JP4296608B2 - Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の新規なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動植物の細胞中に見られる小器官であるペルオキシソームは、コレステロールなどの脂質代謝や吸収に関与する酵素群を含む。ペルオキシソームの増加は食餌や生理的な要因によっても惹起されるが、抗脂血薬（フィブレート類）、殺虫剤及びフタル酸類の可塑剤などを含む構造的に多様な化合物群は、その投与により肝臓や腎臓のペルオキシソームの大きさと数を劇的に増加させると同時に、β−酸化サイクルに必要とされる酵素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能を高めることが知られており、ペルオキシソームプロリフェレータ（peroxisome proliferator）と呼ばれる。このようなペルオキシソーム増加のメカニズムに関する研究の中から、これら化合物群によって活性化される核内受容体が同定されペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（peroxisome proliferator activated receptor：ＰＰＡＲ）と名づけられた。
【０００３】
ＰＰＡＲは、その構造などから核内受容体（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考えられている。他の核内受容体と同様、リガンドとの結合により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配列（ＰＰＲＥ：peroxisome proliferator response element）に結合して標的遺伝子の転写を活性化する。ＰＰＡＲは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ：retinoid X receptor）とヘテロダイマーを形成し、このヘテロダイマーの形でＰＰＲＥに結合することが知られており、また、他の核内受容体と同様、その転写活性化作用を発揮するためには共役転写因子（コアクチベータ）群との相互作用が必要であると考えられている。
【０００４】
これまで、 ＰＰＡＲα、 ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγと称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、それらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている（Lembergerら、Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.、第12巻、第335-363頁、1996年）。これら３種のうち、ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている(Tontonozら、Genes and Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Tontonozら、Cell、第79巻、第1147-1156頁、1994年)。
【０００５】
一方、種々のチアゾリジンジオン誘導体は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM：non-insulin-dependent diabetes melitus)のモデル動物で血糖降下作用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいNIDDM治療薬として期待されている。これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用しＰＰＡＲγを特異的に活性化することが、最近の研究で明らかとなった（Lehmannら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年）。このようなチアゾリジンジオン誘導体のＰＰＡＲγ活性化能と遺伝性肥満マウスにおける血糖低下作用には強い相関が見られることから、ＰＰＡＲγがチアゾリジンジオン誘導体の薬理作用の標的分子であろうと考えられている（Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年）。このことはＰＰＡＲγの特異的発現の場である脂肪組織が、エネルギーバランス維持に重要な役割を果たす臓器であることとも関連付けられ、これらの知見から、ＰＰＡＲγのアゴニストとして特異的に作用する化合物は、糖尿病治療薬として非常に有効であると考えられている。
【０００６】
しかしながら、現在までのところ、ＰＰＡＲ作用薬のスクリーニング方法として知られているものは、いずれも操作が煩雑で多検体の同時処理が難しいという問題点を有する。
【０００７】
例えば、ＰＰＡＲ発現ベクターおよびＰＰＡＲの応答配列（ＰＰＲＥ）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用い、この細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の変化を指標として検体のＰＰＡＲ活性化能を調べる方法が知られている（WO 96/22884、 Tontonozら、Genes and Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年）。また、その改良法として、酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結合させた融合蛋白質発現用のベクター、及びＧＡＬ４の応答配列（GAL4 binding element）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用いる方法が知られている（WO 96/9633724、 Lehmannら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年、 Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年）。これらの方法では動物細胞に外来遺伝子を導入するが、遺伝子導入に際して染色体への組込みが起こるとその組み込まれた部位の影響を受ける場合があるため、遺伝子が染色体の影響を受けない形質転換細胞を用いる必要がある。このような形質転換動物細胞を取得し外来遺伝子を安定して発現させることは技術的な困難を伴う。また、これら方法における転写活性化には、宿主動物細胞由来の共役転写因子やＲＸＲなどが関与すると考えられるため、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できない可能性がある。
【０００８】
また、動物細胞やレポータ遺伝子を使わずに直接ＰＰＡＲとリガンドとの結合を検出する方法としては、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質と、放射性同位元素で標識した被験化合物との結合および拮抗を調べる方法が知られている （Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年、Buckleら、Bioorganic & Medical Chemistry Letters、第6巻、第2121-2126頁、1996年）。また、最近、他の核内受容体ＲＸＲなどと同様に、ＰＰＡＲも、転写共役因子の一つであるＳＲＣ−１とリガンド依存的に相互作用することが明らかにされ、この知見をもとに、Kreyらは、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質と放射性同位元素で標識したＳＲＣ−１とを用いて、被験化合物のリガンドとしての作用を検出する方法を報告している（Kreyら、Molecular Endocrinology、第11巻、第779-791頁、1997年）。しかし、これら方法は、いずれも放射性同位元素による標識を用いるため危険を伴うし、標識した化合物や転写共役因子の大量調製は困難であるので処理能力にも限界がある。
【０００９】
以上のように、 ＰＰＡＲ作用薬のスクリーニングを行うにあたり、簡便かつ精度のよい効率的なスクリーニング方法が望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の新規な同定方法およびスクリーニング方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、転写共役因子群のうち既にＰＰＡＲと相互作用することが知られているＳＲＣ−１のほか、ＣＢＰ（CREB-binding protein）もＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用することを独自に見出すとともに、共役転写因子のＰＰＡＲとの結合領域を同定した。さらに、これらの知見をもとにして、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用を、酵母のTwo-hybridシステムを利用した方法で検出する新しいＰＰＡＲ作用薬の同定およびスクリーニング方法を完成するにいたった。
【００１２】
すなわち、本発明は、
試験用細胞を被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明においては、試験用細胞内でのＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作用を検出する。ＰＰＡＲは、リガンドと結合することにより活性型にコンフォメーションが変化して転写共役因子との相互作用が起こる。すなわち、リガンド依存的相互作用は、ＰＰＡＲのリガンド存在下で促進されるＰＰＡＲと転写共役因子との結合である。
【００１４】
ＰＰＡＲとしては、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγなどのサブタイプが知られており、本発明においてはこれらサブタイプのいずれをも用いることができる。これらのうち、ＰＰＡＲγは、抗糖尿病作用を有するチアゾリジンジオン誘導体の標的分子でありこれに対する特異的作用薬を同定及びスクリーニングする方法は糖尿病治療薬の研究開発に有用である。
【００１５】
ＰＰＡＲは、同じ分子種として同定されるもので、核内レセプターとしての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のものなどが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好ましい。
【００１６】
