JP4484014B2

JP4484014B2 - Hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and immunostimulatory substances

Info

Publication number: JP4484014B2
Application number: JP2003049132A
Authority: JP
Inventors: 万木夫古林; 裕昭松下; 良一築山
Original assignee: ヒガシマル醤油株式会社
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: JP2003327540A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活活性物質、その製造法およびその用途に関する。
より詳しくは、本発明は、皮膚の潤滑性、柔軟性を保ち、老化を防ぐヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を抑制して、皮膚の小ジワやかさつきを防ぎ、また免疫系におけるIgA生産能を賦活化する免疫賦活活性を有する物質、その製造法およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加水分解する酵素であり、動物組織に広く分布している。その基質となるヒアルロン酸は、皮膚・関節液などの組織に多く存在するムコ多糖の一種であり、例えば、皮膚においては、細胞の保護・栄養の運搬・組織水分の保持・柔軟性の維持等に、また、関節液として組織構造・機能の維持および潤滑性の保持等に重要な役割を果たしている。
【０００３】
皮膚や関節等における生体中のヒアルロン酸量は、老化または病的状態により減少し、皮膚の乾燥・肌荒れ・弾力性の低下、シワの増加、あるいは関節の湿潤性悪化による関節痛等を引き起こす。このような状態に対して、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸の分解を抑制し、生体ヒアルロン酸量の維持に寄与する。
【０００４】
また、ヒアルロニダーゼ阻害剤はヒアルロニダーゼに起因する抗炎症・抗アレルギー剤にも利用することができる。これは、ヒアルロニダーゼが炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系の組織への浸潤・血管の透過性を亢進すること、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの遊離の過程に介在している可能性が高いことによる。従って、抗炎症剤・抗アレルギー剤であるインドメタシン、アスピリン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト等には高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。ヒアルロニダーゼ阻害剤は、近年患者数が増加しつつあり、社会問題化しているアトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息、食物アレルギー等のアレルギー性疾患の予防や改善効果が期待されている。
【０００５】
また、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸を配合した化粧料の皮膚への塗布や関節へのヒアルロン酸の注入等の措置による外因性ヒアルロン酸の安定化にも利用することができる。
【０００６】
これまでに、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するものとしては、茶ポリフェノール類（特許文献１）、果実ポリフェノール類（特許文献２）、水溶性プロポリス（特許文献３）、生薬又は飲食物として使用されているチンピ・キジツ・羅漢果の抽出物（特許文献４）、ブナ科の植物であるウラジロガシ抽出物（特許文献５）、カシューナッツ殻油（特許文献６）、ウルシ科植物抽出物（特許文献７）、海藻類（特許文献８）等が見出されているが、作用・効果が不十分な点や、活性を保ったまま製剤に安定に配合することが困難であるというような問題点が残されていた。
【０００７】
一方、生体が外界と接する境界には皮膚と粘膜があるが、粘膜面積の方がはるかに広く、その中でも腸管粘膜表面は最も広い面積を有する。腸管粘膜は多数のウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原と接触する場所であるため、それらの異物抗原から身体を守るための腸管免疫システムが存在する。この腸管免疫として機能するものとしてIgAが存在し、このIgAは、細菌やウィルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレルギー抑制等に重要な役割を果たしている。
【０００８】
免疫力が低い老人や幼児あるいは体力の低下した人は、ウィルスや病原菌などの外部からの異物に対する抵抗力が低い事が知られており、IgAを高く保つ作用を有する物質、あるいはIgAの生産力を高めることができる免疫賦活剤の開発が望まれている。
【０００９】
免疫賦活活性物質としては、発酵乳製品が古くから知られているが、嗜好的要素もあり利用範囲が限定されること、作用・効果が不十分な点や、製剤への配合に特殊な技術が必要なことなどの問題があった。最近においては、エンテロコッカス属の菌体または処理物を有効成分とするもの(特許文献９)、核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品（特許文献１０）、カカオ豆から得られる抽出物を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献１１）等があるが、その実用性はまだ明らかでない。
【００１０】
【特許文献１】
特開平６−９９３９１号公報
【特許文献２】
特開平８−２５９４５３号公報
【特許文献３】
特開平１１−２９０００５号公報
【特許文献４】
特開平６−８０５７６号公報
【特許文献５】
特開平６−２３９７５７号公報
【特許文献６】
特開平６−３２９５２６号公報
【特許文献７】
特開平７−１０７６５号公報
【特許文献８】
特開平９−６７２６６号公報
【特許文献９】
特開平１１−９２３８９号公報
【特許文献１０】
特開２００１−３１４１７２号公報
【特許文献１１】
特開２０００−８６５２６号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、経済的、安全性に優れたヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性ならびに免疫賦活活性を有する物質およびその製造法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、このような物質を用いたヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、免疫賦活活性等の生理活性を有するアレルギー抑制、肌荒れ抑制、小じわ発生の抑制、関節痛の抑制あるいは免疫賦活作用を持つ、食品、化粧品及び医薬を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、免疫賦活活性を有する物質のスクリーニングを鋭意行った。その結果、大豆、ユズ、スダチ、ミカン等の柑橘類、およびこれらの加工副産物である脱脂加工大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐あるいは柑橘類の果皮、柑橘類の果汁を窄汁した残渣等の原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状菌、納豆菌の酵素で処理することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および免疫賦活活性が発現することを発見し、本発明をなすに至った。
【００１３】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活活性を有する物質は、大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を原料とし、糸状菌（麹菌）または納豆菌を利用した発酵物全般から得ることができる。また、本発明の物質は、アルコール不溶性、水可溶性であり、分子量12,000以上である。
【００１４】
すなわち、本発明は、次のとおりのヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質に関する
(1) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。
(2) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分からなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。
(3) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる高分子画分からなるヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。
【００１５】
また、本発明は、次のとおりのヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫活性物質の製造法に関する。
(4) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取することを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質の製造方法。
(5) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特徴とする（1）〜（3）のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質の製造方法。
【００１６】
さらに本発明は、前記物質の次のとおりの用途に関する。
(6) (1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活剤。
(7）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する健康・機能性飲料。
(8）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する化粧品。
(9）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する医薬品。
【００１７】
次に、本発明の前記生理活性を有する高分子物質を得る手段の一例を以下に示す。しかし、本発明はこのような方法に特に限定されるものではない。
大豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐等の大豆加工品、あるいは、ユズ、スダチ等の柑橘類、柑橘類の果皮、柑橘類から果汁を窄汁した残渣等の果実の加工品、あるいは小麦を含有する原料に、水を加えるかそのままで蒸煮あるいは焙煎する等の加熱処理を施し、これに、麹菌等の糸状菌や納豆菌を生育させることによって、本発明に関わる活性成分を発現させる。
【００１８】
これら微生物の生育を促進させるために、各種栄養源を補給することもできる。また、通常の醤油原料である大豆、小麦に大豆加工品や柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を添加して製麹することも可能である。
このようにして培養物中に発現した活性成分はそのままでも利用が可能であり、水や食塩水あるいは30％（v/v）程度未満の低濃度エタノール等のアルコールで容易に抽出することができる。さらには、食塩水や30％（v/v）程度未満のエタノール中で長期間発酵させても得ることができる。
【００１９】
また、大豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐等の大豆加工品、あるいはユズ、スダチ等の柑橘類、柑橘類の果皮、柑橘類から果汁を搾汁した残渣等の果実の加工品、あるいは小麦を含有する原料に、麹類や納豆菌の培養物から得られる粗酵素剤を作用させて生成させることも可能である。
この場合、上記原料を蒸煮もしくは焙煎しておくことが望ましく、処理原料１重量部に対して水、食塩水、30％（v/v）程度未満のエタノールもしくはこれらの混合液を１から10重量部程度加え、腐敗せずに酵素による加水分解が進行する温度、好ましくは水を加えたときは５℃以下で１〜数日間、塩水あるいは30％（v/v）程度以下のエタノールを加えたときは30〜45℃程度で１日〜数週間程度処理する。
【００２０】
