JP4490268B2 - Method for producing cysteine protease-treated collagen and cysteine protease-treated collagen - Google Patents
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Description
本発明は、コラーゲン、その製造方法およびその用途に関する。詳しくは、システインプロテアーゼ処理コラーゲン、その製造方法およびその用途に関する。 The present invention relates to collagen, a production method thereof and use thereof. Specifically, the present invention relates to a cysteine protease-treated collagen, a production method thereof, and a use thereof.
動物において細胞間の結合組織や骨組織を構成する主なタンパク質であるコラーゲンは、化粧品、食品添加剤あるいは医療用材料などの分野において、広く利用されている。
このようなコラーゲン素材において求められる特性は、たとえば、組織再生、構築などにおける生体材料としての良好な機械的性質、生体適合性、生物学的分解性、止血力などが挙げられる。このようなコラーゲンが発揮しうる特性に着目して、コラーゲンを含む材料として、たとえば、食品添加剤；化粧品材料；人工皮膚調製用の溶剤、止血スポンジ、骨再構成材料、軟部組織の充填材などの医療材料への適用が試みられている。
このようにコラーゲンは産業上非常に重要な生体材料となりつつあるが、その一方でさらなる生体との適合性、保湿性、止血力などの諸機能の向上が求められていた。
さらに、現在、広く利用されているコラーゲンは、子ウシ、ブタなどの真皮または骨などから抽出精製したものが多い。しかし、たとえば、子ウシなどの皮には毛や脂肪などが混在するためそれらを除去する前処理が必要であり、精製される酸可溶性コラーゲンの収量は５％程度と高くないこと、家畜間で感染し発病する原因物質を除去する工程、分析工程などが必要になってきているなど、その利用に際し、煩雑な操作が必要な場合もある。また、子ウシの場合、１頭から得られるコラーゲンの量が比較的少ないという課題もあった。
このため、優れた機能を保持しつつ、さらに、家畜間の感染などに起因する煩雑な工程を要しない簡便な方法で生体材料等にも適用が可能で、しかも大量入手が可能なコラーゲンの出現も求められていた。
したがって、本発明は、上記のような背景技術に基づきなされたものであって、生体適合性に優れるとともに、保湿効果、止血力に優れ、またｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞（胚）培養技術に優れた性質を有する、高機能なコラーゲンおよびその製造方法を提供することを課題とする。Collagen, which is a main protein constituting connective tissue between cells and bone tissue in animals, is widely used in fields such as cosmetics, food additives, and medical materials.
The properties required for such a collagen material include, for example, good mechanical properties as biomaterials in tissue regeneration, construction, biocompatibility, biodegradability, hemostasis, and the like. Focusing on the characteristics that can be exerted by such collagen, as materials containing collagen, for example, food additives; cosmetic materials; solvents for preparing artificial skin, hemostatic sponges, bone reconstitution materials, soft tissue fillers, etc. Application to medical materials is being attempted.
As described above, collagen is becoming a very important biomaterial in the industry, but on the other hand, further improvements in various functions such as compatibility with a living body, moisture retention, and hemostasis have been demanded.
Furthermore, currently widely used collagen is extracted and purified from the dermis or bones of calves and pigs. However, for example, since skins such as calves contain hair and fat, pretreatment to remove them is necessary, and the yield of purified acid-soluble collagen is not as high as about 5%. In some cases, complicated operations are required for the use, such as a step of removing a causative substance that causes infection and disease, an analysis step, and the like. In the case of calves, there is also a problem that the amount of collagen obtained from one head is relatively small.
For this reason, the appearance of collagen that can be applied to biomaterials and the like in a simple manner that does not require complicated processes due to infection between livestock, etc. while maintaining excellent functions, and that can be obtained in large quantities Was also sought.
Therefore, the present invention has been made based on the background art as described above, and is excellent in biocompatibility, excellent in moisturizing effect and hemostatic force, and excellent in cell (embryo) culture technology in vitro. It is an object to provide a highly functional collagen having properties and a method for producing the same.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼとを接触させて得られるコラーゲン（以下「システインプロテアーゼ処理コラーゲン」ということがある。）が、生体適合性に優れるとともに、保湿効果、止血力に優れることを見出し本発明を完成するに至った。このようなシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、独特の網目状の会合体構造を有し、線維化が阻害されている。
すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの製造方法は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼとを接触させることを特徴としている。
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼとを接触して得られることを特徴としている。
前記コラーゲンまたはアテロコラーゲンは、魚類、鳥類またはほ乳類由来のコラーゲンまたはアテロコラーゲンであることが好ましく、魚類由来のコラーゲンまたはアテロコラーゲンであることがさらに好ましい。
前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、該システインプロテアーゼ処理コラーゲン分子１つが３本のポリペプチド鎖からなる３重螺旋構造を有し、複数のシステインプロテアーゼ処理コラーゲン分子により網目状の会合体構造を形成していることが好ましい。
前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、複数のシステインプロテアーゼ処理コラーゲン分子による１本の線維への線維化が阻害されていることが好ましい。
前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンが熱により変性する温度は、２５℃以上であることが好ましい。
本発明に係る化粧品は、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。
本発明に係る医療用材料は、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。
本発明に係る食品添加剤は、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。
本発明に係る細胞、組織または胚の培養材料は、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンを含有することを特徴としている。The present inventors have intensively studied to solve the above problems, and collagen obtained by contacting collagen or atelocollagen with cysteine protease (hereinafter sometimes referred to as “cysteine protease-treated collagen”) is biocompatible. In addition to being excellent, the inventors have found that it has excellent moisturizing effect and hemostatic power, and has completed the present invention. Such cysteine protease-treated collagen has a unique network-like aggregate structure, and fibrosis is inhibited.
That is, the outline of the present invention is as follows.
The method for producing cysteine protease-treated collagen according to the present invention is characterized in that collagen or atelocollagen is contacted with cysteine protease.
The cysteine protease-treated collagen according to the present invention is obtained by contacting collagen or atelocollagen with cysteine protease.
The collagen or atelocollagen is preferably fish, avian or mammal-derived collagen or atelocollagen, more preferably fish-derived collagen or atelocollagen.
The cysteine protease-treated collagen has a triple helical structure in which one cysteine protease-treated collagen molecule is composed of three polypeptide chains, and a plurality of cysteine protease-treated collagen molecules form a network-like aggregate structure. It is preferable.
The cysteine protease-treated collagen is preferably inhibited from fibrillation into a single fiber by a plurality of cysteine protease-treated collagen molecules.
The temperature at which the cysteine protease-treated collagen is denatured by heat is preferably 25 ° C. or higher.
The cosmetic according to the present invention is characterized by containing the cysteine protease-treated collagen.
The medical material according to the present invention is characterized by containing the cysteine protease-treated collagen.
The food additive according to the present invention is characterized by containing the cysteine protease-treated collagen.
The cell, tissue or embryo culture material according to the present invention is characterized by containing the cysteine protease-treated collagen.
図１は、アテロコラーゲンの電子顕微鏡写真像（６０，０００倍、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）の一例を示す写真である。
図２は、システインプロテアーゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡写真像（６０，０００倍、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０）の一例を示す写真である。
図３は、ゼラチンの電子顕微鏡写真像（４０，０００倍）の一例を示す写真である。
図４は、細胞と細胞の間に存在する線維を形成するＩ型コラーゲンと細胞膜付近に存在するＩＶ型コラーゲンの例を示す模式図である。図４中、１は細胞、２は細胞、３はＩ型コラーゲン、４はＩＶ型コラーゲンを示す。
図５は、精製したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す写真である。
図６は、システインプロテアーゼ処理コラーゲンのα１成分、α２成分およびアテロコラーゲンのα１成分、α２成分を、陽イオン交換クロマトグラフィーで測定したピークを示すチャートである。
図７は、システインプロテアーゼ処理コラーゲン含有溶液の風乾後の光学顕微鏡による写真である。（倍率：１００倍）
図８は、アテロコラーゲン含有溶液の風乾後の光学顕微鏡による写真である。（倍率：１００倍）
図９は、システインプロテアーゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡写真像（６０，０００倍、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）の一例を示す写真である。
図１０は、アテロコラーゲンの電子顕微鏡写真像（６０，０００倍、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）の一例を示す写真である。
図１１は、アテロコラーゲンと、システインプロテアーゼ処理コラーゲンのエタノールに対する相対溶解度を示すグラフである。
図１２は、ウサギ耳および尾部由来についてのアテロコラーゲンおよびそのシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図１３は、ニワトリ軟骨由来アテロコラーゲンとそのシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。FIG. 1 is a photograph showing an example of an electron micrograph of atelocollagen (60,000 times, 50 mmol / L acetate buffer, pH 4.0).
FIG. 2 is a photograph showing an example of an electron micrograph image (60,000 times, 50 mmol / L acetate buffer, pH 4.0) of cysteine protease-treated collagen.
FIG. 3 is a photograph showing an example of an electron micrograph (40,000 times) of gelatin.
FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of type I collagen forming fibers existing between cells and type IV collagen existing in the vicinity of the cell membrane. In FIG. 4, 1 is a cell, 2 is a cell, 3 is type I collagen, and 4 is type IV collagen.
FIG. 5 is a photograph showing the analysis results of purified cysteine protease-treated collagen by 7.5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
FIG. 6 is a chart showing peaks obtained by measuring the α1 component and α2 component of cysteine protease-treated collagen and the α1 component and α2 component of atelocollagen by cation exchange chromatography.
