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JP4590417B2 - Ｎｐｃ１ｌ１（ｎｐｃ３）およびこのリガンドの同定方法 - Google Patents

Ｎｐｃ１ｌ１（ｎｐｃ３）およびこのリガンドの同定方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、使用方法、ならびにモジュレーターおよびこのリガンドを同定する方法を包含する。
先進国の主な死亡原因である血管疾患の発症をもたらす要因は、血清コレステロールの増加である。２０歳から７４歳のアメリカ人の１９％が、高い血清コレステロールを有すると推定されている。血管疾患の最も一般的な形態は、動脈硬化症であり、動脈壁の肥厚および硬化に関連する状態である。大血管の動脈硬化症は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれる。アテローム性動脈硬化症は、冠動脈疾患、大動脈瘤、下肢の動脈疾患および脳血管疾患などの血管障害において根底にある有力な要因である。
コレステリルエステルは、アテローム性動脈硬化病変の主要成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。コレステリルエステルの形成はまた、食事性コレステロールの腸管吸収における一段階でもある。従って、コレステリルエステル形成の阻害および血清コレステロールの減少により、アテローム性動脈硬化病変形成の進行を阻害し、動脈壁におけるコレステリルエステルの蓄積を減少させ、食事性コレステロールの腸管吸収を阻止することができる。
哺乳動物および動物における全身のコレステロールホメオスタシスの調節には、コレステロールの腸管吸収の調節、細胞コレステロール輸送、食事性コレステロールおよびコレステロール生合成の調節、胆汁酸生合成、ステロイド生合成、ならびにコレステロール含有血漿リポタンパク質の異化が含まれる。コレステロールの腸管吸収の調節は、血清コレステロールレベルを調節する有効な手段であることが証明されている。例えば、コレステロール吸収阻害薬であるエゼチミブ（
Figure 0004590417
 ）は、この点に関して有効であることが示されている。エゼチミブを含有する医薬組成物は、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商品名ゼチア（Ｚｅｔｉａ）（登録商標）で市販されている。エゼチミブが作用する遺伝子標的の同定は、コレステロール吸収のプロセスを理解するため、および他の新規な吸収阻害薬の開発のために重要である。本発明は、エゼチミブの標的であるヒトＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３としても知られている；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９２５２２；Ｄａｖｉｅｓら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（２）：１３７から４５頁およびＩｏａｎｎｏｕ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１（１−２）：１７５から８１頁）のラット相同体およびマウス相同体を提供することにより、この必要性に取り組む。
ＮＰＣ１Ｌ１は、ＹＱＲＬ（配列番号３８）モチーフ（すなわち、原形質膜輸送シグナルへのトランスゴルジネットワーク；Ｂｏｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２２１９から２２２８頁；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：１１２３から１１３５頁；Ｐｏｎｎａｍｂａｌａｍら、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：２５３から２６８頁およびＲｏｔｈｍａｎら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２２７から２３４頁参照）を含むＮ−グリコシル化タンパク質であり、これは、限定的な組織分布を示し、胃腸に多く存在する。また、ヒトＮＰＣ１Ｌ１プロモーターは、ステロール調節エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ１）結合コンセンサス配列を含む（Ａｔｈａｎｉｋａｒら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９３５から４９４０頁；Ｅｒｉｃｓｓｏｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９４５から９５０頁；Ｍｅｔｈｅｒａｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５６３４から１５６４１頁；Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２３０６から２３１０頁；Ｂｅｎｎｅｔｔら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３０２５から１３０３２頁およびＢｒｏｗｎら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９：３３１から３４０頁）。ＮＰＣ１Ｌ１は、ヒトＮＰＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００２０２０）に対して４２％のアミノ酸配列相同性を有し、このＮＣＰ１は、ニーマン−ピック病Ｃ１型に関与する受容体である（Ｃａｒｓｔｅａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：２２８から２３１頁）。ニーマン−ピック病Ｃ１型は、リソソームにおいて低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）由来の非エステル化コレステロールの蓄積が生じる、ヒトにおける稀な遺伝性疾患である（Ｐｅｎｔｃｈｅｖら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２２５：２３５から２４３頁およびＶａｎｉｅｒら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９６：３２８から３３７頁）。さらに、コレステロールはｎｐｃ１−細胞のトランスゴルジネットワークに蓄積し、コレステロールの原形質膜への再配置および原形質膜からのコレステロールの再配置が遅れる。ＮＰＣ１およびＮＰＣｌＬ１は、各々、１３回膜貫通型セグメントならびにステロール感受性ドメイン（ＳＳＤ）を保有する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−Ｒ）、パッチド（ＰＴＣ）およびステロール調節エレメント結合タンパク質切断−活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）をはじめとするいくつかの他のタンパク質が、おそらく直接コレステロール結合が関連している機構によるコレステロールレベルの検知に関与するＳＳＤを含んでいる（Ｇｉｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：２４９から２５８頁；Ｋｕｍａｇａｉら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９１０７から１９１１３頁；Ｈｕａら、（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：４１５から４２６頁およびＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．ら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＳＣＡＰ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａ ｓｔｅｒｏｌ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，」 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １５，２５９から２６８頁（２００４））。
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１が、エゼチミブが作用する標的であり、結果として、ステロールおよび５α−スタノールの腸管輸送および吸収、例えば、コレステロール吸収の調節において重要な役割を果たすという発見に基づいている。従って、本発明は、ステロールおよび５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１介在性腸管輸送をブロックするリガンドを同定するアッセイにおけるＮＰＣ１Ｌ１の使用を提供する。本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供し、この方法は、ＮＰＣ１Ｌ１を、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノン、好ましくは置換２−アゼチジノングルクロニドと候補化合物とに接触させること、およびこの候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合するか否かを判定することを含む。候補化合物をＮＰＣ１Ｌ１に結合させることによる置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合の調節は、この候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合するリガンドであり、ステロールと５α−スタノールの吸収阻害薬であることを示す。
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供し、この方法は、ＮＰＣ１Ｌ１を、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノン、好ましくは置換２−アゼチジノングルクロニドと接触させること、および候補化合物の存在下および不在下で、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合を測定することを含み、候補化合物の存在下での、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合の減少が、前記候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１のリガンドであり、ステロールと５α−スタノールの吸収阻害薬であることを示す。
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１により介在されるステロールまたは５α−スタノールの腸管吸収を阻害する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、ＮＰＣ１Ｌ１を、検出可能なように標識したリガンドと候補化合物とに接触させること、およびこの候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合するか否かを判定することを含み、前記候補化合物とＮＰＣ１Ｌ１との結合が前記リガンドとＮＰＣ１Ｌ１との結合を調節し、前記調節はこの候補化合物がステロールまたは５α−スタノールの腸管吸収阻害薬であることを示す。
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこの機能的断片を細胞表面で発現する宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞またはＣａｃｏ２細胞）を、既知量の検出可能なように標識した（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓまたは蛍光標識で）置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）の存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドの存在について調べようとする試料と接触させること、および（ｂ）このポリペプチドと特異的に結合している、検出可能なように標識した置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）の量を測定することを含み、この試料中のＮＰＣ１Ｌ１リガンドは、このようなリガンドの不在下で測定される結合と比較した、検出可能なように標識した置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）とこのポリペプチドとの結合の実質的な減少を測定することにより同定される。
ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドのもう１つの同定方法も提供する。この方法は、（ａ）蛍光剤（例えば、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウム、ジフェニルオキサゾールおよびポリビニルトルエン）を含浸した複数の支持体粒子を水性懸濁液に入れ、この粒子には、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこの機能的断片を細胞表面で発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞またはＣａｃｏ２細胞）が結合していること、（ｂ）この懸濁液に、放射性標識した（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、または１２５Ｉで）置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）とリガンドの存在について調べようとする試料とを加えること（この際、この放射性同位元素は、置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）とこのポリペプチドが結合する際に蛍光剤を活性化して光エネルギーを生成し得る放射エネルギーを放出し、一方、このポリペプチドとは結合しない放射性標識置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）は、通常、支持体粒子から離れすぎているため、放射性エネルギーにより蛍光剤を活性化することができない）、および（ｃ）懸濁液中の蛍光剤によって放出される光エネルギーを測定することを含み、試料中のＮＰＣ１Ｌ１リガンドが、このようなリガンドの不在下で測定されるものと比較した、光エネルギー放出の実質的な減少を測定することにより同定される。
さらに、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法も提供し、この方法は、（ａ）配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこの機能的断片を細胞表面で発現する宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｊ７７４細胞、マクロファージ細胞またはＣａｃｏ２細胞）を、検出可能なように標識した（例えば、３Ｈ、１４Ｃまたは１２１Ｉで）ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールと、およびリガンドの存在について調べようとする試料と接触させること、および（ｂ）細胞中の検出可能なように標識したステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの量を測定することを含み、試料中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストが、このようなアンタゴニストの不在下で測定されるものと比較した宿主細胞内の検出可能なように標識したステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの実質的な減少を測定することにより同定され、また試料中のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストが、このようなアゴニストの不在下で測定されるものと比較した、宿主細胞内の検出可能なように標識したステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの実質的な増加を測定することにより同定される。
本発明は、被験体におけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１介在性腸管取込みを阻害する方法を包含し、この方法は、本明細書に記載されるスクリーニング法によって同定された物質を被験体に投与することによる。このような物質には、エゼチミブ以外のＮＰＣ１Ｌ１の小分子アンタゴニストなどの化合物が含まれる。また、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を投与することによりＮＰＣ１Ｌ１介在性ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール吸収をアンタゴナイズする方法も意図される。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１介在性吸収は、生物においてＮＰＣ１Ｌ１の発現を減少させるいずれかの方法によってもアンタゴナイズすることができる。例えば、生物細胞へのアンチセンスＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの導入によるか、または生物のＮＰＣ１Ｌ１遺伝子の遺伝子突然変異により（例えば、完全ノックアウト、破壊、末端切断によるか、または１つ以上の点突然変異の導入により）ＮＰＣ１Ｌ１発現を減少させることができる。
また、突然変異型トランスジェニック哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ブタ、モルモット、ネコ、ウマ）、好ましくは内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合突然変異またはヘテロ接合突然変異（例えば、破壊、末端切断、１つ以上の点突然変異、ノックアウト）を含むマウスも本発明に包含され、マウスは機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を全く生産しないことが好ましい。機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く突然変異型マウスは、機能的ＮＰＣ１Ｌ１を有する非突然変異型マウスと比較した場合に、ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールの腸管吸収レベルの低下および／または血清ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールレベルの低下および／または肝臓ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールレベルの低下を示すことが好ましい。突然変異型マウスの染色体において、ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号４５）の欠失領域がヌクレオチド７９０からヌクレオチド９９８であることが好ましい。一実施態様では、ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号１１）はヌクレオチド７６７からヌクレオチド９７５が欠失している。ｎｐｃ１ｌ１変異対立遺伝子を受け継いだ、本発明の親ＮＰＣ１Ｌ１突然変異型マウス（すなわち、ｎｐｃ１ｌ１）のいかなる子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）もまた、本発明の一部である。
本発明の範囲には、試料を、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収アンタゴニストについてスクリーニングする方法も包含され、この方法は、（ａ）機能的ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を含む第１マウスおよび第２マウスと、機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く突然変異型の第３マウスとに、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール含有物質（例えば、放射性標識コレステロール、例えば、１４Ｃ−コレステロールまたは３Ｈ−コレステロールなどを含む）を給餌すること、（ｂ）機能的ＮＰＣ１Ｌ１を含む第１マウスに試料を投与し、第２マウスには投与しないこと、（ｃ）前記第１マウス、第２マウスおよび第３マウスの腸におけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収量を測定すること（例えば、血清コレステロールを測定することにより）、および（ｄ）各マウスでステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルを比較することを含み、第１マウスと第３マウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルが第２マウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収量よりも少ない場合に、この試料がステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収アンタゴニストを含有していると判定される。
本発明はまた、（ａ）薬剤投与形態の置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）（例えば、置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）１０ｍｇを含有する丸剤または錠剤）および（ｂ）情報、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの標的であることを示す挿入物の形のものを含むキットも包含する。このキットに、薬剤投与形態のシンバスタチン（例えば、シンバスタチン５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇまたは８０ｍｇを含有する丸剤または錠剤）も含めてよい。薬剤投与形態のシンバスタチンと薬剤投与形態のエゼチミブは、１つの丸剤もしくは錠剤にまとめてもよいし、または別個の丸剤または錠剤にしてもよい。
本発明はまた、機能的ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードするか生産できる遺伝子が欠失している、いずれかの単離哺乳動物細胞（例えば、単離マウス細胞、単離ラット細胞または単離ヒト細胞）を提供する。単離細胞は、機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を全く生産しない、内因性染色体ＮＰＣ１Ｅ１のホモ接合突然変異を含む突然変異型マウスから単離できる。さらに、突然変異は、変異を受けていないときには配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む）内にあり得る。細胞は、十二指腸、胆嚢、肝臓、小腸または胃組織から単離でき、またはこれらに由来するものであり得る。細胞は、腸細胞であり得る。
本発明は、ラット由来、ヒト由来およびマウス由来のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを、それぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに包含する。ラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトＮＰＣ１Ｌ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、マウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。配列番号１または配列番号１０のラットＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドはラットＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。配列番号３のヒトＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドはヒトＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。配列番号１１または配列番号１３のマウスＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドはマウスＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする。
本発明は、以下の表１において言及されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む、全ての単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリペプチドを包含する。
Figure 0004590417
ヒトＮＰＣ１Ｌ１はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９２５２２の下で開示されている。以下で論じるように、配列番号１に示されるラットＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列は、ラット空腸細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の発現配列タグ（ＥＳＴ）から得た。配列番号５から７は、３つの独立したｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列を含む。配列番号５の下流配列ＥＳＴ（６０３６６２０８０Ｆ１）を決定した。これらの試験から得た配列決定データは、配列番号８に記載している。上流配列もまた決定され、これらのデータは、配列番号９に記載している。
配列番号４３および配列番号４４は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１９２５２２の下で開示されているヒトＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である（Ｄａｖｉｅｓら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５ （２）：１３７から４５頁参照）。
配列番号４５は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＫ０７８９４７の下で開示されているマウスＮＰＣ１Ｌ１のヌクレオチド配列である。
ＮＰＣ１Ｌ１は、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収を媒介する。患者においてＮＰＣ１Ｌ１を阻害することが、患者においてステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収や血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールを減少させるのに有用な方法である。患者においてステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルや血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのレベルを低下させることが、アテローム性動脈硬化症、特に食事性アテローム性動脈硬化症の発生を治療または予防する有用な方法である。
ここで、用語「ステロール」として、これに限らないが、コレステロールおよびフィトステロール（これに限らないが、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびアベノステロール（ａｖｅｎｏｓｔｅｒｏｌ）を含む）が挙げられる。
ここで、用語「５α−スタノール」として、これに限らないが、コレスタノール、５α−カンペスタノールおよび５α−シトスタノールが挙げられる。
現在の仮説に限定されることなく、実施例によりＮＰＣ１Ｌ１とコレステロールとの間の推定分子間相互作用をよりよく理解する。この点に関して、ＮＰＣ１Ｌ１のより興味深い特徴の１つが、ＮＰＣ１Ｌ１がＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ切断−活性化タンパク質）において最初に観察されたステロール感受性ドメイン（ＳＳＤ）を含むことである。ＳＣＡＰは、脂質およびコレステロールホメオスタシスに関連する３５を超える遺伝子を制御する転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の活性化を制御する（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｂｌｏｏｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，１１０４１から１１０４８頁 （１９９９））。ＳＳＤは、５本の推定膜貫通ヘリックスの束にある約１８０個のアミノ酸からなり、コレステロール生合成経路における２つの重要な酵素の調節的機能の役目も果たし、受容体パッチドに存在している。最近、コレステロールとＳＣＡＰのＳＳＤとの高親和性結合が証明され（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．，Ｓｕｎ，Ｌ．，Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＳＣＡＰ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａ ｓｔｅｒｏｌ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ」 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １５，２５９から２６８頁 （２００４））、これにより、コレステロールが同様にＮＰＣ１Ｌ１のＳＳＤとも結合できることが示唆され、エゼチミブがこの部位での結合に関してコレステロールと競争し得る可能性が高まった。
分子生物学
本発明に従って、当分野の技量の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術については、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ここでは「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 （１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 （１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 （１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）参照。
配列番号１０および配列番号１３の逆翻訳配列では、特許審査手続マニュアルのＰＣＴ実施細則の付属書２付録Ｃの表１に示される１文字表記を使用する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖型、二本鎖型、または他の型の、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル多量体型、またはこれらのいずれかのホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを指す。
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２個以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
「コード配列」または発現生成物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素を「コードする」配列は、発現された場合にこの生成物の生産をもたらすヌクレオチド配列である。
用語「遺伝子」とは、１種またはそれ以上のＲＮＡ分子、タンパク質もしくは酵素の全てもしくは一部を含むリボヌクレオチドもしくはアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはこの特定の配列に対応するＤＮＡ配列を意味する。このＤＮＡ配列は、例えば、この遺伝子が発現される条件を決定する調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列を含む場合も含まない場合もある。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得るが、このＲＮＡは、アミノ酸配列に翻訳される場合も翻訳されない場合もある。
本発明は、配列番号１、配列番号５から１１または配列番号１３のうちのいずれかの核酸断片を包含する。核酸「断片」とは、配列番号１、配列番号５から１１または配列番号１３のうちのいずれか由来の少なくとも約３０個（例えば、３１、３２、３３、３４個）、好ましくは少なくとも約３５個（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４個）、より好ましくは少なくとも約４５個（３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４個）、および最も好ましくは少なくとも約１２６個以上の連続するヌクレオチド（１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、１０００または１２００個）を含む。
本発明はまた、配列番号１、配列番号５から１１または配列番号１３のうちのいずれか由来の少なくとも７個（例えば、９、１２、１７、１９個）、好ましくは少なくとも約２０個（例えば、３０、４０、５０、６０個）、より好ましくは約７０個（例えば、８０、９０、９５個）、さらに好ましくは少なくとも約１００個（例えば、１０５、１１０、１１４個）さらに好ましくは少なくとも約１１５個（１１７、１１９、１２０、１２２、１２４、１２５、１２６個）の連続するヌクレオチドからなる核酸断片も包含する。
ここで、用語「オリゴヌクレオチド」とは、注目する遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズ可能であり得る、一般にせいぜい約１００個のヌクレオチド（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０個）の核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有結合されているヌクレオチドを組み込むことによって標識できる。一実施態様では、標識したオリゴヌクレオチドを、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用できる。もう１つの実施態様では、全長遺伝子または遺伝子断片をクローニングするために、または核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（この一方または両方が標識されている場合がある）をＰＣＲプライマーとして使用できる。一般に、オリゴヌクレオチドは、合成により、好ましくは核酸合成装置において調製する。
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」もしくは「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」とは、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある連続した２個以上のアミノ酸を指す。
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の連続した鎖を含む。本発明の好ましいペプチドには、配列番号２または配列番号１２のいずれかに示されるペプチド、ならびにこれらの変異体および断片が含まれる。このような断片は、配列番号２または配列番号１２のうちのいずれか由来の少なくとも約１０個（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個）、より好ましくは少なくとも約２０個（２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０個）、およびさらに好ましくは少なくとも約４２個（４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０個）以上の連続するアミノ酸残基を含むことが好ましい。
本発明はまた、配列番号２または配列番号１２のうちのいずれか由来の少なくとも約７個（例えば、９、１０、１３、１５、１７、１９個）、好ましくは少なくとも約２０個（例えば、２２、２４、２６、２８個）、より好ましくは少なくとも約３０個（例えば、３２、３４、３６、３８個）、およびさらに好ましくは少なくとも約４０個（例えば、４１、４２個）の連続するアミノ酸からなるポリペプチド、好ましくは抗原ポリペプチドも包含する。
本発明のポリペプチドは、無傷のペプチドのタンパク質分解的切断により、化学合成により、または組換えＤＮＡ技術の適用によって作製することができ、タンパク質分解による切断部位によって線引きされたポリペプチドに限定されない。これらのポリペプチドは、単独で、またはこのポリペプチドの免疫原性を高めるために架橋するか、もしくは担体分子と複合体化して、抗体およびこのフラグメントの生産を惹起するための抗原として有用である。この抗体は、例えば、免疫親和性精製のため、またはＮＰＣ１Ｌ１の阻害などのためにイムノアッセイにおいて使用できる。
用語「単離ポリヌクレオチド」または「単離ポリペプチド」とは、それぞれ、細胞中にまたは組換えＤＮＡ発現系に通常見られる他の成分から部分的にもしくは完全に分離されているポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子、または混合ポリマー）またはポリペプチドを包含する。これらの成分として、これに限らないが、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来ゲノム配列が挙げられる。
単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本質的に同種の分子組成であるが、いくらかの異成分を含み得ることが好ましい。
ここで、ＤＮＡの「増幅」とは、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を高めるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することを示し得る。ＰＣＲの説明については、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８）２３９：４８７頁参照。
用語「宿主細胞」とは、この細胞による物質の生産、例えば、この細胞による遺伝子、ＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列またはタンパク質の発現または複製のために、何らかの方法によって選択され、改変され、トランスフェクトされ、形質転換され、増殖され、または使用され、もしくは操作される、いずれかの生物のいずれかの細胞を包含する。好ましい宿主細胞として、ＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ネズミマクロファージＪ７７４細胞、または他のいずれかのマクロファージ細胞株、およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
核酸のヌクレオチド配列は、当分野で公知のいずれかの方法（例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定）によって決定できる。ＤＮＡの「化学的配列決定法」として、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０頁）の方法などが挙げられ、この方法では、個々の塩基特異的反応を利用してＤＮＡがランダムに切断される。ＤＮＡの「酵素的配列決定法」として、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３頁）の方法などが挙げられる。
本明細書における核酸には、天然の調節（発現制御）配列をフランキングすることができ、またはプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域および３’非コード領域などをはじめとする異種配列を結合することもできる。
