４バンドのカメラを使用すれば、同様の手法により８種類までの蛍光色素を定量できる。より一般的に述べると、マルチバンドカメラの検出波長帯の数にマルチバンドカメラの感度特性の数を乗じた数までの蛍光色素を定量することが可能である。

上記（１３）および（１２）式をより一般的な形に書き直すと、次のようになる。

ここで、ターゲット試料には、第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）の蛍光色素が含まれており、マルチバンドカメラは、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上の整数）の検出波長帯と、第１〜第ｋ検出波長帯に対して異なる感度特性を設定する第１〜第ｑ（ｑは２以上の整数）の感度モードとを有しているものとする。成分行列Ｐ_１〜Ｐ_ｋはｋ×１の行列である。行列Ｐ_ｖの第ｉ行成分Ｐ_ｉｖ（ｖは１以上ｑ以下の整数、ｉは１以上ｋ以下の整数）は、マルチバンドカメラを用いて第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードで撮像されたターゲット試料の蛍光画像における一つの画素の値である。Ｊ_１は（ｋ・ｑ）×ｍの行列であり、Ｊ_１の成分行列Ｌ_ｖｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｌ_ｉｖｊは、マルチバンドカメラの第ｉ検出波長帯および第ｖ感度モードで撮像された第ｊ基準試料の蛍光画像においてＰ_ｉｖと同じ画素の値である。

第４実施形態
本実施形態は、第３実施形態と同様に、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が４種類以上のときの定量に関する。第３実施形態では、マルチバンドカメラの感度モードを２種類用意し、それにより検出波長帯の数×２までの蛍光色素の定量を可能にする。これに対し、本実施形態では、異なる波長スペクトルを有する複数の種類の励起光を用いて試料を励起し、それにより検出波長帯の数×励起光の種類数までの蛍光色素の定量を可能にする。

より具体的に述べると、本実施形態では、試料を励起するための光源として、多色発光型ＬＥＤ１０ｂを使用する。このＬＥＤ１０ｂは、異なる主波長を有する複数の種類の出力光を放出することができる。いずれの種類の出力光も、ターゲット試料に含まれるすべての蛍光色素を励起可能な波長スペクトルを有している。基礎データは、各出力光を基準試料に照射して蛍光色素を励起することにより発生する蛍光に基づいて取得される。基礎データは、第１実施形態のようにマルチバンドカメラを用いて蛍光画像を撮像することにより取得してもよいし、第２実施形態のように分光器の分光データを用いて算出してもよい。

同様に、ターゲットデータも、ＬＥＤ１０ｂの各出力光をターゲット試料に照射して蛍光色素を励起し、カメラ３０を用いて蛍光画像を撮像することにより取得される。励起光の波長特性が異なれば、蛍光色素から発する蛍光の波長特性も異なる。したがって、ＬＥＤ１０ｂの出力光の主波長を切り替えながら基礎データおよびターゲットデータを取得することにより、マルチバンドカメラ３０の検出波長帯の数に励起光の種類数を乗じた数までの蛍光色素の定量が可能になる。例えば、励起光の波長特性が２種類あれば６種類までの蛍光色素を定量することができ、波長特性が３種類あれば９種類までの蛍光色素を定量することができる。

一般的には、コンピュータ４０は、次の式で示される演算を実行して各蛍光色素の濃度を算出する。

ここで、ターゲット試料には、第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）の蛍光色素が含まれており、マルチバンドカメラは、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上の整数）の検出波長帯を有しているものとする。成分行列Ｑ_１〜Ｑ_ｋはｋ×１の行列である。行列Ｑ_ｕ（ｕは１以上ｒ以下の整数）の第ｉ行成分Ｑ_ｉｕ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、第ｕ励起光の照射に応じて第ｉ検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像における一つの画素の値である。Ｊ_２は（ｋ・ｒ）×ｍの行列であり、Ｊ_２の成分行列Ｔ_ｕｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｔ_ｉｕｊは、第ｕ励起光の照射に応じてマルチバンドカメラの第ｉ検出波長帯で撮像された第ｊ基準試料の蛍光画像においてＱ_ｉｕと同じ画素の値である。

なお、本実施形態では多色発光型ＬＥＤ１０ｂを光源として使用するが、この代わりに、異なる波長スペクトルの光を発する複数の光源（ＬＥＤなど）を使用してもよい。また、ＬＥＤ１０ｂの代わりに、出力波長が可変の光源を使用してもよい。例えば、Ｘｅランプの出力光からモノクロメータを用いて特定の波長成分を抽出し放射する光源１０ｃや、Ｘｅランプの出力光から波長フィルタを用いて特定の波長成分を抽出し放射する光源１０ｄを使用することができる。

第５実施形態
本実施形態は、基礎データおよびターゲットデータの取得に使用する光学装置が上記実施形態と異なる。上記実施形態では、マルチバンドカメラまたは分光器を用いて基礎データを取得するが、本実施形態では、複数のバンドパスフィルタとモノクロカメラを用いて基礎データを取得する。また、上記実施形態ではマルチバンドカメラを用いてターゲットデータを取得するが、本実施形態では、複数のバンドパスフィルタとモノクロカメラを用いてターゲットデータを取得する。

図７は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。この定量システム３００は、上記の定量システム１００におけるマルチバンドカメラ３０をモノクロカメラ３２で置き換えた構成を有している。また、本実施形態では、バンドパスフィルタ２４として、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素に対応した複数のバンドパスフィルタが使用される。これらのバンドパスフィルタは、互いに異なる透過波長帯を有している。これらの透過波長帯は完全に分離しており、重なりを有さない。バンドパスフィルタ２４としては、例えば干渉フィルタを使用することができる。

本実施形態では、バンドパスフィルタ２４を用いてターゲット試料の蛍光から各蛍光色素の蛍光成分を抽出し、それをモノクロカメラ３２で検出する。これにより、各蛍光色素の蛍光画像が個別に撮像される。モノクロカメラ３２を用いて測定された蛍光強度は上記実施形態と同様の定量計算に使用され、それにより各蛍光色素の濃度が算出される。また、本実施形態では、基礎データを取得する際にも各基準試料からの蛍光を各バンドパスフィルタ２４を介してモノクロカメラ３２で検出する。

以下では、定量計算の理解を容易にするため、ターゲット試料中に第１および第２の蛍光色素が含まれているとし、ターゲット試料の一部位における蛍光色素の濃度の定量を説明する。この場合、上記実施形態と同様に、第１および第２蛍光色素の各々を単独で含む第１および第２の基準試料が用意される。コンピュータ４０は、以下の式で示される演算を行ってターゲット試料の一部位における蛍光色素の濃度を求める。

ここで、Ｏ_１は第１蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像されたターゲット試料の蛍光画像中のある一画素の値であり、Ｏ_２は第２蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像されたターゲット試料の蛍光画像中の同じ画素の値である。Ｊ_１１は第１蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像された第１基準試料の蛍光画像においてＯ_１およびＯ_２と同じ画素の値である。Ｊ_１２は第２蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像された第１基準試料の蛍光画像においてＯ_１およびＯ_２と同じ画素の値である。Ｊ_２１は第１蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像された第２基準試料の蛍光画像においてＯ_１およびＯ_２と同じ画素の値である。Ｊ_２２は第２蛍光色素用のフィルタ２４を通して撮像された第２基準試料の蛍光画像においてＯ_１およびＯ_２と同じ画素の値である。