FIG. 7 is a photograph taken with an optical microscope after air-drying of a cysteine protease-treated collagen-containing solution. (Magnification: 100 times)
FIG. 8 is a photograph taken by an optical microscope after air-drying an atelocollagen-containing solution. (Magnification: 100 times)
FIG. 9 is a photograph showing an example of an electron micrograph image (60,000 times, 50 mmol / L phosphate buffer, pH 7.4) of cysteine protease-treated collagen.
FIG. 10 is a photograph showing an example of an electron micrograph of atelocollagen (60,000 times, 50 mmol / L phosphate buffer, pH 7.4).
FIG. 11 is a graph showing the relative solubility of atelocollagen and cysteine protease-treated collagen in ethanol.
FIG. 12 is a photograph showing the results of 5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of atelocollagen and its cysteine protease-treated collagen from rabbit ears and tail.
FIG. 13 is a photograph showing the results of 5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of chicken cartilage-derived atelocollagen and its cysteine protease-treated collagen.
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲン（以下「ＣＰ−コラーゲン」と表記することがある。）は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼとを接触させて得ることができる。
以下、本発明で用いるコラーゲン、アテロコラーゲン、システインプロテアーゼ、システインプロテアーゼ処理コラーゲン、その製造方法について詳説する。
コラーゲンまたはアテロコラーゲン
本発明で用いられるコラーゲンとしては、たとえば、ウシ、ブタ、ウサギなどのほ乳類、ニワトリなどの鳥類などの、動物の真皮、腱、骨、筋膜など、あるいはサメ、コイ、マグロなど魚類の皮膚、鱗などに由来するコラーゲンが挙げられる。
また、本発明で用いられるアテロコラーゲンとしては、たとえば、ウシ、ブタ、ウサギなどのほ乳類、ニワトリなどの鳥類などの、動物の真皮、腱、骨、筋膜など、あるいはサメ、コイ、マグロなど魚類の皮膚、鱗などのコラーゲンが豊富に含まれる組織を原料とし、ペプシンなどにより、分子のアミノ末端およびカルボキシル末端のテロペプチド領域を除去したアテロコラーゲンが挙げられる。
これらのうちでは、魚類に由来するコラーゲンまたはアテロコラーゲンを好ましく用いることができる。また、コラーゲンとアテロコラーゲンのうちではアテロコラーゲンを好ましく用いることができる。
魚類に由来するコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることにより、原料を簡便、安全にかつ大量に入手可能であり、ヒトに対してより安全なシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。
魚類のうちでは、具体的には、たとえば、キハダマグロなどのマグロ、コイ、ウナギなどが挙げられ、これらのうちでは、マグロをより好ましく用いることができる。
このようなアテロコラーゲンのうちでは、熱による変性温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であるものが望ましい。
このため、魚類のうちでは、キハダマグロなどのマグロ、コイなどのアテロコラーゲンの熱変性温度が２５℃以上のものを原料とすることが好ましい。このような原料を用いることにより、システインプロテアーゼ処理コラーゲンの変性温度を、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上となるようにすることができ、たとえばタイに由来するコラーゲンの変性温度（２０℃程度）に比べて著しく変性温度の高いコラーゲンを得ることができる。したがって、マグロに由来するアテロコラーゲンの場合、貯蔵安定性、利用価値に優れる。さらに、マグロの場合、漁獲量の多さ、捕獲期間の均一性などから、大量に、しかも、均一な性能でシステインプロテアーゼ処理アテロコラーゲンを量的に安定に得ることが可能である。
このような本発明で用いられるアテロコラーゲンは、図１の電子顕微鏡で撮影（６００００倍）した写真に示すように、通常、アテロコラーゲン分子が寄り添って１本の線維状の会合体を形成している線維化アテロコラーゲンであり、分子間の空間がほとんどない。なお、図１中、アテロコラーゲン分子は、電子顕微鏡像の縞模様をもつ部分である。
また、前記アテロコラーゲンは、通常、多種成分からなり、その構成比も、アテロコラーゲンの原料により異なり、限定されない。
このようなアテロコラーゲンは、通常、α１成分、α２成分、β成分およびγ成分の少なくとも４種の成分を含有している。なお、三重螺旋構造の構成単位であるα１成分、α２成分はともに左巻き螺旋の１本鎖であり、その分子量が異なっており、β成分は２つのα成分が分子間で共有結合しているダイマー構造の成分であり、γ成分は３つのα成分が分子間で共有結合しているトリマー構造の成分である。アテロコラーゲン分子は、通常、これらの成分が全体として右巻きの３重螺旋構造を形成している。
α成分の分子量は、通常、好ましくは９０，０００〜１３０，０００、β成分の分子量は、通常、好ましくは１８０，０００〜２６０，０００、γ成分の分子量は、通常、２７０，０００〜３９０，０００であることが望ましい。
なお、各成分は、公知の方法、たとえば、電気泳動などにより容易に分離させることができる。
本発明で用いられるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、通常、中性ｐＨの水溶液に不溶である。
このようなコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、公知の方法により、動物または魚類から抽出可能である。たとえば、前記ほ乳類、鳥類または魚類の真皮、腱、骨、筋膜等コラーゲンが豊富に含まれる組織を、ｐＨ２〜４程度の酸性溶液に投入、溶出させ、ペプシンなどを添加して、分子末端のテロペプチド領域を除去する。その後、このアテロコラーゲンの酸性溶液に塩化ナトリウムなどの塩を加えて、アテロコラーゲンを含む沈殿物を得ることができる。
システインプロテアーゼ
本発明で用いることのできるシステインプロテアーゼは、公知のシステインプロテアーゼであって、その種類は特に限定されないが、このうち、たとえば、システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量より酸性アミノ酸量が多いもの、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるものを好ましく用いることができる。
このようなシステインプロテアーゼとしては、アクチニダイン［ＥＣ ３．４．２２．１４］、パパイン［ＥＣ ３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ ３．４．２２．３］、ブロメライン［ＥＣ ３．４．２２．３２］、カテプシンＢ［ＥＣ ３．４．２２．１］、カテプシンＬ［ＥＣ ３．４．２２．１５］、カテプシンＳ［ＥＣ ３．４．２２．２７］、カテプシンＫ［ＥＣ ３．４．２２．３８］、カテプシンＨ［ＥＣ ３．４．２２．１６］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどが挙げられる。これらのうちでは、好ましくはアクチニダイン、アロライン、ブロメライン、さらに好ましくはアクチニダインを用いることが望ましい。
アクチニダインを用いると、特にマグロ由来のアテロコラーゲンとの接触反応を有効に行うことができ、得られるシステインプロテアーゼ処理コラーゲン中に含まれる、β成分、γ成分の含有量を著しく低減、あるいは実質的にβ、γ成分を除去できる。その結果、α成分量の多い純度の高い均一なシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。また、システインプロテアーゼ処理コラーゲン分子の成分間の共有結合は欠けていると推察される。
このようなシステインプロテアーゼは、公知の方法により入手することができ、たとえば、化学的な合成、細菌や真菌、あるいは各種動植物の細胞または組織からの抽出、それらの培養細胞、これらに由来するシステインプロテアーゼの遺伝子組換体から遺伝子工学的手段により得ることができる。
システインプロテアーゼ処理コラーゲン、その製造方法
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、前記コラーゲンまたはアテロコラーゲンと前記システインプロテアーゼとを接触させて得ることができる。
システインプロテアーゼとコラーゲンまたはアテロコラーゲンとの接触は、溶媒中で行うことができる。溶媒中で接触させる場合、溶媒としては、たとえば、水などを用いることができる。溶媒の量は、コラーゲンまたはアテロコラーゲン１質量部に対して、好ましくは１〜１０００質量部の範囲で用いることが望ましい。
接触に用いるシステインプロテアーゼの量は、コラーゲンまたはアテロコラーゲン１００質量部に対して、好ましくは０．１〜１０質量部、より好ましくは０．５〜５質量部の量であることが望ましい。
システインプロテアーゼと、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとの接触条件として、ｐＨ、温度、処理時間は限定されず、通常の酵素処理と同様に行うことができ、たとえば、ｐＨは、たとえば、好ましくは２．０〜７．０、さらに好ましくは３．０〜５．０の範囲で行うことが望ましい。ｐＨを一定に保つため、緩衝液中で行うことが好ましい。ｐＨを上記範囲とすることにより、コラーゲンまたはアテロコラーゲンが均一に溶解し、酵素反応が効率よく進むという効果がある。
接触温度は、たとえば、好ましくは１５〜４０℃程度の範囲で行うことが望ましい。接触時間は、たとえば、好ましくは１時間〜５日程度の範囲で行うことが望ましい。
反応終了後、必要に応じ、ｐＨを再調整する工程、酵素を失活させる工程などを経てもよい。また、不純物を除去する精製工程などを経てもよい。この場合、タンパク質あるいはペプチドの精製、分画等のための通常の工程を経ることができ、たとえば、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの工程を経ることができる。
このようにして得られるシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくはシステインプロテアーゼ処理コラーゲン分子１つが３本のポリペプチド鎖からなる３重螺旋構造を有し、複数のシステインプロテアーゼ処理コラーゲン分子により網目状の会合体構造が形成されていることが望ましい。そして、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくは複数のシステインプロテアーゼ処理コラーゲン分子による１本の線維への線維化が阻害されており、好ましくは前記アテロコラーゲンのような線維状の会合体構造を実質的に有していない。このようなシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、ｐＨの変化にかかわらず立体的な網目構造が安定に存在する。
なお、本明細書において、網目状とは、化学結合またはファンデルワールス結合などにより分子が連なって立体的な網目をつくり、その間に隙間ができている構造をいう。
また、本明細書において、会合体とは、同種の分子が共有結合によらないで２分子以上が相互作用して結合し、１つの構造単位となっているものである。
具体的には、たとえば、図２は本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの一例を示す電子顕微鏡写真（６００００倍）であるが、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、細い糸状の分子が不規則に結合してできた立体的な網目状の会合体を示す構造物であり、ファシット（Ｆａｂｒｉｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）と呼ばれる３次元構造の線維化が阻害されるコラーゲンと類似の性質を示し、形態的には基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンとも類似している構造、つまり、空間的に隙間を多く有している。なお、コラーゲンが３重螺旋構造を有することは、公知の方法、たとえば円偏光二色スペクトルにより容易に確認することができる。
これに対し、前述のとおり、図１に示すように、原料となるアテロコラーゲンは、アテロコラーゲン分子が寄り添って１本の線維状の会合体を形成した線維化アテロコラーゲンであり、分子間の空間がほとんどない。
このため、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンでは、システインプロテアーゼ処理コラーゲンの隙間に水分子をとりこみやすいので保水効果が高く、また、赤血球や血小板などの細胞を取り込みやすいので止血効果にも優れ、また各種細胞や胚をｉｎ ｖｔｒｏで培養する材料として効果が高いという特異な性質を有する。
なお、図４に示すように、通常、細胞１と細胞２の間にコラーゲンが存在するが、この場合、細胞間の中心部に前述のアテロコラーゲンのような線維を形成するコラーゲン（Ｉ型）３が存在し、細胞間の基底膜近傍には線維会合体を形成しない３次元構造を有するＩＶ型コラーゲン４が存在している。これまで、細胞間基質などからＩ型コラーゲンの抽出法は確立されているが、本発明者らの調査によれば、ＩＶ型コラーゲンのような網目状の会合体構造を有する、線維化が阻害されたコラーゲンに関しては有効な調製法は確立されておらず、本発明は、新規なＩＶ型コラーゲン様会合体を、簡便に提供する手段としても極めて有用である。
