JP4566911B2 - コバラミン分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物試料、特に、哺乳類由来の試料中のホロトランスコバラミン（ホロＴＣ）を分析するための方法、および、この分析で使用するトランスコバラミン（ＴＣ）特異的結合パートナー（ｓｂｐ’ｓ）ならびにそれらの製造方法に関する。

ホロＴＣは、コバラミンとその血清運搬タンパク質であるトランスコバラミンとの複合体である。

コバラミンまたはビタミンＢ_１２は、食物中に発見されたビタミンＢ複合体の一部を形成する水溶性ビタミンである。その核となる分子は、コバルト原子を取り囲む４つのピロールユニットのコリン環からなる。コバラミンは、動物により合成することができない唯一のビタミンであって、腸内で食物から吸収しなければならない。コバラミンは、微生物、特に、嫌気性菌および酵母菌により合成される。

コバラミンは、ビボでは、補酵素として機能し、コバラミン酵素は、三つの型の反応を触媒する事が知られている。前記反応は、（ｉ）分子内転移、例えば、Ｌ−メチルマロニルＣｏＡからのスクシニルＣｏＡの形成、（ii）メチル化、例えば、ホモシステインのメチル化によるメチオニンの形成、および（iii）ある微生物における、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元の反応である。また、コバラミン欠乏により、サイトカインおよび増殖因子調節を阻害することも考えられている（例えば、非特許文献１および２）。

消化の過程では、調理または胃の酸環境により食物中に放出されたコバラミンは、ハプトコリンと呼ばれる唾液タンパク質に捕捉され、複合体を形成する。なお、以下、ハプトコリンは、ＨＣと表す（しかし、当該技術分野では、総称して、Ｒ−バインダーまたはトランスコバラミンＩおよびIIとも呼ぶこともある）。膵酵素は、回腸中で、前記コバラミン−ハプトコリン複合体、ホロハプトコリン（ホロＨＣ）を消化し、ついで、コバラミンを放出し、そのコバラミンは、胃粘膜から分泌される内因子と呼ばれるタンパク質と結合し、さらなる複合体を形成する。前記コバラミン−内因子複合体は、末端回腸上皮の特異的レセプターと結合すると、すぐに、放出因子により解離され、そして、前記コバラミンは、回腸の膜を通じて能動的に輸送され、血流中に分泌され、その運搬タンパク質であるトランスコバラミン（ＴＣ）と結合する。

ＴＣは、従来、トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）と称されていたと認識すべきである。本願明細書で使用するＴＣ、アポＴＣおよびホロＴＣは、それぞれ、ＴＣＩＩ、アポ−ＴＣＩＩおよびホロ−ＴＣＩＩを意味する
コバラミンは、検出可能な量では、遊離形態で血中を循環しない。約９９％のコバラミンは、ＨＣ、ＴＣおよびアルブミンのいずれか一つと結合している。

目的とする組織にコバラミンを輸送する責任を担うタンパク質が、ＴＣである。ＴＣは、重要なトレースタンパク質であり、それなしでは、コバラミンは細胞膜を通過することができない。この重要な代謝機能にも関わらず、血清中の約６〜２５％のコバラミンだけがＴＣに結合するのであって、多くは、ＨＣにより運ばれる。ＴＣは、主として、血清、精液および脳脊髄液(cerebro-spinal fluid)に見出されている４５ｋＤａの単一鎖のポリペプチドである。コバラミン結合ＴＣ（ホロＴＣ）は、細胞膜上の特異的レセプターに付着し、いったん結合すると、前記ホロＴＣの複合体は、飲作用により細胞内に取り込まれる。

ＴＣは、肝臓、脈管内皮、腸細胞(enterocyte)、マクロファージおよび繊維芽細胞により合成され、主としてアポＴＣの形態で、すなわち、結合したコバラミンがない状態で循環する。このものの半減期は、ほぼ９０分と短い。

ヒトＴＣのアミノ酸配列は、以下のようであると考えられている。
ＭＲＨＬＧＡＦＬＦＬ ＬＧＶＬＧＡＬＴＥＭ ＣＥＩＰＥＭＤＳＨＬ ＶＥＫＬＧＱＨＬＬＰ ＷＭＤＲＬＳＬＥＨＬ ＮＰＳＩＹＶＧＬＲＬ ＳＳＬＱＡＧＴＫＥＤ ＬＹＬＨＳＬＫＬＧＹ ＱＱＣＬＬＧＳＡＦＳ ＥＤＤＧＤＣＱＧＫＰ ＳＭＧＱＬＡＬＹＬＬ ＡＬＲＡＮＣＥＦＶＲ ＧＨＫＧＤＲＬＶＳＱ ＬＫＷＦＬＥＤＥＫＲ ＡＩＧＨＤＨＫＧＨＰ ＨＴＳＹＹＱＹＧＬＧ ＩＬＡＬＣＬＨＱＫＲ ＶＨＤＳＶＶＤＫＬＬ ＹＡＶＥＰＦＨＱＧＨ ＨＳＶＤＴＡＡＭＡＧ ＬＡＦＴＣＬＫＲＳＮ ＦＮＰＧＲＲＱＲＩＴ ＭＡＩＲＴＶＲＥＥＩ ＬＫＡＱＴＰＥＧＨＦ ＧＮＶＹＳＴＰＬＡＬ ＱＦＬＭＴＳＰＭＰＧ ＡＥＬＧＴＡＣＬＫＡ ＲＶＡＬＬＡＳＬＱＤ ＧＡＦＱＮＡＬＭＩＳ ＱＬＬＰＶＬＮＨＫＴ ＹＩＤＬＩＦＰＤＣＬ ＡＰＲＶＭＬＥＰＡＡ ＥＴＩＰＱＴＱＥＩＩ ＳＶＴＬＱＶＬＳＬＬ ＰＰＹＲＱＳＩＳＶＬ ＡＧＳＴＶＥＤＶＬＫ ＫＡＨＥＬＧＧＦＴＹ ＥＴＱＡＳＳＳＧＰＹ ＬＴＳＶＭＧＫＡＡＧ ＥＲＥＦＷＱＬＬＲＤ ＰＮＴＰＬＬＱＧＩＡ ＤＹＲＰＫＤＧＥＴＩ ＥＬＲＬＶＳＷ（配列番号１）
下線を付した最初から１８番目のアミノ酸は、血液中を循環する成熟タンパク質には見出されていないリーダー配列である。加えて、複数の既知の多型がある。２５９番目のプロリン（前記下線部分）をアルギニンに置換した多型（配列番号２）が、最も一般的で、配列表に示すように十分に等しい。その他に記載されている多型は、Ｍ１９８Ｔ、Ｉ２１９Ｌ、Ｑ２３４ＲおよびＳ３７６Ｌである。

コバラミンは食物から吸収しなければならないため、結果として、例えば、胃腸炎または胃萎縮をもたらす状況等の胃機能障害、若しくは、機能性ハプトコリン、内因子、放出因子、ＴＣまたはＴＣレセプターを生産できなくなるあらゆる健康状態によって、コバラミンの吸収障害および欠乏症となりうる。

ある個体群の部分群、例えば、高齢、妊娠した女性、慢性または急性の胃腸疾患を有する患者、自己免疫疾患に苦しむそのような個体、悪性貧血の家族歴を持つ個体およびＡＩＤＳ患者は、特に、コバラミン欠乏症に陥りやすい。

コバラミン欠乏症の臨床症状は、多様でありかつ多数である。しかし、根本的には、貧血、巨赤芽球の造血（haematopoiesis）および神経系統の機能的構造的な疾患に伴って生じる。コバラミン欠乏症と診断された個体の約６０％は貧血症であるが、しかし、多くの場合、神経症状が、観測される唯一の臨床症状である。約１０％の患者は、精神医学的な症状を示し、かつ、約４０％は、神経的および精神医学的の両方の症状を示す。

コバラミン欠乏症の早期診断が、患者の予後良好を保証するために重要である。なぜならば、コバラミン欠乏症の徴候、特に、神経精神への影響は、早急に発見し、コバラミン治療により軽減しなければ、回復不能だからである。

それゆえ、コバラミン欠乏症にかかる可能性がある個体であるか否かを明らかにするという観点から、適切かつ効果的な方法で、個体のコバラミンレベルを的確に評価することが望まれている。細胞にコバラミンを運搬する責任を担うのは、ＴＣであるため、生体試料のホロＴＣ含有量は、トータルのコバラミン含有量を用いて行うよりも、コバラミン欠乏症のよい指標となる。

ホロＴＣは、低濃度で体液中に存在するため、以前の分析方法では、一般に、完全に満足しているわけではない。血清ホロＴＣＩＩのレベルが、正常範囲の下端である患者は、通常、血清ホロＴＣＩＩ濃度が約３０×１０^−１２Ｍであり、固体基質、例えば、シリカ上のＴＣの物理吸収に基づく慣用的な分析方法では、検出限界が、約４０×１０^−１２Ｍである。それゆえ、このような分析方法は、ホロ−ＴＣＩＩの評価は相対的にほとんど価値がない（例えば、非特許文献３参照）。

特許文献１に、ＴＣＩＩまたはホロ−ＴＣＩＩ特異的結合パートナー（ｓｂｐ’ｓ）を、ホロ−ＴＣＩＩの分析方法に使用することが提案され、自動操作およびハイスループット分析ラボラトリーの要件をより簡単に適合できるホロ−ＴＣＩＩ分析方法が記載されている。

ここで、本発明者等は、ホロＴＣ特有のエピトープを発見して、ｓｂｐ’ｓを生み出した。前記ｓｂｐ’ｓは、アポＴＣとホロＴＣとの区別に優れる。さらに、ホロＴＣエピトープの環状ペプチド“ミモトープ”擬態を作製することにより、自動化およびハイスループット分析に使用しやすいホロＴＣＩＩの分析方法を可能にするｓｂｐ’ｓを作製できる。

主な自動プラットホーム、例えば、Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）（バイエル、ドイツ）、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）（ロシュ）またはＡｘｓｙｍ（登録商標）（アボット）に容易に適応できる分析方法とするために、ホロＴＣのためのｓｂｐ’ｓが必要である。しかしながら、今のところは、このような分析に必要なアポＴＣとホロＴＣとを区別するｓｂｐ’ｓは、いまだ開示されていない。ＴＣ特異的結合パートナーを利用する分析方法は、自動化には適しているが、分離、および、ホロＴＣ含有量を測定するための余分な工程を必要とし、前記方法を自動化することを困難にし、前記分析を首尾よく行うことができる市販のプラットホームの種類を減らす。

ヒトＴＣに親和性を有するポリクロナール抗体に関する文献報告が少しだけある（例えば、非特許文献４、５、６および７参照）。ヒトＴＣに親和性を有するモノクロナール抗対に関する文献が同じくほんの少しだけある（例えば、非特許文献８および９参照）。これらの著者は、アポＴＣとホロＴＣとを区別するバインダーを見出したことについて、誰も主張していない。クアドロスは、アポＴＣへのコバラミンの結合を阻害する抗体を使用し、細胞にコバラミンを輸送する研究をした（例えば、非特許文献１０参照）。

実際、アポ型のトランスコバラミンとホロ型のトランスコバラミンとの間の物理化学的特徴の違いが十分であり、前記型の一方だけが特異的な抗体またはその他のｓｂｐ’ｓの発現が可能であるか、完全に明確になっているわけではない。実は、野生型ホロＴＣレポーターが、アポＴＣと高い親和力で結合するという報告もある（例えば、非特許文献１１参照）。さらに、ホロＴＣ非特異的抗体が、実際には、そのようなｓｂｐ’ｓを生み出すことはできない可能性があるという提案報告もある。
国際公開第００／１７６５９号パンフレット Miller、Nutrition Reviews 60: 142-144 (2002) Scalabrino et al. J. Neuroimmunology 127: 37-42 (2002) Wickramasinghe et al. J Clin Path 49: 755-758 (1996) Morelli et al. J Lab Clin Med 89 : 645-652 (1976) vanKapel et al. Biochem Biophys Acta 676 : 307-13 (1981) Quadros et al. J Biol Chem 261: 15455-60 (1986) Nexo et al Clin Chem, 46 : 1643-9 (2000) Carmel et al. Proc Soc Exp Biol Med 188: 77-81 (1988) McLean et al Blood 89 : 235-242 (1997) Biochem Biophys Res Comm 222: 149-154 (1996) Nexo et al. Biochem Biophys Acta 628: 190-200 (1980)

抗体等のｓｂｐ’ｓ（すなわち、特異的に結合するリガンド）は、本発明のような分析への使用の適性に非常に重要である２つの特有の特徴を有する。これは、それらの親和性および特異性である。抗体に対する親和性は、約１０^７から約１０^１１Ｍ^−１の範囲であり、その他のｓｂｐ’ｓは、同様の範囲の親和性を示す。高親和性の抗体（＞１０^９Ｍ^−１）は、診断分析の分野に極めて好ましい。なぜならば、低濃度での検体の捕捉を可能にするからである。

高親和性のｓｂｐを特定の検体に対して見出すことができるかどうかは、検体の表面電荷およびトポロジーに本質的には依存する。適当なモチーフ（エピトープ）が存在する場合、このモチーフに対応する抗体、ペプチド、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーまたは有機化学バインダーを、標準的な方法により生み出すことができる。すなわち、例えば、いったん特定のエピトープに対する高い親和性の抗体を同定すると、これにより、このエピトープに対して親和性を有するその他のタイプのｓｂｐ’ｓが見出されることを示す。前記親和性は、前記エピトープの内在的な性質および前記エピトープと前記ｓｂｐの結合部位（パラトープということもある）との間の一致の割合に依存する。

ｓｂｐ’ｓにより示される第２の重要な特徴は、特異性である。これは、検査する試料中に見出されるその他の分子ではなくて、その結合パートナーを認識するｓｂｐの能力である。これは、このエピトープは、前記検体分子に対してどの程度特有であるのか、前記ｓｂｐの結合部位は、どのくらい正確に一致しているのかを、ｓｂｐにより認識される分子のエピトープに主として依存する。前記検体の電荷およびトポロジーの高度に一致する結合領域には、高親和性および高特異性ｓｐｂ’ｓの双方を必要とするため、高特異性を有するｓｂｐ'ｓは、主として、高親和性をも有する。

ｓｂｐ’ｓを識別することによる方法は、主として、その結合パートナーに対して非常に高い親和性を有するｓｂｐ’ｓを同定するために、ますますストリンジェントな条件下で繰り返される一連のスクリーニングに依存する。これにより、非常に強力に結合するｓｂｐ’ｓを特定し、最も強力な結合リガンドが、最も特異的であり、最高の識別力を示すであろうと推測される。

通常の技術とは対照的に、我々は、親和性の乏しい抗体を選択し、これらを調査した。意外なことに、この方法により、アポＴＣよりもホロＴＣに対してよい特異性を示す抗体が特定された。これらの抗体は、ホロＴＣ分析に使用でき、 “ミモトープ”、すなわち、特異的なホロＴＣエピトープの擬態の同定に使用できる。前記ミモトープから、高親和性および高特異性を有するリガンドを含む、さらなるホロＴＣ特異的リガンドを生み出すことができる。前記抗体および前記ミモトープから生み出したものを順番に使用して、前記特異性を比較するホロＴＣに関するエピトープを（実験的または計算により）同定してもよい。

同定した第１の抗体は、本願明細書中で“３Ｃ４”と呼び、アポＴＣよりもホロＴＣに対して少なくとも７０倍の特異性を示す。前記“３Ｃ４”抗体は、比較的親和性が弱い（Ｋａ＜１０^７Ｍ^−１）。

したがって、第１の形態において、本発明は、アポＴＣの少なくとも４０倍を超えるホロＴＣ特異性を有するホロＴＣ特異的結合パートナーを提供する。前記特異性は、好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも７０倍（例えば、１００倍以上）である。

前記ｓｂｐは、野生型アポ／ホロＴＣと組換えアポ／ホロＴＣの双方の場合における前記アポ／ホロの識別力を示すことが好ましい。最も好ましくは、ヒト野生型アポＴＣとホロＴＣ間の特異性が、少なくとも、組換えアポＴＣとホロＴＣとの間と同程度であることである。

我々は、少なくとも7つのエピトープがヒトＴＣに存在し、これらのうちの少なくとも1つ（ここでは、エピトープ４と呼ぶ）が、ホロＴＣに発生し、アポＴＣには発生しないことを見出している。さらに、エピトープ４は、非還元（すなわち非変性）タンパク質にのみ存在し、還元（変性）タンパク質には存在しないことを見出している。これは、エピトープ４が、立体配座または不連続エピトープであることを示す。