一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼと（例えば、直接または他のプロモーター結合タンパク質もしくはプロモーター結合物質を介して）結合し、コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、この３’末端において転写開始部位に隣接し、上流（５’方向）に延びて、任意のレベルにおいて転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。このプロモーター配列内には、転写開始部位（好都合なことに、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、見られる場合がある。このプロモーターは、エンハンサー配列およびレプレッサー配列をはじめとする他の発現制御配列に、または本発明の核酸に、機能し得る形態で結合できる。遺伝子発現を制御するために使用できるプロモーターとして、これに限らないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４から３１０頁）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７から７９７頁）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１から１４４５頁）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９から４２頁）；原核生物発現ベクター（β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７から３７３１頁）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１から２５頁）など）；「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ （１９８０）２４２：７４から９４頁もまた参照；ならびに酵母もしくは他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターが挙げられる。
コード配列は、細胞における転写制御配列および翻訳制御配列がこのコード配列の、ＲＮＡポリメラーゼが媒介するＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへの転写を命令し、次いでこれが（イントロンを含む場合には）ＲＮＡスプライシングを受け、場合により、このコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合に、転写制御配列よび翻訳制御配列「の制御下にある」、「と機能的に結合している」、または「に機能し得る形態で結合されている」。
用語「発現する」および「発現」とは、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が現れるのを可能にすることまたはこれを引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することにより、タンパク質を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は、「発現生成物」、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質を形成するために細胞においてまたは細胞によって発現される。この発現生成物自体もまた、この細胞によって「発現される」といえる。
用語「形質転換」とは、核酸の細胞への導入を意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受け入れている宿主細胞は、「形質転換され」ており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または同じ種の細胞を含む任意の供給源に由来することができ、異なる属または異なる種の細胞に由来することができる。
用語「ベクター」は、媒体（例えば、プラスミド）を包含する。これにより、宿主を形質転換し、場合によって導入された配列の発現および／または複製を促進するために、宿主細胞にＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を導入できる。
本発明において使用できるベクターとして、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片、および宿主ゲノムへの核酸の導入を容易にできる他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供し、当分野で公知であるかまたは公知となる他の全ての形態のベクターが本明細書における使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ参照。
用語「発現系」とは、適切な条件下で、ベクターにより保有され、宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を発現できる、宿主細胞および適合ベクターを意味する。一般的な発現系として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて従来の方法により実施できる。大腸菌宿主細胞は、原核生物系において最も頻繁に使用されるが、他の多くの細菌、例えばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）やバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種々の株が当分野で知られており、これらのものも同様に使用できる。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸を発現させるのに適した宿主細胞として、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物には、グラム陰性生物およびグラム陽性生物、例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方が含まれる。高等真核生物には、非哺乳動物起源、例えば、昆虫細胞および鳥類と、哺乳動物起源、例えば、ヒト、霊長類および齧歯類の両方の動物細胞由来の確立された組織培養細胞系が含まれる。
原核生物宿主−ベクター系には、多くの異なる種に対する幅広い種類のベクターが含まれる。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターとして、ｐＢＲ３２２または多数のこの誘導体（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）がある。ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを発現させるために使用できるベクターとして、これに限らないが、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むベクター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーターを含むベクター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターもしくはλ−ｐＲプロモーターを含むベクター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃなどのハイブリッドプロモーターを含むベクター（ｐＤＲ５４０）が挙げられる。Ｂｒｏｓｉｕｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ （編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，２０５から２３６頁参照。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号、ならびにＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２０３５から２０３９頁；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３から１３０頁；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５から１３５頁およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：２５９頁に開示されているような、大腸菌／Ｔ７発現系において、高レベルで発現され得る。
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの組換え生産に使用できる。昆虫バキュロウイルス発現系をはじめ、あらゆる高等真核生物組織培養細胞系を使用できるが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は通常の手順となっている。有用な細胞株の例として、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。このような細胞株に対する発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子も含む。適した発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例として、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６頁）、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３頁）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびこれらの誘導体、ならびにｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０などのバキュロウイルスベクターが挙げられる。本発明の一実施態様は、膜結合型ＮＰＣ１Ｌ１を包含する。この実施態様では、ＮＰＣ１Ｌ１は、真核細胞の細胞膜において発現され得、この膜結合型タンパク質は、当分野で公知の従来の方法により、この細胞から単離できる。
本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドおよびＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む融合物を包含する。本発明の融合物は、表１に示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのいずれか、またはこれらのいずれかの部分配列もしくは断片（上記）を含み得る。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはこの断片を発現ベクターに挿入することによって構築できることが好都合である。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。このようなタグとして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグおよびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａもまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用できる。このような融合物の構築法および使用法は、極めて従来的であり、当分野では周知である。
ポリペプチドにおいて生じる修飾（例えば、翻訳後修飾）は、このポリペプチドがどのように作製されるかということの関数であることが多い。遺伝子クローンを宿主において発現させることによって作製されるポリペプチドについては、例えば、この修飾の性質および程度は、主に、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびこのポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、大腸菌などの細菌宿主では起こらないことが多い。従って、グリコシル化が望まれる場合には、ポリペプチドを、グリコシル化宿主、通常、真核細胞において発現させることができる。昆虫細胞は、哺乳動物細胞のものと同様の翻訳後グリコシル化を行うことが多い。こういう理由で、昆虫細胞発現系は、グリコシル化の天然パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発されてきた。本発明において使用できる昆虫細胞は、昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）分類の生物に由来するあらゆる細胞である。昆虫は、スポドプテラ・フルイギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｉｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９もしくはＳｆ２１）またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｈｉｇｈ ５）であることが好ましい。本発明に関して、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを製造するために使用できる昆虫発現系の例として、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。必要に応じて、脱グリコシル化酵素を用いて、真核生物発現系での生産の間に結合した糖質を除去できる。
また、他の修飾として、ポリペプチドカルボキシル末端への脂肪族エステルまたはアミドの付加も挙げられる。本発明はまた、修飾、例えば、非天然アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基もしくはホスホトレオニン残基）の組込みを含むＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド類似体も包含する。可能性ある他の修飾として、スルホン化、ビオチン化または他の部分の付加が挙げられる。例えば、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドには、被験体の体内でのペプチドの半減期を延長するポリマーが結合できる。好ましいポリマーとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量が２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａおよび４０ｋＤａであるＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。
本発明のペプチドはまた、環化してもよい。具体的には、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドのアミノ末端残基もしくはカルボキシ末端残基、または本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの２つの内部残基を融合して、環化ペプチドを作製できる。ペプチドを環化する方法は、従来法であり、当分野では極めて周知である。例えば、Ｇｕｒｒａｔｈら、（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：９１１から９２１頁参照。
本発明は、本発明のポリペプチドに対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列へのあらゆる表面的な修飾またはわずかな修飾も意図する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸の配列保存的変異体を意図する。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」は、所与のコドンの１個またはそれ以上のヌクレオチドが変化しても、この位置においてコードされるアミノ酸には変化が起こらない変異体である。本発明のポリペプチドの機能保存的変異体もまた、本発明によって意図される。「機能保存的変異体」は、タンパク質または酵素中の１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、このポリペプチドの全体的な立体構造および機能を変えずに、変化している変異体であり、アミノ酸の類似特性を有するアミノ酸での置換を含むが、これに限らない。類似特性を有するアミノ酸は当分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸として、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ、交換可能であり得る酸性アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸として、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
本発明は、ラットＮＰＣ１Ｌ１、ヒトＮＰＣ１Ｌ１もしくはマウスＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよびこの断片、ならびにこれらのポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、これらの核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。核酸分子は、一本鎖形態のこの核酸分子が適切な状態の温度および溶液イオン強度下で別の核酸分子にアニーリングできる場合に（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、参照）、この別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡと「ハイブリダイズ可能である」。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。典型的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドは含まない、４２℃にて；または３０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４２℃にて、である。典型的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションを４０％ホルムアミド中、５Ｘ ＳＳＣもしくは６Ｘ ＳＳＣを用いて４２℃にて実施することを除き、低ストリンジェンシー条件と同じである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション条件を５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣもしくは６Ｘ ＳＳＣ中、場合により、高温（例えば、４２℃：５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃より高い温度）にて実施することを除き、低ストリンジェンシー条件と同じである。通常、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、当分野においては周知の変数である、核酸の長さや相補性の程度に応じて変わる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高まる程、これらの核酸がハイブリダイズできるストリンジェンシーが高くなる。１００ヌクレオチド長より長いハイブリッドについては、この融解温度を算出するための式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．５０−９．５１参照）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）を用いるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、このオリゴヌクレオチドの長さによりこの特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲参照）。
また、本発明には、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（このアルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間で最大のマッチが得られるように選択される）により比較を実行した場合に、参照ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号１または配列番号５から１０のうちのいずれか）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号２）、参照ヒトＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号３）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号４）または参照マウスＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号１１または配列番号１３のうちのいずれか）およびアミノ酸配列（例えば、配列番号１２）に対して、少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、および最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）である、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびこのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（このアルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間で最大のマッチが得られるように選択される）により比較を実行した場合に、配列番号２の参照ラットＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４の参照ヒトＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列または配列番号１２の参照マウスＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、および最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に包含される。
配列同一性とは、比較されている２配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間での正確なマッチを指す。配列類似性とは、比較されている２つのポリペプチドのアミノ酸間での正確な一致、および同一でない、生化学的に関連するアミノ酸間のマッチの両方を指す。類似特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸については、上記で論じている。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は参照により本明細書に組み込まれる：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３から４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６から２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１から１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９から３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９から６５６頁；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９から１６３頁；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら、（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７から７０頁；アライメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」 Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）第５巻、付録３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ （編）、３４５から３５２頁，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら、「Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ」 Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）第５巻、付録３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ （編）、３５３から３５８頁，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５から５６５頁；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６から７０頁；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５から１０９１９頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０から３００頁；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４から２２６８頁；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３から５８７７頁；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２から２０３９頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」 Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）１から１４頁，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
タンパク質精製
本発明のタンパク質、ポリペプチドおよび抗原フラグメントは、標準的な方法によって精製でき、このような方法として、これに限らないが、塩析沈殿もしくはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、上記で論じたような精製タグ付ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドとともに使用する）、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、ならびに向流分配が挙げられる。このような精製方法は、当分野で周知であり、例えば、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示されている。
精製段階の後には、以下に記載されるような受容体結合活性についてのアッセイを実施することができる。特に、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが細胞供給源もしくは組織供給源から単離されている場合には、アッセイ系に１種またはそれ以上のタンパク質分解酵素の阻害剤、例えばフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチンおよびＥＤＴＡを含めることが好ましい。
抗体分子
本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドの抗原フラグメント（免疫原性を有するものを含む）（例えば、配列番号２、４または１２由来の４２個以上の連続するアミノ酸）は、本発明の範囲内にある。抗原ペプチドは、とりわけ、ＮＰＣ１Ｌ１を認識する単離抗体分子を調製するのに有用であり得る。単離抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、有用なＮＰＣ１Ｌ１リガンドである。
抗原は、抗体と特異的に結合し得る分子である。いくつかの抗原は、単独では抗体生成を惹起し得ない。抗体生成を誘導できるものは免疫原である。
単離抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体は、配列番号３９から４２から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性ペプチド（例えば、ラットＮＰＣ１Ｌ１由来の抗原）を認識することが好ましい。この抗体は、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０７１７、Ａ０７１８、Ａ０８６７、Ａ０８６８、Ａ１８０１またはＡ１８０２であることがより好ましい。
用語「抗体分子」は、これに限らないが、抗体およびこのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含する。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントおよびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
必ずしも必要ではないが、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドが、免疫適格宿主において抗体生成を惹起するための抗原として使用される場合には、より小さい抗原フラグメントは、まず、架橋もしくはコンカテネーションにより、または免疫原性担体分子（すなわち、宿主動物において免疫学的応答を独立して惹起する特性を有する高分子、例えばジフテリア毒素または破傷風毒素）とのカップリングにより、免疫原性が高められることが好ましい。小さいポリペプチドフラグメントは、ハプテン（抗体と特異的に結合できるが、抗体生成を惹起することはできない（すなわち、免疫原性ではない）分子）として作用することがあるため、架橋または担体分子との複合体化が必要である場合がある。このようなフラグメントを免疫原性担体分子と複合体化することで、一般的には「担体効果」として知られるものにより、このようなフラグメントの免疫原性が高められる。
担体分子として、例えば、タンパク質および天然高分子化合物または合成高分子化合物、例えば、ポリペプチド、多糖、リポ多糖などが挙げられる。タンパク質担体分子が特に好ましく、このようなものとして、これに限らないが、キーホールリンペットヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク質、例えば、ヒトガンマグロブリンもしくはウシガンマグロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンもしくはウサギ血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘導体もしくは他の誘導体が挙げられる。他のタンパク質担体については、当業者には明らかである。このタンパク質担体は、このフラグメントに対する抗体が惹起される宿主動物に対して外来のものであることが好ましい。
担体分子との共有結合は、当分野で周知の方法を使用して達成でき、この正確な選択は、使用される担体分子の性質によって決定される。この免疫原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のフラグメントは、例えば、水溶性カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを使用して結合することができる。
これらのようなカップリング剤はまた、別の担体分子を使用することなく、このフラグメントをこれら自体に架橋するためにも使用できる。このような凝集体への架橋もまた、免疫原性を高め得る。免疫原性はまた、既知のアジュバントを単独で使用することによって高めることができるし、カップリングもしくは凝集と組み合わせて使用することによっても高めることができる。
動物のワクチン接種のためのアジュバントとして、これに限らないが、アジュバント６５（ピーナッツオイル、モノオレイン酸マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびモノステアリン酸アルミニウムを含有）；フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント；鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン；界面活性剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオールなど；ポリアニオン、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポールなど；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシンなど；ならびに油性乳剤が挙げられる。本ポリペプチドはまた、リポソームまたは他の微小担体に組み込んだ後に投与してもよい。
アジュバントおよびイムノアッセイの種々の側面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎによるシリーズ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに開示されている。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を包含する他の有用な参考文献として、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９，Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９６２，Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻，１９６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋが挙げられる。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子は、ヒトＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１またはラットＮＰＣ１Ｌ１を認識することが好ましいが、本発明は、あらゆる種、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネコ、ヒツジまたはウマ）に由来するＮＰＣ１Ｌ１を認識する抗体分子を包含する。本発明はまた、本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドと抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子とを含む複合体も包含する。このような複合体は、抗体分子をこの同種ポリペプチドと接触させるだけで生成し得る。
本発明の抗体分子の作製には、種々の方法が使用できる。ヒト抗体は、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；同第５，８７７，３９７号；同第６，２５５，４５８号；同第６，０２３，０１０号および同第５，８７４，２９９号に開示されている方法と同様の方法によって作製できる。
モノクローナル抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、当分野で一般的に知られている方法によって作製できる。これらの方法として、これに限らないが、最初にＫｏｈｌｅｒら、（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５から４９７頁）によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら、（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１から２１６頁およびＨａｇｉｗａｒａら、（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２およびＣｏｔｅら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６から２０３０頁）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７から９６頁，１９８５）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞が抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体を発現しているか否かを調べるためには、ＥＬＩＳＡを使用できる。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子はまた、組換えによっても（例えば、上記で論じたような大腸菌／Ｔ７発現系において）製造できる。この実施態様では、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸を、ｐｅｔ系プラスミドに挿入し、大腸菌／Ｔ７系において発現させることができる。当分野で公知である、組換え抗体を製造するための方法がいくつかある。抗体の組換え製造のための方法の一例が、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。また、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８から１０４１頁；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１から１０４３頁およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３から４２６頁も参照のこと。
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、天然に存在する突然変異が少量で存在し得る可能性を除いて同一である）を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって本質的に汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成され得るという点において有利である。修飾語「モノクローナル」とは、この抗体の特徴を、実質的に均質な抗体集団から得られたものであるとして示し、いずれかの特定の方法によるこの抗体の製造を必要とすることと解釈されるべきではない。本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁によって記載されているようなハイブリドーマ方法によって製造できる。
用語「ポリクローナル抗体」は、他の１種またはそれ以上の同一でない抗体の中で、またはこのような抗体の存在下で製造される抗体を包含する。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を生成した他のいくつかのＢリンパ球の存在下で、あるＢリンパ球から生成される。一般に、ポリクローナル抗体は、免疫化した動物（例えば、ウサギ）から直接得られる。
「二重特異性抗体」は、別個の抗原と結合する２つの異なる抗原結合領域を含む。二重特異性抗体、ならびにこの抗体の作製法および使用法は、従来的であり、当分野で極めて周知である。
抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプとは、別の抗体分子の抗原結合領域または可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対して向けられる抗体である。Ｊｅｒｎｅ（Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．，（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５ｃ：３７３頁およびＪｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．ら、（１９８２）ＥＭＢＯ １：２３４頁）により開示されているように、所与の抗原（例えば、ＮＰＣ１Ｌ１）に対するパラトープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫化で、抗抗体群が生成し、この抗抗体のいくつかは、この抗原と、このパラトープに対する相補的構造を共有する。抗イディオタイプ抗体の部分集団による免疫化で、次いで最初の抗原に対して反応性である抗体部分集団または免疫細胞サブセットが生成する。
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列だけを含む抗体を指す。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列だけを含む抗体を指す。
「ヒト／マウスキメラ抗体」とは、ヒト定常領域と融合されたマウス可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む抗体を指す。