また、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、成分として、α１成分、α２成分などα成分を含有し、β成分、γ成分を実質的に含有していない。α１成分とα２成分の構成比は原料コラーゲンにより異なり、限定されないが、たとえば、好ましくは、α１：α２＝１：１〜３：１の範囲にあることが望ましい。
このようなα１、α２成分の分子量は、通常、好ましくは９０，０００〜１３０，０００であることが望ましい。
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、好ましくは中性ｐＨの水溶液に溶解する。これは、原料のアテロコラーゲンが中性ｐＨの水溶液に不溶であることと大きく相違し、また、天然のファシットやＩＶ型コラーゲンを含む各種コラーゲンが中性ｐＨの水溶液に不溶であることとも大きく相違している。
また、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、通常、熱変性により３重螺旋構造が壊れるがゲル化しない。これは、一般にコラーゲンが熱変性してゼラチンとなり（３重螺旋構造が壊れている）、冷やすとゲル化するのと大きく相違する。また、図３のゼラチンの構造の一例を示す電子顕微鏡写真（４００００倍）に示すように、ゼラチンでは、線維構造あるいは網目状構造は崩壊している。
すなわち、天然のファシットを含むコラーゲンやＩＶ型コラーゲンと、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとは異なるコラーゲンである。
さらに、通常、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンのα１成分、α２成分は、原料となる天然のアテロコラーゲン中のα１、α２成分とは、各α成分の表面電荷が異なっている。たとえば、図６に示すように、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンのα１成分、α２成分は、通常、陽イオン交換クロマトグラフィーで、合計４つのピークを与えるが、その原料となったアテロコラーゲン中のα１、α２成分は、通常、合計６つのピークを与え、これらのピークの溶出時間は全て異なっている。このため表面電荷が異なるものと推測することができる。
また、本発明にかかるシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、アテロコラーゲンと比較し、エタノールなどのアルコールに対する溶解度が著しく向上している。このため、エタノールを添加する化粧品等への溶解性に優れ、高濃度でシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを添加することもできる。
以上のことは、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンが、原料となるコラーゲンまたはアテロコラーゲンにない性質を有し、生体物質との相互作用の起点となる機能が著しく変化したことを示すものである。
本発明に係る前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、熱により変性する温度が、好ましくは２５℃以上、さらに好ましくは２８℃以上であることが望ましい。このため、常温における取り扱いが容易である。前述のとおり、アテロコラーゲンが魚類由来のものである場合、このような変性温度のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得るために、マグロなどを原料魚類とすることが好ましい。
本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、架橋処理して、重合したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとして用いることもできる。
架橋処理は、従来公知の方法により行うことができる。たとえば、化学架橋を使用する方法、熱処理により架橋する方法、紫外線等放射線照射により架橋する方法などが挙げられる。
化学架橋で用いる架橋剤としては、たとえば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミド化合物；エピクロロヒドリン；ビスエポキシジエチレングリコールなどのジエポキシ化合物、ＮａＢＨ４などが挙げられる。架橋剤の濃度は、システインプロテアーゼ処理コラーゲンに対して、好ましくは１０−３〜１０質量％程度で、好ましくは５〜４０℃の範囲で、好ましくは３〜４８時間程度、システインプロテアーゼ処理コラーゲンと架橋剤とを接触させることにより、架橋したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。
紫外線により架橋する場合、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンに、たとえば紫外線ランプなどにより紫外線を、通常、室温で、３〜４８時間程度照射して、架橋したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。
熱架橋する場合は、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを、減圧下、好ましくは１１０〜１６０℃程度の温度で、３〜４８時間程度加熱して、架橋したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得ることができる。
このような架橋したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、耐コラゲナーゼ性、強度を向上させることができる。
なお、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、前述の通り、エタノールなどのアルコールに対する溶解度が高く、たとえば、溶解性向上のために他の化学修飾をする必要がないが、該システインプロテアーゼ処理コラーゲンの目的を阻害しない範囲で、必要に応じ、化学修飾されていてもよい。化学修飾の種類としては、たとえば、アシル化、ミリスチル化、ポリエチレングリコール修飾などが挙げられる。
このうち、たとえば、アシル化修飾であるサクシニル化したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンと無水コハク酸とを、リン酸緩衝液などの中性ｐＨの溶媒中で反応させて得ることができる。サクシニル化することにより、より中性ｐＨの溶媒に対する溶解度を向上させ、使用した際の肌触りを向上できる。
また、ポリエチレングリコール修飾したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、塩化シアヌルで活性化したポリエチレングリコールと反応させることにより得ることができる。
用途
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、食品添加剤、医療材料、化粧品材料、細胞または胚の培養材料などに好適に用いることができる。
たとえば、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、水分の取り込み性能に優れ保湿効果が高く、生体適合性に優れることから、化粧品に用いることができる。このうち、たとえば基礎化粧品などに添加して好適に用いることができる。また、炎症を起こしている皮膚に本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを含有する化粧品を塗布することにより、症状を軽減することもできる。
また、たとえば、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、赤血球や血小板の取り込み性能が高いので、止血効果が高く、生体適合性に優れることから、医療材料としても好適に用いることができる。
さらに、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、生体適合性に優れ、食用として問題なく、食品添加剤としても好適に用いることができる。
加えて、本発明のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、細胞外マトリックスとして各種の細胞、組織あるいは胚の培養に優れた効果が期待され、また安全に用いることができ、細胞培養安定化剤として好適である。
なお、ここで「細胞」とは、外界を隔離する膜構造に囲まれ、内部に自己再生能を備えた遺伝情報とその発現機構を持つ生命体であり、多細胞生物では組織の構成単位であり、「組織」とは、特定の方向に分化し同一の機能、形態を有する細胞集団を意味し、「胚」とは、多細胞生物の個体発生初期のものを意味している。The cysteine protease-treated collagen (hereinafter sometimes referred to as “CP-collagen”) according to the present invention can be obtained by contacting collagen or atelocollagen with cysteine protease.
Hereinafter, collagen, atelocollagen, cysteine protease, cysteine protease-treated collagen used in the present invention, and a method for producing the same will be described in detail.
Collagen or atelocollagen Collagen used in the present invention includes, for example, mammals such as cows, pigs and rabbits, birds such as chickens, animal dermis, tendons, bones, fascia, and fish such as sharks, carp and tuna Collagen derived from skin, scales and the like.
The atelocollagen used in the present invention includes, for example, mammals such as cows, pigs and rabbits, birds such as chickens, animal dermis, tendons, bones, fascia, and fish such as sharks, carp and tuna. Examples include atelocollagen obtained by using a tissue rich in collagen such as skin and scales as a raw material and removing the telopeptide region at the amino terminal and carboxyl terminal of the molecule with pepsin or the like.
Among these, collagen derived from fish or atelocollagen can be preferably used. Of collagen and atelocollagen, atelocollagen can be preferably used.
By using collagen or atelocollagen derived from fish, raw materials can be obtained simply, safely and in large quantities, and cysteine protease-treated collagen that is safer for humans can be obtained.
Specific examples of fish include tuna such as yellowfin tuna, carp, and eel. Among these, tuna can be used more preferably.
Among such atelocollagens, those having a heat denaturation temperature of preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C. or higher are desirable.
For this reason, among fish, it is preferable to use a tuna such as yellowfin tuna and an atelocollagen such as carp having a heat denaturation temperature of 25 ° C. or higher. By using such a raw material, the denaturation temperature of the cysteine protease-treated collagen can be preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C. or higher. For example, the denaturation temperature of collagen derived from Thailand (20 Collagen having a remarkably high denaturation temperature can be obtained. Therefore, in the case of atelocollagen derived from tuna, it is excellent in storage stability and utility value. Furthermore, in the case of tuna, it is possible to stably obtain cysteine protease-treated atelocollagen in a large quantity and with uniform performance due to the large catch and uniformity of the capture period.
