JP4035591B2 - Vascular disease condition improving agent - Google Patents

Description

で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オンは、種々の消化性潰瘍や胃炎の治療予防に有効であることが知られている（特許文献１，特許文献２参照）。しかしながらこれまでの知見において、かかる化合物と遅発性脳血管攣縮との関係については全く知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭５３−１４５９２２号公報
【特許文献２】
特開昭６２−１００１３号公報
【非特許文献１】
Mayberg M.R.,"Cerebral vasospasm". Neurosurgery Clinics of North America, アメリカ合衆国，１９９８年，第９巻，p.615-627
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、血管障害（特に、血管攣縮）が、遺伝子発現プロフィールに与える変化を解明し、この血管攣縮を抑制する薬剤を見出す方法、及びその方法によって得られた血管攣縮抑制剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、出血（特に、クモ膜下出血）後の遺伝子発現プロフィールの変化を確認した結果、血管攣縮を抑えられる物質としてヒートショックプロテインを見出した。
更に、一般式（１）
【化３】

で表される化合物が、出血を起こした障害部位において、ヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管攣縮に対して効果のあることを見出すことにより、基本的には本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第１の発明は、出血を起こした障害部位にヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管障害に関する病態を改善する血管障害病態改善剤である。
【００１１】
この発明において、「出血を起こした障害部位」は、例えば脳である（この場合に、出血は、例えばクモ膜下出血である）。また、本明細書中において、「ヒートショックプロテイン」とは、熱、活性酸素、放射線などのストレス（ショック）により発現するタンパク質を意味しており、ＨＳＰ６０ファミリー、ＨＳＰ７０ファミリー、ＨＳＰ９０ファミリーなどのファミリーを含む。特に、これらのファミリーのうち、ＨＳＰ７０ファミリー（ＨＳＰ７０，ＨＳＰ７２，ＨＳＰ７３等）であることが好ましく、このうちＨＳＰ７２であることが更に好ましい。
【００１２】
「血管障害に関する病態」とは、例えば、出血後に起こる早発性または遅発性の血管攣縮がある。なお、この場合に、「血管障害病態改善剤」は、血管攣縮抑制剤となる。
【００１３】
また、第１の発明において、血管障害病態改善剤、又は血管攣縮抑制剤は、一般式（１）
【化４】

で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン（別名：ゲラニルゲラニルアセトン、一般名：テプレノン、以下、「ＧＧＡ」と称する。）を有効成分とすることが好ましい。ＧＧＡは、プレニルケトン系化合物であり、その構造から見て、種々の異性体が考えられる。本発明は、それら各種の異性体を含むものであり、例えば５，９，１３位がそれぞれＥ体、Ｚ体のいずれでもよく、１種類のみの異性体からなる単独物、または２種類以上の異性体の混合物でもよい。但し、好ましくは、（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅ）体単独、（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）体単独、またはこれら二種類の異性体の任意の混合比による混合物であり、更に好ましくは、（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅ）体と（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）体との質量比が３：２の混合物である。ＧＧＡは、例えば特開昭５３−１４５９２２号公報に記載されている製造方法に準じて製造することができる。
【００１４】
上記化合物は、ヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として用いられ、好ましくは脳血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として、更に好ましくはクモ膜下出血後に発症する遅発性脳血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として用いることができる。本発明に係る化合物の投与形態は特に制限されず、例えば経口的・非経口的に投与することができる。経口投与のための剤型は、固体又は液体の剤型、具体的には錠剤、被羅錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤等が好ましい。非経口投与のための剤型は、注射用製剤、点滴剤、外用剤、坐剤等が好ましい。
【００１５】
また、上記化合物は、慣用される方法により製剤化することが可能であり、通常用いられる賦形剤（例えば、乳糖、白糖、でんぷん、マンニトール等）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、着色剤、矯味矯臭剤等、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して定法により製剤化される。上記化合物の投与量は、症状、年齢、体重などの条件により適宜定められるが、成人一日当たり２０ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇである。
【００１６】
また、第２の発明は、第１の発明に係る剤をスクリーニングするための方法であって、ヒートショックプロテイン（特に、ＨＳＰ７２）の発現誘導を指標とすることを特徴とする。
本発明において、「発現誘導」とは、▲１▼ヒートショックプロテインが実質的に全く発現されていない状態から、ヒートショックプロテインの発現を誘導すること、及び、▲２▼既に発現されているヒートショックプロテインの量を増加させることの両者を含む。「剤」とは、比較的低分子量の化合物、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）、タンパク質等を含む。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の一実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１８】