不連続エピトープは、タンパク質の一次（線形）配列では広く間隔が開いているが、タンパク質を折畳んだ場合、近接してまとまる残基からなる抗原領域である。このようなエピトープは、前記タンパク質のアミノ酸配列の知識からは、推定、予測またはモデルをつくることはできない。なぜならば、これらは、アミノ酸配列と相関性を有していないからである。このようなエピトープは、タンパク質の３次元構造においてのみ存在する。

構造特異的エピトープを含むアミノ酸の組成および配列は、現在、前記タンパク質の結晶構造の知識からのみ推定できる。しかしながら、ヒトホロＴＣまたはＴＣの結晶構造、または、任意の種由来のコバラミン運搬タンパク質の結晶構造は決定されていない。ヒトＴＣの結晶化についての予備報告だけが、発表されており、その中では、ヒトＴＣは、Ｘ−線回折分析にあまり適さない非対称の２つの独立した分子として結晶化することが示されている（Ｇａｒａｕ ｅｔ ａｌ， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ｄ５７ ： １８９０−２ （２００１）参照）。すなわち、ＴＣに構造特異的な抗体の正確なエピトープを決定することは、現在、可能ではない。さらに、これらの予備データは、正確、高解像度のヒトＴＣの結晶構造を、現在の方法で生み出すことは不可能であることを示す。

しかしながら、本発明者等は、驚くべきことに、本願明細書に記載のとおり、ＴＣ配列の特定のアミノ酸およびアミノ酸配列を同定し、エピトープ４のエピトープ領域を提供可能にした。

それゆえ、さらなる形態において、本発明は、ヒトＴＣの以下の領域Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの少なくとも１つにおける少なくとも一箇所に結合するホロＴＣ特異的結合パートナーを提供する。
Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｐ２９７（または、好ましくはＬｙｓ２９６）。

好ましくは、前記ホロＴＣ特異的結合パートナーが、領域ＩおよびＩＩのそれぞれ、領域ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれ、または、領域ＩおよびＩＩＩのそれぞれに結合することである。最も好ましくは、前記特異的結合パートナーが、領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれに結合することである。

それゆえ、さらなる形態において、本発明は、ヒトＴＣの以下の領域Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの少なくとも１つにおける少なくとも一箇所に結合するホロＴＣ特異的結合パートナーを提供する。
Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｎ２９７（または、好ましくはＬｙｓ２９６）。

より好ましくは、前記領域ＩないしＩＩＩが、以下の配列を有することである。

最も一般的なヒトＴＣ配列において、これらの領域が、以下の配列を有する。
Ｉ ＬＰＷＭＤＲＬＳＬＥ ＨＬＮＰＳＩＹＶＧＬ ＲＬＳＳＬＱＡＧＴＫ ＥＤＬＹＬＨＳＬＫおよびＴＡＣＬＫ
ＩＩ ＩＬＡＬＣＬＨＱＫＲ ＶＨＤＳＶＶＤＫＬＬ ＹＡＶＥＰＦＨＱＧＨ ＨＳＶＤＴＡＡＭＡＧ ＬＡＦＴＣＬＫＲＳＮ ＦＮＰＧＲＲＱＲＩＴ ＭＡＩＲＴＶＲＥＥＩ ＬＫＡＱＴＰＥＧＨＦ ＧＮＶ
ＩＩＩ ＲＶＡＬＬＡＳＬＱＤ ＧＡＦＱＮＡＬＭＩＳ ＱＬＬＰＶＬ（配列番号７）
重要であると考えるアミノ酸残基に、下線を施した。

結合パートナーまたはリガンドが、ＴＣのようなタンパク質の領域に結合すると記載されている場合、これは、前記結合パートナーと前記領域における少なくとも1つのアミノ酸との間に、少なくとも一つの相互作用があることを示す。リガンド結合に寄与することは、領域全てのアミノ酸には珍しいが、好ましくは、結合が、その領域における前記リガンドと少なくとも２つのアミノ酸とが相互作用することを示し、より好ましくは、その領域（例えば、８または１０）における３、４、５またはそれ以上のアミノ酸が、前記リガンドと相互作用することである。相互作用は、例えば、前記タンパク質と結晶化または形作られたときの前記リガンドの構造を調べることにより、測定できる。一般的には、約０．５ｎｍ未満の距離が、相互作用を示していると考えられる。

好ましくは、ＴＣ特異的結合リガンドが、下線を付した重要な残基のうちの少なくとも１つの残基によって、前記領域ＩないしＩＩＩと相互作用することである。より好ましくは、ＴＣ特異的結合リガンドが、下線を付した極めて重要な残基のうちの少なくとも１つの残基によって、前記領域ＩないしＩＩＩと相互作用することである。最も好ましくは、前記相互作用の少なくとも半分が、前記重要な残基または極めて重要な残基とである。

ヒトＴＣの結晶構造を欠く場合、ＴＣのミモトープ擬態対するエピトープ４は、３Ｃ４抗体を用いて生み出す。ジスルフィド制限ペプチドのファージ提示ライブラリを、ホロＴＣ特異的モノクロナール抗体（ｍＡｂ）３Ｃ４でスクリーニングし、２つの類似のモチーフを形成する一連の特異的なペプチドを同定した（実施例４参照）。前記ペプチドは、ｍＡｂ ３Ｃ４に特異的であった。これらは、ホロＴＣ上のその他のエピトープに向けられたｍＡｂと結合せず、ｍＡｂ ３Ｃ４との結合は、ホロＴＣによってブロックされた。すなわち、これらは、前記ホロＴＣ特異的エピトープ４の真の擬態、および競合相手であることを示した（実施例５参照）。

本願明細書に記載のミモトープのようなペプチドは、当該分野で十分知られている、アミノ酸を自然に発生する標準的な生化学の単一の文字コードで記載される。これらのうち、本発明に特に重要な意味を持つのは、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）である。

前記ミモトープは、下記のモチーフ
ＳＸ_１ Ｘ_２ＹＸ_３ ＷＤ Ｘ_４ Ｘ_５ Ｘ_６
ここで、Ｘ_１＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
Ｘ_２＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
Ｘ_３＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
Ｘ_４＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
Ｘ_５＝Ｄ、Ｆ
Ｘ_６＝Ｍ、Ｒ（配列番号８）
または、前記モチーフが、ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷ（配列番号９）を有する制限ペプチドで構成され、細胞またはファージの表面に任意に付着している。

このようなミモトープおよび特にそのポリハプテン構築物は、適当なラベルを持つことができるので、ホロＴＣ競合アッセイに有用である。また、前記ミモトープは、アポＴＣよりもホロＴＣに対して特異性を有するその他のホロＴＣ特異的結合パートナーを同定するために使用してもよく、任意で、ホロＴＣに対して高い親和性を有するその他のホロＴＣ特異的結合パートナーを同定するために使用してもよい。

それゆえ、本発明は、モチーフ
ＳＸ_１ Ｘ_２ＹＸ_３ ＷＤ Ｘ_４ Ｘ_５ Ｘ_６
ここで、Ｘ_１＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
Ｘ_２＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
Ｘ_３＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
Ｘ_４＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
Ｘ_５＝Ｄ、Ｆ
Ｘ_６＝Ｍ、Ｒ
または、モチーフ
ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷ
を含む制限ペプチドミモトープ（好ましくはラベルされている）であって、細胞またはファージの表面に任意に付着しており、または２以上（例えば、２、３、４、５または６）のこのようなミモトープの構築物の使用を含むホロＴＣの分析方法を提供する。このような分析方法は、ホロＴＣを、ホロＴＣ特異的結合パートナーに予め結合させ、残りの結合部位を、前記ミモトープにより検出する方法とすることができる。好ましくは、前記分析方法は、前記ミモトープまたはその構築物が、ホロＴＣに対して特異的に結合するリガンド上の特異的結合部位に対してホロＴＣの競合相手として機能する競合アッセイである。

このような分析方法において、前記ｓｂｐは、一般的に、結合されているか、または結合可能である。

概して、このような分析は、ヒト対象または動物対象由来の試料を、限られた数の結合部位を有する限られた量のホロＴＣ特異的結合パートナーと接触させることを含む。ついで、前記試料由来のホロＴＣと前記ミモトープまたはミモトープ構築物とは、これらの部位と結合するために競合する。ついで、前記結合部位または非結合部位を分離し（例えば、架橋または析出剤による析出、ｓｂｐ固定化基質の洗浄、ろ過、磁選、遠心分離、例えば、ｐＨ等の条件の変化等）、結合部分および非結合部分を得ることが好ましい。ついで、前記試料中のホロＴＣを、前記結合部位に結合するか、または、非結合部位に結合せずに残っているミモトープまたはミモトープポリハプテンの量を測定し、これを、前記試料中に存在するホロＴＣの量と関連づけることにより測定できる。前記ｓｂｐと結合するミモトープの量が多ければ多いほど、前記試料中のホロＴＣの量はより少なく表される。前記結合または非結合ミモトープまたはミモトープ構築物を、結合および非結合フラクションの分離なく検出可能である場合、例えば、凝集促進剤の添加に伴う光透過率の変化、または、前記ホロＴＣｓｂｐ、前記ミモトープまたは構築物が蛍光標識され蛍光偏光の変化等により検出可能である場合、前記分析方法は、結合および非結合フラクションの分離を伴う必要性はない。

本発明の全ての関連した形態において、ホロＴＣ濃度の評価のための適当な試料は、あらゆるホロＴＣを含む試料、例えば、体液または組織試料、それらから調製した試料等である。好ましくは、前記試料が、例えば、精液、脳脊髄液または羊水等の体液であり、より好ましくは、血液から生成された試料であり、特に好ましくは血清試料である。

ホロＴＣの分析を含む本発明の全ての形態において、特異的結合パートナーとしては、抗体、単一鎖抗体、抗体フラグメント、抗体構築物、オリゴペプチド（例えば、制限環状ペプチド）、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）、小有機分子等が適当であり、これらは、固定されていてもよいし、固定化可能であってもよい。特異的結合パートナー（例えば、このような分析用）は、抗体であることが好ましく、特に好ましくは、モノクロナール抗体ならびにそのフラグメントおよび構築物（例えば、Ｆ_ＡＢフラグメント）であり、さらに特に好ましくは、前記したモノクロナール抗体３Ｃ４、そのフラグメントおよびその構築物である。また、好ましいｓｂｐとしては、オリゴヌクレオチドアプタマー（すなわち、短く、好ましくは、制限された二重鎖またはより一般的には単一鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列）である。ある場合において、これらのアプタマーの特異性が、一般的に好ましい値よりも低程度の値であってもよい。例えば、これらが、少なくとも８倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１５倍アポＴＣよりもホロＴＣに対して特異性を示すことである。明らかに、前記した通りより高い特異性を有するアプタマーが好ましい。

特に好ましいｓｂｐは、リンカーにより単一ポリペプチドに結合し、単一ＤＮＡ配列によりコードされた完全な抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む単一鎖の抗体フラグメントである。これらは、完全な抗体をコードするｍＲＮＡから、当該分野において既知の技術により調製できる。このようなｓｃＦｖは、完全な抗体よりも極めて短いため、より密接に配置でき、より高い結合部位密度を有する構築物を形成できることから有利である。また、これらは、Ｅ． Ｃｏｌｉおよび／またはバクテリオファージにおいて発現できるため、哺乳類の細胞系で発現させるよりも、より簡単に、大量につくることができ、遺伝子組換えおよび最適化の影響をより受けやすい。ｓｃＦｖは、簡単に配列でき、ＴＣ２および３Ｃ４に対応するｓｃＦｖの配列は、実施例１１で示す（表６）。これらのｓｃＦｖは、対応する抗体全体と比較した場合、同様の特異性を有することが分かった（実施例１１）。

ＴＣ２および３Ｃ４と領域を同等に結合するｓｃＦｖを同定することに加えて、３Ｃ４に対応するｓｃＦｖは、変異およびスクリーニングにより２回目の親和性熟成を行う（実施例１３参照）。すなわち、抗体ＴＣ２の使用が示唆するように、単一鎖の抗体フラグメントｓｃＦｖ＿ＴＣ２、または親和性を熟成させた同等物を使用することが同様に好ましく、抗体３Ｃ４の使用が示唆するように、単一鎖の抗体フラグメントＳｃＦｖ＿３Ｃ４、または親和性を熟成させた同等物を使用することが同様に好ましい。

前記単一鎖抗体フラグメントは、本願明細書に記載のあらゆる方法により、検出するために標識されていてもよい。それらが標識される場合、前記標識を、前記結合領域を介してｓｃＦｖに連結することが好ましい。最も好ましくは、前記標識を、機能側鎖を介して前記結合領域に連結することであり、特には、前記側鎖が、システインのＳＨ基またはチロシンのＯＨ基である。

すなわち、本発明は、本願明細書の実施例に記載の各抗体に対応する単一鎖の抗体、特に、本願明細書に記載するエピトープ４および５に対して特異的なｓｃＦｖをさらに提供する。最も好ましくは、表６に示すＴＣ２＿ＳｃＦＶならびに３Ｃ４＿ＳｃＦｖ、および、表９および１０に示す親和性を熟成させた同等物である。

３Ｃ４＿ＳｃＦｖの結合特性を改善するために、遺伝子組換えおよび最適化を行った（親和性成熟）。個々のクローンのサイズが、１０^５−１０^６のランダム変異導入ライブラリをつくり、当該分野で既知の技術を用い、バクテリオファージ上で発現させた。ｓｃＦｖ ３Ｃ４の親和性成熟により、より高い親和性を有する新規のｓｃＦｖクローンが１２個得られ、ホロＴＣに対する親和性を保持していた（表９）。最高のｓｃＦｖクローンに、２回目の突然変異を行い、ライブラリ構築物から９つの新規のｓｃＦｖを選択したところ、１番目に作製したライブラリで最もよいｓｃＦｖ（表１０のクローン３．１０Ｅ５）よりも、より高い親和性を有するものが６つあった。実施例１５に記載するように、親和性の熟成は、既知の技術を使用することにより行った。

モノクロナール抗体の単一鎖の抗体フラグメントは、標準的な操作を用いて、構築できる（例えば、McCafferty J, Hoogenboom HR, and Chiswell DJ (ed.) (1996) Antibody Engineering - A practical approach, IRL Press, Oxford, UK）。便宜上、例えば、ｍＲＮＡ調製に、ＱｕｉｃＰｒｅｐ（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット、および、Ｅ．Ｃｏｌｉの可溶性タンパク質としてｓｃＦｖ抗体発現用Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）といった市販のキットを使用してもよい。既知の技術および市販のキットを使用することにより、本願明細書に記載のいかなる完全なＩｇＧ抗体からｓｃＦｖを生成するための典型的な方法は、実施例１２に記載した。

上記したミモトープの使用を含む分析に適している特異的結合パートナーは、本願明細書に記載するように、エピトープ４と重複するエピトープに特異的であることが好ましい。このようなリガンドは、通常、エピトープ４に特異的である。

本願明細書に記載のあらゆるリガンドの固定化方法は、当該分野で既知であり、アミド、ジスルフィドまたはアミノ結合の形成（例えば、カルボジイミドカップリング剤を使用することにより）といった共有結合、金へのチオールの吸着といった物理化学的吸着、固定化した特異的結合パートナーのカップリング（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンまたはネズミｍＡｂを捕獲するためのヤギ抗マウス抗体）および不溶性抗体沈殿の形成を含む。固定化リガンドは、基質に予め結合してもよいし、適当な結合パートナーを担持した基質または析出剤の添加により、分析の間に固定化してもよい。

本願明細書に記載の特異的結合リガンドを固定化するために適当な基質は既知であり、ガラス等の表面または高分子の表面、とりわけ、ディッシュ、マイクロタイター分析用プレートまたはシート、特にそのウェルの内部、ＳＰＲスライド、ＡＦＭスライド等の表面、ガラスのビーズまたは高分子ビーズ等の表面、セルロースまたは高分子膜といった膜、さらに、ある条件下で膨張または可溶性であるが、ろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーといった技術によって析出または分離できる樹脂およびデンドリマーといった高分子があげられる。基質として最も好ましくは、Ｂａｎｇｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（例えば、Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＥＭＩ−１００／４０）社製のもの、ＳＰＲチップ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）等の磁化高分子ビーズおよびマイクロタイタープレートの表面である。

本願明細書に記載の標識の種類は、当該分野で既知の多くのいずれの方法による検出のために標識してもよい。このような標識方法としては、蛍光標識（例えば、蛍光発光、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、ルシフェラーゼのようなタンパク質または化学発光剤（ルミノール（３−アミノフタルヒドラジド）または近赤外ルミネセンス金属アザトリフェニリン複合体等）による発光標識、色素といった作用物質の吸収光または反射光での色標識、酵素標識（例えば、アルカリペルオキシダーゼ）、トリチウム、炭素−１４または放射性ヨウ素での放射性同位体標識、シンチレーション剤の使用の有無、および、磁気標識、特に、フェロオキシド標識されたデキストランといった常磁性体基質での磁気標識等があげられる。また、シンチレーション近傍アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移法も適している。磁気、発光および蛍光法、特に、化学発光法が好ましい。

