JP4190005B2 - 結合性分子の選択方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、特定の結合活性を有する結合性分子の選択方法に関する。
背景技術
多くの結合性分子が、物質の検出や同定、あるいは精製のためのツールとして利用されている。また単に物質に結合するのみならず、物質の活性を制御する作用を有する結合性分子も公知である。たとえば、酵素蛋白質に結合して、その活性を上昇させたり、あるいは阻害する作用を有する抗体が知られている。このような抗体は、酵素蛋白質の機能解析などに用いることができる。またその酵素が疾患に関連している場合には、抗体によって疾患の治療効果を期待することもできる。
更に病原体や毒素などの病原因子に対する抗体は、その病原性を中和する作用を利用して疾病の治療に用いることができる。病原因子の病原性を中和する作用を有する抗体は、中和抗体と呼ばれている。ウイルス粒子の表面や、ウイルス感染細胞の表面抗原を認識して結合する抗体は、ウイルス性疾患の治療や感染予防に有用である。中和抗体は、さまざまな機序により中和作用を発現する。
中和とは、ある物質が感染力・毒性・酵素活性などの生物学的活性をもつ場合に、ある結合性分子がこの物質に結合することにより、その活性を消失あるいは弱めることをいう。このように、物質に結合してその活性を中和する結合性分子は、特に中和物質とも呼ばれる。
哺乳動物の免疫機構を利用して体内に中和物質を誘導する方法として、ワクチン療法を挙げることができる。ジェンナーの種痘法発見を端緒として、多くの感染源に対するワクチン療法が開発され、人類の福祉にこれまで大きく貢献した。ワクチンとは、病原性微生物や病原性の原因となる分子そのもの、あるいはその病原性を弱めたものであって、生体に投与することによって、中和抗体等を誘導しうるものを言う。病原性微生物には、ウイルスや細菌などを示すことができる。また病原性の原因となる分子には、病原菌が産生する毒素等が含まれる。ワクチンを、あらかじめ対象とする個体に注射し、免疫系に中和物質すなわち抗体を産生させる行為がワクチン療法の主な目的の一つである。
ワクチン療法は、生物が有する免疫機構の働きを利用している。免疫機構は、１度経験した感染源に対しては、２度目の感染時には非常に迅速に、かつ大規模に働く。すなわち中和物質が迅速にかつ大量に誘導される。その結果、感染が成立しなかったり、あるいは感染が生じたとしても症状が軽くなる効果を期待できる。この現象は細胞生物学的には、抗体のクラススイッチや突然変異による活性の上昇、感染源の抗原に特異的なメモリーＢ細胞あるいはＴ細胞の出現などで説明されている。
ワクチン療法の中でも、たとえばポリオウイルスや天然痘ウイルスに対するワクチン療法は、予防効果が高いとされている。これらのウイルスは変異の頻度が低いため、いったんワクチン療法を確立することができれば、ワクチン療法を施した個体は終生免疫を獲得する。その結果、ワクチン療法の効果を終生にわたって期待することができる。
一方、ワクチン療法が効果的であることは知られていながら、十分な予防効果を達成するのが難しいとされているウイルスも存在する。たとえばインフルエンザウイルスは、ウイルスの変異の頻度が高いため、ウイルスの流行に適合したワクチンを選択しなければ、十分な予防効果を達成できない可能性がある。
インフルエンザウイルスワクチンに関しては、ハイリスクグループにおける接種率が欧州各国の大半の５０％以上に比較して、本邦では１％以下と非常に低い。ハイリスクグループとは老人や入院中の人など抵抗力が弱って感染が起りやすい状態にある人を指す。
当初日本では、インフルエンザを社会に拡大させる学童を重視し、学童中心にインフルエンザワクチンを接種していた。その後、接種群と非接種群で学童の欠席率に大きな違いがないというデータが提出され、ワクチンの有効性が疑問視されたという経緯がある。しかし、ハイリスクグループにおけるワクチンの効果（たとえば重篤化を防ぐ効果等）は明らかであり日本でもワクチン接種が見直されつつある。
しかしながら、ワクチンを接種した場合でも、免疫系はその働きを開始して抗体を産生するまでに２週間程度の時間を要する。抗体ができるまでの期間に重篤化してしまう場合にはこのワクチン療法は無効である。従ってワクチン療法はあくまで予防的な側面が大きい。
ワクチン療法が間に合わない場合に、血清療法が実施されてきた。血清療法においては、ウマなどの人間以外の動物に作らせた抗体（中和物質）が点滴等で患者に直接与えられる。たとえば、蛇毒に対する中和抗体の投与は、毒蛇による咬傷の治療方法として定着している。インフルエンザなどの病原性ウイルスに対しても、血清療法を適用することは可能である。実際、ＡＩＤＳウイルス（ＨＩＶ）やＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する血清療法は、感染後の治療方法の一つとして確立されている。しかし血清療法には、他の動物種の抗体を注入することで、その抗体そのものに対する免疫反応が起ってしまうという問題点がある。この現象は、血清病と呼ばれている。
血清病を防ぐために、現在では分子細胞生物学的な技術が応用されつつある。まず、基盤技術としてモノクローナル抗体の実用化があった。抗原物質で免疫した動物の脾臓には抗原と結合する抗体を産生するＢリンパ球は多数存在する。一つのＢ細胞は、１種類の抗体分子のみを産生する。したがってＢ細胞をクローン化することができれば、必要な反応性を有する抗体分子を産生するＢ細胞を得ることができる。
しかしＢ細胞を試験管内で長期間維持培養し続けることは困難である。そこで永代培養が可能なように株化した腫瘍細胞と抗体産生細胞を融合することにより、抗体を産生し永代培養可能な細胞を作製するというアイデアが生まれ、方法として確立した。このようにして確立した融合株（ハイブリドーマ）は１個の抗体産生細胞と１個の腫瘍細胞に由来するので産生される抗体は１種類であり、モノクローナル抗体と呼ばれる。細胞融合法によるモノクローナル抗体の作成技術は、ケラーとミルスタインにより１９７５年に開発された。モノクローナル抗体は、均一な抗体分子の集合体であることから、交叉反応を生じにくい特異性に優れた抗体として利用されている。しかしこの方法にも次のような問題点が指摘されている。
（１）抗原物質として必要充分量の精製標品を有している必要があること
（２）その物質が免疫される動物に対して免疫原性を示す必要があること
（３）モノクローナル抗体を得るまでに多大な労力と日数を要すること
（４）ヒト抗体を細胞融合法によって得ることは現状では困難である
ヒトへの投与を可能とするために、モノクローナル抗体からキメラ抗体のアイデアが生まれた。キメラ抗体は動物由来の抗体のＦｃ部分をヒトの抗体に変換したもので、これは抗体の遺伝子同士を結合させる手法で実現される。抗体分子の抗原性は主にＦｃ部分に依存しているので、Ｆｃ部分をヒト抗体に由来する構造とすれば、ヒトにおける血清病の問題を避けられると考えられた。コンピュータを用いて抗体の立体構造を計算し、立体構造の変化による活性の変化を小さくする、キメラ抗体の設計技術も開発されている。
また、ヒトの抗体を産生するマウスが開発されている。このマウスにはヒトの抗体遺伝子が移植されていて、このマウスに免疫原を注射することにより、望みの活性をもつヒト型抗体が得られるという。
しかし、これらの方法によっては解決が困難な多くの課題が今なお存在することもことも事実である。たとえば、多種類の抗原に対する抗体を短期間に得ること、あるいは特殊な構造をしたエピトープに特異的に結合する抗体を選択的に得ること、といった要求には、これらの方法では応えることはできない。
実際にインフルエンザウイルスの場合では、ウイルスが頻繁に遺伝子変異を起こすことが知られており、中和抗体を分子生物学的に仮に作製したとしても、１種類の抗体では変異した部分を認識できず中和できない新たなウイルスが必ず出現して無力となる。このため、１年ごとに流行予測に合わせて何種類かの抗体の混合物を準備することが必要となるが、ヒト型抗体・キメラ抗体では、作製に数ヶ月から数年を要することになるので現実的には対応不可能と言ってよい。そこで、中和抗体の作製対象は、細胞表面のレセプターなど変異が少なく、また医薬品としての市場規模の大きいものに絞られているのが現状である。
発明の開示
本発明は、目的とする物質に対して結合活性を有する結合性分子を、容易に、かつ迅速に選択することができる方法の提供を課題とする。
本発明者らは、この課題に対してファージディスプレイ法を用いて、解決を図ることを模索してきた。ファージディスプレイ法を用いた方法では、短期間に多種類の抗原に対する抗体を得ることが可能である。
次に、開発したライブラリーの性能を最大限に引き出すためには一方でスクリーニング方法を工夫することが重要である。たとえば中和物質のスクリーニングは、以下の２段階で実施される。
１）物質と結合性分子との結合力を指標として第１回目のスクリーニングを実施する。
２）１）で結合活性を有するものについて、中和活性を試験する。
抗体ライブラリーの規模（種類）は、たとえば１０^１１種類と天文学的な大きさを有する。１つ１つのクローンの中和活性を直接調べることは事実上不可能である。また、結合力の無いクローンは事実上中和活性も無いと見なしてよい。そこで、まずは結合力を指標とする第１回目のスクリーニングが有効である。
通常１回目のスクリーニングは、何らかの担体に中和の対象となる物質（被中和物質）を結合しておき、溶液中の中和物質のライブラリーを接触させる工程を含む。担体の形状は、ビーズ状や、試験管様の容器の内表面などのように任意である。
このとき被中和物質は高純度に精製されていることが必要である。なぜならば、不純物が多い場合には不純物の方が優先的に担体に結合してしまうために、スクリーニング以前に担体表面上の被中和物質の密度が低下して効率的なスクリーニングを妨げるからである。
また、担体表面に被中和物質を直接結合させると、担体表面における官能基の性質によっては、被中和物質の立体構造が変わったり、結合すべき部位（エピトープ）が構造的に隠されてしまう場合がある。
たとえばインフルエンザウイルスの場合では、インフルエンザウイルスに対する中和抗体のターゲットとしてはＨＡ蛋白質が適当であることはこれまでに知られていた。しかし、蛋白質の豊富な鶏卵からウイルスを精製するため、不純物が混入しやすい。また、インフルエンザウイルス自体も、数種類の蛋白質からなっている。そのため何度も繰り返してカラムを通すなどの工夫をしても、ＨＡ蛋白質の高純度精製は困難である。特にインフルエンザウイルス遺伝子と結合しているＮＰ蛋白質の混入が避けられない。ワクチンとしては、この純度でも十分である。しかし、ＮＰ蛋白質は非常に高い抗原性を持っており、ファージディスプレイ法によって選択される抗体の多くはＮＰ蛋白質に対する結合親和性を有する。
ファージライブラリーからＨＡ蛋白質に結合する抗体を選択するためには、ＮＰ蛋白質を含まないように高度に精製したＨＡ蛋白質を用いる必要があった。しかしＨＡ蛋白質を高度に精製することはコスト的にも高く、工程的にも煩雑となる。そこで、中和抗体を得るための簡便なスクリーニング方法が要求されていた。
本発明者らは、結合すべき物質を高度に精製することなく、結合性分子をスクリーニングすることができる方法を探索した。その結果、結合すべき物質に親和性リンカーを導入し、この親和性リンカーを利用して結合すべき物質を捕捉することによって、前記課題を達成できることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の結合性分子の選択方法、およびそのためのキット、あるいはその成果物に関する。
〔１〕次の工程を含む、特定の結合活性を有する結合性分子の選択方法。
ａ）目的とする結合対象物質に親和性リンカーを結合させる工程
ｂ）結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリーを結合対象物質と接触させ、結合性分子と結合対象物質との複合体を形成させる工程、および
ｃ）親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナーを親和性リンカーと結合させて、ｂ）で形成した複合体を回収する工程
〔２〕結合対象物質に特異的に親和性リンカーを結合させる工程を含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕結合対象物質と共存する可能性のある物質と、結合対象物質とを識別可能とするマーカーを結合対象物質が有しており、当該マーカーに親和性リンカーを導入する〔１〕に記載の方法。
〔４〕識別可能なマーカーが糖鎖であり、該糖鎖に親和性リンカーを結合させる工程を含む、〔３〕に記載の方法。
〔５〕結合対象物質が、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質であり、ＨＡ蛋白質の糖鎖をマーカーとして親和性リンカーを結合させる工程を含む、〔４〕に記載の方法。
〔６〕親和性リンカーと結合パートナーの組み合せが、ビオチン−アビジンおよび／またはストレプトアビジン、レクチン−糖、プロテインＡおよび／またはプロテインＧ−イムノグロブリン定常領域、およびＴａｇペプチド配列−Ｔａｇ抗体からなる群から選択されたいずれかの組み合せである〔１〕に記載の方法。
〔７〕結合性分子が抗体可変領域である〔１〕に記載の方法。
〔８〕可変領域を構成する軽鎖が、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子である〔７〕に記載の方法。
〔９〕ｒｇｄｐライブラリーがファージライブラリーである〔１〕に記載の方法。
〔１０〕次の工程を含む、特定の結合活性を有する結合性分子の選択方法。
ｄ）〔１〕に記載の方法によって選択された結合性分子を提示した遺伝的表示パッケージを増幅する工程、
ｅ）増幅した遺伝的表示パッケージを新たなｒｇｄｐライブラリーとして〔１〕に記載の方法を繰り返す工程
〔１１〕〔１〕に記載の方法によって選択することができる結合性分子。
〔１２〕次の工程を含む、中和活性を有する結合性分子の選択方法。
１）中和すべき物質を特定の物質として用い、〔１〕に記載の方法によって、中和すべき物質に対する結合活性を有する結合性分子を選択する工程、および ２）選択された結合性分子の中和活性を評価し、中和活性を有する結合性分子を選択する工程、
〔１３〕〔１２〕に記載の方法によって選択することができる中和活性を有する結合性分子。
〔１４〕以下の工程を含む、中和抗体の製造方法。
１）結合性分子として抗体の可変領域を提示したｒｇｄｐライブラリーを用い、〔１２〕に記載の方法によって中和活性を有する抗体可変領域を選択する工程、
２）工程１）で選択された抗体可変領域を提示した遺伝的表示パッケージが有する抗体可変領域をコードする遺伝子と、抗体定常領域をコードする遺伝子を融合させる工程、および
３）工程２）で得られた融合遺伝子を発現させて、中和活性を有する抗体分子を得る工程
〔１５〕〔１４〕に記載の方法によって得ることができる、中和活性を有する抗体分子。
〔１６〕次の要素を含む、結合性分子の選択用キット。
Ａ）結合対象物質のマーカーに親和性リンカーを結合させるための手段；ここでマーカーとは、目的とする結合対象物質と共存する可能性のある物質と、結合対象物質とを識別可能とする、結合対象物質が有するマーカーをいう
Ｂ）前記親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナー、および
Ｃ）結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリー
〔１７〕結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリーが、抗体可変領域を提示したｒｇｄｐライブラリーである〔１６〕に記載のキット。
〔１８〕可変領域を構成する軽鎖が、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子である〔１７〕に記載のキット。
あるいは本発明は、〔１４〕に記載の方法によって得ることができる、中和活性を有する抗体分子を投与する工程を含む、中和すべき物質の活性を中和する方法に関する。
本発明において、結合性分子とは、他の物質に対して結合活性を有する物質をいう。結合性分子は、任意の物質からなることができ、その結合特性も制限されない。好ましくは結合性分子は、蛋白質からなり、通常は結合活性は特異的である。ここで特異的な結合活性とは、特定の構造を認識して結合することを言う。したがって、異なる分子であっても、部分的に同じ構造を有する物質に対しては、共通の結合性分子が結合する場合がある。
本発明においては、結合性分子に対して結合対象物質という用語を用いる。結合対象物質は、結合性分子の結合相手である。結合対象物質は、任意の物質であることができる。したがって本発明においては、結合親和性を有する異なる分子のペアを構成する各分子が、結合性分子と結合対象物質となる。ペアのうち、いずれかの分子が結合性分子となることができる。そして他方の分子が、結合対象物質である。
本発明における結合対象物質は、その物質に結合する結合性分子の取得を目的とする物質である。これに対して、結合性分子は、目的の物質（すなわち結合対象物質）に対する結合親和性を有する分子を意味する。
本発明において、結合性分子および結合対象物質となることができる異なる分子のペアは制限されない。具体的には、たとえば次のような物質の組み合せを示すことができる。
抗原−抗体
酵素−酵素阻害物質
生理活性物質−細胞表面受容体
シグナル伝達因子−シグナル伝達物質
更に本発明においては、中和物質という用語を用いる。結合性分子のうち、特に病原性因子の病原性を抑制する活性を有するものを、本発明においては特に中和物質と言う。本発明における病原性因子には、生物に対して何らかの影響を与える生物性の、あるいは非生物性の因子が含まれる。具体的には、たとえば、病原性の微生物、毒素、アレルゲン、あるいは内分泌かく乱物質等を、病原性因子として示すことができる。中和物質は、たとえばこれら病原性因子の細胞への結合阻害を通じて、中和作用を発現することができる。あるいは、中和物質が抗体である場合には、オプソニン効果等を通じて中和作用がもたらされる。
更に本発明は、親和性リンカーを用いる。親和性リンカーは、特定の物質に対する結合親和性を有し、かつ他の分子に親和性リンカーを導入することによって当該分子に結合親和性を付与することができる物質を言う。本発明の親和性リンカーは、結合対象物質に導入可能なものであれば、任意の化合物を用いることができる。好ましくは、結合対象物質に特異的に導入することができる化合物を用いる。特異的な導入とは、当該結合対象物質に共存する可能性のある物質には導入されず、目的とする結合対象物質に選択的に導入できることを言う。結合対象物質に選択的に導入しうる化合物として、結合対象物質が有する識別マーカーに導入することができる化合物を示すことができる。
識別マーカーとは、結合対象物質と共存化合物とを識別することができるマーカーを言う。識別マーカーは、たとえば結合対象物質のみが有する特異な構造であったり、あるいは特異的なアミノ酸配列であることができる。より具体的には、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質が有する糖鎖構造は、識別マーカーとして有用である。糖鎖には、ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド等の親和性リンカーを化学的に導入することができる。このとき、ＨＡ蛋白質に共存する物質が糖鎖構造を持たなければ、結果としてＨＡ蛋白質に選択的にビオチンを導入することができる。
また本発明の親和性リンカーには、ある程度の長さのアームを有する化合物を用いるのが望ましい。一定の長さのアームを有する親和性リンカーを利用することにより、結合対象物質を親和性リンカーを介して固相に捕捉したときに、結合対象物質と固相表面との距離を維持することができる。その結果、結合対象物質の立体構造が維持される。立体構造の維持は、結合対象物質の立体構造を認識する結合性分子の選択において、有利である。本発明において、親和性リンカーのアーム（腕）の望ましい長さはたとえば、９オングストローム（Ｃ−Ｃ結合の約６倍の長さ）以上、通常１５−５０オングストローム、あるいは２０−３０オングストロームを示すことができる。たとえば官能基とスペーサー分子（アーム部分）を付加したビオチンが市販されており、そのアームの長さは約９．６〜４３．４オングストロームである。つまり、スペーサー分子を付加したビオチンは、分子の大きさの点でも、親和性リンカーとして望ましい特徴を備えていると言うことができる。
本発明において、親和性リンカーが結合親和性を有する物質を、結合パートナーと言う。本発明においては、前記結合性分子／結合対象物質という結合親和性物質のペアに加えて、ここに述べた親和性リンカー／結合パートナーという結合親和性物質のペアを利用する。これらの用語は、各物質の物質としての特徴を制限しない。しかし各物質が果たす役割によって明確に使い分けられる。本発明において、親和性リンカーおよび結合パートナーとなることができる異なる分子のペアは制限されない。具体的には、たとえば次のような物質の組み合せを示すことができる。
ビオチン−アビジンおよび／またはストレプトアビジン、
レクチン−糖、
プロテインＡおよび／またはプロテインＧ−イムノグロブリン定常領域
Ｔａｇペプチド配列−Ｔａｇ抗体
本発明において結合性分子は、ファージによって提示されたライブラリーとして存在する。このライブラリーから、目的とする結合対象物質に結合する活性を有する結合性分子を選択することが本発明の目的となる。最も一般的なファージライブラリーは、抗体の可変領域を提示した抗体ライブラリーである。抗体ライブラリーから、目的とする物質に結合活性を有する抗体を選択するには、目的とする物質を高度に精製しなければならないことは既に述べた。しかし高度に精製された物質を要求する限り、精製が困難な物質に対して結合性を有する結合性分子の選択は、物質の精製度に依存することになる。
本発明者らは、結合性物質に親和性リンカーを導入し、この親和性リンカーを利用して結合性物質に結合する結合性分子を選択すれば、結合対象物質の精製度に依存せず、結合性分子の選択を行えるのではないかと考えた。すなわち本発明は、以下の工程を含む結合性分子の選択方法に関する。
ａ）目的とする結合対象物質に親和性リンカーを結合させる工程
ｂ）結合性分子を提示したファージライブラリーを結合対象物質と接触させ、結合性分子と結合対象物質との複合体を形成させる工程、および
ｃ）親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナーを親和性リンカーと結合させて、ｂ）で形成した複合体を回収する工程
本発明においては、親和性リンカーを結合した結合対象物質に、結合性分子を提示したファージライブラリーを接触させる。このとき、結合対象物質は、親和性リンカーを利用して固相に捕捉させておいても良い。あるいは、ファージライブラリーとの接触の後に、親和性リンカーを固相に捕捉することもできる。親和性リンカーを固相に捕捉するためには、通常、親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナーを結合した固相が用いられる。固相として磁性粒子を用いることにより、捕捉した成分を磁石を使って液相から容易に分離することができる。
あるいは［結合パートナー］−［親和性リンカー］−［結合対象物質］−［結合性分子］の４つの成分からなる複合体自身が沈殿として分離できる場合には、必ずしも固相は必要としない。たとえば結合対象物質の分子量が十分に大きい場合、また１分子の結合パートナーに複数分子の親和性リンカーが結合する場合、更には１分子の結合対象物質に、複数分子の結合性分子が結合するような場合には、複合体の分子量が大きくなり沈殿を生成する可能性が高い。
以上のようにして、固相への捕捉や、沈殿として回収された複合体に含まれる結合性分子を選択することにより、本発明に基づく結合性分子の選択方法が実施される。本発明の結合性分子の選択方法は、複数回繰り返すこともできる。すなわち、１回目の選択方法で回収される結合性分子を保持したファージを増幅し、更に同じ選択方法を繰り返すことができる。こうして、本発明の結合性分子の選択方法を繰り返すことにより、結合活性に優れる結合性分子を濃縮することができる。
あるいは、最初の選択工程にのみ本発明を利用し、次のサイクルからは精製度の低い結合対象物質を用いて、結合性分子の選択を行うこともできる。本発明によれば、１回の選択で、目的とする結合活性を有する結合性分子を濃縮することができる。この目的とする活性を有する結合性分子が濃縮されたライブラリーを用いれば、２回目以降の選択には、精製度の低い結合対象物質を用いたとしても、結合対象物質が含まれてさえいれば、目的とする結合性分子が濃縮される可能性が高い。また、本発明の選択方法と、精製度の低い結合対象物質を用いた選択方法を、適宜組み合せて、選択を重ねることもできる。
本発明の結合性分子の選択方法において、ファージライブラリーは、結合対象物質に対する結合活性が期待できる分子種であれば、任意の結合性分子を提示したファージライブラリーを用いることができる。ファージライブラリーに提示される結合性分子としては、抗体可変領域、細胞表面受容体、あるいはランダムペプチド配列等が挙げられる。本発明において、特に望ましい結合性分子は抗体可変領域である。中でも、可変領域を構成する軽鎖が、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子を有するファージライブラリーは、本発明における理想的なファージライブラリーである。
本発明者らは、公知の抗体レパートリーから必要な抗体をスクリーニングすることを妨げている要因について研究を重ねた。本発明者らは、抗体活性の維持に果たす軽鎖の役割に着目した。そして、まず、抗体分子に機能的なコンフォーメーションを与えることができる軽鎖をスクリーニングする方法を確立した。
更に本発明者らは、こうして選択された軽鎖可変領域遺伝子の構造を丹念に解析することによって、限られた構造の軽鎖可変領域遺伝子のみを利用することによって、機能的なコンフォーメーションを維持した抗体分子を高い割合で含む抗体ライブラリーの構築が可能となることを見出した。
本発明者らの知見によれば、重鎖と機能的なコンフォーメーションを再構成しうる軽鎖の構造は、現実には限られた範囲に収束する。この知見に基づいて、本発明者らは、機能的な抗体分子を構成する軽鎖の構造が、一定のレパートリーに集約されることを明らかにし、これをライブラリーの調製に応用した。
機能的なコンフォーメーションを再構成できる軽鎖の選択と、この軽鎖を用いた抗体可変領域を提示するファージライブラリーの構築方法を以下に示す。このようなファージライブラリーは公知である（第２３回日本分子生物学会プログラム・講演要旨集３ＰＢ−１７５「人工抗体ライブラリーからの水痘・帯状疱疹ウイルス中和抗体の単離」，２０００年１１月２５日発行）
本発明において、イムノグロブリンとは、動物種やクラスを問わず、重鎖と軽鎖とで構成される全てのイムノグロブリン分子を意味する。また、抗原との結合が可能な領域のみからなる断片や、あるいはイムノグロブリンを構成する領域が異なる動物種からなるキメラ抗体であることもできる。哺乳動物の重鎖可変領域をコードする遺伝子は、一般に遺伝子の構造的な特徴に基づいていくつかのＶＨファミリーに分類されている。たとえば、ヒトではＶＨ１〜ＶＨ７の７つのファミリーに分類されている。各ファミリーは、ファミリー内で保存性の高い塩基配列を含み、この保存性の高さを利用して各ファミリー用のＰＣＲプライマーが提案されている。軽鎖可変領域も、重鎖と同様に構造的な特徴に基づいてファミリーに分類することができる。
重鎖可変領域をコードする遺伝子は、Ｖ（Ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｄ（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびＪ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の３つの遺伝子群から構成される。Ｖ、Ｄ、そしてＪの各遺伝子群が、それぞれ複数の遺伝子からなっており、それらがランダムに組み合わさり、更に変異が加わることによって抗体の多様性が生まれる。これに対して、軽鎖可変領域を構成しているのは、Ｖ、およびＪの２つの遺伝子群である。軽鎖可変領域においても重鎖可変領域と同様に、複数の遺伝子群の組み合わせと変異によって多様性がもたらされている。
本明細書では、用語「ライブラリー」を用いる。ライブラリーは、多様なレパートリーからなる構成要素を含む集合体を意味する。遺伝子は遺伝子ライブラリーを、抗体分子は抗体ライブラリーを、あるいはファージやファージミドはファージライブラリーをそれぞれ構成する。ファージが内部に保持した抗体遺伝子を表面に発現している場合には、遺伝子ライブラリーであると同時に抗体ライブラリーでもある。
更に本明細書においては、用語「ｒｇｄｐライブラリー」（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｐｌａｙ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ；複製可能な遺伝的表示パッケージのライブラリー）を用いる。ｒｇｄｐライブラリーとは、すなわち、遺伝子を保持するとともに、その遺伝子の発現生成物を表面に提示したもので構成されるライブラリーを呼ぶ。前記ファージライブラリーが、抗体タンパク質を表面に発現している場合には、ｒｇｄｐライブラリーに含まれる。ｒｇｄｐライブラリーには、ファージライブラリーのほか、外来タンパク質をその表面に発現している形質転換細胞やリボゾームからなるライブラリーを示すことができる。
また本発明においては、用語「コンフォーメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」を用いる。イムノグロブリンが、重鎖と軽鎖の会合（ｈｏｌｄｉｎｇ）によって構成されることは既に述べた。この会合の結果として生じる重鎖と軽鎖の結合物の構造が、コンフォーメーションである。コンフォーメーションは、一般的に定常領域における−ＳＳ−結合によって成立する。このとき、常に抗原との結合活性を獲得するとは限らない。本発明において、あるイムノグロブリンが抗原との結合活性を持つとき、そのイムノグロブリンのコンフォーメーションが機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であると言う。そして、ある軽鎖との組み合わせにおいて機能的なコンフォーメーションを与える重鎖が、他の軽鎖との組み合わせによっても機能的なコンフォーメーションを与えるとき、両者の結合を特に再構成（ｒｅ−ｈｏｌｄｉｎｇ）と呼ぶ。
再構成を構成する他の軽鎖とは、いったん別々のクローンとして単離された同一の細胞に由来する軽鎖を含む。また、本発明におけるコンフォーメーションの再構成とは、あくまでもイムノグロブリンの抗原との結合に必要な領域における再構成を意味する。したがって、定常領域の有無に関わらず、可変領域における分子構造がイムノグロブリンとして再構成されていれば、機能的なコンフォーメーションを再構成したと見なす。更に、軽鎖や重鎖をコードする遺伝子への人為的な塩基配列やファージの構成タンパク質の融合などを伴う場合であっても、可変領域における再構成が達成されている限り、本発明においては機能的なコンフォーメーションを再構成したと見なす。より具体的には、本発明における分子構造の再構成とは、たとえば重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが異なるタンパク質として翻訳された場合には、定常領域において形成される−ＳＳ−結合によって重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがイムノグロブリンの可変領域を構成することと言い換えることができる。
ところでｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）のように、人工的なリンカーによって重鎖と軽鎖がはじめから結合されている抗体分子も存在する。この種の特殊な抗体においては、コンフォーメーションは−ＳＳ−結合ではなく、ペプチド結合によって構成される場合がある。したがってｓｃＦｖ抗体においては、定常領域を介することなくコンフォーメーションが再構成される。
本発明に用いる抗体可変領域を提示したファージライブラリーは、まず機能的なイムノグロブリンを再構成することができる軽鎖をコードする遺伝子を選択し、次にこの軽鎖可変領域遺伝子に重鎖をコードする遺伝子のライブラリーを組み合わせることによって調製される。軽鎖可変領域遺伝子の選択は、以下の工程によって行うことができる。
ａ）軽鎖可変領域をコードする、１つまたは複数の遺伝子を取得する工程、
ｂ）軽鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成することが確認されているイムノグロブリン重鎖可変領域をコードする遺伝子を取得する工程、
ｃ）工程ａ）によって得られた軽鎖可変領域をコードする遺伝子の任意の１つを選択し、工程ｂ）で取得した重鎖可変領域をコードする遺伝子とイムノグロブリンの機能的なコンフォーメーションを再構成が可能な条件下でタンパク質に翻訳する工程、
ｄ）工程ｃ）において翻訳されたタンパク質の抗原結合部位の形成を検出する工程、および
ｅ）抗原結合部位の形成が検出されたタンパク質を構成する軽鎖可変領域をコードする遺伝子を選択する工程
本発明において、軽鎖可変領域あるいは重鎖可変領域とは、少なくとも抗原との結合に必要な領域を含む任意の領域とすることができる。言いかえれば、３つのＣＤＲとそれを保持するフレーム（ＦＲ）で構成される領域を含む任意の領域を本発明の可変領域として用いることができる。したがって、たとえば定常領域をも含む断片であっても、抗原との結合に必要な領域を含んでおれば、本発明の可変領域として利用することができる。抗体の可変領域としてしばしば用いられる、ＦａｂやＦａｂ’は、もともとイムノグロブリンの酵素的な切断によって得られる断片に対して与えられた名称である。本発明においては、Ｆａｂを可変領域を特定するための用語として理解すべきではない。
前記の軽鎖可変領域遺伝子の選択方法において、対象となる軽鎖可変領域遺伝子は、任意の抗体産生細胞より得ることができる。抗体産生細胞としては、たとえば、末梢血リンパ球や脾細胞等を挙げることができる。軽鎖可変領域遺伝子の単離にはＲＴ−ＰＣＲを利用するのが有利である。たとえばヒトの場合、ＶＬＪＬ遺伝子を増幅することができるプライマーが明らかにされている（特表平３−５０２８０１あるいは特表平４−５００６０７。また、ＭＲＣ社はホームページ［「Ｖ−ｂａｓｅ」：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌでプライマーを公開している）。したがって、これらのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行えば、工程ａ）に必要な軽鎖可変領域をコードする遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子を工程ｃ）に用いる。
次に工程ｂ）において、軽鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成することが確認されているイムノグロブリン重鎖可変領域をコードする遺伝子を取得する。このとき取得する重鎖可変領域は、工程ａ）で得た軽鎖可変領域と同じ動物種に由来し、かつ軽鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成することができるものであれば、抗原結合特異性などは任意であって良い。このような重鎖可変領域をコードする遺伝子は、たとえば、抗体活性を持つことが明らかなイムノグロブリン分子をコードする遺伝子から得ることができる。工程ｂ）の重鎖可変領域としては、κ鎖およびλ鎖との再構成が可能なものを用意するのが望ましい。このような重鎖可変領域としては、実際に軽鎖との会合効率を確認して、最も効率の高い重鎖可変領域を選ぶのが望ましい。たとえば、重鎖に対応する各種クローンについて、軽鎖との会合効率を検討したところ、次のような構造を持つＶＨ３−４が最も会合の効率が高かったことから、ＶＨ３−４（配列番号：１）を選択した。ＶＨ３−４は、以下に示す構造を持っている。