＜実験例１＞ 蛍光ディファレンシャルディスプレイ法（ＦＤＤ法）による発現プロフィールの変化
クモ膜下出血後に遺伝子発現プロフィールがどのような変化を起こしているかをＦＤＤ法により確認した。ＦＤＤ（蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ）法は、多数のサンプルを同時に発現比較する遺伝子発現解析法原理としては、全ＲＮＡから蛍光アンカープライマーで第一鎖ＤＮＡを合成し、任意プライマーと蛍光アンカープライマーを用いたＰＣＲを行い、複数のｃＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲルで分離後、蛍光イメージを取得し、バンド強度（発現量）が異なるＤＮＡバントを切り出し、再増幅、クローニング、塩基配列を決定するものである。このＦＤＤ法の結果、クモ膜下出血から血管攣縮に伴って、ＨＰＳ７２の発現が高度に増加していることを確認した。
＜実験例２＞ 実験動物、及び脳血管攣縮モデル
なお、以下の実験例においては、実験動物の取扱に関する実験手順は、三重大学医学部の動物実験のガイドラインに従った。スプレーグ−ドーリーラット（ＳＤラット；１１〜１２週齢、３４０〜３８０ｇ；ＪＡＰＡＮ ＳＬＣ社）に抱水クローラル（４００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射にて投与して麻酔をかけた。なお、ラットは自発呼吸できるようにしておいた。２４ゲージカテーテルを右橈骨動脈に配置し、自家動脈血を取りだした。動物は、頭を３０度曲げた状態でヘッドホルダーに配置した。外科顕微鏡による後頭の正中切開にて、前環椎後頭膜を露出させ、２７ゲージの針を小脳延髄槽に穿刺した。０.１ｍｌの髄液を上記針にて取り出し、その後０.３ｍｌの自家血液または生理食塩水を５分間かけてゆっくりと注入した。ラットは、頭を下にして１０分間放置した後、覚醒させた。
ラット脳血管攣縮モデルは、文献記載の方法に準じて行った（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９９，Ｊｕｌ，１０４（１），５９−６６）。即ち、ＳＤラット大槽内に自家動脈血を１回注入した脳血管攣縮モデル（１回出血モデル）を用いた。１回出血モデルにおいて、自家動脈血の大槽内への注入量は、０.４ｍｌとした。また、対照として、上記自家動脈血に代えて、生理食塩水、またはビヒクルを用いて同様に操作した。
【００１９】
＜実験例３＞ 血管造影法
血管造影法（椎骨動脈造影）は、造影剤１ｍｌ（ＩＯＭＥＲＯＮ４００；エーザイ株式会社製）を右橈骨動脈へ注射していった。被爆データは、５０ｍＡＳ、１５０ｋＶ、０.５秒であった。また、焦点−対物間距離を５０ｃｍ、焦点−フィルム間距離を１００ｃｍとして測定した。
【００２０】
＜実験例４＞ 動脈径の測定
脳底動脈の直径は、３箇所（椎骨動脈の節点の０.５ｍｍ上方、中間点、後脳大動脈の分岐点のすぐ下）で測定した。３人の熟練した技術者が、治療群に関する情報を知らされない状態で、コンピュータモニターにて脳底動脈の直径を３回測定した。ＮＩＨ（米国国立医療研究所）の画像解析ソフト、高解像度スキャナー、マッキントッシュ社製コンピュータを用いて平均値を決定した。
【００２１】
＜実験例５＞ ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて、脳底動脈から単離した。このＲＮＡ（０.５μｇ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて提供業者のプロトコルに従って、逆転写した。結果物のｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして使用した。
ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡ（Ｌ１６７６４）の増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１）を、リバースプライマーには、５’−ＡＧＡＧＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号２）を用いた。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して検出した。
【００２２】
＜実験例６＞ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、供給業者のプロトコルに従って実施した。
ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡの増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＧ−３’（配列番号３）を、リバースプライマーには、５’−ＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号４）を用いた。また、ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡの検出用プローブとして、５’（ＦＡＭ）−ＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＴ−（ＴＡＭＲＡ）ｐ３’（配列番号５）を用いた。
【００２３】
ラットβ−アクチンの増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＴＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号６）を、リバースプライマーには、５’−ＣＡＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡ−３’（配列番号７）を用いた。また、ラットβ−アクチンｍＲＮＡの検出用プローブとして、５’（ＦＡＭ）−ＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧ−（ＴＡＭＲＡ）ｐ３’（配列番号８）を用いた。
【００２４】
なお、ＰＣＲ反応と、その結果起きる蛍光染色発光は、７７００−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、リアルタイムにモニターした。シグナルは、ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｖ１.６.３ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して分析した。
【００２５】
＜実験例７＞ ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの大槽への注射
