JP4251399B2 - Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドの同定および解析方法に関する。

タンパク質の翻訳後修飾、中でも糖鎖の付加は、タンパク質の機能に重要な役割を担うことが知られている。糖鎖は、（１）タンパク質の高次構造を決定づけることでタンパク質の活性制御に、（２）タンパク質を見分けるタグとして、タンパク質の品質管理や細胞内輸送に、および（３）直接情報分子として細胞間コミュニケーションに、重要な機能を果たしていることが明らかになりつつある。また、糖鎖修飾の異常により、先天性疾患、癌、免疫不全などが引き起こされる事例も知られるようになってきた。したがって、糖タンパク質の機能およびその制御を解明するためには、糖鎖修飾の構造を解析することが必要である。

タンパク質の糖鎖修飾は、アスパラギン残基にグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合して始まるＮ型糖鎖と、セリン・スレオニン残基にガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合して始まるＯ結合型糖鎖とに大別される。Ｎ型糖鎖については、基本構造の合成に関与する酵素群はほぼ決まっており、また、付加位置のコンセンサス配列も知られている。一方、Ｏ結合型糖鎖については、セリンまたはスレオニン残基にＯ−結合したＧａｌＮＡｃを特異的に遊離させる酵素が知られておらず、非変性条件下で糖タンパク質からＯ結合型糖鎖を取り除くことがきわめて困難であった。このため、糖鎖の構造および機能はまだよく解明されておらず、コンセンサス配列も見つかっていない。タンパク質に最初にＧａｌＮＡｃを付加する酵素は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ）と呼ばれ、ゲノムプロジェクトの成果に基づいて、バイオインフォマティクスの手法によりその遺伝子の解析が進められている。その結果、ｐｐＧａｌＮＡｃＴは２０数種類が存在し、組織によってその発現パターンが様々であることが明らかとなってきた。

タンパク質のどの位置にＯ結合型糖鎖が付加するかを調べるためには、糖タンパク質をプロテアーゼで消化し、異なるフラグメントをＨＰＬＣにより分離した後に各フラグメントのアミノ末端配列を決定するか、またはＨＰＬＣと質量分析によりペプチドの配列を決定する方法が用いられている。しかし、この方法は多くの手間と時間とを要するため、多くの種類の糖タンパク質を解析するのには適していない。したがって、当該技術分野においては、特定の生物または特定の組織で発現されるＯ結合型糖タンパク質を網羅的に解析する方法の開発が求められている。

本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
Van denSteen, et al., Trends in Glycosicence and Glycotechnology, Vol. 12 (63), 35-49,2000

本発明は、Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドを網羅的に解析しうる方法を提供することを目的とする。

本発明は、Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドを同定する方法であって、
（ａ）糖鎖の付加ができないタンパク質発現系で糖転移酵素の基質となりうるペプチドを産生させ、
（ｂ）該ペプチドに糖転移酵素を作用させることによりＯ結合型糖鎖を付加し、
（ｃ）Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドを選択し、
（ｄ）該糖鎖付加ペプチドの構造を解析する、
の各工程を含む方法を提供する。

好ましい態様においては、本発明の方法の工程（ａ）におけるペプチドの産生は、ペプチドをファージ表面にディスプレイさせることにより行われる。また好ましくは、工程（ａ）におけるペプチドの発現は、ペプチドをファージ表面にディスプレイさせることにより行われ、かつ、工程（ｄ）におけるペプチドの構造の解析は、該ファージ中に挿入されたＤＮＡの配列を解析することにより行われる。また好ましくは、本発明の方法は、さらに糖鎖付加ペプチドに付加されたＯ結合型糖鎖の構造を解析する工程を含む。

本発明の方法においては、まず、糖鎖の付加ができないタンパク質発現系で糖転移酵素の基質となりうるペプチドを産生させる。本明細書において用いる場合、「ペプチド」とは、数アミノ酸残基からなる短いペプチドであってもよく、タンパク質であってもよく、タンパク質のフラグメントであってもよい。糖転移酵素としては、ペプチドのセリン残基またはスレオニン残基にＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｆｕｃ、ＧｌｕまたはＸｙｌを付加する活性を有する酵素であればいずれの酵素を用いてもよく、例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃＴ（ＯＧＴ）、Ｏ−ＦｕｃＴ、ＸｙｌＴ（ＸＴ−１）などを用いることができる。糖転移酵素は、動物、植物、微生物などから抽出された天然の酵素であってもよく、遺伝子組換え技術を用いて製造されたものでもよく、人工的に作成した酵素模倣物であってもよい。