検出法が、酸化剤といった補基質の添加を必要とする場合、これを適当な段階で添加する。一般的には、前記標識と同時または適当な洗浄工程の後に添加する。あるいは、本願明細書に記載の種類が、自身の質量により標識されるものであってもよい。このような場合、例えば、当該分野でよく知られた技術であって、通常、Ｂｉａｃｏｒｅのような業者のＳＰＲ機材を利用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりこれらを検出してもよい。その他の物理的な標識方法としては、力を利用した顕微鏡（例えば、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）または化学力顕微鏡）の“チップ”との結合があげられる。この場合、チップのたわみの変化により、結合を検出する。

本発明のいずれかの形態において使用する場合、本願明細書に記載のミモトープおよびその他のペプチドは、固相ペプチド合成のような方法により形成される合成ペプチドであってもよいし、もしくは、ファージの表面上の提示またはバクテリアといった生合成により形成されてもよい。前記ペプチド（例えば、ミモトープ）を生合成する場合、これらは、生合成細胞、ファージ、有機体等から分泌されてもよいし、その表面上に提示されてもよい。表面提示の場合、前記ペプチドは、通常、ファージ上に提示される（例えば、ファージ被覆タンパク質の全てまたは一部に共役して付着する）。このようなペプチド（例えば、ミモトープまたはエピトープ領域の共役物）は、前記ファージの表面から開裂することによるか、若しくは、ファージ全体、提示したペプチドを含むファージの部分または小部分を使用することにより本発明の方法に使用してもよい。前記ペプチドを免疫応答の発生に使用する場合、前記ペプチドを分離した免疫原性担体に共役させる必要がなく、免疫システムを誘発できることから、ファージ全体を使用することが有利である。

さらなる形態において、本発明は、ホロＴＣ特異的結合パートナーを特定する方法であって、アポＴＣの少なくとも４０倍を超えるホロＴＣ特異性を有し、少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも７０倍、最も好ましくは１００倍以上であり、前記ペプチドミモトープ、その構築物またはその共役物で、特異的なバインダーの可能性があるライブラリをスクリーニングすることを含む方法を提供する。このような方法は、下記の実施例１および２においてホロＴＣを使用すると記載しているのと同様に、通常、“パンニング”アッセイの形態を取るが、前記ミモトープは、ホロＴＣのエピトープ４と同等のエピトープに相当し、それゆえ、同定されるバインダーの多くは、アポＴＣよりもホロＴＣに対して特異的に結合するという利点を有する。適当なバインダーは、下記の実施例１および２に記載するように、ｍＡｂｓ、そのフラグメントまたはその構築物を含む。同様の技術であることが明らかであれば、下記の実施例４に記載した方法と同様にして、例えば、小有機分子、アプタマー、またはオリゴペプチド等のその他の種類のスクリーニングを簡単および型どおりに変更できる（例えば、ペプチドファージ提示ライブラリの使用）。同様に、このようなミモトープその構築物を標準的なハイスループットアッセイ法に使用し、特異的なホロＴＣバインダーを、市販されているような合成ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは小有機分子のライブラリから同定してもよい。

アプタマーは、前記ミモトープに対するスクリーニングにより特定可能なｓｂｐの好ましい種である。このようなＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーを同定する場合、前記アポＴＣを超えるホロＴＣ特異性を有することが好ましく、その値が、少なくとも８倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１０倍であることが好ましい。

さらなる形態において、本発明は、哺乳類、または、好ましくは哺乳類以外の対象（例えば、鳥、魚または昆虫）において、ヒトホロＴＣ特異的抗体を誘導する方法であって、前記対象に、前記ミモトープ若しくはその免疫原性構築物および／または共役物（特に、ＢＳＡといった適当なタンパク質と共役させたポリ−ハプテン構築物）を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、前記対象が鳥である。ニワトリが特に適当である。前記ミモトープ、その構築物またはその共役物は、免疫原性であり、好ましくは、免疫応答を誘導するためにミモトープの複数のコピーを有することである。このような方法は、通常、前記ミモトープの適当な抗原構築物を投与し、適当な期間、免疫反応を生じさせる。状況に応じて、１以上の追加抗原投与量の同一またはその他のミモトープ構築物を投与し、そして、前ポリクロナール抗体抽出物の形または好ましくは抗体分泌細胞の形で、記対象から抗体を抽出し、ついで、当該分野で既知の方法を用いて培養してもよい。この方法の形態において、ヒトホロＴＣＩＩ若しくはそのフラグメントまたは構築物を、哺乳類以外の対象の初期免疫処置、または、１以上のブースター免疫処置、若しくは双方に使用してもよい。

また、ホロＴＣ特異的結合パートナーを、本願明細書に記載のエピトープ４のエピトープ領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのうちの少なくとも１つを発現するように設計したペプチド共役物を使用することにより識別してもよい。このようなペプチドは、ヒトホロＴＣからの配列に準ずる；
Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｐ２９７（または好ましくはＬｙｓ２９６）
前記領域は、通常、前記配列を有する。

すなわち、適当なペプチド共役物は、通常、適当なリンカー配列に挟まれた、配列Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ、若しくは、そのフラグメントを有し、前記領域の望ましい３次元構造を示す。好ましくは、配列ＩおよびＩＩ、配列ＩＩおよびＩＩＩまたは配列ＩおよびＩＩＩの全て若しくは一部が、リンカー配列の間に存在することである。より好ましくは、配列Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの３つ全てが、全部または部分的に、リンカー配列の間、および、フランキング配列の一方の末端または双方の末端で前記共役物に少なくとも１箇所（任意の順序で）存在する。全てのリンカーおよび／またはフランキング配列が、システイン残基といった架橋可能な部分を含み、前記ペプチド共役物の３次元構造を制御可能であってもよい。前記共役物は、また、領域Ｉ−ＩＩＩに加えて、若しくは、これらの領域の全てまたは１以上に代えて、前記ミモトープ配列を含んでいてもよい。適当な配列は、化学的に合成されてもよいし、または、より一般的には、本願明細書に記載のミモトープの発現方法と類似の方法により細胞またはファージで発現させることである。

また、ホロＴＣ特異的結合パートナーを、本願明細書に記載のエピトープ４のエピトープ領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩのうちの少なくとも１つを発現するように設計したペプチド共役物を使用することにより識別してもよい。このようなペプチドは、ヒトホロＴＣからの配列に準ずる；
Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｎ２９７（または好ましくはＬｙｓ２９６）

前記ペプチド共役物は、さらに、分析においてそれらを使用し、ホロＴＣ特異的結合パートナーの識別する本発明の形態を形成する。すなわち、前記ペプチド共役物（およびそれらの構築物、標識された相当物等）は、特異的なバインダーを識別する方法、分析方法および免疫反応を誘導する方法を含む本発明の適当な形態において、前記ミモトープの代わりとなりうる。

よりさらなる形態において、本発明は、試料（例えば、生体由来の液体試料）中のホロＴＣを分析するための分析方法を提供する。前記方法は、ホロＴＣ特異的結合パートナーを前記試料と接触させる工程、および、得られたホロＴＣと前記特異的結合パートナーとの共役物を検出する工程を含み、前記特異的結合パートナーが、アポＴＣと比較して少なくとも４０倍ホロＴＣに対して特異性を有し、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは７０倍（例えば、下記の実施例６参照）の特異性を有することである。

この方法において、診断検査において慣用されているように、前記共役物の検出は、直接であってもよいし、または間接的であってもよいし、定量、半定量又は定性であってもよい。すなわち、直接的な検出は、非共役ホロＴＣおよびｓｂｐの特性と相違する前記共役物の特性による物であってもよい（例えば、質量または放射発光、吸収または反射特性）。間接的な検出としては、例えば、ホロＴＣ：ｓｂｐ共役物と競合して形成される接合体を検出することによるか、または、さらなるリガンド（例えば、標識されたリガンド）とホロＴＣ：ｓｂｐ共役物との共役物を検出することによるか、もしくは、前記試料から前記共役物を分離し、コバラミンを放出し、前記放出されたコバラミンを検出することによる。定性および半定量的な検出としては、前記試料に存在するホロＴＣの量が、予め測定した濃度限界よりも上か下かどうか、若しくは、選択した標準における濃度よりも高いか低いかどうかを測定することを含む。例えば、試料の供給源が、ホロＴＣ欠乏を患うか、そうでないかを単に指摘するようなものである。

前記分析は、ホロＴＣ量の定量的な測定を含むことが望ましく、任意で、全ＴＣ量および／または全コバラミン量の測定を含むことである。この分析方法で使用する特異的結合パートナーは、また、モチーフ
ＳＸ_１ Ｘ_２ＹＸ_３ ＷＤ Ｘ_４ Ｘ_５ Ｘ_６
ここで、Ｘ_１＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
Ｘ_２＝ Ｆ、Ｌ、Ｒ
Ｘ_３＝ Ｌ、Ｐ、Ｑ
Ｘ_４＝ Ｍ、Ｑ、Ｙ
Ｘ_５＝Ｄ、Ｆ
Ｘ_６＝Ｍ、Ｒ
または、モチーフ
ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷ
を含む制限ペプチドに対する特異的結合パートナーであってもよく、好ましくは、前記パートナーである。特には、モノクロナール抗体またはフラグメントまたは構築物若しくはこのような特異性を有するＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーであってもよい。さらには、この方法に使用する前記ホロＴＣｓｂｐは、アポＴＣおよびホロＴＣの双方に対して親和性を有するその他のｓｂｐとの先の結合により、ホロＴＣとの結合を妨げてもよいし、好ましくは妨げることである。好ましい形態において、前記特異的結合パートナーは、本願明細書に記載のＴＣのエピトープ４と部分的に重複するエピトープに特異性を有するモノクロナール抗体、もしくは、このような抗体のフラグメントまたは構築物である。特に、このような抗体が、エピトープ４に特異的であり、例えば、前記ＴＣ上の領域Ｉ−ＩＩＩのうち、いずれか一つ、いずれか二つ、または３つ全てに結合してもよい。最も好ましくは、このような抗体、フラグメントまたは構築物が、本願明細書に記載の抗体３Ｃ４（または対応するｓｃＦｖ）、若しくは、そのフラグメントまたは構築物である。適当な特異的結合パートナーは、本願明細書に記載の通り、ＴＣ、前記ミモトープ、または領域Ｉ、ＩＩおよび／またはＩＩＩの適当な構築物との結合のための選択に基づき、慣用的な技術により特定してもよい。

前記ホロＴＣｓｂｐ選択過程は、通常、（ｉ）ホロＴＣおよび／または前記ミモトープまたはその構築物と結合する能力を選択し、（ｉｉ）ホロＴＣおよびアポＴＣについて必要な特異性を有さないｓｂｐの候補を除外する。また、前記ｓｂｐ選択過程は、ハプトコリンまたはその他の血清タンパク質と結合するｓｂｐの候補を除外することを含むことが望ましい。本発明のホロＴＣ分析において、前記ｓｂｐと接触させる前に、ＨＣまたは他の血液タンパク質から分離されたＴＣを必要となるためである。

したがって、本発明のホロＴＣｓｂｐは、アポＴＣと比較して、前記ミモトープまたは構築物に対して、少なくとも４０倍の特異性を有するｓｂｐが好ましく、特には少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも７０倍である。前記ホロＴＣｓｂｐは、また、その他のコバラミン結合タンパク質のホロ型よりもホロＴＣに対して、少なくとも５０倍の選択性を有することが好ましく、好ましくは少なくとも７０倍、より好ましくは１００倍である。

本発明の分析方法において、前記ホロＴＣ特異的結合パートナーは、ホロＴＣを捕獲するために使用してもよいし、第２のリガンドにより予め捕獲されたホロＴＣを識別するために使用してもよい。

前記ホロＴＣｓｂｐを、ホロＴＣを捕獲するために使用する場合、通常、前記固定化剤または沈殿剤の使用により適当な基質上に固定化するか、固定化可能である。このような基質、薬剤および固定化方法は、当該分野でよく知られており、その方法としては、前記した方法があげられる。ついで、前記ホロＴＣ特異的結合パートナーにより捕獲されたホロＴＣを、第２の標識された（任意）リガンドと接触させることにより識別してもよい。このような第２のリガンドは、ホロＴＣに対して特異的であってもよいが、通常、ＴＣ（アポおよびホロの双方）に特異的であって、結合ホロＴＣにより提示される如何なるエピトープと結合してもよい。あるいは、前記第２のリガンドを使用して、捕獲したホロＴＣと、第２のリガンドに対して特異性を有する標識された第３のリガンドとを結合してもよい。ついで、このような第３のリガンドは、例えば、後で添加してもよいし、同時に添加してもよい。検出が、質量感受技術またはＳＰＲといった屈折率感知技術により行われる場合、前記リガンドは、その自身の質量により単に“標識”されていてもよい。

この“特異的な捕獲”技術を利用する典型的な分析方法は、
対象（例えば、ヒト患者または動物、特に哺乳類）由来の液体試料を、固体化または固定化可能なホロＴＣ特異的結合パートナーと接触させて、ホロＴＣ：ｓｂｐ共役物を形成する工程、
前記特異的結合パートナーを、ＴＣまたはホロＴＣに対する第２のリガンドと接触させ、前記第２のリガンドを、前記結合したホロＴＣと結合させ、ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物を形成する工程、
前記ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物から結合していない第２のリガンドを分離し、任意で、前記ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物の濃度を上昇させる工程、
任意で、前記ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物を基質から解離する、および／または、ホロＴＣ：第２のリガンド共役物を前記ｓｂｐから解離する工程であって、前記解離が、前記液体試料の体積未満の体積の液体中に解離することが好ましい、
任意で、補基質または第３のリガンドを添加し、前記ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物の検出を容易にする工程、
ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物を検出する工程、および
ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物の検出量を、前記液体試料中のホロＴＣの濃度と関連付けて、前記液体試料中に存在するホロＴＣの定量、半定量または定性測定を行い、任意で、前記液体試料中に存在するホロＴＣを、前記対象におけるコバラミン欠乏の有無を関連づける工程を含む。

本願明細書に記載の好ましいホロＴＣ用アッセイは、捕獲抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４、および、検出ｓｂｐとして非重複、高親和性抗体（実施例６.３）またはアプタマー（実施例１４）に基づいて構築した。この分析の精度は、市販のホロＴＣ用アッセイ、ＨｏｌｏＴＣ ＲＩＡ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製、Ｎｏｒｗａｙ）と比較することにより検証した（実施例７）。前記市販のアッセイは、異なる原理に基づく。つまり、全ＴＣ（アポＴＣ＋ホロＴＣ）の固相捕獲と、ホロＴＣに結合したコバラミンの解離後
競合タンパク質競合放射免疫測定という原理である（Ｕｌｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４８：５２６−３２（２００２））。本発明の分析方法は、前記市販のアッセイとｒ＝０．９６であり、十分な相関性があった。

３Ｃ４のようなホロＴＣ特異的ｓｂｐの結合は、ホロＴＣに存在し、任意で、アポＴＣにも存在するある特定の部分的に重複するエピトープに特異的なｓｂｐの先の結合により妨げられる。このｓｂｐを妨げる例としては、本願明細書に記載のエピトープ５に特異的なｓｂｐ、および、特に、下記のモノクロナール抗体ＴＣ２があげられる。さらなる例としては、本願明細書に記載の領域ＩないしＩＩＩの少なくとも一つに結合するリガンドである。これらのＴＣ特異的ｓｂｐによりホロＴＣの結合の阻止を使用することは、本発明のホロＴＣ特異的ｓｂｐのさらなる特徴を示す。

本発明のさらなる側面を形成する好ましい分析方法において、ホロＴＣｓｂｐ（任意で標識されている）を、予め、固定化されたまたは固定化可能な第２のリガンドによる捕獲前、同時または後、ホロＴＣ用検出リガンドとして使用する。このような第２のリガンドは、また、前記アッセイの特異性を増加させるために、ホロＴＣに特異的であってもよいが、より好ましくは、ホロＴＣおよびアポＴＣの双方に結合することである。好ましくは、このような第２のリガンドは、ホロＴＣｓｂｐの親和性よりもＴＣに対して著しい親和性を有することである。この親和性は、例えば、少なくとも１０^８Ｍ^−１であり、または少なくとも１０^９Ｍ^−１であり、好ましくは少なくとも１０^１０Ｍ^−１であり、より好ましくは１０^１１Ｍ^−１以上である。特に好ましくは、前記ＴＣ捕獲リガンドが、ホロＴＣｓｂｐのアポＴＣを超えるホロＴＣ特異性の著しい低下を生じないものである。より好ましくは、前記捕獲リガンドが、ホロＴＣｓｂｐのホロＴＣ親和性の著しい低下を生じないものであるべきである。この好ましい捕獲リガンドとしては、エピトープと結合し、前記エピトープとの部分的な重複がなく、前記ホロＴＣｓｂｐと結合するものがあげられる。好ましくは、ホロＴＣｓｂｐが結合する前記エピトープの構造変化を生じさせるように結合しないものである。好ましい捕獲リガンドは、前記ホロＴＣｓｂｐの特異性が、少なくとも４０倍以下に下がらないもの、好ましくは少なくとも５０倍、特には少なくとも７０倍以下に下がらないものである。通常、好ましい捕獲リガンドは、本願明細書に記載の領域ＩないしＩＩＩのいずれにも結合しない。

