JP4659405B2

JP4659405B2 - 骨形成促進剤

Info

Publication number: JP4659405B2
Application number: JP2004218786A
Authority: JP
Inventors: 睦美元賣; 如一森田; 博昭松山; 篤芹澤; 浩川上
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2004-07-27
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2024-07-27
Also published as: JP2006036690A

Description

本発明は、補体第4成分及び／又はβデフェンシンを有効成分とする骨形成促進剤に関するものである。また、本発明は、補体第4成分及び／又はβデフェンシンを配合した骨形成促進用飲食品、医薬又は飼料に関するものである。

近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アンカップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。

従来、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、（１）食餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されている。しかし、これらは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ3 の補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 やカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが
知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。

本発明者らは、食品素材として使用可能な骨形成促進作用や骨吸収抑制作用を有する物質を得るために、乳中に存在する骨形成促進因子及び骨吸収抑制因子を探索し続けてきた。本発明者らは、その過程において、補体第4成分及びβデフェンシンが骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進作用を有することを見出した。骨芽細胞は骨形成で中心的な役割を果たしている細胞で、骨組織表面に存在し、骨基質タンパク質を分泌している。この骨基質タンパク質にリン酸カルシウムの結晶が沈着し硬い骨組織が出来上がる。

一方、破骨細胞は造血幹細胞から発生し、海綿骨表面に存在し、骨を溶解する細胞である。破骨細胞が骨基質を溶解し（骨吸収）、その後、骨芽細胞が骨基質を合成することによって、骨の形成や成長（モデリング）、代謝（リモデリング）が起こると考えられている。本願発明は、補体第4成分及び／又はβデフェンシンが、この骨代謝において骨形成で中心的な役割を果たしている骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進作用を有することを見出したものである。

補体第4成分（Complement component C4）は血清中にあり、抗原抗体複合物と反応して活性化され、複雑な反応を起こしながら生理活性を発揮する酵素様物質である。補体第4成分自体では抗原に対する特異性は持たないが、抗原抗体複合物により活性化され、貧食作用の亢進を起こしたり、特異抗体の結合した細胞や細菌を破壊したりする。現在、補体第1成分（C1）から補体第9成分（C9）まで９つの成分が知られている。補体第４成分は、α鎖、β鎖、γ鎖という３種類のポリペプチド鎖からなる分子量210ｋDaのタンパク質である。補体第3成分を有効成分として含有する胚・胎児及びそれらの組織培養用栄養因子組成物や不妊症治療用組成物は公開されているが（例えば、特許文献1参照。）、補体第4成分が骨芽細胞の分化を促進することに関しては知られていなかった。

デフェンシンは、分子内に３つのＳ−Ｓ結合をもつ強い塩基性の抗菌ペプチドとして知られており、アルギニン残基が4〜10個、システイン残基が6個ある29〜34個のアミノ酸からなる塩基性のタンパク質である。システイン残基の存在位置の違いから、大きくα型とβ型に分けられる。グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する抗菌活性だけではなく、カビやウイルスに対しても抗菌活性を保有する。βデフェンシンは、呼吸器系上皮細胞や粘膜上皮細胞で発現しており、ヒトにおいては６つのタイプが知られている。デフェンシンには、抗菌作用のほか、正常細胞や癌細胞に対する細胞傷害作用、肥満細胞からのヒスタミン放出作用、単球走化作用など広く生体防御に関係していることが知られている。酵母と乳酸菌の特定の培養液濾液を投与してデフェンシン等を分泌させることからなるレトロウィルス感染症治療薬（例えば、特許文献2参照。）や、皮膚におけるデフェンシンの発現を刺激するヨモギの根からなる化粧用組成物などが公開されている（例えば、特許文献3参照。）が、骨芽細胞の分化を促進することに関しては知られていなかった。
特開平10-033164号公報特開2004-115497号公報特開2004-067660号公報

骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患の性質上、日常の食事の中で、嗜好的にも問題なく、長期的・直接的に経口摂取することができ、また、直接的に骨形成促進作用を骨に付与し、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患の予防又は改善治療効果が期待できるような、新規な骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品、医薬又は飼料を提供することを課題とする。