本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性は、発酵分解物中に発現し、これをそのまま利用することも可能である。さらに利用しやすくするために、以下に示すような手段で、抽出し、あるいはその高分子画分を濃縮することによってこれらの活性をさらに高めることもできる。
【００２１】
本発明の生理活性物質を抽出するには、大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品の発酵分解物に、１から10重量部程度の水、食塩水、あるいは30％（v/v）程度未満のエタノールを加えて攪拌をするかしないで1時間〜数日間放置し、ろ過し、そのろ液を使用する。
本発明の生理活性を有する高分子物質を得るには、上記分解物の抽出ろ液に、エタノールを添加して生成する不溶性物質をろ過あるいは遠心分離で集める方法、あるいは、これらの液体を限外ろ過膜に通すことによって高分子物質を含有する画分である非透過液を集める方法、あるいはこの非透過液にエタノールを加えて不溶物を生成させ、それを回収する方法等が利用できる。
【００２２】
本発明に係る高分子物質を採取するために加えるエタノールの量は、高分子物質が不溶性となる濃度であればよく、最終エタノール濃度が30％（v/v）以上、望ましくは50％（v/v）以上になればよい。エタノールに代えてメタノールや2-プロパノール等によっても本発明の高分子物質は回収できるが、安全性の面でエタノールが好ましい。
【００２３】
本発明のアルコール沈殿により高分子画分を採取した残りの液は、新たな原料から高分子物質を回収するために利用することも可能である。また、例えばこの液は添加したエタノールとともにアミノ酸や低分子の糖質を含有するものであり、蒸留などの操作によってエタノールと分離する。エタノールは本発明において再利用でき、また、不揮発成分は調味料や食品として利用することもできる。あるいは、限外ろ過による透過液はそのままで調味料や食品として利用することが可能である。
【００２４】
得られたヒアルロニダーゼ阻害活性および／または免疫賦活活性を有する生理活性物質は、水などに溶解した形態、粉末化した形態、あるいはそのまま利用することが可能であり、製剤としてもよく、また飲食品、化粧品、医薬（医薬部外品も含む）などに適宜配合することができる。
また、必要に応じて、透析、限外ろ過あるいはゲルろ過などの方法によってさらに活性（ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性）または純度の高い物質を得ることも可能である。
【００２５】
本発明の生理活性物質を製剤化するときは温度に留意することが必要で、100℃程度の高温になると活性が低下する可能性がある。
本発明の生理活性物質は、上記の方法により得られた抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用する。
【００２６】
本発明における生理活性物質の使用量は生理活性物質の純度により大きく異なる。例えば大豆皮を原料として麹菌を３日間培養して10倍量の水で２時間抽出後得られたろ液に、２倍量のエタノールを加えて得られた沈殿物を透析した後凍結乾燥した本発明の生理活性物質の場合、成人1人あたり10〜1000mg程度が望ましく、これは飲食品あるいは化粧品として用いたときも免疫賦活剤として用いたときも、あるいはヒアルロニダーゼ阻害剤として用いたときも同様である。
【００２７】
製剤として使用する場合における生理活性物質の使用量は製剤の形態によっても異なるが、0.001重量%以上が好ましく、安全性に全く問題がないので特に上限は規定しない。
【００２８】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性およびまたは免疫賦活活性を有する生理活性物質を飲食物に添加して、ヒアルロニダーゼ阻害作用または免疫賦活作用を有する飲食物を得るに当たって、その免疫賦活物質を飲食物に添加する方法としては、通常一般的に行われている方法でよいが、好ましくは、色素、香料等を添加するように最終工程で添加することが好ましい。
【００２９】
これらの飲食物としては、チューインガム，キャンディ，錠菓，グミゼリー，チョコレート，ビスケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム，シャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャム、乳製品、醤油味噌等の調味料等が挙げられ、これらの飲食物を日常的に接種することにより免疫力を強化する事が可能となる。
【００３０】
これらの飲食物に対する本発明の生理活性物質の添加量としては、飲食物の形態によっても異なるが、0.001重量%以上の添加が望ましく、嗜好性の面からは20重量%以下が望ましい。また、カプセルや錠剤型の健康食品、機能性食品の場合、その濃度に上限を設ける必要はない。
【００３１】
また、本発明の生理活性物質は、そのまま化粧品に添加して使用することもできるが、公知の賦形剤や希釈剤、あるいは他の任意の配合材料とともに混合して顆粒、エマルジョン、溶液、懸濁液などの剤形に調整して使用することができる。さらに、本発明の化粧品では本発明の生理活性物質以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、ビタミン類、保湿剤、増粘剤、界面活性剤、湿潤剤、香料、色素、防腐剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、アミノ酸類、各種動植物抽出物、胎盤抽出物などの化粧品添加物として公知のものを適宜任意に組み合わせて配合することもできる。
【００３２】
具体的な化粧品の例としては、ローション、乳液、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、日焼け止めクリーム等のクリーム類、パック類等の基本化粧品、あるいはファンデーション、口紅、ほお紅、アイシャドー、おしろい等のメークアップ化粧品を挙げることができる。また石けん、洗顔クリーム、ボディローション、入浴剤等として調製することもできる。このような化粧品においては、その製造工程の任意の段階で、本発明の生理活性物質の粉末や液体など、目的に適した剤形のものを配合することができる。
【００３３】
本発明の生理活性物質の免疫賦活活性は、医薬として免疫力の低い老人や幼児あるいは体力の低下した人に、その免疫力を高めるために用いられる。また、主にヒアルロニダーゼ阻害活性は花粉症などのアレルギーを抑制するために用いられる。
【００３４】
これらは、本発明の生理活性物質を含有し、所望により、製剤学的に許容することのできる担体を含有することができる。投与形態としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤などの経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００３５】
これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
【実施例１】
以下の方法により脱脂加工大豆と小麦、大豆皮と小麦、大豆皮を原料とする麹を作成した。
3L容三角フラスコに脱脂大豆100gあるいは大豆皮100gを入れ、熱水120mlを加えた後30分間放置した。続いて、割砕小麦90gを加えよく撹拌後、121℃で45分間オートクレーブ処理を行った。また、大豆皮100gを割砕小麦を加えることなく、上記の処理を行った。放冷後、種麹（Aspergillus oryzae HL-15株）10gを植菌し、よく撹拌した。その後、30℃に保持したウォーターバスで48時間静置培養を行って麹とした。その間、撹拌のため2回の手入れ（20時間後および30時間後）を行った。
【００３７】
培養したそれぞれの麹の一部（90g）に純水150mlを加え、10,000rpmで15分間ホモジネートを行った。続いて、ホモジネート液を7,000rpmで30分間遠心分離を行い、上清を回収して各麹の水抽出液とした。
【００３８】
麹の水抽出液に2倍量のエタノールを添加し沈殿物を生成させた。続いて、7,000rpmで10分間遠心分離を行い、沈殿物を回収し凍結乾燥して試験品１とした。
【００３９】
また、同様に操作して得られた沈殿物を約100mlの純水に溶解し、分画分子量12,000以上の透析チューブ（和光純薬工業製、商品名Seamless cellulose tubing, small size 18, Wako、以下の実施例においても同様の透析チューブを使用した）に充填し、4℃の流水中で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加・混合し生成した沈殿物を、7,000rpmで10分間遠心分離して回収し凍結乾燥して試験品２とした。
【００４０】
試験品１および２を用いて次の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した。その結果を表1に示した。
【００４１】
＜ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定方法＞
乾燥粉末を水に溶解した後、0.1Ｍ酢酸緩衝液（pH 4）中に添加し、濃度の異なる水溶液を調製した。これらの水溶液0.2mlに、ヒアルロニダーゼ（シグマ社製の牛睾丸由来、タイプＩＶ-S）を400単位（0.1ml）添加して反応液とした。なお、これらの反応液中の乾燥粉末の終濃度は、0.01〜10 ｍｇ／ｍｌである。また、これらの乾燥粉末を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照とした。
【００４２】
上記の反応液を37℃で20分間プレインキュベートした後、ヒアルロニダーゼの活性化物質であるCompound48/80（シグマ社製）、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムの混合液を、終濃度が0.1mg/ml、2.5mMおよび150mMとなるように加え、さらに37℃で20分間プレインキュベートした。この溶液に、基質であるヒアルロン酸カリウム（和光純薬製、ヒト臍帯由来）を、終濃度が0.4mg/mlとなるように加えて、37℃で40分間インキュベートして酵素反応を行った。
【００４３】
その後、基質が分解されることによって遊離したN-アセチルグルコサミンをモルガン・エルソンの改良法（Davidson, E. A., J. Biol. Chem., 242, 437, 1967）により発色させ、分光光度計（島津製作所製 UV-1200）を用いて585nmの吸光度を測定した。この測定結果から、本発明品の生理活性物質を含有する反応液におけるヒアルロニダーゼ活性阻害率（%）を、以下に示す計算式（１）に従って計算した。さらに、本発明品の生理活性物質の濃度とヒアルロニダーゼ活性阻害率との関係から、最小二乗法によって、ヒアルロニダーゼ活性を50%阻害する場合の濃度（IC₅₀）（mg/ml）を求め、その結果を表1に示した。
阻害活性(%)＝[（対照反応液の吸光度−試料反応液の吸光度）／対照反応液の吸光度]×100 …（１）
ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験としてヒアルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナトリウム（DSCG）の結果を併記した。
【００４４】
＜免疫賦活活性の測定方法＞
BALB/cマウス雄性７週齢（日本クレア）よりパイエル板組織を取り出し、20%FBS（ウシ胎児血清）を含むRPMI-1690培地（Gibco社製）に浸し、組織を押しつぶし、ナイロンメッシュを通して単細胞浮遊液とした。これを800rpmで5分間遠心分離して上清を除き、20%FBSを含むRPMI培地に1×10⁷個/mlになるように懸濁した。
【００４５】
IgA誘導剤として、試験品１または２を200μg/ml添加した96穴平底プレートに、上記懸濁液を100μlずつ添加し、37℃、5%CO₂の存在下で３日間培養し、培養液を3000rpmで遠心分離し、上清のIgAをELISA法により測定した。
パイエル板細胞に何も添加せずに培養した対照群の値を１とした時の比活性を示した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
【実施例２】
脱脂加工大豆100gと小麦90g、大豆皮100gと小麦90g、大豆皮100g、ユズ皮100g、スダチ皮100gを原料として実施例１と同様の方法で麹をそれぞれ作成した。続いて、実施例１と同様に操作して得られた沈殿物及び透析物を凍結乾燥して試験品３とした。実施例１に記載の方法で、試験品３を用いてヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】