アンチセンスＨＳＰ７２オリゴヌクレオチド（以下、「ＯＤＮ」という）シークエンスとして、５’−ＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号９）を用いた。センスＨＳＰ７２ＯＤＮシークエンスとして、５’−ＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いた。アンチセンスＨＳＰ７２ＯＤＮ及びセンスＨＳＰ７２ＯＤＮは、それぞれ生理食塩水で希釈して、２００μＭの濃度とした。
ＯＤＮ溶液は、２回に渡って大槽に注射した。最初の注射（０.５ｍｌ）は、クモ膜下出血を起こす４８時間前に投与した。次の注射（０.５ｍｌ）は、クモ膜下出血を起こす２４時間前に投与した。なお、各ＯＤＮ溶液については、細胞毒性は観察されなかった。シークエンスの類似性は、ジーンバンクに存在する報告済みのＤＮＡシークエンスと比べてチェックした。
【００２６】
＜実験例８＞ ウエスタンブロット分析
タンパク質の５０μｇ当量を１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜へ転写した。この膜をラットＨＳＰ７２に対するウサギポリクローナル抗体、ＳＰＡ−７６０（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の１：２００００の希釈溶液を使用してインキューベートした。シグナル増幅は、高度化学発光（ＥＣＬ）検出キットを用いて行った。
【００２７】
＜実験例９＞ ＧＧＡの経口投与
ＧＧＡは、ＧＧＡ１００質量％に対してアラビアゴム５質量％及びトコフェロール０.００８質量％を加えて、エマルジョン化して経口投与した。
脳内あるいは脳底動脈内におけるＨＳＰ７２の発現の時間依存性を調査するため、ＧＧＡを単一の投与量（４００ｍｇ／ｋｇ）で投与してから０時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間後にラットを死亡させた。
【００２８】
また、ＨＳＰ７２発現の投与量依存性を調べるため、ラットはＧＧＡを各種の投与量（０，４００，６００，８００ｍｇ／ｋｇ）で投与してから２４時間後に死亡させた。
ＧＧＡやビヒクルの投与による処置を伴うクモ膜下出血後、脳底動脈内のＨＳＰ７２誘導はＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット法や血管造影にて評価した。ＧＧＡ投与群ラットは、１２時間毎にＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。クモ膜下出血群のラットは、自家血０.４ｍｌを注射し、同量（４００ｍｇ／ｋｇ）のビヒクルを１２時間毎に経口投与した。クモ膜下出血とＧＧＡ群のラットは、自家血０.４ｍｌを注射し、１２時間毎にＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。
【００２９】
＜実験結果＞
ＲＴ−ＰＣＲ法によると、クモ膜下出血後第１日目及び第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現は、クモ膜下出血を起こさない場合に比べて、３倍以上に増加した。また、生理食塩水を投与した場合に比べると、クモ膜下出血後第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現は、３倍以上に増加した（図１）。クモ膜下出血後の脳底動脈における構成的ＨＳＰ７３ｍＲＮＡは、生理食塩水の投与によっては変わらなかった（図１）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の結果からも、クモ膜下出血後第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡは、有意に（１.８倍程度）誘導されていることが判明した（図２）。しかしながら、生理食塩水投与後またはクモ膜下出血後において、第１日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現量には、違いが見られなかった。ＨＳＰ７２タンパク質の発現は、誘導的ＨＳＰ７２に対して特異的に反応する抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。その結果、第２日目には、ＨＳＰ７２タンパク質が有意に誘導されている（２.３倍）ことが分かった（図３）。
【００３０】
脳底動脈におけるクモ膜下出血後の血管攣縮試験は、血管造影法によって実施された（図７）。クモ膜下出血を起こしたラットにおいては、血管攣縮は第１日目から観察され、第２日目において最高値となり、動脈径はベースライン（開始前の径）に比べて８６％に減少した。その後、血管攣縮は徐々に解消し、第７日目にはベースラインに戻った。
【００３１】
脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現の重要性を確認するために、ＨＳＰ７２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて、ＨＳＰ７２タンパク質の発現を抑制した。ＲＴ−ＰＣＲ法の結果によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、第２日目におけるＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現増加は抑制されていることが分かった（図４）。デンシトメータを用いた解析によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合に比べると、ＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現量は、６３％に減少していた。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の結果からも、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡ発現量は有意に抑制されている（０.７４倍）ことが判明した（図５）。
【００３２】
アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮによる転写段階での抑制が、タンパク質レベルでの発現を抑制しているかどうかを確認するために、ウエスタンブロット解析を行った。その結果、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮは、ＨＳＰ７２タンパク質の発現を抑制していることが分かった（図６）。デンシトメータを用いた解析によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮに比べると、ＨＳＰ７２タンパク質を約７５％に抑えていた。
【００３３】