本発明者らは、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を有する物質を探索している過程で、補体第4成分及び／又はβデフェンシンが骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
骨はカルシウムやミネラルなどの骨塩と、コラーゲンなどの骨基質からなる。骨を丈夫にするためには、骨密度などの指標で評価される骨塩量だけではなく、しなやかで弾力性のある骨のもとになる骨基質の形成が重要である。コラーゲンは分化した骨芽細胞によって産生されるので、骨芽細胞によるコラーゲンの産生促進は骨基質の形成につながり、骨基質が形成されることにより骨強度の上昇をもたらすことができる。
したがって、本発明は、補体第4成分及び／又はβデフェンシンを有効成分とする新規な骨形成促進剤を提供することにある。また、本発明は、補体第4成分及び／又はβデフェンシンを配合して骨形成促進作用を賦与した飲食品、医薬品又は飼料を提供することにある。
補体第4成分及び／又はβデフェンシンは、血液あるいは乳から調製することができる。補体第4成分は市販の製品もあり、シグマ（Sigma）社等から販売されている。また、βデフェンシンも市販の製品があり、株式会社ペプチド研究所等から販売されている。

本発明の補体第4成分及び／又はβデフェンシンを有効成分とする骨形成促進剤、そして補体第4成分及び／又はβデフェンシンを配合した骨形成促進用飲食品、医薬、飼料等は、骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進作用を有し、また骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患の予防や改善に有用である。また、本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品、医薬、飼料等は、原料の入手が容易であり、常に一定の品質が得られ、複雑な工程を必要としないで安価に製造でき、また大量調製することができる。

本発明の骨形成促進剤を投与するに際しては、補体第4成分及び／又はβデフェンシンを、必要に応じ、常法に従い、乳糖、澱粉等で賦型して、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤としたり、あるいはドリンク剤等として製剤化して用いることもできる。さらには、この補体第4成分及び／又はβデフェンシンを、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に配合して、骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進を図ることも可能である。さらに、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻、牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好なカルシウム剤を併用することにより、骨形成促進作用を一層高めることができる。また、これらの有効成分を飼料に含有させて、家畜や家禽等の骨形成を促進させることもできる。

骨形成促進効果を得るためには、本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品の有効量として、成人において補体第4成分及び／又はβデフェンシン1ng〜100mgを１日に数回に分けて経口的に摂取すればよい。
このように、本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品、医薬を摂取することにより、骨芽細胞の分化を促進して骨形成が促進され、骨粗鬆症等の各種骨疾患を予防又は改善することができる。なお、補体第4成分及びβデフェンシンは、元来、血液あるいは乳由来の成分であり、ラットにおける急性毒性は認められなかった。
以下に実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

試験例１

補体第4成分及びβデフェンシンの骨芽細胞分化促進作用を調べた。すなわち、ヒト由来前骨芽細胞MG63細胞を、10％牛胎児血清を含むDMEM培地(Flow Laboratories社製) を用いて、2×10⁴/mlの細胞数で96穴プレートに播種し、5％CO₂存在下、37℃で4日間培養し、試験用培養細胞とした。そして、培地に1％牛胎児血清を含む培地に交換し、補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）を最終濃度0.1、1、及び10μg/mlとなるように、また、βデフェンシン（βデフェンシン1及び2、株式会社ペプチド研究所製）を最終濃度0.1、1、及び10μg/mlとなるように培地に添加して、37℃で5日間培養した。培養上清を回収し、Procollagen TypeＩ C-peptide EIA Kit (Takara MK101、宝酒造社製)にて培養上清中のＩ型コラーゲン量を測定することにより骨芽細胞分化促進活性を調べた。コントロールとして、補体第4成分及びβデフェンシンが無添加のものを用いた。コラーゲン産生量は、コントロールのＩ型コラーゲン測定量に対するそれぞれのサンプルのＩ型コラーゲン測定量の割合（％）で表した。その結果を表１に示す。

〔表１〕
--------------------------------------------------------------------
最終濃度（μg/ml）コラーゲン産生量（％）
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コントロール（無添加） ― 100±6
補体第4成分 0.1 138±7
1 169±15
10 161±9
βデフェンシン１ 0.1 127±11
1 183±9
10 197±18
βデフェンシン２ 0.1 134±9
1 147±5
10 177±14
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補体第4成分及びβデフェンシンを添加した群はいずれもコントロール（補体第4成分及びβデフェンシン無添加）群に比べＩ型コラーゲン量が増加しており、骨芽細胞分化促進作用を有することが判った。