本発明のこの形態に基づく典型的なアッセイは、
既知の体積の動物対象（特に、哺乳動物、好ましくはヒト患者）由来の液体試料を、ＴＣに対して特異性を有する捕獲リガンド（ｍＡｂ、ｓｃＦｖまたはＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを固定化または固定化可能）と接触させ、ＴＣ：捕獲リガンド共役物を形成する工程、
任意で、ＴＣ：捕獲リガンド共役物のすべてを実質的に含むフラクションを、ＴＣ：捕獲リガンド共役物を実質的には含まないフラクションと分離し、任意で、既知の換算体積とする工程、
前記ＴＣ：捕獲リガンド共役物を、（好ましくは標識した）ホロＴＣ特異的結合パートナー（例えば、前記ｍＡｂ、アプタマー、特異的結合ペプチド等、特に、ｍＡｂ ３Ｃ４または対応するｓｃＦｖ）と接触させて、ｓｂｐ：ホロＴＣ：捕獲リカンド共役物を得る工程、
任意で、結合していないホロＴＣｓｂｐを、前記ｓｂｐ：ホロＴＣ捕獲リガンド共役物と分離する工程、
任意で、補基質または第３のリガンドを添加し、前記結合ホロＴＣｓｂｐの検出を促進する工程、
前記結合ホロＴＣを検出する工程、
前記検出した結合ホロＴＣｓｂｐを前記体積と関連付け、前記液体試料に存在するホロＴＣの定量、半定量または定性指標を得て、任意で、前記液体試料中に存在するホロＴＣと、対象におけるコバラミン欠乏の有無とを関連付ける工程を含んでいてもよい。

前記液体試料は、必要に応じて、前処理をして、試料中のＴＣ濃度を増加させる、および／または、ＨＣ（特に、ホロＨＣ）、必要に応じて、アルブミンを除去または減少させてもよい。通常、これは、ＨＣまたはＴＣが結合する基質への試料の適用、基質と液相の分離、および、（前記基質がＴＣと結合した場合）基質からのＴＣの解離を含み、新たな液体試料、好ましくは既知の少量の液体試料を形成してもよい。このＨＣの減少は、最終的なホロＴＣの検出工程が、前記ホロＴＣから解離したコバラミンの検出を含む場合、特に重要である。

これらの方法の工程は、このようなアッセイにおける当業者にとって明白な方法に適当に変更してもよい。例えば、前記ホロＴＣ特異的バインダーと前記ホロＴＣとの接触を、前記捕獲リガンドでの前記ＴＣの捕獲の前に行うというように、適当に変更してもよい。

本発明の分析方法に使用する捕獲リガンドは、いずれのホロＴＣ特異的バインダーにより結合するエピトープ（例えば、本願明細書に記載のエピトープ４）以外の１以上のＴＣエピトープを結合するリガンドが適当である。さらには、前記捕獲リガンドは、ホロＴＣ特異的エピトープのいずれとも重複していないエピトープと結合することが好ましい。前記した通り、少なくとも７つのＴＣエピトープが識別され、そのうちの少なくとも４つが、ホロＴＣ特異的エピトープ４と重複しない。好ましくは、特に、いずれかのホロＴＣ特異的バインダーと接触させる前に、前記液体試料を前記捕獲リガンドと接触させる場合、前記捕獲リガンドは、エピトープと、または、ホロＴＣ特異的バインダーの結合が、阻害でもなく、ホロＴＣ特異性を低下させない形式で、結合するべきである。

前記捕獲リガンドは、ホロＴＣ特異的エピトープの構造に実質的な変化を生じさせないように、結合することが好ましい。これらは、通常、本願明細書に記載の領域ＩないしＩＩＩのいずれとも結合しないと考えられる。

ｍＡｂ ３Ｃ４の結合または特異性に著しい阻害効果を有さないモノクロナール抗体は、下記の実施例に記載のように識別する。このような抗体は、本発明の分析方法における捕獲リガンドとしての使用に非常に適している。特に、本願明細書に記載のエピトープ２に結合するリガンドは、本発明の分析方法における捕獲リガンドとしての使用に非常に適している。エピトープ２に対するモノクロナール抗体リガンドが同定され、非常に適している。最も好ましい捕獲リガンドは、小リガンド（ｓｃＦｖ等）であり、好ましくは、ＴＣに対して高親和性を有するものである。小リガンドを、より集中して基質に結合させて、さらなる集中効果をもたらすことにより、分析感度を増加させてもよい。抗体フラグメント、小ペプチドバインダー（特に、制限ペプチド）および小有機分子は、全て好ましい小リガンドである。エピトープ２に対して生ずるｍＡｂフラグメント（およびｓｃＦｖ）が最も好ましい。また、適当なものとしては、このような小リガンドの複数の繰り返しを含み、化学結合および／または、比較的小リンカーによる接続された構築物であってもよい。

液体試料中に存在するホロＴＣを、ＴＣ特異的捕獲リガンドにより捕獲し、ホロＴＣを検出するためにホロＴＣ特異的リガント（好ましくは標識された）と接触させる場合、前記捕獲ＴＣを、（前、同時、または好ましくは後に）前記捕獲リガンドにより捕獲された全ＴＣを測定するためにＴＣ検出リガンドと接触させてもよいし、および／または、前記捕獲リガンドにより捕獲されたアポＴＣを測定するためにアポＴＣ検出リガンドと接触させてもよい。このようにして測定された前記ＴＣおよび／またはアポＴＣ量を、流体試料の前記ＴＣおよび／またはアポＴＣ量と関連付けてもよいし、前記ＴＣのホロＴＣ飽和レベルを測定するために使用してもよいし、または、ホロＴＣの測定量と比較して内部標準または検定として使用してもよい。

適当なＴＣ検出リガンドは、好ましくは、標識されたＴＣ特異的結合パートナーであり、例えば、ｍＡｂ、アプタマー等であり、前記した通り、捕獲リガンドにより結合したエピトープ（例えば、本願明細書に記載のエピトープ２）またはいずれのホロＴＣ特異的結合リガンドにより結合したエピトープ（例えば、本願明細書に記載のエピトープ４）のどちらとも部分的に重複しないＴＣのエピトープに対して特異的であることが好ましい。また、適当なＴＣ検出リガンドとしては、本願明細書に記載のエピトープ１、３、６および７に対して生ずるｍＡｂおよび、そのフラグメントならびに構築物があげられ、任意で、当該分野で十分知られ、前述のような方法で標識されていてもよい。

ＴＣ検出リガンドの標識は、ホロＴＣ特異的バインダーの標識と同一であってもよいし、異なっていてもよい。ＳＰＲのような方法を用いて検出する場合、通常、連続して、双方の標識は質量により検出される。このような光度検出（蛍光、発光等）のような方法を使用する場合、前記標識は、区別できることが好ましく（例えば、励起および／または検出波長により）、同時または連続して検出してもよい。

適当なアポＴＣ検出リガンドは、ホロＴＣよりもアポＴＣに対して特異的結合親和性を有するリガンド（例えば、コバラミンまたはコバラミン共役物、任意でシグナル付与基と共役するもの）であってもよいが、ホロＴＣ特異的バインダー（例えば、領域ＩないしＩＩＩのいずれか一つ）に結合するエピトープと部分的に重複するエピトープを結合するリガンドが好ましい。このようなリガンドを利用する分析は、通常、液体試料由来の捕獲されたＴＣをホロＴＣ特異的バインダーと結合する工程、続いて、アポＴＣおよびホロＴＣの双方に存在するが、ホロＴＣ特異的バインダーに結合したエピトープと部分的に重複するエピトープに特異的なアポＴＣ検出リガンドと、捕獲したＴＣと接触させる工程、および、前記ホロＴＣ特異的バインダーおよび前記アポ検出リガンドを検出する工程を含む。このようなアポＴＣ検出リガンドは、予め結合したホロＴＣ特異的バインダーの存在により、ホロＴＣとの結合を実質的には回避し、アポＴＣの対応するエピトープと自由に結合できる。このため、流体試料中に存在するアポＴＣの量を示すシグナルが得られる。

ＴＣ検出リガンドと同様に、アポＴＣ検出リガンドの標識は、ホロＴＣ特異的バインダーの標識と同一であってもよいし、異なっていてもよい。ＳＰＲのような方法を検出に使用する場合、双方の標識を、通常、連続して、質量により検出する。このような光度検出（蛍光、発光等）方法を使用する場合、前記標識は、区別できることが好ましく（例えば、励起および／または検出波長により）、同時または連続して検出してもよい。２つのリガンドを検出するために使用する方法が、区別できないシグナルを与える場合、連続検出を使用することが好ましく、２つのリガンドからのシグナルを区別できる場合、同時検出を使用することが好ましい。

さらに、非常に好ましい本発明の分析方法は、抗体検出として、ｍＡｂ ３Ｃ４を利用することである（実施例６および１７）。このようなアプローチは、少なくとも２つの利点を有する。（ｉ）捕獲ｓｂｐ（例えば、抗体）として、より高いＴＣ親和性を有するｍＡｂまたはアプタマーを使用することにより、試料中の実質的に全てのＴＣを、捕獲および集めることができる；（ｉｉ）検出抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４を使用することにより、ｍＡｂ ３Ｃ４の機能的な親和性が増加する。前記３Ｃ４に対するＫＤを評価した結果、＞１００ｎＭであった。しかしながら、モノクロナール抗体が、二価であるため、両方の結合部位を利用することにより解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を低くし、また、機能的ＫＤ（親和力）が低下する。ｍＡｂ ３Ｃ４の場合、ｍＡｂ ３Ｃ４を、捕獲抗体よりむしろ検出抗体として使用した場合、前記解離速度が、２×１０^−３ｓ^−１から、２×１０^−４ｓ^−１に減少した。前記した通り、適当な捕獲抗体は、ホロＴＣに対するｍＡｂ ３Ｃ４の親和性または特異性に影響を及ぼさないｍＡｂであることが好ましい。我々は、エピトープ２に対する抗体は、これらの要求を最も満足することを見出した。本願明細書に記載したアプタマーｂ９７４−３ｔ１は、ｍＡｂ ３Ｃ４と部分的に重複するが、この重複は、ｍＡｂ ３Ｃ４の親和性または特異性に影響を及ぼすのに十分ではなく、充分な親和性が保持され、このアッセイの必要条件を満たしていた（実施例１６および１７参照）。

また、同一アッセイにおけるホロＴＣおよびアポＴＣの同時測定は、エピトープ４および５に対する抗体を利用して実証した（実施例８および９）。これらのエピトープは、ホロＴＣと完全に重複している。一方、エピトープ４は、アポＴＣに存在していない。すなわち、アポＴＣおよびホロＴＣの混合物を含む試料に、まず、エピトープ４と結合するｍＡｂ ３Ｃ４、ついで、エピトープ５と結合し、異なるシグナルを付与するリガンドと共役する抗体を有するｍＡｂ Ｔｃ２を添加することにより、アポＴＣおよびホロＴＣの双方を同一の試料で直接測定できる。あるいは、検出前に、前記アポＴＣおよびホロＴＣを、まず、非重複リガンド（特に、アプタマーまたはモノクロナール抗体）の、好ましくは、エピトープ２の結合により捕獲して集めてもよい。ホロＴＣにのみ存在するエピトープと結合することによりアポＴＣおよびホロＴＣに存在する１つのエピトープの“阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）”によりアポＴＣを検出する場合、このような阻止は、完全である必要はない。特定の条件下での前記ホロＴＣの結合が、既知の割合の前記結合部位をふさぐか、または、全アポＴＣレベルと比較すると、明らかになった部位の数が問題にならない程度である場合、通常のデータが得られる。好ましくは、ホロＴＣの部位の８０％以上が、前記ホロＴＣの結合より遮られていることが好ましく、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは少なくとも９５％である。

さらには、同一のアッセイにおけるホロＴＣおよび全ＴＣの同時測定を、エピトープ４および６に対する抗体（実施例１０）およびアプタマーｂ９７４−３ｔ１（図１２、実施例１７）を利用して実証した。これらのエピトープは、エピトープ２と重複していないか、１つも重複していない。すなわち、アポＴＣおよびホロＴＣの混合物に、まず、エピトープ４と結合するｍＡｂ ３Ｃ４、ついで、エピトープ６と結合し、異なるシグナルを付与するリガンドと共役する抗体を有するｍＡｂ ３Ｃ１２に添加することにより、アポＴＣおよびホロＴＣの双方を、同一の試料で直接測定できる。同一のアッセイにおけるホロＴＣおよび全ＴＣの同時測定は、また、捕獲ｓｂｐとしてｂ９７４−３ｔ１を使用し、ｍＡｂ ３Ｃ４（エピトープ４）およびｍＡｂ ４−７（エピトープ２Ｂ）を用いたホロＴＣおよび全ＴＣを検出することにより達成できる。

さらなる側面において、本発明は、本発明の分析方法に使用するキットを提供する。前記キットは、任意で標識されているかまたは固定化されているホロＴＣ特異的結合パートナーであって、アポＴＣの少なくとも４０倍を超える（例えば、５０倍以上）ホロＴＣ特異性を有する特異的結合パートナー；好ましくは、任意で標識されているかまたは固定化されているＴＣ結合リガンド（任意）；既知濃度の複数のホロＴＣ溶液（任意）；および前記分析方法の使用説明書（任意）を含む。

以下の限定されない実施例を参照することにより、そして、添付図面を参照することにより、本発明をさらに説明する。

図１ａは、ＳＰＲ“センサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）”であり、エピトープ２特異的ｍＡｂによりチップに固定したホロＴＣへのｍＡｂ ３Ｃ４の結合（８７１ＲＵ）、および、アポＴＣの結合がないこと（０ＲＵ）を示す；
図１ｂは、捕獲リガンドとしてｍＡｂ ５Ｈ２（エピトープ２）である場合の図１に相当する。ホロＴＣへのｍＡｂ ３Ｃ４の結合（１８５ＲＵ）およびアポＴＣとの結合がないこと（０ＲＵ）を示す；
図２は、野生型ホロＴＣおよびアポＴＣに対する本願明細書に記載の様々な抗体の親和性および特異性を示す；
図３ａは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣの“エピトープマップ”を示す；
図３ｂは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣの修正“エピトープマップ”を示す；
図３ｃは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣのさらなる修正“エピトープマップ”を示す；
図４ａは、捕獲抗体として抗体３Ｃ４を利用し、本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す；
図４ｂは、捕獲抗体として抗体３Ｃ４を利用し、吸光検出を使用した本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す；
図４ｃは、捕獲抗体としてホロＴＣ特異的単一鎖抗体を利用し、本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す；
図４ｄは、捕獲抗体として抗体３Ｃ４を利用し、発光検出を使用した本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す；
図５ａは、本発明の分析方法において、ホロＴＣおよびアポＴＣの標準混合物から得られた標準曲線を示し、捕獲抗体上のホロＴＣに結合した検出リガンドｍＡｂ ３Ｃ４の量を示す；
図５ｂは、捕獲抗体上のホロＴＣに結合した検出リガンドとしてのｍＡｂ ３Ｃ４の量を示す図５ａと同等の曲線であって、捕獲抗体は、ｍＡｂ ＴＣ７である；
図６ａは、本願明細書に記載の分析方法と市販のホロＴＣアッセイとの比較を示す；
図６ｂは、本願明細書に記載の分析方法と市販のホロＴＣアッセイとのさらなる比較を示す；
図７ａは、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ５（５Ｃ２）に対して特異的な抗体の、ホロＴＣおよびアポＴＣの固定化混合物への連続的な結合を示す；
図７ｂは、前記捕獲リガンドが、ｍＡｂ ＴＣ７である以外は、図７ａと同一の結合を示す；
図８は、既知の割合で固定化したホロＴＣおよびアポＴＣに対するエピトープ４（３Ｃ４）および６（３Ｃ１２）への相対的な結合を示すＴＣコバラミン飽和標準曲線を示す；
図９は、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ６（３Ｃ１２）に対して特異的な抗体の、固定化したホロＴＣおよびアポＴＣの混合物への連続的な結合を示す；
図１０は、種々の濃度での多糖ヘパリンにより生じるＴＣと本願明細書に記載の様々なｍＡｂとの間の結合阻害を示す；
図１１は、ＳＰＲ“ｓｅｎｓｏｇｒａｍ”であって、ｍＡｂ ３Ｃ４によりチップに固定化したホロＴＣと、アプタマーｂ９７４−３ｔ１の結合を示す。ホロＴＣに代えてアポＴＣを使用した場合、ｍＡｂ ３Ｃ４がアポＴＣを認識しないため（それゆえ、捕獲できない）、応答が見られない；
図１２は、アプタマーｂ９７４−３ｔ１により捕獲されたホロＴＣおよびアポＴＣと、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ２Ｂ（４−７）に特異的な抗体との連続的な結合を示す（下向きの矢印は、注入時期を示す）。捕獲されたアポＴＣに３Ｃ４を注入した場合、エピトープ４が存在しないため、応答が見られない；
図１３ａは、ヒトＴＣのエピトープ４の構造を示す；
図１３ｂは、ヒトＴＣのヘパリン結合部位の構造を示す；
図１４は、ホロＴＣで特定された様々なエピトープの模式図を示す；
図１５ａは、３Ｃ４のパラトープとホロＴＣの好ましいエピトープ領域との間の相互作用を示す；
図１５ｂは、前記３Ｃ４の拡張パラトープと、ホロＴＣのエピトープ領域との間の相互作用を示す。