特に好ましい態様においては、本発明の方法はファージディスプレイ系を用いて行う。まず、分析対象であるペプチドをコードするＤＮＡをファージゲノム中に組み込み、定法にしたがってファージを宿主に感染させて増殖させることにより、ペプチドをファージの表面にディスプレイさせる。ＤＮＡは、特定の生物または特定の臓器に由来するｃＤＮＡライブラリであってもよく、合成オリゴヌクレオチドのライブラリでもよい。ファージディスプレイは、ペプチドをファージのカプシドタンパク質との融合タンパク質としてファージの表面にディスプレイさせる技術であり、レセプターに結合するペプチドのスクリーニング等に一般に用いられている。各種のペプチドディスプレイ用ファージベクターが市販されており、ｃＤＮＡライブラリのサイズやディスプレイさせるべきタンパク質のサイズによって、適宜選択して用いることができる。このようなファージベクターの例は、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。なお、このとき、ファージ表面にディスプレイされるファージカプシドタンパク質中に、糖転移酵素が最初に糖を付加する標的となるアミノ酸配列が含まれていてはならないことに注意すべきである。

特に好ましくは、特開２００４−８９０６９に記載の方法にしたがって、ファージの表面上に多コピーのペプチドをディスプレイするファージを用いることができる。簡単には、ファージ外殻タンパク質をコードするＤＮＡと目的のペプチドをコードするＤＮＡとの間に、ストップコドンを挿入したファージディスプレー用組み換えベクターを作製し、該ストップコドンに適したサプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを作製し、感染させる宿主体内にサプレッサーｔＲＮＡを導入発現させておき、さらに、用いるサプレッサーｔＲＮＡのサプレッサー活性を適当な方法により制御する。この方法を用いることにより、より大きいサイズのペプチドを多コピーでディスプレイするファージを得ることができる。

次に、ペプチドに糖転移酵素を作用させることにより、Ｏ結合型糖鎖を付加させる。糖転移酵素の作用の条件は、それぞれの糖転移酵素に適した条件を用いることができるが、例えば、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５０μＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを含むＴＢＳＴ（１０ｍＭ ＴＢ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）等のバッファー中で、３７℃で２−２４時間インキュベートすることにより行うことができる。ファージディスプレイ系を用いる場合には、ファージに糖転移酵素を作用させることにより、ファージ表面にディスプレイされているペプチドにＯ結合型糖鎖を付加させることができる。

次に、Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドを選択する。選択は、レクチンを用いることにより、例えば、レクチンを固定化したカラムに糖転移酵素を作用させたペプチドを吸着させ、適宜洗浄した後に、付加された糖または同様のレクチン結合活性をもつ糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトースなどを用いて溶出することにより、容易に行うことができる。レクチンは、付加されるＯ結合型糖鎖のタイプに応じて適宜選択することができ、例えば、ＧａｌＮＡｃが付加されたペプチドを選択する場合には好ましいレクチンはジャカリンである。また、ペプチドに結合した糖鎖をビオチンで修飾した後、アビジン、ストレプトアビジン等を用いて、ビオチン修飾糖鎖結合ペプチドを回収することにより行ってもよい。

例えば、以下の実施例において記載されるように、モデル系としてＭｕｃ５ＡＣペプチドおよびＩｇＡヒンジペプチドを用い、これらのペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをファージに組み込んでペプチドをファージ表面に発現させ、このファージをｐｐＧａｌＮＡｃＴで処理してジャカリンカラムで精製することにより、ＧａｌＮＡｃ含有糖ペプチドを回収することが可能である。

次に、このようにして選択された糖鎖付加ペプチドの構造を解析する。ペプチド上の糖鎖が付加されたアミノ酸残基を同定するためには、ＨＰＬＣ、アミノ酸シークエンサー、質量分析（ＭＳ）等を用いる。ファージディスプレイ系を用いる場合には、上述の方法にしたがって得られたファージを回収した後に、そのゲノム中に挿入されたＤＮＡの配列を解析することにより、Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドのアミノ酸配列を決定する。挿入されたＤＮＡの配列は、例えば、ファージゲノム中のＤＮＡ挿入部位付近の配列を基に設計したプライマーを用いて容易に決定することができる。