（補体第4成分及びβデフェンシンの製造）
ファルマシア社製S-Sepharose カラムに脱脂した牛乳10 lを通液した後、20mMリン酸緩衝液（pH7）で十分洗浄した。1.5M食塩を含むリン酸緩衝液（pH8.5）の比率を、1時間で100%まで上昇させながら吸着しているタンパク質をグラジエント溶出し、溶出時間15分の位置で補体第4成分0.5mgを、20分の位置でβデフェンシン0.3mgを回収した。
このようにして得られた補体第4成分及びβデフェンシンは、そのまま骨形成促進剤として使用可能である。

（骨形成促進剤の製造）
補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）1mgに、含水結晶ぶどう糖93.4g、炭酸カルシウム5g、シュガーエステル1g、香料0.5gを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨形成促進剤を製造した。

（骨形成促進剤の製造）
βデフェンシン（β-Defensin-1,4337-s、株式会社ペプチド研究所製）1mgに、含水結晶ぶどう糖 93.4g、炭酸カルシウム5g、シュガーエステル1g、香料0.5gを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨形成促進剤を製造した。

（骨形成促進剤の製造）
補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）1 mg、βデフェンシン（β-Defensin-2, 4338-s、株式会社ペプチド研究所製）1mgに、含水結晶ぶどう糖 93.4g、炭酸カルシウム5g、シュガーエステル1g、香料0.5gを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨形成促進剤を製造した。

（骨形成促進用乳飲料の製造）
生乳を、均質圧力120kg/cm²でホモゲナイズした後、 75℃で15秒間加熱殺菌した生乳に、補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）を、 1 l当たり10mgとなるように無菌下で添加し、100 ml容量のガラス瓶に充填して骨形成促進用乳飲料を製造した。

（骨形成促進用乳飲料の製造）
生乳を、均質圧力120kg/cm²でホモゲナイズした後、 75℃で15秒間加熱殺菌した生乳に、βデフェンシン（β-Defensin-1,4337-s、株式会社ペプチド研究所製）を、 1 l当たり10mgとなるように無菌下で添加し、100 ml容量のガラス瓶に充填して骨形成促進用乳飲料を製造した。

（骨形成促進用ゼリーの製造）
果糖 20.0 (重量％)、グラニュー糖 15.0(重量％)、水飴 5.0(重量％)、寒天 1.0(重量％)、香料 0.11(重量％)、カルシウム 0.1(重量％)、水 58.39(重量％)の割合で原料を混合して、加熱滅菌した後、補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）を、 1 l当たり10mgとなるように無菌下で添加して容器に充填し、骨形成促進用ゼリーを製造した。

（骨形成促進用乳児用調製粉乳の製造）
脱脂乳 75.61 (重量％)、乳清タンパク質濃縮物 2.36 (重量％)、乳糖 13.86 (重量％)、ミネラル混合物 0.32 (重量％)、水溶性ビタミン混合物 0.32 (重量％)、脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53 (重量％)の割合で原料を混合して殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して調製粉乳原料粉を製造した。これに、βデフェンシン（β-Defensin-2, 4338-s、株式会社ペプチド研究所製）を、1 kg当たり10mgとなるように無菌下で添加、混合し、骨形成促進用乳児用調製粉乳を製造した。

（骨形成促進用ドッグフードの製造）
大豆粕 12.0 (重量％)、脱脂粉乳 14.0(重量％)、大豆油 4.0(重量％)、コーン油 2.0(重量％)、パーム油 28.0(重量％)、トウモロコシ澱粉 15.0(重量％)、小麦粉 9.0(重量％)、ふすま 2.0(重量％)、ビタミン混合物 9.0(重量％)、ミネラル混合物 2.0(重量％)、セルロース 3.0(重量％)、の割合で原料を混合して殺菌し冷却後、補体第4成分（Complement C4, C8195、シグマ社製）を、 1 l当たり10mgとなるように無菌下で添加して成型し、骨形成促進用イヌ飼育用飼料（ドッグフード）を製造した。

Claims

補体第４成分及び／又はβデフェンシンからなる骨形成促進剤。
補体第４成分及び／又はβデフェンシン並びに製剤化に当たり許容される成分からなる骨形成促進用医薬。