「ヒト化」抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヒト化型非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、キメラ免疫グロブリンであり、このキメラ免疫グロブリンは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列しか含まない。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラットまたはウサギの相補性決定領域由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基もまた、対応する非ヒト残基によって置換されている。
「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーによってこのｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となる。単鎖抗体の製造について記載されている技術（米国特許第５，４７６，７８６号；同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号）を、抗ＮＰＣ１Ｌ１特異的単鎖抗体の製造に適応させることができる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，２６９から３１５頁 （１９９４）参照。
「ジスルフィドによって安定化されたＦｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって連結された可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する分子を包含する。
本発明の範囲内にある抗体フラグメントはまた、ＩｇＧの酵素的切断により（例えば、ペプシンにより）生じ得るＦ（ａｂ）２フラグメントを包含する。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いたＦ（ａｂ）２の還元によっても生じ得る。
Ｆｖフラグメントは、ＶＬ領域またはＶＨ領域である。
免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従って、種々のクラスへ割り当てることができる。免疫グロブリンについては、少なくとも５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）に分けることができる。
本発明の抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体分子はまた、化学的部分とも結合させることができる。この化学部分は、とりわけ、ポリマー、放射性核種または細胞傷害性因子であり得る。この化学部分は、被験体の体内でのこの抗体分子の半減期を延長するポリマーであることが好ましい。適したポリマーとして、これに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、分子量が２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａであるＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。米国特許第６，１３３，４２６号に記載されているＰＥＧ化抗ＩＬ−８抗体を製造する方法を、本発明のＰＥＧ化抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体の製造に適応させることができる。Ｌｅｅら、（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３から９８１頁）は、ＰＥＧ結合単鎖抗体について開示している。Ｗｅｎら、（２００１）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５から５５３頁）は、抗体と、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））と結合したＰＥＧとの複合体形成について開示している。
本発明の抗体分子はまた、標識、例えば、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒまたは５６Ｆｅとも結合させることができる。
本発明の抗体分子はまた、フルオロフォア、例えば、希土類キレート、フルオレセインおよびこの誘導体、ローダミンおよびこの誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定フリーラジカルをはじめとする、蛍光標識または化学発光標識とも結合させることができる。
この抗体分子はまた、細胞傷害性因子、例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトイアッカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）とも結合させることができる。
本発明の抗体分子を種々の部分と結合するための当分野で公知の方法であればいずれを使用してもよく、これらの方法として、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５頁；Ｄａｖｉｄら、（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４頁；Ｐａｉｎら、（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９頁およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．，（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７頁が挙げられる。
抗体を複合体化する方法は、従来的であり、当分野で極めて周知である。
スクリーニングアッセイ
本発明は、血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの上昇をはじめとする、種々の医学的状態の処置および管理において有用であり得る、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４または１２）の選択的リガンドの同定を可能にする。従って、本発明のＮＰＣ１Ｌ１は、リガンドを同定するためにスクリーニング系において使用できる。これらのリガンドは、ＮＰＣ１Ｌ１のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。本質的には、これらのアッセイは、（１）ＮＰＣ１Ｌ１、（２）適切な既知のＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、ステロール（コレステロール、フィトステロール（これに限らないが、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールおよびアベノステロール（ａｖｅｎｏｓｔｅｒｏｌ）が挙げられる）など）、コレステロール酸化生成物、５α−スタノール（これに限らないが、コレスタノール、５α−カンペスタノールおよび５α−シトスタノールが挙げられる）、置換アゼチジノン（例えば、エゼチミブ）、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブ（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７から９３頁）またはＤｅＮｉｎｎｏら、（１９９７）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０ （１６）：２５４７から５４頁）に記載されているような１１−ケトチゴゲニンの４”，６”−ビス［（２−フルオロフェニル）カルバモイル］−β−Ｄ−セロビオシル誘導体または任意の置換アゼチジノン、ならびに（３）候補ＮＰＣ１Ｌ１リガンドの存在について調べようとする試料を用いることにより、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供する。
用語「特異的」とは、例えば、スクリーニングアッセイにおけるＮＰＣ１Ｌ１とリガンドの結合を説明するために用いられる場合には、リガンドまたはアンタゴニスト（例えば、置換アゼチジノン、エゼチミブ、ステロール（コレステロールなど）もしくは５α−スタノール）が、アッセイ系にある他のタンパク質と比べて、ＮＰＣ１Ｌ１と優先的に結合する程度を指す、専門用語である。例えば、ＮＰＣ１Ｌ１と特異的に結合するＮＰＣ１Ｌ１のリガンドの特異的結合の検出は、このような結合を示すアッセイによって生じたシグナルが、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１またはリガンドが不在である陰性対照で生じたシグナルよりも少しでも強い場合に顕在化される。さらに、「特異的結合」は、ＮＰＣ１Ｌ１を一部分とする複合体における、リガンドのＮＰＣ１Ｌ１との直接結合または間接的な結合（例えば、別の部分を介した結合）を包含する。ＮＰＣ１Ｌ１リガンドが結合する部分は、別のタンパク質またはＮＰＣ１Ｌ１の翻訳後修飾（例えば、脂質鎖または炭水化物鎖）であり得る。
スクリーニングアッセイにおける使用に適した置換アゼチジノンの非限定的な例として、米国特許第ＲＥ３７，７２１号；同第５，６３１，３６５号；同第５，７６７，１１５号；同第５，８４６，９６６号；同第５，６８８，９９０号；同第５，６５６，６２４号；同第５，６２４，９２０号；同第５，６９８，５４８号；同第５，７５６，４７０号；同第５，６８８，７８７号；同第５，３０６，８１７号；同第５，６３３，２４６号；同第５，６２７，１７６号；同第５，６８８，７８５号；同第５，７４４，４６７号；同第５，８４６，９６６号；同第５，７２８，８２７号；同第６，６３２，９３３号および米国特許出願公開番号２００３／０１０５０２８（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。
本発明は、試料が、既知のリガンド（例えば、エゼチミブ、エゼチミブ−グルクロニド、化合物２など）とＮＰＣ１Ｌ１との結合について競合する候補化合物を含むか否かを判定することにより、この試料がＮＰＣ１Ｌ１リガンドを含むか否かを評価する方法を提供する。このリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。本発明の一実施態様では、既知のリガンド（例えば、エゼチミブ、エゼチミブ−グルクロニド、化合物２など）とＮＰＣ１Ｌ１の結合が混乱をきたす。用語「既知のリガンド」とは、ＮＰＣ１Ｌ１と結合することが知られている化合物で、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイおよび方法に用いるために、検出可能なように標識することができる化合物を指す。「既知のリガンド」には、本明細書に記載されるようなスクリーニングアッセイに用いるために、検出可能なように標識できる置換２−アゼチジノングルクロニドが含まれる。
エゼチミブは、当業者に周知の種々の方法（例えば、米国特許第５，６３１，３６５号、同５，７６７，１１５号、同５，８４６，９６６号、同６，２０７，８２２号、米国特許出願公開番号２００２／０１９３６０７およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０２０４８（これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている方法など）によって調製できる。
「試料」、「候補化合物」または「候補物質」とは、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２）またはこの機能的断片と結合する能力について、試験またはアッセイにおいて評価される化合物または組成物を指す。この組成物は、候補化合物、例えば、小分子、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、素粒子（例えば、α粒子、β粒子）または抗体を含み得る。
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１と結合する化合物のリガンドを同定する方法を提供し、この方法は、ＮＰＣ１Ｌ１を、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノン、好ましくは置換２−アゼチジノン−グルクロニドと候補化合物とに接触させること、およびこの候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合するか否かを判定することを含み、前記候補化合物とＮＰＣ１Ｌ１との結合が検出可能なように標識した置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合を調節する。候補化合物をＮＰＣ１Ｌ１に結合させることによる置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合の調節は、この候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合するリガンドであることを示す。この調節はまた、この候補化合物がｉｎ ｖｉｖｏでのステロールと５α−スタノールの吸収阻害薬であり得るという良い指標である。
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供し、この方法は、ＮＰＣ１Ｌ１を、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノン、好ましくは置換２−アゼチジノングルクロニドと接触させること、および候補化合物の存在下および不在下で、ＮＰＣ１Ｌ１と検出可能なように標識した置換２−アゼチジノンとの結合を測定することを含み、候補化合物の存在下での、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノンとＮＰＣ１Ｌ１との結合の減少が、前記候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１のリガンドであり、ステロールと５α−スタノールの吸収阻害薬であることを示す。
置換２−アゼチジノンは、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉで検出可能なように標識されるか、または蛍光標識された置換２−アゼチジノンである。置換２−アゼチジノンは、３５Ｓまたは１２５Ｉ、特に３５Ｓで標識されることが好ましい。
置換２−アゼチジノンは置換２−アゼチジノングルクロニドであることが好ましい。置換２−アゼチジノングルクロニドである化合物は、以下の構造（Ｉ）を有する化合物である：
Figure 0004590417
 （式中、Ｘ１はグルクロニドと４−フェニル環を連結する基、例えば、これに限らないが、−Ｏ−または−Ｃ１−３アルキル−を表し、Ｘ２は場合によって置換されていてもよい−アルカンジイル−を表し、フェニル基はいずれも場合によって置換されていてよい）。構造（Ｉ）中のフェニル−Ｘ２−部分の例として、以下の構造（ＩＩ）において示される２−アゼチジノン構造の４位に表されているものが挙げられる。置換２−アゼチジノングルクロニドのさらなる例として、これに限らないが、米国特許第５，７５６，４７０号、ＷＯ０２／０６６４６４およびＵＳ２００２／０１３７６８９に記載されているものが挙げられる。置換２−アゼチジノングルクロニド化合物のさらなる例として、以下のような構造（ＩＩ）を有するものならびにこの医薬として許容される塩およびこのエステルが挙げられる：
Figure 0004590417
 （式中、
Ａｒ１はアリールおよびＲ４−置換アリールからなる群から選択され、
Ｘ、ＹおよびＺは独立して−ＣＨ２−、−ＣＨ（Ｃ１−６アルキル）−および−Ｃ（Ｃ１−６アルキル）２−からなる群から選択され、
Ｒは−ＯＲ６、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ９、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ６Ｒ７、糖残基、二糖残基、三糖残基および四糖残基からなる群から選択され、
Ｒ１は−Ｈ、−Ｃ１−６アルキルおよびアリールからなる群から選択されるか、またはＲおよびＲ１は一緒になってオキソであり、
Ｒ２は−ＯＲ６、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ９および−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３は−Ｈ、−Ｃ１−６アルキルおよびアリールからなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は一緒になってオキソであり、
ｑ、ｒおよびｔは各々独立して０および１から選択され、
ｍ、ｎおよびｐは各々独立して０、１、２、３および４から選択され、
Ｒ４は、独立して各々存在するごとに：
−ＯＲ５、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ８、−Ｏ−Ｃ１−５アルキル−ＯＲ５、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＯ）Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＯ）ＯＲ８、−ＮＲ５（ＣＯ）ＮＲ６Ｒ７、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ８、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ５、−ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ｔＲ８、−Ｏ−Ｃ１−１０アルキル−ＣＯＯＲ５、−Ｏ−Ｃ１−１０アルキル−ＣＯＮＲ５Ｒ６およびフルオロからなる群から選択される１から５個の置換基であり、
Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して各々存在するごとに−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、アリールおよびアリール置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ８は独立してＣ１−６アルキル、アリールおよびアリール置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ９は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＲ１０Ｒ１１、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−（ＣＨ２）３−ＮＲ１０Ｒ１４からなる群から選択され、
Ｒ１０は独立して各々存在するごとに−Ｈおよび−Ｃ１−３アルキルから選択され、
Ｒ１１は−Ｈ、−Ｃ１−３アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−３アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１０Ｒ１０、−ＳＯ２−Ｃ１−３アルキルおよび−ＳＯ２−フェニルからなる群から選択され、
Ｒ１２は
Figure 0004590417
 から選択され、
Ｒ１３は−ＯＨおよび−ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択され、
Ｒ１４は−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−３アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１０Ｒ１０、−ＳＯ２−Ｃ１−３アルキルおよび−ＳＯ２−フェニルからなる群から選択される）。
式ＩＩの一実施態様では、ｑおよびｒの少なくとも一方が１であり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒの合計が１、２、３、４、５または６であるという条件で、ならびにｐが０であり、ｒが１である場合に、ｍ、ｑおよびｎの合計が１、２、３、４または５であるという条件で、ｑ、ｒおよびｔが各々独立して０および１から選択され、ｍ、ｎおよびｐが各々独立して０、１、２、３および４から選択される化合物がある。式ＩＩの第２の実施態様では、次式ＩＩａの化合物がある。
Figure 0004590417
こうした各実施態様の種類として、Ｒ９が−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＲ１０Ｒ１１である化合物がある。こうした各実施態様のもう１つの種類として、Ｒ９が−ＳＯ２−基を含む、すなわち、Ｒ９が−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−ＮＲ１０Ｒ１１、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１、−（ＣＨ２）３−ＮＲ１０−ＳＯ２−Ｃ１−３アルキルおよび−（ＣＨ２）３−ＮＲ１０−ＳＯ２−フェニルからなる群から選択され、Ｒ１１が−ＳＯ２−Ｃ１−３アルキルおよび−ＳＯ２−フェニルから選択される化合物がある。
用語「アルキル」とは、指定数の炭素原子を有する、分枝鎖飽和脂肪族一価炭化水素基および直鎖飽和脂肪族一価炭化水素基の両方を包含するよう意図されている。アルキル基の例として、これに限らないが、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル（Ｐｒ）、ｎ−ブチル（Ｂｕ）、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびこれらの異性体、例えば、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｓｅｃブチル（ｓ−Ｂｕ）、ｔｅｒｔブチル（ｔ−Ｂｕ）、イソペンチル、イソヘキシルなどが挙げられる。名づけられたアルキル基に指定の接頭語（ｎｏｒｍａｌの場合には「ｎ−」、ｓｅｃの場合には「ｓ−」、ｔｅｒｔの場合には「ｔ−」、イソの場合には「ｉ−」など）が付いていなければ、この名づけられたアルキル基がｎ−アルキル基（すなわち、「プロピル」は「ｎ−プロピル」である）であるよう意図されている。用語「アリール」とは、フェニル（Ｐｈ）、ナフチル、インデニル、テトラヒドロナフチルまたはインダニルを包含するよう意図されている。フェニルが好ましい。
Ｒ１２がグルクロニドまたはメチルエステルグルクロニドである場合のＲ１２のヒドロキシル基の適した保護基（本明細書中では「ＰＧ」と表される）として、これに限らないが、炭水化物保護基として有用であることが知られているもの、例えばベンジル、アセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、トリメチルシリル、パラ−メトキシベンジル、ベンジリジンおよびメトキシメチルなどが挙げられる。このような保護基を選択的に加え、除去するのに必要な条件は、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ，ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９のような標準的な教本に見られる。
式ＩＩの化合物は、１またはそれ以上の不斉中心を含み得るため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一種のエナンチオマー、エナンチオマー混合物、ジアステレオマー混合物および単一種のジアステレオマーとして生じる場合があり、このような全ての異性体は式ＩＩの範囲内にある。
式ＩＩの化合物の放射性同位元素は、例えば、硫黄が「ホット」−３５Ｓ−で置き換えられている、特に放射性硫黄同位元素がＲ９部分に組み込まれている式ＩＩの化合物のようなアッセイにおいて特に有用である。ＮＰＣ１Ｌ１リガンドを同定するアッセイにおける式ＩＩの化合物のこのような全ての放射性同位元素の使用は、本発明の範囲内に含まれる。
用語「医薬として許容される塩」とは、一般に、遊離酸を適した有機塩基または無機塩基と反応させることによって調製される式ＩＩの化合物の毒性のない塩、特に、陽イオン（ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛およびテトラメチルアンモニウムなど）から形成されるもの、ならびにアミン（アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−ｐ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イル−メチルベンゾイミダゾール、ジエチルアミン、ピペラジン、モルホリン、２，４，４−トリメチル−２−ペンタミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど）から形成される塩を意味する。
式ＩＩの化合物が塩基性である場合には、塩は医薬として許容される毒性のない酸（無機酸および有機酸を含む）から調製できる。このような酸として、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸が特に好ましい。
医薬として許容されるエステルの例として、これに限らないが、−Ｃ１−４アルキルならびにフェニル、ジメチルアミノおよびアセチルアミノで置換された−Ｃ１−４アルキルが挙げられる。本明細書において、「Ｃ１−４アルキル」とは、１から４個の炭素原子を含有する直線脂肪族鎖または分枝脂肪族鎖、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを包含する。
構造式ＩＩの化合物は、適切な材料を用い、以下のスキームの手順に従って調製でき、以下の具体例によってさらに例示される。種々のクロマトグラフィー技術が式ＩＩの化合物の調製に使用できる。これらの技術として、これに限らないが、高速液体クロマトグラフィー（順相、逆相およびキラル相を含む）；超臨界流体クロマトグラフィー；分取薄層クロマトグラフィー；シリカゲルまたは逆相シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；およびラジアルクロマトグラフィーが挙げられる。特に断りのない限り、温度は全て摂氏温度である。
本明細書において使用されるいくつかの略語を示す：
Ａｃ アシル（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−）
Ｂｎ ベンジル
ｃａｌｃ． 理論値
セライト セライト（商標）珪藻土
デス・マーチン・ペルヨージナン １，１，１−トリス（アセチルオキシ）−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンゾドキソール−３−（１Ｈ）−オン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ｅｑｕｉｖ． 当量
ＥＳ−ＭＳ 電子スプレーイオン−質量分析
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ｈ 時間
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ｍｉｎ 分
ｍ．ｐ． 融点
ＭＳ 質量スペクトル
ｒ．ｔ．（またはｒｔ） 室温
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ｔｌｃ 薄層クロマトグラフィー
以下の一般スキームにより、構造式ＩＩ−４の化合物の合成法を説明する。全ての置換基は、特に断りのない限り、式ＩＩにおいて定義したとおりである。この方法では、ＩＩ−１を適したパラジウム触媒、例えば、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）または［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）など、およびヨウ化銅（Ｉ）の存在下でＩＩ−２タイプの末端アルキンで処理する。この反応は通常、不活性有機溶媒、例えば、ＤＭＦ中、室温から１００℃の間で６から４８時間行われ、この生成物は構造式ＩＩ−３の内部アルキンである。アルキンＩＩ−２は、ＩＩ−１との反応において対応する放射性標識付加物を提供するよう放射性原子、例えば、３５Ｓを含み得る。ＩＩ−３のＩＩ−４への変換は、有機合成分野の当業者には公知の種々の加水分解法を用いて達成できる。例えば、特に緩和加水分解プロトコールでは、メタノールと水を含む混合溶媒系でのＩＩ−３の第３級アミン塩基、例えば、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどでの処理を必要とする。この反応の生成物は構造式ＩＩ−４の化合物である。本明細書に記載される手順を利用することにより、当業者ならば、式ＩＩのさらなる化合物を容易に調製することができる。
Figure 0004590417
使用できる、さらなる２つのタイプのスクリーニング系として、標識したリガンド結合アッセイ（例えば、直接結合アッセイまたはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ））および「ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール取込み」アッセイがある。この結合アッセイに用いる標識リガンドは、ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは既知のＮＰＣ１Ｌ１アゴニストもしくは既知のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを、測定可能な基（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉまたは３Ｈ）で標識することによって得ることができる。種々の標識形態のステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールが市販されているが、標準的な技術を使用して作製することもできる（例えば、コレステロール−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］、コレステロール−［１，２，６，７−３Ｈ（Ｎ）］またはコレステロール−［７−３Ｈ（Ｎ）］；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。好ましい実施態様では、エゼチミブを、ＢＯＤＩＰＹ基で蛍光標識する（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７から９３頁）か、または検出可能な基、例えば３５Ｓ、１２５Ｉまたは３Ｈ、好ましくは３５Ｓで標識する。
（直接結合アッセイ） 一般に、本発明のＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１２）またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体の所定量を、漸増量の標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニスト（上記で論じたもの）と接触させ、結合していない標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストを洗浄により除去した後、標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストの結合量を測定する。標識リガンドまたは標識既知アゴニストもしくはアンタゴニストの量が増加するので、最終的には全ての受容体結合部位が占有されるか、または飽和状態になる点に到達する。大過剰の非標識リガンドまたは非標識既知アゴニストもしくはアンタゴニストにより、標識リガンドまたは標識既知アゴニストもしくはアンタゴニストの特異的受容体結合が無効にされる。
標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストと受容体との非特異的結合が最小限に抑えられるアッセイ系を使用することが好ましい。非特異的結合は、一般に、標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストの全結合の、５０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、および最も好ましくは５％未満である。
基本的な結合アッセイでは、ＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、
（ａ）ＮＰＣ１Ｌｌ（例えば、配列番号２もしくは４もしくは１２）、この断片またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体を、既知量の標識ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニスト（例えば、標識エゼチミブ）の存在下で、ＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの存在について調べようとする試料と接触させること、および
（ｂ）ＮＰＣ１Ｌ１と直接または間接的に結合した標識ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストの量を測定することを含む。
試料中のＮＰＣ１Ｌ１リガンドは、このようなリガンドの不在下で測定される結合と比較した、標識ステロール（例えば、コレステロール）もしくは５α−スタノールまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストとＮＰＣ１Ｌ１との直接または間接的結合の実質的な減少を測定することによって同定される。例えば、試料の存在下での［３Ｈ］−コレステロールとＮＰＣ１Ｌ１との直接または間接的結合の減少は、この試料が、ＮＰＣ１Ｌ１結合について［３Ｈ］−コレステロールと競合している物質を含むことを示唆する。
このアッセイには、ＮＰＣ１Ｌ１依存的リガンド（例えば、ステロール（コレステロールなど）または５α−スタノール）結合はいずれも起こらない対照実験を含めることができる。このアッセイでは、例えば、いずれの機能的ＮＰＣ１Ｌ１も欠く全細胞または細胞膜、例えば、本発明のトランスジェニック突然変異型ｎｐｃ１ｌ１−マウスから単離されたか、または誘導された細胞もしくは膜を、リガンド結合ついてアッセイする。試料をＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在についてスクリーニングする場合には、調べられている試料の存在下で観察された結合のレベルを、本明細書に記載されるような、ＮＰＣ１Ｌ１依存的結合完全に起こらない対照実験でのレベルと比較することが有用である。理想的には、アンタゴニストを含む試料の存在下で観察される結合のレベルが対照実験のレベルと同じくらいになることであるが、必ずしもそうではない。
また、試料を、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４または１２）との結合について直接試験できる。このタイプの基本的アッセイには、以下の段階が含まれ得る：
（ａ）ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２）、この断片またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体を、標識候補化合物（例えば、［３Ｈ−エゼチミブ］と接触させる段階と、
（ｂ）この標識候補化合物とＮＰＣ１Ｌ１との直接または間接的結合を検出する段階。
また、これらの試験はＮＰＣ１Ｌ１依存的結合が完全に起こらない対照実験とともに実施され得る。例えば、このアッセイは、いずれの機能的ＮＰＣ１Ｌ１も欠く全細胞または細胞膜（例えば、本明細書に記載されるような、トランスジェニック突然変異型ｎｐｃ１ｌ１−マウスから誘導された細胞または細胞膜）を用いて実施できる。
ＮＰＣ１Ｌ１と結合することが分かった候補化合物は、（例えば、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの取込みを阻害することにより）ＮＰＣ１Ｌ１のリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。
本発明の一実施態様では、結合した候補化合物を、ガラス繊維フィルターを用いて濾過した後に定量する。この実施態様の一側面では、結合した候補化合物は、ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎより入手）でのシングルチューブ真空濾過後に検出される。フィルターは、非特異的結合を減少させるために、０．５％ポリエチレンイミンに浸漬することによって前処理してもよい。濾過は、氷冷バッファーをアッセイチューブに加え、フィルターを通じて混合物に注ぎ、次いでこのチューブとフィルターをさらなるバッファーで２回以上リンスすることにより達成される。このバッファーは、ＴｒｉｓバッファーまたはＭＥＳバッファー（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％コール酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ ６．７０）であり得る。フィルターは、シンチレーション液（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ ＤＭ ｌｉｑｕｉｄまたはＰａｃｋａｒｄ Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ＭＶ）を用いてカウントできる。
また、試料のＭｉｌｌｉｏｒｅ ９６−ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ）での真空濾過を用いることによっても、当業者に周知の方法で十分な精度を達成できる。
（ＳＰＡアッセイ） ＮＰＣ１Ｌ１リガンドはまた、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用しても測定できる。ＳＰＡアッセイは、従来的であり、当分野で極めて周知である。例えば、米国特許第４，５６８，６４９号参照。ＳＰＡでは、注目する標的を、直径約５ミクロンの小さなミクロスフェアに固定化する。ミクロスフェアは、通常、ポリヒドロキシフィルムでコーティングされた固体シンチラントコアを含み、さらにこれには、カップリング分子が含まれ、このカップリング分子がアッセイ設計のための遺伝子的連結を可能にする。放射性同位元素により標識された分子がミクロスフェアに結合すると、この放射性同位元素はシンチラントに近接することとなり、同位元素によって放出される電子からの有効なエネルギーの転移が起こり、この結果として光の放出がもたらされる。放射性同位元素は、自由溶液中に残存するが、シンチラントからは離れすぎており、電子は水性媒体にエネルギーを消散させるために、検出されないままである。シンチレーションは、シンチレーションカウンターを用いて検出できる。一般に、ＳＰＡには３Ｈ、１２５Ｉおよび３５Ｓ標識が適している。
受容体介在性結合事象についてのアッセイには、レクチンコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）を、ＳＰＡビーズカップリング分子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）として使用できる。このＷＧＡがカップリングしているビーズは、グリコシル化された細胞膜および糖タンパク質を捕捉し、これは幅広い種類の受容体供給源および培養細胞膜に使用されてきた。受容体は、ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ上に固定され、同位元素により標識されたリガンドが結合するとシグナルが生成される。受容体結合ＳＰＡアッセイに有用であり得る他のカップリング分子として、ポリ−Ｌ−リジンおよびＷＧＡ／ポリエチレンイミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。例えば、Ｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７ （付録７）：Ｓ１４３からＳ１４５；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．ら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：７０から７５頁；Ｋｉｅｎｈｕｓら、（１９９２）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８９から３９９頁；Ｊｉｎｇ，Ｓ．ら、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ９：１０６７から１０７９頁参照。
ＳＰＡビーズ中に含まれるシンチラントとして、例えば、ジフェニルアントラシン（ＤＰＡ）の固体溶媒として作用する、ケイ酸イットリウム（ＹＳｉ）、酸化イットリウム（ＹＯｘ）、ジフェニルオキサゾールまたはポリビニルトルエン（ＰＶＴ）が挙げられる。