ＰＰＡＲα（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Greenら、Nature、第347巻、第645-650頁、1990年、Goettlicherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、第4653-4657頁、1992年）、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Kliewerら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、Amriら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第2367-2371頁、1995年、Xingら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第217巻、第1015-1025頁、1995年）及び、ＰＰＡＲγ（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Zhuら、Jounal of Biological Chemistry、第268巻、第26817-26820頁、1993年、Kliewerら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、Mukherjeeら、Journal of Biological Chemistry、第272巻、第8071-8076頁、1997年、Elbrechtら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第224巻、第431-437頁、1996年、Chemら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第196巻、第671-677頁、1993年、Tontonozら、Genes & Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Aperloら、Gene、第162巻、第297-302頁、1995年）の遺伝子配列およびアミノ酸配列はすでに報告されている。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォームが存在し、 ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。
【００１７】
これらの報告の中で、他の核内受容体とのホモロジーなどから推定して、
ＰＰＡＲのリガンド結合領域（ligand binding domain：ＬＢＤ）は、ＰＰＡＲαの場合、Ｎ末端側から約１６７番目から４６８番目までのアミノ酸を含む領域に、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）の場合、Ｎ末端側から約１３８番目から４４０番目までのアミノ酸を含む領域に、そしてＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲγ２）の場合、Ｎ末端側から約１７４番目から４７５番目までのアミノ酸を含む領域に相当するものとされている。
【００１８】
ＰＰＡＲと転写共役因子（コアクチベーター）との相互作用検出のためには、少なくともリガンド結合領域含むポリペプチドを用いればよい。ＰＰＡＲのリガンド結合領域含むポリペプチドを切り出して用いることにより、非特異的な相互作用を排除できるので好ましい。
【００１９】
本発明に用いる転写共役因子（コアクチベーター）は、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用するもの、すなわち、ＰＰＡＲのリガンド存在下でＰＰＡＲとの相互作用が促進されるものであればよい。核内受容体と相互作用すると考えられている転写共役因子としては、例えば、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＲＩＰ１４０（Cavaillesら、EMBO Journal、第14巻、第3741-3751頁、1995年）、ＴＩＦ１（Douarinら、EMBO Journal、第14巻、第2020-2033頁、1995年、Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、第110-124頁、1996年）、ＴＩＦ２（Voegelら、EMBO Journal、第15巻、第3667-3675頁、1996年）、ＳＵＧ１（Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、第110-124頁、1996年）、Ｐ３００（Chakravartiら、Nature、第383巻、第99-103頁、1996年）などが挙げられ、これらはＰＰＡＲともリガンド依存的に相互作用することが期待できる。
【００２０】
これらのうち、ＣＢＰおよびＳＲＣ−１は、各々本明細書の後記実施例およびKreyらの報告に示された通り、ＰＰＡＲと相互作用することが確認されており、本発明に好適に使用することができる。
【００２１】
ＣＢＰ（CREB-binding protein）は、最初ＣＲＥ（cAMP-regulated enhancer）に結合する転写因子ＣＲＥＢ（cAMP-regulated enhancer binding protein）の共役転写因子（コアクティベーター）として同定された蛋白質であり、その遺伝子およびアミノ酸配列も知られている（Chriviaら、Nature、第365巻、第855-859頁、1993年；Kwokら、Nature、第370巻、第223-226頁）。最近、ＣＢＰは、ＣＲＥＢとのみならず、核内受容体ともリガンドの存在下で結合し共役転写因子として働くこと、また、ＣＢＰのＮ末端部分が核内受容体との相互作用に関与していることが明らかとなった（Kameiら、Cell、第85巻、第403-414頁、1995年）。ＣＢＰのＮ末端部分がＰＰＡＲγともリガンド依存的に相互作用することは、発明者らが独自に見いだした。
【００２２】
ＳＲＣ−１は、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）などの核内受容体とリガンド依存的に相互作用し、共役転写因子として働くことが知られており、その遺伝子およびアミノ酸配列も知られている（Onateら、Science、第270巻、第1354-1357頁、1995年）。また、Kreyらの報告（Molecular Endocrinology、第11巻、第779-791頁、1997年）で、アフリカツメガエル由来ＰＰＡＲのリガンド結合領域とＲＩ標識したＳＲＣ−１とを用いた実験により、ＰＰＡＲもリガンド依存的にＳＲＣ−１と相互作用することが示されている。
【００２３】
ＰＰＡＲとのリガンド依存的相互作用を検出する際には、転写共役因子全体を用いてもよいが、少なくともＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与する領域）を含むポリペプチドを用いることもできる。転写共役因子は一般に、分子量が大きく、その全体を使った場合には蛋白質の発現が困難となる場合があるので、この観点から適切な領域を選択して使用することが好ましい。
【００２４】
転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与する領域）は、
核内受容体との結合領域の位置が報告されていればその情報からＰＰＡＲ結合領域を推定することができる。また、蛋白-蛋白質間相互作用を検出する系（例えば酵母のtwo-hybrid システムなど）を用いて、ある領域とＰＰＡＲとの相互作用の有無を調べ、適切な領域を選択することができる。転写共役因子がＣＢＰの場合、そのＮ末端部分（約１番目から４５０番目までのアミノ酸を含む領域）付近にＰＰＡＲ結合領域が存在する。
【００２５】
本発明においては、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作用を試験用細胞内でレポーター遺伝子の発現を指標として検出し、被験物質によって起こる相互作用の変化を測定する。
【００２６】
ＰＰＡＲ及び転写共役因子の相互作用に着目しＰＰＡＲ自体の転写活性化作用を検出しないので、ＰＰＡＲの転写活性化能発現に関与する哺乳動物固有の種々の因子の存在を要しない。従って試験用細胞は、特に哺乳動物細胞を用いる必要がない。細胞は、真核細胞であればよく、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞などが挙げられる。これらのうち、酵母細胞は培養が容易で迅速に実施できる上、外来遺伝子の導入など遺伝子組換え技術を適用するのが容易である点で有利である。酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、チゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等、サッカロマイセス属、チゾサッカロマイセス属等に属する微生物の細胞株を用いることができる。
【００２７】
試験用細胞は、通常、外来のＰＰＡＲ及び転写共役因子を含むものが用いられる。内因性のＰＰＡＲやこれと相互作用する転写共役因子を有しない細胞を用いることは、内因性の要素による影響を排除できるので好ましい。
【００２８】
被験物質によって起こるＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用の変化は、two-hybrid システムを利用した方法で効率よく測定することができる。
【００２９】
Two-hybrid システムは、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白-蛋白質間相互作用を検出する方法である（米国特許第5283173、およびProc.Natl.Acad.Sci. USA、第88巻、第9578-9582頁、1991年）。多くの転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領域という異なる機能をもった２つの領域に分割できるが、two-hybridシステムでは、例えば２つの蛋白質XとYの相互作用を調べるために、２種類の融合蛋白質、すなわち、転写因子のDNA結合領域とXからなる融合蛋白質、および、転写因子の転写活性化領域とYからなる融合蛋白質を同時に酵母細胞内で発現させる。蛋白質XとYが相互作用する場合には両者の結合により、２種類の融合蛋白質が全体として１つの機能する転写複合体を形成し、細胞の核内において、応答配列（response element）（転写因子が特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現（例えば遺伝子産物の酵素活性など）により検出することが可能となる。
【００３０】
Two-hybrid システムは、通常、特定の蛋白質と相互作用する未知蛋白質の遺伝子同定などに用いられ、蛋白-蛋白質間相互作用の定性的な評価に用いられるのが一般的である。本発明者らは、このシステムを利用してＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用を十分な感度で定量測定し、定量的評価が必須となる受容体のアンタゴニスト／アゴニストの同定やスクリーニングにも適用できる方法を完成した。
【００３１】
本発明の一つの実施態様としては、
（ｉ）ＰＰＡＲの少なくともリガンド結合領域と転写因子の第一の領域からなる第一の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域のいずれかである、第一の融合遺伝子、
（ｉｉ）ＰＰＡＲと相互作用する転写共役因子の少なくともＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域からなる第二の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第二の領域は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合領域である場合には転写活性化領域であり、転写因子の第一の領域が転写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合領域である、第二の融合遺伝子、及び
（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子、を含む試験用細胞を用い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法が挙げられる。
【００３２】
この実施態様において、ＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用検出のために用いられる転写因子は、細胞内で転写活性化の機能を発揮し得る真核生物の転写因子（ＰＰＡＲ以外）であれば特に限定されないが、哺乳動物細胞由来の転写共役因子等の働きを必要とせず、単独で効率よく酵母細胞内でも転写活性化能を発揮するという観点から、酵母由来の転写因子を用いることが好ましい。
【００３３】