【００４９】
【実施例３】
（酵素処理による活性の発現）
米と押麦を等量混合したものを原料として麹菌（Aspergillus oryzae）を接種して実施例１の方法と同様に培養し麹を作成した。得られた麹50gに200mlの0.1Mリン酸バッファー（pH 7.0）を加え、菌体破砕のために氷中でホモジナイズ(10,000rpm×15分）を行った後、遠心分離(7,000rpm×15分）により上清を得た。メンブレンフィルター(0.45μm）で上清をろ過し、麹菌酵素を含む酵素液とした。大豆皮、ユズ皮、スダチ皮（それぞれ4g）を100ml容三角フラスコに入れ、熱水8mlを加え30分放置した後、121℃で30分間オートクレーブした。放冷後、酵素液を20ml加え、30℃で18時間インキュベートした。インキュベート後の反応液を遠心分離(3,500rpm×10分）し、得られた上清に対して2倍容量のエタノールを加えて沈殿を生じさせた。続いて、遠心分離(7,000rpm×10分）により回収した沈殿物を凍結乾燥してヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。表３に示すとおり、麹菌の酵素で処理することにより活性が発現した。
【表３】

【００５０】
【実施例４】
アレルギー反応は４つの型に分類され、その中のＩ型アレルギー反応は組織中の肥満細胞や血液細胞中の好塩基球の細胞膜上にあるFCεリセププターにIgE抗体が結合し、その２分子の抗体が抗原で架橋されることにより脱顆粒現象が生じて、酵素やヒスタミン、セロトニンの化学伝達物質が細胞外へ遊離する。これらの物質により気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギー疾患が発症すると考えられている。そこで、Ｉ型アレルギー反応に関与する正常好塩基球や肥満細胞と同様な機能を有するラット好塩基球白血球細胞（RBL-2H3）を用いて、片岡および高垣の文献（片岡正博、高垣裕：生薬学雑誌、46(1)、25-29、1992）に従い本発明の試験品２の脱脂加工大豆と小麦の麹の透析物について抗アレルギー活性を評価した。
【００５１】
ラット好塩基球白血病細胞（RBL-2H3）は、Wistar系ラットにβ-chloroethylamide を投与して作成された Rat basophilic leukemia 細胞（RBL 細胞）群中クローニングより得られた細胞である。RBL-2H3 細胞はRPMI-1640培地（Sigma製）に3％ Fetal calf serum (HyClone 製)および0.2％ Bovine serum albumin Fraction V（生化学工業製）を含む培養液中37℃、５％CO₂で培養した。
【００５２】
RBL-2H3 細胞液（5×10⁵ cells/ml）を24 Well（Costar 製）に0.4ml分注し、マウス抗DNPIgE抗体を0.5μg/ml加えて、37℃、5％CO₂インキュベーターで12時間培養し感作を行った。培養後 Well中の培養液を吸引除去しリン酸バッファーで2回洗浄後、Releasing medium を260μl加えた。Releasing mediumに溶解した試験品2を添加し、10分間インキュベート後、抗原として20μlのDNP-BSA（4.0μg/ml）を加え更に30分間インキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミン量を ELISA キット（SPI bio 社）を用いて測定し、ヒスタミンの遊離抑制を抗アレルギー活性の指標とした。比較試験としてフマル酸ケトチフェンの結果を併記した。
表４に示したとおり試験品２を添加した区は無添加にくらべてヒスタミン遊離を抑制し、抗アレルギー活性が認められた。
【００５３】
【表４】

【００５４】
【実施例５】
脱脂加工大豆と小麦を主原料とした生揚げ醤油100mlにエタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混合し、生成した不溶物を遠心分離によって採取した。次いで、それぞれの沈殿物を100mlの純水に溶解し、再度エタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混合し、生成した不溶物を遠心分離によって集め凍結乾燥して乾燥物を得た。得られた乾燥物を試験品４として用いた。また、同様に操作して得られた沈殿物を約20mlの水に溶解し、分画分子量12000以上の透析チューブに詰め、4℃の流水で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加・混合し生成した沈殿物を遠心分離によって集め、凍結乾燥によって乾燥した。得られた乾燥物を試験品５とした。
試験品４および５を用いて実施例１と同様の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した。結果を表５に示した。
【００５５】
【表５】

【００５６】
【実施例６】
丸大豆と小麦を主原料とした生揚げ醤油500mlにエタノール1000mlを添加し十分混合後一夜静置し、上清をデカンテーションで除き、さらに66%のエタノール1500mlで十分洗浄した。生成した沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離して集め、室温で2時間程度エタノールを飛散させた後凍結乾燥すると凍結乾燥物25 gが得られた(以下、沈殿物という)。この乾燥物20gを約100mlの水に溶解し、透析チューブに詰めて一夜流水中で透析した。透析内液にその2倍量のエタノールを加えて混合後遠心分離し、得られた沈殿物を凍結乾燥すると凍結乾燥物2.6 gが得られた（以下、透析残存物という）。それぞれについて実施例1と同様の方法で、ヒアルロニダーゼ阻害活性および免疫賦活活性を測定し、その結果を表６に示した。免疫賦活活性についてはIgA誘導剤としての試料添加量を200μg/mlおよび2mg/mlで行い、また、ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験としてヒアルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナトリウム（DSCG）の結果を併記した。
【００５７】
【表６】

【００５８】
【実施例７】
醤油麹1kgに水2.2Lおよび防腐のためにエタノール500mlを加え30℃で1および4週間放置し、麹菌酵素による分解を行った。これらの期間中麹菌、乳酸菌、酵母等の増殖は認められなかった。これを圧搾してろ液を得、さらに清澄ろ過して得られたろ液500mlに、エタノールを1L添加して混合後しばらく静置し、生成した沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離して集めた。さらに、その一部を実施例６と同様に透析、エタノールによる沈殿、および凍結乾燥して透析残存物を得た。これらについて実施例１と同様の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性ならびに免疫賦活活性を測定した。その結果を表７に示した。
【００５９】
【表７】

【００６０】
【実施例８】
生揚げ醤油6Lを限外ろ過膜（分画分子量5,000）に通し、透過液4.8
Lと非透過液1.2 Lに分別した。また、生揚げ醤油、透過液（低分子）、非透過液(高分子)のそれぞれの一部をとり、95℃、5分加熱後55℃、2日保持し、発生する火入れおりをセライトろ過で除いて火入れろ過醤油を得た。これらの150mlにエタノールを300ml添加混合後しばらく静置したところ、透過液およびその火入れろ過液から沈殿の発生は認められなかった。
【００６１】
沈殿が生成したものについて、デカンテーションおよび遠心分離によって沈殿物を集めた。得られた沈殿物はそれぞれ150mlの水で溶解しエタノール300mlを添加して沈殿を発生させ同様の方法で回収した。沈殿物の1/2量は凍結乾燥し、残りの1/2量は少量の水に溶解して透析チューブに詰め、 1夜冷流水にて透析後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加して生成した沈殿物を遠心分離で採取し凍結乾燥した。
それぞれについてヒアルロニダーゼ阻害活性を測定し、表８にその結果を示した。
【００６２】
表８によると、加熱したほうがヒアルロニダーゼ阻害活性は低く、生揚げ醤油から回収するほうが有利と思われる。また、限外ろ過によって高分子画分を濃縮してから、エタノール沈殿させると効率よく回収できることが示唆された。
【００６３】
【表８】