続いて工程ｃ）において、工程ａ）によって得られた軽鎖可変領域をコードする遺伝子の任意の１つと工程ｂ）で得た重鎖可変領域をコードする遺伝子とを、イムノグロブリンの機能的なコンフォーメーションを再構成が可能な条件下でタンパク質に翻訳する。工程ｂ）では、機能的なコンフォーメーションを構成しうる重鎖可変領域をコードする遺伝子を選択しているので、工程ｃ）においてはイムノグロブリン分子の可変領域としての構造を再構成しているものは、機能的なコンフォーメーションを再構成したと見なすことができる。なお、ここでいうイムノグロブリン分子とは、イムノグロブリンにおける抗原との結合に必須の部分を含む限り、あらゆる構成であることができる。したがって、定常領域の有無に関わらず、抗原結合部位を再構成しているものは、イムノグロブリン分子として再構成されたと見なすことができる。
工程ｃ）におけるイムノグロブリンの再構成が可能な条件下とは、−ＳＳ−結合によって重鎖可変領域と軽鎖可変領域の会合（ｈｏｌｄｉｎｇ）が可能となる条件を意味する。より具体的には、たとえば前述のように大腸菌のペリプラズムなど生体内の還元環境でのＦａｂタンパク質の発現は、イムノグロブリンの再構成が可能な条件と言える。抗体のコンフォメーション形成に必要な還元的微小環境としては、ヒトなどの哺乳動物細胞では小胞体などのオルガネラを挙げることもできる。更に、重鎖と軽鎖の可変領域が人工的なアミノ酸配列（リンカー）で結合されたｓｃＦｖタイプの抗体であれば、イムノグロブリンとしての再構成に必ずしも還元的な環境を必要としない場合もある。
工程ｃ）における軽鎖可変領域と重鎖可変領域の発現には、外来遺伝子を表面に発現するファージを用いるのが有利である。例えば繊維状ファージは、その表面にｃｐ３やｃｐ８などのファージの構成タンパク質との融合タンパク質として外来遺伝子にコードされるタンパク質を発現する。
さて、通常ファージライブラリーのスクリーニングは、ファージを粒子として回収するステップを含む。したがって、たとえば外来遺伝子をファージミドとして感染させた場合には、ヘルパーファージを感染させることによりファージ粒子として回収される。ところが本発明者らは、ｃｐ３との融合タンパク質としてＦａｂ遺伝子を挿入したファージミドを感染させた大腸菌をヘルパーファージを加えないで培養すると、その培養上清中に、Ｆａｂとｃｐ３の融合タンパク質が分泌されることを見出した。ファージミドを感染させた大腸菌によって分泌されるＦａｂとｃｐ３の融合タンパク質は、２０時間の培養後でさえ微量ではあったが、軽鎖を選択するには十分な量であった。したがって、軽鎖可変領域遺伝子の選択方法のための試料としては、ファージミドを感染させた宿主微生物の培養上清を利用することもできる。ヘルパーファージを感染させてファージ粒子として回収する工程を不要とするこの方法は、実験操作上、きわめて簡便である。
この方法に基づいてファージミドを感染させた宿主微生物の培養上清をスクリーニングのための試料とするためには、宿主微生物において動作可能なプロモーターと、シグナル配列とを備えたベクターを用いる。たとえば大腸菌を宿主とする場合には、シグナル配列としてｐｅｌＢ配列などを挿入した繊維状ファージ用のファージミドベクターを利用することができる。
もしも軽鎖可変領域が重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションを再構成しうるものであれば、イムノグロブリンの可変領域が形成される。この可変領域の形成を検出することによって、選択すべき軽鎖可変領域を知ることができる。可変領域の形成は例えば、イムノアッセイの原理を利用して検出することができる。すなわち、κ鎖（あるいはλ鎖）に対する抗体を固相化抗体としてコートしたプレートに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の発現生成物を含む試料を加えて、軽鎖可変領域をプレート上に捕捉する。もしも重鎖可変領域が軽鎖可変領域と会合していれば、重鎖可変領域は軽鎖可変領域とともにプレート上に捕捉されるはずである。次いで重鎖やＦａｂに対する標識抗体を加えれば、両者が会合できたときに限り、標識抗体がプレート上に捕捉されることになる。適当な時間インキュベーションしてプレートを洗浄し、標識抗体を検出すれば、機能的なコンフォーメーションを構成する軽鎖可変領域を検出することができる。標識抗体と固相化抗体は、逆の組合せとすることもできる。あるいは、重鎖可変領域を予めビオチン化しておき、標識アビジンによって検出することもできる。前述のとおり、ここで検出に用いる試料は、ファージミドを感染させた大腸菌の培養上清を用いることができることを我々は見出している。
こうして重鎖可変領域との会合が確認された軽鎖可変領域を、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションが可能な軽鎖可変領域として選択することができる。軽鎖可変領域をコードする遺伝子がファージライブラリーとして保持されている場合には、ファージを回収することによって軽鎖可変領域の遺伝子を選択することができる。
以上に述べた過程を経て得られた軽鎖可変領域遺伝子は、重鎖可変領域との再構成が可能であるのみならず、スクリーニングに利用した発現系における発現が証明されたものとなる。たとえばファージによる発現を利用した場合には、大腸菌において十分な発現が見られるものが選択される。したがって、哺乳動物細胞では発現するものの、大腸菌では発現量が少なくなる遺伝子をこの段階で除くことができる。このような特徴は、本発明における軽鎖可変領域遺伝子の選択方法において期待することができる新規な利点である。これに対して従来の抗体ライブラリーの作製技術においては、軽鎖の選択工程を含まないため、発現レベルが不充分な軽鎖遺伝子の混入を防ぐことはできなかった。
選択された軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、そのまま遺伝子ライブラリーの調製に用いることができる。しかしこの段階では、選択した軽鎖可変領域遺伝子の間に重複が存在している可能性がある。したがって、好ましくは軽鎖可変領域遺伝子の構造を解析し、重複を除いた上で、遺伝子ライブラリーの調製に用いる。遺伝子の重複は、たとえば次のような方法によって除くことができる。
まず前記工程ｄ）の後に、あるいは先だって軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を決定し、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を推定する。推定されたアミノ酸配列を比較し、同じアミノ酸配列をコードする遺伝子は除く。この段階で更に、欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）のチェックも行うのが望ましい。このため、塩基配列の決定を行って読みとり枠のずれているものを除いた。
なお、遺伝子の取捨選択は、実際には、類似の遺伝子をグルーピングし、各グループから代表的な配列を選択することになる。このとき、選択された遺伝子を偏りなくカバーできるように、そしてＶＬ−ＪＬ結合点のズレに関しても天然に存在する抗体で見られる分布を損なわないように選択する。実際には、遺伝子のデータベースから実際の抗体で使用されている軽鎖可変領域遺伝子をリストアップし、結合点のズレに関して集計した結果を元に分布を決定した。
以上の結果を総合したところ、本発明者らの解析結果によれば、ヒトのイムノグロブリンの場合、このような選択方法に基づいて選択される代表的な軽鎖可変領域のレパートリーサイズは、κ鎖で１０１、並びにλ鎖でも９９である。
つまり、ヒトの機能的なイムノグロブリンを代表しうる軽鎖可変領域のレパートリーサイズは、せいぜい２００にすぎないことが明らかとなったのである。なお、本発明者らが明らかにしたおよそ１００というレパートリーサイズを、限定的に解釈すべきではない。すなわち、本発明の選択方法に基づいて、たとえばヒトの軽鎖可変領域遺伝子を選択するときに選択すべき軽鎖可変領域遺伝子の数は、必ずしも１００になるとは限らない。あくまでも、得られたアミノ酸配列に基づいて、ここに述べた選択方法を実施することによって選択された軽鎖の遺伝子を以降の工程に用いることが重要である。
更にスクリーニングによって得られたファージ抗体のＶＬ遺伝子を分類した結果、ＶＬ遺伝子の使用は特定の遺伝子に偏っていることがわかった。この結果から、イムノグロブリンのコンフォーメーションを再構成しうる軽鎖を多く含むセットを揃えることにより、機能的なイムノグロブリンの割合の高い良質なライブラリーを作製できることが示された。
ここで、生体内における抗体の多様性を維持するには、アミノ酸配列の解析の対象をできるだけ大きく取ることが望ましい。
１人のヒトの軽鎖を構成するゲノム遺伝子は、３６種類のＶｌ、７種類のＪｌ、３７種類のＶｋ、そして４種類のＪｋで構成される。Ｖ遺伝子とＪ遺伝子の組み合わせによって軽鎖遺伝子が作られるので、単純計算では３６×７＝２５２と３７×４＝１４８の和、つまり４００種類となる。加えて、遺伝子の結合の際にその結合点のアミノ酸の数には、変異が伴う。つまり、前述のように抗体遺伝子の再構成に特有の現象により、平均±１アミノ酸程度（最大で±５アミノ酸程度）の多様性が生まれる。この組み合わせから更に不要な遺伝子は削除されて、個人の抗体遺伝子のレパートリーとなる。さらに、個人によって遺伝子は少しずつ異なっている（これを多型；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍという）。全人類が持っている抗体遺伝子の種類を調べ尽くすことは現実的ではないが、総計して１０００種類程度であると推定される。これらのことから、１人のヒトがあらゆる抗原に対応する抗体のセットを作ることができるとすれば、理論的には好ましくは４００種類以上１０００種類程度までのアミノ酸配列について本発明による解析方法を実施することによって、軽鎖可変領域遺伝子のレパートリーを十分に再現することができることになる。
本発明者らがヒトにおいて明らかにしたこのような軽鎖のレパートリーサイズ（２００種類）は、約１０００種類のアミノ酸配列の解析の結果得られた数字である。したがって、理論的には、あらゆる抗体セットにおいて機能的なコンフォーメーションを再構成することができる軽鎖可変領域が選択されていると言うことができる。実験的にも、本発明による２００種類と言う軽鎖可変領域遺伝子のレパートリーサイズは、生体内における抗体の多様性をｉｎ ｖｉｔｒｏで再現するのに十分有効であることを示すことができた。しかし、より多くの塩基配列を決定し、そのアミノ酸配列についても解析を行えば、レパートリーサイズが大きくなる可能性は否定できない。
そこで、本発明によって選択された軽鎖可変領域ライブラリーのレパートリーサイズを、軽鎖遺伝子ライブラリーとの混合によって補うことができる。すなわち、軽鎖可変領域についても重鎖と同じく選択をかけない全ての軽鎖遺伝子（ＶＬライブラリーと呼ぶ）を用いてライブラリーを作製するのである。こうして作製したＶＬライブラリーを２００種の軽鎖可変領域のみを用いたライブラリー（ＫＬ２００ライブラリーと呼ぶ）と混合することによって、相補的に欠点を補うライブラリーとすることができる。各ライブラリーは以下に述べる特徴を持つ。
ＫＬ２００ライブラリーは、重鎖とのコンフォメーション形成が確認されている。ただし数を限定したために、特定の特異性を持つクローンを形成するのに必要な軽鎖が除外されている可能性も否定できない。
ＶＬライブラリーは、独立クローン数が１０^９に達しているため必要なクローンはもらしていない。しかし発現と重鎖とのコンフォメーション形成率はＫＬ２００ライブラリーに比較して低い。
なお、本発明において、アミノ酸配列の解析結果に基づいて分類した各グループから、いずれの遺伝子を選択するかは本来任意である。したがって、重鎖との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖をコードする遺伝子の構造をここに明らかにすることには大きな意味はない。重要なのは、このような選択方法によって、重鎖とともに機能的なコンフォーメーションを再構成することができる軽鎖の選択工程を実施することである。いずれにせよ、このような操作を通じて、ヒトであれば、１０１種類のκ鎖遺伝子ライブラリーと、９９種類のλ鎖遺伝子ライブラリーからなる軽鎖可変領域遺伝子ライブラリーが得られることになる。
さて、本発明において選択された軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリーは、後に述べるように重鎖可変領域をコードする遺伝子を組み合わせることによってイムノグロブリンの遺伝子ライブラリーを与える。したがって、本発明によって選択された軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリーは、イムノグロブリンの遺伝子ライブラリー調製用のライブラリーとして有用である。すなわち本発明は、少なくともイムノグロブリンの軽鎖可変領域をコードする遺伝子からなる遺伝子ライブラリーであって、イムノグロブリンの重鎖と機能的なコンフォーメーションを再構成できない軽鎖可変領域をコードする遺伝子が実質的に排除されている遺伝子ライブラリーに関する。
本発明において、イムノグロブリンの重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成できない軽鎖可変領域をコードする遺伝子とは、先に述べた軽鎖可変領域の選択方法によって排除することができる。重鎖可変領域と機能的なコンフォーメーションを再構成できない軽鎖可変領域をコードする遺伝子を、本発明においてはｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子と呼ぶ。本発明においてｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除されたライブラリーとは、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子の完全な排除までも要求するものではない。たとえばｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が混入したライブラリーであっても、免疫学的な反応に基づく抗体のスクリーニングを妨げない範囲であれば、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除されたライブラリーと言うことができる。
抗体のスクリーニングを妨げない範囲とは、ライブラリーに占めるｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子の割合が、たとえば０−５０％、望ましくは０−２５％であることを意味する。ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子の割合は低いほどスクリーニングの効率が高まり、有用なクローンをスクリーニングの過程で失う危険性が低くなることは言うまでも無い。しかし発明者らが試作したライブラリーにおいて、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅな遺伝子を５０％含むと考えられるＶＬライブラリーをｄｅｆｅｃｔｉｖｅな遺伝子を完璧に排除したＫＬ２００ライブラリーに様々な割合で混合したところ、５０％までの混合では有効なスクリーニングができることを確認している。この事実により、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅな遺伝子の割合がより好ましくは２５％以下であれば、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除されていると言うことができる。
前記の軽鎖のみからなるライブラリーは、重鎖の可変領域をコードする遺伝子ライブラリーを組み合わせるための材料として有用である。このようなライブラリーとしては、たとえばファージのｃｐ３をコードする遺伝子にｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除された軽鎖ライブラリーを組み込むとともに、重鎖の可変領域を挿入するためのクローニングサイトを設けたファージライブラリーを挙げることができる。一般にファージライブラリーは、ファージの宿主微生物に対する感染性を損なうことがないように、ファージミド上に外来遺伝子を保持させ、これをヘルパーファージを用いてファージ化する方法が用いられる。本発明のファージライブラリーも、ファージミド上に構築することができる。すなわち、宿主において機能するプロモーターの制御下に、シグナル配列と連結した前記軽鎖可変領域をコードする遺伝子と、重鎖可変領域をコードする遺伝子のクローニングサイトを設ける。重鎖可変領域遺伝子のためのクローニングサイトは、目的とする遺伝子に見出される頻度の低い制限酵素とするのが有利である。本発明に用いるファージライブラリーは、ファージミドのみならずファージのゲノムを利用することもできる。クローニングサイトを付加したプライマーによって重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲによって合成し、ファージライブラリーに挿入すればイムノグロブリンの可変領域を発現するファージライブラリーを完成することができる。
あるいは、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除された軽鎖ライブラリーを大腸菌用の発現ベクターに組み込んで、大腸菌に形質転換することによって軽鎖可変領域ライブラリー分泌発現株とすることもできる。この大腸菌に、ＰＣＲによって得た重鎖可変領域を組み込んだファージを感染させれば、Ｆａｂをその表面に再構成したファージ粒子を得ることができる。重鎖可変領域遺伝子を様々な免疫履歴を持つ個体から選択することによって、目的とする抗体に合った抗体ライブラリーを得ることができる。
このような方法に基づいて、ファージライブラリー作成用キットを提供することができる。このキットは、ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除された軽鎖ライブラリーと、重鎖可変領域遺伝子増幅用のプライマーとからなる。使用者は、重鎖可変領域遺伝子増幅用のプライマーを用いて、目的とする抗体に合った免疫履歴を持つ遺伝子ソースからＰＣＲ生成物を得ることができる。たとえば、がんの宿主からは、腫瘍関連抗原を認識する抗体ポピュレーションに富むライブラリーが期待できる。
こうして選択された軽鎖可変領域遺伝子を利用し、目的とするライブラリーを調製する。本発明に用いるライブラリーは、以下の工程を含む、イムノグロブリンの軽鎖可変領域遺伝子と重鎖可変領域遺伝子の組み合わせからなる遺伝子ライブラリーの調製方法により調製することができる。
ａ）軽鎖可変領域遺伝子として、重鎖可変領域遺伝子の発現産物との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子をコードするものを選択し、
ｂ）工程ａ）によって得られる軽鎖可変領域遺伝子の集合である遺伝子のライブラリーを調製し、
ｃ）工程ｂ）のライブラリーに重鎖をコードする遺伝子のライブラリーを組み合わせる
工程ａ）の軽鎖の選択工程は、先に述べたとおりである。先に得られた軽鎖をコードする遺伝子を集めて、工程ｂ）のライブラリーとすることができる。軽鎖可変領域遺伝子が繊維状ファージに保持されている場合には、このファージを増殖させ、回収してライブラリーとすることができる。次いで工程ｃ）として、前記軽鎖の遺伝子ライブラリーに重鎖の遺伝子ライブラリーを組み合わせる。重鎖可変領域遺伝子を、末梢血リンパ球や脾細胞のような抗体産生細胞より取得する方法は公知である。たとえばヒトのイムノグロブリンは、ＶＨ１〜ＶＨ７の７つのＶＨファミリーからなる。
各ファミリーの遺伝子を増幅することができるプライマーは公知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｚｅｌｅｎｅｔｚ，Ａ．Ｄ．，Ｌｅｖｙ，Ｓ．＆ Ｌｅｖｙ，Ｒ．（１９９２）．Ｕｓｅ ｏｆ ｆａｍｉｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，１９３−２０３．また、ＭＲＣ社はホームページ「Ｖ−ｂａｓｅ」：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌでプライマーを公開している）。したがって、このようなプライマーに基づいてＲＴ−ＰＣＲを行えば、各ファミリー毎に重鎖可変領域遺伝子を増幅することができる。
増幅生成物として得られた重鎖可変領域遺伝子は、適当なベクターに挿入することによって遺伝子ライブラリーとすることができる。このとき、ＶＨファミリー毎に重鎖可変領域遺伝子ライブラリーを調製し、生体内における各ファミリーの構成割合に応じて混合することによって、本発明に用いる遺伝子ライブラリーをより生体内の抗体レパートリーに近い状態にすることができる。具体的には、たとえばヒトの場合、各ポピュレーションはおよそ次のような割合で存在することが明らかにされている。生体における抗体レパートリーを模倣することによって、スクリーニングを通じて必要なクローンを失う機会を少なくすることができる。
ＶＨ１：２５％
ＶＨ２： ６．６％
ＶＨ３：４０％
ＶＨ４：１９％
ＶＨ５： ５％
ＶＨ６： ３．８％
ＶＨ７： １．２％
以下に重鎖可変領域遺伝子の取得について、より具体的に述べる。７種のＶＨファミリー毎にプライマーを設定し、６個のＪＨ遺伝子に共通に働くプライマーと組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを行う。ヒトの各ＶＨファミリーをファミリーごとに幅広く増幅することができるプライマーは公知である（Ｍａｒｋｓ ＪＤ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２，５８１−５９７あるいはＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｚｅｌｅｎｅｔｚ，Ａ．Ｄ．，Ｌｅｖｙ，Ｓ．＆ Ｌｅｖｙ，Ｒ．（１９９２）．Ｕｓｅ ｏｆ ｆａｍｉｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，１９３−２０３．また、ＭＲＣ社はホームページ「Ｖ−ｂａｓｅ」：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌでプライマーを公開している）。用いたプライマーによって各ファミリーがきちんと増幅されているかどうかを確認する。すなわち、増幅されたＶＨＤＪＨ構造を有するバンドについて各ファミリー毎に数１０種のクローンを得て塩基配列を決定し、どの重鎖可変領域遺伝子が増幅されているかを解析する。もしも増幅されていない遺伝子が存在する場合には更に新しくプライマーを設計し、追加する。たとえば、それまでに報告されているプライマーでは増幅することができなかった遺伝子の増幅を可能とする新たなプライマーが報告されている。
ｉｎ ｆｒａｍｅでＶＨＤＪＨ構造を持つクローンについては、適当なベクターに組み込んで大腸菌中での発現と軽鎖可変領域遺伝子との会合−ｆｏｌｄｉｎｇ−を解析する。もしどこかの段階が正しく起こらないクローンが存在すればその理由を推定し、ライブラリー全体の中でそのクローンの占める率を推定する。
個体のイムノグロブリンのポピュレーションは、免疫履歴によって影響を受けている。したがって、なるべく多数の個体の免疫的経歴を反映できるように、多様なＢ細胞から重鎖可変領域遺伝子を調製するようにする。実際には、臍帯血、扁桃、末梢血、あるいは骨髄等、入手可能な重鎖可変領域遺伝子ソースの種類を増やす。
更に、免疫原（自己の抗原も含む）と一度も接触していないｎａｉｖｅなＢ細胞集団からＢ細胞を調製することも重要である。なぜならば、自己の成分と反応するクローンは免疫系の成熟時に排除されるからである。自己抗原に対する抗体レパートリーをも含む遺伝子ライブラリーとするには、ｎａｔｉｖｅなＢ細胞は重要である。そして混合に際してはリンパ球数とクローン数が比例するように心がける。最終的には１０^９オーダー（１０^９〜１０^１０）の独立したＶＨＤＪＨライブラリーを作製する。
このような操作は、次のような意義を持つ。抗体の抗原結合面を構成するアミノ酸配列は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２についてはゲノム上に存在する遺伝子によって規定されており（進化的な選別も含めて）、その多様性の総数は１万種程度である。その上に重鎖ＣＤＲ３の極端に高い多様性が上積みされる。そこで抗体ライブラリーとしてはこの１万種の多様性はできる限り一様に偏り無い形で含んだ上で、重鎖ＣＤＲ３（これは個々人、個々のＢ細胞でランダムなプロセスで作られている）についてはなるべく広範囲にライブラリー化される必要がある。上記の方法はこの要求を満たしている。
以上のような解析を通じて、本発明者らは、ＣＤＲの中にシステイン残基を含む場合には、ＶＨ遺伝子の発現が正しく起こらなかった等の知見を得た。また、作製した重鎖可変領域ライブラリーに関して、その７０％以上が大腸菌中での発現と重鎖可変領域ドメインとの会合−ｆｏｌｄｉｎｇ−が正しく起きていることが確認できた。
あるいは免疫履歴を逆用し、重鎖可変領域遺伝子のソースを選択することによって、あるていどライブラリーを特徴付けることができる。たとえばある感染症の既往歴を持つ場合には、その病原体に対して親和性の高いイムノグロブリンを得られる可能性が高まる。あるいはがん患者の抗体産生細胞を重鎖可変領域遺伝子のソースとすることにより、腫瘍抗原を認識するイムノグロブリンを得ることもできる。
更に、ＶＨ遺伝子に対して人為的な変異を加えることによって、ライブラリーの多様性を高めることができる。人為的な変異を与える方法としては、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，４３３−４５５，１９９４）が公知である。前記ライブラリーにおいては、軽鎖可変領域におけるｄｅｆｅｃｔｉｖｅ遺伝子が実質的に排除されているため、重鎖可変領域遺伝子の多様性は、そのままライブラリーの多様性として反映される。したがって、公知のｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを適用した場合であっても、はるかに高度な多様化を達成することができる。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲは、以下のように行うことができる。
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲは、無作為に点突然変異を導入する方法として用いられる手法である。具体的には、ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼの以下の生化学的性質を用いる。
（１）Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは通常Ｍｇ^２＋イオン存在下で用いられるが、Ｍｎ^２＋イオンの存在下では塩基の取り込みに誤りを起こしやすくなる。
（２）ＰＣＲ反応時に塩基の供給源としてｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰを通常は等量で混合するが、この濃度を突然変異を起こしやすいように変更する。
（３）上述の塩基の供給源としてｄＩＴＰを混合する。ｄＩＴＰはＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによってＤＮＡ鎖にとりこまれると塩基イノシンを形成する。イノシンはどの塩基とも塩基対を形成しないので、ＰＣＲ反応が進行するとイノシンに相補的な塩基の部分には無作為の塩基が挿入される。
以上のような３つの条件の相乗的効果により、突然変異が無作為に導入される。具体的には、たとえば７．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ、１．０ｍＭ ｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ、０．１−１．０ｍＭ ｄＩＴＰのような条件で反応を行う。実際には、実験の目的に合わせて更に濃度条件などを調整する。温度などの反応条件は通常のＰＣＲと同様に設定する。
上記の遺伝子ライブラリーの調製には、公知のベクターを用いることができる。本発明に用いることができるベクターとしては、たとえば先に調製した軽鎖可変領域遺伝子ライブラリーを保持したファージライブラリーを示すことができる。すなわち、ファージミドが保持している軽鎖可変領域遺伝子の上流に重鎖可変領域遺伝子を挿入するのである（Ｇｅｎｅ １９４（１９９７）３５−４６ Ｉｂａ Ｙ ｅｔ ａｌ）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域を同時に表面に発現するファージライブラリーを用いれば、本発明の選択方法に利用可能なライブラリーとすることができる。すなわち、前記遺伝子ライブラリーをファージライブラリーとして構成することによって、ｒｇｄｐライブラリーとすることができる。遺伝子ライブラリーは、ファージのみならず、リボゾームや大腸菌鞭毛タンパク質の融合タンパク質として外来遺伝子を発現するシステムを用いることによってｒｇｄｐライブラリーとすることができる。
代表的なｒｇｄｐライブラリーとして、ファージライブラリーが挙げられる。上記の抗体ライブラリーに基づくファージライブラリーは、次のようにして得ることができる。ファージ表面に外来タンパク質を発現させるには、一般にファージミドとヘルパーファージが用いられる。例えば、ｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア製）などのファージミドベクターが市販されている。ファージミドには、ｃｐ３やｃｐ８等のファージの構成タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい外来タンパク質をコードする遺伝子を連結する。
ファージミドは、大腸菌などの宿主に感染させることによって増幅できる。しかしこの状態ではファージ粒子として回収することはできない。いわば、一般の遺伝子ライブラリーと同じ状態にある。ファージミドが保持する外来タンパク質を表面に提示したファージ粒子とするには、ファージミドを感染させた宿主にヘルパーファージを重感染させる。たとえばファージミドベクターｐＴＺ１９Ｒは、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７の重感染によってファージ粒子として回収することができる。このとき利用されるファージミドのｃｐ３タンパク質が外来タンパク質と融合されていれば、完成するファージの表面には外来タンパク質が提示されることになる。
市販のファージミドに抗体の遺伝子のクローニングに好適な制限酵素サイトを導入しておけば、本発明による軽鎖可変領域遺伝子ライブラリーを重鎖可変領域遺伝子ライブラリーとともに組み込むことができる。ファージミドベクターｐＴＺ１９Ｒに適当な制限酵素サイトを導入し、ＰＣＲで増幅した抗体遺伝子ライブラリーを組み込む方法が公知である（Ｇｅｎｅ １９４，３５−４６，１９９７）。以下に述べる実施例においては、ファージミドベクターのシグナル配列ＰｅｌＢの下流にＳｆｉＩサイトとＡｓｃＩサイトを導入した。一方、軽鎖可変領域遺伝子の増幅には、同じサイトを導入したプライマーを用いる。ＰＣＲの増幅生成物を当該制限酵素で消化してこのサイトに組み込むことにより、ＰｅｌＢの下流に抗体可変領域遺伝子が挿入され、更にその下流に位置するｃｐ３との融合タンパク質をコードするファージミドベクター（図１のｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ）とすることができる。
あるいは、重鎖可変領域遺伝子を細菌宿主発現用のベクターに挿入することもできる。この場合には、ベクターを細菌に形質転換することによって重鎖可変領域遺伝子を発現させる。得られた形質転換細胞に、更に軽鎖可変領域遺伝子を保持したファージライブラリーを感染させることにより、結果的に本発明のための遺伝子ライブラリーが完成する。大腸菌の形質転換用ベクターとしては、ｐＦＫ等を示すことができる。なお細菌に形質転換するには、重鎖可変領域遺伝子を適当な分泌シグナルの下流に連結することによって、重鎖可変領域タンパク質をペリプラズムに分泌させることができる。ｐＦＫは、分泌シグナルとしてｐｅｌＢを備えたベクターである。
本発明によって選択された結合性分子は、結合対象物質に対する結合活性に優れる。したがって本発明によって選択される結合性分子のうち、病原因子を結合対象物質として選択された結合性分子には、中和活性を期待することができる。つまり、本発明によって選択された結合性分子の中和活性を確認すれば、中和物質を選択することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む中和物質の選択方法に関する。
１）中和すべき物質を特定の物質として用い、本発明の方法によって、中和すべき物質に対する結合活性を有する結合性分子を選択する工程、および
２）選択された結合性分子の中和活性を評価し、中和活性を有する結合性分子を選択する工程、
本発明において、結合性分子の中和活性を評価し、中和活性を有する結合性分子を選択する工程は、病原性因子に対する結合性分子の中和活性の評価に基づいて行われる。病原性因子の中和活性の評価方法は公知である。たとえばウイルスや毒素の場合、結合性分子を添加しない対照と比較して、培養細胞に対するウイルスや毒素の影響を結合性分子の添加によって抑制することができれば、その結合性分子が中和活性を有することがわかる。評価の結果、中和活性を有すると判断された結合性分子は、中和物質として有用である。
本発明によって選択された中和活性を有する結合性分子は、そのまま、あるいはより安全な投与形態に改変して、病原性因子の中和に利用することができる。たとえば抗体可変領域であれば、選択されたファージクローンが保持した可変領域をコードする遺伝子を回収し、Ｆａｂ、あるいはキメラ抗体として発現可能なベクターに組み込む。中和抗体としての作用を期待する場合には、Ｆｃ部分を備えたキメラ抗体とするのが望ましい。あるいは、当該可変領域を構成するＣＤＲを、ヒトイムノグロブリンのＣＤＲ領域に組み込んでヒト化抗体とする技術も公知である。いずれにせよ、Ｆｃ部分を備える完全なイムノグロブリン分子とすることで、正常なイムノグロブリンが生体内において有している異物除去機能を模倣させることができる。
イムノグロブリンは、公知の方法によって生体に投与することができる。より具体的には、静注などによって血中に投与することにより、その中和作用を生体に導入することができる。イムノグロブリン製剤の投与量は、投与対象者の性別、体格、症状、年齢などの条件を考慮して、当業者が適切な量を選択することができる。具体的には、体重１ｋｇ当たり、たとえば２〜４００ｍｇ／回、通常３〜２００ｍｇ／回が投与される。
本発明に基づく、中和活性を有する結合性分子の選択方法は、あらゆる病原性因子に対して応用することができる。本発明によって中和活性を有する結合性分子を選択することができる病原因子として、たとえば以下の病原性因子を示すことができる。これらの病原性因子を結合対象物質として利用することにより、本発明に基づいて中和活性を有する結合性分子を選択することができる。
ウイルス：
インフルエンザウイルス
水痘ウイルス
ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）
ＨＢＶ（Ｂ型肝炎）
麻疹ウイルス
病原細菌：
病原性大腸菌
黄色ブドウ球菌
腸球菌
病原毒素：
ベロ毒素
ハブ毒素
以下に、結合対象物質としてインフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ蛋白質）を例に、本発明に基づく結合性分子、並びに中和物質の選択方法の原理を説明する。ＨＡ蛋白質は赤血球を凝集する機能を有する蛋白質（ヘマグルチニン；ＨＡ）で、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）と共にインフルエンザウイルス粒子の表面に存在する外殻スパイク蛋白質である。現在、インフルエンザウイルスの感染予防方法としては、不活化インフルエンザワクチンの接種が最も一般的である。一般にインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスを鶏卵に接種し、その漿尿液中に蓄積するウイルス粒子を原料として製造される。漿尿液から回収し、濃縮したウイルス粒子をホリマリン等で不活化したウイルス全粒子ワクチンや、ウイルス粒子を分解したＨＡ蛋白質画分を利用したＨＡサブユニットワクチン等が製造されている。
Ａ型には１５種類のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１５）があるが、ＨＡ蛋白質は変異を起こしやすく、同一亜型内であっても多少の変異が見られる。このような変異は、抗原ドリフトと呼ばれている。インフルエンザワクチンが最も有効に機能するためには、ワクチンとして用いたウイルスのＨＡ蛋白質の抗原性が流行ウイルスの抗原性と一致することが重要である。つまり、ＨＡ蛋白質の抗原性に応じた中和抗体の存在が、インフルエンザウイルスの感染予防には重要である。
発明者らは、細胞あるいはウイルスなどの外表面に存在している糖鎖に注目した。哺乳動物細胞では、蛋白質合成後ゴルジ体という細胞内小器官において、蛋白質に糖鎖が付加される。糖鎖は一定のアミノ酸配列に対して付加される。例えば、アスパラギンに対する糖鎖付加であれば、［Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］というモチーフのＡｓｎに糖鎖が付加される。
この糖鎖の付加は蛋白質を細胞表面へ送るシグナルとなっている。したがって細胞表面の蛋白質は糖鎖が付加されているものが多い。ウイルスもそのシステムを利用し、糖鎖の付加した外被蛋白質を宿主細胞表面に送り、発芽して成熟ウイルスを形成する。従って、ウイルス表面も糖鎖の付加した蛋白質が数多く見られることとなる。
インフルエンザウイルスの粗精製物に関しては、表面蛋白質であるＨＡ蛋白質が糖鎖の修飾を受けている。また、粗精製ＨＡ蛋白質中の、ＨＡ蛋白質以外の主要な蛋白質成分であるＮＰに関しては、糖鎖は付加されていない。本発明者らは、粗精製ＨＡタンパク質の糖鎖にビオチンを化学的に結合したのち、ファージ抗体ライブラリーと反応させ、ビオチン化ＨＡタンパク質と結合した抗体をストレプトアビジンマグネットビーズを用いてストレプトアビジンマグネットビーズ−ビオチン化ＨＡタンパク質−抗体という複合体の形で回収した。このとき、糖鎖がついていないＮＰはビオチンが結合していないので、ストレプトアビジンマグネットビーズに吸着されないため、ＮＰに結合していた抗体は回収されない。
このようにして、粗精製ＨＡタンパク質中に多量に混入しているＮＰに反応する抗体を有効に除くことができた。あるいは、この操作だけでＨＡタンパク質と結合する抗体が得られることも考えられる。
また、ＨＡの場合、糖鎖の修飾は活性に関係のない部分にも生じており、ＨＡは活性に係わらない部分を介してビオチンというスペーサー（間隔）で担体に結合することとなる。このため、ＨＡ蛋白質は立体構造が担体による影響を受けること無く保持されスクリーニングに好適な環境となる。
本発明の方法は、インフルエンザウイルス以外にも適用することができる。たとえば次のような病原ウイルスの糖蛋白質は、それぞれ感染において重要な役割を果たしている。つまりいずれの蛋白質抗原も中和抗体の標的とすべき蛋白質である。したがって、上記の方法を応用して本発明に基づく中和抗体の選択と製造が可能である。
−ＨＩＶのｇｐ１２０（ＨＩＶ／エイズウイルス）
−ＨＴＬＶ−１のｇｐ４６（成人Ｔ細胞性白血病ウイルス）
−ＨＢＶのＨＢｓ蛋白質（Ｂ型肝炎ウイルス）
−ＨＣＶのＥ１，Ｅ２（Ｃ型肝炎ウイルス）
また、哺乳動物細胞表面の蛋白質においても糖鎖を通じてビオチン化し、その後界面活性剤などを利用して溶解して、アビジンビーズもしくはストレプトアビジンビーズを用いて精製することによって、細胞膜表面の蛋白質のみを特異的にスクリーニングすることが可能である。あるいは糖鎖が付加されている毒素あるい蛋白質などの中和物質を得るためにも応用可能である。
糖鎖にビオチンを付加する具体的な方法としては、ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ビオチン−ＬＣ−ヒドラジド）を用いることができる。この試薬は市販されており、またキットも市販されているので購入することにより実施可能である。
中和物質の標的となるのは、ほとんどといって良いほど、細胞表面の蛋白質である。細胞表面の物質を選択的にスクリーニングすることができる本発明はその意味でも有力な方法であると考えられる。
更に本発明は、本発明の結合性分子の選択方法に用いられる各要素を予め組み合せたキットを提供する。すなわち本発明は、次の要素を含む、結合性分子の選択用キットに関する。
Ａ）結合対象物質のマーカーに親和性リンカーを結合させるための手段；ここでマーカーとは、目的とする結合対象物質を共存する可能性のある物質と識別可能なマーカーを言う
Ｂ）前記親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナー、および
Ｃ）結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリー
本発明のキットを構成する各要素としては、具体的には先に述べたとおりのものを用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
１．インフルエンザワクチンのビオチン化
ＨＡ抗原９０μｇ相当分（インフルエンザワクチン１９９９年１ｍＬ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で４℃一晩透析し、０．２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＩＯ_４ ｉｎ ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）を添加し、暗所で３０分攪拌して、糖鎖部分の酸化を行った。次に、１．５Ｍグリセロールｉｎ ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）を１０μＬ添加し、５分反応させ、酸化反応を停止させた。再度、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で４℃一晩透析し、５０ｍＭ ＥＺ−Ｌｉｎｋ^ＴＭＢｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ピアス社製ｃａｔ Ｎｏ．２１３４０）を１００μＬ添加し、室温で２時間攪拌させながら反応させたのち、ＰＢＳバッファーに対して４℃で一晩透析した。これらの操作により、糖蛋白質の糖鎖部分へ選択的にビオチンを結合することができる。これによって得られたビオチン化インフルエンザワクチンを以下のスクリーニングに使用した。
スクリーニングのために、以下２から４のようにして、軽鎖可変領域遺伝子として、重鎖可変領域遺伝子の発現産物との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子を含む抗体ファージライブラリーを調製した。この抗体ファージライブラリーは、生体内のイムノグロブリン遺伝子のポピュレーションを忠実に再現している。したがって、理論的には、生体において産生される可能性のあるあらゆる抗体を、このライブラリーから選択することができる。
２．ライブラリー作製用ファージミドベクターの作製
２−１ 重鎖および軽鎖の組合せライブラリーを作製するためのベクターの作製。
図１に概念的に示すように、ｐＴＺ１９Ｒファージミドベクター（ファルマシア）にＭ１３ファージのｐｅｌＢ（シグナル配列）、Ｈｉｓ６タグ配列、Ｍ１３ファージのｃｐ３タンパク質（Δｃｐ３（１９８ａａ−４０６ａａ）Ｎ端欠失キャプシドタンパク質３）配列、およびｐｒｏｔｅｉｎＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを適当な制限酵素部位で組み込みベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄを作成した（ＧＥＮＥ １９４（１９９７）３５−４６ Ｉｂａ Ｙ ｅｔ ａｌ参照）。軽鎖λ５，λ６遺伝子に存在するＢｓｔＰＩでその遺伝子が切断されることを避けるためにｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄはＸｈｏＩ部位が設けられている。ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を図２に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図３〜図５に示した。
このベクターの所定の位置に重鎖と軽鎖の遺伝子を挿入することにより、実際の抗体タンパク質発現ベクターが完成することとなる。完成したベクターによって発現される抗体の形状はＦａｂ型であり、重鎖軽鎖はＮ末の可変領域に続いて定常領域ＣＨ１，ＣＬをそれぞれ有している。定常領域同士の−ＳＳ−結合によって、重鎖と軽鎖は結合されることになる。軽鎖定常領域ＣＬ遺伝子は前述のｃｐ３遺伝子と結合されており、結果として発現タンパク質はＦａｂ−ｃｐ３の形状となる。
具体的には、以下のような操作を行った。
用いたプライマー：

ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ 重鎖部分の作製
１）ｐＡＡＬＦａｂを鋳型にして５２７−５９９を用いたＰＣＲ，５４７−５９０を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した。
２）５４４−５４５，５４６−５４７，５４８−５４９にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
３）１）２）を混合し５２７，５９０によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ軽鎖部分
４）５４２−５６２，５６１−６１３を用いたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
５）５３８−５３９，５４２−５４３にてＰＣＲを行いＤＮＡ断片を作製した
６）４）５）を混合し５３８，５６２によるＰＣＲを行い、これをｐＡＡＬＦａｂのＳａｃＩ−ＮｈｅＩ ｓｉｔｅにクローニングした
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ
６）ＶＨ ｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８ＴをＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩにて消化、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを作用させて平滑末端に変えた後ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＨ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製した。
７）ＶＨ ｓｔｕｆｆｅｒ部分の作製
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６００にてＰＣＲ。６）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
８）これをＫｐｎＩにて消化、ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎさせてＶＬ部分のｓｔｕｆｆｅｒを作製
９）ＳｆｉＩ，ＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−６６３にてＰＣＲ。１）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
１０）ＡｓｃＩ ｓｉｔｅの導入
ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを鋳型にして５２７−ＬＣＰ３ＡＳＣにてＰＣＲし、それをＳａｃＩ完全消化、ＳａｌＩ部分消化した２）にクローニングした。
１１）ｇａｍｍａＣＨ１部分をヒト遺伝子に変換
ヒトｇａｍｍａＣＨ１部分にはＢｓｔＰＩ ｓｉｔｅが存在するためこれをなくす設計でクローニングを行った。扁桃ｃＤＮＡを鋳型にしてｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１ｍｉｄＳ，ｈＣＨ１ｍｉｄＡＳ−ｈＣＨ１Ｈ６にてＰＣＲしたのち、これを混合してｈＣＨ１Ｂｓｔ−ｈＣＨ１６ＳｍａにてＰＣＲし、そのＤＮＡ断片を３）のＢｓｔＰＩ−Ｓｍａ ｓｉｔｅにクローニングした。
１２）Ｘｈｏ ｓｉｔｅの導入
１１）を鋳型に７０２−６６３にてＰＣＲを行い、これを１１）のＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングした。
２−２ 重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターの作製
公知の手法（ＧＥＮＥ １９４（１９９７）３５−４６ Ｉｂａ Ｙ ｅｔ ａｌ参照）に従って、まずｐＡＡＬＦａｂベクター（図１）を作製した。ｐＡＡＬＦａｂベクターのＸｂａＩからＥｃｏＲＩの間を欠落させ、新たに制限酵素切断部位Ｋｐｎ Ｉ，Ｓｆｉ Ｉ，Ｎｃｏ Ｉ，Ｓｐｅ Ｉを付加して、ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔを経て、ＶＨ（重鎖可変領域）をクローニング可能としたベクターｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１）を作製し、重鎖可変領域を一時的にクローニングするためのベクターとした。ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を図６に、制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を図７〜図８に示した。
具体的には