上記（２２）式および（２３）式を一般化すると、次のようになる。

ここで、ターゲット試料には第１〜第ｍ（ｍは２以上の整数）の蛍光色素が含まれており、これに応じて第１〜第ｍのバンドパスフィルタが用意されるものとする。Ｏ_ｊは（ｊは１以上ｍ以下の整数）は、第ｊ蛍光色素用のフィルタを通して撮像されるターゲット試料中の蛍光画像中のある一画素の値である。行列Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｍ以下の整数）は、第ｊ蛍光色素用のフィルタを通して撮像されたる第ｉ基準試料の蛍光画像においてＯ_ｊと同じ画素の値である。

本実施形態の方法は、ターゲット試料からの蛍光をバンドパスフィルタを通して検出する。このため、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルが大きく重なり合っている場合は、本実施形態の方法の定量精度は上記実施形態に比べると劣る。しかし、この方法は、バンドパスフィルタを通して検出した蛍光強度を直接蛍光色素の濃度として扱う従来技術に比べると、より高い定量精度を有している。これは、上記の計算式が蛍光スペクトルの重なりの有無に影響されないためである。従来技術よりも優れた定量精度は、本発明者による実験によっても確かめられている。

第６実施形態
本実施形態は、本発明を細胞の生理的活性の測定に応用する。すなわち、本実施形態ではターゲット試料が細胞である。細胞の生理的活性を測定するために、細胞がもつ受容体や酵素などの機能性分子を蛍光色素で標識し、蛍光色素の濃度を定量することにより、機能性分子の量や分布を測定することができる。同一の細胞内に存在する複数の種類の分子を同時に測定する場合は、それらの分子を励起波長および蛍光波長の異なる複数の蛍光色素で標識し、蛍光色にしたがって分子を識別する。

この場合、各蛍光色素からの蛍光をバンドパスフィルタを用いて抽出および検出し、蛍光強度を求めることが考えられる。しかし、これらの色素の蛍光スペクトルが大きく重なる場合は、複数の色素からの蛍光をフィルタで分離しきれないために分子の識別が困難である。

これに対し、本実施形態は、図１に示す定量システムを用い、図２に示す手順にしたがって細胞中の蛍光色素の濃度を定量する。本実施形態の定量システム１００は、事前に取得した基礎データとマルチバンドカメラ３０によって取得されたＲ、ＧおよびＢ値を用いて計算により蛍光色素の濃度を求める。基礎データは、上記実施形態に関して述べたいずれの方法で取得してもよい。複数の色素からの蛍光を分離して検出する必要がないので、分子の識別が容易である。したがって、本実施形態の定量システム１００は、細胞の生理活性の測定に有用である。

以下では、ターゲット試料が細胞のときに考慮すべき事項を説明する。

第１に、細胞の厚さを補正することが好ましい場合がある。本発明の方法で蛍光色素の濃度を定量するためには、基準試料およびターゲット試料からの蛍光を測定するときの試料中の光路長が等しいことが好ましい。光路長が変わると同じ濃度の試料でも蛍光強度が変わるためである。ターゲット試料が細胞のとき、蛍光色素を含んだ細胞の厚さ、すなわち光路長はせいぜい１０μｍほどである。基準試料が蛍光色素の溶液である場合、このようなオーダーの厚さの溶液試料を精度よく作成することは困難である。また仮にできたとしても、一つの細胞内にはその形状に応じて厚みの分布があり、これは個々の細胞で異なる。これに対し、溶液試料では全視野にわたって一定の光路長となる。したがって、特定の細胞を測定する場合、溶液試料を基準試料として使用できないことがある。

使用される顕微鏡が共焦点の光学系をもっていれば、その顕微鏡は一定の光路長の蛍光像を取得するため、溶液試料を基準試料として使用できる。共焦点の光学系をもたない顕微鏡の場合、細胞の厚みの補正法としては次のようなものが考えられる。例えば、細胞内に含まれるＦ１およびＦ２という蛍光色素の濃度分布を測定する場合、これらの色素に加えて細胞全体を均一に染色する蛍光色素Ｆ３を細胞に与える（Ｃａｌｃｅｉｎ，ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒなど）。これらの三つの色素で染色した細胞をターゲット試料とし、これら三つの色素を単独に含む色素溶液を基準試料として測定して本発明の方法で計算を行うと、細胞の厚みの成分を含んだ各色素の濃度分布が求まる。このうち色素Ｆ３は細胞全体にわたって均一の濃度で分布しているため、求められた濃度分布は細胞の厚みの分布と比例する。色素Ｆ３の各画素での濃度を各画素の細胞の厚みの係数として用い、算出されたＦ１およびＦ２の各画素の濃度をこの値で除算することにより、細胞の厚みの違いを補正した濃度分布を得ることができる。

この場合、基準試料とした溶液試料の光路長を正確に知ることが困難なため、蛍光色素の濃度の絶対値を得ることはできない。しかし、細胞内の色素の濃度の分布を正確に把握するうえで、この補正は有用である。

第２に、基準試料が細胞であるとき、シェーディング補正を行うことが好ましい場合がある。蛍光色素によっては、色素単独では蛍光が微弱で、細胞内の特定の分子と結合したときにのみ強い蛍光を発するものがある。例えばＤＡＰＩなど、核酸を染色するための色素にはそのようなものが多い。また、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質に関しては、遺伝子を細胞に導入することで細胞内で蛍光色素を作ることはできるが、細胞外での色素試料の作製は困難である。そのような色素に関しては、溶液試料を基準試料として使うことができない。このような蛍光色素を定量する場合、その蛍光色素を用いて染色した細胞において蛍光を発している領域から基礎データを取得する。細胞の画像を取得し、その中から選択した領域内の蛍光強度の平均値を基準濃度に対する蛍光強度として使用する。この値を全画素についての基準濃度に対する蛍光強度として割り当てる。

通常、蛍光顕微鏡における励起光の照明は視野全体にわたって均一ではない。このため、溶液試料のように均一に色素が分布する試料からの蛍光を蛍光顕微鏡で観察すると、励起光の強さに応じて画像内に蛍光が強い部分と弱い部分が生じてしまう。この現象はシェーディングと呼ばれる。各画素の基準濃度の値はこのシェーディングの情報を含んだものでなくてはならない。基準試料として溶液試料を使用した場合は、このシェーディングの情報を含んだデータを得ることができる。しかし、細胞試料を使い、その一部の領域から基準データを取得する場合は、シェーディングの情報を得ることができない。

このような場合、シェーディングのデータを得るために、定量で使用するものと同じ光学系（フィルタ、ダイクロイックミラー、レンズなど）を使用して蛍光を検出可能な蛍光色素の溶液から蛍光画像を取得する。これをシェーディング画像として使用し、画素ごとに演算を行うことで、基準試料の画像（全画素に同じ蛍光強度が与えられた画像）にシェーディングの情報を与えることができる。そのための演算方法としては、次のようなものが考えられる。

Ｉ_ＲＣ＝Ｉ_Ｓ×Ｉ_Ｒ／Ｉ_{Ｓ−ＭＡＸ}
Ｉ_ＲＣ：シェーディング情報が与えられた基準試料画像の輝度
Ｉ_Ｒ：元の基準試料画像の輝度
Ｉ_Ｓ：シェーディング画像の輝度
Ｉ_{Ｓ−ＭＡＸ}：シェーディング画像の輝度の最大値

あるいは、ターゲット試料の画像のシェーディングを補正し、基準試料の画像として全画素に同じ蛍光強度が与えられた画像をそのまま使用する方法も考えられる。この場合、ターゲット試料の画像のシェーディングを補正するための演算方法として、次のようなものが考えられる。