ＳＰＡアッセイは、試料がＮＰＣ１Ｌ１リガンドを含むか否かを分析するために使用できる。これらのアッセイでは、細胞表面上にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２）を発現する宿主細胞またはこの膜画分が、ＳＰＡビーズ（例えば、ＷＧＡコーティングＹＯｘビーズまたはＷＧＡコーティングＹＳｉビーズ）とともにインキュベートされるか、またはこのビーズにより捕捉される。ＮＰＣ１Ｌ１を有するビーズを、標識された既知リガンドまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、３Ｈ−コレステロール、３Ｈ−エゼチミブ、１２５Ｉ−エゼチミブまたは３５Ｓ−エゼチミブ類似体）とともにインキュベートする。このアッセイ混合物は、調べようとする試料またはブランク（例えば、水）のいずれかをさらに含む。任意のインキュベーション後、シンチレーションカウンターを使用してシンチレーションを測定する。試料において、ＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストは、このようなリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの不在下で測定される蛍光（ブランク）と比較して、蛍光の実質的な減少が測定されることによって同定できる。蛍光の実質的な減少が測定されることにより、この試料が、直接または間接的ＮＰＣ１Ｌ１結合について既知リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストと競合する物質を含むことが示唆され得る。
また、試料は、ＳＰＡアッセイにおいて結合を直接検出することにより、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドとして同定できる。このアッセイでは、調べようとする候補化合物の標識したものを、ＳＰＡビーズに結合された、ＮＰＣ１Ｌ１を発現する宿主細胞またはこの膜画分と接触させることができる。次いで、標識候補化合物と、ＮＰＣ１Ｌ１またはＮＰＣ１Ｌ１を含む複合体を発現する宿主細胞または膜画分との複合体の存在を検出するために、蛍光をアッセイできる。ＮＰＣ１Ｌ１と直接または間接的に結合する候補化合物は、ＮＰＣ１Ｌ１アゴニスト活性またはＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト活性を保有し得る。
ＳＰＡアッセイはまた、ＮＰＣ１Ｌ１依存的結合が全く起こらない対照実験とともに実施できる。対照実験は、例えば、いずれの機能的ＮＰＣ１Ｌ１も欠く細胞または細胞膜（例えば、本明細書に記載されるような、トランスジェニック突然変異型ｎｐｃ１ｌ１−マウスから誘導された細胞または細胞膜）を用いて実施できる。対照実験を実施すると、アンタゴニストの存在について調べている試料の存在下で観察される結合のレベルを、対照実験で観察されるレベルと比較することができる。
（ステロール／５α−スタノール取込みアッセイ） アッセイは、試料が、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１介在性取込みをアゴナイズまたはアンタゴナイズし得るか否かを決定するために実施できる。これらのアッセイでは、細胞表面上にＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２）を発現する宿主細胞（上記で論じたもの）を、検出可能なように標識したステロール（例えば、３Ｈ−コレステロールもしくは１２５Ｉ−コレステロール）または５α−スタノールとともに、試料またはブランクのいずれかと接触させることができる。任意のインキュベーション後に、吸収されていないステロールまたは５α−スタノールを除去するため、この細胞を洗浄できる。ステロールまたは５α−スタノールの取込みは、宿主細胞における標識ステロールまたは５α−スタノールの存在を検出することによって決定できる。例えば、アッセイされる細胞またはこの溶解物もしくは画分（例えば、薄層クロマトグラフィーにより分離された画分）を、液体シンチラントと接触させ、シンチレーションカウンターを使用してシンチレーションを測定できる。
これらのアッセイでは、試料中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストは、このようなアンタゴニストの不在下で測定される取込みと比較して、標識ステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）または５α−スタノールの取込みの実質的な減少を測定することによって同定でき、アゴニストは、このようなアゴニストの不在下で測定される取込みと比較して、標識ステロール（例えば、３Ｈ−コレステロール）または５α−スタノールの取込みの実質的な増加を測定することによって同定できる。
取込みアッセイはまた、ＮＰＣ１Ｌ１依存的取込みが全く起こらない対照実験とともに実施できる。対照実験は、例えば、いずれの機能的ＮＰＣ１Ｌ１も欠く細胞（例えば、本明細書に記載されるような、トランスジェニック突然変異型ｎｐｃ１ｌ１−マウスから誘導された細胞）を用いて実施できる。対照実験を実施すると、アンタゴニストの存在について調べている試料の存在下で観察される取込みのレベルを、対照実験で観察されるレベルと比較することができる。
（ＮＰＣ１Ｌ１の供給源） 原理的には、本発明の結合アッセイは、本発明の可溶性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを、例えば、大腸菌発現系または他の原核生物もしくは真核生物発現系からの標準的な方法による生成およびリフォールディング後に使用して、実施できる。生じた受容体−標識リガンド複合体は、例えば、この受容体に対する抗体を使用して沈殿させることができる。次いで、この沈殿物を洗浄し、結合した標識リガンドまたはアンタゴニストもしくはアゴニストの量が測定できる。
また、ＮＰＣ１Ｌ１は膜結合型である。本発明のＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号２、４または１２）をコードする核酸を、適切な宿主細胞にトランスフェクトでき、これにより、ＮＰＣ１Ｌ１は、この細胞の膜に組み込まれる。次いで、この細胞から膜画分を単離し、アッセイのためのＮＰＣ１Ｌ１の供給源として使用できる。また、細胞表面においてＮＰＣ１Ｌ１を発現する全細胞をアッセイに使用してもよい。標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストと、非トランスフェクト宿主細胞／非形質転換宿主細胞との特異的結合または非トランスフェクト宿主細胞／非形質転換宿主細胞由来の膜画分との特異的結合は無視してよいものであることが好ましい。
上記スクリーニング系、例えば、直接結合、シンチレーション近接アッセイ、ステロール／５αスタノール取込みアッセイのためのＮＰＣ１Ｌ１の供給源として、種々の膜が直接使用できる。実施例５、６、７、８、９、１７、２７および２９に記載されるように、ＮＰＣ１Ｌ１は特定の組織、特に腸組織の刷子縁細胞において高度に発現される。従って、ＮＰＣ１Ｌ１の供給源として刷子縁膜（ＢＢＭ）小胞調製物を利用できる。膜はアカゲザル、ラット、マウスまたはヒト組織由来の哺乳動物腸組織から導かれ得る。
膜は、腸組織の刷子縁細胞から導かれ得る。このような膜は、新たに屠殺した動物から腸組織を採取することにより、従来どおり調製される。組織の粘膜を擦り取り、緩衝液に集め、ホモジナイズする。細胞残屑を除去し、遠心分離により膜画分を集める。刷子縁膜小胞の調製には、当業者には公知である従来の技術が使用できる。Ｈａｕｓｅｒ，Ｈ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｋ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃ．，Ｂｏｗｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６０２，５６７から５７７頁 （１９８０）；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，Ｇｉｒｂｉｇ，Ｆ．，Ｇｕｔｊａｈｒ，Ｕ．，Ｋｏｗａｌｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｊｏｕｖｅｎａｌ，Ｋ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｔｒｉｐｉｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｓｓ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１８０３５から１８０４６頁 （１９９３）；Ｒｉｇｔｒｕｐ，Ｋ．Ｍ．，Ｏｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，２９２０から２９２６頁 （１９９２）参照。
膜調製物は、小胞であっても非小胞形態形態であってもよい。
また、ＮＰＣ１Ｌ１を含むリポソームおよびリポソーム調製物もまた、特許請求される方法のスクリーニングアッセイのための有望なＮＰＣ１Ｌ１供給源であり得る。
ＮＰＣ１Ｌ１を発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞もまた使用できる。宿主細胞は、本発明のＮＰＣ１Ｌ１をコードする核酸を適切な宿主細胞に形質転換するか、またはトランスフェクトすることにより調製でき、これにより、受容体が、この細胞の膜に組み込まれる。次いで、この細胞から膜画分を単離し、アッセイのための受容体の供給源として使用できる。また、細胞表面において受容体を発現する全細胞を、アッセイに使用してもよい。標識リガンドまたは標識既知アンタゴニストもしくはアゴニストと非トランスフェクト宿主細胞／非形質転換宿主細胞との特異的結合または非トランスフェクト宿主細胞／非形質転換宿主細胞由来の膜画分との特異的結合は無視してよいものであることが好ましい。
好ましい宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ネズミマクロファージＪ７７４細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、または他の任意のマクロファージ細胞系、およびヒト腸上皮Ｃａｃｏ２細胞が挙げられる。
本発明は、これらの膜調製物を用いて、例えば、ＮＰＣ１Ｌ１を含む膜、例えば刷子縁膜小胞調製物を、検出可能なように標識した置換アゼチジノン化合物（既知ＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストである）と候補化合物とに接触させること、およびこの候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１と結合できるか否かを判定することにより、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法を提供する。候補化合物をＮＰＣ１Ｌ１に結合させることにより、検出可能なように標識したＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストとＮＰＣ１Ｌ１との結合が調整され得る。さらに、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドは、候補化合物の存在下および不在下で、検出可能なように標識したＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストとＮＰＣ１Ｌ１との結合を測定することにより同定でき、検出可能なように標識したＮＰＣ１Ｌ１リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストとＮＰＣ１Ｌ１との結合の減少が、この候補化合物がＮＰＣ１Ｌ１のリガンドであることを示す。
ＮＰＣ１Ｌ１はまた、ＮＰＣ１Ｌ１を含む膜画分の可溶化によっても得ることができる。膜は、例えば、哺乳動物組織またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞から、上記で論じたように得ることができる。
（ＮＰＣ１Ｌ１リガンドの結合親和性） スクリーニングアッセイにおいてＮＰＣ１Ｌ１と結合するリガンドを同定するには、ＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンド（例えば、検出可能なように標識した置換２−アゼチジノングルクロニド）の親和性および特異性が重要である。当然のことながら、既知リガンドはスクリーニングアッセイにおいて使用するために標識する。本発明の一実施態様では、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドの結合親和性のＫＤ値は、ヒトＮＰＣ１Ｌ１のエゼチミブグルクロニド１のＫＤ値以下である。この実施態様の一側面では、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドの結合親和性のＫＤ値は、約２００ｎＭ以下であり、詳しくはＫＤ値は約１００ｎＭ以下であり、より詳しくはＫＤ値は約５０ｎＭ以下であり、さらに詳しくはＫＤ値は約２０ｎＭ以下であり、最も詳しくはＫＤ値は約１０ｎＭ以下である。アッセイにおける有用性のためには、既知リガンドのＫＤ値において下限値は本質的になく、例えば、ｐＭ範囲に下がり得る。ＫＤ値が小さくなるにつれて、ヒトＮＰＣ１Ｌ１のリガンドの結合親和性が高まり、スクリーニングアッセイにとっては望ましい。
本発明のもう１つの実施態様では、ラットＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドの結合親和性のＫＤ値は、ラットＮＰＣ１Ｌ１のエゼチミブグルクロニド１のＫＤ値以下である。この実施態様の一側面では、ラットＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドの結合親和性のＫＤ値は、約２００ｎＭ以下であり、詳しくは約１００ｎＭ以下であり、より詳しくは約５０ｎＭ以下であり、さらに詳しくは約２０ｎＭ以下であり、最も詳しくは約１０ｎＭ以下である。
本発明のもう１つの実施態様では、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドは、（ａ）３５Ｓで標識された硫黄含有置換２−アゼチジノングルクロニド（特に、Ｒ９が−ＳＯ２−基を含む式ＩＩの化合物）および（ｂ）１２５Ｉで標識された置換２−アゼチジノングルクロニドから選択される。
この実施態様の一側面では、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドは、（ａ）３５Ｓで標識された硫黄含有置換２−アゼチジノングルクロニド（特に、Ｒ９が−ＳＯ２−基を含む式ＩＩの化合物）および（ｂ）ＫＤ値が、エゼチミブグルクロニド１のＫＤ値以下である、１２５Ｉで標識された置換２−アゼチジノングルクロニドから選択される。
この実施態様のもう１つの側面では、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の既知リガンドは、（ａ）３５Ｓで標識された硫黄含有置換２−アゼチジノングルクロニド（特に、Ｒ９が−ＳＯ２−基を含む式ＩＩの化合物）および（ｂ）ＫＤ値が約２００ｎＭ以下である、詳しくは約１００ｎＭ以下である、より詳しくは約５０ｎＭ以下である、さらに詳しくは約２０ｎＭ以下である、最も詳しくは約１０ｎＭ以下である、１２５Ｉで標識された置換２−アゼチジノングルクロニドから選択される。
マウス由来の膜を使用した、候補化合物の中からＮＰＣ１Ｌ１リガンドを同定するスクリーニングに３Ｈ−標識エゼチミブグルクロニドを使用する場合、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドとして同定される候補化合物が、ＫＤ値、約１２０００ｎＭ以下、好ましくは約１０００ｎＭ以下、より好ましくは約１００ｎＭ以下、最も好ましくは約１０ｎＭ以下を有する結合親和性を示す候補であることが好ましい。ラット由来の膜またはヒト由来の膜を使用した、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドを同定するためのスクリーニングに３Ｈ−標識エゼチミブグルクロニドを使用する場合、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドとして同定される候補化合物が、ＫＤ値、約１０００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、およびより好ましくは約１０ｎＭ以下を有する結合親和性を示す候補であることが好ましい。アカゲザル由来の膜を使用した、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドを同定するためのスクリーニングに３Ｈ−標識エゼチミブグルクロニドを使用する場合、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドとして同定される候補化合物が、ＫＤ値、約５０ｎＭ以下、および好ましくは約１０ｎＭ以下を有する結合親和性を示す候補であることが好ましい。
ラットまたはヒト由来の膜を使用した、候補化合物の中からＮＰＣ１Ｌ１リガンドを同定するためのスクリーニングに３５Ｓ−標識化合物２を使用する場合、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドとして同定される候補化合物が、約１０μＭから約１ｎＭの範囲のＫＤ値を有する結合親和性を示す候補であることが好ましい。ラットまたはヒト膜を使用するアッセイに１２５Ｉ−標識置換２−アゼチジノングルクロニド化合物を使用する場合、ＮＰＣ１Ｌ１リガンドとして同定される候補化合物が、約１０ｎＭから約１０ｐＭ、および好ましくは約１００ｐＭから約１０ｐＭの範囲のＫＤ値を有する結合親和性を示す候補であることが好ましい。
（マウスアッセイ） 本発明は、いずれの機能的ＮＰＣ１Ｌ１も欠く突然変異型トランスジェニックマウスを包含する。このマウスは、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収阻害薬、好ましくはＮＰＣ１Ｌ１の阻害薬を同定するためのスクリーニングアッセイにおける好都合な対照実験として使用できる。本発明のマウスアッセイは、以下の段階を含むことが好ましい：
（ａ）機能的ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子を有する第１マウスおよび第２マウスと、機能的ＮＰＣ１Ｌ１を欠く突然変異型の第３マウスとに、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール含有物質（例えば、放射性標識コレステロール、例えば１４Ｃ−コレステロールまたは３Ｈ−コレステロールを含む）を給餌すること；
このステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール含有物質は、放射性標識コレステロールなどの標識コレステロール、例えば、３Ｈまたは１４Ｃ標識コレステロールを含むことが好ましい。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノール含有物質はまた、例えば、トウモロコシ油中にコールド非標識ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールも含み得る。
これらのアッセイでは、ｎｐｃ１ｌ１−突然変異型の第３マウスは、低レベルのステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収を示す（＋）−対照実験として使われ、第２マウスが、阻害を受けていない正常なレベルのステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収を示す（−）−対照実験として使われる。第２マウスには、ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストについて調べようとする試料は投与されない。第１マウスが、本実験である。
（ｂ）機能的ＮＰＣ１Ｌ１を有する第１マウスに試料を投与し、第２マウスには投与しないこと；
（ｃ）前記第１マウス、第２マウスおよび第３マウスの腸におけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収量を測定すること；
ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収は、当分野で公知のいずれかの方法によって測定できる。例えば、腸管吸収レベルは、血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのレベルを測定することによりアッセイできる。
（ｄ）各マウスでステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルを比較すること；
ここで、第１マウスと第３マウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルが第２マウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収量よりも少ない場合に、この試料がステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収アンタゴニストを含有していると判定される。
試料がステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収阻害薬（例えば、ＮＰＣ１Ｌ１阻害薬）を含有している場合、第１マウスにおけるステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収レベルは、ｎｐｃ１ｌ１突然変異型の第３マウスのレベルと同じくらいになることが好ましい。
これらのスクリーニングアッセイに使用できる、代替（＋）−対照実験として、ＮＰＣ１Ｌ１の既知アンタゴニスト、例えば、エゼチミブが投与される機能的ＮＰＣ１Ｌ１を有するマウスがある。
医薬組成物
例えば、上記のスクリーニング法によって発見されたＮＰＣ１Ｌ１リガンドを治療的に用いて（例えば、医薬組成物において）、ＮＰＣ１Ｌ１の活性を刺激し、またはブロックし、これにより、ＮＰＣ１Ｌ１により引き起こされ、または媒介されるいずれかの医学的状態を治療することができる。さらに、本発明の抗体分子もまた治療的に用いて（例えば、医薬組成物において）、ＮＰＣ１Ｌ１と結合し、これによりＮＰＣ１Ｌ１がステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールと結合する能力をブロックことができる。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの結合をブロックすることにより、（例えば、腸細胞などの腸管細胞による）この分子の吸収が阻止され得る。ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの吸収をブロックすることは、被験体における血清コレステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールレベルを低下させる有用な方法であり、これにより、例えば、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心臓病、卒中または動脈硬化症の発生率が低下する。
用語「被験体」または「患者」とは、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、霊長類、ネコ）、最も好ましくはヒトを包含する。
用語「医薬組成物」とは、有効成分と医薬として許容される担体および／またはアジュバントとを含む組成物を指す。
本発明の組成物は、単純溶液で投与できるが、より一般には、この組成物は、担体、好ましくは医薬として許容される担体などの他の物質と組み合わせて使用する。有用な医薬として許容される担体は、本発明の組成物を被験体に送達するのに適した、いずれかの適合する、毒性のない物質であり得る。医薬として許容される担体には、滅菌水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固体が含まれ得る。医薬として許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた、医薬組成物中に組み込むことができる。
本発明の医薬組成物は、丸剤またはカプセル剤の形態であることが好ましい。丸剤およびカプセル剤を製剤するための方法は、当分野では極めて周知である。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与には、活性薬物成分を、経口用、無毒の、任意の医薬として許容される不活性担体、例えば、ラクトース、デンプン、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール（液体形態）と組み合わせることができる。さらに、所望によりまたは必要に応じて、この混合物に、適した結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた組み込むことができる。適した結合剤として、デンプン、ゼラチン、天然糖、トウモロコシ甘味料、天然ガムおよび合成ガム、例えばアラビアガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよび蝋が挙げられる。滑沢剤のうち、これらの投与形に用いられるものとして、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤として、デンプン、メチルセルロース、グアーガムなどが挙げられる。甘味剤および香味剤および防腐剤もまた、適切な場合には含めることができる。
本発明の医薬組成物は、第２の医薬組成物または物質と組み合わせて投与できる。好ましい実施態様では、第２の組成物としてコレステロール降下剤が挙げられる。併用治療が使用される場合、両方の組成物を、同時送達用の単一組成物に製剤してもよいし、または２つ以上の組成物に別々に製剤してもよい（例えば、キット）。
この製剤は、単位投与形態で与えることができることが好都合であり、これは製薬分野で周知の任意の方法によって調製できる。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
治療適用に関する投与計画は、治療用物質の作用を改変し得る種々の因子、例えば、患者の状態、体重、性別および食事、いずれかの感染の重篤度、投与時間、および他の臨床学的因子を考慮して、医師によって決定され得る。治療投与量は、安全性と有効性が最適となるように、低レベルから漸増されることが多い。投与量は、小さい分子サイズおよび投与後に減少する可能性のある半減期（クリアランス時間）を考慮するように調整できる。
本発明のリガンドの「有効量」は、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収レベルを検出可能なように低下させるか、またはこの組成物が投与された被験体の血清ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールレベルを検出可能なように低下させる量であり得る。
このような物質の治療的投与に用いられる一般的なプロトコールは、当分野では周知である。本発明の医薬組成物は、例えば、いずれかの腸管外経路または非腸管外経路によって投与できる。
本発明の丸剤およびカプセル剤は、経口投与できる。注射可能な組成物は、当分野で公知の医療用具を用いて、例えば、皮下注射針を用いる注射によって投与できる。
本発明の注射可能な医薬組成物はまた、無針皮下注射器具、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されている装置を用いて投与してもよい。
アンチセンス
本発明はまた、例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２により定義されるアミノ酸配列またはこの部分配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５から１１または配列番号１３のうちのいずれか）と特異的にハイブリダイズして、このｍＲＮＡの翻訳を阻止することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。さらに、本発明は、例えば、配列番号２もしくは配列番号４もしくは配列番号１２より定義されるアミノ酸配列またはこの部分配列を有するＮＰＣ１Ｌ１をコードするゲノムＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズすることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドも意図する。
本発明は、さらに、（ａ）細胞膜を通過し、この細胞内のＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡと特異的に結合して、このｍＲＮＡの翻訳を阻止することにより、ステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールのＮＰＣ１Ｌ１介在性吸収を減少させるのに有効なある量のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）細胞膜を通過することが可能な医薬として許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活化する物質と結合されている。もう１つの実施態様では、ｍＲＮＡを不活化する物質がリボザイムである。
アンチセンスＮＰＣ１Ｌ１ ＲＮＡを患者の細胞に導入することによってＮＰＣ１Ｌ１の発現レベルを低下させることは、ステロール（例えば、コレステロール）または５□−スタノールの腸管吸収および患者の血清コレステロールを低下させるのに有用な方法である。
キット
本発明のキットは、医薬製剤中、より好ましくは薬剤投与形態、例えば、丸剤、散剤、注射液、錠剤、水和性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤または坐剤中に、好ましくは医薬として許容される担体と合わせてエゼチミブを含む。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。好ましくは投与形態はゼチア（Ｚｅｔｉａ）（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐ．）である。エゼチミブは、いずれかの好都合な形態で供給できる。例えば、エゼチミブを含む錠剤は、３０錠入、９０錠入または５００錠入の瓶で供給できる。
本発明のキットはまた、エゼチミブの標的がＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３）であることを示す、例えば、パッケージ挿入物の形の情報も含む。用語「エゼチミブの標的」とは、エゼチミブがステロール（例えば、コレステロール）または５α−スタノールの腸管吸収を直接減少させるか、またはＮＰＣ１Ｌ１をアンタゴナイズすることによって間接的に減少させることを示す。挿入物の形態は、紙または磁気記録媒体などの電子媒体（例えば、フロッピーディスク）またはＣＤ−ＲＯＭなど、いずれの形態でもよい。
パッケージ挿入物はまた、キット内の医薬組成物および投与形に関する他の情報も含み得る。一般に、このような情報は、患者および医師が封入された医薬組成物および投与形を効果的で安全に使用するのを手助けする。例えば、エゼチミブ（例えば、ゼチア（Ｚｅｔｉａ）（登録商標））および／またはシンバスタチン（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標））に関する以下の情報は、挿入物で供給できる：薬物動態学、薬理学、臨床研究結果、有効性評価基準、適応症および用法、禁忌、警告、使用上の注意、副作用、過量投与、適切な用量および投与、供給形態、適切な保存状態、照会先および特許情報。
本発明のキットはまた、医薬製剤中、より好ましくは薬剤投与形態、例えば丸剤、散剤、注射液、錠剤、水和性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤または坐剤中に、好ましくは医薬として許容される担体と合わせて、シンバスタチン（
Figure 0004590417
 ）も含む。シンバスタチンの投与形態は、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）であることが好ましい。
シンバスタチンを含む錠剤または丸剤は、いずれかの好都合な形態で供給できる。例えば、シンバスタチン５ｍｇを含む丸剤または錠剤は、以下のように供給できる：３０錠入、６０錠入、９０錠入、１００錠入または１０００錠入の瓶。シンバスタチン１０ｍｇを含む丸剤または錠剤は、以下のように供給できる：３０錠入、６０錠入、９０錠入、１００錠入、１０００錠入または１００００錠入の瓶。シンバスタチン２０ｍｇを含む丸剤または錠剤は、以下のように供給できる：３０錠入、６０錠入、９０錠入、１００錠入、１０００錠入または１００００錠入の瓶。シンバスタチン４０ｍｇを含む丸剤または錠剤は、以下のように供給できる：３０錠入、６０錠入、９０錠入、１００錠入または１０００錠入の瓶。シンバスタチン８０ｍｇを含む丸剤または錠剤は、以下のように供給できる：３０錠入、６０錠入、９０錠入、１００錠入、１０００錠入または１００００錠入の瓶。
エゼチミブおよびシンバスタチンは、キットにおいて、別個の組成物として供給してもよいし、または単一組成物に合わせることができる。例えば、エゼチミブおよびシンバスタチンは、別個の薬剤投与形態（例えば、２つの別々の丸剤または錠剤）においてと同様の、単一の、共通の薬剤投与形態（例えば、丸剤または錠剤）に入れて供給できる。
ｎｐｃ１ｌ１−細胞
本発明は、機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質をコードするか生産できるＮＰＣ１Ｌ１遺伝子が欠失している、いずれかの単離哺乳動物細胞（例えば、単離マウス細胞、単離ラット細胞または単離ヒト細胞）を提供する。この実施態様には、遺伝子コード領域またはいずれかの調節エレメント（例えば、プロモーター）の点突然変異、末端切断または欠失を含む突然変異型ｎｐｃ１ｌ１遺伝子が含まれる。
例えば、このような細胞は、機能的ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を全く生産しない、内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１のホモ接合突然変異を含む突然変異型マウス（例えば、下記、実施例２２のマウス）から単離できる。さらに、本発明は、このような突然変異型マウス、特に機能的ＮＰＣ１Ｌ１を全く生産しない突然変異型トランスジェニックマウス（マウスにおける内因性染色体ＮＰＣ１Ｌ１の欠失領域が、配列番号４５に示される核酸配列のヌクレオチド７９０から９９８に相当する）から誘導されたか、または単離されたいかなる細胞、組織、器官、体液、核酸、ペプチドまたは他の生物学的物質も含む。
単離細胞は、例えば、突然変異型マウスの十二指腸、胆嚢、肝臓、小腸または胃から単離するか、または誘導することができる。さらに、この細胞は、腸細胞であり得る。
ｎｐｃ１ｌ１−突然変異型細胞は、ステロール、５α−スタノールまたはエゼチミブのＮＰＣ１Ｌ１依存的取込みまたは結合が起こらないことから、例えば、スクリーニングアッセイにおける対照実験において使用するのに有用である（例えば、前掲、参照）。スクリーニングアッセイにおいて特定の試料によってもたらされる阻害のレベルは、突然変異型細胞を用いて実施したアッセイのレベルと比較することができる。理想的には、例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて、アンタゴニストの存在下で、非突然変異型細胞または細胞膜で観察される結合の量が、突然変異型ｎｐｃ１ｌ１細胞または細胞膜単独を用いて観察される結合の量と同じくらいになることであるが、必ずしもそうではない。
以下の実施例は、本発明をより明確に記載するために提供されており、本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
（実施例１）
ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１のクローニングおよび発現
ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１またはヒトＮＰＣ１Ｌ１は、全て、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して都合よく増幅することができる。このアプローチでは、ラットｃＤＮＡライブラリー、マウスｃＤＮＡライブラリーまたはヒトｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡを、適切なプライマーと標準的なＰＣＲ条件を使用して増幅することができる。プライマーの設計および最適な増幅条件は、当分野で一般的に公知である標準的な技術である。
増幅したＮＰＣ１Ｌ１遺伝子は、これもまた当分野で一般的に公知である方法を使用して、都合よく発現させることができる。例えば、ＮＰＣ１Ｌ１を、ｐＥＴ系プラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｏｌａ，ＣＡ）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に挿入できる。次いで、このプラスミドを、Ｔ７発現系（例えば、ＢＬ２１ＤＥ３大腸菌細胞）に形質転換し得、液体培養により増殖させ、（例えば、ＩＰＴＧをこの細菌培養物に加えることによって）誘導できる。
（実施例２）
直接結合アッセイ
膜調製物：ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号２、４または１２）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされたＣａｃｏ２細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡ／リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートし、続いて、繰返しピペッティングすることにより、回収する。この細胞を１０００×ｇにて５分間遠心分離する。ＥＤＴＡ／ＰＢＳをデカントし、等量の氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎ（ＰＴ１０チップ、設定５、３０秒）で破砕する。核および未破壊の細胞を１０００×ｇにて１０分間沈降させ、この後、上清を５００００×ｇにて１０分間遠心分離する。この上清をデカントし、ペレットをＰｏｌｙｔｒｏｎにより再懸濁し、タンパク質アッセイ（ビシンコニン酸，Ｐｉｅｒｃｅ）用に試料を取り、この組織を再度５００００×ｇにて遠心分離する。ペレットを−２０℃で凍結保存する。
結合アッセイ：飽和結合では、４種類の濃度の［３Ｈ］−エゼチミブ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、１０−５Ｍエゼチミブを伴わずに１０−５Ｍエゼチミブとともに、膜タンパク質５０μｇとともに、総量２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で３０℃で３０分間、３連でインキュベートする。試料をＧＦ／Ｂフィルターで濾過し、冷Ｔｒｉｓバッファー２ｍｌで３回洗浄する。フィルターを電子レンジ中で乾燥させ、Ｍｅｌｔｉｌｅｘワックスシンチラントに浸漬し、４５％効率で計数する。競合結合アッセイでは、５種類の濃度の試料を、上記条件下で、１８ｎＭ［３Ｈ］−エゼチミブおよび膜タンパク質７０μｇとともに３連でインキュベートする。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）非線形最小二乗曲線フィッティングプログラムを用いて曲線をこのデータにフィッティングし、Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ．ら、（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９から３１０８頁）に従ってＩＣ５０値からＫｉ値を得る。
（実施例３Ａ）
ＳＰＡアッセイ
９６ウェルプレートの各ウェルに、ヒトＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１−ＣＨＯ過剰発現膜（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ）１０μｇと２００μｇ／ウェルのＹｓｉ−ＷＧＡ−ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との反応混合物１００μｌを、ＮＰＣ１Ｌ１アッセイバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）で調製する。０．４ｎＭのリガンド−［１２５Ｉ］−エゼチミブ−ストックをＮＰＣ１Ｌ１アッセイバッファーで調製する。上記の溶液を、以下のように９６ウェルアッセイプレートに加える：ＮＰＣ１Ｌ１アッセイバッファー５０μｌ、反応混合物１００μｌ、リガンドストック５０μｌ（最終リガンド濃度は０．１ｎＭである）。このアッセイプレートを、プレートシェーカーにて５分間振盪し、次いで、８時間インキュベートした後に、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にてｃｐｍ／ウェルを測定する。