このような転写因子としては、例えば、酵母のＧＡＬ４蛋白質（Keeganら、Science、第231巻、第699-704頁、1986年、Maら、Cell、第48巻、第847-853頁、1987年）、ＧＣＮ４蛋白質（Hopeら、Cell、第46巻、第885-894頁、1986年）、ＡＤＲ１蛋白質（Thukralら、Molecular and Cellular Biology、第9巻、第2360-2369頁、1989年）などが挙げられる。
【００３４】
転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写活性化能を有しないものであればよい。また、転写因子の転写活性化領域は、転写活性化能は有するが、単独で応答配列に対するＤＮＡ結合能を有しないものであればよい。
【００３５】
転写因子のＤＮＡ結合領域および転写活性化領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側（およそ第７６８番目から８８１番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。また、ＧＣＮ４の場合、Ｃ末端側（およそ第２２８番目から２６５番目までのアミノ酸を含む領域）及びＮ末端側（およそ第１０７番目から１２５番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。また、ＡＤＲ１の場合、Ｎ末端側（およそ第７６番目から１７２番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側（およそ第２５０番目から１３２３番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。
【００３６】
応答配列は、転写因子に対応した応答配列を用いればよく、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列が用いられる。転写因子に対応する応答配列は、一般にその転写因子によって転写活性が制御される遺伝子の上流域に存在しているので、その領域を切り出して用いることができる。あるいはその配列が知られているのであれば、化学合成により対応するオリゴヌクレオチドを合成して用いてもよい。
【００３７】
例えば、転写因子としてＧＡＬ４を用いる場合、応答配列としては、ＵＡＳg（ガラクトース代謝遺伝子の上流域活性化部位：upstream activation site of galactose genes）と称されるＧＡＬ４特異的なＤＮＡ配列を用いることができる。ＵＡＳgは、ＧＡＬ１遺伝子等ガラクトース代謝遺伝子の上流域に含まれるので、これらの領域を用いることができる。あるいは、ＵＡＳgに相当する塩基配列を、化学合成して用いてもよい。
【００３８】
応答配列の下流に配置されるレポータ遺伝子は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、安定でかつ活性の定量的測定が容易な酵素の遺伝子などを用いることが好ましい。このようなレポータ遺伝子としては、例えば、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）等があげられる。このうち大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は、発色基質を用いて可視光で容易に測定可能である点で好ましい。レポータ遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するものであってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来のものと置き換えられたものを用いることもできる。レポータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されていればよい。
【００３９】
第一の融合蛋白質は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域と転写因子の第一の領域（ＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域）を含み、第二の融合蛋白質は、転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域（転写活性化領域又はＤＮＡ結合領域）を含む。融合蛋白質を構成する二種の領域はいずれが上流域に配置されていてもよい。融合蛋白質は、その必要機能を損なわない範囲で付加的な構成、あるいは配列などの欠失や置換を有していてもよい。
【００４０】
転写因子の第一及び第二の領域は、両者が一体となってはじめて応答配列と結合し遺伝子の転写を活性化する機能を果たすものである。このためには、第一の領域をＤＮＡ結合領域とした場合には、第二の領域は転写活性化領域とし、第一の領域を転写活性化領域とした場合には、第二の領域はＤＮＡ結合領域とする必要がある。第一及び第二の領域は、両者が一体となった時に機能を果たすものであれば、必ずしも同一の転写因子に由来するものである必要はなく、異なる転写因子に由来するものであってもよい。
【００４１】
第一及び第二の融合蛋白質をコードする融合遺伝子は通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計し構築することができる。第一及び第二の融合蛋白質を構成するＰＰＡＲのリガンド結合領域、転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域、転写因子のＤＮＡ結合領域、及び転写因子の転写活性化領域をコードするＤＮＡは、例えば、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や合成プローブを用いるスクリーニングなどにより、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離することができる。これら各領域をコードするＤＮＡを連結し、これを適当なプロモーターの下流に連結することによりすることにより融合遺伝子を構築できる。各領域及びこれをコードするＤＮＡは、必要な機能を損なわれない範囲で配列上の付加・欠失・置換などが導入されていてもよい。
【００４２】
得られた第一及び第二の融合遺伝子は、適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すればよい。第一および第二の融合遺伝子は、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成してもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよう構成してもよい。
【００４３】
応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子もまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計、構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入すればよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
【００４４】
すべての構成を含む試験用細胞は、例えば、応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた宿主細胞に、第一及び第二の融合遺伝子を含む一つ又は二つのプラスミドを導入することにより取得できる。
【００４５】
かくして得られた試験用細胞を、例えば被験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現によりＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用を検出し測定する。被験物質がＰＰＡＲと結合し、その結合に依存して転写共役因子との相互作用が生じるとき、レポーター活性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアゴニストとして同定される。また、例えば被験物質がＰＰＡＲと結合するが転写共役因子との相互作用を促進しないとき、真のリガンドあるいはアゴニストとして同定された薬物と共に系に加えると、真のリガンドあるいはアゴニストによって発現するレポーター活性の減少が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアンタゴニストとして同定される。
【００４６】
本発明のうちＣＢＰとのリガンド依存的な相互作用を検出し、該相互作用に対する被験物質の作用を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、例えば、ＰＰＡＲとＣＢＰとのリガンド依存的相互作用を、直接測定する方法がある。このような方法では、例えばＲＩなどで標識したＣＢＰもしくはそのＰＰＡＲ結合領域を用い、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲのリガンド結合領域からなる融合タンパク質との結合を被験物質の存在下で直接的に検出することで実施できる。
【００４７】
本発明の方法により、例えばＰＰＡＲγに対する作用薬のスクリーニングを行うことができる。ＰＰＡＲγのリガンドとしては、種々のチアゾリジンジオン誘導体が同定されている他、アラキドン酸代謝物の一つであるプロスタグランジン類の15d-PGJ2（15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2）が真のリガンドであると考えられている（Cell、第83巻、第803-812頁および第813-819頁、1995年）。従って、ＰＰＡＲγに対するアゴニストの同定やスクリーニングの際には、15d-PGJ2を陽性コントロールとして用いることができる。また、15d-PGJ2によるリガンド依存的相互作用の発現に対する阻害の有無を調べることにより、ＰＰＡＲγに対するアンタゴニストの同定やスクリーニングを実施することができる。
【００４８】
ＰＰＡＲγのアゴニストは、優れた血糖降下作用を有する糖尿病治療薬として期待される。また、ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分化誘導因子であることから、ＰＰＡＲγのアンタゴニストは抗肥満薬としての作用を有することが期待される。
【００４９】
また、ＰＰＡＲγに対する作用薬のスクリーニングの際には、他のサブタイプ、すなわち、ＰＰＡＲαやＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）に対する作用も検定することにより、ＰＰＡＲγに対する選択性の高い薬物を選別することができる。
【００５０】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００５１】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular Cloning」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００５２】
【実施例】
実施例１ ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築
（１）ＰＰＡＲγ２及びＣＢＰの遺伝子の単離
ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織由来のcDNAライブラリー（Clontech社製）からPCR法によって取得した。PCRには以下の後記配列表の配列番号１及び２に示したプライマーを用いた。これらプライマーは、遺伝子データベースGenbankのAccession番号D83233に記載されたヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するための制限酵素認識部位を付加した。得られた1574塩基対断片は開始コドンの前にSmaI認識部位、終止コドンの後にXhoI認識部位を有しており、完全長のヒトＰＰＡＲγ2をコードしている。