Ｉ_ＴＣ＝Ｉ_Ｔ×Ｉ_{Ｓ−ＭＡＸ}／Ｉ_Ｓ
Ｉ_ＴＣ：シェーディングが補正されたターゲット試料画像の輝度
Ｉ_Ｔ：元のターゲット試料画像の輝度
Ｉ_Ｓ：シェーディング画像の輝度
Ｉ_{Ｓ−ＭＡＸ}：シェーディング画像の輝度の最大値

上記の演算で得られた基準試料画像またはターゲット試料画像を用いて上記（１）式に示される計算を行うことにより、シェーディングの影響が補正された蛍光色素の濃度分布画像を得ることができる。この場合、基準試料とした溶液試料の光路長を正確に知ることが困難なため、蛍光色素の濃度の絶対値を得ることはできない。しかし、細胞内の色素の濃度の分布を正確に把握するうえで、この補正は有用である。

第７実施形態
本実施形態は、本発明をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）の測定に応用する。ＦＲＥＴは、ある蛍光分子に対して与えられた励起エネルギーが別の蛍光分子に移動する現象である。励起エネルギーを与える蛍光分子はドナーと呼ばれ、励起エネルギーを受け取る蛍光分子はアクセプタと呼ばれる。ドナーおよびアクセプタは、分子に蛍光色素を与えることにより生成される。

ＦＲＥＴが発生すると、ドナーの蛍光強度が低下し、アクセプタの蛍光強度が増加する。そのため、ＦＲＥＴの測定は次のように行われることが多い。ドナーを励起する波長の光をターゲット試料に照射し、ターゲット試料から発する蛍光を検出する。このとき、試料からの蛍光をバンドパスフィルタを用いてドナーの蛍光の波長域およびアクセプタの蛍光の波長域に分光する。これにより、アクセプタおよびドナーの蛍光強度を別個に測定し、アクセプタ／ドナーの蛍光強度の比を算出する。この蛍光強度比を用いてＦＲＥＴを解析することができる。

しかし、ＦＲＥＴという現象の性質上、ドナーとアクセプタの蛍光スペクトルは大きくは離れておらず、その一部が重なり合うことが多い。そのため、バンドパスフィルタでは互いに蛍光を完全に分離できず、ＦＲＥＴ測定の精度が低下してしまう。

本発明は、このようなＦＲＥＴ測定の問題点を解決することができる。本実施形態は、図１に示す定量システムを用い、図２に示す手順にしたがってＦＲＥＴを測定する。まず、ドナー用の蛍光色素を所定の単位濃度で単独で含むドナー基準試料およびアクセプタ用の蛍光色素を所定の単位濃度で単独で含むアクセプタ基準試料を用意する（ステップＳ２０２）。これらの基準試料を励起し、各蛍光色素からの蛍光の強度をＲ、ＧおよびＢ波長帯の各々で測定し、得られた測定強度を基礎データとして保存する（ステップＳ２０４）。蛍光強度の測定には、マルチバンドカメラ３０を使用してもよいし、分光器３５を使用してもよい。この後、ターゲット試料中のドナーを励起し、ターゲット試料から発するドナー蛍光およびアクセプタ蛍光をマルチバンドカメラ３０を用いて検出する（ステップＳ２０６）。このステップＳ２０６は、ターゲット試料が生きている細胞の場合など、ターゲット試料の活動状態に応じてターゲット試料内のＦＲＥＴ量が時々刻々と変化するような場合には、その変化を測定するために連続的に複数回行ってもよい。この後、上記の（１）式にしたがってドナー用蛍光色素およびアクセプタ用蛍光色素の濃度を算出し（ステップＳ２０８）、これらの色素の濃度分布を示す画像をディスプレイ装置４２上に表示する（ステップＳ２１０およびＳ２１２）。

本実施形態ではＣａ^２＋を含むＣａｍｅｌｅｏｎ溶液（１４μｇ／ｍｌ）をターゲット試料として使用する。Ｃａｍｅｌｅｏｎは、その分子内にドナーとしての蛍光色素ＣＦＰとアクセプタとしての蛍光色素ＹＦＰを含んでいる。またＣａｍｅｌｅｏｎは、これらの蛍光色素の間にＣａ^２＋針と結合する部位も含んでいる。ＣａｍｅｌｅｏｎにＣａ^２＋が結合すると、分子の構造が変化し、それに応じてＣＦＰからＹＦＰへのＦＲＥＴが顕著となる。その結果、ＣＦＰの蛍光が低下し、ＹＦＰの蛍光が増加する。Ｃａ^２＋濃度が高まると、それに応じてＹＦＰ／ＣＦＰの蛍光強度比も高まる。

本実施形態では、ターゲット試料中のＣａ^２＋の濃度を段階的に変えながらＣＦＰおよびＹＦＰの濃度を定量し、その濃度に単位濃度当たりの蛍光強度を乗算してＣＦＰおよびＹＦＰの蛍光強度を算出する。そして、これらの蛍光強度を用いてＹＦＰ／ＣＦＰの蛍光強度比を算出する。

図８は、ターゲット試料中のＣａ^２＋の濃度と本実施形態で算出された蛍光強度比との関係を示している。本実施形態との比較のため、図８には、従来の方法で求められた蛍光強度比も示されている。この方法では、ターゲット試料からの蛍光をマルチバンドカメラ３０で検出し、マルチバンドカメラ３０のＧ値をＹＦＰの蛍光強度、Ｂ値をＣＦＰの蛍光強度とみなしてＧ／Ｂの比を計算する。図８において、菱形は従来の方法により求められた蛍光強度比を示し、四角はマルチバンドカメラ３０を用いて取得した基礎データに基づく蛍光強度比を示し、三角は分光器３５を用いて取得した基礎データに基づく蛍光強度比を示している。

図８に示されるように、本実施形態の方法で取得した蛍光強度比は、Ｃａ^２＋の濃度変化に応じて、従来法で取得した蛍光強度比よりも大きく変化する。このことはＣａ^２＋濃度の微妙な変化を検出するときに有利である。従来法においてＹＦＰの蛍光を測定するカメラ３０のＧ波長帯では、ＣＦＰの蛍光も検出される。したがって、Ｇ波長帯では、ＦＲＥＴによりＹＦＰの蛍光強度が増加する一方でＣＦＰの蛍光が減少する。これによりカメラ３０のＧ値の増加が抑えられ、それに応じて蛍光強度比の変化が抑えられていると考えられる。これに対し、本実施形態の方法では、蛍光の混在に影響されない計算式を用いて蛍光強度を算出するので、Ｃａ^２＋の濃度変化に応じて蛍光強度比が感度よく変化する。

本実施形態では、図５に示される表現方法を用いて定量結果が表示される。この方法では、蛍光色素の濃度情報が偽カラーを用いて表示される。具体的には、第１および第２の蛍光色素の濃度分布が画像８１および８２として表示される。これらの画像８１および８２では、蛍光色素の濃度が輝度によって表される。ＦＲＥＴ解析では一般的にこれら二つの蛍光色素の強度比、すなわち濃度比によってＦＲＥＴの量が評価されるため、画像８３では、算出された蛍光強度比の分布が偽カラーを用いて示されている。さらに、蛍光強度比を図８のグラフのようにＣａ^２＋濃度と関連づけることで、蛍光強度比の値をＣａ^２＋濃度の値に変換することもできる。画像８４ではＣａ^２＋濃度の分布が偽カラーを用いて示されている。これらの画像８１〜８４内には、カラーバー８５も表示される。