血管造影法によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮ、又はセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽に投与した場合には、クモ膜下出血後第２日目と第３日目の動脈径には、有意な差異が認められた（図７）。すなわち、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合には、血管攣縮は有意に増悪した。これに対して、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、クモ膜下出血後の血管攣縮には、影響を与えなかった。いずれの群においても、血管攣縮は、クモ膜下出血後第７日目には回復した。
【００３４】
脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現に対するＧＧＡの用量依存的な影響を確認するために、経口投与後２４時間目の評価を行った（図８）。脳及び脳底動脈のいずれにおいても、ＨＳＰ７２の発現は、４００ｍｇ／ｋｇの投与量で認められ、用量に依存して６００ｍｇ／ｋｇの投与量でピークに至った。
【００３５】
また、脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現に対するＧＧＡの時間依存的な影響を確認するために、単一の用量（４００ｍｇ／ｋｇ）を投与した後の経時的な評価を行った（図９）。脳におけるＨＳＰ７２の発現は、ＧＧＡ投与後４時間でピークに達し、その後徐々に減少して４８時間目には見られなくなった。一方、脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現は、ＧＧＡ投与後４時間目から認められ、１２時間目でピークに達した後、徐々に減少して４８時間目には見られなくなった。
【００３６】
脳底動脈において、ＧＧＡ投与によるＨＳＰ７２の発現変化を、ＲＴ−ＰＣＲ法及びウエスタンブロット法を用いて検討した（図１０及び図１１）。生食大槽内投与後、４回ＧＧＡを経口投与した２日目では、２回ＧＧＡを投与した１日目に比べ、脳底動脈のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現レベル有意に上昇は、投与量依存性であった。これは、くも膜下出血後も同様に、投与量依存性に上昇していた。さらに、２日目の各群を比較すると、生食大槽内投与に比べ、ＳＡＨでは、ＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現レベルが有意に上昇していた。ＧＧＡ経口投与、ヴィークル経口投与ともに、くも膜下出血後２日目、３日目で、ＨＳＰ蛋白質の顕著な誘導がみられた。
ＧＧＡ投与後、２日目では、生食大槽内投与とくも膜下出血ではＨＳＰ７２蛋白質の発現レベルは同程度であったが、３日目ではくも膜下出血でＨＳＰ７２蛋白質の発現が有意に上昇していた。
【００３７】
血管造影法によれば、ＧＧＡまたはビィークルを投与した後にクモ膜下出血を起こすと、第１日目〜第３日目において、動脈径に有意な変化が認められた（図１２）。図から明らかなように、ＧＧＡを経口投与すると、血管攣縮は改善された。
【００３８】
【発明の効果】
クモ膜下出血後の遺伝子発現プロフィールの変化から解析したところ、ヒートショックプロテインの発現誘導を行う物質をスクリーニングすることにより、クモ膜下出血後の血管攣縮を抑制できる物質を見出すことに成功した。
また、このスクリーニングによって見出されたＧＧＡを投与することにより、脳底動脈にヒートショックプロテインを誘導し、クモ膜下出血後の脳血管攣縮を抑制することができた。
【００３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】 大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後のＨＳＰ７２，ＨＳＰ７３，及びβアクチンの発現量を確認するために、脳底動脈におけるＲＴ−ＰＣＲを行ったサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図２】 大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行ったときのＨＳＰ７２／βアクチン発現量比を示すグラフ図である。
【図３】 大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後に、ＨＳＰ７２に対するウエスタンブロット法を行ったときの写真図である。
【図４】 クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後のＨＳＰ７２ｍＲＮＡ発現量を確認したＲＴ−ＰＣＲサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図５】 クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＨＳＰ７２／βアクチン発現量比を示すグラフ図である。
【図６】 クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後にＨＳＰ７２に対するウエスタンブロット法を行ったときの写真図である。
【図７】 クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血を起こした後の血管攣縮を経時的に血管造影法で確認したときの結果を示すグラフである。
【図８】 ＧＧＡ（０，４００，６００，８００ｍｇ／ｋｇ）投与後、２４時間目において、脳または脳底動脈でのＨＳＰ７２の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図９】 ＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）投与後、脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の経時的な発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図１０】 各処置（クモ膜下出血＋ビヒクル、生理食塩水＋ＧＧＡ、クモ膜下出血＋ＧＧＡ）を行った場合において、ＨＳＰ７２の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図１１】 各処置（クモ膜下出血＋ビヒクル、生理食塩水＋ＧＧＡ、クモ膜下出血＋ＧＧＡ）を行った場合において、ＨＳＰ７２タンパク質の発現をウエスタンブロット法で確認したときの写真図である。
【図１２】 ビィークルまたはＧＧＡを前投与した場合に、クモ膜下出血を起こした後の血管攣縮を経時的に血管造影法で確認したときの結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a vascular disorder condition improving agent.