Such atelocollagen used in the present invention is usually a fiber in which atelocollagen molecules lie close together to form a single fibrous aggregate, as shown in a photograph taken with an electron microscope (60000 times) in FIG. Atelocollagen with little intermolecular space. In FIG. 1, the atelocollagen molecule is a portion having a stripe pattern of an electron microscope image.
In addition, the atelocollagen is usually composed of various components, and the composition ratio varies depending on the raw material of atelocollagen and is not limited.
Such atelocollagen usually contains at least four kinds of components, α1 component, α2 component, β component and γ component. Note that the α1 component and α2 component, which are structural units of the triple helix structure, are both single-stranded left-handed spirals, have different molecular weights, and the β component is a dimer in which two α components are covalently bonded between molecules. The γ component is a trimeric component in which three α components are covalently bonded between molecules. Atelocollagen molecules usually form a right-handed triple helix structure as a whole.
The molecular weight of the α component is usually preferably 90,000 to 130,000, the molecular weight of the β component is usually preferably 180,000 to 260,000, and the molecular weight of the γ component is usually 270,000 to 390, 000 is desirable.
Each component can be easily separated by a known method such as electrophoresis.
Collagen or atelocollagen used in the present invention is usually insoluble in an aqueous solution having a neutral pH.
Such collagen or atelocollagen can be extracted from animals or fish by known methods. For example, a tissue rich in collagen, such as the dermis, tendon, bone, fascia, etc. of mammals, birds or fish, is poured into an acidic solution having a pH of about 2 to 4, eluted, added with pepsin, etc. Remove the telopeptide region. Thereafter, a salt such as sodium chloride can be added to the acidic solution of atelocollagen to obtain a precipitate containing atelocollagen.
Cysteine protease The cysteine protease that can be used in the present invention is a known cysteine protease, and the type thereof is not particularly limited. For example, as cysteine protease, the amount of acidic amino acid is larger than the amount of basic amino acid. Those active in the hydrogen ion concentration in the acidic region can be preferably used.
Such cysteine proteases include actinidin [EC 3.4.22.14], papain [EC 3.4.22.2], ficin [EC 3.4.22.3], bromelain [EC 3.4. .22.32], cathepsin B [EC 3.4.22.1], cathepsin L [EC 3.4.22.15], cathepsin S [EC 3.4.22.27], cathepsin K [
When actinidine is used, a contact reaction with telo-derived atelocollagen can be effectively performed, and the content of β component and γ component contained in the resulting cysteine protease-treated collagen is significantly reduced, or substantially β , Γ component can be removed. As a result, a highly pure and uniform cysteine protease-treated collagen with a large amount of α component can be obtained. Moreover, it is speculated that the covalent bond between the components of the cysteine protease-treated collagen molecule is lacking.
Such cysteine proteases can be obtained by known methods, such as chemical synthesis, extraction from bacteria or fungi, or various animal or plant cells or tissues, cultured cells thereof, and cysteine proteases derived therefrom. Can be obtained by genetic engineering means.
Cysteine Protease Treated Collagen and Method for Producing the Same The cysteine protease treated collagen according to the present invention can be obtained by bringing the collagen or atelocollagen into contact with the cysteine protease.
Contact of cysteine protease with collagen or atelocollagen can be carried out in a solvent. When contacting in a solvent, water can be used as the solvent, for example. The amount of the solvent is preferably 1 to 1000 parts by mass with respect to 1 part by mass of collagen or atelocollagen.
The amount of cysteine protease used for the contact is preferably 0.1 to 10 parts by mass, more preferably 0.5 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of collagen or atelocollagen.
The contact conditions between cysteine protease and collagen or atelocollagen are not limited to pH, temperature, and treatment time, and can be performed in the same manner as normal enzyme treatment. For example, the pH is preferably 2.0 to 7, for example. 0.0, and more preferably in the range of 3.0 to 5.0. In order to keep pH constant, it is preferable to carry out in a buffer solution. By setting the pH in the above range, there is an effect that collagen or atelocollagen is uniformly dissolved and the enzymatic reaction proceeds efficiently.
The contact temperature is preferably in the range of preferably about 15 to 40 ° C., for example. The contact time is, for example, preferably in the range of about 1 hour to 5 days.
After completion of the reaction, a step of readjusting the pH, a step of inactivating the enzyme, etc. may be performed as necessary. Moreover, you may pass through the refinement | purification process etc. which remove an impurity. In this case, normal steps for protein or peptide purification, fractionation, etc. can be performed, such as dialysis, gel filtration chromatography, isoelectric precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, etc. The process can be performed.
The cysteine protease-treated collagen thus obtained preferably has a triple helical structure in which one cysteine protease-treated collagen molecule is composed of three polypeptide chains, and is formed into a network-like aggregate by a plurality of cysteine protease-treated collagen molecules. It is desirable that a structure be formed. The cysteine protease-treated collagen of the present invention preferably inhibits fibrosis into a single fiber by a plurality of cysteine protease-treated collagen molecules, and preferably has a fibrous aggregate structure such as atelocollagen. Does not have. Such cysteine protease-treated collagen has a stable three-dimensional network structure regardless of changes in pH.
Note that in this specification, the term “network-like” refers to a structure in which molecules are connected by chemical bonds or van der Waals bonds to form a three-dimensional network and a gap is formed between them.
In this specification, an aggregate is a unit in which two or more molecules of the same kind are interacted and bonded without being based on a covalent bond.
Specifically, for example, FIG. 2 is an electron micrograph (60000 times) showing an example of the cysteine protease-treated collagen of the present invention. In the cysteine protease-treated collagen of the present invention, thin filamentous molecules are irregularly bound. Is a structure showing a three-dimensional network-like aggregate, which is similar to a collagen that inhibits fibrosis of a three-dimensional structure called facilitated collagens interrupted triple helix, and has a morphology Specifically, it has a structure similar to that of type IV collagen existing in the basement membrane, that is, it has many gaps in space. In addition, it can be easily confirmed that collagen has a triple helical structure by a known method, for example, a circular dichroic spectrum.
On the other hand, as shown in FIG. 1, atelocollagen as a raw material is a fibrotic atelocollagen in which atelocollagen molecules nestle to form a single fibrous aggregate as described above, and there is almost no intermolecular space. .
For this reason, the cysteine protease-treated collagen according to the present invention has a high water retention effect because it easily incorporates water molecules into the gaps between the cysteine protease-treated collagen, and also has an excellent hemostatic effect because it easily takes up cells such as red blood cells and platelets. It has a unique property that it is highly effective as a material for culturing various cells and embryos in vitro.
As shown in FIG. 4, collagen is usually present between
Further, the cysteine protease-treated collagen according to the present invention contains α components such as α1 component and α2 component as components, and substantially does not contain β component and γ component. The composition ratio of the α1 component and the α2 component varies depending on the raw collagen, and is not limited. For example, it is preferable that α1: α2 = 1: 1 to 3: 1.
The molecular weight of such α1 and α2 components is usually preferably 90,000 to 130,000.
The cysteine protease-treated collagen according to the present invention is preferably dissolved in an aqueous solution having a neutral pH. This is very different from the fact that the raw material atelocollagen is insoluble in an aqueous solution at neutral pH, and it is also very different from the fact that various collagens including natural facit and type IV collagen are insoluble in an aqueous solution at neutral pH. ing.
In addition, the cysteine protease-treated collagen according to the present invention is not gelled, although the triple helical structure is usually broken by heat denaturation. This is largely different from the fact that collagen is generally heat-denatured to become gelatin (the triple helical structure is broken) and gelates when cooled. Further, as shown in an electron micrograph (40000 times magnification) showing an example of the structure of gelatin in FIG. 3, the fiber structure or the network structure is broken in gelatin.
That is, it is a collagen different from collagen containing natural facilit or collagen type IV and cysteine protease-treated collagen according to the present invention.
Furthermore, the α1 component and α2 component of the cysteine protease-treated collagen according to the present invention usually have a different surface charge from the α1 and α2 components in the natural atelocollagen used as a raw material. For example, as shown in FIG. 6, the α1 component and α2 component of the cysteine protease-treated collagen according to the present invention usually give a total of four peaks by cation exchange chromatography. The α1 and α2 components usually give a total of six peaks, and the elution times of these peaks are all different. For this reason, it can be estimated that the surface charges are different.
Further, the cysteine protease-treated collagen according to the present invention has significantly improved solubility in alcohols such as ethanol as compared to atelocollagen. For this reason, it is excellent in solubility in cosmetics to which ethanol is added, and cysteine protease-treated collagen can be added at a high concentration.
The above indicates that the cysteine protease-treated collagen of the present invention has properties not found in the collagen or atelocollagen used as a raw material, and the function that is the starting point of the interaction with the biological substance has changed significantly.
In the cysteine protease-treated collagen according to the present invention, the temperature for denaturation by heat is preferably 25 ° C. or higher, more preferably 28 ° C. or higher. For this reason, handling at room temperature is easy. As described above, when atelocollagen is derived from fish, it is preferable to use tuna or the like as raw fish in order to obtain cysteine protease-treated collagen at such a denaturing temperature.
The cysteine protease-treated collagen of the present invention can also be used as a polymerized cysteine protease-treated collagen after crosslinking.
The crosslinking treatment can be performed by a conventionally known method. Examples thereof include a method using chemical crosslinking, a method of crosslinking by heat treatment, and a method of crosslinking by irradiation with radiation such as ultraviolet rays.