【００６４】
【実施例９】
大豆または小麦を蒸煮し、これに糸状菌、もしくは納豆菌を接種し、30℃で3日間培養後、培養物100gに水500mlを加えて4℃で20時間攪拌し、布ろ過および遠心分離によって澄明な抽出液を得た。得られた抽出液にその2倍量のエタノールを添加し、生じた沈殿物を遠心分離で採取した。さらにこの沈殿物を10mlの純水に溶解し、透析チューブに詰めて流水中で15時間透析した。透析内液に2倍量のエタノールを加えて発生した不溶物を遠心分離によって集め、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を反応最終濃度が1mg/mlになるように調製してヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。結果は表９にしめした。表９から明らかなように、大豆、小麦の原料そのものからはヒアルロニダーゼ阻害活性は得られず、麹菌あるいは納豆菌を生育することによって強い活性物質が得られた
【００６５】
【表９】

＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。
【００６６】
【実施例１０】
大豆および小麦を原料とした市販の発酵食品のヒアルロニダーゼ阻害活性について検討した。試料が液体の場合は、100gにエタノールを200ml添加して混合した。固形物試料の場合は、その200gに純水400gを加えて10,000rpmで10分間ホモジナイズし、遠心分離により上清300gを採取し、エタノール600mlを加えて混合した。それぞれ、発生した沈殿物を遠心分離により回収し、適量の純水に溶解して透析チューブに詰め、流水で一夜透析後、透析内液を凍結乾燥し乾燥粉末を得て阻害活性測定用の試料とした。結果は表10に示したように、各種発酵物からヒアルロニダーゼ阻害活性物質が得られた。
【００６７】
【表１０】

＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。
【００６８】
【実施例１１】
大豆と小麦を原料として作成した醤油麹、または大豆を原料として作成した納豆10gに水50mlを加えてホモジナイズした後ろ過し、得られたろ液を凍結乾燥して、乾燥物それぞれ0.15gと0.13gを得た。これを純水に10mg/mlになるよう溶解し、0.2μmのフィルターによってろ過して試料液とした。この試料液を用いて実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ阻害活性および免疫賦活活性を測定した。その結果を表11に示した。
【００６９】
【表１１】