ｐｒｉｍｅｒ６１０とｐｒｉｍｅｒ６１１をアニールさせ、それをｐＦＣＡＨ３−Ｅ８ＴのＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ ｓｉｔｅにクローニングしてｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎの作製を行なった。さらに、ｐｒｉｍｅｒ５２７とｐｒｉｍｅｒ６１９にてＰＣＲを行い、これをさらにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ ｓｉｔｅにクローニングし、ＳｆｉＩ，ＮｃｏＩ ｓｉｔｅへ導入した。
３．イムノグロブリン軽鎖ライブラリーの作製
３−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン軽鎖遺伝子の単離
骨髄細胞（検体Ｎｏ．５９）４×１０^７ｃｅｌｌｓ、および臍帯血と末梢血のリンパ球から、市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製 ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、２．６μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによって作製した。プライマーには、オリゴｄＴを用いた。得られたｃＤＮＡを鋳型にして、軽鎖遺伝子の取得用５’プライマー（κ１〜κ６、λ１〜λ６）と３’プライマー（ｈＣＫＡＳＣプライマーまたはｈＣＬＡＳＣプライマー）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μｌのＴＥバッファーに懸濁した。用いたプライマーの塩基配列とＰＣＲの条件は以下のとおりである。軽鎖遺伝子取得用プライマーの塩基配列中、下線部はＳｆｉＩサイト、ＡｓｃＩサイトを示す。
５’−プライマーκ１〜κ６