これらのアッセイでは、［１２５Ｉ］−エゼチミブが、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜、マウスＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜またはラットＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞膜と結合することを示す。放射性標識コレステロール（例えば、１２５Ｉ−コレステロール）を用いて同じ実験を実施しても同様の結果が得られる。
（実施例３Ａ）
代替ＳＰＡアッセイ
最終濃度は：１ｎＭ３５Ｓ−２（Ｋｍ〜２から５ｎＭ、〜５００００ｄｐｍ／アッセイ）でなければならない；
膜（約１から２ｎＭ受容体）１μｇ；０．００７％から０．０３％タウロコール酸塩（１％ストック０．１４０μｌ）；０．０１０％から０．０５％ジギトニン（１％ストック０．２００μｌ）；５％ＤＭＳＯ（阻害薬１．００μｌ）。
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＤＭＳＯ阻害薬溶液１μｌを入れた後、放射性リガンドおよび界面活性剤をバッファーＡ １０μｌ中２×溶液として加える。１分間振盪して、阻害薬とリガンドを確実に混合した後、バッファーＡで希釈した受容体溶液９μｌを加えて開始する。再度、振盪した後、プレートを３７℃で２時間インキュベートする。次いで、ＷＧＡビーズ（０．３ｍｇ）をバッファーＡ中懸濁液３μｌとして加えた後、３０分間振盪する。膜をビーズとともに３０分間プレインキュベートした後にリガンドを加えても同様の結果が得られる。最後に、バッファーＡで３００μｌに希釈し、これでプレートを埋め、３０００ｒｐｍ×５分で回転させ、「Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」カウンターで各ウェルにつき２分読み取る。
ストック
リガンド：３５Ｓ−２は、５２５．４２ｎＭ、０６１６μＣｉ／μｌ（アセトニトリル中）である；ｓｐｅｃ．ａｃｔ．＝３．８９１６×１０−４ｆｍｏｌ／ｄｐｍ；１１６８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
膜：第３バッチ組換えヒト（ＨＥＫ−２９３細胞で発現させたもの）；２０．２μｇ／μｌ ストック；〜２０−４０ｐｍｏｌ ＮＰＣ１Ｌ１／ｍｇ タンパク質
バッファーＡ：２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３；０．９６ｍＮ ＮａＨ２ＰＯ４；５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；５．５ｍＭグルコース（任意選択で添加する）；１１７ｍＭ ＮａＣｌ；５．４ｍＭ ＫＣｌ
（実施例４）
コレステロール取込みアッセイ
ＳＲ−Ｂ１を発現するＣＨＯ細胞またはラットＮＰＣ１Ｌ１の３種の異なるクローンもしくはマウスＮＰＣ１Ｌ１の１種のクローンを発現するＣＨＯ細胞のいずれかを、無コレステロール培地で一晩飢餓にし、次いで、１０□Ｍエゼチミブの不在下または存在下で混合合成ミセルエマルジョン中の［３Ｈ］−コレステロールを、４分間、８分間、１２分間または２４分間投与した。この細胞を回収し、脂質を有機的に抽出した。抽出された脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上にスポットし、有機気相内で分離した。各アッセイについての遊離コレステロールのバンドを単離し、シンチレーションカウンターで計数した。
ＳＲ−Ｂ１発現細胞は、４分間程度の初期に［３Ｈ］−コレステロール取込みの増加を示した。この取込みはまた、エゼチミブによって阻害された。３種のラットクローンおよび１種のマウスクローンは、バックグラウンドレベルの［３Ｈ］−コレステロール取込みを生じるように見えた。この取込みは、非形質転換ＣＨＯ細胞の取込みと同程度であった。
これらの実験において、より最適な実験条件が開発された場合には、ＣＨＯ細胞が［３Ｈ］−コレステロールのマウスＮＰＣ１Ｌ１依存的取込み、ラットＮＰＣ１Ｌ１依存的取込みおよびヒトＮＰＣ１Ｌ１依存的取込みを行うことができることを示すデータが得られるであろう。
（実施例５）
Ｗｉｓｔａｒラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現
これらの実験では、いくつかのラット組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現を評価した。評価した組織は、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、遠位結腸、肝臓、膵臓、心臓、大動脈、脾臓、肺、腎臓、脳、筋肉、精巣、卵巣、子宮、副腎および甲状腺であった。全ＲＮＡ試料を、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、プールした。次いで、これらの試料を、標準的な二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用するＴａｑｍａｎ解析によるリアルタイム定量ＰＣＲに付した。代表的なプローブの設計では、５’リポーター色素（例えば、６ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）またはＶＩＣ）および３’クエンチング色素（例えば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチル−ローダミン））を組み込んだ。
ラットＮＰＣ１Ｌ１：
順方向：ＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣ（配列番号１４）
逆方向：ＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴ（配列番号１５）
プローブ：［６ＦＡＭ］ＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＣＣ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１６）
ラットβ−アクチン：
順方向：ＡＴＣＧＣＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧ（配列番号１７）
逆方向：ＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡ（配列番号１８）
プローブ：［ＶＩＣ］ＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１９）
ＰＣＲ反応を、９６ウェル形式で、各ウェルに反応混合物２５μｌを用いて実行した。この反応混合物には、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１２．５μｌ）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（０．５μｌ）、５０ｍＭ塩化マグネシウム（２μｌ）、ＲＴ反応から得たｃＤＮＡ（０．２μｌ）を含めた。多重反応には、各々２００ｎＭの遺伝子特異的プライマーおよび１００ｎＭのＦＡＭ標識プローブおよび各々１００ｎＭの遺伝子特異的プライマーおよび５０ｎＭのＶＩＣ標識プローブを含めた。反応は、標準的な２段階サイクリングプログラム（９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル）を用いて実行した。
十二指腸、空腸および回腸組織において最高レベルの発現が観察された。これらのデータは、ＮＰＣ１Ｌ１が腸におけるコレステロール吸収においてある役割を果たしていることを示す。
（実施例６）
マウス組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１の発現
これらの実験では、いくつかのマウス組織におけるマウスＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現を評価した。評価した組織は、副腎、ＢＭ、脳、心臓、ランゲルハンス島、ＬＩ、小腸、腎臓、肝臓、肺、ＭＬＮ、ＰＬＮ、筋肉、卵巣、下垂体、胎盤、パイエル板、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、子宮および気管であった。全ＲＮＡ試料を、少なくとも３種の雄動物および３種の雌動物から単離し、プールした。次いで、これらの試料を、以下のプライマーおよびプローブを使用するＴａｑｍａｎ解析によるリアルタイム定量ＰＣＲに付した：
マウスＮＰＣ１Ｌ１：
順方向：ＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣ（配列番号２０）
逆方向：ＧＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡ（配列番号２１）
プローブ：［６ＦＡＭ］ＣＣＣＡＧＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＧＣ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号２２）
パイエル板、小腸、胆嚢、および胃の組織において最高レベルの発現が観察された。これらのデータは、消化系において生じるＮＰＣ１Ｌ１のコレステロール吸収の役割と一致する。
（実施例７）
ヒト組織におけるヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現
これらの実験では、４６種の正常組織の２０４５の試料におけるヒトＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現を評価した。マイクロアレイに基づく遺伝子発現解析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの確立されたプロトコールに厳密に従って、塩基対４１９２から５１１７（配列番号４３）に対応するｃＲＮＡプローブを使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ９５ ＧｅｎｅＣｈｉｐで実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐを、低光量増幅管（ＰＭＴ）下でスキャンし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ４．０アルゴリズムまたはＭＡＳ ５．０アルゴリズムのいずれかを用いてデータを正規化した。さらに、ほとんどの試料について「スパイクイン（ｓｐｉｋｅ ｉｎｓ）」を使用して、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃアルゴリズムおよび手順に従って、標準曲線を作成し、ＲＮＡ濃度値を得た。これらの結果の概要を以下の表２に示す。
Figure 0004590417
Figure 0004590417
影を付けたデータは、最高レベルのＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡが検出された組織に該当する。「存在」の欄では、ＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡが検出された評価された特定の組織試料の割合を示す。「不在」の欄では、ＮＰＣ１Ｌ１ ＲＮＡが検出されなかった評価された特定の組織試料の割合を示す。「下位２５％」の欄、「中央値」の欄および「上位７５％」の欄では、評価された各組織セットで観察された相対的ＮＰＣ１Ｌ１シグナル強度の統計的分布を示す。
（実施例８）
ラット小腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ ｍＲＮＡ、ラットＳＲ−Ｂ１ ｍＲＮＡの分布
これらの実験では、ラット小腸の近位−遠位軸に沿ったラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの分布を評価した。５匹の独立した動物から小腸を単離し、ほぼ等しい長さの１０切片に分割した。全ＲＮＡを単離し、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡ、ラットＩＢＡＴ（回腸胆汁酸輸送体）ｍＲＮＡまたはラットＳＲ−Ｂ１ ｍＲＮＡの局所発現レベルについて、Ｔａｑｍａｎ解析によるリアルタイム定量ＰＣＲによって解析した。この解析に使用したプライマーおよびプローブは：
ラットＮＰＣ１Ｌ１：
順方向：ＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣ（配列番号２３）
逆方向：ＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴ（配列番号２４）
プローブ：［６ＦＡＭ］ＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＣＣ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号２５）
ラットビリン：
順方向：ＡＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣ（配列番号２６）
逆方向：ＴＧＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴ（配列番号２７）
プローブ：［ＶＩＣ］ＣＴＴＣＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＡＴＧＧＡＡ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号２８）
ラットＳＲ−Ｂ１：
順方向：ＡＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号２９）
逆方向：ＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡ（配列番号３０）
プローブ：［６ＦＡＭ］ＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＡ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号３１）
ラットＩＢＡＴ：
順方向：ＧＡＧＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＴ（配列番号３２）
逆方向：ＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡ（配列番号３３）
プローブ：［６ＦＡＭ］ＡＧＴＣＣＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣ ＴＣ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号３４）
であった。
各動物の腸切片のｍＲＮＡ発現レベルを別個に解析し、次いで、観察された発現レベルを、この腸切片において観察されたビリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。次に、各切片についての正規化観察ＲＮＡ発現レベルの平均をとった。
ＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１発現レベルは、より遠位の回腸切片と比較して、空腸（切片２から５）において最高であった。空腸は、コレステロール吸収部位であると考えられているため、これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のこのような役割を示唆している。回腸に有利なＩＢＡＴ分布は十分に立証されており、この実験での対照として使われた。
（実施例９）
ラット空腸組織におけるラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ解析
ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの局在化を、ラット空腸連続切片のｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析によって特性決定した。この解析に使用したプローブは：
Ｔ７−センスプローブ：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号３５）
Ｔ７−アンチセンスプローブ：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号３６）
であった。
これらのＲＮＡプローブは、ラットＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド３３１８から３６７２（配列番号１）に相当するＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ増幅を使用して合成した。センスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブおよびアンチセンスジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブは、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを製造業者の教示に従って使用して、Ｔ７プロモーターから作製した。ラット空腸の連続凍結切片をセンスプローブおよびアンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン標識を、これまでの方法に基づいてＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて検出した。陽性シグナルは、ハイブリダイゼーション部位における赤色反応生成物の沈着によって確認される。
このアンチセンスプローブは、低倍率（４０×）では、陰窩−繊毛軸に沿って、上皮の強い染色を示した。観察されたラットＮＰＣ１Ｌ１ ｍＲＮＡの発現レベルは、繊毛先端よりも陰窩において多少強いように思われた。高倍率（２００×）では、腸細胞において染色が観察されたが、杯細胞では観察されなかった。センスプローブ（対照）では染色が観察されなかったことにより、ＮＰＣ１Ｌ１アンチセンスシグナルの高い特異性が確認された。これらのデータは、コレステロールの腸管吸収におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割のさらなる証拠を提供した。
（実施例１０）
蛍光標識エゼチミブと一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞との結合についてのＦＡＣＳ解析
これらの実験では、ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチミブ（Ａｌｔｍａｎｎら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５８０（１）：７７−９３）がＮＰＣ１Ｌ１およびＳＲ−Ｂ１と結合する能力を評価した。「ＢＯＤＩＰＹ」とは、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブを検出するために使用した蛍光基である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ（ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ（ｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ）、マウスＳＲ−Ｂ１ ＤＮＡ（ｍＳＲＢＩ／ＣＨＯ）またはＥＧＦＰ ＤＮＡ（ＥＧＦＰ／ＣＨＯ）で一過性にトランスフェクトした。ＥＧＦＰとは、陽性対照として使用した強化緑色蛍光タンパク質である。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、次いで、１００ｎＭ ＢＯＤＩＰＹ標識エゼチミブで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。また、細胞をＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブで標識しない対照実験および非トランスフェクトＣＨＯ細胞をＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブで標識する対照実験も実施した。
非トランスフェクトＣＨＯ細胞、ｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞またはｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞では、染色が観察されなかった。陽性対照ＥＧＦＰ／ＣＨＯ細胞では、蛍光が検出された。また、マウスＳＲ−Ｂ１／ＣＨＯ細胞では、染色が検出された。これらのデータは、試験した条件下では、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブがＳＲ−Ｂ１と結合可能であること、およびこのような結合が蛍光ＢＯＤＩＰＹ基の存在によって除去されないことを示す。より最適な条件が決定されると、ＢＯＤＩＰＹ−エゼチミブがｒＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞およびｍＮＰＣ１Ｌ１／ＣＨＯ細胞を標識することが示される。
（実施例１１）
抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２で標識した一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析
これらの実験では、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧタグ付ＮＰＣ１Ｌ１の発現を評価した。ＣＨＯ細胞をマウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡ、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。使用した８アミノ酸ＦＬＡＧタグは、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３７）であった。このタグは、分泌シグナル配列直後のアミノ末端細胞外ループ上に挿入した。これらの細胞を、市販の抗ＦＬＡＧモノクローナルマウス抗体Ｍ２とともにインキュベートし、続いて、ＢＯＤＩＰＹタグ付抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。処理した細胞を、次いで、ＦＡＣＳによって解析した。
このＭ２抗体は、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を染色した。マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞では、染色が観察されなかった。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１およびマウスＮＰＣ１Ｌ１が有意な固有の蛍光を有しておらず、抗ＦＬＡＧ抗体が結合していないことを示した。これらの細胞の観察されたＦＬＡＧによる標識により、このＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質がＣＨＯ細胞の細胞膜に局在化していることが示された。
（実施例１２）
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ解析
これらの実験では、ＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の表面および細胞質での局在化を評価した。ＣＨＯ細胞をＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。これらの融合物では、ＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、ＥＧＦＰ融合物は、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にあった。これらの細胞を、次いで、Ｍ２抗ＦＬＡＧマウス（一次）抗体で染色し、続いて、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス抗体で二次染色した。対照実験では、細胞を二次抗体でのみ染色し、一次抗体（Ｍ２）では染色しなかった。染色した細胞を、次いで、ＦＡＣＳにより解析した。
対照実験では、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされた細胞をＢＯＤＩＰＹ抗マウス二次抗体で染色したが、一次抗体では染色しなかった。このデータは、二次抗マウス抗体が、ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１に対して有意な特異性を有さないこと、およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１自体が有意な蛍光を有さないことを示した。
別の対照実験では、非標識ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞をＦＡＣＳ解析した。これらの実験では、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の自己蛍光を検出した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１細胞を抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した。この解析からのデータは、これらの細胞が二次ＢＯＤＩＰＹ標識抗体で標識されたことを示した。このことにより、ＣＨＯ細胞の表面でのＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質の発現が示された。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２およびＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した。この解析から得たデータは、両方のマーカー（ＢＯＤＩＰＹおよびＥＧＦＰ）が存在することを示し、このことにより、キメラタンパク質の表面発現が示された。このデータはまた、タンパク質の一部が細胞内に存在し、輸送小胞と関連し得ることも示した。これらのデータは、コレステロール、または細胞内小器官（粗面小胞体など）で発現したタンパク質の小胞輸送におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の役割を裏付けた。
（実施例１３）
ＣＨＯ細胞株クローンにおけるＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰキメラのＦＡＣＳ解析および蛍光顕微鏡検査
これらの実験では、ラットＮＰＣ１Ｌ１の細胞局在化をＦＡＣＳ解析および免疫組織化学によって評価した。ＣＨＯ細胞をＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡでトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、次いで、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。この融合物では、ＦＬＡＧタグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のアミノ末端にあり、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグは、ラットＮＰＣ１Ｌ１のカルボキシ末端にある。染色した細胞を、次いで、ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡検査法によって解析した。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰ ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を抗ＦＬＡＧマウス抗体Ｍ２で染色し、次いで、ＢＯＤＩＰＹ標識抗マウス二次抗体で染色した。これらの細胞のＦＡＣＳ解析により、両方のマーカーが検出され、このことにより、キメラタンパク質の表面発現が示された。
ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１−ＥＧＦＰでトランスフェクトされた細胞を６３×倍率で蛍光顕微鏡によって分析した。これらの細胞の蛍光顕微鏡による分析では、有意な核周囲オルガネラ染色を含む非核染色を示した。この画像を分析しても、小胞関連タンパク質の存在は確認できなかった。これらのデータは、融合タンパク質がＣＨＯ細胞の細胞膜上で発現されたことを示した。
（実施例１４）
ポリクローナル抗ラットＮＰＣ１Ｌ１ウサギ抗体の作製．
アミノ末端システイン残基またはカルボキシ末端システイン残基を含む合成ペプチド（配列番号３９から４２）を、ジスルフィド結合を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質と結合し、これを抗原として使用して、ニュージーランド白色ウサギ（３ヶ月齢から９ヶ月齢の範囲）においてポリクローナル抗血清を惹起した。このＫＬＨ−ペプチドを、等量のフロイントアジュバントと混合することによって乳化し、これを３箇所の皮下背面部位に注射した。１６週間免疫スケジュールの前に、免疫前血清試料を採取し、続いて、０．２５ｍｇ ＫＬＨ−ペプチドの初回注射を実施し、スケジュールどおり０．１ｍｇ ＫＬＨ−ペプチドの追加抗原注射を３回実施した。動物の耳介動脈から採血し、この血液を凝固させた後、この血清を遠心分離によって集めた。
固相に結合した遊離ペプチド（１μｇ／ウェル）を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、抗ペプチド抗体力価を決定した。結果を、ＯＤ４５０ ０．２をもたらした血清希釈の逆数として表す。検出は、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）複合体およびＡＢＴＳを使用して行った。
（実施例１５）
ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるラットＮＰＣ１Ｌ１発現のＦＡＣＳ解析
これらの実験では、ＣＨＯ細胞の表面におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を評価した。ＣＨＯ細胞をラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡでトランスフェクトした後、ウサギ免疫前血清または上記実施例１４に記載した１０週間抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清（すなわち、Ａ０７１５、Ａ０７１６、Ａ０８６７またはＡ０８６８）のいずれかとともにインキュベートした。一次抗血清で標識した細胞を、次いで、ＢＯＤＩＰＹ修飾抗ウサギ二次抗体で染色し、続いて、ＦＡＣＳ解析を行った。
免疫前血清試料のいずれについても、抗体表面標識は観察されなかった。Ａ０７１５およびＡ０８６８の両方において、ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の特異的細胞表面標識が観察された。抗血清Ａ０７１６およびＡ０８６７は、このアッセイ形式においてラットＮＰＣ１Ｌ１表面発現を認識しなかった。このことは、天然の非融合ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質がＣＨＯ細胞において発現され、ＣＨＯ細胞膜に局在化することを示す。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、コレステロールの腸管吸収における役割と一致する。
（実施例１６）
ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用する、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞もしくはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞または非トランスフェクトＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析
これらの実験において、ＣＨＯ細胞におけるＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１の発現を評価した。ＣＨＯ細胞をＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡまたはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１ ＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞を、Ａ０８０１血清、Ａ０８０２血清、Ａ０７１５血清もしくはＡ０８６８血清（実施例１４参照）または抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２のいずれかで標識した。標識した細胞を、次いで、ＢＯＤＩＰＹ標識抗ウサギ二次抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、トランスフェクト細胞株と同様に解析した。
試験した抗血清のいずれについても、非トランスフェクトＣＨＯ細胞の陽性染色は観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞の血清Ａ０８０１による標識は観察されたが、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞ではこのような標識は観察されなかった。ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞またはＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞では血清Ａ０８０２による標識は観察されなかった。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞では血清Ａ０７１５による強い標識が観察され、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞では血清Ａ０７１５による弱い標識が観察された。ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびマウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞では血清Ａ０８６８による弱い標識が観察された。ＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞では抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体による強い標識が観察された。この強いＭ２染色は、Ｍ２が既知の濃度の親和性精製されたモノクローナル抗体であるという事実に起因する可能性が高い。対照的に、個々の抗血清は、未精製のポリクローナルであり、予測できない濃度の抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗体を含む。これらのデータは、ＦＬＡＧ−マウスＮＰＣ１Ｌ１タンパク質およびＦＬＡＧ−ラットＮＰＣ１Ｌ１タンパク質がＣＨＯ細胞において発現され、ＣＨＯ細胞膜に局在化されるというさらなる証拠を提供する。ＮＰＣ１Ｌ１の細胞表面発現は、コレステロールの腸管吸収における役割と一致する。
（実施例１７）
ウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５を用いるラット空腸組織の免疫組織化学分析
これらの実験では、ラット空腸におけるラットＮＰＣ１Ｌ１の局在化を免疫組織化学により分析した。ラット空腸を取り出し、すぐにＯ．Ｃ．Ｔ．化合物に包埋し、液体窒素で凍結した。クリオスタットミクロトームを用いて切片（６μｍ）を作製し、スライドガラス上に載せた。切片を室温にて風乾した後、ブアン固定液で固定した。ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ免疫染色を、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰキットを使用して行った。内因性組織ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートすることによりブロックし、非特異的抗体結合を、１０％非免疫ウサギ血清中で４５分間インキュベートすることにより最小限に抑えた。切片を、１：５００希釈のウサギ抗ラットＮＰＣ１Ｌ１抗血清Ａ０７１５またはＡ０８６８とともに４℃でインキュベートし、続いて、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとともにインキュベートした。続いて、これらの切片を、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＯ）−Ｈ２Ｏ２染色系で発色させ、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、顕微鏡により検査した。このプロトコールを使用する陽性反応は、抗原抗体反応部位における赤色反応生成物の沈着によって確認する。核は、ヘマトキシリン対比染色による青色を呈した。対照は、同じ組織ブロックの隣接する切片で同時に実施した。対照手順は、以下の（１）一次抗体を免疫前血清で置き換えること、（２）一次抗体を非免疫ウサギ血清で置き換えること、（３）一次抗体をＰＢＳで置き換えること、（４）二次抗体をＰＢＳで置き換えることとした。
本実施例は、抗ラットＮＰＣ１Ｌ１血清Ａ０７１５または免疫前血清で染色した組織の、低倍率（４０×）および高倍率（２００×）での分析を示す。Ａ０７１５で染色された組織は、低倍率では、繊毛上皮層（腸細胞）で強い陽性染色を示した。Ａ０７１５で染色された組織は、高倍率では、腸細胞頂端膜で強い陽性染色を示した。免疫前血清でのみ処理した組織では、染色は観察されなかった。血清Ａ０８６８を用いた場合も同様の結果が得られた。これらのデータは、ラットＮＰＣ１Ｌ１がラット空腸において発現されることを示し、これは、コレステロールの腸管吸収における役割と一致する。
（実施例１８）
標識コレステロール取込みアッセイ
本実施例では、ラットＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を評価した。これらのアッセイでは、コレステロール取込みを、単一濃度にて、パルス−チェイス実験により評価した。これらの実験で得られたデータを以下の表３に示す。
細胞：
Ａ．ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
細胞は、１２ウェルプレートに５０００００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
手順：
全ての試薬および培養プレートを、特に断りのない限り、３７℃で維持した。
（飢餓） 維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％ＦＣＳ）を除去し、細胞を、無血清ＨＡＭＳ培地で洗浄した。無血清培地を、次いで、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠乏血清（ＬＰＤＳ））に取り替えた。
各細胞株の１プレートを一晩飢餓状態にした。残りの２プレートを、「飢餓なし」とした（以下参照）。
（プレインキュベーション） 全てのプレートから培地を除去し、無血清ＨＡＭＳで洗浄し、３０分間飢餓培地に取り替えた。
（３Ｈ−コレステロールパルス） 以下のものを各ウェルに直接加えた。
混合胆汁酸塩ミセル５０μｌ中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール（〜１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散される
最終的な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ
標識コレステロールパルスの時点は、０分、４分、１２分および２４分であった。各処理について３連のウェルを調製した。
（洗浄） 指定時間に培地を吸引し、細胞を３７℃でＨｏｂｂｓバッファーＡ（５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、０．２％ ＢＳＡ、ｐＨ ７．４）で１回、ＨｏｂｂｓバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣＩ、ｐＨ ７．４（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
（処理／分析） 細胞を０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温で一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、シンチレーション計測法により放射能を測定した。全てのウェルから５０μｌアリコートをさらに２つずつ、Ｐｉｅｒｃｅ ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ法により総タンパク質についてアッセイした。この細胞において観察された標識コレステロールの量を、この細胞におけるタンパク質の量により正規化した。