【００７０】
【実施例１２】
（機能性食品）
実施例1と同様の方法によって得られた大豆皮麹1kgに15%のエタノールを3L添加して一夜冷蔵保管し、その後ろ過して抽出液2Lを得た。これに4Lのエタノールを加えて撹拌後1週間静置した。生成した沈殿物をデカンテーションによって集め、これを40℃で減圧乾燥後、凍結乾燥によって乾燥粉末30gを得た。
(1) 上記の凍結乾燥粉末10%、馬鈴薯澱粉20%、乳糖70%を混合し、粉末食品を得た。
(2) 上記の凍結乾燥粉末1%、オレンジ果汁5%、異性化糖15%、クエン酸0.1%、香料0.1%、水78.8%を混合してオレンジ果汁飲料を得た。
これらの粉末食品及び飲料は抗アレルギー及び免疫力向上のために食用に供される。
【００７１】
【実施例１３】
（化粧品）
実施例12と同様にして得られた乾燥粉末10gを100mlの純水に溶解し、透析チューブに充填し一夜流水中で透析した。その透析内液を凍結乾燥すると淡褐色の精製粉末が得られた。下記の処方例に従って混合してローションを得た。
（処方例）
ポリオキシエチレン（20E. O.）ソルビタンモノステアレート2.0（重量%、以下同じ）、ポリオキシエチレン（60E. O.）硬化ヒマシ油2.0、オリーブ油0.5、エタノール10.0、上記の精製粉末の20%水溶液10.0、精製水75.5（合計100）
【００７２】
【実施例１４】
（医薬品）
実施例13の乾燥粉末50%、デキストリン50%を混合し、0.1gをゼラチンカプセルに充填する。これを、花粉症の予防薬として1日3回1カプセルずつ服用する。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a hyaluronidase inhibitory, antiallergic and immunostimulatory active substance, a process for its production and its use.
More specifically, the present invention suppresses the activity of hyaluronidase that degrades hyaluronic acid, which keeps skin lubricity and flexibility, and prevents aging, and prevents skin wrinkles and roughness, and also produces the ability to produce IgA in the immune system. The present invention relates to a substance having an immunostimulatory activity that activates, its production method and its use.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronidase is an enzyme that hydrolyzes hyaluronic acid and is widely distributed in animal tissues. Hyaluronic acid as a substrate is a kind of mucopolysaccharide that is abundant in tissues such as skin and joint fluid. For example, in the skin, cell protection, transport of nutrients, retention of tissue moisture, maintenance of flexibility, etc. In addition, it plays an important role as a synovial fluid in maintaining the tissue structure / function and maintaining lubricity.
[0003]
The amount of hyaluronic acid in the living body in the skin and joints decreases due to aging or a pathological condition, and causes dryness, rough skin, decreased elasticity, increased wrinkles, joint pain due to deterioration of joint wettability, and the like. In such a state, the hyaluronidase inhibitor suppresses the degradation of hyaluronic acid and contributes to the maintenance of the amount of biological hyaluronic acid.
[0004]
Hyaluronidase inhibitors can also be used as anti-inflammatory / anti-allergic agents caused by hyaluronidase. This is because hyaluronidase is activated during inflammation, destroys the matrix of connective tissue, enhances the infiltration of inflammatory tissues and the permeability of blood vessels, and releases histamine from mast cells in type I allergy. This is because there is a high possibility of interposition. Therefore, high hyaluronidase inhibitory activity has been observed for indomethacin, aspirin, cromoglycate sodium, tranilast and the like, which are anti-inflammatory agents and antiallergic agents. Hyaluronidase inhibitors are increasing in the number of patients in recent years, and are expected to prevent or improve allergic diseases such as atopic dermatitis, hay fever, bronchial asthma and food allergies, which are becoming social problems.
[0005]
The hyaluronidase inhibitor can also be used to stabilize exogenous hyaluronic acid by measures such as application of cosmetics containing hyaluronic acid to the skin or injection of hyaluronic acid into the joint.
[0006]
So far, those having hyaluronidase inhibitory activity include tea polyphenols (Patent Document 1), fruit polyphenols (Patent Document 2), water-soluble propolis (Patent Document 3), chimneys used as crude drugs or foods and drinks.・ Extracts of pheasants and rahan fruit (Patent Document 4), extract of Japanese beech family (Patent Document 5), cashew nut shell oil (Patent Document 6), urushiaceae plant extract (Patent Document 7), seaweed (Patent Document 8) and the like have been found, but problems such as insufficient action and effect and difficulty in stably blending into a preparation while maintaining activity remain. .
[0007]
On the other hand, there are skin and mucous membrane at the boundary where the living body comes into contact with the outside world, but the area of the mucosa is much wider, and the surface of the intestinal mucosa has the largest area. Since the intestinal mucosa is a place where many viruses, bacteria, parasites, pathogenic antigens and food antigens come into contact, there exists an intestinal immunity system for protecting the body from these foreign antigens. IgA exists as a substance that functions as intestinal immunity, and this IgA plays an important role in neutralizing bacteria and viruses, suppressing bacterial adhesion to tissues, and suppressing allergy by food antigens.
[0008]
Older and young children with low immunity, infants, or people with weak physical strength are known to have low resistance to foreign substances such as viruses and pathogens, and substances that have an action to keep IgA high, or IgA productivity The development of an immunostimulant that can increase the blood pressure is desired.
[0009]
Fermented dairy products have been known for a long time as immunostimulatory active substances, but there are also liking factors that limit the range of use, inadequate action and effect, and special technology for blending into formulations There were problems such as needing. Recently, it is obtained from an enterococcus cell or treated product as an active ingredient (Patent Document 9), a food and drink having an immunostimulatory action containing a nucleic acid composition as an active ingredient (Patent Document 10), and cocoa beans. Although there exists an immunostimulant which uses an extract as an active ingredient (patent document 11) etc., its practicality is not yet clear.
[0010]
[Patent Document 1]
JP-A-6-99391
[Patent Document 2]
JP-A-8-259453
[Patent Document 3]
JP-A-11-290005
[Patent Document 4]
JP-A-6-80576
[Patent Document 5]
JP-A-6-239757
[Patent Document 6]
JP-A-6-329526
[Patent Document 7]
Japanese Patent Laid-Open No. 7-10765
[Patent Document 8]
JP-A-9-67266
[Patent Document 9]
Japanese Patent Laid-Open No. 11-92389
[Patent Document 10]
JP 2001-314172 A
[Patent Document 11]
JP 2000-86526 A
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
This invention is made | formed in view of the said situation, Comprising: It aims at providing the substance which has the hyaluronidase inhibitory activity excellent in economical and safety | security, antiallergic activity, and immunostimulatory activity, and its manufacturing method.
Furthermore, the present invention provides allergy suppression, hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity, immunostimulatory activity and other physiological activities using such substances, skin roughening, fine wrinkle suppression, joint pain suppression or immunostimulatory action. The object is to provide food, cosmetics and medicines.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors diligently screened for substances having hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity, and immunostimulatory activity. As a result, citrus fruits such as soybeans, yuzu, sudachi and mandarin oranges, and these processed by-products such as defatted soybeans, soybean hulls, soybean meal, okara, tofu or citrus peels, and citrus juice residue It was discovered that hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity, and immunostimulatory activity were expressed by treating raw materials with enzymes of filamentous fungus, natto and / or filamentous fungus, and natto. Thus, the present invention was achieved.
[0013]
The substance having hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and immunostimulatory activity according to the present invention is obtained from fermented products using soybean, wheat, citrus fruits, fruits or processed products thereof as a raw material and using filamentous fungi (Bacillus or Natto). be able to. Further, the substance of the present invention is alcohol insoluble and water soluble, and has a molecular weight of 12,000 or more.
[0014]
That is, the present invention relates to the following hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and immunostimulatory substance.
(1) Hyaluronidase inhibition, anti-allergic activity consisting of fermented products obtained by treating soybeans, wheat, citrus fruits, fruits or raw materials containing these processed products with filamentous fungi, natto bacteria and / or filamentous fungi, natto bacteria enzymes And / or immunostimulatory active substances.
(2) Hyaluronidase inhibition consisting of a high molecular fraction of fermented products obtained by treating soybeans, wheat, citrus fruits, fruits or raw materials containing these processed products with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes Antiallergic and / or immunostimulatory active substances.
(3) Fermented products obtained by treating soybeans, wheat, citrus fruits, fruits, or raw materials containing these processed products with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes, with water, saline or low concentration A hyaluronidase inhibitory, antiallergic activity and / or immunostimulatory active substance comprising a polymer fraction obtained by extraction or immersion with alcohol.
[0015]
The present invention also relates to a method for producing hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and immunologically active substance as follows.
(4) Fermented products obtained by treating soybeans, wheat, citrus fruits, fruits, or raw materials containing these processed products with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes, with water, saline or low concentration Hyaluronidase inhibition, antiallergic activity according to any one of the above (1) to (3), wherein ethanol is added to a liquid obtained by extraction or immersion with alcohol to cause precipitation, and the precipitate is collected. Or the manufacturing method of an immunostimulation active substance.
(5) Fermented products obtained by treating soybeans, wheat, citrus fruits, fruits, or raw materials containing these processed products with filamentous fungi, natto and / or filamentous fungi, or natto fungi enzymes, water, saline or low-concentration alcohol The hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and immunostimulatory substance according to any one of (1) to (3), wherein the obtained liquid is extracted or immersed in and concentrated by ultrafiltration to obtain a concentrate Manufacturing method.
[0016]
Furthermore, this invention relates to the following uses of the said substance.
(6) Hyaluronidase inhibition, antiallergic activity and / or immunostimulant comprising the substance described in any one of (1) to (3) as an active ingredient.
(7) A health / functional beverage having hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity and / or immunostimulatory activity comprising the substance described in any one of (1) to (3) as an active ingredient.
(8) A cosmetic having hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity and / or immunostimulatory activity, comprising the substance described in any one of (1) to (3) as an active ingredient.
(9) A pharmaceutical having hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity and / or immunostimulatory activity, comprising the substance described in any one of (1) to (3) as an active ingredient.
[0017]
Next, an example of means for obtaining the physiologically active polymer substance of the present invention is shown below. However, the present invention is not particularly limited to such a method.
Processed soy products such as soybeans, defatted soybeans, soybean hulls, soybean meal, okara, tofu, etc., or citrus fruits such as yuzu and sudachi, citrus peels, processed fruit products such as citrus fruit juice residue, or Active ingredients related to the present invention are expressed by applying heat treatment to raw materials containing wheat, such as adding water or steaming or roasting as it is, and growing filamentous fungi such as koji and natto Let
[0018]
In order to promote the growth of these microorganisms, various nutrient sources can be supplemented. It is also possible to make soybeans by adding soybean processed products, citrus fruits, fruits or processed products thereof to soybeans and wheat which are ordinary soy sauce raw materials.
Thus, the active ingredient expressed in the culture can be used as it is, and can be easily extracted with water, saline or alcohol such as low-concentration ethanol of less than about 30% (v / v). . Further, it can be obtained by fermentation for a long time in saline or ethanol of less than about 30% (v / v).
[0019]
In addition, processed soybean products such as soybeans, defatted soybeans, soybean hulls, soybean meal, okara, tofu, etc., or citrus fruits such as yuzu and sudachi, citrus peels, residues obtained by squeezing juice from citrus fruits, Or it is also possible to make it produce | generate by making the crude enzyme agent obtained from the culture of moss and natto bacteria act on the raw material containing wheat.
In this case, it is desirable to steam or roast the above raw materials, and 1 to 10 parts by weight of water, saline, ethanol of less than about 30% (v / v) or a mixture thereof is 1 to 10 parts. Add about parts by weight, add the temperature of hydrolysis without enzymatic decay, preferably 5 ° C or less for 1 to several days when adding water, add salt water or 30% (v / v) or less ethanol When it is used, it is treated at about 30 to 45 ° C for about 1 day to several weeks.
[0020]