ヒトトランスコバラミンおよびヒトホロトランスコバラミンに特異的なマウスモノクロナール抗体の開発
１．１）免疫付与
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、ＡｄｊｕＰｒｉｍｅ Ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）と混合した組換えヒトホロＴＣを２０μｇ腹腔内（ｉ.ｐ.）へ注入し、その後、４週間隔で、２０μｇの２ブースター注入した。

１.２）融合
最終ブースター４日後、脾臓を除去し、ＰＥＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、脾細胞を、ＨＡＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ）感受性プラズマ細胞種ＯＵＲ１（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３のサブクローン）と融合した。融合生成物を、ＨＡＴを含む培地（１０％ＣＰＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）を加えたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を入れた５×９６Ｆトレイ（Ｎｕｎｃ）にプレートした。１週間後、融合生成物に、ＨＴ（ｓｉｇｍａ）を含む培地を与えた。

１．３）初期スクリーニング
２週間後、ハイブリドーマを、固相キャプチャーアッセイを用いてスクリーニングした。前記細胞培地を、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｍｅｒｃｋ−Ｅｓｔａｐｏｒ、Ｆｒａｎｃｅ）で被覆した１μｍの磁化ビーズの１％（ｗ／ｖ）懸濁液１０μＬと混合し、室温で１時間保持した。前記マウスモノクロナール抗体を結合した磁化ビーズを、磁石を用いて単離し、１ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）で４回洗浄した。洗浄したビーズを、５７Ｃｏ−標識コバラミン（ＩＣＮ、ＵＳＡ）で前処理し、血清中のアポＴＣを、５７Ｃｏ−標識ホロＴＣに替えたプール血清（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＵＳＡ）１００μＬに懸濁した。前記混合物を室温で３０分間保持し、前記ビーズを、磁石を用いて単離した。前記ビーズに関連した放射能を、ガンマカウンターで計測した。

１.４）クローニング
抗−ＴＣ抗体陽性のウェルを、Ｂａｌｂ／ｃ腹膜フィーダー細胞（ウェルあたり１００００）を予め撒いた９６ウェルトレイ（Ｎｕｎｃ）で、限界希釈によりクローニングした。陽性クローンを選択し、１００％のサブクローンが、特異的な抗体を産生するまで再クローニングした。細胞のストックを、液体窒素で１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を含むＣＰＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）中で凍結した。

１．５）２次スクリーニング
細胞培地からの抗体を、前記磁化ビーズで単離した。１０μＬの抗体被覆ビーズを、前記したとおり、組換えヒトアポＴＣまたはホロＴＣ濃度を増加させた存在下で、５７Ｃｏで予め標識した血清と混合した。

前述のように調製し、以下の抗体を発現するマウスキメラ細胞系を、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＡＳＡの名において、欧州細胞カルチャーコレクション（（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ−Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ＯＪＧ、ＵＫ）に預けた。

本願明細書で使用する場合、前記エピトープの番号は、対応する抗体に結合したＴＣおよび／またはホロＴＣのエピトープの表示に使用する。

選択したモノクロナール抗体の親和性および特異性
前記モノクロナール抗体の親和性および特異性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて表面プラズモン共鳴により評価した。

２．１）ウサギ抗−マウスＩｇＧポリクロナール抗体またはマウスモノクロナール抗体の、デキストラン被覆ＣＭ５チップへの固定化
デキストラン被覆ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）のカルボキシル化表面を、業者が提供したプロトコルに従って活性化した。つまり、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）／０．２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、カルボキシル化したチップに、１０μＬ／分で７分間注入し、ついで、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に５０μｇ／ｍＬとなるように溶解したウサギ抗−マウスＩｇＧポリクロナール抗体を、１０μＬ／分で７分間注入し、最後に、前記チップに、１Ｍエタノールアミンを１０μＬ／分で７分間を注入することによりブロッキングした。前記デキストラン被覆チップマウスモノクロナール抗体の固定化は、同様にして行った。

２．２）マウスモノクロナール抗体の、ウサギ抗−マウスＩｇＧ被覆デキストランチップとの結合
生成された状態で入手できないマウスモノクロナール抗体、すなわち、デキストラン被覆チップ上に直接固定化できないマウスモノクロナール抗体（実施例２．１）を、ウサギ抗−マウスＩｇＧ被覆デキストランチップと結合した。抗体を、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ）、０．００３Ｍ ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ）で、約５０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、前記チップに５μＬ／分で３分間注入した。モノクロナール抗体の結合をリアルタイムで追跡し、結合した質量をｓｅｎｓｏｒｇｒａｍで、ＲＵ（屈折単位（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｕｎｉｔｓ））で記録した。

２．３）アポＴＣおよびホロＴＣのマウスモノクロナール抗体との結合
アポＴＣおよびホロＴＣを、異なる濃度にＨＢＳ−ＥＰで希釈し、マウスモノクロナール抗体を固定化したチップに、５μＬ／分で３分間注入した。異なる濃度のアポＴＣおよびホロＴＣの結合のオンとオフとを記録し、親和定数を評価した（表１）。この方法により得られる典型的なセンサグラムを、図１ａおよび１ｂに示す。

２．４）エピトープマッピング
前記エピトープ特異性パターンを、１７つのｍＡｂのパネルで特徴づけ、機能的なエピトープマップを作成した（表１）。抗体をホロＴＣまたはアポＴＣと二つ組で結合させた。第１のｍＡｂを、実施例２．１に記載したデキストラン被覆チップ上に固定化するか、または、前記抗−マウスＩｇＧチップに固定化した。後者の場合、ついで、１：１０で希釈したマウス血清を、前記抗−マウスＩｇＧチップの結合部位を過剰飽和させるために注入した。ホロＴＣまたはアポＴＣを注入し、第１のｍＡｂ、続いて第２のｍＡｂを結合させた。全てのｍＡｂを可能な全ての順列で組み合わせ、同時に結合できないか、または第１の抗体により障害が生じた結合は、それぞれ、完全、部分重複とみなした。重複データに基づき、ついで、エピトープマップを構築した（図３ａ）。ついで、下記実施例１７の結果に基づき、このエピトープマップを図３ｂに示すように拡張した。ついで、前記エピトープマップを拡張し、図３ｃに示すように、実施例１８および１９に記載のエピトープ領域に適応させた。表２は、各種類のエピトープに結合する抗体のデータを示す。

エピトープ４および５に対するモノクロナール抗体は、アポＴＣとの結合の相違にのみ分離できる。前記エピトープがホロＴＣと完全に重複したのに対し、エピトープ４はアポＴＣで認められなかった（または、非常に弱く認められた）ため、アポＴＣと完全に分離した。

ＴＣは、内因性多糖ヘパリンに対する結合部位を有することが知られている。また、ホロＴＣと種々のｍＡｂとの間の相互作用に対する平均分子量１２０００Ｄａの非分画ヘパリンの阻害効果を試験した。図３ｂに示すように、前記ヘパリン結合部位が、エピトープ６と大きく、エピトープ４と若干、そして、エピトープ２Ａとはより小さい度合いで重複することが分かった。

さらに、エピトープ６抗体３Ｃ１２の精製製品を用いた実験では、このエピトープが、エピトープ１および２と部分的に重複することが明らかになった。

Ｆａｒｅｓ Ｎａｍｏｕｒ博士により、親切にも、ＴＣ遺伝子のエクソン内に隠れたスプライシング部位を有し、発現したＴＣにおいて２７アミノ酸（１１７−１４４）欠如を生じるＴＣ欠乏患者由来の血液試料が提供された。前記変異ＴＣは、ｍＡｂ３−９で認識されたが、ｍＡｂ２−２では認識されなかった。これは、エピトープ２が、配列１１７−１４４と著しく重複することを示す。共通のＴＣ多型Ｐ２５９Ｒは、前記いずれの抗体による認識にも影響を及ぼさなかった。

^＊−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ大学からの抗体
丸括弧内の抗体は、ｍＡｂ＃１と部分的に重複する。

^＊−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ大学からの抗体（Ｕｌｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ４８：５２６−３２；（２００２））、比較目的を含む。
^１ＫＤは、ホロＴＣに対する値である。
^２エピトープ２は、ヘパリン（前記参照）およびアプタマーｂ９７４−３ｔ１（実施例１５および表１１参照）で得られた結果に基づき、２つのサブグループＡおよびＢ再分割した。
^３アポＴＣに対するＫｄ値が高く、アポＴＣ製品中に微量（＜１％）のホロＴＣが存在することにより、特異性が７０倍より多いことを明白に確認できなかった。

血清中のモノクロナール抗体の特異性
３．１）ヤギ抗−マウスＩｇＧ被覆磁化粒子へのモノクロナール抗体の固定化
モノクロナール抗体を、約７μｇ／ｍＬとなるように、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈し、０．２％（ｗ／ｖ）ウサギ抗−マウスＩｇＧ被覆磁化粒子（直径０．８μｍ）（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ、Ｆｒａｎｃｅ）と、１時間、室温で混合した。ついで、ビーズを磁石を用いて単離し、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む冷ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁した。

３．２）固定化モノクロナール抗体への野生型ホロＴＣの結合
磁化ビーズに結合したモノクロナール抗体（３．１）１０μＬを、５７Ｃｏ−コバラミン（約５０ｆｍｏｌ；ＩＣＮ、ＵＳＡ）で前処理し、全てのアポＴＣを、５７Ｃｏ−標識ホロＴＣに替えた血清１００μＬと混合し、そして、室温で１時間保持した。ついで、ビーズを、磁石を用いて沈殿させ、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、磁石による沈殿後、ガンマカウンターで計測した。

３．３）固定化モノクロナール抗体への野生型アポＴＣの結合
磁化粒子に結合したモノクロナール抗体（３．１）１０μＬを、１００μＬの血清と混合し、室温で１時間保持した。ついで、ビーズを、磁石を用いて沈殿させ、上清を取った。前記ビーズを、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、磁石による沈殿後、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび５７Ｃｏ−コバラミン（約５０ｆｍｏｌ）を含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し、室温で１時間保持し、磁石により前記ビーズを沈殿させた後、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、ガンマカウンターで計測した。前記血清上清に存在するアポＴＣ量を評価するために、これらを５７Ｃｏ−コバラミン（約５０ｆｍｏｌ）で処理し、ついで、高親和性抗ＴＣ抗体で被覆した磁化ビーズ１０μＬ処理した。前記磁化ビーズの量は、血清試料中の実質的にすべてのＴＣを結合する能力を有する（Ｕｌｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４８：５２６−３２；２００２参照）。前記ビーズを、磁石を用いて沈殿させ、ガンマカウンターで計測した。

３．４）野生型ホロＴＣに対するモノクロナール抗体の特異性
前記モノクロナール抗体によるホロＴＣおよびアポＴＣの結合を、モノクロナール抗ヒトＴＣ抗体の結合と比較した。前記モノクロナール抗ヒトＴＣ抗体の結合は、血清からホロＴＣおよびアポＴＣを定量的に除去して予め確認した（Ｕｌｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ４８：５２６−３２；２００２参照）。その結果を、図２に示す。エピトープ４に対して特異的なモノクロナール抗体は、ホロＴＣに結合したが、検出可能な量のアポＴＣとは結合しなかった。その他のエピトープに対する抗体は、ホロＴＣおよびアポＴＣの双方に結合した。

ｍＡｂ ３Ｃ４でのファージ提示ペプチドライブラリのバイオパンニング
ジスルフィド環化した１３ｍｅｒのペプチドライブラリ（Ｃｏｓｍｉｘ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を選別した。充分な可変性（＞１０^８変異）のペプチドライブラリであって、好ましくは自由度が制限されているものを使用した。

４．１）ｍＡｂ ３Ｃ４のカップリング手順
Ｄｙｎａｌ（登録商標）カルボキシビーズ２０μＬを、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）１ｍＬで３回洗浄した。ビーズの活性化は、１００μＬの０．５Ｍ ＥＤＣ／０．１Ｍ ＮＨＳで、１０分間、室温で行った。４μｇのｍＡｂ ３Ｃ４を、１００μＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中で、４５分間、室温で前記ビーズに固定化した。ブロッキングは、ＰＢＳに溶解した１００ｍＭのエタノールアミンで行った。ブロッキング後、前記ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄した。

４．２）パンニング手順
各ライブラリの約１０^１２のパッケージされたファージミドを、２０μＬの３Ｃ４−被覆ビーズで、時間インキュベートした。コントロールとして、対象のないカルボキシビーズ２０μＬを使用した。インキュベート後、ビーズを、ＰＢＳＴで洗浄した。充填したファージミドの溶出を、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２（Ｇｌｙ））で、１０分間行った後、すぐに、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０（Ｔｒｉｓ））で中和した。結合したファージ粒子の増幅および精製は、標準的な手順に従って行った。つまり、１ｍＬのファージを、１ｍＬのログフェーズのＥ．Ｃｏｌｉ細胞に移した。振とうすることなく３０分間培養した後、３７℃で振とうしながら３０分間さらに培養した。１０００ｇで１０分間遠心し、１ｍＬの２ＴＹ−培地（１６ｇトリプシン、１０ｇ酵母エキスおよび１Ｌあたり５ｇのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、滅菌）に懸濁し、バクテリアを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１％グルコースを含む大きな四角プレートにプレートした。３０℃で一晩プレートを培養した。次の日、１０ｍＬの２ＴＹを加え、プレートの細胞をばらばらにした。１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１％グルコースを含む２ＴＹ５０ｍＬに、１００〜５００μＬ加え、３７℃で、ＯＤ６００が約０、５になるまで約２時間生育させた。１０倍過剰のヘルパーファージ、例えば、Ｍ１３ファージを加え、３７℃で３０分間、振とうすることなく培養した後、振とうしながら３０分培養した。１０００ｇで遠心し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ＴＹ ５０ｍＬに細胞を懸濁した。３０℃で１晩培養し、２５００ｇで１５分間回転し、上清を新しいチューブに移して、そこに、１／５体積の２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣｌを加えた。氷上で１時間培養し、２５００ｇで１５分間遠心して、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１２０００ｇで２分間回転して残りのバクテリアを除去し、上清を新しいチューブに移して、そのうちの１００μＬを次の段階の選別に使用した。第２段階のパンニング後、定量的な濃縮が、すでに観察された。第２および第３段階からのクローンをシーケンスした。様々なクローンが、何度も生じており、２つのモチーフを形成する、全部で７つの異なる配列が得られた。
モチーフ１（配列番号１０〜１４）：
ＣＳＸ_１ Ｘ_２ＹＸ_３ＷＤＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ ＣＳ
ＣＳは、骨格の部分であり、
Ｘ_１＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
Ｘ_３＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
Ｘ_５＝Ｄ、Ｆ
Ｘ_２＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
Ｘ_４＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
Ｘ_６＝Ｍ、Ｒ
モチーフ２：
ＣＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷＣＳ（配列番号１５）
４．３）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
マイクロタイタープレートを、１００μＬの１μｇ／ｍＬ ｍＡｂ ３Ｃ４、または、無関係のコントロール抗体で、ＰＢＳ中で、４℃で一晩被覆した。残りの結合部位を、ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。一部のウェルは、ＢＳＡのみで被覆した。モノクロナールパッケジファージミドを、ウェルあたり１０^１０ないし１０^８ｃｆｕの濃度でＰＢＳに添加し、１時間培養した。プラスミド調製物を遠心し、凝集物を除去した。ウェルを、０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで６回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを検出するために、抗Ｍ１２抗体（例えば、ファルマシア）を結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１００μＬをＰＢＳで１／５０００に希釈し、各ウェルに加え、室温で１時間培養した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｈ_２Ｏ_２を追加したクエン酸（ｐＨ４．０）に溶解した色素基質ｏ−フェニルジアミンを加え、その発色反応を、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の添加により、２〜５分後に停止させた。結果を、下記の表３に示す。