【００５３】
ＣＢＰのN末端部分のｃＤＮＡを、マウス脂肪細胞から調製したRNAから逆転写反応により選られたcDNAから、PCR法によって取得した。PCRには以下の後記配列表の配列番号３及び４に示したプライマーを用いた。これらプライマーは、Chriviaらの文献（Nature、第365巻、第855-859頁、1993年）に記載されたヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部位を付加した。得られた1411塩基対断片は開始コドンの前にBamHI認識部位、C末端にBglII認識部位を有しており、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸をコードしている。
【００５４】
（２）ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築
上記（１）で得られた1574塩基対のＰＰＡＲγ２遺伝子を、その末端に設計したXhoI認識部位と塩基配列中に存在するBamHI認識部位にて切断した。得られた断片を、転写因子GAL4のDNA結合領域（GAL4の１から１４７番目のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGBT9（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）のBamHI-SalI部位に挿入した。これにより、ヒトＰＰＡＲγ2の181番目のアミノ酸残基以降の部分（リガンド結合領域）とGAL4のDNA結合領域との融合タンパク質を発現するためのプラスミドpGBT9-PPARγ2（図１Ａ）を得た。
【００５５】
（３）ＣＢＰのＮ末端領域（ＰＰＡＲ結合領域）とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築
上記（１）で得られた1411塩基対のＣＢＰ遺伝子（Ｎ末端領域）を、その末端に設計したBamHI認識部位とBglII認識部位にて切断した。得られた断片を、GAL4の転写活性化領域（GAL4の７６８から８８１番目のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGAD424（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）のBamHI-BglII部位に挿入した。これにより、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸残基までの部分（Ｎ末端領域）とGAL4の転写活性化部位との融合蛋白質を発現するためのプラスミドpGAD424-CBP（図１Ｂ）を得た。
【００５６】
（４）酵母の形質転換
酵母細胞株SFY526（Clontech社製）を用い、これに、上記（２）及び（３）で得られた融合蛋白質発現プラスミドpGBT9-PPARγ2及びpGAD424-CBPを導入した。細胞株SFY526（ゲノタイプは、MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, canr, gal4-542, gal80-538, URA3::GAL1-lacZ）は、GAL1とlacZの融合遺伝子が染色体に組込まれており、GAL4遺伝子の欠損変異を有している細胞株である（Bartelら、Bio Techniques、第14巻、第920-924頁、1993年）。形質転換は、酢酸リチウム法により行い、それぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた合成培地にて培養することにより選別を行って、それぞれのプラスミドの一方のみが導入された形質転換株及び両プラスミドが導入された形質転換株を得た。
【００５７】
（５）ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用の検出
上記（４）で得たpGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を、YPD培地（液体培地）で培養した。培養の際、培地中に、ＰＰＡＲγ2の生体内でのリガンドである15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2をYPD培地で希釈したものを添加（もしくは無添加）した。15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2（以下15d-PGJ2と略す）は、市販品（CAYMAN CHEMICAL社製、USA）を用いた。培養は４〜５時間行った。培養後、酵母菌体を遠心分離により回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【００５８】
その結果、15d-PGJ2を培地中に加えたことによりpGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母でβ-ガラクトシダーゼ活性（ＬａｃＺ遺伝子発現）の増大が観察された（図２Ａ）。また、このような 15d-PGJ2によるβ-ガラクトシダーゼ活性の増大は、15d-PGJ2の濃度に依存して認められた（図２Ｂ）。これらは、リガンド15d-PGJ2の存在によってＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用がおこったことによると考えられ、この結果から、ＣＢＰのＮ末端領域はＰＰＡＲと相互作用することが明らかとなった。また、この系でＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出・測定できるものと考えられた。
【００５９】
次に、被験薬物として、次式
【００６０】
【化１】
【００６１】
で示されるチアゾリジンジオン誘導体Ｔ−１７４（化学名：５−〔〔２−（２−ナフタレニルメチル）−５−ベンゾオキサゾリル〕メチル〕−２，４−チアゾリジンジオン）を用い、ＰＰＡＲγに対する作用を調べた。
【００６２】
前記と同様にして、pGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を培養した。但し、培養の際、培地中には15d-PGJ2にかえて、被験薬物としてＴ−１７４を添加した。Ｔ−１７４は、特開昭６４−５６６７５（実施例４９）記載の方法に準じて合成したものを用いた。
【００６３】
その結果、pGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母でのみβ-ガラクトシダーゼ活性の上昇が観察され（図３Ａ）、その作用はＴ−１７４の濃度に依存した（図３Ｂ）。このように、Ｔ−１７４の存在によりＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出されたことから、Ｔ−１７４は、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用するアゴニストであると同定された。
【００６４】
Ｔ−１７４は、マウスの病態モデル（KK-Aγマウス）において、血糖降下作用を示すことが知られている（特開昭６４−５６６７５及び特開平０２−１６７２２５）。その作用点は明らかではなかったが、上記の結果から、Ｔ−１７４の作用標的分子はＰＰＡＲγであることがわかった。
【００６５】
実施例２ ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築
ＳＲＣ−１の全領域のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織から調製したcDNAライブラリーから、PCR法によって取得する。プライマーは、Onateらの文献（Science、第270巻、第1354-1357頁、1995年）に記載されたヒトＳＲＣ−１の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部位を付加する。
【００６６】
これをＣＢＰのｃＤＮＡにかえて用い、前記実施例１（２）及び（３）と同様にして、ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGBT9に、ＳＲＣ−１のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGAD424に各々挿入して、ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター、及びＳＲＣ−１の全領域とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現ベクターを構築する。
【００６７】
得られる二種の融合蛋白質発現プラスミドを前記実施例１（４）と同様にして、GAL1とlacZの融合遺伝子が染色体に組込まれていてGAL4遺伝子の欠損変異を有している酵母細胞株SFY526に導入する。
【００６８】
得られた形質転換株を用いて、前記実施例１（５）と同様にして、ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガンド依存的相互作用を検出する。
【００６９】
【発明の効果】
細胞内でのＰＰＡＲの転写活性化能を検出する従来のＰＰＡＲ作用薬の同定方法では、細胞内因性の共役転写因子やＲＸＲなどの関与を受けるが、本発明の方法では、これらの関与がないので、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できる。また、本発明の方法は、哺乳動物細胞を用いる必要がなく、酵母細胞を用いることもできるので、培養操作が容易かつ迅速に行える。さらに、放射性同位元素標識した被験化合物や蛋白質を用いる必要もないので、安全かつ簡便である。
【００７０】
本発明の方法によれば、多数の被験物質を同時に処理することが可能で、しかも十分な感度と定量性があるので、ＰＰＡＲのアゴニスト及びアンタゴニストの同定及びスクリーニングを効率よく良く行うことができる。
【００７１】
【配列表】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 使用したプラスミドｐＧＢＴ９−ＰＰＡＲγ２及びｐＧＡＤ４２４−ＣＢＰの構成を示す模式図。
【図２】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰのリガンド依存的相互作用を示した図。
【図３】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰの相互作用に対するＴ−１７４の作用を示した図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の新規なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動植物の細胞中に見られる小器官であるペルオキシソームは、コレステロールなどの脂質代謝や吸収に関与する酵素群を含む。ペルオキシソームの増加は食餌や生理的な要因によっても惹起されるが、抗脂血薬（フィブレート類）、殺虫剤及びフタル酸類の可塑剤などを含む構造的に多様な化合物群は、その投与により肝臓や腎臓のペルオキシソームの大きさと数を劇的に増加させると同時に、β−酸化サイクルに必要とされる酵素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能を高めることが知られており、ペルオキシソームプロリフェレータ（peroxisome proliferator）と呼ばれる。このようなペルオキシソーム増加のメカニズムに関する研究の中から、これら化合物群によって活性化される核内受容体が同定されペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（peroxisome proliferator activated receptor：ＰＰＡＲ）と名づけられた。