In the present invention, the hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity and / or immunostimulatory activity are expressed in the fermentation degradation product and can be used as it is. In order to make it easier to use, these activities can be further enhanced by extracting or concentrating the polymer fraction by the means shown below.
[0021]
In order to extract the physiologically active substance of the present invention, about 1 to 10 parts by weight of water, saline, or 30% (v / v) is added to soybean, wheat, citrus fruits, fruits or fermented decomposition products of these processed products. Add less than about ethanol and stir for 1 hour to several days, filter, and use the filtrate.
In order to obtain the physiologically active polymer substance of the present invention, an insoluble substance produced by adding ethanol to the extracted filtrate of the above-mentioned decomposition product is collected by filtration or centrifugation, or these liquids are limited. A method of collecting a non-permeate that is a fraction containing a polymer substance by passing through a filtration membrane, a method of adding ethanol to this non-permeate to generate an insoluble matter, and a method of collecting it can be used.
[0022]
The amount of ethanol added to collect the polymer material according to the present invention may be a concentration at which the polymer material becomes insoluble, and the final ethanol concentration is 30% (v / v) or more, preferably 50% (v / v) or more. Although the polymer substance of the present invention can be recovered by using methanol, 2-propanol or the like instead of ethanol, ethanol is preferable in terms of safety.
[0023]
The remaining liquid obtained by collecting the polymer fraction by the alcohol precipitation of the present invention can be used for recovering the polymer substance from a new raw material. In addition, for example, this liquid contains amino acid and low molecular weight saccharide together with added ethanol, and is separated from ethanol by an operation such as distillation. Ethanol can be reused in the present invention, and non-volatile components can also be used as seasonings and foods. Alternatively, the permeate obtained by ultrafiltration can be used as it is as a seasoning or food.
[0024]
The obtained physiologically active substance having hyaluronidase inhibitory activity and / or immunostimulatory activity can be used in the form dissolved in water, powdered form, or as it is, and may be used as a preparation, It can be suitably blended in cosmetics, medicines (including quasi drugs) and the like.
Further, if necessary, a substance having higher activity (hyaluronidase inhibitory activity, antiallergic activity and / or immunostimulatory activity) or higher purity can be obtained by a method such as dialysis, ultrafiltration or gel filtration.
[0025]
When formulating the physiologically active substance of the present invention, it is necessary to pay attention to the temperature, and the activity may decrease at a high temperature of about 100 ° C.
As the physiologically active substance of the present invention, the extract obtained by the above method may be directly used as it is, but generally it is dissolved or dispersed in an appropriate liquid carrier, or an appropriate powder carrier. Mixed or adsorbed thereto, and in some cases, an emulsifier, a dispersant, a suspending agent, a spreading agent, a penetrating agent, a wetting agent, a stabilizer and the like are further added to the emulsion, oil, wettable powder, Used as a preparation for powders, tablets, capsules, liquids, etc.
[0026]
The amount of the physiologically active substance used in the present invention varies greatly depending on the purity of the physiologically active substance. For example, gonococci are cultured for 3 days using soybean hulls as raw material, extracted with 10 volumes of water for 2 hours, dialyzed from a precipitate obtained by adding 2 volumes of ethanol, and then freeze-dried. In the case of the physiologically active substance of the invention, about 10 to 1000 mg per adult is desirable, which is the same when used as a food or drink or cosmetic, as an immunostimulator, or as a hyaluronidase inhibitor. is there.
[0027]
The amount of the physiologically active substance used as a preparation varies depending on the form of the preparation, but is preferably 0.001% by weight or more, and there is no problem with safety, so no upper limit is specified.
[0028]
A method of adding a physiologically active substance having hyaluronidase inhibitory activity and / or immunostimulatory activity of the present invention to food and drink, and obtaining the food and drink having hyaluronidase inhibitory action or immunostimulatory action, and adding the immunostimulatory substance to food and drink In general, a generally used method may be used. However, it is preferable to add a dye, a fragrance, or the like in the final step.
[0029]
These foods and drinks include chewing gum, candy, tablet confectionery, gummy jelly, chocolate, biscuits or snacks, frozen confectionery such as ice cream, sherbet or ice confectionery, beverages, pudding, jam, dairy products, soy sauce miso It is possible to strengthen immunity by daily inoculation with these foods and drinks.
[0030]
The amount of the physiologically active substance of the present invention to be added to these foods and drinks varies depending on the form of the food and drink, but is preferably 0.001% by weight or more, and is preferably 20% by weight or less from the viewpoint of palatability. In the case of capsule or tablet-type health foods and functional foods, there is no need to set an upper limit for the concentration.
[0031]
The physiologically active substance of the present invention can be used as it is by adding it to cosmetics as it is, but it is mixed with known excipients, diluents, or other optional compounding materials and mixed with granules, emulsions, solutions, suspensions. It can be used by adjusting to a dosage form such as a turbid liquid. Furthermore, in the cosmetics of the present invention, in addition to the physiologically active substance of the present invention, vitamins, humectants, thickeners, surfactants, wetting agents, fragrances, pigments, preservatives, as long as the effects of the present invention are not impaired. Well-known cosmetic additives such as ultraviolet absorbers, antioxidants, amino acids, various animal and plant extracts, and placenta extracts can be used in any appropriate combination.
[0032]
Specific cosmetic examples include lotions, emulsions, cleansing creams, massage creams, creams such as sun creams, basic cosmetics such as packs, or make-up cosmetics such as foundations, lipsticks, blushers, eye shadows, and funny. Can be mentioned. It can also be prepared as a soap, face-wash cream, body lotion, bathing agent, and the like. Such cosmetics can be formulated in a dosage form suitable for the purpose, such as a powder or liquid of the physiologically active substance of the present invention, at any stage of the production process.
[0033]
The immunostimulatory activity of the physiologically active substance of the present invention is used as a medicine to increase the immunity of elderly people and infants with low immunity or those with reduced physical strength. In addition, hyaluronidase inhibitory activity is mainly used to suppress allergies such as hay fever.
[0034]
These contain the physiologically active substance of the present invention, and can contain a pharmaceutically acceptable carrier, if desired. The dosage form is not particularly limited, and for example, oral preparations such as powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or pills, or injections And parenteral preparations such as topical solutions, ointments, suppositories, topically applied creams, and eye drops.
[0035]
These formulations are excipients, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity promoters, diluents, preservatives, colorants, fragrances, stabilizers, humectants, preservatives, or oxidation It can manufacture in accordance with a conventional method using an inhibitor etc.
[0036]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[Example 1]
The following methods were used to prepare cocoons made from defatted soybean and wheat, soybean hulls and wheat, and soybean hulls.
In a 3 L Erlenmeyer flask, 100 g of defatted soybean or 100 g of soybean hulls was added, and 120 ml of hot water was added and left for 30 minutes. Subsequently, 90 g of cracked wheat was added and stirred well, followed by autoclaving at 121 ° C. for 45 minutes. In addition, 100 g of soybean hulls was subjected to the above treatment without adding cracked wheat. After allowing to cool, 10 g of seed potato (Aspergillus oryzae HL-15 strain) was inoculated and stirred well. Thereafter, static culture was performed in a water bath maintained at 30 ° C. for 48 hours to obtain a sputum. In the meantime, twice maintenance (after 20 hours and after 30 hours) was performed for stirring.
[0037]
150 ml of pure water was added to a part (90 g) of each cultured sputum and homogenized at 10,000 rpm for 15 minutes. Subsequently, the homogenate solution was centrifuged at 7,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was collected to obtain a water extract of each bottle.
[0038]
Two times the amount of ethanol was added to the water extract of koji to produce a precipitate. Subsequently, the mixture was centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes, and the precipitate was collected and lyophilized to obtain Test Product 1.
[0039]
In addition, a precipitate obtained by the same operation was dissolved in about 100 ml of pure water, and a dialysis tube having a fractional molecular weight of 12,000 or more (trade name: Seamless cellulose tubing, small size 18, Wako, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. The same dialysis tube was also used in the above Example) and dialyzed overnight in running water at 4 ° C. After that, the precipitate formed by adding and mixing twice the amount of ethanol to the dialysis internal solution, 7,000 Centrifugation was carried out at rpm for 10 minutes, and recovery and freeze-drying were carried out to make a test product 2.
[0040]
Using test products 1 and 2, hyaluronidase inhibitory activity and immunostimulatory activity were measured by the following method. The results are shown in Table 1.
[0041]
<Method for measuring hyaluronidase inhibitory activity>
The dry powder was dissolved in water and then added to 0.1 M acetate buffer (pH 4) to prepare aqueous solutions having different concentrations. To 0.2 ml of these aqueous solutions, 400 units (0.1 ml) of hyaluronidase (derived from Sigma Co., Ltd., Beef Testicle, type IV-S) was added to obtain a reaction solution. The final concentration of the dry powder in these reaction solutions is 0.01 to 10 mg / ml. Moreover, the reaction liquid which does not add these dry powders was produced similarly to the above, and was used as a control.
[0042]
After preincubating the above reaction solution at 37 ° C. for 20 minutes, a mixed solution of Compound 48/80 (manufactured by Sigma), calcium chloride and sodium chloride, which is an activator of hyaluronidase, was added at a final concentration of 0.1 mg / ml, 2.5 They were added to mM and 150 mM, and further preincubated at 37 ° C. for 20 minutes. To this solution, potassium hyaluronate as a substrate (manufactured by Wako Pure Chemicals, derived from human umbilical cord) was added so as to have a final concentration of 0.4 mg / ml, and incubated at 37 ° C. for 40 minutes for enzyme reaction.
[0043]
After that, the N-acetylglucosamine released by the decomposition of the substrate is colored by the improved method of Morgan Elson (Davidson, EA, J. Biol. Chem., 242, 437, 1967), and the spectrophotometer (Shimadzu Corporation) Absorbance at 585 nm was measured using a UV-1200). From this measurement result, the hyaluronidase activity inhibition rate (%) in the reaction solution containing the physiologically active substance of the present invention was calculated according to the following calculation formula (1). Furthermore, from the relationship between the concentration of the physiologically active substance of the present invention and the hyaluronidase activity inhibition rate, the concentration (IC) when 50% of the hyaluronidase activity is inhibited by the least square method. ₅₀ ) (Mg / ml) and the results are shown in Table 1.
Inhibitory activity (%) = [(absorbance of control reaction solution−absorbance of sample reaction solution) / absorbance of control reaction solution] × 100 (1)
Regarding the inhibition of hyaluronidase, the result of sodium cromoglycate (DSCG), which is a hyaluronidase inhibitor, is also shown as a comparative test.
[0044]
<Method for measuring immunostimulatory activity>
Remove Peyer's patch tissue from 7-week-old male BALB / c mice (Claire Japan), soak in RPMI-1690 medium (Gibco) containing 20% FBS (fetal bovine serum), crush the tissue, and float single cells through nylon mesh Liquid. This was centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and 1 x 10 in RPMI medium containing 20% FBS. ⁷ Suspension was made so as to be a unit / ml.
[0045]
Add 100 μl of the above suspension to a 96-well flat bottom plate containing 200 μg / ml of test sample 1 or 2 as an IgA inducer, and add 37 μC, 5% CO ₂ Was cultured for 3 days in the presence of, the culture was centrifuged at 3000 rpm, and the IgA of the supernatant was measured by ELISA.
The specific activity was shown when the value of the control group cultured without adding anything to Peyer's patch cells was 1.
[0046]
[Table 1]