５’−プライマーλ１〜λ６

ＰＣＲの条件

３−２ ライブラリー作製に適した軽鎖を選択して軽鎖遺伝子ライブラリーを作製する方法
３−２−１ 軽鎖遺伝子のファージミドへの組込み
１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。

３７℃で１時間、５０℃で１時間反応後、そのうち１０μｌ分をアガロース電気泳動し、６００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ（図２）をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。

３−２−２ ファージミドの大腸菌への導入
得られたｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを用いて以下のように大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。即ち、ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μｌに溶解した。そのうち、１．５μｌをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ製）２０μｌに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーター

３−２−３ ファージミドで形質転換した大腸菌からのＦａｂ−ｃｐ３型抗体培地中への分泌
形質転換した上記の大腸菌を形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍｌに植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＴＹ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でｉｎｃｕｂａｔｅし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、軽鎖遺伝子の塩基配列を調べた。
ＳＯＢ培地：９５０ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後２５０ｍＭのＫＣｌ溶液１０ｍＬを加え、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した。精製水を加えて１０００ｍＬに調整した後、オートクレーブで２０分間滅菌し、使用直前に滅菌した２ＭのＭｇＣｌ_２を５ｍＬ加えた。

２×ＹＴ培地：９００ｍＬの精製水に次の成分を加えて振とうし、完全に溶解した後５ＮＮａＯＨでｐＨを７．０に調製し、精製水を加えて１０００ｍＬとした。オートクレーブで２０分間滅菌して使用した。

その他の試薬は以下から購入した。
メーカー 品名
シグマ アンピシリンナトリウム
和光純薬 フェノール
シグマ ＢＳＡ
ＤＩＦＣＯ ２×ＹＴ培地
和光純薬 カナマイシン硫酸塩
ナカライテスク ポリエチレングリコール６０００
ナカライテスク Ｔｗｅｅｎ２０
片山化学 ＮａＣｌ
和光純薬 ＩＰＴＧ
和光純薬 スキムミルク
和光純薬 アジ化ナトリウム
和光純薬 トリエチルアミン
和光純薬 過酸化水素
和光純薬 ＯＰＤ錠
和光純薬 エタノール
κ１、κ２、κ３、κ４、κ５、およびκ６、並びにλ１、λ２、λ３ａ、λ３ｂ、λ４、λ５、λ６、λ７、λ８、λ９、およびλ１０の全てについて以上の操作を行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。続いてκ１、κ２などの各グループのクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合した。これら軽鎖の各グループは、それぞれ実際の生体内でどのような割合で発現しているのかが既に知られている。ＰＣＲ法で増幅してベクターに組み込んだこれらの遺伝子クローンを、ｉｎ ｖｉｖｏ）での使用頻度に近い比率になるように混合しＶＬライブラリーとした。ＶＬライブラリーにおける各ｆａｍｉｌｙの構成比率を以下に示す。

次に、ＶＬライブラリーから無作為に選んだ約１０００個の軽鎖遺伝子の塩基配列を確認した。すなわち、蛍光プライマーｈｕＣＨ１Ｊ（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧＧ−３’／配列番号：４５）を用い、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって塩基配列を決定した。得られた塩基配列を比較して重複するクローンを除いた。更にデータベースと照合し、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認されたクローンについて、予め発現することがわかっている重鎖遺伝子のクローンの一つＶＨ３−４と組み合わせて、発現実験を行った。操作は以下のとおりである。ＶＨ３−４のアミノ酸配列を配列番号：１に示した。
まずＶＨ３−４をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。一方、ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンについてもＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製し、ＶＨ３−４の重鎖遺伝子とライゲーションすることにより、組み合わせた。得られたｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。生えてきたコロニーを試験管にいれた培地にうえ、ＩＰＴＧで発現を誘導することにより、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子を培養上清中に発現させた。２０時間程度の培養により、ヘルパーファージの感染無しでもＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子が培養上清に発現される。この培養上清を用いて以下のようなＥＬＩＳＡを行った。
３−２−４ ＥＬＩＳＡ法による重鎖と軽鎖の正しい発現と会合の検定
１）抗体結合９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレートの作製
抗κ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１５９）を０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ＮａＮ_３で１．２５μｇ／ｍｌで希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加した。４℃で一晩静置することにより、ウエルに抗κ抗体を吸着させた。反応液を捨て、５％ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ＮａＮ_３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し、３７℃で２時間静置することにより、非特異的な吸着を防ぐためにブロッキングした。
次に、非特異的活性吸収済の抗λ抗体（ＭＢＬ ｃｏｄｅ Ｎｏ．１５９）を０．０１Ｍナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ＮａＮ_３で２．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し氷室で一晩静置した。反応液を捨て、５％ＢＳＡ ｉｎ ０．０１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ８．０，０．１％ＮａＮ_３を２００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で２時間静置し、非特異的な結合を防ぐためにブロッキングを行った。
２）１次反応
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌとして、ヒトＦａｂ（１０μｇ／ｍｌ）を、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ_３をそれぞれ１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加した。ＩＰＴＧでＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現を誘導した培養上清の原液を１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
３）２次反応
１次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ_３で希釈した抗Ｆｄ抗体（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
４）３次反応
２次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いでＰＢＳ／０．１％ＮａＮ_３で希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（４０００倍希釈）を１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加し３７℃で１時間反応させた。
５）発色反応および吸光度測定
３次反応を終了したマイクロタイタープレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄した。次いで発色基質溶液（ＳＩＧＭＡ １０４０ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔａｂｌｅｔｓ １粒あたり５ｍｌの５０ｍＭジエタノールアミンＰＨ９．８に溶解したもの）を１００μｌずつマイクロタイタープレートに添加した。室温で反応させ、４０５ｎｍの吸光度が０．５以上になったと思われる時点で、停止液を添加し、プレートリーダー（タイターテック マルチスキャンＭＣＣ）で吸光度測定した。
このＥＬＩＳＡで陽性（吸光度０．５以上）となったクローンは、Ｆａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているとし、κ鎖遺伝子、λ鎖遺伝子それぞれ反応性の高いものから１００個ずつ選択した。両者を混合してＦａｂ−ｃｐ３型の抗体分子の発現と会合がうまく行われているクローンを集めたライブラリーＫＬ２００とした。
４．軽鎖遺伝子ライブラリーと重鎖遺伝子ライブラリーの組み合わせライブラリーの作製
４−１−１ ＰＣＲを用いたイムノグロブリン重鎖遺伝子の単離
３−１と同様の手順を用いて臍帯血、骨髄液、および末梢血のリンパ球、並びに扁桃からｈｕｍａｎ μ ｐｒｉｍｅｒ（以下に示すプライマーの６３４）あるいはｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを用いてｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを鋳型にして、以下に示すヒト抗体重鎖遺伝子の取得用５’プライマー（ＶＨ１〜ＶＨ７）と３’プライマー（ｈｕｍａｎ ＪＨプライマー４種を等量混合したもの、以下に示すプライマーの６９７〜７００）、または、ｈｕｍａｎ μ プライマー（以下に示すプライマーの６３４）を用いて、ＰＣＲを行った。表中、下線をつけた部分はＳｆｉＩサイトを示す。ｈＶＨ２ａはｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ２ ｆａｍｉｌｙに対応していないため、新たにＶＨ２ａ−２を設計した。またｈＶＨ４ａではＶＨ４ファミリー全体に対応していないため、新たにｈＶＨ４ａ−２を設計した。ＶＨ５ａもｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ＶＨ５ ｓｕｂｆａｍｉｌｙに対応していなかったため新たにＶＨ５ａ−２を設計した。またＶＨ７に対応するｐｒｉｍｅｒとしてｈＶＨ７を設計した。これらについても遺伝子増幅を行い、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（０−２）に組み込み、その塩基配列を決定することによって、どのような遺伝子が増幅されたのかを確認した。ｈＶＨ５ａ−２についてはｈＶＨ１ａと配列が酷似しているため、ｈＶＨ１ａで増幅させたものと同様の遺伝子産物が得られることが予想されるためこれについては使用しなかった。ＰＣＲ産物は、フェノール処理後、エタノール沈殿して１０μＬのＴＥバッファーに懸濁した。

４−１−２ 重鎖遺伝子ライブラリーの作製
４−１−１で得たＰＣＲ産物を以下の条件で制限酵素処理した。

３７℃で２時間反応後、そのうち１０μＬ分をアガロース電気泳動し、４００ｂｐ付近のバンドを切り出して、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。ＰＣＲ産物と同様に制限酵素処理したｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ（図１）をジーンクリーンＩＩキットで精製し、制限酵素処理したＰＣＲ産物と以下の条件で１６℃で４時間〜一晩反応させることによりライゲーションした。

４−１−３ ファージミドの大腸菌への導入
得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１２Ｓに形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３μＬに溶解する。そのうち、１．５μＬをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、エレクトロポレーション法により形質転換した。

形質転換用培地（ＳＯＢ）２ｍｌに上記操作の終了した形質転換大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地で培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーを楊枝でつついて分離し、それぞれプラスミドを調製し、重鎖遺伝子の塩基配列を調べた。ＶＨ１〜ＶＨ７の全てについてこれらのことを行い、目的のクローンが得られているかどうか確認した。これらの各グループ（ファミリー）のクローンをｉｎ ｖｉｖｏでの使用頻度に近い比率になるように混合してＶＨライブラリーとした。ＶＨライブラリーにおける各ファミリーの構成比率を以下に示す。

４−２ 組み合わせ遺伝子ライブラリーの作製
ＶＨライブラリー２００μｇを下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、重鎖遺伝子を切り出して、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。

ｄｅｌｅｔｉｏｎが無いと確認された軽鎖遺伝子クローンＫＬ２００、およびＶＬライブラリーの挿入されたベクターｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄについても下記条件でＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、軽鎖遺伝子を含む断片を、ジーンクリーンＩＩキットで精製した。

次に、ＶＨ遺伝子ライブラリー断片と軽鎖遺伝子の挿入されたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄベクターを、次の条件下、１６℃で一晩反応させてライゲーションした。

反応の終了したＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ１２Ｓを形質転換した。具体的にはＤＮＡを一旦エタノール沈殿し、１／５ＴＥ（ＴＥを滅菌済ＭｉｌｌｉＱで５倍希釈したもの）３０μＬに溶解した。これをコンピテントセルＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）５００μＬに懸濁し、エレクトロポレーションを行った。