【０００３】
ＰＰＡＲは、その構造などから核内受容体（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考えられている。他の核内受容体と同様、リガンドとの結合により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配列（ＰＰＲＥ：peroxisome proliferator response element）に結合して標的遺伝子の転写を活性化する。ＰＰＡＲは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ：retinoid X receptor）とヘテロダイマーを形成し、このヘテロダイマーの形でＰＰＲＥに結合することが知られており、また、他の核内受容体と同様、その転写活性化作用を発揮するためには共役転写因子（コアクチベータ）群との相互作用が必要であると考えられている。
【０００４】
これまで、 ＰＰＡＲα、 ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγと称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、それらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている（Lembergerら、Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.、第12巻、第335-363頁、1996年）。これら３種のうち、ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている(Tontonozら、Genes and Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Tontonozら、Cell、第79巻、第1147-1156頁、1994年)。
【０００５】
一方、種々のチアゾリジンジオン誘導体は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM：non-insulin-dependent diabetes melitus)のモデル動物で血糖降下作用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいNIDDM治療薬として期待されている。これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用しＰＰＡＲγを特異的に活性化することが、最近の研究で明らかとなった（Lehmannら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年）。このようなチアゾリジンジオン誘導体のＰＰＡＲγ活性化能と遺伝性肥満マウスにおける血糖低下作用には強い相関が見られることから、ＰＰＡＲγがチアゾリジンジオン誘導体の薬理作用の標的分子であろうと考えられている（Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年）。このことはＰＰＡＲγの特異的発現の場である脂肪組織が、エネルギーバランス維持に重要な役割を果たす臓器であることとも関連付けられ、これらの知見から、ＰＰＡＲγのアゴニストとして特異的に作用する化合物は、糖尿病治療薬として非常に有効であると考えられている。
【０００６】
しかしながら、現在までのところ、ＰＰＡＲ作用薬のスクリーニング方法として知られているものは、いずれも操作が煩雑で多検体の同時処理が難しいという問題点を有する。
【０００７】
例えば、ＰＰＡＲ発現ベクターおよびＰＰＡＲの応答配列（ＰＰＲＥ）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用い、この細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の変化を指標として検体のＰＰＡＲ活性化能を調べる方法が知られている（WO 96/22884、 Tontonozら、Genes and Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年）。また、その改良法として、酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結合させた融合蛋白質発現用のベクター、及びＧＡＬ４の応答配列（GAL4 binding element）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用いる方法が知られている（WO 96/9633724、 Lehmannら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年、 Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年）。これらの方法では動物細胞に外来遺伝子を導入するが、遺伝子導入に際して染色体への組込みが起こるとその組み込まれた部位の影響を受ける場合があるため、遺伝子が染色体の影響を受けない形質転換細胞を用いる必要がある。このような形質転換動物細胞を取得し外来遺伝子を安定して発現させることは技術的な困難を伴う。また、これら方法における転写活性化には、宿主動物細胞由来の共役転写因子やＲＸＲなどが関与すると考えられるため、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できない可能性がある。
【０００８】
また、動物細胞やレポータ遺伝子を使わずに直接ＰＰＡＲとリガンドとの結合を検出する方法としては、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質と、放射性同位元素で標識した被験化合物との結合および拮抗を調べる方法が知られている （Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996年、Buckleら、Bioorganic & Medical Chemistry Letters、第6巻、第2121-2126頁、1996年）。また、最近、他の核内受容体ＲＸＲなどと同様に、ＰＰＡＲも、転写共役因子の一つであるＳＲＣ−１とリガンド依存的に相互作用することが明らかにされ、この知見をもとに、Kreyらは、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質と放射性同位元素で標識したＳＲＣ−１とを用いて、被験化合物のリガンドとしての作用を検出する方法を報告している（Kreyら、Molecular Endocrinology、第11巻、第779-791頁、1997年）。しかし、これら方法は、いずれも放射性同位元素による標識を用いるため危険を伴うし、標識した化合物や転写共役因子の大量調製は困難であるので処理能力にも限界がある。
【０００９】
以上のように、 ＰＰＡＲ作用薬のスクリーニングを行うにあたり、簡便かつ精度のよい効率的なスクリーニング方法が望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の新規な同定方法およびスクリーニング方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、転写共役因子群のうち既にＰＰＡＲと相互作用することが知られているＳＲＣ−１のほか、ＣＢＰ（CREB-binding protein）もＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用することを独自に見出すとともに、共役転写因子のＰＰＡＲとの結合領域を同定した。さらに、これらの知見をもとにして、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用を、酵母のTwo-hybridシステムを利用した方法で検出する新しいＰＰＡＲ作用薬の同定およびスクリーニング方法を完成するにいたった。
【００１２】
すなわち、本発明は、
試験用細胞を被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明においては、試験用細胞内でのＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作用を検出する。ＰＰＡＲは、リガンドと結合することにより活性型にコンフォメーションが変化して転写共役因子との相互作用が起こる。すなわち、リガンド依存的相互作用は、ＰＰＡＲのリガンド存在下で促進されるＰＰＡＲと転写共役因子との結合である。
【００１４】
ＰＰＡＲとしては、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγなどのサブタイプが知られており、本発明においてはこれらサブタイプのいずれをも用いることができる。これらのうち、ＰＰＡＲγは、抗糖尿病作用を有するチアゾリジンジオン誘導体の標的分子でありこれに対する特異的作用薬を同定及びスクリーニングする方法は糖尿病治療薬の研究開発に有用である。
【００１５】
ＰＰＡＲは、同じ分子種として同定されるもので、核内レセプターとしての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のものなどが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好ましい。
【００１６】
ＰＰＡＲα（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Greenら、Nature、第347巻、第645-650頁、1990年、Goettlicherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、第4653-4657頁、1992年）、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Kliewerら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、Amriら、Journal of Biological Chemistry、第270巻、第2367-2371頁、1995年、Xingら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第217巻、第1015-1025頁、1995年）及び、ＰＰＡＲγ（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Zhuら、Jounal of Biological Chemistry、第268巻、第26817-26820頁、1993年、Kliewerら、Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、Mukherjeeら、Journal of Biological Chemistry、第272巻、第8071-8076頁、1997年、Elbrechtら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第224巻、第431-437頁、1996年、Chemら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第196巻、第671-677頁、1993年、Tontonozら、Genes & Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Aperloら、Gene、第162巻、第297-302頁、1995年）の遺伝子配列およびアミノ酸配列はすでに報告されている。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォームが存在し、 ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。