下線を施したアミノ酸は、保存され、かつ、前記ライブラリの骨格部分である。

表面プラズモン共鳴により選択したファージの特異性の評価
抗体は、実施例２に記載の通り、デキストラン被覆ＣＭ５チップに共有結合により固定した。ファージを、ＨＢＳ−ＥＰ中で１０倍希釈し、１０μＬ／分で３分間注入した。結合したファージミドの量を、リアルタイムで記録し、応答単位（ＲＵ）で表した。ホロＴＣによるブロッキングを評価するために、１０μＬ／分で３分間のファージミドを注入する前に、１μＭのホロＴＣを、１０μＬ／分で５分間注入した。阻害は、ホロＴＣで前処理した３Ｃ４に結合したファージミドのＲＵの数を、前処理を行わなかった結合ＲＵの数で割って、１００をかけることにより算出した。

^＊ＲＵ：応答単位 ^１ｎ．ｄ．：測定不可

^＊ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ大学からの抗体（Ｕｌｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ４８：５２６−３２；（２００２））。比較目的としての使用。

ホロＴＣの直接測定用アッセイ
６．１）モノクロナール抗体３−９のヨウ素化
ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）プレコートヨウ素化チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）および取扱説明書を用いて、ｍＡｂ ３−９を１２５Ｉで標識した。つまり、濃縮ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）ヨウ素化試薬を５０μｇ含むチューブを、１ｍＬの０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｔｒｉｓ）でリンスした。ついで、Ｔｒｉｓに溶解した５０μｇの抗体を加え、室温で５分間、培養した。Ｔｒｉｓに溶解した１０ｍｇ／ｍＬチロシンを５０μＬ加え、５分間培養し、ついで、前記混合物を、１０ｍＬの０．０１Ｍリン酸緩衝液、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％メルチオレートおよび１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．３で平衡にしたＮＡＰ−５カラムでクロマトグラフした。

６．２）磁化ビーズへのホロＴＣ特異的ｍＡｂ ３Ｃ４の固定化
４ｍｇのＥｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＥＭＩ−１００／４０（０．８３μｍの磁化ビーズ）を、氷冷した０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０（ＭＥＳ））４ｍＬで３回洗浄した。活性化は、４２ｍＬの０．０６３Ｍ ＥＤＣ／０．３３Ｍスルホン化ＮＨＳで、室温で１５分間行った。活性化したビーズを、３０ｍＬのＭＥＳで２回リンスした。２．８ｍｇのｍＡｂ ３Ｃ４を、室温で２時間、６．８ｍＬのＭＥＳ中で固定化した。ブロッキングは、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０５Ｍエタノールアミン（ＰＢＳ）で行った。ブロッキング後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、４０ｍＬのＰＢＳに懸濁した。

６．３）捕獲抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４を用いたホロＴＣアッセイ
８００μＬの血清を、８００μＬのＰＢＳと混合し、ついで、ｍＡｂ ３Ｃ４被覆磁化ビーズを５０μＬ加えた。室温で１時間の培養後、ビーズを、磁気ラックを用いて分離し、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＰＢＡ）を含むＰＢＳ４００μＬで３回洗浄し、４００μＬのＰＢＡに懸濁した。ついで、５００００ｃｐｍの１２５Ｉで標識したｍＡｂ ３−９を加え、室温で１時間培養した。ビーズを前記磁気ラックで分離し、４００μＬのＰＢＡで３回洗浄し、ガンマカウンターで計測した。標準曲線を、組換えヒトホロＴＣで作成したキャリブレータを用いて構築し、前記試料と並行して行った。一般的な標準曲線を図４に示す。

６．４）検出抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４を用いたホロＴＣアッセイ
結合の様子を、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡した。Ｂｉａｃｏｒｅの装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。ＴＣのエピトープ２に対する抗−ヒトＴＣモノクロナール抗体を、前記実施例２．１に記載のとおり、デキストラン被覆ＣＭ５チップに固定化した。１８ｎｇ／μＬのホロＴＣおよびアポＴＣを１５μＬ注入した後、前記抗体を固定化したチップを前記装置に入れた。ホロＴＣとアポＴＣとの割合は、０：１００〜１００：０に変化させたが、常に、全体量は同一の１８ｍｇ／ｍＬとなるようにした。ついで、５０ｎｇ／μＬのｍＡｂ ３Ｃ４を５μＬ注入し、結合した抗体の量を、センサグラムで記録した。図５ａは、一般的な標準曲線を示す。図５ｂは、前記エピトープ２に対する捕獲リガンドが、ｍＡｂ ＴＣ７である場合に同様にして得られた曲線である。

６．５）ホースラディッシュペルオキシダーゼとモノクロナール抗体３−１１の共役
ｍＡｂ ３−１１を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）マレイミド活性化ＨＲＰキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）および取扱説明書を用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共役させた。つまり、ＰＢＳに溶解したｍＡｂ ３−１１を、２５倍のモル濃度過剰のＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート）（ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド））で改質し、３０分後、９０倍のモル濃度過剰のヒドロキシルアミンで、室温で２時間、脱保護した。チオール化した抗体を脱塩し、ついで、８倍過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）マレイミド活性化ＨＲＰと、室温で１時間反応させた。前記共役物を、１００倍過剰体積量のＰＢＳで３回透析した。

６．６）アルカリフォスファターゼと抗体３−１１の共役
ｍＡｂ ３−１１を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）スルホン化−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）および取扱説明書を用いて、ビオチン化した。つまり、ＰＢＳに溶解した１０ｎｍｏｌのｍＡｂ ３−１１を、２０倍モル濃度過剰のスルホン化−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（脱イオン水）と混合した。氷上で２時間保持し、ついで、ＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラムでタンパク質を精製した。最後に、ビオチン化した抗体を、ストレプトアビジン−共役アルカリフォスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、ＵＳＡ）と結合させた。

６．７）捕獲抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４を用いたホロＴＣ非同異性サンドイッチアッセイ
Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳに溶解した１０μｇ／ｍＬ ｍＡｂ ３Ｃ４で、４℃で一晩被覆し、ついで、ＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで、室温で２時間、ブロッキングした。各ウェルに、血清を５０μＬおよびＰＢＳを５０μＬ加え、室温で３０分間培養した。２００μＬのＰＢＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＡ＋）で３回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰ−共役ｍＡｂ ３−１１（実施例６．５参照）を加え、前記混合物を、室温で３０分間培養した。各ウェルを２００μＬのＰＢＡ＋で３回洗浄し、２００μＬのＨＲＰ−基質、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を加え、１０分間培養した。前記反応物を、１００μＬの０．１２Ｍ ＨＣｌで急冷し、その着色を４５０ｎｍで測定した。典型的な標準曲線を図４Ｂに示した。

６．８）捕獲抗体としてｓｃＦｖ ３Ｃ４を用いたホロＴＣ非同異性サンドイッチアッセイ
Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳに溶解した１０μｇ／ｍＬ 抗−ｈｉｓ−ｔａｇ ｍＡｂ（ａｂｃａｍ、ＵＫ）で、４℃で一晩被覆し、ついで、１０ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ（ＰＢＳ中）で、室温で２時間、ブロッキングした。各ウェルに、ホロＴＣを５０μＬおよびＰＢＳを５０μＬ加え、室温で３０分間培養した。２００μＬのＰＢＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＡ＋）で３回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰ−共役ｍＡｂ ３−１１（実施例６．５参照）を加え、前記混合物を、室温で３０分間培養した。各ウェルを２００μＬのＰＢＡ＋で３回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−基質、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を加え、１０分間培養した。前記反応物を、１００μＬの０．１２Ｍ ＨＣｌで急冷し、その着色を４５０ｎｍで測定した。野生型および２つの人工変異体を用いた場合の典型的な標準曲線を図４Ｃに示す。

６．９）捕獲抗体としてｍＡｂ ３Ｃ４を用いたホロＴＣ非同異性ビーズアッセイ
５０μＬの血清および５０μＬのＰＢＳを、ｍＡｂ ３Ｃ４被覆磁化ビーズ１０μＬと混合した。室温で２０分間培養した後、ビーズを、磁気ラックを用いて分離し、２００μＬのＰＢＡ＋で６回洗浄し、１００μＬのＡＰ−共役ｍＡｂ ３−１１に懸濁した。２０分後、ビーズを前記磁気ラックで分離し、ＰＢＡ＋で６回洗浄し、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ（登録商標）Ｐｌｕｓ基質（Ａｕｒｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ａｕｓｔｒｉａ）を加え、ルミノメータで読み取った。典型的な標準曲線を図４Ｄに示す。

市販のアッセイとの比較分析
市販のホロＴＣ用アッセイＨｏｌｏＴＣ ＲＩＡ（登録商標）で測定してホロＴＣ値が１４ｐＭから１３９ｐＭの範囲である１５個の血清試料を、実施例６．３に記載のホロＴＣアッセイにより定量した。２つの方法により得られた値を比較したところ、よい相関性を示した（ｒ＝０．９６）（図６ａ）。

市販のホロＴＣ用アッセイＨｏｌｏＴＣ ＲＩＡ（登録商標）で測定してホロＴＣ値が２４ｐｍｏｌ／Ｌから１４８ｐｍｏｌ／Ｌの範囲である２４個の血清試料を、実施例６．７に記載のホロＴＣアッセイにより定量した。２つの方法により得られた値を比較したところ、よい相関性を示した（ｒ＝０．９８）（図６Ｂ）。

ホロＴＣおよびアポＴＣのデュアルアッセイ
結合の様子を、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。前記捕獲抗体（ＴＣのエピトープ２に対する高親和性抗−ヒトＴＣモノクロナール抗体）を、実施例２．１に記載のとおりに、デキストラン被覆ＣＭ５チップに固定化した。前記抗体を固定化したチップを、前記装置に導入し、その後、ホロＴＣおよびアポＴＣの混合物を１５μＬ注入した。ＴＣの全体量は、一定の１８ｎｇ／μＬとして、ホロＴＣとアポＴＣの相対量を変化させた。結合したホロＴＣの量は、４００ｎｇ／μＬのホロＴＣ特異的抗体ｍＡｂ ３Ｃ４を６０μＬ注入することにより測定した。結合したｍＡｂ ３Ｃ４の量を、センサグラムで記録した。前記チップに洗浄処理を施し、ついで、２５ｎｇ／μＬのｍＡｂ ＴＣ２を５μＬ注入することにより、結合したアポＴＣの量を測定した。ｍＡｂ ＴＣ２はＴＣに対して特異的であるが、ホロＴＣ上のｍＡｂ ３Ｃ４と完全に重複する。すなわち、ｍＡｂ ３Ｃ４に注入後、アポＴＣフラクションのみを検出する。図7ａおよび７ｂは、第１の抗体により捕獲されたアポＴＣとホロＴＣとの相関関係、および、結合したｍＡｂ ３Ｃ４およびＴＣの量を示す。ｍＡｂ ３Ｃ４は、低親和性抗体であるため、ホロＴＣの完全な閉塞は困難であることが分かった。一方、ホロＴＣだけで、全ＴＣの６〜２５％を構成するため、＞９０％閉塞は十分である。図７ｂにおいて、第１の抗体はＴＣ７である。

ホロＴＣおよびアポＴＣのデュアルアッセイ
エピトープ４または５との重複がない抗−ヒトＴＣ特異的モノクロナール抗体、例えば、エピトープ２に対する抗体を、前記実施例２．１に記載のとおりに、磁化ビーズに固定化した。分取した血清または血漿（１００〜５００μＬ）を、１／１０の体積の前記固定化抗体および、任意でＰＢＳ（＞１００μＬ）と混合し、室温で３０分間培養した。前記ビーズを、磁石を用いて沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳで懸濁した。シグナル付与基と共役させた過剰のｍＡｂ ３Ｃ４を加え、３０分間培養し、ついで、前記ビーズを沈殿させ、上述のように洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳで懸濁させた。異なるシグナル付与基と共役させた過剰のｍＡｂ ＴＣ２を加え、前記混合物を室温で３０分間培養した。ビーズを沈殿させ、上述のように洗浄した。最後に、結合したｍＡｂ ３Ｃ４およびＴＣ２を、それらの個々のシグナル付与基を用いて測定し、前記ホロＴＣおよびアポＴＣ濃度を、標準曲線に書き加えることにより決定した。

ホロＴＣおよび全ＴＣ：ＴＣ飽和のデュアルアッセイ
結合の様子を、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。前記捕獲抗体（ＴＣのエピトープ２に対する高親和性抗−ヒトＴＣモノクロナール抗体）を、実施例２．１に記載のとおり、デキストラン被覆ＣＭ５に固定化した。前記抗体を固定化したチップを、前記装置に導入し、その後、ホロＴＣおよびアポＴＣの混合物を１５μＬ注入した。ＴＣの全体の濃度は、一定の１８ｎｇ／μＬとして、ホロＴＣとアポＴＣの相対量を変化させた。４００ｎｇ／μＬのホロＴＣ特異的抗体ｍＡｂ ３Ｃ４を６０μＬ注入することにより、結合したホロＴＣの量を測定した。結合したｍＡｂ ３Ｃ４の量を、センサグラムで記録した。前記チップに洗浄処理を施し、ついで、結合したＴＣの全体量を、１００ｎｇ／μＬのｍＡｂ ３Ｃ１２を１５μＬ注入することにより測定した。ｍＡｂ ３Ｃ１２はＴＣに対して特異的であり、エピトープ２および４と重複がないエピトープ６と結合する（図３）。ｍＡｂ ３Ｃ４および３Ｃ１２を、前記固定化ホロＴＣ／アポＴＣと結合させることにより、ホロＴＣおよび全ＴＣの双方の量を、絶対値又は飽和水準として測定し、表すことができる。図８は、ＴＣ飽和に対する典型的な標準曲線を示す。図９は、前記試料中における、ホロＴＣおよび全ＴＣへの抗体３Ｃ４および３Ｃ１２の結合を、それぞれ示す。

表６は、モノクロナール抗体ＴＣ２および３Ｃ４の単一鎖Ｆｖ抗体フラグメントの配列である。

ＶＨ配列は大文字で、続くリンカー配列を小文字で、最後にＶＬ配列を小文字で示した。

ｍＡｂ ＴＣ２および３Ｃ４に対応する単一鎖抗体フラグメント
ＴＣ２および３Ｃ４に対応する単一鎖抗体を作成し、シークエンスした。その配列を、表６に示す。各ｓｃＦｖに関して、重鎖可変領域（ＶＨ）を大文字で示し、続くリンカー配列を小文字で示し、さらに続く軽鎖可変領域（ＶＬ）を大文字で示した。表６に示す配列を有するｓｃＦｖは、ＳＰＲチップを固定化し、結合定数を、実施例２に記載の方法を用いて、対応する全てのＩｇＧ抗体の結合定数と比較した。得られた結果を表７に示す。表７に示すように、ｓｃＦｖの特異性は、対応する全ての抗体の特異性と同等であった。

（表６）−ｓｃＦｖの配列
ＴＣ２＿ＳｃＦｖ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＧＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡｇｇｔｇｇａｇｇｃｇｇｔｔｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇａｔｃｃｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｇＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号１６）
３Ｃ４＿ＳｃＦｖ
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡｇｇｔｇｇａｇｇｃｇｇｔｔｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇａｔｃｃｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｇＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＴＴＡＣＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧ（配列番号１７）
（表７）ｓｃＦｖのアミノ酸配列
ＴＣ２＿ＳｃＦｖ
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＬＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＹＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＶＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＤＴＤＹＤＴＴＦＩＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＧＱＶＦＦＫＭＴＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＧＲＴＹＧＩＨＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ，ＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＫＱＦＹＤＬＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１８）
３Ｃ４＿ＳｃＦｖ
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＩＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＰＹＹＹＧＩＲＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＩＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＳＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＶＴＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１９）

市販の方法を用いたｍＲＮＡからの単一鎖抗体フラグメントの調製
１２．１）ｍＲＮＡの調製
純粋なｍＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびその取扱説明書を用いて、ハイブリドーマ細胞から調製した。