Figure 0004590417
（実施例１９）
コレステロール取込みに対するエゼチミブの効果
マウスＮＰＣ１Ｌ１もしくはラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が３Ｈ−標識コレステロールを取り込む能力に対するエゼチミブの効果を、パルス−チェイス実験により評価した。１種類のマウスＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡクローン（Ｃ７）と３種類のラットＮＰＣ１Ｌ１クローン（Ｃ７、Ｃ１７およびＣ２１）を評価した。マウスＳＲ−Ｂ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、マウスＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびラットＮＰＣ１Ｌ１で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞がエゼチミブの不在下で標識コレステロールを取り込む能力もまた、パルス−チェイス実験により評価した。これらの実験で得られたデータを以下の表４および表５に示す。さらに、４種類の異なる非標識コレステロール濃度の存在下でトランスフェクトＣＨＯ細胞および非トランスフェクトＣＨＯ細胞によって取り込まれる総コレステロール量もまた、評価した。これらの実験によるデータを以下の表６に示す。
細胞：
Ａ．ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡまたはマウスＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞
Ｂ．ＣＨＯバックグラウンド（トランスフェクションなし）
Ｃ．ＳＲ−Ｂ１トランスフェクトＣＨＯ細胞
細胞は、１２ウェルプレートに５０００００細胞／ウェル（ｍＬ）にて播種した。
手順：
全ての試薬および培養プレートを、特に断りのない限り、３７℃で維持した。
（飢餓） 維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％ＦＣＳ）を除去し、細胞を無血清ＨＡＭＳ培地で洗浄した。無血清培地を、次いで、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠乏血清（ＬＰＤＳ））に取り替えた。細胞を一晩飢餓状態にした。
（プレインキュベーション／前投与） 全てのプレートから培地を除去し、新鮮な飢餓培地に取り替え、３０分間プレインキュベートした。ウェルの半分にエゼチミブを含む培地を与えた（ＥｔＯＨ中のストック溶液；最終濃度＝１０μＭ）。
（３Ｈ−コレステロールパルス） 以下のものを各ウェルに直接加えた：
混合胆汁酸塩ミセル５０μｌ中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール（〜１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散される
最終的な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ
標識コレステロールパルスの時点は、４分、１２分、２４分および４時間であった。各処理について３連のウェルを調製した。
（洗浄） 指定時間に培地を吸引し、細胞を３７℃でＨｏｂｂｓバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ＮａＣｌ、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４）で１回、ＨｏｂｂｓバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣＩ、ｐＨ ７．４（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
（処理／分析）
Ａ．４分、１２分、２４分の時点：細胞を０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温にて一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、シンチレーション計測法により放射能を測定した。
Ｂ．４時間の時点：消化した細胞を薄層クロマトグラフィーによって分析して、細胞中のコレステロールエステルの量を決定した。
抽出物をＴＬＣプレート上にスポットし、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相２ｍｌ中で３０分間展開を行い、続いて、２回目の展開を、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）移動相１ｍｌ中で１５分間行った。
Ｃ．細胞抽出物のタンパク質測定：細胞抽出物の試料を含むプレートをオービタルシェーカー上に１２０ｒｐｍにて指定した時間置いた後、抽出物を１２×７５本のチューブにプールした。プレートを乾燥させ、ＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を加えた。試料のタンパク質含量を測定した。全てのウェルから５０μｌアリコートをさらに２つずつ、Ｐｉｅｒｃｅ ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ法により総タンパク質についてアッセイした。この細胞において観察された標識コレステロールの量を、この細胞におけるタンパク質の量に対して正規化した。
Figure 0004590417
Figure 0004590417
Figure 0004590417
（実施例２０）
標識コレステロール取込みアッセイ
本実施例では、ラットＮＰＣ１Ｌ１またはマウスＳＲ−Ｂ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力を評価した。また、マウスＳＲ−Ｂ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が標識コレステロールを取り込む能力をラットＮＰＣ１Ｌ１が増強する能力も評価した。これらのアッセイでは、コレステロール取込みを、単一濃度にて、パルス−チェイス実験により評価した。これらの実験で得られたデータを以下の表７に示す。
細胞：
Ａ．ＣＨＯバックグラウンド細胞（モックトランスフェクション）。
Ｂ．マウスＳＲ−Ｂ１で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞。
Ｃ．ラットＮＰＣ１Ｌ１ ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ（ｎ＝８クローン）。
一過性にトランスフェクトされた細胞を、１２ウェルプレートに３０００００細胞／ウェル（ｍＬ）で播種した。
手順：
全ての試薬および培養プレートを、特に断りのない限り、３７℃で維持した。
（飢餓） 細胞から維持培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％ＦＣＳ）を除去し、１ｍＬ「飢餓」培地（Ｆ１２ ＨＡＭＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５％リポタンパク質欠乏血清（ＬＰＤＳ））に取り替えた。細胞を１時間飢餓状態にした。
（３Ｈ−コレステロールパルス） 以下のものを各ウェルに直接加えた：
混合胆汁酸塩ミセル５０μｌ中の０．５μＣｉ ３Ｈ−コレステロール（約１．１×１０６ｄｐｍ／ウェル）
４．８ｍＭタウロコール酸ナトリウム（２．５８１ｍｇ／ｍＬ）
０．６ｍＭオレイン酸ナトリウム（０．１８３ｍｇ／ｍＬ）
０．２５ｍＭコレステロール（０．１ｍｇ／ｍＬ）
これらは、超音波振動により「飢餓」培地中に分散される
最終的な培地のコレステロール濃度＝５μｇ／ｍＬ
標識コレステロールパルスの時点は、２４分および４時間とした。各処理について３連のウェルを調製した。
（洗浄） 指定時間に培地を吸引し、細胞を３７℃でＨｏｂｂｓバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）で１回、ＨｏｂｂｓバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＢＳＡなし））で１回洗浄した。
（処理／分析）
Ａ．２４分の時点：細胞を０．２Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ／ウェル）を用いて室温にて一晩消化した。１．５ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、中和し、シンチレーション計測法により放射能を測定した。
Ｂ．４時間の時点：消化した細胞を薄層クロマトグラフィーによって分析して、細胞中のコレステロールエステルの量を決定した。
抽出物を薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）含有移動相２ｍｌ中で３０分間展開を行い、続いて、２回目の展開をヘキサン：イソプロパノール（３：２）含有移動相１ｍｌ中で１５分間行った。
Ｃ．細胞抽出物のタンパク質測定：細胞抽出物の試料を含むプレートをオービタルシェーカー上に１２０ｒｐｍにて示した時間置いた後、抽出物を１２×７５本のチューブにプールした。プレートを乾燥させ、ＮａＯＨ（２ｍｌ／ウェル）を加えた。試料のタンパク質含量を測定した。全てのウェルから５０μｌアリコートをさらに２つずつ、Ｐｉｅｒｃｅ ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ法により総タンパク質についてアッセイした。この細胞において観察された標識コレステロールの量を、この細胞におけるタンパク質の量に対して正規化した。
Figure 0004590417
（実施例２１）
ラットＮＰＣ１Ｌ１、マウスＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１の発現
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１を細胞に導入し、発現させた。種特異的ＮＰＣ１Ｌ１発現構築物を、クローン特異的ＰＣＲプライマーを使用してプラスミドｐＣＤＮＡ３にクローニングして、このベクターのポリリンカーと適合する適切な制限部位でフランキングされるＯＲＦを作製した。３つのＮＰＣ１Ｌ１種全てについて、小腸全組織ＲＮＡを、オリゴｄＴを鋳型プライマーとして使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用の鋳型として使用した。ラットＮＰＣ１Ｌ１をＥｃｏＲＩ断片としてクローニングし、ヒトＮＰＣ１Ｌ１をＸｂａＩ／ＮｏｔＩ断片としてクローニングし、マウスＮＰＣ１Ｌ１をＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした。各クローンの順方向鎖および逆方向鎖の配列決定を実施して、配列の完全性を確認した。標準的な一過性トランスフェクション手順を、ＣＨＯ細胞に対して使用した。６ウェルプレートにおいて、トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ細胞をプレーティング密度２×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、細胞を２μｇのプラスミドＤＮＡおよび６μＬのリポフェクトアミンとともに５時間インキュベートし、次いで、新鮮な培地に交換した。４８時間後、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清を使用して、ＦＡＣＳまたはウエスタンブロットのいずれかによりＮＰＣ１Ｌ１発現について細胞を解析した。ＮＰＣ１Ｌ１を発現する安定な長期細胞株を確立するために、製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって推奨されるように、ジェネティシン（Ｇ４１８、０．８ｍｇ／ｍｌ）の存在下でトランスフェクトＣＨＯ細胞を選択した。１ヶ月間の培養選抜後、細胞集団を抗ＮＰＣ１Ｌ１抗血清で染色し、ＦＡＣＳにより選別した。個々の陽性染色細胞を、限界希釈により単離した後にクローニングし、次いで、ジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む選択培地で維持した。
トランスフェクション手順を受け入れにくい他の細胞は、アデノウイルスベクター系を使用して作製した。ＮＰＣ１Ｌ１を発現させるために使用するこの系は、Ａｄ５（Ｃ型アデノウイルス）から誘導される。この組換え複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域、Ｅ２領域およびＥ４領域の改変によって欠損性にされている。このベクターはまた、Ｅ３領域にもさらなる改変を有し、この改変は、一般にＥ３ｂ領域の遺伝子ＲＩＤａおよびＲＩＤｂに影響を及ぼす。ＮＰＣ１Ｌ１発現は、アデノウイルスのＥ３領域において置換された発現カセットとしてＣＭＶプロモーターを使用して行われた。ラットＮＰＣ１Ｌ１およびマウスＮＰＣ１Ｌ１を、アデノウイルスベクターと適合する制限部位でフランキングされるクローン特異的プライマーを使用して増幅した。アデノウイルスの感染性粒子を２９３−Ｄ２２細胞から、力価５×１０１０Ｐ／ｍＬで作製した。ウイルス溶解物を使用して、標準的なトランスフェクション方法を受け入れにくい細胞を感染させた。ＣａＣｏ２細胞（この細胞は異種タンパク質発現に強い抵抗を示す）では、ＮＰＣ１Ｌ１のアデノウイルス媒介性発現が感染後少なくとも２１日間持続することがウエスタンブロット分析によって証明されている。
（実施例２２）
ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトトランスジェニックマウス
ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウスを、標的突然変異誘発を介して構築した。この方法では、マウスＮＰＣ１Ｌ１遺伝子の特定領域を欠失するように設計された標的化構築物を利用した。この標的化プロセス中に、大腸菌ｌａｃＺリポーター遺伝子を、内因性ＮＰＣ１Ｌ１プロモーターの制御下に挿入した。ＮＰＣ１Ｌ１（配列番号４５）の欠失領域は、ヌクレオチド７９０からヌクレオチド９９８である。この標的化ベクターは、ヌクレオチド７８９で終わる１．９ｋｂ ５’アームと、ヌクレオチド９９９で始まる３．２ｋｂ ３’アームによりフランキングされるＬａｃＺ−Ｎｅｏカセットを含む。組換え胚幹細胞株のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲを使用して、相同組換えについてアッセイした。増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって視覚化した。この試験ＰＣＲでは、遺伝子特異的プライマーを使用した（このプライマーは、標的化ベクターアームの外側にこれに隣接して存在し、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット配列に特異的な３つのプライマーのうちの１つと対合する）。５’ＰＣＲ再確認のために、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチドＡＴＧＴＴＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＣＣＣ（配列番号４６）を、３’ＰＣＲ再確認のために、ＮＰＣ１Ｌ１特異的オリゴヌクレオチドＧＧＡＴＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣ（配列番号４７）を使用した。Ｆ２マウスの遺伝子型決定を、ＮＰＣ１Ｌ１特異的順方向プライマーＴＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＣ（配列番号４８）、ＬａｃＺ−Ｎｅｏカセット特異的順方向プライマーＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣ（配列番号４９）を、ＮＰＣ１Ｌ１遺伝子特異的逆方向プライマーＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＣ（配列番号５０）と組み合わせて使用する、多重ＰＣＲによって実施し、標的対立遺伝子と内因性対立遺伝子の両方の決定を可能にした。アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ生成物の分析により、野生型マウス、ヘテロ接合体ヌルマウスおよびホモ接合体ヌルマウスを互いに区別した。
（実施例２３）
ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスにおける急速コレステロール吸収
ＮＰＣ１Ｌ１がコレステロール吸収において役割を果たすか否かを判定するために、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスを試験した。
野生型（＋／＋）マウスとＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）を得るために、ＮＰＣ１Ｌ１が欠損したマウス（−／−）を、ヘテロ接合体マウス（＋／）を交配することによって作出する。非絶食マウス（６．５週齢から９週齢、１２９系とＣ５７ＢＬ／６系バックグラウンドとのミックス系統）の体重を測定し、群分けした（ｎ＝２ −／−およびｎ＝４ ＋／＋）。全ての動物に１μＣｉ ｌ４Ｃ−コレステロール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，［４−ｌ４Ｃ］コレステロール，ＮＥＣ−０１８）および担体コレステロール塊（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．１ｍｇを含有するトウモロコシ油（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．１ｍｌを胃管栄養法により与えた（給餌ニードル、２４Ｇ×１インチ、Ｐｏｐｐｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。２時間後、心臓穿刺により採血した。肝臓を取り出し、この重量を測定し、３試料を２０ｍｌ計測用バイアルに入れた。組織を１Ｎ ＮａＯＨ １ｍｌ、６０℃で一晩消化した。この組織消化物を、４Ｎ ＨＣｌ ２５０μｌを加えて酸性化し、次いで、液体シンチレーション計測（ＬＳＣ）した。微量遠心機による１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により血漿を分離し、ＬＳＣ用に、血漿から２連の１００μｌアリコートを取り出した。
この急速法により評価し、血漿および肝臓における放射性コレステロールの総量として表したコレステロール吸収は、野生型マウス（＋／＋）が平均１１，７７３ｄｐｍを吸収し、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスが１４Ｃ−コレステロール９９２ｄｐｍを吸収したことを示した。これらの結果は、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスではコレステロール吸収が９２％減少していることを示している。これらのデータは、ＮＰＣ１Ｌ１のコレステロールの腸管吸収における役割を裏付ける。ＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト（エゼチミブなど）を被験体に投与することによって被験体におけるＮＰＣ１Ｌ１介在性コレステロール吸収を阻害することは、被験体における血清コレステロールレベルおよびアテローム性動脈硬化症の発生率を低下させるのに有用な方法である。
（実施例２４）
ＮＰＣ１Ｌ１（ＮＰＣ３）ノックアウトマウスにおけるコレステロール吸収（糞便比率法（Ｆｅｃａｌ Ｒａｔｉｏ Ｍｅｔｈｏｄ）：コレステロール／シトスタノール）
本実施例では、ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（−／−）、ヘテロ接合体マウス（＋／−）および年齢適合野生型マウス（＋／＋）において、コレステロール吸収およびエゼチミブの活性を測定した。
マウスにおけるコレステロール吸収を、Ａｌｔｍａｎｎら （Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５８０（１）：７７から９３頁 （２００２））により記載されている糞便二重同位元素比率法（ｄｕａｌ ｆｅｃａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｒａｔｉｏ ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。マウス（ｎ＝４から６／群）に標準的な齧歯類用飼料を給餌し、一部の群では、最大有効量のエゼチミブ（１０ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置した。マウスにトウモロコシ油０．１ｍｌ中の１４Ｃ−コレステロール（１μＣｉ、非標識コレステロール０．１ｍｇ）および３Ｈ−シトスタノール（２μＣｉ）を胃管栄養法により与えた。糞便を２日間採取し、糞便中の１４Ｃ−コレステロールおよび３Ｈ−シトスタノールレベルを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｘｉｄｉｚｅｒで燃焼することにより測定した。糞便二重同位元素技術（ｆｅｃａｌ ｄｕａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により評価した、吸収されたコレステロールの割合は、飼料を給餌した野生型（＋／＋）マウスとヘテロ接合体マウス（＋／−）においては同程度であった（ヘテロ接合体マウスは１４Ｃ−コレステロール投与量の４６±５％を吸収し、年齢適合野生型マウスは１４Ｃ−コレステロール投与量の５１±３％を吸収した）。ＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウス（−／−）は、１４Ｃ−コレステロールの１５．６０±０．４％を吸収した。この値は、最大有効量のエゼチミブで処置した野生型マウスと同程度であり（１６．１±０．３％）、野生型マウスに対して６９％低い値であった（ｐ＜０．００１）。エゼチミブで、１０ｍｇ／ｋｇ／日にて処置したＮＰＣ１Ｌ１ノックアウトマウスでのコレステロール吸収は、未処置のノックアウトマウスで見られたものと同程度であった（それぞれ、１６．２±０．６％と１５．６％±０．４％）。従って、大部分のコレステロール吸収は、ＮＰＣ１Ｌ１の存在に依存しているが、残るＮＰＣ１Ｌ１を有していないマウスにおけるコレステロール吸収は、エゼチミブ処置に反応しない。これらの結果は、ＮＰＣ１Ｌ１がコレステロールの小腸細胞取込みおよび吸収に関与しており、エゼチミブ感受性経路に存在することを示している。
（実施例２５）
マウススクリーニングアッセイ（急速コレステロール吸収）
以下のスクリーニングアッセイを使用して、試料中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在を同定する。
野生型マウス（＋／＋）とＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）を得るために、ＮＰＣ１Ｌ１が欠損したマウス（−／−）を、ヘテロ接合体マウス（＋／）を交配することによって作出する。
第１の実験セットでは、非絶食マウス（６．５週齢から９週齢、１２９系とＣ５７ＢＬ／６系バックグラウンドとのミックス系統）の体重を測定し、群分けする（ｎ＝１から４ −／−およびｎ＝１から４ ＋／＋）。全ての動物に１μＣｉ ｌ４Ｃ−コレステロール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，［４−ｌ４Ｃ］コレステロール，ＮＥＣ−０１８）および担体コレステロール塊（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．１ｍｇを含有するトウモロコシ油（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．１ｍｌを胃管栄養法により与える（給餌ニードル、２４Ｇ×１インチ、Ｐｏｐｐｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。
別の実験セットでは、１から４匹の野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）を、マウスにＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について調べようとする試料をさらに給餌することを除き、上記の第１の実験セットにおけるマウスと同じように処置する。
２時間後、各マウスから心臓穿刺により採血する。肝臓を取り出し、この重量を測定し、３試料を２０ｍｌ計測用バイアルに入れる。組織を１Ｎ ＮａＯＨ １ｍｌ、６０℃で一晩消化する。この組織消化物を、４Ｎ ＨＣｌ ２５０μｌを加えて酸性化し、次いで液体シンチレーション計測（ＬＳＣ）する。微量遠心機による１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により血漿を分離し、ＬＳＣ用に、血漿から２連の１００μｌアリコートを取り出す。
この急速法により評価したコレステロール吸収を、血漿および肝臓における放射性コレステロールの総量として表す。試験試料を給餌した野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）における（上記の方法によって測定した）コレステロール吸収レベルが、この試料を給餌していない野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）におけるコレステロール吸収量より少ない場合に、この試料がＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含有していると判定される。
（実施例２６）
マウススクリーニングアッセイ（糞便比率法：コレステロール／シトスタノール）
以下のスクリーニングアッセイを使用して、試料中のＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在を同定する。
マウスにおけるコレステロール吸収を、Ａｌｔｍａｎｎら （Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５８０（１）：７７から９３頁 （２００２））により記載されている糞便二重同位元素比率法により測定する。
３つのマウス群（ｎ＝１から６／群）を設ける。２つの独立した群を野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）で構成し、１つの群をＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）で構成する。
各群に標準的な齧歯類用飼料を給餌し、一部の群では、毎日処置した。マウスにトウモロコシ油０．１ｍｌ中の１４Ｃ−コレステロール（１μＣｉ、非標識コレステロール０．１ｍｇ）および３Ｈ−シトスタノール（２μＣｉ）を胃管栄養法により与える。野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）で構成される１群のマウスにＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストの存在について調べようとする試料をさらに給餌する。糞便を２日間採取し、糞便中の１４Ｃ−コレステロールおよび３Ｈ−シトスタノールレベルを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｘｉｄｉｚｅｒで燃焼することにより測定する。
試験試料を給餌した野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）およびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス（−／−）における（上記の方法によって測定した）コレステロールおよび／またはシトスタノール吸収レベルが、この試料を給餌していない野生型ＮＰＣ１Ｌ１マウス（＋／＋）におけるコレステロールおよび／またはシトスタノール吸収量より少ない場合に、この試料がＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニストを含有していると判定される。
（実施例２７）
刷子縁膜小胞を使用した結合解析
以下のスクリーニングアッセイを使用して、試料中のＮＰＣ１Ｌ１リガンドの存在を同定し得る。
（材料） 本明細書に記載される結合アッセイ用に、以下の２種類の化合物を合成した。３Ｈ−エゼチミブグルクロニド１（３４．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびこの３５Ｓ−プロパルギル−スルホンアミド誘導体２（８００から１１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
Figure 0004590417
（エゼチミブグルクロニドおよびＳ−プロパルギル−スルホンアミド エゼチミブ−グルクロニドの合成） エゼチミブグルクロニド（化合物１）（ＥＺＥ−グルクロニドとも呼ばれる）は、米国特許第５，７５６，４７０号における手順に従って作製され得る。以下の一般スキームにより、化合物２および放射性標識３５Ｓ−２の合成法を説明する。
Figure 0004590417
化合物 ３５ Ｓ−２（放射性標識 ３５ Ｓを有する化合物２）の調製
段階Ａ：［３５Ｓ］Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド（ｉ）の調製
塩化メチレン中のストック溶液から［３５Ｓ］塩化メタンスルホニル（Ｄｅａｎ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，１７６７頁参照）適量（３．５ｍＣｉ）を取り出し、５ｍＬ三角フラスコに入れた。これを、次いで、約５０μＬ量になるまで大気圧下で蒸留した。この溶液に、すぐにプロパルギルアミン５０μＬを加えた。１５分後、この反応混合物を酢酸エチル１０ｍＬで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（３×２ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後に得られた溶液のカウント値は、３．３ｍＣｉであり、ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ、５％アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル、１５分間で直線勾配、１ｍＬ／分、ｔＲ＝４．４分）による放射化学的純度は９９．９％であった。
段階Ｂ：［３５Ｓ］４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロパ−１−イン−１−イル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（［３５Ｓ］）（ｉｉｉ）の調製 プラスチック製微量遠心管内で、［３５Ｓ］Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド３．０ｍＣｉ、化合物ｉｉ（Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００２），第１２巻，３１１頁に従って調製したもの）１ｍｇおよびトリエチルアミン１μＬをジメチルホルムアミド１００μＬに溶かした。この溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）８．１ｍｇを含むストック溶液１０μＬおよびジメチルホルムアミド１ｍＬ中のヨウ化銅１．４ｍｇを加えた。室温で６０時間攪拌した。この時点でのＨＰＬＣでは５５％変換を示した。この反応混合物のＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ、５％アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル、１５分間で直線勾配、１ｍＬ／分、ｔＲ＝９．３分）による放射化学的純度は４４．４％であり、この反応混合物をこのまま次の段階において使用した。
段階Ｃ：［３５Ｓ］４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロパ−１−イン−１−イル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸３５Ｓ−２の調製 化合物ｉｉｉを含む未精製の反応混合物をメタノール２５μＬ、水９０μＬおよびトリエチルアミン３０μＬで処理し、室温にて１時間攪拌した。この時点でこの反応物を緩慢な窒素気流下で濃縮して、ほぼ乾固させた。この残渣を１：１ アセトニトリル：Ｈ２Ｏに溶かし、セミ分取クロマトグラフィー（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８ ２５０×９．４ｍｍカラム、７０：３０ アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）４ｍＬ／分、注入 １×０．２ｍＬ）に付した。生成物５４０μＣｉを得（この生成物のＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ、７０：３０ アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、１ｍＬ／分、ｔＲ＝１０．４分）による放射化学的純度は９９．９％であった）、化合物２のオーセンティック試料と共溶出した。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ＝５０８（生成物−グルクロニド−Ｈ２Ｏ）、ＳＡ＝７６９Ｃｉ／ｍｍｏｌ。
３５Ｓ−２の代替調製法
段階Ａ：ｉｉｉの調製 塩化メチレン中のストック溶液から［３５Ｓ］塩化メタンスルホニル（Ｄｅａｎ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，１７６７頁参照）適量（１．３ｍＣｉ）を取り出し、５ｍＬ三角フラスコに入れた。これを、次いで、約５０μＬ量になるまで大気圧下で蒸留した。この溶液に、すぐにｖ １ｍｇのピリジン（水素化カルシウムで新たに蒸留したもの）５μＬ中溶液を加えた。
Figure 0004590417
この溶液を室温にて５分間攪拌した。この時点でこの溶液を緩慢な窒素気流下で濃縮して、ほぼ乾固させた。この反応混合物のＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ、５％アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル、１５分間で直線勾配、１ｍＬ／分、ｔＲ＝９．３分）による放射化学的純度は８０．１％であり、この反応混合物をこのまま次の段階において使用した。
段階Ｂ：３５Ｓ−２の調製 ｉｉｉを含む未精製の反応混合物をメタノール２５μＬ、水９０μＬおよびトリエチルアミン３０μＬで処理し、室温にて１時間攪拌した。この時点でこの反応物を緩慢な窒素気流下で濃縮して、ほぼ乾固させた。この残渣を１：１ アセトニトリル：Ｈ２Ｏに溶かし、セミ分取クロマトグラフィー（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８ ２５０×９．４ｍｍカラム、７０：３０ アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）４ｍＬ／分、注入 １×０．２ｍＬ）に付した。生成物３５０μＣｉを得（この生成物のＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ、７０：３０ アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、１ｍＬ／分、ｔＲ＝１０．４分）による放射化学的純度は９８．４％であった）、２のオーセンティック試料と共溶出した。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ＝５０８（生成物−グルクロニド−Ｈ２Ｏ）、ＳＡ＝９１１Ｃｉ／ｍｍｏｌ。
化合物２およびｉｖは、放射性標識を実施しないことを除き、３５Ｓ−２の合成のための同じ基本手順に従って、調製できる。
（刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）の調製）
膜をアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）腸、ラット（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）腸およびマウス（雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）腸から、以下の参考文献において記載されているＭｇ＋＋沈殿法および下記変形を使用して、調製した（Ｈａｕｓｅｒ，Ｈ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｋ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃ．，Ｂｏｗｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６０２，５６７から５７７頁 （１９８０）；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，Ｇｉｒｂｉｇ，Ｆ．，Ｇｕｔｊａｈｒ，Ｕ．，Ｋｏｗａｌｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｊｏｕｖｅｎａｌ，Ｋ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｔｒｉｐｉｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｓｓ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１８０３５から１８０４６頁 （１９９３）；Ｒｉｇｔｒｕｐ，Ｋ．Ｍ．，Ｏｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，２９２０から２９２６頁 （１９９２））。
新たに屠殺した動物の腸を切片にし、氷冷緩衝生理食塩水（バッファーＡ：２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．９６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭグルコース、１１７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．４）で潅流し、冷却したガラス板上に載せ、縦方向に切開し、粘膜をガラス製顕微鏡スリップで擦り取った。この粘膜は、新鮮なものを使用した場合でも凍結したものを使用した場合でも結果は同じであった。膜を調製するために、粘膜擦過物を、３００ｍＭ Ｄ−マンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４、ＨＣｌを含む）で構成され、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルの１％希釈物（セット１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む冷バッファー（２０容量）に再懸濁した。これらをＰｏｌｙｔｒｏｎを中速で氷上で使用して、顕微鏡検査により完全に細胞溶解したことが分かるまでホモジナイズした。次いで、固体ＭｇＣｌ２を攪拌しながらゆっくりと加えて最終濃度１０ｍＭにし、この溶液を氷上で１５分間攪拌し続けた。細胞残屑を３０００ｇにて１５分間の遠心分離により除去し、膜を４８０００ｇにて６０分間の遠心分離により回収した。膜を、５０ｍＭ Ｄ−マンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡおよび２ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４０）を含むバッファーに再懸濁し、４８０００ｇにて６０分間の遠心分離することによりさらに洗浄した。最終ペレットを１２０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４０）に濃度約１０から２０ｍｇタンパク質／ｍｌに再懸濁し、これを等分し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。活性は無期限に安定し、活性の損失を最小限に抑えて凍結融解できた。
膜タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８から２５４頁 （１９７６））により、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、測定した。刷子縁膜の濃縮を、マーカー酵素としてγ−グルタミルトランスフェラーゼを使用して評価した（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，Ｇｉｒｂｉｇ，Ｆ．，Ｇｕｔｊａｈｒ，Ｕ．，Ｋｏｗａｌｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｊｏｕｖｅｎａｌ，Ｋ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｔｒｉｐｉｅｒ，Ｄ．，Ｗｅｓｓ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１８０３５から１８０４６頁 （１９９３））。これにより、最初のホモジェネートに対して６倍濃縮されていることが示された。