【００１７】
これらの報告の中で、他の核内受容体とのホモロジーなどから推定して、
ＰＰＡＲのリガンド結合領域（ligand binding domain：ＬＢＤ）は、ＰＰＡＲαの場合、Ｎ末端側から約１６７番目から４６８番目までのアミノ酸を含む領域に、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）の場合、Ｎ末端側から約１３８番目から４４０番目までのアミノ酸を含む領域に、そしてＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲγ２）の場合、Ｎ末端側から約１７４番目から４７５番目までのアミノ酸を含む領域に相当するものとされている。
【００１８】
ＰＰＡＲと転写共役因子（コアクチベーター）との相互作用検出のためには、少なくともリガンド結合領域含むポリペプチドを用いればよい。ＰＰＡＲのリガンド結合領域含むポリペプチドを切り出して用いることにより、非特異的な相互作用を排除できるので好ましい。
【００１９】
本発明に用いる転写共役因子（コアクチベーター）は、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用するもの、すなわち、ＰＰＡＲのリガンド存在下でＰＰＡＲとの相互作用が促進されるものであればよい。核内受容体と相互作用すると考えられている転写共役因子としては、例えば、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＲＩＰ１４０（Cavaillesら、EMBO Journal、第14巻、第3741-3751頁、1995年）、ＴＩＦ１（Douarinら、EMBO Journal、第14巻、第2020-2033頁、1995年、Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、第110-124頁、1996年）、ＴＩＦ２（Voegelら、EMBO Journal、第15巻、第3667-3675頁、1996年）、ＳＵＧ１（Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、第110-124頁、1996年）、Ｐ３００（Chakravartiら、Nature、第383巻、第99-103頁、1996年）などが挙げられ、これらはＰＰＡＲともリガンド依存的に相互作用することが期待できる。
【００２０】
これらのうち、ＣＢＰおよびＳＲＣ−１は、各々本明細書の後記実施例およびKreyらの報告に示された通り、ＰＰＡＲと相互作用することが確認されており、本発明に好適に使用することができる。
【００２１】
ＣＢＰ（CREB-binding protein）は、最初ＣＲＥ（cAMP-regulated enhancer）に結合する転写因子ＣＲＥＢ（cAMP-regulated enhancer binding protein）の共役転写因子（コアクティベーター）として同定された蛋白質であり、その遺伝子およびアミノ酸配列も知られている（Chriviaら、Nature、第365巻、第855-859頁、1993年；Kwokら、Nature、第370巻、第223-226頁）。最近、ＣＢＰは、ＣＲＥＢとのみならず、核内受容体ともリガンドの存在下で結合し共役転写因子として働くこと、また、ＣＢＰのＮ末端部分が核内受容体との相互作用に関与していることが明らかとなった（Kameiら、Cell、第85巻、第403-414頁、1995年）。ＣＢＰのＮ末端部分がＰＰＡＲγともリガンド依存的に相互作用することは、発明者らが独自に見いだした。
【００２２】
ＳＲＣ−１は、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）などの核内受容体とリガンド依存的に相互作用し、共役転写因子として働くことが知られており、その遺伝子およびアミノ酸配列も知られている（Onateら、Science、第270巻、第1354-1357頁、1995年）。また、Kreyらの報告（Molecular Endocrinology、第11巻、第779-791頁、1997年）で、アフリカツメガエル由来ＰＰＡＲのリガンド結合領域とＲＩ標識したＳＲＣ−１とを用いた実験により、ＰＰＡＲもリガンド依存的にＳＲＣ−１と相互作用することが示されている。
【００２３】
ＰＰＡＲとのリガンド依存的相互作用を検出する際には、転写共役因子全体を用いてもよいが、少なくともＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与する領域）を含むポリペプチドを用いることもできる。転写共役因子は一般に、分子量が大きく、その全体を使った場合には蛋白質の発現が困難となる場合があるので、この観点から適切な領域を選択して使用することが好ましい。
【００２４】
転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与する領域）は、
核内受容体との結合領域の位置が報告されていればその情報からＰＰＡＲ結合領域を推定することができる。また、蛋白-蛋白質間相互作用を検出する系（例えば酵母のtwo-hybrid システムなど）を用いて、ある領域とＰＰＡＲとの相互作用の有無を調べ、適切な領域を選択することができる。転写共役因子がＣＢＰの場合、そのＮ末端部分（約１番目から４５０番目までのアミノ酸を含む領域）付近にＰＰＡＲ結合領域が存在する。
【００２５】
本発明においては、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作用を試験用細胞内でレポーター遺伝子の発現を指標として検出し、被験物質によって起こる相互作用の変化を測定する。
【００２６】
ＰＰＡＲ及び転写共役因子の相互作用に着目しＰＰＡＲ自体の転写活性化作用を検出しないので、ＰＰＡＲの転写活性化能発現に関与する哺乳動物固有の種々の因子の存在を要しない。従って試験用細胞は、特に哺乳動物細胞を用いる必要がない。細胞は、真核細胞であればよく、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞などが挙げられる。これらのうち、酵母細胞は培養が容易で迅速に実施できる上、外来遺伝子の導入など遺伝子組換え技術を適用するのが容易である点で有利である。酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、チゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等、サッカロマイセス属、チゾサッカロマイセス属等に属する微生物の細胞株を用いることができる。
【００２７】
試験用細胞は、通常、外来のＰＰＡＲ及び転写共役因子を含むものが用いられる。内因性のＰＰＡＲやこれと相互作用する転写共役因子を有しない細胞を用いることは、内因性の要素による影響を排除できるので好ましい。
【００２８】
被験物質によって起こるＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用の変化は、two-hybrid システムを利用した方法で効率よく測定することができる。
【００２９】
Two-hybrid システムは、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白-蛋白質間相互作用を検出する方法である（米国特許第5283173、およびProc.Natl.Acad.Sci. USA、第88巻、第9578-9582頁、1991年）。多くの転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領域という異なる機能をもった２つの領域に分割できるが、two-hybridシステムでは、例えば２つの蛋白質XとYの相互作用を調べるために、２種類の融合蛋白質、すなわち、転写因子のDNA結合領域とXからなる融合蛋白質、および、転写因子の転写活性化領域とYからなる融合蛋白質を同時に酵母細胞内で発現させる。蛋白質XとYが相互作用する場合には両者の結合により、２種類の融合蛋白質が全体として１つの機能する転写複合体を形成し、細胞の核内において、応答配列（response element）（転写因子が特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現（例えば遺伝子産物の酵素活性など）により検出することが可能となる。
【００３０】
Two-hybrid システムは、通常、特定の蛋白質と相互作用する未知蛋白質の遺伝子同定などに用いられ、蛋白-蛋白質間相互作用の定性的な評価に用いられるのが一般的である。本発明者らは、このシステムを利用してＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用を十分な感度で定量測定し、定量的評価が必須となる受容体のアンタゴニスト／アゴニストの同定やスクリーニングにも適用できる方法を完成した。
【００３１】
本発明の一つの実施態様としては、
（ｉ）ＰＰＡＲの少なくともリガンド結合領域と転写因子の第一の領域からなる第一の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域のいずれかである、第一の融合遺伝子、
（ｉｉ）ＰＰＡＲと相互作用する転写共役因子の少なくともＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域からなる第二の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第二の領域は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合領域である場合には転写活性化領域であり、転写因子の第一の領域が転写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合領域である、第二の融合遺伝子、及び
（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子、を含む試験用細胞を用い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法が挙げられる。
【００３２】
この実施態様において、ＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用検出のために用いられる転写因子は、細胞内で転写活性化の機能を発揮し得る真核生物の転写因子（ＰＰＡＲ以外）であれば特に限定されないが、哺乳動物細胞由来の転写共役因子等の働きを必要とせず、単独で効率よく酵母細胞内でも転写活性化能を発揮するという観点から、酵母由来の転写因子を用いることが好ましい。
【００３３】
このような転写因子としては、例えば、酵母のＧＡＬ４蛋白質（Keeganら、Science、第231巻、第699-704頁、1986年、Maら、Cell、第48巻、第847-853頁、1987年）、ＧＣＮ４蛋白質（Hopeら、Cell、第46巻、第885-894頁、1986年）、ＡＤＲ１蛋白質（Thukralら、Molecular and Cellular Biology、第9巻、第2360-2369頁、1989年）などが挙げられる。
【００３４】
転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写活性化能を有しないものであればよい。また、転写因子の転写活性化領域は、転写活性化能は有するが、単独で応答配列に対するＤＮＡ結合能を有しないものであればよい。
【００３５】
転写因子のＤＮＡ結合領域および転写活性化領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側（およそ第７６８番目から８８１番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。また、ＧＣＮ４の場合、Ｃ末端側（およそ第２２８番目から２６５番目までのアミノ酸を含む領域）及びＮ末端側（およそ第１０７番目から１２５番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。また、ＡＤＲ１の場合、Ｎ末端側（およそ第７６番目から１７２番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側（およそ第２５０番目から１３２３番目までのアミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。