１２．２）ｃＤＮＡへの変換
前記ｍＲＮＡを、鋳型として使用し、ｃＤＮＡを調製した。ランダムヘキサマープライマーを使用し、ｃＤＮＡ合成を準備し、ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡヘテロ二本鎖を、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および取扱説明書を用いて合成した。

１２．３）Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子のＰＣＲ
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡヘテロ二本鎖を熱変性した。そして、軽および重プライマーミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを増幅するために設計した特異的なプライマー存在下で、前記ｃＤＮＡ鎖ＰＣＲの鋳型として使用した。あるいは、文献（例えば、前記ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）に公表されているこのようなプライマーを、標準的な合成方法により調製してもよい。

１２．４）増幅したＶ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子の精製
増幅したＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖ＰＣＲフラグメントを、２％低融点アガロースゲルで電気泳動により分離精製し、エチレンブロマイド染色した。前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌバンドを慎重に切断し、前記ＰＣＲ産物を、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（登録商標）ゲル精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ． Ｋ１９９９−２５）または類似の市販の製品で回収した。

１２．５）Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子のｓｃＦｖ遺伝子へのアセンブリ
前記Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖ドメインを、前記リンカーフラグメント（ＧＧＧＳ）_３を用いて結合し、完全なｓｃＦｖ配列を得た。前記リンカーは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインが、それらの抗原結合構造を保持するのに充分な柔軟性に富み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを連結する。その他のリンカーはよく知られ、約１５アミノ酸を含む。

１２．６）ＰＣＲ増幅、切断およびファージミドとのライゲーション
前記ｓｃＦｖ抗体を、制限酵素（Ｓｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ））部位を組み込んだプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡを、実施例１２．４のように精製し、これらの酵素で切断し、最後に、ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローンした。

１２．７）溶性抗体のトランスフォーメーションおよび発現
前記ｓｃＦｖ遺伝子を含むベクターを、エレクトロポレーションによりＥ．Ｃｏｌｉ細胞に導入し、前記ベクターが感染した細胞だけが生育する条件下で、細胞を生育した。好ましくは、Ｅ．Ｃｏｌｉ株を選択し、ペリプラズムスペース（例えば、ＨＢ２１５１）に合成したタンパク質を移すことである。

合成したｓｃＦｖ抗体の精製を単純にするために、実施例１２．６のｓｃＦｖ遺伝子を、前記抗体のＣ末端に“ｔａｇ”を導入する発現ベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６；ｈｉｓ−ｔａｇ）にサブクローンしてもよい。前記“ｔａｇ”はモノクロナール抗体により認識され、アフィニティークロマトグラフィー精製に使用してもよい。

１２．８）バクテリオファージ表面のｓｃＦｖ抗体のトランスフォーメーションおよび発現
ｓｃＦｖ遺伝子を含む前記ベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅを、Ｅ．Ｃｏｌｉ（例えば、ＴＧ１）のサプレッサ株に導入し、前記ファージ表面に前記ｓｃＦｖ抗体を提示させる。ｓｃＦｖ抗体を提示するファージ粒子を、基本的には実施例４．２に記載の通りに調製した。

ファージ提示を用いたｓｃＦｖ ３Ｃ４の親和性熟成
バクテリオファージの表面に提示したｓｃＦｖライブラリ構築するために、基本的には実施例１２の工程に従った。しかしながら、ＰＣＲ突然変異方法は、工程１２．６で取り入れた。いくつかのこのような方法が記載されているが、Ｖ−遺伝子全体に変異をランダムに誘導する変異性ＰＣＲ（例えば、Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ（登録商標）ラダム突然変異キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）またはチェーン−シャッフリング（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＦＩＮＤ（登録商標）、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）といった非局在突然変異手段が一般的に認識されている。後者の場合、前記鎖（表６）をシャッフルするために、少なくとも２つの異なるｓｃＦｖ抗体クローンを必要とする。ついで、前記ミュータントライブラリのバイオパンニングは、より高い親和性を有するクローンを選択するために行われる。

１３．１）変異性ＰＣＲ増幅
ｓｃＦｖ抗体ＤＮＡを、抗体Ｖ遺伝子用配列プライマーおよびＴａｑポリメラーゼを使用して、Ｔａｑポリメラーゼの適合度を減少させ、０．５〜２．０ｍＭ ＭｎＣｌ_２の存在下、ＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡを精製し、切断し、そして、実施例１２に記載の通りサブクローンした。

１３．２）チェーン−シャッフリング（ＦＩＮＤ（登録商標）、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＢ）
少なくとも２つの異なるｓｃＦｖ抗体ＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ（例えば、ＢＡＬ３１；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）で断片化し、一本鎖フラグメントの個体群を作成した。前記ｓｓＤＮＡフラグメントを、フェノール抽出／エタノール沈降により精製した後、実施例２．４に記載のとおり電気泳動した。前記ｓｓＤＮＡフラグメントを再構築し、前記フラグメントの３’および５’末をアニールするプライマー配列を用いてＰＣＲにより増幅した。前記アニールされたｓｃＦＶを精製し、実施例１２に記載の通りサブクローンした。

１３．３）ミュータントライブラリのバイオパンニング
得られたライブラリは、個々のクローンの大きさが１０^５〜１０^６であった。ホロ−ＴＣを実施例６．６に記載したようにビオチン化し、ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｗａｙ）と結合させた。バイオパンニングは、基本的には実施例４．２に記載したように行った。ホロＴＣ特異性に影響を及ぼすことを確実にするために、少なくとも１００倍過剰のアポＴＣ存在下で、バイオパンニングを行った。あるいは、ライブラリを過剰のアポＴＣ固定化磁化ビーズで前処理した。

１３．４）ＥＬＩＳＡスクリーニング
個々のファージ抗体クローンを、基本的には実施例４．３に記載のとおりにホロＴＣ被覆マイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。前記プレートは、ビオチン化したホロＴＣをスプレプトアビジン被覆マイクロタイターウェル（ＮＵＮＣ（登録商標）、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に固定化することにより調製した。選択したファージ抗体を、実施例１２．７に記載のとおり、形質転換し、溶性ｓｃＦｖ抗体として発現させた。

１３．５）選択ｓｃＦｖ抗体の評価
選択ｓｃＦｖ抗体を、基本的には実施例２に記載のとおり表面プラズモン共鳴により評価した。精製した抗体調製物を、ホロＴＣを固定化したチップに注入した。前記ホロＴＣチップは、実施例２．１に記載の通りに調製したチップにホロＴＣを結合させるか、または、ストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に、ビオチン化したホロＴＣ結合させることにより調製した。得られた結果を、表９および１０に示す。

報告されているｋｏｆｆ値は、表９に示す値よりも一般的に高い。なぜならば、結合した抗原の量が、３５００ＲＵと比較して５００ＲＵとこの実験よりも低く、あまり再結合が起こらなかったためである。

ｓｃＦｖ抗体の全長抗体型への再構成
標準的な組換えＤＮＡ手段（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ（ｅｄ．）（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を用いて、ｃＤＮＡクローンからのｓｃＦｖを、マウスまたはヒト遺伝子定常領域に結合させることにより、前記ｓｃＦｖ抗体フラグメントを、全長抗体型に再構築した。キメラ重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、強力なウィルスプロモータ（例えば、ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の制御下におき、抗体の短期間および安定した発現のために、細胞系ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５０）または骨髄種細胞系ＮＳＯ（ＡＴＣＣ＃８５１１０５０３）と共にトランスフェクションした。哺乳類ＩｇＧ Ｆｃ（例えば、リウマチ因子）に対する自己抗体を妨げる危険性を最小限にするために、このような抗体にあまり感染しないＩｇＧ３型に再構築した。

１４．１）ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクション
前記ＣＯＳ−１細胞を、トランスフェクションの前日に、ペトリ皿に配置した。発現させる遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、前記細胞にトランスフェクトし、３日後、前記培地から抗体を回収した。

１４．２）ＮＳ０細胞のトランスフェクション
プラスミドＤＮＡを、約１０Ｅ７のＮＳ０細胞に、氷上でエバポレーションによりトランスフェクトした。ついで、細胞を、トランスフェクトした細胞だけが生存可能な選択培地で成育させた。トランスフェクション後３週間で、抗体を細胞培地から回収した。

アプタマーｂ９７４−３ｔ１のエピトープマッピング
１８，０００Ｄａのアプタマーｂ９７４−３ｔ１のエピトープ特異性を測定した。

１５．１）種々の抗−ヒトＴＣ ｍＡｂに固定化したホロＴＣへのアプタマーの結合
１０つの異なる抗−ヒトＴＣ抗体のアレイを、ウサギ抗−マウスＩｇＧで予め被覆したデキストラン被覆チップに固定化した。前記操作は、実施例２．２に記載の通りに行った。ホロＴＣ（１５μＬ、０．４μＭ）を注入し、前記ｍＡｂに結合させた後、アプタマーｂ９７４−３ｔ１（１５μＬ、１μＭ）を注入した。

１５．２）種々の抗−ヒトＴＣ ｍＡｂの存在下および非存在下における固定化アプタマーによるホロＴＣの結合
アプタマーｂ９７４−３ｔ１を、ストレプトアビジン被覆磁化粒子（０．８μｍ）に、実施例３．１と類似の方法で固定化した。なお、前記実施例において、前記抗−マウスＩｇＧ被覆粒子をストレプトアビジン粒子に替えた。ついで、実施例３．２に記載のとおり、９つの異なるＴＣ特異性抗体存在下で、前記粒子に野生型ホロＴＣを捕獲させた。５Ｈ２および３Ｃ４を１００μｇ／ｍＬで試験した以外は、全ての抗体は１０μｇ／ｍＬとした。

表１１に示すように、アプタマーｂ９７４−３ｔ１は、エプトープ６抗体および一部のエピトープ２抗体（２Ａ）と完全またはほぼ完全に重複した。ｍＡｂ３−９および５Ｈ２の一部の範囲では、あいまいな結果が得られた。前記アプタマーおよびｍＡｂの双方は、１つの組み合わせではホロＴＣと同時に結合したが、他方ではそうではなかった。しかしながら、表現形式が、結合効率に影響を及ぼすことは珍しいことではない。同時に結合することは、少なくとも１つの実験において確認されたため、完全に重複するものは除いた。

エピトープ６とアプタマーの強力な重複に基づいて、ヘパリンとの重複もまた極めて強力である（図３のエピトープマップおよび図１０の阻害データ参照）。

ホロＴＣ特異的抗体３Ｃ４によるホロＴＣの捕獲およびアプタマーｂ９７４−３ｔ１による検出
結合の様子を、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。モノクロナール抗体３Ｃ４を、前記実施例２．１に記載のとおり、デキストラン被覆ＣＭ５チップに固定化した。前記抗体を固定化したチップを導入し、その後、０．４ＭホロＴＣまたはアポＴＣを１５μＬ、続いて、１５μＬの１μｍアプタマーｂ９７４−３ｔ１を注入した。前記アプタマーは、約１０ＲＵのレベルまで捕獲したホロＴＣに結合し、捕獲したホロＴＣのＲＵあたり結合したアプタマーは、３９ｍＲＵであった（図１１、上部曲線）。アポＴＣは、ホロＴＣに特異的なｍＡｂ ３Ｃ４により捕獲されなかったため、アプタマーは、この第２のケースのいずれにおいても結合しなかった（図１１、下部曲線）。

固定化したＴＣ特異的アプタマーｂ９７４−３ｔ１によるアポＴＣおよびホロＴＣの捕獲、ｍＡｂ ３Ｃ４を用いた結合したホロＴＣの検出、エピトープ２抗体ｍＡｂ４−７による全ＴＣ（アポＴＣおよびホロＴＣ）の検出
１７．１）ストレプトアビジン被覆ＳＡチップへのアプタマーの固定化
ビオチン化アプタマーｂ９７４−３ｔ１を、ストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した。前記アプタマーを、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２および２ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ＨＢＳ−Ｐ＋）を加えた０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０で、約１８μｇ／ｍＬに希釈し、５μＬ／分で７分間チップに注入した。アプタマーの結合をリアルタイムで追跡し、結合した質量をセンサグラムでＲＵ（応答単位）で記録した。前記アプタマーを約１５００ＲＵで前記チップに固定化した。

１７．２）固定化したアプタマーへのアポＴＣおよびホロＴＣの結合
アポＴＣおよびホロＴＣをＨＢＳ−Ｐ＋で、約１８μｇ／ｍＬに希釈し、前記固定化したアプタマーを備えたチップに、５μＬ／分で７分間注入した。結合した質量を、センサグラムで記録した。

１７．３）ＴＣおよびホロＴＣに特異的なモノクロナール抗体による結合したアポＴＣおよびホロＴＣの検出
ホロＴＣに特異的なモノクロナール抗体ｍＡｂ ３Ｃ４を、ＨＢＳ−Ｐ＋に５０μｇ／ｍＬに希釈し、捕獲アポＴＣおよびホロＴＣを有するチップに、５μＬ／分で１分間注入した。その後、ＴＣに特異性を有するが、ホロＴＣには特異性を有さず、ｍＡｂ ３Ｃ４と重複しないエピトープを有するモノクロナール抗体を、５μＬ／分で１分間注入した。各ｍＡｂの結合した質量を、センサグラムで記録した。

図１２は、前記固定化したアプタマーによるアポＴＣおよびホロＴＣの捕獲、その後の、捕獲されたＴＣへのｍＡｂ ３Ｃ４および４−７の結合を示す典型的なセンサグラムを示す。図中の矢印は、ＴＣの注入（ｉｎｊ．）、ｍＡｂ ３Ｃ４の注入（３Ｃ４）、ｍＡｂ４−７の注入（４−７）および洗浄（ｗ）を示す。ｍＡｂ ３Ｃ４は、捕獲されたホロＴＣにのみ結合し、ｍＡｂ４−７は、アポＴＣおよびホロＴＣと同等によく結合した（表１２）。図１２に示すように、アプタマーｂ９７４−３ｔ１は、アポＴＣよりもホロＴＣに対してわずかに特異性を示した（すなわち、ホロ型であった場合、前記チップに結合したＴＣの量がより多かった）。これは、約３倍と推測された。

ヒトトランスコバラミン３次元構造の初期予測
ＨＭＭＳＴＲ／Ｒｏｓｅｔｔａ予測サーバを用いてシミュレーションを行った。前記ＨＭＭＳＴＲ／Ｒｏｓｅｔｔａサーバは、前記配列からタンパク質の構造：３つの状態（Ｈ、Ｅ、Ｌ）の形式の２次構造、バックボーンねじれ角（ｐｈｉ、ｐｓｉ）の形式の局部構造、コンテキストシンボル（ストランドおよびβターン）の形式の超二次構造、および座標形式の３次元構造を予測する。（Ｃ．Ｂｙｓｔｏｆｆ、Ｖ．Ｔｈｏｒｓｓｏｎ、Ｄ．Ｂａｋｅｒ）ＨＭＭＳＴＲは、配列構造モチーフのＩ−サイトライブラリに基づく隠れマルコフモデルである。Ｉ−サイトは、クエリーにおいて局在構造モチーフを予測し、ついで、これらをＲｏｓｅｔｔａにより使用し、３次元構造を発生させる。Ｒｏｓｅｔｔａは、Ｋｉｍ Ｓｉｍｏｎｓ、Ｄａｖｉｄ Ｂａｋｅｒ、Ｉｎｇｏ ＲｕｄｚｉｎｓｋｉおよびＣｈａｒｌｅｓ Ｋｏｏｐｅｒｂｅｒｇにより開発されたモンテカルロフラグメントインサートプロテインフォールディングプログラム（Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ）である（Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ、１９９７）。前記ヒトトランスコバラミンのアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２００６２から取得した。

図１３は、予測したアポトランスコバラミンの欠失変異体（実施例２.４）の３次元構造を、リボン形式で示す。図１３の上図には、ｍＡｂ ３Ｃ４エピトープを備えたＴＣの正面を示す（実施例１９参照）。前記エピトープは、赤色の球形で示す。図１３の下図は、仮のヘパリン結合部位を備えたＴＣの背面を示す。前記ヘパリン結合部位は、球形で示す。

２７個のアミノ酸欠失の予測した空間近接および仮想ヘパリン結合部位は、前記欠失変異体と重複するエピトープ２に対する抗体が、ヘパリンおよびアプタマーｂ９７４−３ｔ１により阻害され、これらが、ヘパリン結合部位に結合するという我々の実験的所見により裏付けられた（実施例２および１３）。さらに、エピトープ６に対する抗体は、ヘパリンおよびアプタマーｂ９７４−３ｔ１により阻害され、そして、エピトープ１および２抗体により、ある程度まで阻害されるため、前記３次元構造は、エピトープ６が前記ヘパリン結合部位を広げることを示す。