以下では、本実施形態の利点を従来技術との対比により説明する。本実施形態と同様に主に演算によって蛍光強度比を求める方法としては、Ｇｅｒａｌｄ Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎらによる論文「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、第７４巻、２７０２〜２７１３頁、１９９８年５月）に開示されるものが知られている。この方法は、本実施形態と同様に３種類の試料を用意する。また、この方法では、３種類のバンドパスフィルタ、すなわちドナーを励起してドナーの蛍光を測定するためのフィルタ、アクセプタを励起してアクセプタの蛍光を測定するためのフィルタ、およびドナーを励起してアクセプタの蛍光を測定するためのフィルタが使用される。この方法は、これらの試料とフィルタを組み合わせで９個の測定値を取得し、数学的な演算によってＦＲＥＴの値を求める。

しかし、本実施形態の方法は、Ｇｏｒｄｏｎらの方法よりもいっそう簡便である。なぜなら、Ｇｏｒｄｏｎらの方法では蛍光を９回測定するのに対し、本実施形態の方法では蛍光測定の回数が３回で済むからである。このように、本発明の定量方法をＦＲＥＴに応用すると、アクセプタ／ドナーの蛍光強度比を簡易かつ迅速に取得することができる。

第１実施例
以下では、幾つかの実施例を挙げて本発明を更に説明する。本発明者は、図１に示される定量システム１００を使用し、第１実施形態の方法にしたがって蛍光色素の定量を行った。マルチバンドカメラ３０としては、浜松ホトニクス社製３板式カラーカメラＯＲＣＡ−３ＣＣＤ Ｃ７７８０を使用した。図９は、カメラ３０の分光感度特性を示している。すでに述べたように、カメラ３０はＬａｗ ＬｉｇｈｔモードとＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードという２種類の感度モードを有している。図９における実線がＬａｗ Ｌｉｇｈｔモードにおける感度特性を示し、波線がＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードにおける感度特性を示している。本実施例では、Ｌｏｗ ＬｉｇｈｔモードでのＲ、ＧおよびＢ値を定量計算に使用した。

使用した蛍光色素は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ｆｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの３種類である。本発明者は、これらのうち二つを適当な濃度で混合した３種類の溶液をターゲット試料として調製した。これら３種類の色素溶液は、すべて吸収波長が同一波長帯（３５０〜４４０ｎｍ）にある。この波長帯の光をこれらの色素溶液に照射して色素を励起すると、これらの溶液は互いに異なるスペクトルを有する蛍光を発する。バンドパスフィルタ２２はこの波長帯に等しい透過波長帯を有しており、Ｘｅランプ１０ａの白色光からこの波長帯の成分を抽出して励起光を生成する。

以下では、具体的な定量手順を説明する。まず、基準試料を調製した。カメラ３０の感度に応じて適正な蛍光強度が得られるように各蛍光色素の単位濃度を決め、その単位濃度で各蛍光色素を単独で含む溶液を調製した。こうして得られる３種類の溶液が基準試料である。

次に、これらの基準試料を用いて基礎データを取得した。具体的には、各基準試料を励起し、各基準試料から発する蛍光画像をカメラ３０を用いて撮像した。この撮像は、露光３０ｍｓｅｃおよびＧａｉｎ＝Ｌｏｗの条件下で行った。カメラ３０のＲ、ＧおよびＢ波長帯で取得された画像データはコンピュータ４０の記憶装置内に保存された。これらの画像データの画素値が、定量計算で使用される基礎データである。

次いで、２種類の基準試料を適当な割合で混合したターゲット試料を作成し、このターゲット試料に励起光を照射する。ターゲット試料の蛍光画像をカメラ３０を用いて撮像し、画像データを取得する。この画像データの画素値がターゲットデータである。コンピュータ４０は、基礎データとターゲットデータを使用し、上記（１）式に示される演算を画素ごとに実行して、ターゲット試料中における二つの蛍光色素の濃度分布を算出した。

第２実施例
本発明者は、カメラ３０の代わりに分光器３５を用いて基礎データおよびターゲットデータを取得することも行った。分光器３５としては、浜松ホトニクス社製ＰＭＡ−１１（ｃ７４７３、ＢＴＣＣＤ ２００−９５０ｎｍ）を用いた。分光器３５を用いた基準試料からの蛍光の測定は、光源モードでｓ／ｎ＝１８、Ｇａｉｎ＝Ｍｉｄｄｌｅ、波長間隔＝１ｎｍの条件下で行った。コンピュータ４０は、分光器３５によって取得された分光データに５ｐｏｉｎｔ（５ｎｍ）のｓｍｏｏｔｈｉｎｇ処理を施した。

参考のため、ターゲット試料から取得した分光データを図１０および図１１に示す。図１０は、蛍光色素Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを様々な比率で混合したターゲット試料から取得した分光データを示している。これらの色素から発する蛍光のピーク波長の間隔は比較的広く、約１１０ｎｍである。図１１は、蛍光色素Ｆｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを様々な比率で混合したターゲット試料から取得した分光データを示している。これらの色素から発する蛍光のピーク波長の間隔は比較的狭く、約３０ｎｍである。上述のように、これらの分光データにはｓｍｏｏｔｈｉｎｇ処理が施されている。

コンピュータ４０は、基準試料およびターゲット試料から取得した分光データを用いて上記（９）、（１０）および（１）式に示される演算を実行し、色素の濃度を算出した。基準試料から取得したすべての分光波長帯の分光データに図９に示される感度特性を乗算してから加算し、さらに（１０）式に示される補正用の係数ａを乗算することにより、基礎データＪが算出された。同様に、ターゲット試料から取得したすべての分光波長帯の分光データに図９に示される感度特性を乗算してから加算し、さらに補正用の係数ａを乗算することにより、ターゲットデータＲ_ｔｇｔ、Ｇ_ｔｇｔおよびＢ_ｔｇｔが算出された。この演算には、ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ処理された３００〜７８０ｎｍにおける５ｎｍ刻みの分光データが使用された。分光器３５は試料中の一部位のみを測定できる。コンピュータ４０によって算出された数値は、その測定部位における色素濃度を示している。

第３実施例
本発明者は、第５実施形態の方法にしたがって蛍光色素の濃度を定量することも行った。この実施例では、基準試料およびターゲット試料から発する蛍光の強度をバンドパスフィルタを通して測定した。３種類の蛍光色素の蛍光スペクトルに応じて三つのバンドパスフィルタを使用した。第１のバンドパスフィルタは、中心波長４４０ｎｍとバンド幅２１ｎｍを有している。第２のバンドパスフィルタは、中心波長５１０ｎｍとバンド幅２３ｎｍを有している。第３のバンドパスフィルタは、中心波長５４６ｎｍとバンド幅１０ｎｍを有している。

バンドパスフィルタを透過した蛍光はモノクロカメラを用いて検出した。モノクロカメラとしては、浜松ホトニクス社製モノクロデジタルカメラＯＲＣＡ−ＩＩを使用した。蛍光画像の撮影は、露光３０ｍｓｅｃ、Ｇａｉｎ＝Ｌｏｗ、ビニング４＊４の条件下で行った。

コンピュータ４０は、モノクロカメラによって撮像された蛍光画像の画素値を用いて上記（２２）および（２３）式に示される演算を行った。これにより、ターゲット試料中の二つの蛍光色素の濃度が算出された。