Examples of the crosslinking agent used in the chemical crosslinking include water-soluble carbodiimide compounds such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride; epichlorohydrin; diepoxy compounds such as bisepoxydiethylene glycol; NaBH 4 and the like. Is mentioned. The concentration of the cross-linking agent is preferably about 10 −3 to 10% by mass, preferably in the range of 5 to 40 ° C., preferably about 3 to 48 hours, with respect to the cysteine protease-treated collagen. By contacting with an agent, crosslinked cysteine protease-treated collagen can be obtained.
In the case of crosslinking with ultraviolet rays, the crosslinked cysteine protease-treated collagen can be obtained by irradiating the cysteine protease-treated collagen according to the present invention with ultraviolet rays, for example, at room temperature for about 3 to 48 hours.
In the case of thermal crosslinking, the crosslinked cysteine protease-treated collagen can be obtained by heating the cysteine protease-treated collagen according to the present invention under reduced pressure, preferably at a temperature of about 110 to 160 ° C. for about 3 to 48 hours. .
Such cross-linked cysteine protease-treated collagen can improve collagenase resistance and strength.
As described above, the cysteine protease-treated collagen according to the present invention has a high solubility in alcohols such as ethanol. For example, there is no need to perform other chemical modifications to improve the solubility of the cysteine protease-treated collagen. It may be chemically modified as necessary within the range not impairing the purpose. Examples of the chemical modification include acylation, myristylation, and polyethylene glycol modification.
Among these, for example, succinylated cysteine protease-treated collagen that is an acylation modification is obtained by reacting the cysteine protease-treated collagen of the present invention with succinic anhydride in a neutral pH solvent such as a phosphate buffer. be able to. By succinylation, the solubility with respect to the solvent of more neutral pH can be improved, and the touch when used can be improved.
Polyethylene glycol-modified cysteine protease-treated collagen can be obtained by reacting with polyethylene glycol activated with cyanuric chloride.
Applications The cysteine protease-treated collagen according to the present invention can be suitably used for food additives, medical materials, cosmetic materials, cell or embryo culture materials, and the like.
For example, the cysteine protease-treated collagen of the present invention can be used in cosmetics because it has excellent moisture uptake performance, a high moisturizing effect, and excellent biocompatibility. Among these, it can be suitably used by adding to basic cosmetics, for example. In addition, the symptoms can be alleviated by applying a cosmetic containing the cysteine protease-treated collagen of the present invention to inflamed skin.
In addition, for example, the cysteine protease-treated collagen of the present invention can be suitably used as a medical material because it has a high uptake ability of red blood cells and platelets, has a high hemostatic effect, and is excellent in biocompatibility.
Furthermore, the cysteine protease-treated collagen of the present invention is excellent in biocompatibility, has no problem for food, and can be suitably used as a food additive.
In addition, the cysteine protease-treated collagen of the present invention is expected to have an excellent effect in culturing various cells, tissues or embryos as an extracellular matrix, can be used safely, and is suitable as a cell culture stabilizer. .
The term “cell” as used herein refers to a life form surrounded by a membrane structure that isolates the outside world and having genetic information with self-regenerative ability and its expression mechanism. In multicellular organisms, it is a structural unit of tissue. In addition, “tissue” means a cell population differentiated in a specific direction and having the same function and form, and “embryo” means an early stage of multicellular organism ontogeny.
本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、網目状構造を有し、線維化が阻害されており、水分子あるいは赤血球等の取り込み能力に優れ、生体適合性に優れる。また、保湿効果、止血力、細胞保持力に優れる。 The cysteine protease-treated collagen according to the present invention has a network structure, fibrosis is inhibited, has an excellent ability to take up water molecules or erythrocytes, and is excellent in biocompatibility. Moreover, it is excellent in a moisturizing effect, hemostatic power, and cell retention power.
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例により何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not restrict | limited at all by these Examples.
キハダマグロ皮部からのアテロコラーゲンの抽出
５００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）１１００ｍＬの入ったワーリングブレンダーに、キハダマグロ皮部５３４ｇを投入し粉砕した。４℃で３日間撹拌後、１００００×ｇで３０分間遠心し、１次上澄みを得た。沈殿部分に５００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）６００ｍＬを加え、３時間撹拌後、１００００×ｇで３０分間遠心し、２次上澄みを得た。
１次および２次上澄みを集め、ブタ・ペプシン（シグマ社製）を最終濃度１００Ｕ／ｍＬになるように添加して、４℃で３日間撹拌した。
これに、塩化ナトリウムを２．５ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えて溶解させ、さらに、４℃で１６時間放置した後、１００００×ｇで３０分間遠心して沈殿物を集めた。
集めた沈殿物に、２０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を、沈殿が溶解する量を加えた。得られたアテロコラーゲン量は、１３９ｇ（収率２６％）であった。 Extraction of Atelocollagen from Yellowfin Tuna Skin Part 534 g of yellowfin tuna skin part was put into a Waring blender containing 1100 mL of 500 mmol / L citrate buffer (pH 2.5) and pulverized. After stirring at 4 ° C. for 3 days, the mixture was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain a primary supernatant. 600 mL of 500 mmol / L citrate buffer (pH 2.5) was added to the precipitate, and the mixture was stirred for 3 hours and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain a secondary supernatant.
The primary and secondary supernatants were collected, porcine pepsin (manufactured by Sigma) was added to a final concentration of 100 U / mL, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 3 days.
Sodium chloride was added to this so as to have a concentration of 2.5 mol / L and dissolved, and the mixture was further allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours, and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to collect a precipitate.
To the collected precipitate, 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0) was added in such an amount that the precipitate dissolved. The amount of atelocollagen obtained was 139 g (yield 26%).
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの製造
調製例１で得たアテロコラーゲンを４℃で１００倍容量の２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で、３回透析した。透析後、アテロコラーゲンに対して、１．０重量％となるようにシステインプロテアーゼ（アクチニダイン）を添加した。温度を２０℃にして３日間撹拌し、粗精製物を得た。
得られた粗精製物を、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。詳しくは、粗精製物を２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）（以下「Ａ液」という。）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（商品名：東ソー株式会社製）に注入し、Ａ液を３００ｍＬ流してゲルに吸着しない成分を洗浄した。次に、１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）（以下「Ｂ液」という。）を３００ｍＬ流入し、システインプロテアーゼ処理コラーゲン（「ＣＰコラーゲン）ということがある。）を分画した。画分を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、分子量約１０万の成分のみからなることが確認できた（図５）。得られた精製システインプロテアーゼ処理コラーゲン６３ｇを、蒸留水で３回透析した後、凍結乾燥した。収率１１．８％。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの陽イオンクロマトグラフィー分析
調製例１で調製したアテロコラーゲンから分画したα１、α２成分と、前記精製したシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ陽イオンクロマトグラフィーで測定した。図６に示すように、アテロコラーゲンに含まれるα１成分、α２成分は、陽イオンクロマトグラフィー等により通常６つのピークを与えるが、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは通常４つのピークを与えるのみであり、また、アテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンのα成分は、すべて溶出時間が異なっていた。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの電子顕微鏡撮影
アテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ別々に５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、常法に従いセルディスクにグルタルアルデヒドを用いて固定化した。固定化したアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとを、電子顕微鏡（Ｓ−９００，１０ｋＶ、株式会社日立製作所製）で倍率６万倍で撮影した（図１，２）。
その結果、アテロコラーゲン（図１）では、３重螺旋構造が規則的に配列した典型的な線維状の会合体構造を形成していたのに対し、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲン（図２）は、不規則で網目状の隙間の多い会合体構造となっていることが確認できた。
この会合体構造の違いは、システインプロテアーゼ処理コラーゲンのポリペプチド主鎖末端構造が、アテロコラーゲンのそれとは異なるためであると推測される。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの風乾処理試験
アテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとを、それぞれ別々に５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、スライドガラス上に１０μＬ滴下し、４℃下で１６時間放置して乾燥させた。乾燥したそれぞれの試料を、光学生物顕微鏡（株式会社島津製作所製）で分析した。その結果、システインプロテアーゼ処理コラーゲン（図７）は、アテロコラーゲン（図８）よりも緻密な紋様を示すことが確認できた。また、それぞれの粘ちょう性を、表面張力（液滴重量法）によって分析したところ、システインプロテアーゼ処理コラーゲンが、アテロコラーゲンより粘ちょう性が高いことが確認された。
この結果、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、アテロコラーゲンと比較して、ヒト肌表面への浸透と保護に有効であることが確認された。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの止血性能評価
１０週令のオスＷｉｓｔａｒラットをエーテルで導入麻酔し、抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、脾臓の先端を一部削除および１８Ｇの注射針で穿針をして出血させた。出血部位にシステインプロテアーゼ処理コラーゲン、アテロコラーゲンをそれぞれ置き、止血させた。それぞれの試験群における止血に要した平均時間は、アテロコラーゲンで８６秒、システインプロテアーゼ処理コラーゲンで３９秒、コラーゲン止血剤（市販品）で９１秒であった。
コントロールは無処置とした。止血までの時間（秒）を測定した結果を表１に示す。この結果、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、アテロコラーゲンや市販品コラーゲン止血剤の半分以下の時間（秒）で有意に止血できることが示され、著しい止血性能の向上が確認された。
皮下埋入試験
１０週令のオスＷｉｓｔａｒラットをエーテルで導入麻酔し、抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、背部に皮膚切開を入れ、皮下に２０ｍｇのシステインプロテアーゼ処理コラーゲン、アテロコラーゲンをそれぞれ一塊にして埋入した。４週間後の埋入した部位を切開したところ、システインプロテアーゼ処理コラーゲン、アテロコラーゲンは吸収され、肉眼では確認できなかった。また、組織の炎症や癒着などの異物反応は肉眼では確認できなかった。
調製例１で製造したアテロコラーゲンと、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンとの、中性ｐＨにおける超分子構造の形態学的特徴を下記の通り評価した。
走査型電子顕微鏡観察のために中性ｐＨに緩衝能を有する溶液を用意した。
溶液条件：５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
走査型電子顕微鏡撮影のため、各１．０ｍｇ／ｍＬのシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとアテロコラーゲンを上記溶液にてそれぞれ透析した。２４ウエルプレートの各ウエルにセルディスクを入れ、そのウエルに透析後の各試料溶液を加えて、４℃にて一晩放置後、グルタルアルデヒドでコラーゲン自己会合物をセルディスクに固定化した。
それぞれのコラーゲン透析試料を走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ−９００）にて６万倍にて撮影した。各透析溶液のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンとアテロコラーゲン自己会合物の異なるｐＨの緩衝液で処理した写真を図９、１０に示す。
図１、図２、図９、図１０の電子顕微鏡写真から、アテロコラーゲン自己会合物はｐＨ（４．０〜７．４）が異なっても線維構造を形成することが確認された。システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、このｐＨ範囲において線維構造を形成せず立体的な網目構造を形成することが確認された。
コラーゲン自己会合物の超分子構造の違いは、システインプロテアーゼ処理コラーゲンとアテロコラーゲン分子の自己会合に関係するアミノ酸配列などが影響していると推定される。なぜなら、システインプロテアーゼ処理コラーゲンはシステインプロテアーゼにより限定加水分解を受けているからである。
これらの結果から、システインプロテアーゼ処理コラーゲンはｐＨ４．０〜７．４の範囲内で立体的な網目構造を保持し、また、アテロコラーゲンと異なる超分子構造体であることが確認された。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンのエタノールに対する溶解度
調製例１で製造したアテロコラーゲンと、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンとのエタノールに対する溶解度を評価した。
これらコラーゲンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、１．０％のシステインプロテアーゼ処理コラーゲン溶液とアテロコラーゲン溶液を調製した。
各システインプロテアーゼ処理コラーゲン溶液とアテロコラーゲン溶液に、エタノールを最終濃度が０、１０、１５、２０、４０、６０、８０％（Ｖ／Ｖ）になるように加えて混和した。４℃で１時間放置後、１０、０００×ｇで３０分間遠心して上清を分離した。上清に含まれるコラーゲン濃度を２１０ｎｍの吸光度を測定して求めた。
０％エタノール濃度でのシステインプロテアーゼ処理コラーゲン上清溶液とアテロコラーゲン上清溶液の２１０ｎｍの吸光度を１００％として、各エタノール濃度での吸光度の相対比（％）を計算した。すなわち、ここでは、相対比は溶解度に正比例するものとして表される。図１１にその結果を示す。
図１１から明らかなように、アテロコラーゲン溶液は１５％エタノール濃度での相対比は５５％であるが、同エタノール濃度でのシステインプロテアーゼ処理コラーゲンの相対比は１００％であり、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは０％と１５％エタノール濃度での溶解度が変わらないことが確認できた。さらに、２０％エタノール濃度での相対比は、アテロコラーゲンで僅か６％であるがシステインプロテアーゼ処理コラーゲンでは８０％であった。溶解度５０％を与えるエタノール濃度は、アテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンで約１０％の差が示された。
これらの結果から、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、アテロコラーゲンに比して、エタノールに対する溶解度がきわめて高いことが確認された。この結果は、システインプロテアーゼ処理コラーゲンがアテロコラーゲンとは異なる表面構造をもつことが原因であると考えられる。
また、エタノールに対する溶解度が高いことは、下記のような優位性を有する。すなわち、たとえば、化粧品では、エタノールを添加する場合が多く、エタノールに対する溶解度が高ければ、それだけ高濃度でシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを添加できる。したがって、システインプロテアーゼ処理コラーゲンを添加する効果をより高めることができる。
また、本発明に係るシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、このように特殊な化学修飾をしていなくても、エタノールに対する溶解性が高く、化学修飾による性質劣化の心配がない。なお、たとえば、システインプロテアーゼ処理コラーゲンをアシル化修飾してエタノールに対する溶解度を高めることも可能であり、この場合、濃度がより高まるため、肌触りがより滑らかとなり、粉っぽい感じが少なくなり、化粧品としてより有効なものとなると推定される。
さらに、化粧品、医療用材料等において、水に難溶な他の化合物を溶解させる場合、溶剤としてエタノール含量の比率が高くなるが、その場合でも、十分量のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを共存させることが可能である。
そして、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは溶解度が高いため、高濃度のエタノール水溶液中でも均一に分散させて試料を調製することが可能となる。よって、多様な分野で利用することが可能である。さらに、エタノール中にシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを添加して溶媒を蒸発させることにより、均一に分散した固形物を得ることができる。これは、多層フィルムの形成等に利用可能である。
システインプロテアーゼ処理コラーゲンの水分蒸発量
調製例１で製造したアテロコラーゲンと、前記システインプロテアーゼ処理コラーゲンとの水分蒸発量を評価した。
まず、下記の３つの溶液を調製した。
コントロール：２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、
アテロコラーゲン：２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した０．５％アテロコラーゲン溶液、
システインプロテアーゼ処理コラーゲン：２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解した０．５％ＣＰ−コラーゲン溶液
各溶液につき、ウエル直径１６ｍｍ（２．０ｍｍ２）の２４ウエル・プラスチックプレート（ＩＣＮ社製、Ｌｉｂｒｏ）を１枚づつ用意し、その重量（風袋）を測定した。それぞれのプラスチックプレートの各ウエルに、同じ溶液を２００μＬ加えてその重量を電子天秤で測定した。具体的には風袋重量との差から、それぞれのプレートに加えた溶液の重量（ｍｇ）を計算して求めた。
各プレートを２２℃、湿度５０％〜６０％の保温庫に入れて、そのまま１１時間、１３時間、１４時間、１８時間、２２時間、３０時間、３７時間静置した。
各時間毎に各プレートの重量を電子天秤にて測定して、風袋重量とタンパク質濃度の補正を行い水分蒸発量を求めた。具体的には、０時間に加えたアテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲン（ＣＰコラーゲン）の溶液重量から、タンパク質重量（０．５ｍｇ／ｍＬ）を差し引き、それぞれの水量Ｗ（０）とした。アテロコラーゲンとシステインプロテアーゼ処理コラーゲンのＷ（０）がコントロールのＷ（０）と等しくなるように係数を求め、それぞれの補正係数で各時間のＷ（ｔ）を補正しＷ‘（ｔ）を算出した。次に、各時間の溶液重量Ｗ’（ｔ）からＷ（０）を引き算してｄＷ‘（ｔ）を計算した。３７時間放置後のコントロールの重量変化ｄＷ（３７）を１００％として、各時間の溶液の重量変化ｄＷ’（ｔ）の相対比（％）（＝ｄＷ’（ｔ）×１００÷ｄＷ（３７）を計算して、放置時間（時間）と水分蒸発相対比（％）の推移を評価した。つまり、コントロールの３７時間後の蒸発量を１００として、すべてをその相対値として表した。
その結果を表２に示す。
表２から明らかなように、アテロコラーゲンはコントロールに対して、水分蒸発の抑制効果は１３時間後の６％から徐々に低下し、１８時間以降はコントロールとほとんど差がないことが示された。つまり、時間経過に伴い、水分蒸発抑制効果は失われる結果であった。一方、システインプロテアーゼ処理コラーゲンは、１３時間後のコントロールに対して１０％も水分蒸発量が抑制されていることが示された。さらに驚くべきことに、この著しい水分蒸発抑制効果は２２時間経過後でも１０．５％であり、水分蒸発抑制効果は長時間持続することが初めて確認された。この実験結果より、システインプロテアーゼ処理コラーゲンの水分保持力は、アテロコラーゲンのそれと大きく異なることが明確となった。
＜前記「１３時間の６％」の算出法＞
表の数値を１３時間で比べて、コントロールは３７．４％，アテロコラーゲンは３５．３％，システインプロテアーゼ処理コラーゲンは３３．６％である。前記６％とは、蒸発量変化の差である２．１（＝３７．４−３５．３）を分子とし、３７．４を分母とした場合の割合を示している。
The obtained crude product was purified by cation exchange chromatography. Specifically, the crude product was injected into a TSKgel SP-Toyopearl 650M column (trade name: manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 20 mmol / L citrate buffer (pH 3.5) (hereinafter referred to as “A solution”). Then, 300 mL of liquid A was flowed to wash away components that were not adsorbed on the gel. Next, 300 mL of 20 mmol / L citrate buffer solution (pH 3.5) (hereinafter referred to as “B solution”) containing 1.5 mol / L sodium chloride is flowed in, which is referred to as cysteine protease-treated collagen (“CP collagen”). When the fraction was analyzed by 7.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was confirmed that it consisted only of components having a molecular weight of about 100,000 (FIG. 5). 63 g of cysteine protease-treated collagen was dialyzed three times with distilled water and then lyophilized, yield 11.8%.
Cation Chromatography Analysis of Cysteine Protease-treated Collagen α1 and α2 components fractionated from atelocollagen prepared in Preparation Example 1 and the purified cysteine protease-treated collagen were each measured by cation chromatography. As shown in FIG. 6, α1 component and α2 component contained in atelocollagen usually give six peaks by cation chromatography or the like, but cysteine protease-treated collagen according to the present invention usually gives only four peaks. In addition, the alpha components of atelocollagen and cysteine protease-treated collagen all had different elution times.