【００３６】
応答配列は、転写因子に対応した応答配列を用いればよく、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列が用いられる。転写因子に対応する応答配列は、一般にその転写因子によって転写活性が制御される遺伝子の上流域に存在しているので、その領域を切り出して用いることができる。あるいはその配列が知られているのであれば、化学合成により対応するオリゴヌクレオチドを合成して用いてもよい。
【００３７】
例えば、転写因子としてＧＡＬ４を用いる場合、応答配列としては、ＵＡＳg（ガラクトース代謝遺伝子の上流域活性化部位：upstream activation site of galactose genes）と称されるＧＡＬ４特異的なＤＮＡ配列を用いることができる。ＵＡＳgは、ＧＡＬ１遺伝子等ガラクトース代謝遺伝子の上流域に含まれるので、これらの領域を用いることができる。あるいは、ＵＡＳgに相当する塩基配列を、化学合成して用いてもよい。
【００３８】
応答配列の下流に配置されるレポータ遺伝子は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、安定でかつ活性の定量的測定が容易な酵素の遺伝子などを用いることが好ましい。このようなレポータ遺伝子としては、例えば、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）等があげられる。このうち大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は、発色基質を用いて可視光で容易に測定可能である点で好ましい。レポータ遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するものであってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来のものと置き換えられたものを用いることもできる。レポータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されていればよい。
【００３９】
第一の融合蛋白質は、ＰＰＡＲのリガンド結合領域と転写因子の第一の領域（ＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域）を含み、第二の融合蛋白質は、転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域（転写活性化領域又はＤＮＡ結合領域）を含む。融合蛋白質を構成する二種の領域はいずれが上流域に配置されていてもよい。融合蛋白質は、その必要機能を損なわない範囲で付加的な構成、あるいは配列などの欠失や置換を有していてもよい。
【００４０】
転写因子の第一及び第二の領域は、両者が一体となってはじめて応答配列と結合し遺伝子の転写を活性化する機能を果たすものである。このためには、第一の領域をＤＮＡ結合領域とした場合には、第二の領域は転写活性化領域とし、第一の領域を転写活性化領域とした場合には、第二の領域はＤＮＡ結合領域とする必要がある。第一及び第二の領域は、両者が一体となった時に機能を果たすものであれば、必ずしも同一の転写因子に由来するものである必要はなく、異なる転写因子に由来するものであってもよい。
【００４１】
第一及び第二の融合蛋白質をコードする融合遺伝子は通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計し構築することができる。第一及び第二の融合蛋白質を構成するＰＰＡＲのリガンド結合領域、転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域、転写因子のＤＮＡ結合領域、及び転写因子の転写活性化領域をコードするＤＮＡは、例えば、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や合成プローブを用いるスクリーニングなどにより、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離することができる。これら各領域をコードするＤＮＡを連結し、これを適当なプロモーターの下流に連結することによりすることにより融合遺伝子を構築できる。各領域及びこれをコードするＤＮＡは、必要な機能を損なわれない範囲で配列上の付加・欠失・置換などが導入されていてもよい。
【００４２】
得られた第一及び第二の融合遺伝子は、適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すればよい。第一および第二の融合遺伝子は、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成してもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよう構成してもよい。
【００４３】
応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子もまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計、構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入すればよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
【００４４】
すべての構成を含む試験用細胞は、例えば、応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた宿主細胞に、第一及び第二の融合遺伝子を含む一つ又は二つのプラスミドを導入することにより取得できる。
【００４５】
かくして得られた試験用細胞を、例えば被験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現によりＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用を検出し測定する。被験物質がＰＰＡＲと結合し、その結合に依存して転写共役因子との相互作用が生じるとき、レポーター活性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアゴニストとして同定される。また、例えば被験物質がＰＰＡＲと結合するが転写共役因子との相互作用を促進しないとき、真のリガンドあるいはアゴニストとして同定された薬物と共に系に加えると、真のリガンドあるいはアゴニストによって発現するレポーター活性の減少が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアンタゴニストとして同定される。
【００４６】
本発明のうちＣＢＰとのリガンド依存的な相互作用を検出し、該相互作用に対する被験物質の作用を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、例えば、ＰＰＡＲとＣＢＰとのリガンド依存的相互作用を、直接測定する方法がある。このような方法では、例えばＲＩなどで標識したＣＢＰもしくはそのＰＰＡＲ結合領域を用い、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲのリガンド結合領域からなる融合タンパク質との結合を被験物質の存在下で直接的に検出することで実施できる。
【００４７】
本発明の方法により、例えばＰＰＡＲγに対する作用薬のスクリーニングを行うことができる。ＰＰＡＲγのリガンドとしては、種々のチアゾリジンジオン誘導体が同定されている他、アラキドン酸代謝物の一つであるプロスタグランジン類の15d-PGJ2（15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2）が真のリガンドであると考えられている（Cell、第83巻、第803-812頁および第813-819頁、1995年）。従って、ＰＰＡＲγに対するアゴニストの同定やスクリーニングの際には、15d-PGJ2を陽性コントロールとして用いることができる。また、15d-PGJ2によるリガンド依存的相互作用の発現に対する阻害の有無を調べることにより、ＰＰＡＲγに対するアンタゴニストの同定やスクリーニングを実施することができる。
【００４８】
ＰＰＡＲγのアゴニストは、優れた血糖降下作用を有する糖尿病治療薬として期待される。また、ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分化誘導因子であることから、ＰＰＡＲγのアンタゴニストは抗肥満薬としての作用を有することが期待される。
【００４９】
また、ＰＰＡＲγに対する作用薬のスクリーニングの際には、他のサブタイプ、すなわち、ＰＰＡＲαやＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）に対する作用も検定することにより、ＰＰＡＲγに対する選択性の高い薬物を選別することができる。
【００５０】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００５１】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular Cloning」［Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００５２】
【実施例】
実施例１ ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築
（１）ＰＰＡＲγ２及びＣＢＰの遺伝子の単離
ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織由来のcDNAライブラリー（Clontech社製）からPCR法によって取得した。PCRには以下の後記配列表の配列番号１及び２に示したプライマーを用いた。これらプライマーは、遺伝子データベースGenbankのAccession番号D83233に記載されたヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するための制限酵素認識部位を付加した。得られた1574塩基対断片は開始コドンの前にSmaI認識部位、終止コドンの後にXhoI認識部位を有しており、完全長のヒトＰＰＡＲγ2をコードしている。
【００５３】
ＣＢＰのN末端部分のｃＤＮＡを、マウス脂肪細胞から調製したRNAから逆転写反応により選られたcDNAから、PCR法によって取得した。PCRには以下の後記配列表の配列番号３及び４に示したプライマーを用いた。これらプライマーは、Chriviaらの文献（Nature、第365巻、第855-859頁、1993年）に記載されたヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部位を付加した。得られた1411塩基対断片は開始コドンの前にBamHI認識部位、C末端にBglII認識部位を有しており、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸をコードしている。
【００５４】
（２）ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築