形質転換用培地（ＳＯＢ）１２ｍｌに上記操作の終了した大腸菌を植え、３７℃で１時間振盪培養したあと、一部を寒天培地（Ａｍｐプレート）にまき、残りは、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地５００ｍｌで培養し、グリセリンストックした。寒天培地は３０℃でインキュベートし、生えてきたコロニーの数から得られたクローンの数を推定した。それぞれ５×１０^１０クローンが得られた。
扁桃ｍＲＮＡよりｒａｎｄａｍ ｈｅｘａｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ１とした。（１．２８×１０^１０の独立したクローン）
臍帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ μ Ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターにクローニングし、ＫＬ２００と組み合わせた遺伝子ライブラリーをＡＩＭＳ２とした．（３．２０×１０^１０の独立したクローン）
臍帯血、骨髄液、末梢血、扁桃ｍＲＮＡよりｈｕｍａｎ μ Ｐｒｉｍｅｒにて合成したｃＤＮＡをもとに得た各ＶＨ ｆａｍｉｌｙをＶＬ ｌｉｂｒａｒｙと組み合わせたライブラリーをＡＩＭＳ３とした。（４．５０×１０^１０の独立したクローン）
更に（ＡＩＭＳ１＋ＡＩＭＳ２）：ＡＩＭＳ３＝１：１で混合し、１×１０^１１の独立したクローンからなるファージ抗体ライブラリーとした（ＡＩＭＳ４と呼ぶ）。
４−３ 組み合わせ遺伝子ライブラリーによるファージライブラリーの作製
４−３−１ ファージライブラリーの調製
１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地３００ｍＬを入れた５リットルのフラスコにＡＩＭＳ４懸濁液を２．５ｍＬを加え、３７℃で振とう培養し１時間おきに波長６００ｎｍにおける吸光度を測定しながら、吸光度が１．０になるまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ液（Ｍ１３ＫＯ７）をフラスコ当たり１２ｍＬ加えてヘルパーファージを感染させ、３７℃で２時間培養し、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓとした。
３リットルのフラスコ２４本に２×ＹＴ培地６００ｍＬと１００μｇ／ｍＬのアンピシリン１．２ｍＬ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン０．８ｍＬ、ヘルパーファージ感染済みＤＨ１２Ｓ ２００ｍＬを加えて３７℃で２時間毎に波長６００ｎｍの吸光度を測定しながら振とう培養した。アンピシリンは、測定毎に２００μｇ／ｍＬとなるよう追加した。培養は波長６００ｎｍにおける吸光度が１．３になるまで行った。
菌体は４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を集めた。上清に２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ４Ｌを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心、沈殿を１ＬのＰＢＳで溶かし、２０％のポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ２００ｍＬを加えて約２０分間静かに攪拌した後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を捨ててさらに４℃で８０００ｒｐｍ、３分間遠心して沈殿を回収した。沈殿は０．０５％ＮａＮ_３を加えたＰＢＳで溶解し、４℃で１０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を回収した後、４℃で８０００ｒｐｍ、３分間さらに遠心して上清を回収した。
回収したファージ溶液の力価は以下のようにチェックした。すなわち、ファージ溶液をＰＢＳで１０^６、１０^７、１０^８希釈し、その１０μＬをＤＨ１２Ｓ ９９０μＬに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをＬＢＧＡプレートに１００μＬ播いて３０℃で１８時間培養した。コロニーの数をカウントすることにより希釈前の原液の力価を算出した。ファージ溶液原液を２％スキムミルク及び０．０５％ＮａＮ_３を含むＰＢＳに２×１０^１４／ｍｌになるよう懸濁した。
４−３−２ Ｆａｂ−ｃｐ３を表面に発現しているファージを濃縮する方法
以上のようにして調製したライブラリーには、Ｆａｂ−ｃｐ３をその表面に発現しているファージを選択的に濃縮し、ヘルパーファージやＦａｂ−ｃｐ３の発現していないファージの混入割合を減少させるための工夫が施されている。すなわち上記ライブラリーを構成するファージが発現する重鎖のＣ末端には、Ｈｉｓ６ペプチド（ヒスチジンタグ）が付加されている。ヒスチジンタグを発現したファージは、ニッケルイオンなどに吸着することを利用して容易に回収することができる。具体的にはニッケルイオンが付加されたゲル（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース等）を用いる。操作は以下のとおりである。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを２％スキムミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下ブロッキング緩衝液）で室温で３０分ブロッキングした。次に、重鎖にＨｉｓ−Ｔａｇが付加されていないＦａｂを表面に発現しているファージ（ｐＦＣＡ−Ｅ９ＨＬφ；ファージＨｉｓ−）と重鎖にＨｉｓ−Ｔａｇが付加されているＦａｂを表面に発現しているファージ（ｐＦＣＡＨ６−Ｄ１．３ＨＬφ；ファージＨｉｓ＋）をファージＨｉｓ−：ファージＨｉｓ＋＝１００：１となるようにブロッキング緩衝液中で混合した。これらの合計１×１０^１０ＣＦＵのファージ溶液２５０μＬをＮｉ−ＮＴＡアガロースと混合し、室温１時間反応させた。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースをブロッキング緩衝液で洗浄し、次いで０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ７．５５）５００μＬを加えてＮｉ−ＮＴＡアガロースに結合していたファージを溶出した。
溶出したファージを回収し、回収したクローンを調べてみたところ、２３クローン中１５クローンがファージＨｉｓ＋であった（表４）。このことはＮｉ−ＮＴＡアガロースにより、Ｈｉｓ６ペプチドが付加されたファージが５３倍に濃縮されたことを示している。
この操作を加えることにより、ライブラリーの性能を向上させ、あるいはスクリーニングの能率を上昇させることが可能であることが示された。

５．ビオチン化インフルエンザワクチンを用いた抗ＮＰ抗体の除去
ＮＰタンパクには糖が結合していないが、ＨＡタンパクには糖が結合していることを利用し、１．でＨＡ蛋白質の糖鎖部分をビオチン化した。このビオチン化抗原に抗体ファージを結合させ、ストレプトアビジンマグネティックビーズで、ビオチン化抗原−抗体ファージ複合体を回収すると、ビオチン化されていないＮＰタンパクに結合した抗体ファージは回収されてこない。すなわち、この操作で、抗ＮＰ抗体が除去され、抗ＨＡ抗体が選択的に濃縮される。
５−１ １．で得たビオチン化インフルエンザワクチンの１／１０量（ビオチン化されているのはほとんどＨＡ抗原のみであるので、ビオチン化ＨＡ抗原９μｇ相当分）と４−２．の抗体ファージライブラリー１．０×１０^１４ｃｆｕを２％スキムミルク共存下、全量５ｍＬになるように調製し、タンパク質の非特異吸着が少ない試験管であるミニソープチューブ（Ｎｕｎｃ社製）２本に２．５ｍＬずつ入れ、ローテーターを用いて室温２時間反応させた。抗体ファージライブラリーとしては、４−２に述べたＡＩＭＳ４を用いた。ＡＩＭＳ４は、４−２で調製した抗体ファージライブラリーの中でも、特に大きなレパートリーサイズを有するライブラリーである。
この反応液に、２％スキムミルクでプレブロックしたストレプトアビジンビーズ０．３ｍｇ（プロメガ社製）を懸濁し、ローテーターを用いてさらに室温で２０分反応させた。磁石でマグネットビーズを引き寄せておいて、上清を除くという方法で、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて１５回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。これに、チューブ１本当たり１ｍＬの０．１Ｍ トリエチルアミン（ｐＨ１２．３）を加え、室温で１０分攪拌し、溶出した抗体ファージ液をチューブ１本当たり０．２５ｍＬ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８で中和した。
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
５−２ ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地５０ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になるよう増殖させ、上記で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
５−３ ヘルパーファージの感染
２）の培養液５２．５ｍＬに、２×ＹＴ培地４３４．５ｍＬ、４０％グルコース１２．５ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．５ｍＬを加えて３７℃で波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養した後、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を沈殿させ、回収して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．１５ｍＬを加えた２×ＹＴ培地１５０ｍＬに懸濁した。これにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を１／１００量（１．５ｍＬ）加え、３７℃で１時間振とう培養した。
培養液を予め３７℃に暖めた培地（２×ＹＴ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた液）４５０ｍＬに加えて３７℃で一晩培養した。
５−４ ファージの回収
３）の培養液を４℃で７０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清に２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて室温で２０分間静置した後、４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、培養液の１／１０量の滅菌ＰＢＳを加えて溶解し、再度２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして４℃で１００００ｒｐｍ、２分間遠心した。これに０．０５％のＮａＮ_３を加えたＰＢＳを培養液の１／１００量加えて沈殿を溶解し、抗体ファージを回収した。
得られた抗体ファージ４×１０^１２ｃｆｕを用いて、５−１から５−４の操作を同様に行い、抗ＮＰ抗体を除去した抗体ファージを得た。
６．抗ＮＰ抗体を除去した抗体ファージを用いたスクリーニング
６−１ スクリーニング用試験管の作製
インフルエンザワクチン（１９９９年）１ｍＬにＰＢＳ ２ｍＬを加えて３ｍＬに調製し、試験管（マキシソープチューブ）１本（Ｎｕｎｃ社製）に添加して４℃で１８時間インキュベートして、試験管内表面へ抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、２％スキムミルク含有ＰＢＳ溶液３ｍＬずつを加えて室温で１時間反応させ、ファージ抗体が非特異的に試験管に結合することを防ぐためにブロッキングを行った。
６−２ スクリーニング操作
２．で得られた抗体ファージを２％スキムミルク含有ＰＢＳになるよう溶解して１×１０^１４ｃｆｕ／３ｍＬに調製し、この液を６−１で作製した抗原結合マキシソープチューブ１本に添加して室温で２時間反応させた後、ＰＢＳで８回洗浄した。
続いて抗原結合マキシソープチューブに結合したファージを以下のように回収した。すなわち、０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１２．３）を３ｍＬ添加し、ローテーターを用いて室温で２０分間反応させ乖離させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１ｍＬを加えて中和し、この液を回収した。
６−３ 回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地５０ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になるよう増殖させ、３−２で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
２）ヘルパーファージの感染
１）の培養液５４ｍＬに、２×ＹＴ培地４３３ｍＬ、４０％グルコース１２．５ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．５ｍＬを加えて３７℃で波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養した後、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を沈殿させ、回収して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．１５ｍＬを加えた２×ＹＴ培地１５０ｍＬに懸濁した。これにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を１／１００量（１．５ｍＬ）加え、３７℃で１時間振とう培養した。
培養液を予め３７℃に暖めた培地（２×ＹＴ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた液）４５０ｍＬに加えて３７℃で一晩培養した。
３）ファージの回収
２）の培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清に２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて室温で２０分間静置した後、４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収し、培養液の１／１０量の滅菌ＰＢＳを加えて溶解し、再度２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして４℃で１００００ｒｐｍ、２分間遠心した。これに０．０５％のＮａＮ_３を加えたＰＢＳを培養液の１／１００量加えて沈殿を溶解し、抗体ファージを回収した。
６−４ 増幅したファージによる再スクリーニング
増幅したファージを用いて６−２と同様に抗原結合試験管を用いてスクリーニングを繰り返した。スクリーニングでの洗浄は、非特異に吸着したファージを乖離し、結合力の高いファージを選択する上で重要なステップであることから、２回目、３回目のスクリーニングにおける洗浄条件はＰＢＳで１６回にした。
６−５ ファージのスクリーニングの評価法
６−４の方法でスクリーニングを繰り返すとき、（抗原吸着済試験管に投入したファージの総数）÷（抗原吸着済試験管から回収したファージの総数）が前回のスクリーニングに比べて明らかに小さくなれば、目的の抗体を提示しているファージが濃縮されつつあると推測できる。溶液に含まれるファージ数の計算は以下のように行った。
１）ファージの希釈系列を以下のように作製した。
［１］１×１０^−２希釈：ファージ液１０μＬ＋ＰＢＳ９９０μＬ
［２］１×１０^−４希釈：［１］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ９９０μＬ
［３］１×１０^−６希釈：［２］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ９９０μＬ
［４］１×１０^−８希釈：［３］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ９９０μＬ
［５］１×１０^−９希釈：［４］の希釈液１００μＬ＋ＰＢＳ９００μＬ
［６］１×１０^−１０希釈：［５］の希釈液１００μＬ＋ＰＢＳ９００μＬ
［４］、［５］、および［６］の希釈系列１０μＬにＤＨ１２Ｓ ９９０μＬを加えたものを作り、３７℃で１時間感染させ、これをＬＢＧＡプレートに１００μＬまいて３０℃で１８〜２４時間培養し、コロニーを計数した。上記希釈系列のうち、通常［４］のプレートが５０個以上のプラークを作る。ｍＬ当たりのファージ数は［４］のプレートのプラーク数に基づいて、以下のように算出される。
原液のファージ数＝（コロニー数／プレート）×（１×１０^８）×１０^３ｃｆｕ／ｍＬ
また、回収されたファージ数も同様に計算し、本抗原に対する抗体を提示するファージの数をスクリーニングごとに求めたところ、表５のようになった。したがって、スクリーニングによって目的の抗体を呈示しているファージクローンが濃縮されていることが予測された。

７．スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合活性の測定
以上のスクリーニングによって選択された抗体について、抗原結合活性（アフィニティー）の測定を行った。アフィニティーの測定には、ファージ型の抗体ではなく、Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体をサンプルとして用いた。測定方法は、９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ法とした。Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体の発現誘導法については８．で述べる。
まずＥＬＩＳＡ用のプレートを以下のように調製した。インフルエンザワクチン（１９９９年）をＰＢＳで１５倍希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄して、アフィニティーの測定に用いた。８．の手順で採取した培養上清を各ウェルに１００μＬ加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、２５０倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ｃｐ３抗体（（株）医学生物学研究所製）を１００μＬ加えて２５℃で１時間反応させた。再度ＰＢＳで４回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液１００μＬを加えて暫時反応させた後、２Ｎ硫酸１００μＬを加えて反応を停止し、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果８８クローン中７３クローンに結合活性が確認された（図９）。
更にこれら７３クローンのうち、３３クローンについて中和活性を調べたところ、表６のように２２クローンに中和活性があった。中和活性測定方法については、９．で述べる。この段階では、まだ塩基配列を確認していないので、これらのクローンの中には同じクローンが存在する可能性がある。中和活性の測定と平行して、これらのクローンの塩基配列を決定して照合したところ（１０．に示す）、当然のことながら同じクローンは同程度のアフィニティーを示し、中和活性のあるなしも一致していたことが確認された。

８．Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体の発現誘導
ファージの感染した大腸菌を１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴで３０℃１８時間培養した後、０．１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ １．５ｍＬに上記培養液を５μＬ加えて３０℃で４時間培養した。このときの大腸菌の濃度は波長６００ｎｍの吸光度を測定するとき、約０．５であった。
これに１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を加えてさらに３０℃で１８時間培養した後、培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブにとり、１００００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心してその培養上清をとり、０．２２μｍフィルターで滅菌処理したものを検体とした。
Ｆａｂ−ｃｐ３型抗体が発現しているか否かは７．で示したＥＬＩＳＡ法で確認した。
９．インフルエンザウイルス中和活性測定方法
ＭＤＣＫ細胞を９６ウェル平底プレート（コーニング社ｃａｔ＃３５９６）の各ウェルに（約１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）分注し、ＣＯ_２インキュベータにてウェルの底にモノレイヤーシートを形成するように３７℃で培養した。次の日０．２％ＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含むＭＥＭ培地により９６ウェル丸底プレートの各ウェル内に試験する各抗体を４倍希釈して入れた。０．２％ＢＳＡを含むＭＥＭ培地により希釈したインフルエンザウイルス液（４×１０^４ＦＦＵ／ｍＬ）２５μＬと、希釈した抗体あるいはコントロールの溶液２５μＬを混合し、３７℃６０分反応させた。
それらの混合液を先に述べた９６穴プレート中のＭＤＣＫ細胞に２５μＬ添加し、３７℃６０分保温することにより、ウイルスを細胞に吸着させた。
吸着後ＰＢＳで洗浄し１００μＬ／ｗｅｌｌの０．５％トラガントガム（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ ｇｕｍ）と５μｇ／ｍＬのトリプシンを含むＭＥＭ培地を添加し、さらに３７℃２４時間培養した。
培養後、ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１００％エタノールをウェルに添加し、室温１０分処理し、ウェルをヘアドライヤーで乾燥させた。ＰＡＰ染色後フォーカスを計数した。
抗体の中和能の強さは、何も入れない場合（陽性コントロール）からのフォーカスの減少率を算出した後結果のみ示した。
１０．モノクローナル抗体の同定
７．で抗原結合活性を示したクローンを選択し、ＬＢＧＡ中で３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてファージミドを精製した。これを用いて、その遺伝子の配列を確認した。配列は、Ｈ鎖については、蛍光プライマーＴ７（アロカ社製）を用いて、Ｌ鎖については、蛍光プライマーｈｕＣＨ１Ｊ（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧＧ−３’／配列番号：４５、アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって決定した。結果を表７にまとめた。その結果、２種類のクローンが得られていたことがわかった。また、このうちの１種であるタイプ１４が中和活性を示していたことがわかった（Ｈ鎖／配列番号：６１（塩基配列）、配列番号：６２（アミノ酸配列）；Ｌ鎖／配列番号：６３（塩基配列）、配列番号：６４（アミノ酸配列））。

１１．ＩｇＧコンストラクションベクターの作製
Ｆａｂ型抗体から可変領域（Ｖ領域）遺伝子を遺伝子組換により移すだけで、ＩｇＧ型抗体が産生できるようなベクター（ＩｇＧコンストラクションベクター）の作製をまず実施した（図１０参照）。
１１−１ ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋からのＸｈｏＩ部位の除去
ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）には、あとの操作に不都合となるＸｈｏ
Ｉ部位が存在するため、まずその除去を行った。
ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋２μｇ（１０μＬ）と、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７９μＬ，ＸｈｏＩ（１０ｕ／μＬ、宝酒造社製）１μＬを混合し、３７℃２時間反応させて、切断した。フェノール−クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿して、ＤＷ３８μＬに溶解し、１０×ｋｌｅｎｏｗ ｂｕｆｆｅｒ（添付バッファー）５μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（宝酒造社製）５μＬ，ｋｌｅｎｏｗ ｆｌａｇｍｅｎｔ（５ｕ／μＬ、宝酒造社製）２μＬを添加して３７℃で１５分反応させることにより、ＸｈｏＩ切断により生じた突出末端を埋めた。
フェノール−クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿して濃縮し、５μＬの１／１０ＴＥに溶解した。これに、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（添付バッファー）２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ２μＬ，ＤＷ１０μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造社製）１μＬを加えて混合し、１６℃で１８時間インキュベートした。エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分をコンピテントセルＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行うことにより、形質転換した。