なお、この態様においては、ファージに組み込むＤＮＡとして、ｃＤＮＡライブラリ以外の種々のものを用いることができる。例えば、特定のタンパク質の糖鎖付加位置をマッピングするためには、そのタンパク質をコードするＤＮＡを切断して得たフラグメントや、ＤＮＡをテンプレートとしてランダムプライマーにより製造したフラグメントのライブラリなどを用いることができる。また、各糖転移酵素の特性決定や認識配列の研究に利用するために、部位特異的変異またはランダム変異が導入されたペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを用いてもよい。

この方法にしたがえば、特定の糖転移酵素によりＯ結合型糖鎖が付加されたペプチドをレクチンカラム等で精製し、このファージに挿入されている遺伝子を解析することにより、Ｏ結合型糖鎖が付加されるペプチド配列を同定することが可能である。さらに、特定の細胞や組織、または特定の生物に由来するｃＤＮＡライブラリを用いることにより、糖転移酵素により修飾されるタンパク質を網羅的に同定することが可能である。すなわち、本発明は、糖転移酵素の特性や作用メカニズムの解析に、糖タンパク質の構造、機能および活性制御の解析に、ならびに糖タンパク質を介する細胞内および細胞間シグナル伝達の解析に有用である。

さらに、本発明の方法にしたがって得られた糖鎖付加ペプチドから、付加された糖鎖の構造を解析することができる。糖鎖構造の解析は、各種のレクチンや糖鎖特異的抗体を用いるアッセイ、質量分析などの、当該技術分野においてよく知られる方法を用いて行うことができる。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

ペプチド提示ファージクローンの作成
Ｍｕｃ５ＡＣペプチドおよびＩｇＡヒンジペプチドの配列に基づいて、以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成した。

このオリゴヌクレオチドをＴ７Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）１０−７ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にインフレームとなるように組み込んだ。Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）は、バクテリオファージＴ７に基づくファージディスプレイシステムであり、マルチクローニングサイトに組み込まれたＤＮＡにコードされるペプチドをファージカプシドタンパク質との融合タンパク質としてファージ表面に発現することができる。

定法にしたがってファージを増殖させ、プレートライセートにより回収し、ポリエチレングリコール沈殿により濃縮して、ファージを精製した。ファージをＴＢＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に対して透析した。

分泌型ヒトｐｐＧａｌＮＡｃＴ３を文献（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５３１，１１５−１２１（２００２））に記載の方法にしたがってバキュロウイルス系で合成し、精製した。ｐｐＧａｌＮＡｃＴの活性を確認するためには、蛍光標識を付けた合成ムチンペプチドを基質として使用し、ＨＰＬＣを用いて糖鎖修飾による溶出位置のシフトに基づいて分析した。

以下の表に示される条件で反応を行った。

撹拌しながら３７℃で１２．５時間反応させた後、ポジティブコントロールには１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを、その他には４５０μｌのＴＢＳＴを加えて、反応を停止させた。

ｐｐＧａｌＮＡｃＴと反応させたファージと、ジャカリンアガロース（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）とをＴＢＳＴ中で４℃で一晩処理した後、ミニカラムに詰め、大過剰のＴＢＳＴで洗浄した後、１０ｍＭ ＧａｌＮＡｃで溶出した。各画分に含まれるファージ数を計測した。結果を図１に示す。

Ｍｕｃ５ＡＣペプチドおよびＩｇＡヒンジペプチドのいずれについても、ジャカリンカラムからＧａｌＮＡｃ含有糖ペプチドが溶出された。このことから、本発明の方法を用いて、ファージ表面にディスプレイされた糖鎖付加ペプチドを単離することが可能であることが示された。

図１は、ジャカリンカラムによるＧａｌＮＡｃ付加ペプチドの精製を示す。

Claims (2)

1. ファージディスプレイ系を用いて作成したペプチドライブラリーに対して、Ｏ−結合型糖転移酵素を作用させ、Ｏ−結合型糖鎖が付加されたペプチドを、対応する糖鎖を認識するレクチンを用いて選択し、該糖鎖付加ペプチドをディスプレイしているファージ内のＤＮＡの塩基配列を解析することを特徴とする、Ｏ−結合型糖鎖が付加されたペプチドを同定及び／又は解析する方法。
2. Ｏ−結合型糖鎖が付加されたペプチドを同定及び／又は解析するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするキット;
   （ａ）ファージディスプレイ系を用いて作成したペプチドライブラリー、
   （ｂ）Ｏ−結合型糖転移酵素、
   （ｃ）（ｂ）の酵素で付加される糖鎖を認識するレクチン。