また、参考までに、第２実施例で使用したものと同じ分光器を使用して蛍光強度を測定した。具体的には、分光器を用いて１ｎｍ刻みの蛍光強度を測定し、すべての分光波長帯における蛍光強度を積算することにより蛍光強度を算出した。

図１２は、蛍光色素Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを様々な比率で混合したターゲット試料からバンドパスフィルタを通して測定した分光データを示している。また、図１３は、蛍光色素Ｆｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを様々な比率で混合したターゲット試料からバンドパスフィルタを通して測定した分光データを示している。

比較例
本発明者は、上記実施例との比較のため、ターゲット試料から発する蛍光からバンドパスフィルタを用いて各色素の蛍光を抽出し、その蛍光をモノクロカメラで撮影した。使用したバンドパスフィルタは、第３実施例と同じである。モノクロカメラとしては、浜松ホトニクス社製モノクロデジタルカメラＯＲＣＡ−ＩＩを使用した。蛍光画像の撮像は、露光３０ｍｓｅｃ、Ｇａｉｎ＝Ｌｏｗ、ビニング４＊４の条件下で行った。

この例では、次の式（従来式）にしたがってターゲット試料中の二つの蛍光色素の濃度ｃ_１およびｃ_２を算出した。

ここで、Ｓａｍｐｌｅ Ｓ１およびＳａｍｐｌｅ Ｓ２は、ターゲット試料の蛍光からバンドパスフィルタを用いて抽出された蛍光の強度であり、Ｋｉｊｙｕｎ Ｓ１およびＫｉｊｙｕｎ Ｓ２は、基準試料から発する蛍光の強度である。これらの式から明らかなように、本例では、バンドパスフィルタを通して測定された蛍光の強度を各蛍光色素の濃度として扱っている。

濃度計算結果
まず、図１４および図１５を参照しながら、蛍光スペクトルの重なりが少ないＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの定量結果を説明する。図１４は、第１および第２実施例で算出されたＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。図１５は、第３実施例および比較例で算出されたＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。これらの図において、横軸は色素の混合比を示し、縦軸は色素の濃度を示している。濃度は各色素の単位濃度を１として表示されている。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの単位濃度は２μＭ（マイクロモル）であり、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの単位濃度は１μＭである。

図１４において菱形は第１実施例で算出されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの濃度を示し、四角は第２実施例で算出されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの濃度を示し、三角は第１実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示し、×は第２実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。図１５において菱形は第３実施例で算出されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの濃度を示し、四角は比較例で算出されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの濃度を示し、三角は第３実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示し、×は比較例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。また、これらの図において、一点鎖線はターゲット試料におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒの実際の濃度を示し、波線はターゲット試料におけるＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの実際の濃度を示している。

図１４と図１５を比較すると分かるように、中心波長の間隔が比較的広いＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの定量精度は、実施例と比較例とでほとんど変わらない。これは、これらの色素間で蛍光スペクトルの重なりが小さいためである。

次に、図１６および図１７を参照しながら、蛍光スペクトルの重なりが大きいＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの定量結果を説明する。図１６は、第１および第２実施例で算出されたＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。図１７は、第３実施例および比較例で算出されたＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。これらの図において、横軸は色素の混合比を示し、縦軸は色素の濃度を示している。濃度は各色素の単位濃度を１として表示されている。Ｆｕｒａ２の単位濃度は４μＭであり、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの単位濃度は０．８μＭである。

図１６において菱形は第１実施例で算出されたＦｕｒａ２の濃度を示し、四角は第２実施例で算出されたＦｕｒａ２の濃度を示し、三角は第１実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示し、×は第２実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。図１７において菱形は第３実施例で算出されたＦｕｒａ２の濃度を示し、四角は比較例で算出されたＦｕｒａ２の濃度を示し、三角は第３実施例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示し、×は比較例で算出されたＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの濃度を示している。また、これらの図において、一点鎖線はターゲット試料におけるＦｕｒａ２の実際の濃度を示し、波線はターゲット試料におけるＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの実際の濃度を示している。

図１６と図１７を比較すると分かるように、中心波長の間隔が比較的狭い蛍光を発するＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの定量精度は、実施例と比較例とで大きく異なっている。これは、これらの色素間で蛍光スペクトルの重なりが大きいためである。比較例の方法では、一方の色素の蛍光が他方の色素の蛍光に混在したまま検出されるので、定量の精度が大きく低下する。これに対し、実施例の方法では、蛍光スペクトルの重なりに影響されることなく、高い精度で色素濃度を定量することができる。

第３実施例では、比較例と同じように、バンドパスフィルタを通して試料からの蛍光を検出する。この場合でも比較例より優れた定量精度を得られることが図１７から分かる。これは、第３実施例で使用する計算式（２２）および（２３）式と比較例で使用する（２６．１）および（２６．２）式との違いに起因する。ただし、図１６と図１７の比較から分かるように、バンドパスフィルタを介さずに蛍光を検出する第１および第２実施例では、第３実施例よりもさらに優れた定量精度を得ることができる。この原因は、第１および第２の実施例では隣接する検出波長帯が重なっており、かつ評価を行う全波長帯をカバーしているのに対し、第３実施例では隣接する検出波長帯が重なっておらず、またスポット的に一部位の波長帯域のみのデータを扱っているため、ターゲットサンプルの評価波長帯全域をカバーしておらず、データ欠如があることによるものと考えることができる。

また、図１４および図１６から明らかなように、蛍光強度をカメラで測定しても、蛍光強度を分光器で測定し分光データを用いて計算を行った場合と遜色のない定量精度を得ることができる。これから明らかなように、第１実施例における手法、すなわちマルチバンドカメラを用いた測定は、測定しようとする、ある任意幅の波長域での分光データに、カメラの感度関数と同等の特性を掛け合わせて蛍光強度を求める。したがって、カメラを用いた測定は、基本的には分光器を用いた測定のように全波長域にわたってデータを採取したときと同等の情報を取得している。そのため、カメラを用いても分光と同等の精度の定量を行うことができる。

また、この実験結果では、カメラによる測定結果と分光器による測定結果に差が生じている。しかし、本発明者らは、この差の最大の原因が光による色素のダメージに応じた蛍光強度の減少にあることを解明した。すなわち、分光測定では測定時間が長すぎ、色素の光量低下が大きすぎた。その後は、分光測定の時間を短くすることで、カメラによる測定結果と分光器による測定結果とがほぼ合致した。

以下では、図１８〜図２０を参照しながら、第１および第２実施例による定量の精度を確認する。図１８は、Ｆｕｒａ２を含む基準試料、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを含む基準試料、ならびにＦｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗを含むターゲット試料の蛍光スペクトルを示している。Ｆｕｒａ２の単位濃度は４μＭであり、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗの単位濃度は０．８μＭである。ターゲット試料では、Ｆｕｒａ２およびＣａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗが０．６：１．４の比率で混合されている。実際に分光器を用いてターゲット試料を測定した結果を図１８中のターゲットスペクトルとして示す。

第１実施例のカメラ方式での定量計算結果は、Ｆｒａ２：ＣａＹ＝０．５７１：１．４００５であり、第２実施例の分光器方式での定量計算結果は、Ｆｒａ２：ＣａＹ＝０．５２８：１．４３４であった。この算出された濃度を対応する基準試料の蛍光スペクトル（以下では、「基準スペクトル」と呼ぶ）にそれぞれ掛け合わせて両者の和をとれば、分光強度をシミュレートできる。図１９および図２０は、このようにして計算されたシミュレーションスペクトルを示している。