[0047]
[Example 2]
100 g of defatted soybeans and 90 g of wheat, 100 g of soybean hulls and 90 g of wheat, 100 g of soybean hulls, 100 g of yuzu hulls, and 100 g of sudachi hulls were used as raw materials in the same manner as in Example 1. Subsequently, a precipitate and a dialyzate obtained by operating in the same manner as in Example 1 were lyophilized to obtain a test product 3. Table 2 shows the results of measuring the hyaluronidase inhibitory activity and the immunostimulatory activity using the test product 3 by the method described in Example 1.
[0048]
[Table 2]

[0049]
[Example 3]
(Expression of activity by enzyme treatment)
A mixture of equal amounts of rice and oats was used as a raw material to inoculate Aspergillus oryzae and cultured in the same manner as in Example 1 to prepare a koji. After adding 200 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) to 50 g of the obtained koji and homogenizing (10,000 rpm × 15 minutes) in ice for cell disruption, centrifugation (7,000 rpm × 15 minutes) ) To obtain a supernatant. The supernatant was filtered with a membrane filter (0.45 μm) to obtain an enzyme solution containing the koji mold enzyme. Soybean skin, yuzu skin and sudachi skin (4 g each) were placed in a 100 ml Erlenmeyer flask, 8 ml of hot water was added and allowed to stand for 30 minutes, and then autoclaved at 121 ° C. for 30 minutes. After cooling, 20 ml of enzyme solution was added and incubated at 30 ° C. for 18 hours. The reaction solution after the incubation was centrifuged (3,500 rpm × 10 minutes), and a 2-fold volume of ethanol was added to the resulting supernatant to cause precipitation. Subsequently, the precipitate collected by centrifugation (7,000 rpm × 10 minutes) was lyophilized and the hyaluronidase inhibitory activity was measured. As shown in Table 3, the activity was expressed by treatment with koji mold enzymes.
[Table 3]

[0050]
[Example 4]
Allergic reactions are classified into four types. Among them, IgE antibody binds to FCε receptor on the cell membranes of mast cells in tissues and basophils in blood cells. Cross-linking with an antigen causes a degranulation phenomenon, and enzymes, histamine, and serotonin chemical mediators are released out of the cell. These substances are thought to cause allergic diseases such as bronchial asthma and allergic rhinitis. Therefore, using rat basophil leukocytes (RBL-2H3) that have the same functions as normal basophils and mast cells involved in type I allergic reactions, Kataoka and Takagaki literature (Masahiro Kataoka, Hiroshi Takagaki: Nama) The antiallergic activity of the defatted soybean and wheat straw dialyzates of the test product 2 of the present invention was evaluated according to a pharmaceutical magazine, 46 (1), 25-29, 1992).
[0051]
Rat basophil leukemia cells (RBL-2H3) are cells obtained by cloning in a group of rat basophilic leukemia cells (RBL cells) prepared by administering β-chloroethylamide to Wistar rats. RBL-2H3 cells were cultured in RPMI-1640 medium (Sigma) containing 3% Fetal calf serum (HyClone) and 0.2% Bovine serum albumin Fraction V (Seikagaku Corporation) at 37 ° C, 5% CO ₂ Incubated with
[0052]
RBL-2H3 cell fluid (5 × 10 ^Five cells / ml) is dispensed into 24 Well (Costar), 0.4 ml, mouse anti-DNPIgE antibody is added at 0.5 μg / ml, and the temperature is 37 ° C, 5% CO ₂ Sensitization was performed by culturing for 12 hours in an incubator. After culturing, the culture medium in the well was removed by aspiration, washed twice with phosphate buffer, and 260 μl of Releasing medium was added. Test product 2 dissolved in Releasing medium was added and incubated for 10 minutes, and then 20 μl of DNP-BSA (4.0 μg / ml) was added as an antigen and incubated for another 30 minutes. The amount of histamine released into the supernatant was measured using an ELISA kit (SPI bio), and inhibition of histamine release was used as an index of antiallergic activity. As a comparative test, the results of ketotifen fumarate are also shown.
As shown in Table 4, in the group to which the test product 2 was added, histamine release was suppressed and anti-allergic activity was observed compared to the case where the test product 2 was not added.
[0053]
[Table 4]

[0054]
[Example 5]
Ethanol 50, 100, and 200 ml were added to and mixed with 100 ml of freshly fried soy sauce made mainly from defatted soybeans and wheat, and the resulting insoluble matter was collected by centrifugation. Next, each precipitate was dissolved in 100 ml of pure water, 50, 100, and 200 ml of ethanol were again added and mixed, and the resulting insoluble matter was collected by centrifugation and lyophilized to obtain a dried product. The obtained dried product was used as test product 4. Further, the precipitate obtained by the same operation was dissolved in about 20 ml of water, packed in a dialysis tube having a molecular weight cut off of 12000 or more, and dialyzed overnight at 4 ° C. with running water. Subsequently, the precipitate formed by adding and mixing twice the amount of ethanol to the dialyzed solution was collected by centrifugation and dried by lyophilization. The obtained dried product was designated as test product 5.
Using test products 4 and 5, hyaluronidase inhibitory activity and immunostimulatory activity were measured in the same manner as in Example 1. Table results 5 It was shown to.
[0055]
[Table 5]

[0056]
[Example 6]
1000 ml of ethanol was added to 500 ml of freshly fried soy sauce made mainly of whole soybeans and wheat, mixed well, allowed to stand overnight, the supernatant was removed by decantation, and further washed thoroughly with 1500 ml of 66% ethanol. The resulting precipitate was collected by decantation and centrifugation, and ethanol was scattered for about 2 hours at room temperature, followed by freeze-drying to obtain 25 g of a freeze-dried product (hereinafter referred to as precipitate). 20 g of this dried product was dissolved in about 100 ml of water, packed in a dialysis tube and dialyzed overnight in running water. Two times the amount of ethanol was added to the dialyzed internal solution, mixed and centrifuged, and the resulting precipitate was lyophilized to obtain 2.6 g of lyophilized product (hereinafter referred to as dialysis residue). For each, the hyaluronidase inhibitory activity and immunostimulatory activity were measured in the same manner as in Example 1, and the results were obtained. Table 6 It was shown to. For immunostimulatory activity, the amount of sample added as an IgA inducer was 200 μg / ml and 2 mg / ml, and for hyaluronidase inhibition, the results of sodium cromoglycate (DSCG), a hyaluronidase inhibitor, were listed as a comparative test. .
[0057]
[Table 6]

[0058]
[Example 7]
To 1 kg of soy sauce cake, 2.2 L of water and 500 ml of ethanol for preservative were added and left at 30 ° C. for 1 and 4 weeks, followed by decomposition with koji mold enzyme. During these periods, no growth of gonorrhea, lactic acid bacteria, yeast, etc. was observed. This was squeezed to obtain a filtrate. Further, 1 L of ethanol was added to 500 ml of the filtrate obtained by clarification and the mixture was allowed to stand for a while after mixing. The resulting precipitate was collected by decantation and centrifugation. Further, a part thereof was dialyzed, precipitated with ethanol and freeze-dried in the same manner as in Example 6 to obtain a dialysis residue. About these, hyaluronidase inhibitory activity and immunostimulatory activity were measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 7.
[0059]
[Table 7]