上記（１）で得られた1574塩基対のＰＰＡＲγ２遺伝子を、その末端に設計したXhoI認識部位と塩基配列中に存在するBamHI認識部位にて切断した。得られた断片を、転写因子GAL4のDNA結合領域（GAL4の１から１４７番目のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGBT9（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）のBamHI-SalI部位に挿入した。これにより、ヒトＰＰＡＲγ2の181番目のアミノ酸残基以降の部分（リガンド結合領域）とGAL4のDNA結合領域との融合タンパク質を発現するためのプラスミドpGBT9-PPARγ2（図１Ａ）を得た。
【００５５】
（３）ＣＢＰのＮ末端領域（ＰＰＡＲ結合領域）とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築
上記（１）で得られた1411塩基対のＣＢＰ遺伝子（Ｎ末端領域）を、その末端に設計したBamHI認識部位とBglII認識部位にて切断した。得られた断片を、GAL4の転写活性化領域（GAL4の７６８から８８１番目のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGAD424（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）のBamHI-BglII部位に挿入した。これにより、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸残基までの部分（Ｎ末端領域）とGAL4の転写活性化部位との融合蛋白質を発現するためのプラスミドpGAD424-CBP（図１Ｂ）を得た。
【００５６】
（４）酵母の形質転換
酵母細胞株SFY526（Clontech社製）を用い、これに、上記（２）及び（３）で得られた融合蛋白質発現プラスミドpGBT9-PPARγ2及びpGAD424-CBPを導入した。細胞株SFY526（ゲノタイプは、MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, canr, gal4-542, gal80-538, URA3::GAL1-lacZ）は、GAL1とlacZの融合遺伝子が染色体に組込まれており、GAL4遺伝子の欠損変異を有している細胞株である（Bartelら、Bio Techniques、第14巻、第920-924頁、1993年）。形質転換は、酢酸リチウム法により行い、それぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた合成培地にて培養することにより選別を行って、それぞれのプラスミドの一方のみが導入された形質転換株及び両プラスミドが導入された形質転換株を得た。
【００５７】
（５）ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用の検出
上記（４）で得たpGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を、YPD培地（液体培地）で培養した。培養の際、培地中に、ＰＰＡＲγ2の生体内でのリガンドである15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2をYPD培地で希釈したものを添加（もしくは無添加）した。15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2（以下15d-PGJ2と略す）は、市販品（CAYMAN CHEMICAL社製、USA）を用いた。培養は４〜５時間行った。培養後、酵母菌体を遠心分離により回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【００５８】
その結果、15d-PGJ2を培地中に加えたことによりpGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母でβ-ガラクトシダーゼ活性（ＬａｃＺ遺伝子発現）の増大が観察された（図２Ａ）。また、このような 15d-PGJ2によるβ-ガラクトシダーゼ活性の増大は、15d-PGJ2の濃度に依存して認められた（図２Ｂ）。これらは、リガンド15d-PGJ2の存在によってＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用がおこったことによると考えられ、この結果から、ＣＢＰのＮ末端領域はＰＰＡＲと相互作用することが明らかとなった。また、この系でＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出・測定できるものと考えられた。
【００５９】
次に、被験薬物として、次式
【００６０】
【化１】
で示されるチアゾリジンジオン誘導体Ｔ−１７４（化学名：５−〔〔２−（２−ナフタレニルメチル）−５−ベンゾオキサゾリル〕メチル〕−２，４−チアゾリジンジオン）を用い、ＰＰＡＲγに対する作用を調べた。
【００６２】
前記と同様にして、pGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を培養した。但し、培養の際、培地中には15d-PGJ2にかえて、被験薬物としてＴ−１７４を添加した。Ｔ−１７４は、特開昭６４−５６６７５（実施例４９）記載の方法に準じて合成したものを用いた。
【００６３】
その結果、pGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む酵母でのみβ-ガラクトシダーゼ活性の上昇が観察され（図３Ａ）、その作用はＴ−１７４の濃度に依存した（図３Ｂ）。このように、Ｔ−１７４の存在によりＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出されたことから、Ｔ−１７４は、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用するアゴニストであると同定された。
【００６４】
Ｔ−１７４は、マウスの病態モデル（KK-Aγマウス）において、血糖降下作用を示すことが知られている（特開昭６４−５６６７５及び特開平０２−１６７２２５）。その作用点は明らかではなかったが、上記の結果から、Ｔ−１７４の作用標的分子はＰＰＡＲγであることがわかった。
【００６５】
実施例２ ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築
ＳＲＣ−１の全領域のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織から調製したcDNAライブラリーから、PCR法によって取得する。プライマーは、Onateらの文献（Science、第270巻、第1354-1357頁、1995年）に記載されたヒトＳＲＣ−１の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部位を付加する。
【００６６】
これをＣＢＰのｃＤＮＡにかえて用い、前記実施例１（２）及び（３）と同様にして、ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGBT9に、ＳＲＣ−１のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGAD424に各々挿入して、ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター、及びＳＲＣ−１の全領域とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現ベクターを構築する。
【００６７】
得られる二種の融合蛋白質発現プラスミドを前記実施例１（４）と同様にして、GAL1とlacZの融合遺伝子が染色体に組込まれていてGAL4遺伝子の欠損変異を有している酵母細胞株SFY526に導入する。
【００６８】
得られた形質転換株を用いて、前記実施例１（５）と同様にして、ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガンド依存的相互作用を検出する。
【００６９】
【発明の効果】
細胞内でのＰＰＡＲの転写活性化能を検出する従来のＰＰＡＲ作用薬の同定方法では、細胞内因性の共役転写因子やＲＸＲなどの関与を受けるが、本発明の方法では、これらの関与がないので、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できる。また、本発明の方法は、哺乳動物細胞を用いる必要がなく、酵母細胞を用いることもできるので、培養操作が容易かつ迅速に行える。さらに、放射性同位元素標識した被験化合物や蛋白質を用いる必要もないので、安全かつ簡便である。
【００７０】
本発明の方法によれば、多数の被験物質を同時に処理することが可能で、しかも十分な感度と定量性があるので、ＰＰＡＲのアゴニスト及びアンタゴニストの同定及びスクリーニングを効率よく良く行うことができる。
【００７１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 使用したプラスミドｐＧＢＴ９−ＰＰＡＲγ２及びｐＧＡＤ４２４−ＣＢＰの構成を示す模式図。
【図２】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰのリガンド依存的相互作用を示した図。
【図３】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰの相互作用に対するＴ−１７４の作用を示した図。
Claims (6)
- 試験用細胞を被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子ＣＢＰとのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定することからなり、該試験用細胞は以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含むものである、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法であって、ＰＰＡＲがＰＰＡＲγである方法。
（ｉ）ＰＰＡＲの少なくともリガンド結合領域と転写因子の第一の領域からなる第一の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域のいずれかである、第一の融合遺伝子；
（ｉｉ）ＰＰＡＲと相互作用するＣＢＰの少なくともＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域からなる第二の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因子の第二の領域は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合領域である場合には転写活性化領域であり、転写因子の第一の領域が転写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合領域である、第二の融合遺伝子； 及び
（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結合領域が結合する応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子。 - 第二の融合遺伝子に含まれる「ＣＢＰのＰＰＡＲ結合領域」が、
ＣＢＰのＮ末端部分１番目から４５０番目までのアミノ酸を含む領域である、請求項１記載の方法。 - 第一の融合遺伝子に含まれる「ＰＰＡＲのリガンド結合領域」が、ＰＰＡＲγのＮ末端側から１７４番目から４７５番目までのアミノ酸を含む領域である、請求項１又は２記載の方法。
- 試験用細胞が酵母細胞である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- ＰＰＡＲγがヒト由来である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
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