Electron micrograph of cysteine protease-treated collagen Atelocollagen and cysteine protease-treated collagen were separately dissolved in 50 mmol / L acetate buffer (pH 4.0) and immobilized on cell discs using glutaraldehyde according to a conventional method. The immobilized atelocollagen and cysteine protease-treated collagen were photographed with an electron microscope (S-900, 10 kV, manufactured by Hitachi, Ltd.) at a magnification of 60,000 (FIGS. 1 and 2).
As a result, atelocollagen (FIG. 1) formed a typical fibrous aggregate structure in which triple helical structures were regularly arranged, whereas cysteine protease-treated collagen according to the present invention (FIG. 2). It was confirmed that the structure was an irregular and reticulated aggregate structure.
This difference in aggregate structure is presumed to be due to the fact that the polypeptide main chain terminal structure of cysteine protease-treated collagen is different from that of atelocollagen.
Air- drying treatment test of cysteine protease-treated collagen Atelocollagen and cysteine protease-treated collagen were separately dissolved in 50 mmol / L acetate buffer (pH 4.0), dropped 10 μL onto a slide glass, and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. And dried. Each dried sample was analyzed with an optical biological microscope (manufactured by Shimadzu Corporation). As a result, it was confirmed that cysteine protease-treated collagen (FIG. 7) showed a finer pattern than atelocollagen (FIG. 8). Moreover, when each viscosity was analyzed by surface tension (droplet weight method), it was confirmed that cysteine protease-treated collagen has higher viscosity than atelocollagen.
As a result, it was confirmed that cysteine protease-treated collagen is more effective in penetrating and protecting the human skin surface than atelocollagen.
Evaluation of hemostatic performance of cysteine protease-treated collagen 10-week-old male Wistar rats were anesthetized with ether, anesthetized by intraperitoneal administration of chloral hydrate, and the tip of the spleen was partially removed and the needle was punctured with an 18G needle And bleed. Cysteine protease-treated collagen and atelocollagen were placed on the bleeding site to stop bleeding. The average time required for hemostasis in each test group was 86 seconds for atelocollagen, 39 seconds for collagen treated with cysteine protease, and 91 seconds for collagen hemostatic agent (commercially available product).
The control was untreated. Table 1 shows the results of measuring the time (seconds) until hemostasis. As a result, it was shown that cysteine protease-treated collagen can significantly stop hemostasis in less than half the time (seconds) of atelocollagen or commercially available collagen hemostatic agent, confirming a marked improvement in hemostatic performance.
Subcutaneous implantation test Male Wistar rats aged 10 weeks were anesthetized with ether, anesthetized by intraperitoneal administration of chloral hydrate, a skin incision was made in the back, and 20 mg of cysteine protease-treated collagen and atelocollagen were submerged subcutaneously. Buried. When the embedded site was cut open 4 weeks later, cysteine protease-treated collagen and atelocollagen were absorbed and could not be confirmed with the naked eye. Furthermore, foreign body reactions such as tissue inflammation and adhesion could not be confirmed with the naked eye.
A solution having a buffer capacity at a neutral pH was prepared for observation with a scanning electron microscope.
Solution conditions: 50 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4)
For scanning electron microscope photography, 1.0 mg / mL cysteine protease-treated collagen and atelocollagen were each dialyzed with the above solution. Cell discs were placed in each well of a 24-well plate, and each sample solution after dialysis was added to the wells. After standing overnight at 4 ° C., collagen self-associates were immobilized on the cell discs with glutaraldehyde.
Each collagen dialysis sample was photographed at 60,000 times with a scanning electron microscope (Hitachi S-900). FIGS. 9 and 10 show photographs of dialysis solutions treated with different pH buffer solutions of cysteine protease-treated collagen and atelocollagen self-associates.
From the electron micrographs of FIGS. 1, 2, 9, and 10, it was confirmed that the atelocollagen self-associate forms a fiber structure even when the pH (4.0 to 7.4) is different. Cysteine protease-treated collagen was confirmed to form a three-dimensional network structure without forming a fiber structure in this pH range.
It is presumed that the difference in supramolecular structure of collagen self-association is influenced by amino acid sequences related to self-association between cysteine protease-treated collagen and atelocollagen molecules. This is because cysteine protease-treated collagen has undergone limited hydrolysis by cysteine protease.
From these results, it was confirmed that cysteine protease-treated collagen retains a three-dimensional network structure within a pH range of 4.0 to 7.4, and is a supramolecular structure different from atelocollagen.
Solubility of cysteine protease-treated collagen in ethanol The solubility of ethanol in atelocollagen produced in Preparation Example 1 and the cysteine protease-treated collagen was evaluated.
These collagens were dissolved in 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0) to prepare 1.0% cysteine protease-treated collagen solution and atelocollagen solution.
Ethanol was added to each cysteine protease-treated collagen solution and atelocollagen solution to a final concentration of 0, 10, 15, 20, 40, 60, 80% (V / V) and mixed. After standing at 4 ° C. for 1 hour, the supernatant was separated by centrifugation at 10,000 × g for 30 minutes. The collagen concentration contained in the supernatant was determined by measuring the absorbance at 210 nm.
The relative ratio (%) of the absorbance at each ethanol concentration was calculated with the absorbance at 210 nm of the cysteine protease-treated collagen supernatant solution and the atelocollagen supernatant solution at 0% ethanol concentration as 100%. That is, here, the relative ratio is expressed as being directly proportional to the solubility. FIG. 11 shows the result.
As is clear from FIG. 11, the relative ratio of the atelocollagen solution at 15% ethanol concentration is 55%, but the relative ratio of cysteine protease-treated collagen at the same ethanol concentration is 100%, and the cysteine protease-treated collagen is 0. % And 15% ethanol concentrations were confirmed to be unchanged. Furthermore, the relative ratio at 20% ethanol concentration was only 6% for atelocollagen but 80% for cysteine protease treated collagen. The ethanol concentration giving 50% solubility showed about 10% difference between atelocollagen and cysteine protease treated collagen.
From these results, it was confirmed that cysteine protease-treated collagen has extremely high solubility in ethanol as compared to atelocollagen. This result is considered to be caused by the fact that cysteine protease-treated collagen has a surface structure different from that of atelocollagen.
In addition, the high solubility in ethanol has the following advantages. That is, for example, in cosmetics, ethanol is often added. If the solubility in ethanol is high, cysteine protease-treated collagen can be added at a higher concentration. Therefore, the effect of adding cysteine protease-treated collagen can be further enhanced.
Moreover, even if the cysteine protease-treated collagen according to the present invention is not specially modified in this way, it has high solubility in ethanol, and there is no fear of property deterioration due to chemical modification. In addition, for example, cysteine protease-treated collagen can be acylated to increase the solubility in ethanol. In this case, since the concentration is increased, the touch becomes smoother, the powdery feeling is reduced, and the cosmetics are used. It is estimated to be more effective.
Furthermore, in the case of dissolving other compounds that are hardly soluble in water in cosmetics, medical materials, etc., the ratio of ethanol content as a solvent increases, but even in that case, a sufficient amount of cysteine protease-treated collagen can coexist. Is possible.
Since cysteine protease-treated collagen has high solubility, it is possible to prepare a sample by uniformly dispersing it in a high-concentration ethanol aqueous solution. Therefore, it can be used in various fields. Furthermore, a uniformly dispersed solid can be obtained by adding cysteine protease-treated collagen to ethanol and evaporating the solvent. This can be used for forming a multilayer film.
The amount of water evaporation between the atelocollagen produced in Preparation Example 1 of cysteine protease-treated collagen and the cysteine protease-treated collagen was evaluated.
First, the following three solutions were prepared.
Control : 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0),
Atelocollagen : 0.5% atelocollagen solution dissolved in 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0),
Cysteine protease-treated collagen : 0.5% CP-collagen solution dissolved in 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0) For each solution, a 24-well plastic plate with a well diameter of 16 mm (2.0 mm 2 ) (manufactured by ICN) , Libro) was prepared one by one and the weight (tare) was measured. 200 μL of the same solution was added to each well of each plastic plate, and the weight was measured with an electronic balance. Specifically, the weight (mg) of the solution added to each plate was calculated from the difference from the tare weight.
Each plate was placed in a heat storage box at 22 ° C. and a humidity of 50% to 60% and allowed to stand for 11 hours, 13 hours, 14 hours, 18 hours, 22 hours, 30 hours, and 37 hours.
The weight of each plate was measured with an electronic balance every time, and the tare weight and protein concentration were corrected to determine the amount of water evaporation. Specifically, the protein weight (0.5 mg / mL) was subtracted from the solution weight of atelocollagen and cysteine protease-treated collagen (CP collagen) added at 0 hours to obtain each water amount W (0). A coefficient was calculated so that W (0) of atelocollagen and cysteine protease-treated collagen was equal to W (0) of control, and W (t) at each time was corrected by each correction coefficient to calculate W ′ (t). . Next, dW ′ (t) was calculated by subtracting W (0) from the solution weight W ′ (t) at each time. Relative ratio (%) of weight change dW ′ (t) of solution for each time (%) (= dW ′ (t) × 100 ÷ dW (37) The transition of the standing time (hours) and the moisture evaporation relative ratio (%) was evaluated, that is, the evaporation amount after 37 hours of the control was taken as 100, and all were expressed as relative values.
The results are shown in Table 2.
As is apparent from Table 2, it was shown that atelocollagen was gradually reduced from 6% after 13 hours with respect to control, and that there was almost no difference from control after 18 hours. In other words, the moisture evaporation suppression effect was lost with time. On the other hand, it was shown that the amount of water evaporation of the cysteine protease-treated collagen was suppressed by 10% with respect to the control after 13 hours. Surprisingly, this remarkable water evaporation suppression effect was 10.5% even after 22 hours, and it was confirmed for the first time that the water evaporation suppression effect lasted for a long time. From this experimental result, it became clear that the water retention ability of cysteine protease-treated collagen is significantly different from that of atelocollagen.