得られた形質転換体１２個について、ＬＢＧＡ中で３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを抽出し、配列を確認した。配列は、蛍光プライマーＴ３（アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって決定した。その結果、いずれも同じように、ＸｈｏＩ部位が除去されていた。このうちのひとつ（Ｎｏ．１）を４００ｍＬの培養液からアルカリ法にて調製し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心法で精製して、２２０μｇ得た。これを、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ΔＸｈｏとした。
１１−２ ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ＡｓｃＮｈｅの作製
１１−１で得られたＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ΔＸｈｏのＥｃｏＲＩ部位に、ＡｓｃＩ部位とＮｈｅＩ部位を導入し、ＥｃｏＲＩ部位を削除する作業を行った。まず、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ΔＸｈｏ ２μｇ（１０μＬ）と、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＥｃｏＲＩ（１２ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、アガロースゲル電気泳動して目的の断片（３ｋｂ）を回収し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。次に、ＡｓｃＦプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＡＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＴＧＣＴＡＧＣ−３’／配列番号：６５）１μＬとＮｈｅＲプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＡＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣ−３’／配列番号：６６）１μＬを混合した後ＤＷ８μＬを加え１０μＬとして、９５℃５分、６０℃５分、２５℃と温度を下げて、アニールさせた。このアニール産物５μＬとＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ΔＸｈｏ ＥｃｏＲＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、１１−１と同様にして塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．３，７，８，１１が向きも正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．３をＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ＡｓｃＮｈｅと名づけた。
１１−３ リーダーペプチド部分の作製
Ｈ鎖用リーダーペプチドとＬ鎖用リーダーペプチドを合成し、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ＡｓｃＮｈｅに組み込んだ。
１１−３−１ Ｈ鎖用リーダーペプチド断片（ＮＮ断片）の作製とＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ＡｓｃＮｈｅへの組み込み
まず、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋ＡｓｃＮｈｅ ２μｇ（１０μＬ）と、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＮｈｅＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，１０×ＢＳＡ １０μＬ，ＤＷ６８μＬ，ＮｏｔＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して目的の断片（３．０ｋｂ）を回収し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。
次に、ＮＮＦプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’／配列番号：６７）１μＬとＮＮＲプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣ−３’／配列番号：６８）１μＬを混合した後ＤＷ８μＬを加え１０μＬとして、９５℃５分、６０℃５分、２５℃と温度を下げて、アニールさせた。
このアニール産物１０μＬを１０％アクリルアミド電気泳動後、エチレンブロマイド染色１０分行ったのち、水でゆすぎ、紫外線下（３６６ｎｍ）で撮影後、該当部分（１０６ｂｐ）付近を切り出した。これを５００μＬのＴＥに入れ、ローテーターにて一晩回転攪拌して溶出した。フェノール・クロロホルム処理後、２本に分け、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ロシュ社製ｃａｔ．Ｎｏ．９０１３９３）を０．５μＬずつ、３Ｍ 酢酸ナトリウムｐＨ５．２を２５μＬずつ、エタノールを６００μＬずつ添加し、よく混合して−２０℃に３時間おいて沈殿させた後ＴＥ １０μｌに懸濁した。
これに、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＮｈｅＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、先ほどと同様にグリコーゲン・エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，１０×ＢＳＡ １０μＬ，ＤＷ６８μＬ，ＮｏｔＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、グリコーゲン・エタノール沈殿して濃縮し、５μＬの１／１０ＴＥに懸濁した。これに、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ Ｍ１３＋−ＡｓｃＮｈｅ ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。
エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、１１−１と同様にして塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．１，２，４，５，７，８，９，１０，１１が正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．１をＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＮＮと名づけた。
１１−３−２ Ｌ鎖用リーダーペプチド断片（ＳＡ断片）の作製とＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＮＮへの組み込み
まず、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＮＮ ２μｇ（１０μＬ）と、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＳａｌＩ（１２ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ（ＡｓｃＩに添付）１０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して目的の断片（３．０ｋｂ）を回収し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。
回収した断片をエタノール沈殿して濃縮し、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。次に、ＳＡＦプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＡＡＴＧＴＡＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＣ−３’／配列番号：６９）１μＬとＳＡＲプライマー（０．２ｎｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＡＴＴＣ−３’／配列番号：７０）１μＬを混合した後ＤＷ８μＬを加え１０μＬとして、９５℃５分、６０℃５分、２５℃と温度を下げて、アニールさせた。
このアニール産物１０μＬを１０％アクリルアミド電気泳動後、エチレンブロマイド染色１０分行ったのち、水でゆすぎ、紫外線下（３６６ｎｍ）で撮影後、該当部分（１０５ｂｐ）付近を切り出した。これを５００μＬのＴＥに入れ、ローテーターにて一晩回転攪拌して溶出した。フェノール・クロロホルム処理後、２本に分け、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ロシュ社製ｃａｔ．Ｎｏ．９０１３９３）を０．５μＬずつ、３Ｍ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．２を２５μＬずつ、エタノールを６００μＬずつ添加し、よく混合して−２０℃に３時間おいて沈殿させた後ＴＥ １０μｌに懸濁した。
これに、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＳａｌＩ（１２ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、先ほどと同様にグリコーゲン・エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ（ＡｓｃＩに添付）１０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、グリコーゲン・エタノール沈殿して濃縮し、５μＬの１／１０ＴＥに懸濁した。
これに、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＮＮ ＳａｌＩ−ＡｓｃＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。
得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、１１−１と同様にして塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．２，３，４，５，６，８，９，１０，１１，１２が正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．２をＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＮＮと名づけた。
１１−４ プロモーター部位の作製とＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＮＮへの組み込み
ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）のプロモーターは、強いプロモーター活性を持つことが知られているが、Ｈ鎖遺伝子のクローニングの際用いるＳｐｅＩ部位が存在する。そこで、ＳｐｅＩ部位を欠失させてプロモーター部位を得るために、２段階に分けてＰＣＲを行った。
まず、ＳｐｅＩ部位の上流側をＢａｍＨＩ部位とはさむ形でＰＣＲし、ＳｐｅＩ部位の下流側をＮｈｅＩ部位とはさむ形でＰＣＲした。富山医科薬科大学医学部ウィルス学講座教授の白木先生より供与されたサイトメガロウィルスＤＮＡ１μｇ（５μＬ）、ＢＳ’Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＣＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＧＴ−３’／配列番号：７１）１μＬ、ＢＳ’Ｒプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴ−３’／配列番号：７２）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ６８μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。
次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で１３０ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ２０μｌに懸濁した（ＢＳ’断片）。
同様にして、サイトメガロウィルスＤＮＡ１μｇ（５μＬ）、Ｓ’ＮＦプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＧＴＴＡＴ−３’／配列番号：７３）１μＬ、Ｓ’ＮＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＡＧＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’／配列番号：７４）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ６８μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で６９０ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ ２０μｌに懸濁した（Ｓ’Ｎ断片）。
次に、ＢＳ’断片３μＬ、Ｓ’Ｎ断片３μＬ、ＢＳ’Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＣＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＧＴ−３’／配列番号：７１）１μＬ、Ｓ’ＮＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＡＧＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’／配列番号：７４）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ６７μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で７８０ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ １０μｌに懸濁した。
これに、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＮｈｅＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。
続いて、これに１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＢａｍＨＩ（１５ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して７６０ｂｐ付近のバンド切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、５μＬの１／１０ＴＥに溶解した（ＢＮプロモーター断片）。
ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＮＮ ２μｇ（１０μＬ）、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＮｈｅＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。
続いて、これに１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＢａｍＨＩ（１５ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して３．１ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。ＢＮプロモーター断片５μＬ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＮＮ ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。
エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、１１−１と同様にして塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．１，２，３，５，８，９，１０，１２が正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．１をＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＰＮＮと名づけた。
１１−５ ターミネーター部位の作製とＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＰＮＮへの組み込み
ウサギｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ５μｇ（５μＬ）、ＡＢＦプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣ−３’／配列番号：７５）１μＬ、ＡＢＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＧ−３’／配列番号：７６）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ６８μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で４７０ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ １０μｌに懸濁した。これに、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。
続いて、これに１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＢａｍＨＩ（１５ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して４５０ｂｐ付近のバンド切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、５μＬの１／１０ＴＥに溶解した（ＡＢターミネーター断片）。
ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＰＮＮ ２μｇ（１０μＬ）、１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。
続いて、これに１０×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ７８μＬ，ＢａｍＨＩ（１５ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して３．９ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。
ＡＢターミネーター断片５μＬ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＰＮＮ ＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。
得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、１１−１と同様にして塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．１，３，５，９，１０が正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．１をＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＴＰＮＮと名づけた。
１１−６ Ｈ鎖定常領域の作製とＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＴＰＮＮへの組み込み（ＩｇＧコンストラクションベクターの完成）
ヒト扁桃組織のリンパ球から、市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製 ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、１．６μｇのｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した（２２０μＬ分）。ｃＤＮＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによって作製した。プライマーには、ランダムヘキサマーを用いた。得られたｃＤＮＡのうち２μＬ、ＸＮＦプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧ−３’／配列番号：７７）１μＬ、ＸＮＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’／配列番号：７８）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ７１μＬ、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。
次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、１．０ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ １０μｌに懸濁した。（ＣＨ領域断片）。
このＣＨ領域断片には、Ｌ鎖をクローニングするためのＳａｃＩＩ部位を含んでいるので、これを除く作業を行った。
まず、ＳａｃＩＩ部位の上流側をＸｈｏＩ部位とはさむ形でＰＣＲし、ＳａｃＩＩ部位の下流側をＮｏｔＩ部位とはさむ形でＰＣＲした。上記で得られたＣＨ領域断片１μＬ、ＸＳ’Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣ−３’／配列番号：７９）１μＬ、ＸＳ’Ｒプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴ−３’／配列番号：８０）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ７２μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で５６０ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ ２０μｌに懸濁した（ＸＳ’断片）。同様にして、ＣＨ領域断片１μＬ、Ｓ’ＮｏｔＦプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧ−３’／配列番号：８１）１μＬ、Ｓ’ＮｏｔＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＡＧＴＧＡＡＴＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣ−３’／配列番号：８２）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ７２μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で６００ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ ２０μｌに懸濁した（Ｓ’Ｎｏｔ断片）。
次に、ＸＳ’断片３μＬ、Ｓ’Ｎｏｔ断片３μＬ、ＸＳ’Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｓ’ＮｏｔＲプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ６７μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、紫外線下（３６６ｎｍ）で１．０ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ １０μｌに懸濁した。
これに、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、１０×ＢＳＡ １０μＬ、ＤＷ６６μＬ、ＸｈｏＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬ、ＮｏｔＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して１．０ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、５μＬの１／１０ＴＥに溶解した（ＣＨ領域ΔＳａｃ断片）。
ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＴＰＮＮ ２μｇ（１０μＬ）、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、１０×ＢＳＡ １０μＬ、ＤＷ６６μＬ、ＸｈｏＩ（１０ｕｌ／μＬ；宝酒造社製）２μＬ、ＮｏｔＩ（１０ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して４．３ｋｂ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。
ＣＨ領域ΔＳａｃ断片５μＬ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＡＴＰＮＮ ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片２μＬ，１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ，１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ８μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。
エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いて１１−１と同様にしてＤＨ１２Ｓを形質転換した。得られた形質転換体１２個から１１−１と同様にしてプラスミドを抽出し、蛍光プライマーＣＭＶＦ（５’−ＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣ−３’／配列番号：８３、アロカ社製）を用いて、また、逆方向から蛍光プライマーＴ７（アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって塩基配列を決定した。その結果、Ｎｏ．１，２，４，５，９，１２が正しく目的の断片を有していた。このうち、Ｎｏ．１のプラスミドを４００ｍＬの培養液からアルカリ法にて調製し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心法で精製して、２００μｇ得た。これをＩｇＧコンストラクションベクターと名づけ、以下のＩｇＧ化の実験に用いた（配列番号：８４、図１１）。
１２．中和活性を示すクローンのＩｇＧ化
上記７．の過程で中和活性を有していたＦａｂ抗体をＩｇＧに遺伝子変換することを試みた。Ｆａｂ抗体としては、タイプ１４のうちの１つであるクローンＢ１４を用いた。ＩｇＧ型にすることにより、オプソニン効果などの免疫反応を引き起こすことによりより有効にインフルエンザウイルスが中和できることが期待できる。
また、ファージ由来のタンパク質であるｃｐ３分子をはずすことで、抗体そのものに対する免疫反応を減少させることができる。すなわち、ＩｇＧ化を実施することにより、より実用に促した形態の中和物質が得られることとなる（図１２）。
１２−１ 具体的な工程
１２−１−１ ＰＣＲ法による遺伝子の増幅と制限酵素部位設定
Ｆａｂ遺伝子であるＢ１４の配列中にクローニングする際必要な制限酵素配列が無いことを調べたところ、ＶＨ、ＶＬＣＬ内とも該当する制限酵素部位は無かった。次にＢ１４遺伝子をテンプレートとし、重鎖と軽鎖の両端にクローニングに用いる制限酵素部位を付けるプライマーを用いＰＣＲ法にて増幅させ、フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を取得した（図１３）。
プライマー名称とその配列：

ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。

上記を９５℃３分で、インキュベート後、９４℃２分、５５℃２分、７４℃２分を１５サイクル反応させた。
次に、ＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲル１００Ｖ定電圧電気泳動し、紫外線下（３６６ｎｍ）で必要な遺伝子部分があるゲルを切り出し（重鎖：約４００ｂｐ；軽鎖：約６００ｂｐのバンド）、ｓｕｐｒｅｃ−０１（Ｔａｋａｒａ９０４０）に入れ、−８０℃で１５分おいた後、３７℃１５分処理、遠心分離を１５，０００ｒｐｍ室温５分行った。ＴＥ５０μＬ加えもう一度遠心し、溶出物をフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿後、ＴＥ ２０μｌに懸濁したのち、ＤＡＰＩでＤＮＡ量をチェックした。（Ｂ１４ｈ １０ｎｇ／μＬ，Ｂ１４Ｌ １２．５ｎｇ／μＬ）
１２−１−２ 抗体発現カセットベクターの作製
次に、下記の条件で、３７℃２時間反応させ、ＩｇＧ１ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎベクターと重鎖のフラグメントをＳｐｅＩ−ＸｈｏＩにて切断し、重鎖をＩｇＧ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒにクローニングする準備を行った。

それぞれ０．８％アガロースゲル１００Ｖ定電圧電気泳動し、紫外線下（３６６ｎｍ）で必要な遺伝子部分があるゲルを切り出し、ｓｕｐｒｅｃ−０１（Ｔａｋａｒａ９０４０）にいれ、−８０℃で１５分おいた後、３７℃１５分処理、遠心分離を１５，０００ｒｐｍ室温５分行った。ＴＥ５０μＬ加えもう一度遠心し、溶出物をフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿後、ＴＥ２０μＬに懸濁した。ＤＡＰＩでＤＮＡ量をチェックした。
精製したベクターおよびインサートＤＮＡは、ベクターＤＮＡが１００ｎｇ／μＬ、インサートＤＮＡは０．５ｐｍｏｌ／μＬの濃度に調整し以下の条件でライゲーションを行った。

１５℃１６時間反応後、エタノール沈殿を行い緩衝液を除き、ミリＱ水５μＬに懸濁した。このうち１μＬをＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１２Ｓ ｃｅｌｌｓ（ＧＩＢＣＯ：１８３１２−０１７）にエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）し、全量をＬＢＧＡプレートにまき、３０℃で１８時間培養した。
プレートよりコロニーを選択し、ＴＹＧＡ培地２ｍＬ ３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを精製した。
突然変異をチェックするためのＤＮＡ配列解析は、カスタムプライマー２４１ ＣＭＶＦ ＩＤＲ８００蛍光プライマー（５’ＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴｇＴＣｇＴＡＡＣＡＡＣＴＣ３’／配列番号：８９）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって実施し、正しい配列のクローン（Ｂ１４ＶＨ）について以下の工程を実施した。
軽鎖についても、ベクターに入れる操作を上記と同様に実施した。

上記の条件で３７℃２時間培養後、それぞれ精製したベクターおよびインサートＤＮＡをベクターＤＮＡは１００ｎｇ／μＬ、インサートＤＮＡは０．５ｐｍｏｌ／μＬに調整し、ライゲーションを以下の条件で行った。

１５℃１６時間反応後エタノール沈殿し、ミリＱ水５μＬに懸濁した。このうち１μＬをＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１２Ｓ ｃｅｌｌｓ（ＧＩＢＣＯ：１８３１２−０１７）にエレクトロポレーションし、全量をＬＢＧＡプレートにまき、３０℃１８時間培養した。プレートよりコロニーを選択し、ＴＹＧＡ培地２ｍＬ ３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを精製した。突然変異を調べるためのシークエンス解析は、Ｔ３ ＩＲＤ８００蛍光プライマー（アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって実施し、正しい配列のクローン（Ｂ１４ＶＨＶＬＣＬ）について次の段階へ進んだ。
１２−１−３ 発現ベクターの加工
今回発現ベクターとしてｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社：ＳＣ２１２２２０；ＣＭＶプロモーターによって哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）での目的蛋白質の産生に適する）を採用した。
しかしながら、購入時のマルチクローニングサイト（以下ＭＣＳ）の状態では、ＩｇＧ１遺伝子準備ベクターからＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切り出した抗体発現カセットがライゲーションできない。そこで、合成ＤＮＡ（サワデー社合成）を既存のＭＣＳに入れ替えた。
＊合成ＤＮＡの名称と配列

具体的には１００μＭのＣＭＫＭ−ＳａｃＩＦ−ＫＳを１０μＬ、１００μＭのＣＭＫＭ−ＫｐｎＩＲを１０μＬ、計２０μＬを９５℃５分加熱後、電源を切り２０分放置した。１０％アクリルアミド電気泳動をして、エチレンブロマイド染色１０分後水でゆすぎ、紫外線下（３６６ｎｍ）で撮影後、該当部分（６８ｂｐ）付近を切り出した。これをＴＥに入れローテーターで回転攪拌して一晩溶出した。フェノール・クロロホルム処理、グリコゲン・エタノール沈殿の後ＴＥ２０μＬに懸濁した。ＤＡＰＩにてＤＮＡ量を確認した。
合成した新たなＭＣＳとベクターを以下の条件で切断し、新たなＭＣＳとベクターをつなぎあわせることで発現ベクターを完成させた。
新ＭＣＳの切断：