分光器方式では、基準スペクトルおよびターゲットスペクトルが実際に測定される。このため、基準スペクトルを用いてシミュレーション計算を行い、得られた蛍光スペクトルとターゲットスペクトルとを比較することにより、計算そのものの精度が確認できる。一方、カメラ系を厳密に考えると、カメラ方式で得られる基準スペクトルおよびターゲットスペクトルは分光器方式で得られるそれらとは微妙に違う。このため、カメラ方式でのシミュレーション計算により得られる蛍光スペクトルと、分光器方式でのシミュレーション計算により得られる蛍光スペクトルとで違いが生ずるのは当然である。したがって、実際に測定されたターゲットスペクトルとシミュレーショ計算により得られた蛍光スペクトルとの偏差量が、そのままカメラ方式および分光器方式の精度を反映するわけではない。しかし、概略の精度は確認できるため、この手法を採用することにした。

図１８と図１９および図２０とを比較すると明らかなように、実測の蛍光スペクトルと第１および第２実施例の定量結果を用いて計算された蛍光スペクトルとは極めて近い形状を有している。したがって、第１および第２実施例は優れた精度で蛍光色素の濃度を定量できることが分かる。

第８実施形態
以下では、本発明の別の実施形態を説明する。図２１は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。この定量システム８００は、第１実施形態の定量システム１００におけるマルチバンドカメラ３０をマルチバンドカメラ３０ａに置き換えた構成を有している。本実施形態では、パーソナルコンピュータ４０の代わりに、マルチバンドカメラ３０ａ内に設けられた論理回路が上記（７）式の演算を実行する。

図２２は、本実施形態の定量に関連する種々のデータを示している。第１実施形態と同様に、マルチバンドカメラ３０ａは、三つの検出波長帯、すなわちＲ波長帯、Ｇ波長帯およびＢ波長帯を有している。図２２（ａ）は、マルチバンドカメラ３０ａの感度特性を示している。この図に示されるように、隣り合う検出波長帯は、部分的に重なり合っている。マルチバンドカメラ３０ａは、これらの検出波長帯に対応する三つの撮像素子と、入力光の波長成分を三つの検出波長帯に分離して、対応する撮像素子に送る色分解プリズムを含んでいる。

図２３は、マルチバンドカメラ３０ａに搭載された信号処理回路を示すブロック図である。信号処理回路３１は、上述した三つの撮像素子１０１〜１０３に加えて、増幅器１１１〜１１３、Ａ／Ｄコンバータ１２１〜１２３、定量演算用の論理回路１３０、タイミング調整回路１４１〜１４３、インタフェース回路１５０、駆動回路１６０、タイミング発生回路１６２および制御回路１６４を含んでいる。

撮像素子１０１〜１０３は、駆動回路１６０によって駆動され、ターゲット試料の蛍光像をそれぞれＲ、ＧおよびＢ波長帯で撮像し、三つの画像信号を生成する。これらの画像信号は、増幅器１１１〜１１３によって増幅され、Ａ／Ｄコンバータ１２１〜１２３によってディジタル化されて、定量演算用の論路回路１３０に入力される。

論路回路１３０は、これらの画像信号を用いて上記（７）式に示される演算を実行し、ターゲット試料中の蛍光色素の濃度を画素ごとに計算する。以下では、（７）式における行列（Ｊ^Ｔ・Ｊ）^−１・Ｊ^Ｔを「基準データＭ」と表記する。本実施形態では、この基準データＭは、コンピュータ４０からインタフェース回路１５０を介して論路回路１３０に入力される。ただし、この代わりに、マルチバンドカメラ３０ａ内に設けられた記憶装置に基準データＭが格納されていてもよい。論理回路１３０は、各画素に対して算出した濃度に応じた値をその画素に割り当てて、ターゲット試料における各蛍光色素の濃度分布を表す画像信号を生成する。これらの画像信号は、マルチバンドカメラ３０ａのＲ、ＧおよびＢ出力のいずれかとなる。

タイミング発生回路１６２は、Ａ／Ｄコンバータ１２１〜１２３、論理回路１３０、タイミング調整回路１４１〜１４３、駆動回路１６０および制御回路１６４にクロック信号を供給する。制御回路１６４は、外部インタフェース回路１５０を通じてコンピュータ４０から命令を受け取り、その命令に応じて論理回路１３０の動作を制御する。例えば、制御回路１６４は、論理回路１３０による（７）式の演算を禁止して、Ｒ、ＧおよびＢ波長帯で取得した画像データそのものをマルチバンドカメラ３０ａから出力させることもできる。Ｒ、ＧおよびＢ出力は、タイミング調整回路１４１〜１４３によって同期され、外部インタフェース回路１５０からコンピュータ４０に送られる。

コンピュータ４０は、マルチバンドカメラ３０ａのＲ、ＧおよびＢ出力を用いて定量結果表示用の画像をディスプレイ装置４２上に表示する。例えば、図３に示されるように、Ｒ、ＧおよびＢ出力を重ね合わせた画像６３をカラーバー６４とともに表示してもよいし、図４に示されるように、Ｒ、ＧおよびＢ出力を分離して別個の画像として表示してもよい。コンピュータ４０は、これらの画像をプリンタ４４を用いて印刷することができる。

以下では、定量システム８００を用いてターゲット試料中の蛍光色素の濃度を定量する方法を具体例を挙げて説明する。図２２（ｂ）は、ターゲット試料、ならびに第１および第２蛍光色素の蛍光スペクトルを示す。このターゲット試料は、Ｈｅｌａ細胞を２種類の蛍光色素、ＤＡＰＩおよびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色することにより得たものである。ＤＡＰＩは細胞の核、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎはミトコンドリアをそれぞれ染色する。ＤＡＰＩの蛍光スペクトルは４６０ｎｍ付近に、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの蛍光スペクトルは５１５ｎｍ付近に、それぞれピークを有する。

まず、第１実施形態と同様に、基準試料を用意し、基礎データを取得する。具体的には、Ｈｅｌａ細胞をＤＡＰＩのみ、またＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎのみで染色して、第１および第２の基準試料を作成する。これらの基準試料には、４０５±５ｎｍの透過波長帯を有するバンドパスフィルタ２２を通して励起光が照射される。図２２（ｃ）は、第１基準試料の蛍光スペクトルを示し、図２２（ｄ）は、第２基準試料の蛍光スペクトルを示している。

基準試料から発する蛍光の光学像は、４２０ｎｍ以上の透過波長帯を有するバンドパスフィルタ２４を通してマルチバンドカメラ３０ａにより撮像される。マルチバンドカメラ３０ａ中の撮像素子１０１〜１０３は、一つの基準試料に対して、三つの検出波長帯で取得された三つの画像データを生成する。コンピュータ４０は、制御回路１６４に命令を送って論路回路１３０による（７）式の演算を禁止し、これらの画像データをマルチバンドカメラ３０ａに出力させる。これらの画像データは、コンピュータ４０に送られ、コンピュータ４０内の記憶装置に保存される。すべての基準試料について同様の測定が行われ、画像データが保存される。