<Calculation method of “6% of 13 hours”>
Comparing the values in the table at 13 hours, the control is 37.4%, atelocollagen is 35.3%, and cysteine protease-treated collagen is 33.6%. The 6% indicates a ratio when 2.1 (= 37.4-35.3) that is a difference in evaporation amount is a numerator and 37.4 is a denominator.
ウサギの耳および尾からのアテロコラーゲンの抽出
ウサギの耳５．４５ｇと尾部１８．２ｇをそれぞれ細かに細断して、０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液１００ｍＬを加えて、ワーリングブレンダーにて粉砕した。４℃にて３日間撹拌後、１０，０００×ｇにて３０分間遠心し各試料の一次上清を得た。さらに沈澱部分に１００ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を加えて、撹拌後、同様に遠心して二次上清を得た。
これら一次、二次上清を集めて、それぞれの試料溶液にブタ・ペプシン（シグマ社製）を最終濃度３０Ｕ／ｍＬになるように添加し、４℃にて３日間撹拌した。
同条件で遠心後の上清全量に対して、最終濃度２．５ｍｏｌ／Ｌになるように塩化ナトリウムを加えて溶解し、４℃にて１時間放置後、１０，０００×ｇで３０分間遠心して沈澱を集めた。沈澱を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を適量加えて溶解し、これらを耳由来アテロコラーゲン試料と尾部由来アテロコラーゲン試料とした。 Extraction of Atelocollagen from Rabbit Ear and Tail Rabbit ear 5.45 g and tail 18.2 g were each finely chopped, added with 100 mL of 0.1 mol / L acetic acid aqueous solution, and ground with a Waring blender. After stirring at 4 ° C. for 3 days, the mixture was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain the primary supernatant of each sample. Further, 100 mL of 100 mmol / L acetic acid aqueous solution was added to the precipitate, stirred, and then centrifuged in the same manner to obtain a secondary supernatant.
These primary and secondary supernatants were collected, porcine pepsin (manufactured by Sigma) was added to each sample solution to a final concentration of 30 U / mL, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 3 days.
Under the same conditions, the total amount of the supernatant after centrifugation was dissolved by adding sodium chloride to a final concentration of 2.5 mol / L, allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes. Collected the precipitate with heart. The precipitate was dissolved by adding an appropriate amount of 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0), and these were used as ear-derived atelocollagen samples and tail-derived atelocollagen samples.
ウサギ耳由来と尾部由来システインプロテアーゼ処理コラーゲンの調製
調製例２にて得たウサギ耳および尾のアテロコラーゲンの一部をそれぞれ別々の蓋付き容器に移した。
システインプロテアーゼ（アクチニダイン）は、５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトールと１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で２５℃，１時間放置して活性化した。各アテロコラーゲン試料溶液に３．０％（ｗ／ｖ）活性化アクチニダインとなるように添加した。２０℃にて７日間撹拌し粗生成物を得た。
ウサギ耳由来と尾部由来システインプロテアーゼ処理コラーゲンの精製
調製したウサギ由来システインプロテアーゼ処理コラーゲン（耳由来と尾部由来）とアクチニダインは、陰イオン交換ゲルを用いるバッチ法にて分離精製した。
詳しくは、酵素反応粗生成物に２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃゲル（東ソー株式会社製）を適量添加して、２５℃にて１時間放置後、１０，０００×ｇにて３０分間遠心して上清にシステインプロテアーゼ処理コラーゲンを得た。
この粗精製物を５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、図１２に示すように、得られたウサギ由来のシステインプロテアーゼ処理コラーゲンは、α鎖のみからなる分子量約１０万の成分のみから成ることが確認できた。得られたウサギ耳および尾部由来の精製システインプロテアーゼ処理コラーゲンは蒸留水に３回透析した後、凍結乾燥した。 Preparation of Rabbit Ear-Derived and Tail-Derived Cysteine Protease Treated Collagen Part of the rabbit ear and tail atelocollagen obtained in Preparation Example 2 was transferred to separate containers with lids.
Cysteine protease (actinidyne) was activated by standing in a 20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.5) containing 5 mmol / L dithiothreitol and 1 mmol / LEDTA for 1 hour at 25 ° C. To each atelocollagen sample solution, 3.0% (w / v) activated actinidin was added. The mixture was stirred at 20 ° C. for 7 days to obtain a crude product.
Purification of rabbit ear-derived and tail-derived cysteine protease-treated collagen The rabbit-derived cysteine protease-treated collagen (derived from the ear and tail) and actinidine were separated and purified by a batch method using an anion exchange gel.
Specifically, an appropriate amount of TSKgel DEAE-Toyopearl 650C gel (manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0) was added to the crude enzyme reaction product, and left at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to obtain cysteine protease-treated collagen in the supernatant.
As a result of analyzing this crudely purified product by 5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, as shown in FIG. 12, the obtained cysteine protease-treated collagen derived from rabbit has only a component having a molecular weight of about 100,000 consisting only of α chain. It was confirmed that it consisted of The obtained purified cysteine protease-treated collagen derived from the rabbit ear and tail was dialyzed three times in distilled water and then lyophilized.
ウシ酸可溶性コラーゲン（タイプＩ）由来システインプロテアーゼ処理コラーゲ ンの調製
市販品のウシ酸可溶性コラーゲン（タイプＩ）（ナカライテスク、品番＃０９３５０ ３４）が１．０ｍｇ／ｍＬ濃度になるよう２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加えて溶解した。あらかじめ５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトールと１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で２５℃で１時間放置して活性化したシステインプロテアーゼ（アクチニダイン）を、ウシ酸可溶性コラーゲン試料溶液に１．０％（ｗ／ｖ）となるように添加した。２０℃にて７日間撹拌し粗生成物を得た。
ウシ酸可溶性コラーゲン由来システインプロテアーゼ処理コラーゲンの精製
前述のようにして調製したウシ由来システインプロテアーゼ処理コラーゲンとアクチニダインを、陰イオン交換ゲルを用いるカラム法にて分離精製した。
詳しくは、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃゲル（東ソー株式会社製）をつめたカラムに、酵素反応粗生成物を流してウシ由来ＣＰ−コラーゲンを分画した。
この粗精製物を５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、β鎖とγ鎖のない分子量約１０万のα鎖成分のみから成ることが確認できた。 Bovine acid soluble collagen (Type I) bovine acid soluble collagen (type I) derived from cysteine protease treatment collagen preparations commercially available (Nacalai Tesque, part number # 09350 34) to become 1.0 mg /
Purification of bovine acid-soluble collagen-derived cysteine protease-treated collagen The bovine-derived cysteine protease-treated collagen and actinidine prepared as described above were separated and purified by a column method using an anion exchange gel.
Specifically, the enzyme reaction crude product was passed through a column packed with TSKgel DEAE-Toyopearl 650C gel (manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 20 mmol / L acetate buffer (pH 4.0), and bovine-derived CP-collagen. Was fractionated.
As a result of analyzing this crudely purified product by 5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it was confirmed that it consisted only of an α chain component having a molecular weight of about 100,000 having no β chain and γ chain.
ニワトリ由来アテロコラーゲンの調製
ニワトリの軟骨９３ｇを細断して、０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液１０００ｍＬを加えて、ワーリングブレンダーにて粉砕した。４℃にて２日間撹拌後、１０，０００×ｇにて３０分間遠心して上清を集めた。上清溶液にブタ・ペプシン（シグマ社製）を最終濃度３０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３０℃にて３日間撹拌した。同条件で遠心後の上清全量に対して、最終濃度２．５ｍｏｌ／Ｌになるように塩化ナトリウムを加えて溶解して１時間放置後、１０，０００×ｇで３０分間遠心して沈澱を集めた。沈澱を２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を適量加えて溶解し、これらをニワトリ由来アテロコラーゲン試料とした。
ニワトリ由来システインプロテアーゼ処理コラーゲンの調製
前述のようにして得たニワトリのアテロコラーゲン溶液に前述のように活性化したシステインプロテアーゼ（アクチニダイン）を３．０％（ｗ／ｖ）になるように添加した。３０℃にて３日間撹拌し粗生成物を得た。この粗精製物を５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析した結果、図１３に示すように、β鎖のない分子量約９万〜１３万のα鎖成分のみから成ることが示された。 Preparation of chicken-derived atelocollagen Chick cartilage 93 g was chopped, added with 1000 mL of 0.5 mol / L acetic acid aqueous solution, and pulverized with a Waring blender. After stirring at 4 ° C. for 2 days, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 × g for 30 minutes. Porcine pepsin (manufactured by Sigma) was added to the supernatant solution to a final concentration of 30 U / mL, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 3 days. Under the same conditions, the total amount of the supernatant after centrifugation is dissolved by adding sodium chloride to a final concentration of 2.5 mol / L, allowed to stand for 1 hour, and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to collect the precipitate. It was. The precipitate was dissolved by adding an appropriate amount of 20 mmol / L acetate buffer (pH 5.0), and these were used as chicken-derived atelocollagen samples.
Preparation of Chicken-Derived Cysteine Protease Treated Collagen To chicken atelocollagen solution obtained as described above, cysteine protease (actinidine) activated as described above was added to 3.0% (w / v). The mixture was stirred at 30 ° C. for 3 days to obtain a crude product. As a result of analysis of this crude product by 5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was shown that it consisted only of α chain components having no β chain and a molecular weight of about 90,000 to 130,000 as shown in FIG. .
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