[0060]
[Example 8]
Pass 6L of raw fried soy sauce through an ultrafiltration membrane (molecular weight cut off 5,000).
Separated into L and non-permeate 1.2 L. Also, take a portion of each of the raw fried soy sauce, permeate (low molecular weight), and non-permeate (high molecular weight), heat at 95 ° C for 5 minutes, and hold at 55 ° C for 2 days. The soy sauce filtered by heating was removed. When 150 ml of ethanol was added to and mixed with 150 ml of these, the mixture was allowed to stand for a while, and no precipitation was observed in the permeate and its fired filtrate.
[0061]
For the precipitate that formed, the precipitate was collected by decantation and centrifugation. The obtained precipitates were dissolved in 150 ml of water, and 300 ml of ethanol was added to generate precipitates, which were collected in the same manner. 1/2 amount of the precipitate is lyophilized, and the remaining 1/2 amount is dissolved in a small amount of water, packed in a dialysis tube, dialyzed in cold running water overnight, and then twice as much ethanol in the dialysis internal solution. The precipitate formed by adding was collected by centrifugation and lyophilized.
Measure hyaluronidase inhibitory activity for each, Table 8 The results are shown in.
[0062]
According to Table 8, the hyaluronidase inhibitory activity is lower when heated, and it is more advantageous to recover from freshly fried soy sauce. In addition, it was suggested that the polymer fraction can be efficiently recovered by ethanol precipitation after concentration of the polymer fraction by ultrafiltration.
[0063]
[Table 8]

[0064]
[Example 9]
Steam soybeans or wheat, inoculate them with filamentous fungi or natto, and incubate at 30 ° C for 3 days. Add 500ml of water to 100g of the culture, stir at 4 ° C for 20 hours, and filter by cloth filtration and centrifugation. A clear extract was obtained. Two times the amount of ethanol was added to the resulting extract, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. Further, the precipitate was dissolved in 10 ml of pure water, packed in a dialysis tube, and dialyzed for 15 hours in running water. Insoluble matter generated by adding 2 volumes of ethanol to the dialyzed internal solution was collected by centrifugation and lyophilized. This lyophilizate was prepared so that the final concentration of the reaction was 1 mg / ml, and the hyaluronidase inhibitory activity was measured. The results are shown in Table 9. As is apparent from Table 9, hyaluronidase inhibitory activity was not obtained from the raw materials of soybeans and wheat, and strong active substances were obtained by growing koji mold or natto bacteria.
[0065]
[Table 9]

* Hyaluronidase activity intensity was expressed in the same manner as in Table 3.
[0066]
[Example 10]
The hyaluronidase inhibitory activity of commercial fermented foods made from soybeans and wheat was investigated. When the sample was liquid, 200 ml of ethanol was added to 100 g and mixed. In the case of a solid sample, 400 g of pure water was added to 200 g thereof, homogenized at 10,000 rpm for 10 minutes, 300 g of the supernatant was collected by centrifugation, and 600 ml of ethanol was added and mixed. Collect the generated precipitate by centrifugation, dissolve it in an appropriate amount of pure water, pack it in a dialysis tube, dialyze with running water overnight, freeze-dry the dialysis solution, obtain a dry powder, and sample for measuring the inhibitory activity It was. As a result, as shown in Table 10, hyaluronidase inhibitory active substances were obtained from various fermented products.
[0067]
[Table 10]

* Hyaluronidase activity intensity was expressed in the same manner as in Table 3.
[0068]
Example 11
Soy sauce cake made from soybeans and wheat as raw materials, or 10 g of natto made from soybeans as raw materials, 50 ml of water added, homogenized and filtered, and the resulting filtrate was freeze-dried and dried to 0.15 g and 0.13 g, respectively. Got. This was dissolved in pure water to 10 mg / ml and filtered through a 0.2 μm filter to obtain a sample solution. Using this sample solution, hyaluronidase inhibitory activity and immunostimulatory activity were measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 11.
[0069]
[Table 11]

[0070]
Example 12
(Functional food)
3 L of 15% ethanol was added to 1 kg of soybean hull obtained by the same method as in Example 1 and stored refrigerated overnight, followed by filtration to obtain 2 L of extract. 4 L of ethanol was added thereto, and the mixture was stirred and allowed to stand for 1 week. The generated precipitate was collected by decantation, dried at 40 ° C. under reduced pressure, and then freeze-dried to obtain 30 g of dry powder.
(1) The above freeze-dried powder 10%, potato starch 20% and lactose 70% were mixed to obtain a powdered food.
(2) The above lyophilized powder 1%, orange fruit juice 5%, isomerized sugar 15%, citric acid 0.1%, fragrance 0.1% and water 78.8% were mixed to obtain an orange fruit juice drink.
These powdered foods and beverages are used for food to improve antiallergy and immunity.
[0071]
Example 13
(Cosmetics)
10 g of the dry powder obtained in the same manner as in Example 12 was dissolved in 100 ml of pure water, filled in a dialysis tube, and dialyzed overnight in running water. When the dialysis solution is lyophilized, Purification A powder was obtained. A lotion was obtained by mixing according to the following formulation example.
(Prescription example)
Polyoxyethylene (20E. O.) sorbitan monostearate 2.0 (% by weight, the same shall apply hereinafter), polyoxyethylene (60E. O.) hydrogenated castor oil 2.0, olive oil 0.5, ethanol 10.0, above Purification 20% aqueous solution of powder 10.0, purified water 75.5 (100 in total)
[0072]
Example 14
(Medicine)
50% of the dry powder of Example 13 and 50% of dextrin are mixed, and 0.1 g is filled into a gelatin capsule. Take 1 capsule 3 times daily to prevent hay fever.

Claims

A hyaluronidase inhibitor comprising a fermented product obtained by treating soybeans, wheat, processed products thereof, or raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, and enzymes of natto fungi.

Hyaluronidase inhibition consisting of soybean, wheat, processed products of these, or high molecular fractions of fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes Agent.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration A hyaluronidase inhibitor consisting of a polymer fraction obtained by extraction or immersion with alcohol.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration The method for producing a hyaluronidase inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein ethanol is added to a liquid obtained by extraction or immersion with alcohol to cause precipitation.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration The method for producing a hyaluronidase inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the concentrate is obtained by extracting or immersing with alcohol and concentrating the obtained liquid by ultrafiltration.

Hyaluronidase inhibitory drugs as an active ingredient hyaluronidase inhibitor according to claim 1.

Histamine for the treatment of allergic diseases consisting of fermented products obtained by treating soybean, wheat, processed products thereof, or raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes Release inhibitor.

Allergic diseases consisting of soybean, wheat, processed products thereof, or raw materials containing yuzu and sudachi peels, and high molecular fractions of fermented products treated with filamentous fungi, natto fungi, and / or fungi, natto fungi enzymes A histamine release inhibitor for treatment.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration A histamine release inhibitor for the treatment of allergic diseases comprising a polymer fraction obtained by extraction or immersion with alcohol.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration 10. The method for producing a histamine release inhibitor for treating allergic diseases according to any one of claims 7 to 9, wherein ethanol is added to a liquid obtained by extraction or immersion with alcohol to cause precipitation. Method.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration 10. The production of a histamine release inhibitor for treating allergic diseases according to any one of claims 7 to 9, wherein the concentrate is obtained by extraction or immersion with alcohol and concentrating the obtained liquid by ultrafiltration. Method.

Histamine release inhibitor drugs as an active ingredient the histamine release inhibitor for treating allergic diseases as claimed in any of claims 7-9.

An immunostimulatory activator comprising a fermented product obtained by treating soybeans, wheat, processed products thereof, or raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, and enzymes of natto fungi.

Immunostimulation consisting of soybean, wheat, processed products thereof, or high-molecular fractions of fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi pericarp with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes Activator.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration An immunostimulatory activator comprising a polymer fraction obtained by extraction or immersion with alcohol.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi and / or fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration The method for producing an immunostimulatory activator according to any one of claims 13 to 15, wherein ethanol is added to a liquid obtained by extraction or immersion with alcohol to cause precipitation, and the precipitate is collected.

Soybeans, wheat, processed products thereof, or fermented products obtained by treating raw materials containing yuzu and sudachi peel with filamentous fungi, natto fungi, and / or filamentous fungi, natto fungi enzymes, water, saline or low concentration The method for producing an immunostimulatory activator according to any one of claims 13 to 15, wherein the concentrate is obtained by extracting or immersing with alcohol and concentrating the obtained liquid by ultrafiltration.

Immunostimulatory medicament for immunopotentiating activator as an active ingredient as claimed in any of claims 13 to 15.