本実施形態の基準試料では、核やミトコンドリアの分布に応じて蛍光色素が点在する。このため、基準試料の各蛍光画像から、基準試料中の蛍光を発する部位を表示する任意の一画素の値を取得し、基礎データとして使用する。図２２（ｆ）は、第１基準試料から取得した、ある一画素のＲ、ＧおよびＢ値、すなわちＲｆ_１、Ｇｆ_１およびＢｆ_１を示している。ここで、Ｒｆ_１＝１９．９８０、Ｇｆ_１＝１２１．９３９、Ｂｆ_１＝２５２．９００である。図２２（ｇ）は、第２基準試料から取得した、ある一画素のＲ、ＧおよびＢ値、すなわちＲｆ_２、Ｇｆ_２およびＢｆ_２を示している。ここで、Ｒｆ_２＝１７．５３６、Ｇｆ_２＝１６４．０６２、Ｂｆ_２＝８．９２６である。これらの値が基準試料から取得された基礎データであり、（２）式に示される行列Ｊ中の各成分に等しい。

コンピュータ４０は、こうして取得した行列Ｊを用いて、基準データＭ、すなわち行列（Ｊ^Ｔ・Ｊ）^−１・Ｊ^Ｔを算出する。算出された基準データはコンピュータ４０内の記憶装置に格納される。後述するように、この基準データＭは、すべての画素に対する（７）式の演算に共通して使用される。こうして定量の第１段階が終了する。

次に、バンドパスフィルタ２２を介してターゲット試料に励起光を照射し、ターゲット試料から発する蛍光の画像をマルチバンドカメラ３０ａで撮像する。この結果、論理回路１３０には、Ｒ、ＧおよびＢ波長帯で撮像された蛍光画像を表す三つの画像信号が入力される。図２２（ｅ）は、ターゲット試料の蛍光画像のある一画素のＲ、ＧおよびＢ値、すなわちＲ_ｔｇｔ、Ｇ_ｔｇｔおよびＢ_ｔｇｔを示している。ここで、Ｒ_ｔｇｔ＝２４．６０５、Ｇ_ｔｇｔ＝１８２．１１０、Ｂ_ｔｇｔ＝１９２．１４５である。

コンピュータ４０は、制御回路１６４に命令を送り、論理回路１３０による（７）式（実際には（１）式）の演算を許可する。論路回路１３０には、コンピュータ４０から基準データＭも供給される。論路回路１３０は、この基準データＭを用いて、各画素に対して（１）式の演算を実行し、ＤＡＰＩおよびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの濃度ｃ_１およびｃ_２を算出する。図２２（ｈ）は、図２２（ｅ）に示されるＲ、ＧおよびＢ値を有する画素に対して算出された濃度ｃ_１およびｃ_２を示している。ここで、ｃ_１＝０．７４、ｃ_２＝０．５６である。上記実施形態と同様に、これらの濃度値の単位は、対応する基準試料中の蛍光色素の濃度である。

論路回路１３０は、各画素に対して算出した濃度ｃ１およびｃ２に応じた値をその画素に割り当てて、ターゲット試料におけるＤＡＰＩおよびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの濃度分布を示す二つの画像信号を生成する。これらの画像信号は、Ｒ、ＧおよびＢ信号のいずれかとして論理回路１３０から出力される。したがって、ＤＡＰＩおよびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの濃度分布は、異なる色の画像データとしてマルチバンドカメラ３０ａからコンピュータ４０に送られる。これらの画像信号は、互いに分離されてコンピュータ４０に送信されてよいし、単一のコンポジット信号に変換されてからコンピュータ４０に送信されてもよい。コンピュータ４０は、これらの画像信号を用いて、定量結果を表す画像をディスプレイ装置４２上に表示する。

図２４は、本実施形態の定量結果画像を示しており、ここで、（ａ）はマルチバンドカメラ３０ａの出力画像、（ｂ）はその出力画像から分離されたＤＡＰＩの濃度分布画像、（ｃ）はその出力画像から分離されたＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの濃度分布画像である。これらのオリジナルはカラー画像であるが、ここでは白黒に変換した画像を示す。ＤＡＰＩの画像では核のみが、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの画像ではミトコンドリアのみが表示されている。このように、本実施形態の定量システムは、細胞における二つの構造体をリアルタイムで明確に分離して表示することができる。

比較のため、本発明者らは、上記（１）式の演算を行わない３バンドカメラを用いてターゲット試料の蛍光画像を取得した。図２５は、この比較例の定量結果画像を示しており、ここで、（ａ）は３バンドカメラの出力画像であり、（ｂ）および（ｃ）はその出力画像から抽出したＢ波長域およびＧ波長域の蛍光画像である。これらもオリジナルはカラー画像であるが、ここでは白黒に変換した画像を示す。使用した色素の蛍光スペクトルの分布に応じて、ＤＡＰＩの蛍光はＢおよびＧ波長域の両方で検出され、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの蛍光はそのほとんどがＧ領域で検出される。このため、Ｂ波長域の画像にはＤＡＰＩで染色された核の像しか現れないが、Ｇ波長域の画像にはＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色されたミトコンドリアの像とＤＡＰＩで染色された核の像が重なって現れてしまう。

本実施形態では、パーソナルコンピュータ４０上で動作するソフトウェアの代わりにマルチバンドカメラ３０ａ内のハードウェアが定量演算を行い、その演算結果を用いて濃度分布を表す画像信号を生成する。このため、ソフトウェア処理によって濃度分布画像を生成する場合に比べて、濃度分布画像を迅速に表示することが可能である。この結果、ユーザは、ターゲット試料の撮像後、定量の結果をすぐに確認することができる。

本実施形態の手法は、マルチバンドカメラを使用する上記実施形態のいずれにも応用することができる。また、第２実施形態のように、基準試料からの基礎データの取得を分光器３５を用いて行ってもよい。

以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

上記実施形態では、Ｒ、ＧおよびＢ波長帯を検出波長帯として有する撮像装置が主に使用されている。しかし、本発明で使用される撮像装置は、他の任意の検出波長帯を有していてもよい。

上記（１）式は、行列Ｊが正則でない場合の式である。行列Ｊが正則でないのは、ターゲット試料に含まれる蛍光色素の数と検出波長帯の数が一致していないからである。第１実施形態では三つの検出波長帯があるので、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が３種類であれば、行列Ｊは正則となる。この場合、（１）式は次のような簡単な形に書き直される。

上記実施形態で使用される３バンドカメラの代わりに、図２６に示される感度特性を有する４バンドカメラを使用してもよい。この４バンドカメラもＬｏｗ ＬｉｇｈｔモードとＨｉｇｈ Ｌｉｇｈｔモードという二つの感度モードを有している。したがって、第３実施形態で説明したように、８種類までの蛍光色素を定量することが可能となる。また、図２６に示されるように、この４バンドカメラは近赤外領域に感度を有している。したがって、この４バンドカメラは、近赤外領域に発光領域を持つ蛍光色素の定量に有用である。

第８実施形態で使用されるマルチバンドカメラ３０ａは、色分解プリズムと複数の撮像素子を有しているが、これらの代わりにカラーモザイクフィルタ等が印刷された一つの撮像素子を有していてもよい。

本発明の方法および定量システムは、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍光色素の濃度を精度良く定量することができる。

Claims (12)

1. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法であって、
   隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度を取得することと、
   前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像することと、
   次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出すること
   を備える方法。
   

   