（結合アッセイ） アッセイを１２×７５ｍｍガラス製試験管において総量２０から１００μｌで実施した。一般に、凍結した膜をバッファーＡまたは０．０３％タウロコール酸塩および０．０５％ジギトニンを含むバッファーＡで最終濃度０．０２から５ｍｇ／ｍｌに希釈した。このアッセイにおいて、放射性標識リガンドは、一般に３Ｈ−エゼチミブ（ＥＺＥ）グルクロニド１に対して２５から５０ｎＭであり、この３５Ｓ類似体２に対して３から５ｎＭであり、これらをＤＭＳＯ溶液またはＣＨ３ＣＮ溶液として送達した。競合するリガンドを同様にＤＭＳＯ溶液として加えて、全体として有機溶媒含有量２から１０％とした。非特異的結合は、１００μＭエゼチミブグルクロニドとの競合により見極めた。バッファーＡのうちの少なくとも２成分、重炭酸塩およびリン酸塩は、後に重要ではないことが分かったため、通常は省略した。平衡状態を確立するため、化合物１との反応物を、室温にて、アカゲザルの膜の場合には少なくとも３時間、ラットの膜の場合には少なくとも１時間インキュベートし、化合物２との反応物についてはアカゲザルのブラッシュメンブランの場合もラットのブラッシュメンブラン（ｂｒｕｓｈ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）の場合も３７℃で２時間の間インキュベートした。さらに、マウスＮＰＣ１Ｌ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞、ラットＮＰＣ１Ｌ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞またはヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞由来の膜の場合には、化合物２との反応物を３７℃で２時間の間インキュベートした。
結合したリガンドを、ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルターを使用するシングルチューブ真空濾過により定量した。ガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｃ）はＷｈａｔｍａｎから入手した。非特異的結合を減少させるために、フィルターを０．５％ポリエチレンイミンに浸漬することによって前処理した。濾過は、氷冷バッファー（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％コール酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．７０））２．５ｍｌをアッセイチューブに加え、フィルターを通して混合物に注ぎ、次いでチューブとフィルターをさらなるバッファー２×２．５ｍｌで３回以上洗浄することにより、実施した。フィルターを、７ｍｌバイアルで、シンチレーション液（Ｐａｃｋａｒｄ ＤＭ ｌｉｑｕｉｄ）を用いて測定した。３連のアッセイを実施した場合の標準誤差は、一般に＜４％であった。一例として、ラット刷子縁膜（２ｍｇ／ｍｌ）の、４０００００ｄｐｍ（５０ｎＭ）の３Ｈ−エゼチミブグルクロニドの存在下での１００μｌアッセイでは、１５０００ｄｐｍの特異的結合と３０００ｄｐｍの非特異的結合が得られた。フィルターが、非特異的結合の大部分の原因であった（２０００ｄｐｍ）。
また、化合物２をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ９６−ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ）で真空濾過を行っても、十分な精度が得られる。
（データ解析） 飽和実験からのデータをスキャッチャード解析に付し、線形回帰を実行して、平衡解離定数（Ｋｄ）および最大受容体濃度（Ｂｍａｘ）を得た。得られたこれらの値間の相関係数は、一般に０．９６より大きかった。競合実験からのデータを解析し、結合データのヒルプロットからＩＣ５０値を決定した。リガンドの結合および解離についての動態データをＷｅｉｌａｎｄ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎｏｆｆ（Ｗｅｉｌａｎｄ，Ｇ．，Ｍｏｌｉｎｏｆｆ，．Ｂ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２９，３１３から３３０頁 （１９８１））の解析に付した。リガンドの解離と時間との関係を示す１次プロットについては、解離速度定数（ｋ−１）を直接決定した。リガンドの結合速度（ｋ１）を、方程式ｋ１＝ｋｏｂｓ（［ＬＲｅ］／（［Ｌ］［ＬＲ］ｍａｘ））（式中、［Ｌ］はリガンドの濃度であり、［ＬＲｅ］は平衡状態における複合体の濃度であり、［ＬＲ］ｍａｘは存在する受容体の最大数であり、ｋｏｂｓはＬｎ（［ＬＥ］ｅ／（［ＬＲ］ｅ−［ＬＲ］ｔ））と時間との関係を示す擬１次プロットの傾きである）により決定した。
（結合解析） エゼチミブをｉｎ ｖｉｖｏで迅速にこのグルクロニドへと変換する。この代謝生成物は、排他的にさもなくば主として、コレステロール取込みの阻害に関与すると考えられている。よって、３Ｈ−エゼチミブおよびこの対応するグルクロニド誘導体（１）の両方を調製し、腸刷子縁膜調製物との結合について、シングルチューブ真空濾過技術を用いて試験した。３Ｈ−エゼチミブの疎水性の結果として、高い非特異的結合が観察されたため、結合アッセイでの放射性リガンドとしてのこの使用を除外した。しかしながら、グルクロニド誘導体（１）の物理的性質の向上により、この放射性リガンドでは特異的結合が観察されたため、これをアカゲザル腸刷子縁膜、ラット腸刷子縁膜およびマウス腸刷子縁膜における結合を評価するのに使用した。
アカゲザル腸擦過物、ラット腸擦過物およびマウス腸擦過物をホモジナイズし、この刷子縁膜を単離した。膜画分のみで特異的結合が観察された。アカゲザル刷子縁膜（図１）およびラット（図２）刷子縁膜との全結合、非特異的結合および特異的結合をプロットした。アカゲザルＢＢＭＶ（８３μｇ／アッセイ）またはラットＢＢＭＶ（２５０μｇ／アッセイ）のアリコートを漸増濃度の３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともにインキュベートした。１０から１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドの存在下で決定した全結合および非特異的結合を示す。特異的結合は、全結合と非特異的結合との差から算出した。上記のように、非線形回帰によりデータをフィッティングし、この線形スキャッチャードプロットを示している。アカゲザルの膜でのデータは、単一の結合部位（Ｋｄ＝４１ｎＭおよび濃度５．５ｐｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）に相当する。ラットの膜では、親和性が約１０倍低い（Ｋｄ＝５４０ｎＭ）。３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドは、マウスの膜における化合物の親和性が低いため、マウス標的についての結合アッセイに最適なリガンドではない。これらの有効性は、エゼチミブによるコレステロール取込み阻害に対するこれらの種の感受性とほぼ相関する。
（結合速度定数および解離速度定数） エゼチミブ−グルクロニドは、結合に時間がかかり、この受容体とともに比較的長寿命の複合体を形成する。実際には、リガンドのオフ速度は一般的に速いために、Ｋｄ値が１００ｎＭより大きいリガンド／受容体相互作用は、認識されずに済まされることが多いことから、このことは伝統的なフィルター−結合アッセイにおいて相互作用を検出するために重要であった。ラットの膜およびアカゲザルの膜について、化合物１の結合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を決定し、これらを代替法として用いて、関係Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに従って解離定数（Ｋｄ）を算出した。結合動態研究では、３００μｇ／アッセイのラット刷子縁膜小胞を２５ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともに室温で最大３時間インキュベートした。結合動態研究では、８３μｇ／アッセイのアカゲザル刷子縁膜小胞を２５ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともに室温で最大５時間インキュベートした。全結合から１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドの存在下で測定した非特異的結合を差し引いて、特異的結合を算出した。この特異的結合を図３Ａおよび４Ａに示す。解離動態研究では、ラット刷子縁膜小胞を２５ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともに室温で２時間インキュベートし、リガンドの解離を、１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドを加えて開始した。アカゲザル刷子縁膜小胞を４２ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともに室温で４時間インキュベートし、リガンドの解離を、１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドを加えて開始した。ラットの解離研究およびアカゲザルの解離研究の両方において、試料を種々の時点で採取し、放射性同位元素を検出した。解離曲線を図３Ｂ（ラット）および４Ｂ（アカゲザル）に示す。
ラットの膜では、結合速度定数はｋｏｎ＝５，５４０Ｍ−１ｓ−１（拡散律速接触の場合の１０８から１０９Ｍ−１ｓ−１と比較）であり、解離速度定数はｋｏｆｆ＝２．４×１０−３ｓ−１であり、この値は、半減期４．７分に相当する。このデータは図３に示す（ここで、実線は、これらの速度定数の理論値である）。これらの速度定数から推定されるＫｄ値（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝４４０ｎＭ）は、平衡状態での測定値（Ｋｄ＝５４０ｎＭ）とよく一致している。
（上記のように）３Ｈ−エゼチミブグルクロニドが少なくとも１０倍有力なアカゲザルの膜では、結合速度は同じであるが、複合体の解離半減期は約９０分に増加する。これらのデータは図４に示す（ここで、理論直線は、ｋｏｎ＝３，９００Ｍ−１ｓ−１およびｋｏｆｆ＝１．２３×１０−４ｓ−１および推定Ｋｄ＝３２ｎＭ（平衡状態での測定値（Ｋｄ＝４１ｎＭ）と比較）に相当する）。
（実施例２８）
有力なＮＰＣ１Ｌ１リガンドの結合解析
エゼチミブグルクロニドの３５Ｓ−標識プロパルギル−スルホンアミド類似体（３５Ｓ−２）をＮＰＣ１Ｌ１アンタゴニスト候補として同定した。化合物２を、実施例２７に記載のとおり調製した。この化合物２の、いくつかの種類の刷子縁膜小胞に対する親和性が著しく向上していることが分かった。アカゲザル刷子縁膜小胞では、５６μｇタンパク質／アッセイを、漸増濃度のＥＺＥ−グルクロニドおよび２の存在下で、２５ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともにインキュベートした。ラット刷子縁膜小胞では、１５０μｇタンパク質／アッセイを、漸増濃度のＥＺＥ−グルクロニドおよび２の存在下で、５０ｎＭ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともにインキュベートした。マウス刷子縁膜小胞では、２０μｇタンパク質／アッセイを、漸増濃度のＥＺＥ−グルクロニドおよび２の存在下で、３ｎＭ ３５Ｓ−２とともにインキュベートした。
２は、ラット由来の腸細胞刷子縁膜調製物に対してより有力であり（３５倍）、アカゲザルの膜調製物に対するエゼチミブグルクロニドの効力と等しい（図５、表８）。また、マウスの膜に対する親和性も高い（図６、表８）。
Figure 0004590417
（実施例２９）
腸組織への３Ｈ−エゼチミブグルクロニド（１）結合の分布
これまでの研究により、コレステロール吸収が、主として空腸で起こり、回腸および十二指腸では実質的に少ないことが立証されている。結合活性が同様に分布しているか否かを判定するために、３Ｈ−エゼチミブグルクロニド（３Ｈ−１）を放射性リガンドとして用いる結合アッセイを使用して、アカゲザルの腸およびラットの腸由来の切片における結合部位の分布を決定した。
アカゲザル研究では、アカゲザル小腸の回腸に相当する１０ｃｍを分離し、残りの腸を等しい長さの３切片に分割した（近位部、中央部および遠位部）（各７０ｃｍ）。ラット研究では、アカゲザル小腸の回腸に相当する１０ｃｍを分離し、残りの腸を等しい長さの３切片に分割した（近位部、中央部および遠位部）（各３６ｃｍ）。刷子縁膜小胞を、実施例２７に記載のとおり調製した。小胞（１００から２００μｇ）タンパク質／アッセイのアリコートを、１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドの不在下および存在下で、５０ｎＭ ３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドとともにインキュベートした。
図７で示されるように、３Ｈ−エゼチミブグルクロニドに対する特異的結合は、両方の種とも、空腸においてピークに達しており、これまでに観察されたコレステロール吸収パターンと一致している。
（実施例３０）
ＮＰＣ１Ｌ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合活性とｉｎ ｖｉｖｏでの結合活性との相関
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合活性がｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の予測となるか否かを判定するために、ラット膜結合アッセイにより試験した、エゼチミブグルクロニドのエナンチオマーおよびエゼチミブグルクロニドのいくつかの近似構造類似体を、実施例２３から２６に記載されているラットの急速コレステロール吸収研究により試験した。選択した類似体は、ある範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性を有しており、エゼチミブグルクロニドと類似した物理的性質を有すると予想された（表９および１２）。ラット標的に対してＫｄ＞１０００００ｎＭであるエナンチオマーは、ｉｎ ｖｉｖｏ アッセイでは不活性であった。他の類似体については、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、同順位序列の有効性が観察される。これにより、観察された結合がエゼチミブの標的によることがさらに明示される。
Figure 0004590417
Figure 0004590417
Figure 0004590417
（実施例３１）
エゼチミブグルクロニドおよびこの類似体の組換えＮＰＣ１Ｌ１に対する結合親和性
コレステロール結合モチーフについての遺伝子データベースの検索により、ＮＰＣ１Ｌ１をエゼチミブの候補標的として同定した。続いて、コレステロール吸収が８０％減少していることが分かり、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスではエゼチミブ処置に応答しなかった。これは、このタンパク質がエゼチミブの有効性に必要であることを強く示唆している。ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの直接標的であるか否かを判定するために、ＮＰＣ１Ｌ１トランスフェクト細胞およびラット刷子縁膜小胞に対するエゼチミブグルクロニドおよびいくつかの類似体の結合親和性を比較した。
ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（約５０００００細胞／アッセイ）を、漸増濃度のＥＺＥ−グルクロニド（化合物１）、化合物２、３、５、６または８の不在下または存在下で５ｎＭ ３５Ｓ−２（約１００万ｄｐｍ／アッセイ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。化合物８は、化合物２の類似体（この類似体では、２の３−ヒドロキシルプロピル部分のヒドロキシル基がオキソ基で置換されている）である。
ヒトＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（約６０００００細胞／アッセイ）を、漸増濃度のＥＺＥ−グルクロニド（化合物１）、化合物２、３、５、６または８の不在下または存在下でバッファーＡ中５ｎＭ ３５Ｓ−２（約１００万ｄｐｍ／アッセイ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。
図９および１２、ならびに表１０で示されるように、組換えタンパク質対する親和性と天然タンパク質に対する親和性は、実質的に同一であり、このことは、哺乳動物組織においては、ＮＰＣ１Ｌｌがエゼチミブの直接標的であり、結合には他のタンパク質を必要としないということの有力な証拠を提供する。
ヒト組換えＮＰＣ１Ｌ１に対するエゼチミブグルクロニドおよびこの類似体の親和性も決定した。これらの結果を図９に示す。これらの結果では、エゼチミブグルクロニド（１）のヒトタンパク質に対する親和性が９０７ｎＭであることが示されている。プロパルギル−スルホンアミド類似体（２）は、約５０倍強く（Ｋｄ＝２１ｎＭ）、このことは、この化合物が、ヒトにおけるコレステロール吸収の阻害効力が高い可能性があることを示唆している。
Figure 0004590417
（実施例３２）
野生型マウスおよびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス由来の膜への３５Ｓ−２の結合
ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの標的であるということを、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスおよび対照マウス由来の腸刷子縁膜における３５Ｓ−２を用いた結合研究により最終確認を得た。
野生型マウスおよびＮＰＣ１Ｌ１ノックアウト（−／−）マウスの腸組織から刷子縁膜小胞を調製した。１５μｇタンパク質／アッセイ、３０μｇタンパク質／アッセイおよび６０μｇタンパク質／アッセイの刷子縁膜小胞を、１００μＭ ＥＺＥ−グルクロニドの存在下および不在下でバッファーＡ中４ｎＭ３５Ｓ−２とともに３７℃で３時間インキュベートした。
これらの結果を図１０に示す。これらの結果では、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス由来の膜では検出可能な結合が観察されないが、年齢適合野生型対照膜には検出可能な結合が存在していることが示されている。この実験において、対照マウスの膜で観察された結合親和性（Ｋｄ＝１５６ｎＭ）は、これまでの研究で観察された結合親和性と実質的に同一であった（図１１）。
（実施例３３）
ラット由来の刷子縁膜小胞、マウス由来の刷子縁膜小胞およびアカゲザル由来の刷子縁膜小胞を使用した結合解析
結合研究を実施して、種々の刷子縁膜小胞に対するエゼチミブグルクロニドの相対的結合親和性を比較した。
３Ｈ−エゼチミブグルクロニド１を、実施例２７に記載のとおり調製した。刷子縁膜を、実施例２７に記載のとおり調製した。
（結合アッセイ） アッセイを１２×７５ｍｍガラス製試験管において総量２０から１００μｌで実施した。一般に、凍結した膜をバッファーＡまたは０．０３％タウロコール酸塩および０．０５％ジギトニンを含むバッファーＡで最終濃度０．５から５ｍｇ／ｍｌに希釈した（バッファーＡ：２６ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．９６ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５．５ ｍＭグルコース、１１７ ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．４）。［３Ｈ］エゼチミブグルクロニド１の最終濃度は、一般に２５から５０ｎＭであり、これらをＤＭＳＯ溶液またはＣＨ３ＣＮ溶液として送達した。競合するリガンドを、同様にＤＭＳＯ溶液として加えて、全体として有機溶媒含有量１から５％とした。非特異的結合は、１００から５００μＭエゼチミブグルクロニドとの競合により見極めた。バッファーＡのうちの少なくとも３成分、重炭酸塩およびリン酸塩、ならびにグルコースは、後に重要ではないことが分かったため、通常は省略した。平衡状態に達するまで、反応物をインキュベートした（ラットの膜の場合には１時間またはアカゲザルの膜の場合には３時間）。
結合したリガンドを、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルターでのシングルチューブ真空濾過により回収した。非特異的結合を減少させるために、フィルターを０．５％ポリエチレンイミンに浸漬することによって前処理した。濾過を、氷冷バッファー（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％コール酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．７））２．５ｍｌをアッセイチューブに加え、フィルターを通して混合物に注ぎ、次いでチューブとフィルターをさらなるバッファー２×２．５ｍｌで３回以上洗浄することにより、実施した。フィルターを、７ｍｌバイアルで、Ｐａｃｋａｒｄ社製のシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ＭＶ ｌｉｑｕｉｄ）を用いて測定した。３連のアッセイを実施した場合の標準誤差は、一般に＜４％であった。一例として、ラット刷子縁膜（２ｍｇ／ｍｌ）の、４０００００ｄｐｍ（５０ｎＭ）の［３Ｈ］エゼチミブグルクロニドの存在下での１００μｌアッセイでは、１５０００ｄｐｍの特異的結合と３０００ｄｐｍの非特異的結合が得られた。フィルターが非特異的結合の大部分の原因であった（２０００ｄｐｍ）。
（データ解析） 非特異的結合の補正後、非線形回帰により飽和−結合データを単一の式［Ｂ］＝Ｂｍａｘ×［Ｌ］／（［Ｌ］＋ＫＤ）にフィッティングした（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ）。この線形スキャッチャードプロットを例示している。競合実験からのＫｉについてのデータを、式［Ｂ］＝［Ｂ０］／（１＋［Ｉ］／Ｋｉ ｏｂｓ）への非線形回帰により解析し、必要に応じて、放射性リガンド競合をＫｉ＝Ｋｉ ｏｂｓ／（１＋［Ｌ＊］／ＫＤ）として補正した。
一次速度定数（ｋｏｂｓおよびｋｏｆｆ）を、一次速度式Ａ＝Ａ０ｅ−ｋｔへの非線形回帰により決定した。動態データｋｏｎをＷｅｉｌａｎｄ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎｏｆｆ（３２）に従って、方程式ｋｏｎ＝ｋｏｂｓ（［ＬＲ］ｅ／（［Ｌ］［ＬＲ］ｍａｘ））（式中、［Ｌ］はリガンドの濃度であり、［ＬＲ］ｅは平衡状態における複合体の濃度であり、［ＬＲ］ｍａｘは存在する受容体の最大数であり、ｋｏｂｓは見かけの一次速度定数である）を用いて解析した。
（結合解析） ラット由来、マウス由来およびアカゲザル由来の腸細胞刷子縁膜調製物を用いて、［３Ｈ］エゼチミブグルクロニドを使用した結合研究、ガラス繊維フィルターでの伝統的な迅速濾過アッセイを実施した（表１１）。表１１では、界面活性剤の不在下でのこれらの膜に対する［３Ｈ］エゼチミブグルクロニドの結合親和性を示している。観察された結合は、特異的飽和結合であり、単一分子部位と一致していた。ラットおよびサルについてのスキャッチャード解析および特異的／非特異的結合ウインドウを図１２に示す。ラットの膜では、結合親和性が比較的弱く（ＫＤ＝５４２ｎＭ）、ネズミの膜ではさらに弱かった（ＫＤ＝１００００ｎＭ）。対照的に、アカゲザルの膜における結合親和性は約１０倍高かった（ＫＤ＝４１ｎＭ）。結合部位の数は、種および調製に応じて５から２０ｐｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質と変動した。
［３Ｈ］エゼチミブグルクロニドの結合速度および解離速度を決定し、タンパク質−リガンド相互作用で一般に観察される速度と比べて遅いことが分かった。例えば、ラット刷子縁膜およびサル刷子縁膜との結合についての速度定数は、ｋｏｎ＝５．５４および３．９０×１０３Ｍ−１ｓ−１である（図１２）。これらの値は、拡散律速接触で一般に観察されるもの（１０８から１０９Ｍ−１ｓ−１）よりも１０００００倍小さい。同様に、これらの複合体は、非常に長寿命であり、２５℃で速度定数ｋｏｆｆ＝２．４×１０−３ｓ−１および１．２×１０−４ｓ−１（ラット複合体およびサル複合体それぞれの半減期４．７分および９６分に相当する）で解離する。比較して、一般的な拡散律速の、１００のナノ極性ＫＤリガンドの解離半減期は、通常＜１秒である。これらの速度定数からＫ０値（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）、それぞれ４４０ｎＭおよび３２ｎＭが推定される。これらの値は、平衡滴定による測定値（図１２）および先に述べた飽和による測定値（通り）とよく一致している。上記のような、ゆっくりと形成する長寿命の複合体は、タンパク質の構造変化が律速であることを示唆する。
Figure 0004590417
表１１はまた、ラット由来、マウス由来およびアカゲザル由来の種々の腸細胞刷子縁膜調製物における［３Ｈ］エゼチミブグルクロニドのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合とｉｎ ｖｉｖｏ結合との相関も示している。ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＤ５０値は、コレステロール吸収研究およびコレステロール摂食研究から得られる。ｉｎ ｖｉｖｏでのエゼチミブ有効性（ＥＤ５０）の順位序列は以下のとおりであり：アカゲザル（０．０００５ｍｐｋ）＞ラット（０．０３ｍｐｋ）＞マウス（０．５ｍｐｋ）、この順位序列はｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合親和性（ＩＣ５０）の順序、以下：アカゲザル（４１ｎＭ）＜ラット（５４２ｎＭ）＜マウス（１２０００ｎＭ）と同じである。
刷子縁膜に対する１の結合親和性は、全ての種で、ｉｎ ｖｉｖｏでのエゼチミブによるコレステロール取込み阻害に対する感受性と相関し（マウス＜ラット＜サル）（Ｃｌａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ；Ａ ｖｉｅｗ ｆｒｏｍ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７、１から９頁 （２００４）；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｒ．Ｊｒ．，Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｈｏｏｓ，Ｌ．＆ Ｔｅｔｚｌｏｆｆ，Ｇ．Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ＡｐｏＥ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１，２０３２から２０３８頁 （２００１）；Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ａ．Βｅｔａ−ｌａｃｔａｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１，１８７３から１８８７頁 （２００４））、アッセイがｉｎ ｖｉｖｏでのエゼチミブの標的に関するアッセイであるという前提と一致する（表１１）。この相互作用が極めて特異的であるということの証拠として、エゼチミブエナンチオマーのグルクロニドを調製した。このエゼチミブエナンチオマーのグルクロニドがｉｎ ｖｉｔｒｏでは完全に不活性であることが分かり（全ての種において、Ｋｉ＞１００×エゼチミブグルクロニドのＫＤ）、ラット急速コレステロール吸収モデルではｉｎ ｖｉｖｏでのこの活性損失と一致した（エナンチオマーが解析されている表１２を参照）。
（実施例３４）
ＮＰＣ１Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるエゼチミブの標的としてのＮＰＣ１Ｌ１．
本実施例では、エゼチミブがＮＰＣ１Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞と特異的に結合することを証明する。
（ＮＰＣ１Ｌ１の一過性発現） ラットＮＰＣ１Ｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ４３７８６７）またはヒトＮＰＣ１Ｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ４３７８６５）を発現するプラスミドｐＣＲ３．１を、標準的な分子生物学プロトコールを用いて調製した。トランスフェクションの１８時間前に、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清、４．５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭの入ったＴ−２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）につき１０×１０６細胞にて播種した。これらをＤＮＡ ２５μｇで、Ｆｕｇｅｎｅ トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）をＦｕｇｅｎｅ：ＤＮＡ ６：１ の割合で使用して、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて４８時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳに基づく細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して回収し、５００×ｇにてペレット化し、これをドライアイスでスナップ凍結し、−８０℃で保存した。
（ＨＥＫ−２９３細胞由来の膜調製物） 膜を、凍結した細胞ペレットを８％スクロースを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４０）（１０容量）に再懸濁し、この懸濁液を、大部分の細胞が溶解するまで、プローブ式超音波処理装置を用いて氷上で超音波処理することにより、調製した。膜を単離するために、超音波処理物を１６００×ｇにて１０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した後、上清を１２５０００×ｇにて１時間遠心分離して、膜を回収した。これらの膜を、１６０ｍＭ ＮａＣｌおよび５％グリセロールを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４０）に再懸濁し、１０から２０ｍｇ／ｍｌタンパク質において−８０℃で保存した。
ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブによって阻害される経路の重要な成分であるということを示す最新の証拠を求めて、組換えラットＮＰＣ１Ｌ１および組換えヒトＮＰＣ１Ｌ１をヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞において発現させた（図１３、パネル１）。ＮＰＣ１ＬＩを発現するＨＥＫ−２９３細胞の細胞溶解物（図１３、パネル１のレーン１およびレーン３）および野生型細胞由来の細胞溶解物（図１３、パネル１のレーン２およびレーン４）を、抗ＮＰＣ１Ｌ１抗体Ａ１８０１を用いるゲル電気泳動およびウエスタンブロットによって解析した。過剰のＮＰＣ１Ｌ１特異的ペプチドを含めて、この抗体のＮＰＣ１Ｌ１に対する特異性を評価した（図１３、パネル１のレーン３およびレーン４）。１を使用した予備結合研究では、ＮＰＣ１Ｌ１発現細胞由来の膜調製物に対する特異的結合を示したが、モックトランスフェクト細胞由来の膜に対する特異的結合は示さなかった（示していない）。
ＢＯＤＩＰＹ標識蛍光エゼチミブグルクロニド類似体（ＳＣＨ３５４９０９）に関しても、ＮＰＣ１Ｌ１発現細胞との結合が観察された（図１３、パネル２Ａ）。図１３のパネル２では、ＮＰＣ１Ｌ１−２９３細胞の表面に結合した蛍光エゼチミブグルクロニド類似体（ＳＣＨ３５４９０９）（パネル２Ａ）、１００μＭ非標識エゼチミブグルクロニドの存在下でのＳＣＨ３５４９０９とＮＰＣ１Ｌ１−２９３細胞との非特異的結合（パネル２Ｂ）、ＳＣＨ３５４９０９と野生型ＨＥＫ２９３細胞との結合（パネル２Ｃ）、および１００μＭ非標識エゼチミブグルクロニドの存在下でのＳＣＨ３５４９０９と野生型ＨＥＫ２９３細胞との非特異的結合（パネル２Ｄ）についての共焦点顕微鏡画像を示している。いずれの場合にも、プレーティングした細胞を、５００ｎＭ ＳＣＨ３５４９０９を含有する培養培地において３７℃で４時間インキュベートした。細胞を、続いてＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡により蛍光を検出した。
ＳＣＨ３４５９０９の結合は、ＮＰＣ１Ｌ１発現細胞の細胞表面膜において全く明らかであったが、過剰の非標識エゼチミブグルクロニドの存在下では完全に廃止された（図１３、パネル２Ｃ）。野生型ＨＥＫ２９３細胞では、結合は観察されなかった（図１３、パネル２Ｂおよびパネル２Ｄ）。これらの結果は、エゼチミブグルクロニドがＮＰＣ１Ｌ１と特異的に結合することを証明した。
（実施例３５）
エゼチミブのｉｎ ｖｉｖｏ標的としてのＮＰＣ１Ｌ１
ＮＰＣ１Ｌ１がｉｎ ｖｉｖｏでのエゼチミブの直接結合標的であるという証拠を得るため、１およびいくつかの重要な類似体の、ＨＥＫ−２９３細胞膜において発現される組換えラットＮＰＣ１Ｌ１および組換えヒトＮＰＣ１Ｌ１に対する結合親和性を決定し、天然ラット腸細胞刷子縁膜および天然アカゲザル腸細胞刷子縁膜に対する結合親和性と比較した。構造に微細な変化を有し、天然刷子縁膜（１０００倍の範囲に及ぶ）に対する結合親和性を有さない一連のエゼチミブ類似体を選択した。
表１２では、組換えＮＰＣ１Ｌ１−２９３細胞膜および天然刷子縁膜に対する結合親和性（Ｋｉ値）の比較を示している。選択したエゼチミブグルクロニド類似体を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から調製した組換えラットＮＰＣ１Ｌ１膜および組換えヒトＮＰＣ１Ｌ１膜と天然ラット刷子縁膜および天然アカゲザル刷子縁膜とに対して比較する。結合アッセイを、０．０３％タウロコール酸ナトリウムおよび０．０５％ジギトニンの存在下、最終量２０μｌにおいて、平衡状態に達するまで実施した。天然ラット実験、組換えラット実験および組換えヒト実験では、１．２５ｍｇタンパク質／ｍｌおよび１００ｎＭの１を使用し、天然アカゲザル実験では１．２５ｍｇタンパク質／ｍｌおよび２０ｎＭの１を使用した。
阻害の不在下で観察された全結合および非特異的結合は、それぞれ、天然ラット：７，７００ｄｐｍ＆１，１００ｄｐｍ、組換えラット：３３０００ｄｐｍ＆１，１００ｄｐｍ、天然アカゲザル：７，３００ｄｐｍ＆３６７ｄｐｍ、および組換えヒト：１９，２００ｄｐｍ＆１０００ｄｐｍであった。類似体の構造を表１２に記載する。化合物４は、立体化学的配置３Ｓ，４Ｒを有する、エゼチミブエナンチオマーのグルクロニドである。これらの測定は、０．０３％タウロコール酸塩および０．０５％ジギトニン（これらの界面活性剤の臨界ミセル濃度より低いレベル）を含むバッファー中で実施した。これらの条件は、組換え調製物において見かけの結合を２０倍ほど強化し（主として、Ｂｍａｘ効果）、１およびこの類似体のＫｉ値の定量比較を一段と進めやすくした。
表１２で示されるように、組換えラットＮＰＣ１Ｌ１および天然ラット刷子縁膜に対するＫｉ値は実質的に同一である。これは、ＮＰＣ１ＬＩがｉｎ ｖｉｖｏでのエゼチミブの分子標的であることを強く示唆している。組換えヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞由来の膜の場合、この結合親和性もまたラットの膜において観察された結合親和性と同等であるが、一方、天然アカゲザル刷子縁膜に対する結合親和性は、一様に〜１０倍強い。この結果は、エゼチミブではヒトまたはラットよりもサルにおいて有効性が大きい順序となるという発見と一致している（Ｃｌａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ；Ａ ｖｉｅｗ ｆｒｏｍ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７，１から９頁 （２００４）；Ｊｅｕ，Ｌ．＆ Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｏｆ ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ（ＳＣＨ ５８２３５），ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２５，２３５２から２３８７頁 （２００３））。
Figure 0004590417
ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの標的であるという決定的な証拠は、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスの組織を用いた研究によって得られた。ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスから調製した腸細胞刷子縁膜は、１に対して特異的な、検出可能な結合親和性を示さなかったが、一方、年齢適合野生型マウス由来の膜は高レベルの特異的結合（ＫＤ＝１２μＭ）を示した（図１４）。
図１４Ａでは、腸細胞刷子縁膜をＮＰＣ１Ｌ１が欠損した雄マウスおよび同性の野生型同腹子から調製し、これらの膜を１の結合について試験した。結合についての条件は、０．０３％タウロコール酸ナトリウムおよび０．０５％ジギトニンの存在下、２０μｌ量中５ｍｇ／ｍｌタンパク質および５００ｎＭ １でであった。左側が野生型マウス由来の膜であり、右側がＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス由来の膜である。棒グラフでは、野生型マウスおよびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス各々についての全結合（左のバー）、５００μＭコールドエゼチミブグルクロニドの存在下での非特異的結合（中央のバー）および特異的結合（右のバー）、エラーバーにより三連の測定値を表している。このグラフは、野生型マウスでは特異的結合が容易に検出できるが、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウスでは特異的結合が存在しないことを示している。
図１４Ｂでは、非標識エゼチミブグルクロニドの１との競合を表すプロットを示している。野生型マウス由来の膜（上側の曲線）ではＫｉ＝１２０００ｎＭが得られたが、ノックアウト動物由来の膜（下側の曲線）では特異的結合が実質的に検出できなかった。条件は、図１４Ａにおいて記載されているものであった。
本研究では、組換えタンパク質と刷子縁膜との間の結合の定量比較が必要である。ＳＲ−ＢＩ（スカベンジャー受容体タイプＢ１）は、エゼチミブと候補タンパク質との結合を利用した発現クローニング戦略により、潜在的標的としてこれまでに確認された。この仮説は、ＳＲ−ＢＩ欠損マウスにおいてコレステロール吸収もエゼチミブ活性も影響を受けなかったことで、簡単に退けられた（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｓ．Ｗ．ら Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ，ｔｙｐｅ １（ＳＲ−Ｂ１）ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ １５８０，７７から９３頁 （２００２））。これらの結果は、エゼチミブが天然の腸膜と組換えＮＰＣ１Ｌ１を発現する細胞とに、同等の親和性で結合し、ＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス由来の膜とは結合しないことを示す。これにより、ＮＰＣ１Ｌ１とエゼチミブとの間の特異的結合相互作用が示される。ＮＰＣ１Ｌ１が欠損したマウスは、腸コレステロール取込みにおいて障害があり、もはやエゼチミブとは反応しないというこれまでに公開されている研究結果（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｓ．Ｗ．ら Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ Ｃｌ Ｌｉｋｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，１２０１から１２０４頁 （２００４））と、これらのデータにより、ＮＰＣ１Ｌ１がエゼチミブの直接標的として明確に確立される。