上記の条件で、３７℃２時間インキュベート後、フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿し、ＴＥ１０μＬに懸濁して、これをインサートとした。
ベクターの切断：

上記の条件で、３７℃２時間インキュベート後、それぞれ０．８％アガロースゲル１００Ｖ定電圧電気泳動し、紫外線下（３６６ｎｍ）で４．３ｋｂ付近のバンドを切り出し、ｓｕｐｒｅｃ−０１（Ｔａｋａｒａ９０４０）にいれ、−８０℃で１５分おいた後、３７℃１５分処理、遠心分離を１５，０００ｒｐｍ室温５分行った。ＴＥ５０μＬを加えてもう一度遠心し、溶出物をフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿後、ＴＥ２０μＬに懸濁した。ＤＡＰＩでＤＮＡ量を確認した。
精製したベクターおよびインサートＤＮＡをベクターＤＮＡが１００ｎｇ／μＬ、インサートＤＮＡが０．５ｐｍｏｌ／μＬの濃度に調整し、以下の条件でライゲーションを行った。

１５℃１６時間反応後、エタノール沈殿後、ミリＱ水５μＬに懸濁した。このうち０．１〜１μＬをＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１２Ｓ ｃｅｌｌｓ（ＧＩＢＣＯ：１８３１２−０１７）にエレクトロポレーションし、全量をＬＢＧＡプレートにまき、３０℃１８時間培養した。プレートよりコロニーを選択し、ＴＹＧＡ培地２ｍＬ ３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを精製した。遺伝子配列決定は前記と同様に行った。
完成したベクターはＣｓＣｌによる超遠心法にて、３９１．２μｇ得られた（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｓａｌ−Ｎｏｔ Ｌｏｔ．０１０３０６）。
１２−１−４ 抗体発現カセットの発現ベクターへの組み込み
以下の条件で、３７℃２時間反応させ抗体発現カセットベクターからＩｇＧ遺伝子を切り出した。

反応後フェノール、クロロホルム処理を行い、グリコーゲン・エタノール沈殿を行った後乾燥させた。
抗体発現カセット（約４．５ｋｂ）とベクター部分（約４．３ｋｂ）の分子量がほぼ同じことから、電気泳動後、切り出す際にベクター部分が混入する可能性が高い。これを防ぐため、ＰｖｕＩ処理またはＦｓｐＩ処理してベクター部分を切断後、泳動することで切り出しを容易にできた。

上記の条件で、３７℃６時間反応後、０．８％アガロースゲルで１００Ｖ定電圧電気泳動し、紫外線下（３６６ｎｍ）で抗体発現カセット（約４．５ｋｂ）があるゲルを切り出し、ｓｕｐｒｅｃ−０１（Ｔａｋａｒａ９０４０）にいれ、−８０℃で１５分おいた後３７℃１５分インキュベートし、遠心分離を１５，０００ｒｐｍ 室温５分行った。ＴＥ５０μＬ加えもう一度遠心し、溶出物をフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿後、ＴＥ２０μＬに懸濁した。
ＤＡＰＩでＤＮＡ量をチェックした。これが抗体発現カセットとなり、このカセットをタンパク発現ベクターにライゲーションした。
まず、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ ｖｅｃｔｏｒをＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切断した。

３７℃２時間インキュベーション後、０．８％アガロースゲル１００Ｖ定電圧電気泳動し、紫外線下（３６６ｎｍ）で４．３ｋｂ付近のバンドを切り出し、ｓｕｐｒｅｃ−０１（Ｔａｋａｒａ９０４０）にいれ、−８０℃で１５分おいた後、３７℃１５分処理、遠心分離を１５，０００ｒｐｍ室温５分行った。ＴＥ５０μＬ加えもう一度遠心し、溶出物をフェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿後、ＴＥ２０μＬに懸濁した。ＤＡＰＩでＤＮＡ量をチェックした。精製したベクターおよびインサートＤＮＡをベクターＤＮＡが１００ｎｇ／μＬ、インサートＤＮＡが０．５ｐｍｏｌ／μＬに調整して以下の条件でライゲーションを行った。

１５℃１６時間反応後、エタノール沈殿後、ミリＱ水５μＬに懸濁した。このうち０．１〜１μＬをＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１２Ｓ ｃｅｌｌｓ（ＧＩＢＣＯ：１８３１２−０１７）にエレクトロポレーションし、全量をＬＢＧＡプレートにまき、３０℃１８時間培養した。プレートよりコロニーを選択し、ＴＹＧＡ培地２ｍＬ ３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを精製した。シークエンス解析は、Ｔ３およびＴ７蛍光プライマー（アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって決定した。
配列の正しいクローンについて、プラスミドをＣｓＣｌによる超遠心法にて大量抽出し、３００．０μｇのプラスミドが得られた（Ｂ１４ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）。これを用いて、真核細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）にトランスフェクション、発現させた。
１２−１−５ ＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクション
上記細胞にてＩｇＧ１型の抗体を発現させるためにプラスミドＤＮＡをＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社：Ｔ２０１００７）を使用してトランスフェクションした。具体的な順序は以下の手順で実施した。
１）６０ｍｍプレートにＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにトランスフェクションの前日から準備［培地：α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１２５６１−０５６）＋１０％ＦＣＳ（エキテック社：２６８−１）］
２）プラスミドＤＮＡ（Ｂ１４ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）６μｇを１ｍＬの無血清培地（Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ−以下ＳＦＭと略す−（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ：１２０５２−０９８ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ））に溶かし、０．２２μｍのフィルターをかけて、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｒｅａｇｅｎｔ ３０μＬを１ｍＬのＳＦＭに溶かした。
３）ＳＦＭに溶かしたプラスミドＤＮＡとＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｒｅａｇｅｎｔをすばやく混ぜ、室温３０分静置した。
４）細胞をＳＦＭ １ｍＬで２回洗い、プラスミドＤＮＡ−ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）を細胞の入ったプレートにゆっくり加え、インキュベーター内３７℃５時間培養した。
５）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを吸引し、αＭＥＭ １０％ＦＣＳで２回洗った後、αＭＥＭ １０％ＦＣＳを５ｍＬ加え、インキュベーター内３７℃４８時間培養した。
６）αＭＥＭ １０％ＦＣＳ＋７００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ：Ｇ７０３４）の培地１０ｍＬに置き換え、セレクションを開始した（以後の培地はαＭＥＭ １０％ＦＣＳ＋７００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を使用）。
７）３７℃４８時間培養後、細胞をＰＢＳ １０ｍＬにて洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ４０４９）にてプレートより剥離、回収し細胞数を測定した。その結果を元にｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎを０．５〜１．０ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ ９６ｗｅｌｌ ２ｐｌａｔｅｓの条件で行った。
８）１０日間培養後、各ウェルの培養上清を用いて、抗原結合性についてのＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡの抗原としては、インフルエンザＨＡワクチン（１９９９年）をＰＢＳで１５倍希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌの割合でマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏａｐ ｍｉｃｒｏｃｕｐ）の各ウェルに入れ、室温で一晩静置した。抗原の希釈液を捨て、２００μＬの５％ＢＳＡ／ＰＢＳをウエルに入れて３７℃、１．５時間ブロッキングした。
このウエルに培養上清１００μＬを加え、３７℃で１時間反応させた。更に１００μＬのＰＯＤ標識 抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖、医学生物学研究所製 Ｎｏ．２０６、２，５００倍希釈）を加え、室温で１時間反応させた。反応後、抗体溶液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄した後に１００μＬの基質溶液（オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液）を加えて室温で２０分反応後、１００μＬの反応停止液（１．５Ｎリン酸）を添加した。ＰＯＤによって生成する色素を４９２ｎｍで測定した。
結合活性の高いクローンを選択「２Ｅ４」、細胞を剥離し、αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋７００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地３ｍｌに懸濁、６ウェルプレートにて培養を継続した。コンフルエント後、細胞を剥離し、αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋７００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地１５０ｍＬに懸濁、２５ｃｍディッシュ６枚に２５ｍＬづつ撒き、約２日間培養を続けた。各ディッシュの上清を除き、無血清状態に慣れさせる目的で、αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋７００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地とＳＦＭ＋５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地を半量づつ混合した培地にて２４時間培養した。
各ディッシュの上清を除き、ＰＢＳにてディッシュ上の細胞を２回洗浄後、ＳＦＭ＋５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地を２５ｍＬづつ加える。４８時間ごとに培養上清を回収、新しいＳＦＭ＋５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８培地添加を続けて行った。
最終的に１０００ｍＬの培養上清が得られ、精製直前に遠心を行って沈殿物を除いたものを以下の精製に用いた。
１２−１−６ 培養上清からの発現タンパク（ＩｇＧ）の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ：１７−０６１８−０１）１ｍＬをカラムにつめ、５ｍＬの結合バッファー（２０ｎＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）を流速１滴／２秒で送液し平衡化した。培養上清１０００ｍＬをアプライ、流速１滴／２秒で送液し、発現タンパク（ＩｇＧ）をカラムに結合させた。
５ｍＬの結合バッファを流速１滴／２秒で送液し、非吸着成分を洗浄後、５ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）を流速１滴／秒で送液、溶出液を０．５ｍＬづつ１．５ｍＬチューブに回収した。回収チューブにはあらかじめ中和バッファー（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０）５０μＬを添加、回収と同時に中和した。各溶出液をＳＤＳ ＰＡＧＥにて泳動、クマシー染色にてタンパクが溶出されたチューブを確認し、これを透析チューブに集め、ＰＢＳにて１晩透析、０．２２μｍフィルター滅菌をかけた。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ測定：０．３３４、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動、クマシー染色で濃度、純度を確認した。約１７２μｇ／ｍＬが１．５ｍＬ得られた（２Ｅ４）。
また、この濃度を基準とした段階希釈による抗原結合性の変化も確認した（図１４）。
これについて、前記のように中和活性測定を実施した。
産業上の利用の可能性
本発明は、任意の結合対象物質に結合する結合性分子を、ファージライブラリーから選択することができる方法を提供する。本発明では、選択に用いる結合対象物質が、必ずしも高度に精製された状態でなくても、目的とする結合性分子を効率的に取得することができる。特に望ましい態様においては、粗精製状態の結合対象物質を用いて、目的とする結合性分子を簡単に選択することができる。
公知の方法においては、ファージライブラリーからの選択には高度に精製された結合対象物質が多量に必要であった。したがって、精製が難しい結合性物質を利用して、ファージライブラリーから結合性分子を選択するには、時間と費用の消費が避けられなかった。本発明によれば、結合性物質の精製工程を簡略化できることから、ウイルス抗原のような精製が困難な結合性物質に対する結合性分子であっても、容易に選択することができる。つまり本発明によって、ファージライブラリーから、任意の結合性分子を取得することが可能となった。
本発明による結合性分子の選択方法は、従来の方法では取得が難しかった、ウイルス等に対する結合活性を有する結合性分子の効率的な選択を可能とした。ウイルスに対する結合性分子には、中和物質としての作用を期待することができる。中和物質は、病原性因子の病原性を中和し、疾患の治療や予防に用いることができる。つまり本発明は、ファージライブラリーからの中和物質の取得を実現したと言って良い。したがって本発明は、各種の疾患の治療や予防に有用な中和物質の探索に貢献する。
インフルエンザやＨＩＶのような変異の激しいウイルスに対する中和物質の取得は、一般には困難である。しかし本発明においては、中和物質を容易に選択できる。更に、本発明者らが構築した人工抗体ファージライブラリーは、抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける多様性を忠実に再現した抗体ライブラリーである。したがって両者を組み合せることによって、変異の激しいウイルスに対しても、迅速に中和活性を有する結合性分子を選択することができる。このように、本発明を利用することによって、有用な中和物質を容易に選択することが可能となった。
本発明によって、インフルエンザやＨＩＶ等の変異の激しいウイルスに対しても、迅速に中和活性を有する結合性分子を提供することができる。本発明によって得ることができる中和活性を有する結合性分子は、ウイルスの治療や予防に有用である。ウイルス感染症には、ワクチンによる予防が最も効果的な対策とされてきた。ウイルスを対象とする血清療法は知られていたが、ヒト以外の動物に由来する抗血清を利用する場合には、常に血清病の危険が伴っていた。
本発明によれば、ファージライブラリーに提示された結合性分子の中から、目的とする活性を有するものを迅速に選択できる。更に選択されたファージクローンからは、必要な活性を有する結合性分子をコードする遺伝子を取得することができる。この遺伝子を利用すれば、ヒトへの安全な投与が可能な製剤を容易に調製することができる。その結果、中和活性を有する結合性分子を利用した治療用の製剤を迅速に提供することができる。このことは、ウイルスに対するより安全な血清治療を可能とすることを意味している。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による可変領域ライブラリーの作製に用いた各種のベクターの構造を模式的に示す図である。
１）ｐＡＡＬＦａｂ：Ｄ１．３ ｍｕｔａｔｉｏｎ用ベクター。
２）ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ：Ｅ８発現用ベクター。ｐＡＡＬＦａｂをもとに、制限酵素サイトを改変した。新たにＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、およびＫｐｎＩサイトを付加し、ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩサイトの位置を変更した。
３）ｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔをもとに、制限酵素サイトを改変した。ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ間を欠落させ、新たにＫｐｎＩ、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、およびＳｐｅＩサイトを付加した。重鎖可変領域遺伝子をＳｆｉＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニング可能。
４）ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ：重鎖可変領域遺伝子クローニング用ベクター。ｐＦＣＡＨ３−Ｅ８Ｔ、およびｐＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄをもとにＤＮＡ配列を改変した。マウスγＣＨ１をヒトγＣＨ１で置きかえた。新たに、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、およびＡｓｃＩサイトを付加した。軽鎖可変領域をＳｆｉＩ−ＡｓｃＩサイトにクローニング可能。
図２は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図３は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）である。
図４は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）である。
図５は、ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（３）である。
図６は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの塩基配列を示す図である。
図７は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（１）である。
図８は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサートの制限酵素サイトと塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図（２）である。
図９は、ＥＬＩＳＡ法による結合活性の確認を示す図である。
図１０は、ＩｇＧコンストラクションベクターの構築を示す図である。
図１１は、ＳａｃＩＩ−ＡｓｃＩ間でＶＬ−ＣＬ遺伝子を組み込み、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ間でＶＨ遺伝子を組み込むことを示す図である。
図１２は、ＩｇＧ１コンストラクションベクターを用いた中和抗体のＦａｂ−ｃｐ３ ｆｏｒｍからＩｇＧ ｆｏｒｍへの変換の概念図である。
図１３は、ＰＣＲによる遺伝子増幅ならびに制限酵素部位設定を示す図である。
図１４は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ精製Ｂ１４−２Ｅ４抗体段階希釈の結果を示す図である。

Claims (12)

1. ａ）目的とする結合対象物質に親和性リンカーを結合させる工程
   ｂ）結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリーを結合対象物質と接触させ、結合性分子と結合対象物質との複合体を形成させる工程、および
   ｃ）親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナーを親和性リンカーと結合させて、ｂ）で形成した複合体を回収する工程、
   を含む、特定の結合活性を有する結合性分子の選択方法であって、該結合対象物質がインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質であり、結合対象物質と共存する可能性のある物質と結合対象物質とを識別可能とするマーカーとしてのＨＡ蛋白質の糖鎖を該結合対象物質が有しており、該糖鎖に親和性リンカーが結合している、前記方法。
2. 結合対象物質に特異的に親和性リンカーを結合させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 親和性リンカーと結合パートナーの組み合せが、ビオチン−アビジンおよび／またはストレプトアビジン、レクチン−糖、プロテインＡおよび／またはプロテインＧ−イムノグロブリン定常領域、およびＴａｇペプチド配列−Ｔａｇ抗体からなる群から選択されたいずれかの組み合せである請求項１に記載の方法。
4. 結合性分子が抗体可変領域である請求項１に記載の方法。
5. 可変領域を構成する軽鎖が、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子である請求項４に記載の方法。
6. ｒｇｄｐライブラリーがファージライブラリーである請求項１に記載の方法。
7. 次の工程を含む、特定の結合活性を有する結合性分子の選択方法。
   ｄ）請求項１に記載の方法によって選択された結合性分子を提示した遺伝的表示パッケージを増幅する工程、
   ｅ）増幅した遺伝的表示パッケージを新たなｒｇｄｐライブラリーとして請求項１に記載の方法を繰り返す工程
8. 次の工程を含む、中和活性を有する結合性分子の選択方法。
   １）中和すべき物質を特定の物質として用い、請求項１に記載の方法によって、中和すべき物質に対する結合活性を有する結合性分子を選択する工程、および
   ２）選択された結合性分子の中和活性を評価し、中和活性を有する結合性分子を選択する工程
9. 以下の工程を含む、中和抗体の製造方法。
   １）結合性分子として抗体の可変領域を提示したｒｇｄｐライブラリーを用い、請求項８に記載の方法によって中和活性を有する抗体可変領域を選択する工程、
   ２）工程１）で選択された抗体可変領域を提示した遺伝的表示パッケージが有する抗体可変領域をコードする遺伝子と、抗体定常領域をコードする遺伝子を融合させる工程、および
   ３）工程２）で得られた融合遺伝子を発現させて、中和活性を有する抗体分子を得る工程
10. 次の要素を含む、請求項１に記載の方法に用いるための、結合性分子の選択用キット。
    Ａ）結合対象物質のマーカーに親和性リンカーを結合させるための手段；ここでマーカーとは、目的とする結合対象物質と共存する可能性のある物質と、結合対象物質とを識別可能とする、結合対象物質が有するマーカーをいう
    Ｂ）前記親和性リンカーとの親和性を有する結合パートナー、および
    Ｃ）結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリー
11. 結合性分子を提示したｒｇｄｐライブラリーが、抗体可変領域を提示したｒｇｄｐライブラリーである請求項１０に記載のキット。
12. 可変領域を構成する軽鎖が、重鎖可変領域との機能的なコンフォーメーションの再構成が可能な軽鎖分子である請求項１１に記載のキット。

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