   ここで、Ｏ_１〜Ｏ_ｋは、前記第１〜第ｋ検出波長帯で撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊはｋ行ｍ列からなる行列であり、Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｋ以下の整数、ｊは１以上ｍ以下の整数）は、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎ（ｎは２以上の整数）における、前記第１〜第ｍ基準試料から発する蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ （ｔは１〜ｎの整数）を、該分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎにおいて第１〜第ｋの検出波長帯に感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を有する撮像装置を用いて測定し、感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を成分とするｋ行ｎ列の行列と、蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ を成分とするｎ行ｍ列の行列とを掛け合わせ、全波長λ１〜λｎにわたって積分することにより算出される。
2. 前記撮像装置は、前記第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
   各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、前記マルチバンドカメラを用いて各前記基準試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像し、各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍光画像から取得し、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍの算出は、前記第ｉ検出波長帯で撮像された前記第ｊ基準試料の蛍光画像から取得された前記画素の値を前記行列Ｊの成分Ｊ_ｉｊとして使用する
   請求項１に記載の方法。
3. 前記撮像装置は、前記第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
   各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、各前記基準試料から発する蛍光の分光強度を分光器を用いて測定し、前記分光強度と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での前記測定強度を算出する
   請求項１に記載の方法。
4. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を撮像装置を用いて定量する方法であって、
   前記撮像装置は、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯と、前記撮像装置の異なる感度特性を設定する第１〜第ｑ（ｑは２以上の整数）の感度モードとを有しており、
   隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯および各前記感度モードでの測定強度を取得することと、
   前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯および各前記感度モードで撮像することと、
   次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出すること
   を備える方法。
   

   

   ここで、Ｐ_ｖ（ｖは１以上ｑ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｐ_ｖの第ｉ行成分Ｐ_ｉｖ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、前記撮像装置を用いて前記第ｉ検出波長帯および前記第ｖ感度モードで撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊ_１は（ｋ・ｑ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_１の成分行列Ｌ_ｖｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｌ_ｉｖｊは、前記第ｊ基準試料から発する蛍光の前記第ｉ検出波長帯および前記第ｖ感度モードでの前記測定強度である。
5. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を、異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法であって、
   隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料を用意し、異なる波長スペクトルを有し前記第１〜第ｍ蛍光色素をすべて励起する第１〜第ｒ（ｒは２以上の整数）の励起光の各々を前記第１〜第ｍ基準試料に照射し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度を取得することと、
   各前記励起光を前記ターゲット試料に照射し、前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像することと、
   次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出すること
   を備える方法。
   

   

   ここで、Ｑ_ｕ（ｕは１以上ｒ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｑ_ｕの第ｉ行成分Ｑ_ｉｕ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、前記第ｕ励起光の照射に応じて前記第ｉ検出波長帯で撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊ_２は（ｋ・ｒ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_２の成分行列Ｔ_ｕｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｔ_ｉｕｊは、前記第ｕ励起光の照射に応じて前記第ｊ基準試料から発する蛍光の前記第ｉ検出波長帯での前記測定強度である。
6. 前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第１〜第ｋ検出波長帯で撮像して第１〜第ｋの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第１〜第ｋの画像信号が入力される演算回路と、を含んでおり、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍの算出は、前記演算回路が前記第１〜第ｋの画像信号を用いて前記演算を実行する処理を含んでおり、
   前記演算回路に、前記ターゲット試料の複数の部位における前記濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出させ、第１〜第ｍの蛍光色素の濃度分布を表す第１〜第ｍの画像信号を生成させることを更に備える請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
   前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、
   異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
   次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する演算装置と、
   を備える蛍光色素濃度定量システム。
   

   

   ここで、Ｏ_１〜Ｏ_ｋは、前記第１〜第ｋ検出波長帯で撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊはｋ行ｍ列からなる行列であり、Ｊの第ｉ行第ｊ列成分Ｊ_ｉｊ（ｉは１以上ｋ以下の整数、ｊは１以上ｍ以下の整数）は、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎ（ｎは２以上の整数）における、前記第１〜第ｍ基準試料から発する蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ （ｔは１〜ｎの整数）を、該分光波長帯λ１、λ２、・・・λｎにおいて第１〜第ｋの検出波長帯に感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を有する撮像装置を用いて測定し、感度特性Ｓ _１λｔ 、・・・Ｓ _ｋλｔ を成分とするｋ行ｎ列の行列と、蛍光強度ｆ _１λｔ 、・・・ｆ _ｍλｔ を成分とするｎ行ｍ列の行列とを掛け合わせ、全波長λ１〜λｎにわたって積分することにより算出される。
8. 前記光検出器および前記撮像装置は、前記第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラであり、
   前記光検出器は、各前記検出波長帯にて各前記基準試料の蛍光画像を撮像し、各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍光画像から取得し、
   前記演算装置は、前記第ｉ検出波長帯で撮像された前記第ｊ基準試料の蛍光画像から取得された前記画素の値を前記行列Ｊの成分Ｊ_ｉｊとして使用する
   請求項７に記載の定量システム。
9. 前記光検出器は、各前記基準試料から発する蛍光の分光強度を測定する分光器を含んでおり、
   前記撮像装置は、前記第１〜第ｋ検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
   前記演算装置は、前記分光強度と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での強度を算出し、算出された強度を前記行列Ｊの各成分として使用する
   請求項７に記載の定量システム。
10. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
    前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、
    異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯と前記撮像装置の異なる感度特性を設定する第１〜第ｑ（ｑは２以上の整数）の感度モードとを有し、前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯および各前記感度特性で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
    次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する演算装置と、
    を備える蛍光色素濃度定量システム。
    

    

    ここで、Ｐ_ｖ（ｖは１以上ｑ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｐ_ｖの第ｉ行成分Ｐ_ｉｖ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、前記第ｉ検出波長帯および前記第ｖ感度モードで撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊ_１は（ｋ・ｑ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_１の成分行列Ｌ_ｖｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｌ_ｉｖｊは、前記第ｊ基準試料から発する蛍光の前記第ｉ検出波長帯および前記第ｖ感度モードで測定された強度である。
11. ターゲット試料中に含まれる第１〜第ｍ（ｍは２以上６以下の整数）の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
    異なる波長スペクトルを有し前記第１〜第ｍ蛍光色素をすべて励起する第１〜第ｒ（ｒは２以上の整数）の励起光を生成する光源と、
    前記第１〜第ｍ蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第１〜第ｍの基準試料への各前記励起光の照射に応じて各前記基準試料から発する蛍光の強度を測定する光検出器と、
    異なる第１〜第ｋ（ｋは２以上６以下の整数）の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料への各前記励起光の照射に応じて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
    次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第１〜第ｍ蛍光色素の濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出する演算装置と、
    を備える蛍光色素濃度定量システム。
    

    

    ここで、Ｑ_ｕ（ｕは１以上ｒ以下の整数）はｋ行１列からなる行列であり、Ｑ_ｕの第ｉ行成分Ｑ_ｉｕ（ｉは１以上ｋ以下の整数）は、前記第ｕ励起光の照射に応じて前記第ｉ検出波長帯で撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。Ｊ_２は（ｋ・ｒ）行ｍ列からなる行列であり、Ｊ_２の成分行列Ｔ_ｕｊ（ｊは１以上ｍ以下の整数）の第ｉ行成分Ｔ_ｉｕｊは、前記第ｕ励起光の前記第ｊ基準試料への照射に応じて前記第ｉ検出波長帯で測定された蛍光の強度である。
12. 前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第１〜第ｋ検出波長帯で撮像して第１〜第ｋの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第１〜第ｋの画像信号が入力される、前記演算装置としての演算回路と、を含んでおり、
    前記演算回路は、前記第１〜第ｋの画像信号を用いて前記演算を実行し、前記ターゲット試料の複数の部位における前記濃度ｃ_１〜ｃ_ｍを算出して、第１〜第ｍの蛍光色素の濃度分布を表す第１〜第ｍの画像信号を生成する、請求項７〜１１のいずれかに記載の定量システム。

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