（実施例３６）
界面活性剤の［３Ｈ］エゼチミブグルクロニド結合における効果
組換えタンパク質を用いた研究では、当初、トランスフェクトＮＰＣ１Ｌ１−２９３細胞の膜における結合部位の出現数が非常に少ないという実用的な側面があった。０．０３％タウロコール酸塩と０．０５％ジギトニンの組合せがこれらの膜および天然腸細胞刷子縁膜調製物との特異的結合に及ぼす影響は、図１５で例示されるように劇的なものである。
等量（２５μｇタンパク質）のラット刷子縁膜、組換えラットＮＰＣ１Ｌ１を一過性に発現するＨＥＫ−２９３細胞由来の膜および組換えヒトＮＰＣ１Ｌ１を一過性に発現するＨＥＫ−２９３細胞由来の膜を、２５ｎＭ １とともに、最終量２０μｌにおいて、平衡状態に達するまでインキュベートした。インキュベーション条件は、タウロコール酸ナトリウムおよびジギトニンを、それぞれ、最終濃度０．０３％および０．０５％まで含むバッファーＡとタウロコール酸ナトリウムおよびジギトニンを含まないバッファーＡであった。ｘ軸にある「Ｃ」は界面活性剤の不在下での対照を表し、「＋ｄｅｔ」は両方の界面活性剤の存在下での応答を表す。これらの結果を３本編成のバー群として示している。全結合（各３本編成バー群内の左のバー）、１００μＭ非標識エゼチミブグルクロニドの存在下での非特異的結合（各３本編成バー群内の中央のバー）および特異的結合（各３本編成バー群内の右のバー）を示す。
（実施例３７）
ラット膜およびアカゲザルの膜におけるＮＰＣ１Ｌ１に対するエゼチミブグルクロニドおよび種々の類似体の結合親和性
ラット刷子縁膜に関する、３Ｈ−エゼチミブグルクロニドを使用した結合アッセイの結果から決定されるように、式ＩＩの代表的な試験化合物が、ＩＣ５０ 約１３０００ｎＭ以下を有すると決定された。詳しくは特定の試験化合物がＩＣ５０ 約１９００ｎＭ以下を有し、より詳しくは特定の試験化合物がＩＣ５０ 約１０００ｎＭ以下を有し、最も詳しくは特定の試験化合物がＩＣ５０ １００ｎＭ未満を有した。アカゲザル刷子縁膜に関する、３Ｈ−エゼチミブグルクロニドを使用した結合アッセイの結果から決定されるように、式ＩＩの代表的な試験化合物が、ＩＣ５０ 約４２００ｎＭ以下を有すると決定された。詳しくは特定の試験化合物がＩＣ５０ 約１６５ｎＭ以下を有し、より詳しくは、特定の試験化合物がＩＣ５０ １００ｎＭ未満を有し、および最も詳しくは特定の試験化合物がＩＣ５０ ５０ｎＭ未満を有した。
以下の実施例において、繰り返し使用される特定の中間体には以下の名称を使用する：
Figure 0004590417
化合物（３Ｒ，４Ｓ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ヨードフェニル）アゼチジン−２−オン（ｉ−６）および４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−ヨードフェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（ｉ−７）を、Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｓ．；Ｃａｐｌｅｎ，Ｍ．Ａ．；Ｄｏｍａｌｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．；Ｂｒｏｗｎｅ，Ｍ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｒ．Ｊｒ．；Ｃｌａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００２），１２，３１１頁に従って調製した。化合物ｉ−８は、ヒドロキシ保護したｉ−７類似体（式中、保護基はアシルである）である。
また、以下の実施例において、以下の定義も使用する：
Figure 0004590417
（実施例３８）
Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルアセトアミド（ｉ−１）の調製
塩化アセチル（０．５２ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を、０℃で、ピリジン（２．５ｍＬ）中、プロパルギルアミン（０．５ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加え、得られた混合物を周囲温度まで加温した。約１５時間後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ ＨＣｌおよびブラインで連続洗浄した。この有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物（ｉ−１）を得た。この化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
（実施例３９）
Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルベンゼンスルホンアミド（ｉ−２）の調製
塩化ベンゼンスルホニル（１．１６ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を、室温で、ピリジン（５ｍＬ）中、プロパルギルアミン（０．６２ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（２２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えた。得られた溶液を周囲温度にて約１５時間エイジングした。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ ＨＣｌおよびブラインで連続洗浄した。この有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物（ｉ−２）を得た。この化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
（実施例４０）
Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−プロパ−２−イン−１−イル尿素（ｉ−３）の調製
塩化ジメチルカルバミル（０．８４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を、室温で、ピリジン（５ｍＬ）中、プロパルギルアミン（０．６２ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（２２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えた。得られた懸濁液を周囲温度にて約１５時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ ＨＣｌおよびブラインで連続洗浄した。この有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物（ｉ−３）を得た。この化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
（実施例４１）
Ｎ−メチル−Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド（ｉ−４）の調製
塩化メタンスルホニル（１．１２ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を、室温で、ピリジン（１０ｍＬ）中、Ｎ−メチルプロパルギルアミン（１．２２ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（３５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えた。約１５時間エイジングした後、反応混合物を酢酸エチルに注ぎ込み、１Ｎ ＨＣｌおよびブラインで連続洗浄した。この有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物（ｉ−４）を得た。この化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
（実施例４２）
Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド（ｉ−５）の調製
塩化メタンスルホニル（１．４０ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ）を、０℃で、ピリジン（１０ｍＬ）中、プロパルギルアミン（１．００ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（４４．０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に滴加した。約１５時間エイジングした後、反応混合物を１Ｎ ＨＣｌに注ぎ込み、酢酸エチルで２回抽出した。合わした有機抽出物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物ｉ−５を得た。未精製のｉ−５を、静置して結晶化させ、この化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
（実施例４３）
Ｎ−（３−｛４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソアゼチジン−１−イル］フェニル｝プロパ−２−イン−１−イル）メタンスルホンアミド（化合物６ａ）の調製
Figure 0004590417
トリエチルアミン（７当量）を、窒素雰囲気下、ＤＭＦ（最終生成物に対し、０．１Ｍ濃度）中、（３Ｒ，４Ｓ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ヨードフェニル）アゼチジン−２−オン（ｉ−６）（１．００当量）、Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド（ｉ−５）（１．５０当量）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．１５当量）およびヨウ化銅（Ｉ）（０．３０当量）の溶液に加え、得られた溶液を室温でエイジングする。反応完了後、揮発性物質を真空蒸発させる。未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、標題の化合物を得ることができる。
（実施例４４）
段階Ａ：４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロパ−１−イン−１−イル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（化合物７ａ）の調製
Figure 0004590417
トリエチルアミン（０．０７ｍＬ、０．５０２ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中、４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−ヨードフェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（ｉ−７）（０．０５０ｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）、Ｎ−プロパ−２−イン−１−イルメタンスルホンアミド（ｉ−５）（０．０１４ｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．０１２ｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（０．００５ｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加え、得られた溶液を室温で１８時間エイジングした。揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として０から２５％メタノール／塩化メチレン）により精製し、標題の化合物を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）７１３（ＭＨ＋）、５０５。
段階Ｂ：４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロパ−１−イン−１−イル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（化合物７ｂ、本明細書中では化合物２ともと呼ばれる）の調製
Figure 0004590417
化合物７ａのメタノール／水／トリエチルアミン（１：７：２、１ｍＬ）中溶液を室温で約１．５時間攪拌した。揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８相での分取逆相高速液体クロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１０から６５％アセトニトリル／水、０．１％ＴＦＡ修飾剤）により精製し、標題の化合物（７ｂ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）６９９（ＭＨ＋）、５０５；Ｃ３４Ｈ３６ＦＮ２Ｏ１１ＳのＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ 理論値（ＭＨ＋）６９９．２０２４、測定値６９９．２０１６。
（実施例４５）
（化合物６Ｂから６Ｇおよび化合物７Ｃから７Ｎ）
（与えられたＭＳデータで示される）以下の式ＩＩａの化合物を調製した。これらの化合物は、実施例４３（表１３に示す）または実施例４４（表１４に示す）に記載されている一般合成手順により調製することができる。
Figure 0004590417
Figure 0004590417
Figure 0004590417
Figure 0004590417
（実施例４６）
段階Ａ：４−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−オキソ−１−｛４−［（トリメチルシリル）エチニル］フェニル｝アゼチジン−２−イル）フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（８ａ）の調製
Figure 0004590417
トリエチルアミン（６９．０μＬ、０．４９５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中、ｉ−７（５０．０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）、トリメチルシリアセチレン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）（１２．０μＬ、０．０８５ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１３．０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（５．１０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加え、得られた溶液を室温で１８時間エイジングした。揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として０から２５％メタノール／塩化メチレン）により精製し、標題の化合物（８ａ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）６６０（Ｍ−ＯＨ）＋、４７０。
段階Ｂ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−１−（４−エチニルフェニル）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（８ｂ）の調製
Figure 0004590417
８ａのメタノール／水／トリエチルアミン（０．２５ｍＬ：１．１０ｍＬ：０．４０ｍＬ）中溶液を室温で約６時間攪拌した。揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８相での分取逆相高速液体クロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１０から６５％アセトニトリル／水、０．１％ＴＦＡ修飾剤）により精製し、標題の化合物（８ｂ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）５７４（Ｍ−ＯＨ）＋，３９８；Ｃ３２Ｈ３１ＦＮＯ９（ＭＨ＋）についての計算値ＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ５９２．１９８３，実測値５９２．１９８５。
（実施例４７）
段階Ａ：４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロピル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（９ａ）の調製
Figure 0004590417
メタノール（２ｍＬ）中、７ａ（４０．０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）およびパラジウム（〜８ｍｇ、活性炭に対して１０重量％（乾燥ベース））の混合物を、大気圧下で約１時間水素化した。反応混合物をセライトのショートプラグで濾過して、大量のメタノールで溶出し、濾液を真空蒸発させ、標題の化合物（９ａ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）５０９（Ｍ−糖−ＯＨ）＋。
段階Ｂ：４−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（４−｛３−［（メチルスルホニル）アミノ］プロピル｝フェニル）−４−オキソアゼチジン−２−イル］フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（９ｂ）の調製
Figure 0004590417
９ａのメタノール／水／トリエチルアミン（１：７：２、１ｍＬ）中溶液を室温で約１時間攪拌した。揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８相での分取逆相高速液体クロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１０から６５％アセトニトリル／水、０．１％ＴＦＡ修飾剤）により精製し、標題の化合物（９ｂ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）７３５（Ｍ＋Ｎａ）＋，６８５（Ｍ−ＯＨ）＋，５０９（Ｍ−糖−ＯＨ）＋；Ｃ３４Ｈ３９ＦＮ２Ｏ１１Ｓ（ＭＨ＋）についての計算値ＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ７０３．２３３７，実測値７０３．２３３７。
（実施例４８）
段階Ａ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−アセトキシ］−３−（４−フルオロフェニル）プロピル｝−１−［４−（３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチルシリル）オキシ］プロパ−１−イン−１−イル］フェニル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ａ）の調製
Figure 0004590417
トリエチルアミン（１７０μＬ、１．２５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、ＤＭＦ（１．３ｍＬ）中、ｉ−８（１５６ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチル（２−プロピニルオキシ）シラン（４３．０μＬ、０．２１４ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（ＩＩ）（１２．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（７．００ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、得られた溶液を室温で約２０時間エイジングした。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ込み、ジエチルエーテルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、この濾液を真空濃縮した。未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１５から４０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、標題の化合物１０ａを得た。
段階Ｂ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−［４−（３−ヒドロキシプロパ−１−イン−１−イル）フェニル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ｂ）の調製
Figure 0004590417
フッ化テトラブチルアンモニウム水和物（３９．０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）中の１０ａ（１３６ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）に加え、得られた溶液を室温で１時間エイジングした。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液に注ぎ込み、エーテルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空濃縮した。未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、標題の化合物１０ｂを得た。
段階Ｃ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４−オキソ−１−［４−（３−オキソプロパ−１−イン−１−イル）フェニル］アゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ｃ）の調製
Figure 0004590417
デス・マーチン・ペルヨージナン（３３．０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）を、室温で、ジクロロメタン（１ｍＬ）中、１０ｂ（６２．０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）およびピリジン（３１．０μＬ、０．３８６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。３０分後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ込み、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空濃縮した。未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出；２０から４０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、標題の化合物１０ｃを得た。
段階Ｄ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−［４−（カルボキシエチニル）フェニル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ｄ）の調製
Figure 0004590417
リン酸二水素ナトリウム（９．００ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）および亜塩素酸ナトリウム（５．００ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）の水溶液（０．１ｍＬ）を、室温で、１０ｃ（３７．０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルアルコール（０．４ｍＬ）、ジオキサン（０．２ｍＬ）およびイソブチレン（〜０．１ｍＬ）中溶液に加えた。１．５時間後、反応混合物を真空濃縮し、未精製の残渣を酢酸エチルで繰り返しトリチュレートした。有機洗液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、標題の化合物１０ｄを得た。
段階Ｅ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−１−［４−（カルボキシエチニル）フェニル］−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（１０ｅ）の調製
Figure 0004590417
メタノール（３ｍＬ）中、４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−［４−（カルボキシエチニル）フェニル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ｄ）およびシアン化ナトリウム（約１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）の溶液を４５℃まで加熱した。２２時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、メタノール／水／トリエチルアミン（１：７：２、１ｍＬ）に溶かした。室温で約１時間攪拌した後、揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８相での分取逆相高速液体クロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１０から６０％アセトニトリル／水、０．１％ＴＦＡ修飾剤）により精製し、標題の化合物（１０ｅ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）４４２．０（Ｍ−糖−ＯＨ）＋，６１８．０（Ｍ−ＯＨ）＋；Ｃ３３Ｈ３１ＦＮＯ１１（ＭＨ＋）についての計算値ＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ６３６．１８８１，実測値６３６．１８８９。
（実施例４９）
段階Ａ：４−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−｛４−（３−（エチルアミノ）−３−オキソプロパ−１−イン−１−イル］フェニル｝−４−オキソアゼチジン−２−イル）フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１１ａ）の調製
Figure 0004590417
ＤＭＦ（４０．０μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）中、塩酸エチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンの１Ｍ溶液を、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中の、４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−［４−（カルボキシエチニル）フェニル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１０ｄ）（２７．０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１９．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８．００ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）に加えた。４．５時間後、反応混合物を酢酸エチルに注ぎ込み、水およびブラインで連続洗浄した。この有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。未精製の残渣を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出；５０から６０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、標題の化合物１１ａを得た。
段階Ｂ：４−｛（２Ｓ，３Ｒ）−１−｛４−［３−（エチルアミノ）−３−オキソプロパ−１−イン−１−イル］フェニル｝−３−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４−オキソアゼチジン−２−イル｝フェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（１１ｂ）の調製
Figure 0004590417
メタノール（３ｍＬ）中、４−（（２Ｓ，３Ｒ）−３−［（３Ｓ）−３−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−１−｛４−（３−（エチルアミノ）−３−オキソプロパ−１−イン−１−イル）フェニル｝−４−オキソアゼチジン−２−イル）フェニルメチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロナート（１１ａ）（２２．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）およびシアン化ナトリウム（〜１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）の溶液を４５℃まで加熱した。１８時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、メタノール／水／トリエチルアミン（１：３：１、２．５ｍＬ）に溶かした。室温で約１時間攪拌した後、揮発性物質を真空蒸発させ、未精製の残渣を、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８相での分取逆相高速液体クロマトグラフィー（勾配溶出；溶出剤として１０から６０％アセトニトリル／水、０．１％ＴＦＡ修飾剤）により精製し、標題の化合物（１１ｂ）を得た。ｍ／ｚ（ＥＳ）６６３．０（Ｍ＋Ｈ）＋；についての計算値ＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚＣ３５Ｈ３６ＦＮ２Ｏ１０（ＭＨ＋）６６３．２３５４，実測値６６３．２３４１。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、上記の説明から当業者にとって明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものと意図される。
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号およびプロトコールが、本願を通じて引用される。これらの開示は、全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。
図１Ａは、アカゲザル刷子縁膜（ＢＢＭ）小胞への３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドの結合を示した平衡飽和結合プロットを示す図である。観察された全結合（全）を白丸、非特異的結合（ＮＳ）を三角、および特異的結合（Ｓ−結合）を黒丸で示す。 図１Ｂは、アカゲザル刷子縁膜小胞への３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニド結合のスキャッチャード解析を示す図である。 図２Ａは、ラット刷子縁膜小胞への３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニド（１）の結合を示した平衡飽和結合プロットを示す図である。１００μＭ非標識エゼチミブグルクロニドの存在下での測定で観察された全結合（白丸）および非特異的結合（三角）を含む。特異的結合（黒丸）は、全結合と非特異的結合との差から評価した。１００μｌ量において２．５ｍｇタンパク質／ｍｌにて、１時間のインキュベーション後、結合を測定した。方法に記載のとおり、非線形回帰によりデータを当て嵌めた。 図２Ｂは、ラット刷子縁膜小胞への３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニド結合のスキャッチャード解析を示す図である。結合データから、単一の高親和性部位（ＫＤ＝５４２ｎＭおよびＢｍａｘ＝２０．７ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）が確認される。 図３Ａは、ラット刷子縁膜小胞における３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドの結合動態解析を示す図である。条件は、２５℃で２５ｎＭの１および３ｍｇ／ｍｌタンパク質とした。二次速度定数ｋｏｎ（０．５５×１０−４Ｍ−１ｓ−１）は、方法に記載のとおりｋｏｂｓ（０．００４ｓ−１）から算出した。 図３Ｂは、ラット刷子縁膜小胞における３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニド１の解離動態解析を示す図である。２５ｎＭの１および３ｍｇ／ｍｌタンパク質を１時間インキュベートして複合体を形成した後、１００μＭ非標識エゼチミブグルクロニドとの競合により解離を開始した。曲線は、ｋｏｆｆ＝０．００２４ｓ−１についての理論曲線である。 図４Ａは、アカゲザル刷子縁膜小胞における３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドの結合動態解析を示す図である。 図４Ｂは、アカゲザル刷子縁膜小胞における３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドの解離動態解析を示す図である。 アカゲザル（Ａ）およびラット（Ｂ）刷子縁膜小胞からＥＺＥ−グルクロニドと化合物２により３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニドを解離させる結合アッセイの結果を示す図である。 マウス刷子縁膜小胞からＥＺＥ−グルクロニドと２により３５Ｓ−２を解離させる結合アッセイの結果を示す図である。 アカゲザル（Ａ）およびラット（Ｂ）腸組織の種々の部分から調製したアカゲザル（Ａ）およびラット（Ｂ）刷子縁膜への３Ｈ−ＥＺＥ−グルクロニド結合の分布を示す図である。 ラットＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からＥＺＥ−グルクロニドと種々の類似体により３５Ｓ−２を解離させる結合アッセイの結果を示す図である。 ヒトＮＰＣ１Ｌ１でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からＥＺＥ−グルクロニドおよび種々の類似体により３５Ｓ−２を解離させる結合アッセイの結果を示す図である。 野生型マウス（Ａ）およびＮＰＣ１Ｌ１ノックアウト（−／−）マウスから調製した刷子縁膜小胞への３５Ｓ−２の結合を示す図である。 野生型マウス刷子縁膜小胞およびＮＰＣ１Ｌ１ノックアウト（−／−）マウス刷子縁膜小胞から化合物２により３５Ｓ−２が解離される結合アッセイの結果を示す図である。 図１２Ａは、ラット腸細胞刷子縁膜における、非標識化合物と１との競合によるエゼチミブグルクロニドのＫＤの平衡測定を示す図である。膜（１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質）を１（５０ｎＭ）および指示濃度のエゼチミブグルクロニドとともに１時間インキュベートして、確実に平衡に至らせた。平衡状態でのＫＤは６００ｎＭである。 図１２Ｂは、アカゲザルサルについての対応測定を示す図である。これは、０．５から１．２５ｍｇ／ｍｌタンパク質および２２から５０ｎＭ １で行い、インキュベーション時間を３時間より長くした。平衡状態でのＫＤは３８．６ｎＭである。 ウエスタンブロット解析（パネル１）および免疫蛍光測定（パネル２）によるＨＥＫ−２９３細胞におけるＮＰＣ１Ｌ１の発現を示す図である。 図１４Ａは、界面活性剤の存在下での、野生型マウスおよびＮＰＣ１Ｌ１欠損マウス由来の腸細胞刷子縁膜への３Ｈ−エゼチミブグルクロニドの結合を示す図である。 図１４Ｂは、非標識エゼチミブグルクロニドと標識エゼチミブグルクロニドとの競合研究を示す図である。 界面活性剤、タウロコール酸塩およびジギトニンの［３Ｈ］エゼチミブグルクロニド結合における効果を示す図である。

Claims (10)

  1. ヒトＮＰＣ１Ｌ１を、候補化合物と、化合物１、化合物２、化合物８および式ＩＩａの化合物：
    Figure 0004590417
    Figure 0004590417
    式中、
    （ｉ）Ｒ ９ は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ ２ −ＮＲ １０ Ｒ １１ （式中、Ｒ １１ は、−Ｈ、−Ｃ １−３ アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ １−３ アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ １０ Ｒ １０ 、−ＳＯ ２ −Ｃ １−３ アルキルおよび−ＳＯ ２ −フェニルから成る群から選択される）であるか、または
    （ｉｉ）Ｒ ９ は、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ ２ −ＮＲ １０ Ｒ １１ 、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ １０ Ｒ １１ 、−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＲ １０ −ＳＯ ２ −Ｃ １−３ アルキルおよび−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＲ １０ −ＳＯ ２ −フェニル（式中、Ｒ １１ は、−ＳＯ ２ −Ｃ １−３ アルキルおよび−ＳＯ ２ −フェニルから選択される）から成る群から選択され；
    Ｒ １０ は、各々の存在ごとに独立して、−Ｈおよび−Ｃ １−３ アルキルから選択され；
    Ｒ １２ は、
    Figure 0004590417
     から成る群から選択される検出可能なように標識した置換２−アゼチジノングルクロニド化合物とに接触させること、および
    前記候補化合物がヒトＮＰＣ１Ｌ１と結合するか否かを判定すること
    を含む、ＮＰＣ１Ｌ１のリガンドを同定する方法であって、
    ここで、前記候補化合物のヒトＮＰＣ１Ｌ１への結合が、前記の検出可能なように標識した置換２−アゼチジノングルクロニドのヒトＮＰＣ１Ｌ１への結合を調節し、前記調節は候補化合物がヒトＮＰＣ１Ｌ１に結合するリガンドであることを示す、前記方法。
  2. 置換２−アゼチジノングルクロニドが ３ Ｈ、 ３５Ｓおよび１２５Ｉからなる群からの検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 置換２−アゼチジノングルクロニドが式ＩＩａの化合物である、請求項２に記載の方法。
  4. 置換２−アゼチジノングルクロニドが式ＩＩａ
    ｛式中、Ｒ９は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ ２ −ＮＲ １０ Ｒ １１ 、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ １０ Ｒ １１ 、−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＲ １０ −ＳＯ ２ −Ｃ １−３ アルキルおよび−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＲ １０ −ＳＯ ２ −フェニル（式中、Ｒ １１ は、−ＳＯ ２ −Ｃ １−３ アルキルおよび−ＳＯ ２ −フェニルから選択される）から成る群から選択される｝の化合物である、請求項３に記載の方法。
  5. 式ＩＩａの置換２−アゼチジノングルクロニドが３５Ｓで標識されている、請求項４に記載の方法。
  6. Ｒ ９ が−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ ２ −ＮＲ １０ Ｒ １１ である請求項５の方法。
  7. 検出可能なように標識した２−アゼチジノングルクロニドが３５Ｓ−標識された化合物２：
    Figure 0004590417
     である、請求項１に記載の方法。
  8. Ｒ １２ が
    Figure 0004590417
     である、請求項１に記載の方法。
  9. 検出可能なように標識した２−アゼチジノングルクロニドが化合物１、化合物２および化合物８から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 検出可能なように標識した２−アゼチジノングルクロニドが ３ Ｈおよび １２５ Ｉから成る群から選択される検出可能な標識を含む、請求項９に記載の方法。
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