図１４は、前記ホロＴＣ構造の漫画を、３面ピラミッドとして示し、実験データに基づく異なる抗体エピトープの局在性を示す。

ホロＴＣ上のｍＡｂ ３Ｃ４のエピトープの初期予測
アポＴＣとコバラミンのドッキングおよびホロＴＣとｍＡｂ ３Ｃ４のドッキングのシミュレーションを、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｌｔｄにより彼らが所有する独自のシミュレーション技術を用いて行った。アポトランスコバラミンのアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２００６２から取得した。前記鎖は、最初は、不規則に形付けられていた。前記それぞれのシステイン残基のイオウが、２．０３８±０．０５Åの距離に到達する場合、システイン２１ならびに２６７、８３ならびに９６、１１６ならびに３０９、および１６５ならびに２０５との間に形成されていると知られていたジスルフィド結合（ＳＮ Ｆｅｄｏｓｏｖ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：２６０１５−２０）が、形成されるようにプログラムした。前記３次元のコバラミン構造は、ＰＤＢ登録番号１ＢＭＴ（メチオニン合成酵素Ｂ１２結合領域）から取得し、ＴＣと反応する前に水で緩和した。文献で報告されているように、コバラミンの結合により、ＴＣに著しい構造変化が生じた（Ｅ Ｈｉｐｐｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９７０；２０８：３３７−９）。

我々は、前記ｍＡｂ ３Ｃ４のＣＤＲ領域のアミノ酸配列（表７）を決定したように、初期構造は、ヒトＩｇＧ１モデルに挿入したｍＡｂ ３Ｃ４ ＣＤＲ配列に基づいて行った（ＥＡ Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；３１：１６９−２１７）。可変領域は、最初、不規則に形作られていた。

ｍＡｂ ３Ｃ４とホロＴＣとの間の相互作用をシミュレーションすると、初期配向は、ホロＴＣのＣ１６５−Ｃ２０５とＣ末端（３２０−４２７）との間に示される抗体の結合領域を不規則に選択した。抗体とホロＴＣとの当初の距離は、１０Åを超え、前記溶液のイオン強度は、５０とした。

全てのシミュレーションは、Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎプロセッサーを搭載したリナックスワークステーションで行った。

前記エピトープは、ホロＴＣのアミノ酸として定義した。予測した複合体は、前記抗体のアミノ酸から＜５Åに位置していた。３６のアミノ酸はこれらの要件を満たしており、アミノ酸３９−７７＋２６５−２６９、１６１−２４３および２７１−２９７（表１３Ａ）にわたる３つの個別の領域で分けることができる。近接したアミノ酸を含む前記エピトープを定義するアミノ酸残基の数は、６８である（表１３Ｂ）。前記エピトープは、前記タンパク質のトンネル付近に位置している（図１３）。前記トンネルの一方の面には、コバラミンが結合する。

前記抗体において、前記エピトープおよび拡張エピトープに対応するアミノ酸は、それぞれ、３２および３９であり、前記パラトープおよび拡張パラトープを構成していた。前記アミノ酸は、２つの領域、つまり、パラトープおよび拡張パラトープのＶＬ鎖の１４残基ならびに１６残基およびＶＨ鎖の１８残基ならびに２３残基のそれぞれに分けることができる（表１４ＡおよびＢ）。

前記パラトープ（抗体）と前記エピトープ（ホロＴＣ）との間の相互作用および含まれる残基を、図１５Ａに示す。対応する拡張パラトープと拡張エピトープとの間の相互作用を、図１５Ｂに示す。

図１ａは、ＳＰＲ“センサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）”であり、エピトープ２特異的ｍＡｂによりチップに固定したホロＴＣへのｍＡｂ ３Ｃ４の結合（８７１ＲＵ）、および、アポＴＣの結合がないこと（０ＲＵ）を示す。 図１ｂは、捕獲リガンドとしてｍＡｂ ５Ｈ２（エピトープ２）である場合の図１に相当する。 図２は、野生型ホロＴＣおよびアポＴＣに対する本願明細書に記載の様々な抗体の親和性および特異性を示す。 図３ａは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣの“エピトープマップ”を示す。 図３ｂは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣの修正“エピトープマップ”を示す。 図３ｃは、本願明細書に記載のエピトープマッピング法により作成したＴＣのさらなる修正“エピトープマップ”を示す。 図４ａは、捕獲抗体として抗体３Ｃ４を利用し、本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す。 図４ｂは、捕獲抗体として抗体３Ｃ４を利用し、吸光検出を使用した本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す。 図４ｃは、捕獲抗体としてホロＴＣに特異的な単一鎖抗体を利用し、本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す。 図４ｄは、捕獲抗体としてホロＴＣに特異的な単一鎖抗体を利用し、発光検出を使用した本願明細書に記載のホロＴＣ分析方法に、ホロＴＣの標準溶液を適用した結果を示す。 図５ａは、本発明の分析方法において、ホロＴＣおよびアポＴＣの標準混合物から得られた標準曲線を示し、捕獲抗体上のホロＴＣに結合した検出リガンドとしてのｍＡｂ ３Ｃ４の量を示し、図５ｂは、捕獲抗体上のホロＴＣに結合した検出リガンドとしてのｍＡｂ ３Ｃ４の量を示す図５ａと同等の曲線であって、捕獲抗体は、ｍＡｂ ＴＣ７である。 図６ａは、本願明細書に記載の分析方法と市販のホロＴＣアッセイとの比較を示し、図６ｂは、本願明細書に記載の分析方法と市販のホロＴＣアッセイとのさらなる比較を示す。 図７ａは、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ５（５Ｃ２）に対して特異的な抗体の、ホロＴＣおよびアポＴＣの固定化混合物への連続的な結合を示し、図７ｂは、前記捕獲リガンドが、ｍＡｂ ＴＣ７である以外は、図７ａに示す物と同一の結合を示す。 図８は、既知の割合で固定化したホロＴＣおよびアポＴＣに対するエピトープ４（３Ｃ４）および６（３Ｃ１２）への相対的な結合を示すＴＣコバラミン飽和標準曲線を示す。 図９は、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ６（３Ｃ１２）に対して特異的な抗体の、固定化したホロＴＣおよびアポＴＣの混合物への連続的な結合を示す。 図１０は、種々の濃度での多糖ヘパリンにより生じた、ＴＣと本願明細書に記載の様々なｍＡｂとの間の結合阻害を示す。 図１１は、ｍＡｂ ３Ｃ４によりチップに結合したホロＴＣと、アプタマーｂ９７４−３ｔ１の結合を示すＳＰＲ“ｓｅｎｓｏｇｒａｍ”を示す。 図１２は、アプタマーｂ９７４−３ｔ１により捕獲されたホロＴＣおよびアポＴＣと、エピトープ４（３Ｃ４）およびエピトープ２Ｂ（４−７）に対して特異的な抗体との連続的な結合を示す（下向きの矢印は、注入時期を示す）。 図１３ａは、ヒトＴＣのエピトープ４の構造を示す。 図１３ｂは、ヒトＴＣのヘパリン結合部位の構造を示す。 図１４は、ホロＴＣ上に識別された様々なエピトープの模式図を示す。 図１５ａは、３Ｃ４のパラトープとホロＴＣの好ましいエピトープ領域との間の相互作用を示し、図１５ｂは、前記３Ｃ４の拡張パラトープと、ホロＴＣのエピトープ領域との間の相互作用を示す。

配列番号３ ヒトＴＣの結合領域Ｉのアミノ酸配列
配列番号４ ヒトＴＣの結合領域Ｉのアミノ酸配列
配列番号５ ヒトＴＣの結合領域ＩＩのアミノ酸配列
配列番号６ ヒトＴＣの結合領域ＩＩＩのアミノ酸配列
配列番号７ ヒトＴＣの好ましい結合領域ＩＩのアミノ酸配列
配列番号８ ミモトープ
配列番号９ ミモトープ
配列番号１０ ミモトープ
配列番号１１ ミモトープ
配列番号１２ ミモトープ
配列番号１３ ミモトープ
配列番号１４ ミモトープ
配列番号１５ ミモトープ
配列番号１６ 単一鎖抗体構築物ＴＣ２＿ｓｃＦｖ
配列番号１７ 単一鎖抗体構築物３Ｃ４＿ｓｃＦｖ
配列番号１８ 単一鎖抗体構築物ＴＣ２＿ｓｃＦｖ
配列番号１９ 単一鎖抗体構築物３Ｃ４＿ｓｃＦｖ

Claims (26)

1. ホロＴＣ特異的結合パートナーを特定するための方法であって、前記特異的結合パートナーは、アポＴＣの少なくとも４０倍を超えるホロＴＣ特異性を有し、
   モチーフ ＳＸ₁ Ｘ₂ＹＸ₃ ＷＤ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆
   ここで、Ｘ₁＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
   Ｘ₂＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
   Ｘ₃＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
   Ｘ₄＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
   Ｘ₅＝Ｄ、Ｆ
   Ｘ₆＝Ｍ、Ｒ
   またはモチーフ ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷを含む環状ペプチド、その構築物、または、以下のヒトＴＣ領域ＩないしＩＩＩの少なくとも１つの構築物を少なくとも１つ有する潜在的な特異的なバインダーのライブラリをスクリーニングすることを含む方法。
   Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
   ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
   ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｎ２９７
2. アポＴＣの少なくとも４０倍を超えるホロＴＣ特異性を有するホロＴＣ特異的結合パートナーであって、前記特異的結合パートナーが、抗体、単一鎖抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物である特異的結合パートナー。
3. モチーフ ＳＸ₁ Ｘ₂ＹＸ₃ ＷＤ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆
   ここで、Ｘ₁＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
   Ｘ₂＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
   Ｘ₃＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
   Ｘ₄＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
   Ｘ₅＝Ｄ、Ｆ
   Ｘ₆＝Ｍ、Ｒ
   または、モチーフ ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷを含む環状ペプチドのうち少なくとも一つに対して、アポＴＣの少なくとも４０倍の親和性を有する請求項２記載の特異的結合パートナー。
4. ヒトＴＣの領域Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの少なくとも一つにおける少なくとも一つの箇所に結合する請求項２または３に記載の特異的結合パートナー。
   Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
   ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
   ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｎ２９７
5. 前記特異的結合パートナーとホロＴＣとの結合が、ホロＴＣおよびアポＴＣの双方に存在し、前記ホロＴＣ特異的結合パートナーのホロＴＣ結合部位と重複する部位に親和性を有する特異的結合パートナーの結合により阻害される請求項２から４のいずれかに記載の特異的結合パートナー。
6. 前記特異的結合パートナーが、抗体、単一鎖抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物である請求項２から５のいずれかに記載の特異的結合パートナー。
7. 前記特異的結合パートナーが、欧州細胞カルチャーコレクションにアクセッションＮｏ．０２１１０７４１で預けられた抗体３Ｃ４である請求項２記載の特異的結合パートナー。
8. 前記特異的結合パートナーが、以下の配列を有する単一鎖抗体、その親和性成熟単一鎖抗体またはその組換え抗体である請求項２記載の特異的結合パートナー。
   ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＩＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＰＹＹＹＧＩＲＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＩＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＳＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＶＴＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１９）
9. 試料中のホロＴＣを分析するための分析方法であって、前記試料を、ホロＴＣ特異的結合パートナーと接触させる工程、および、ホロＴＣおよび前記特異的結合パートナーの合成共役物を検出する工程を含み、前記特異的結合パートナーが、請求項２から８のいずれかに記載の特異的結合パートナーである方法。
10. 前記ホロＴＣと特異的結合パートナーとの共役物を、前記共役物の特性により直接検出する請求項９記載の方法。
11. 競合を形成するさらなる共役物を検出することによるか、または、前記特異的結合パートナー、ホロＴＣおよびさらなるリガンドの共役物を検出することにより、前記ホロＴＣと特異的結合パートナーとの共役物を間接的に検出する請求項９記載の方法。
12. 前記ホロＴＣ特異的結合パートナーが、固定されているか、または固定化可能であり、それを用いて、ホロＴＣを捕獲する請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記ホロＴＣ特異的結合パートナーを用いて、固定化されているかまたは固定化可能な第２のリガンドにより捕獲されたホロＴＣを検出する請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
14. モチーフ ＳＸ₁ Ｘ₂ＹＸ₃ ＷＤ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆
    ここで、Ｘ₁＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
    Ｘ₂＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
    Ｘ₃＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
    Ｘ₄＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
    Ｘ₅＝Ｄ、Ｆ
    Ｘ₆＝Ｍ、Ｒ
    またはモチーフ ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷ
    を含む制限ペプチドミモトープ、または、２以上のこれらのミモトープの構築物を使用することを含む請求項９から１３のいずれかに記載のホロＴＣ分析方法。
15. 前記ミモトープを、前記ホロＴＣ特異的結合パートナーとの結合におけるホロＴＣに対する競争相手として使用する請求項１４記載の方法。
16. 下記の工程を含む請求項９記載の方法。
    ｉ）対象の液体試料を、固定化されているかまたは固定化可能なホロＴＣ特異的結合パートナーと接触させ、ホロＴＣ：ｓｂｐ共役物を形成する工程、
    ｉｉ）前記特異的結合パートナーを、ＴＣまたはホロＴＣに対する第２のリガンドと接触させ、前記第２のリガンドを結合したホロＴＣと結合させて、ｓｂｐ：ホロＴＣ：第２のリガンド共役物を形成する工程、
    ｉｉｉ）結合していない第２のリガンドを、前記ｓｂｐ：ホロＴＣ：第２のリガンド共役物から分離する工程、
    ｖｉ）ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物を検出する工程、および
    ｖｉｉ）ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物の検出量を、前記液体試料中のホロＴＣ濃度と相関させて、液体試料中に存在するホロＴＣを測定する工程。
17. さらに、下記の工程を含む請求項１６記載の方法。
    ｉｖ）ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物を、固定化されている状態から解離する工程、および／または、前記ｓｂｐからホロＴＣ：第２のリガンド共役物を解離する工程、および
    ｖ）ホロＴＣ：ｓｂｐ：第２のリガンド共役物またはホロＴＣ：第２のリガンド共役物の検出を促進するために、補基質または第３のリガンドを加える工程。
18. さらに、前記液体試料中に存在するホロＴＣの濃度を、前記対象のコバラミン欠乏の有無と関連付ける工程を含む請求項１６または１７記載の方法。
19. さらに、アポＴＣまたは全ＴＣを測定することを含む請求項９から１８のいずれかに記載の方法。
20. 哺乳類（ヒトを除く）または哺乳類でない対象にヒト−ホロＴＣ特異的抗体を誘導する方法であって、 哺乳類（ヒトを除く）または哺乳類でない対象にヒト−ホロＴＣ特異的抗体を誘導する方法であって、
    モチーフ ＳＸ ₁ Ｘ ₂ ＹＸ ₃ ＷＤ Ｘ ₄ Ｘ ₅ Ｘ ₆
    ここで、Ｘ ₁ ＝Ｆ、Ｇ、Ｌ
    Ｘ ₂ ＝Ｆ、Ｌ、Ｒ
    Ｘ ₃ ＝Ｌ、Ｐ、Ｑ
    Ｘ ₄ ＝Ｍ、Ｑ、Ｙ
    Ｘ ₅ ＝Ｄ、Ｆ
    Ｘ ₆ ＝Ｍ、Ｒ
    モチーフ ＳＦＦＹＳＬＣＹＣＷ
    または、以下のヒトＴＣの領域ＩないしＩＩＩの少なくとも一つを含む免疫原基質を、前記対象に投与することを含む方法。
    Ｉ）Ｌｅｕ３９ないしＬｙｓ７７およびＴｈｒ２６５ないしＬｙｓ２６９
    ＩＩ）Ｉｌｅ１６１ないしＶａｌ２４３
    ＩＩＩ）Ａｒｇ２７１ないしＡｓｎ２９７
21. 請求項９から１９のいずれかに記載の分析方法に使用するキットであって、任意で標識されているか、または、固定化されたホロＴＣ特異的結合パートナーであって、アポＴＣの少なくとも４０倍を超えるホロＴＣ特異性を有するホロＴＣ特異的結合パートナーを含むキット。
22. 前記特異的結合パートナーが、請求項７または８記載の特異的結合パートナーである請求項２１記載のキット。
23. さらに、任意で標識化されているか、または、固定化されているＴＣ結合リガンドを含む請求項２１または２２記載のキット。
24. さらに、既知濃度のホロＴＣ溶液を複数含む請求項２１から２３のいずれかに記載のキット。
25. さらに、前記分析方法を実施するための説明書を含む請求項２１から２４のいずれかに記載のキット。
26. さらに、既知濃度のアポＴＣ溶液を複数含む請求項２１から２５のいずれかに記載のキット。

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