[0002]
[Prior art]
Vascular disorders are fundamental pathological conditions such as ischemic heart disease, cerebrovascular disorders, peripheral vascular disorders, and are extremely important in clinical medicine. Cerebral vasospasm, which is one of cerebrovascular disorders, refers to cerebral artery spasm that occurs after subarachnoid hemorrhage (hereinafter sometimes referred to as “SAH”). This cerebral vasospasm may be early-onset or late-onset. Among these, delayed cerebral vasospasm develops 3 to 9 days after the onset of subarachnoid hemorrhage. It is said that late neuroischemic injury (cerebral vasospasm) occurs in 27% to 38% of patients with subarachnoid hemorrhage. In addition, even if surgical or post-surgical procedures for intracranial aneurysms are successful, 26% to 38% of such patients will suffer from sequelae, and deaths due to vasospasm It can be seen.
Conventionally, investigation of the mechanism inherent in delayed cerebral vasospasm has been widely conducted, and many advanced treatments have been performed (see Non-Patent Document 1), but there are no reports of successful reports. Not issued.
[0003]
On the other hand, in recent years, many genes have been identified by the remarkable development of biotechnology. However, for these genes, although the primary structure is known, it is difficult to say that the function is known. In addition, since DNA microarrays allow the expression profiles of many genes to be seen, research is ongoing to confirm the effects of various shocks (eg, heat shock, drug administration, etc.) on gene expression.
[0004]
By the way, heat shock protein (HSP) is a general term for a protein group in which synthesis is induced when a cell or an individual undergoes a temperature change of about 5 ° C. to 10 ° C. higher than normal temperature (heat shock). . In addition to heat shock, HSP synthesis is also induced by various chemical substances (for example, inhibitors of electron transport systems, transition metals, SH reagents, ethanol, etc.). For this reason, HSP is also called a stress protein. In eukaryotes, low molecular weight HSP groups such as HSP90, HSP70, ubiquitin, and HSP26 are representative HSPs, and each amino acid sequence is well conserved during the evolution process. Among these, human HSP70 has at least about 10 types of HSP70 genes.
[0005]
The functions of HSP are diverse. For example, HSP70 is known to have a function of binding to a denatured protein and preventing its associated precipitation and a function of releasing the binding protein in an ATP-dependent manner. HSP60 also has a function of recognizing and binding a folding intermediate molten globule structure.
[0006]
On the other hand, the general formula (1)
[Chemical 2]

It is known that 6,10,14,18-tetramethyl-5,9,13,17-nonadecatetraen-2-one represented by the formula is effective for the treatment and prevention of various peptic ulcers and gastritis. (See Patent Document 1 and Patent Document 2). However, in the knowledge so far, the relationship between such a compound and delayed cerebral vasospasm is not known at all.
[0007]
[Patent Document 1]
JP-A-53-145922
[Patent Document 2]
JP-A-62-10013
[Non-Patent Document 1]
Mayberg MR, "Cerebral vasospasm". Neurosurgery Clinics of North America, USA, 1998, Vol. 9, p.615-627
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above-described problems, and its object is to elucidate changes that a vascular disorder (particularly, vasospasm) has on a gene expression profile and to find a drug that suppresses this vasospasm. And a vasospasm inhibitor obtained by the method.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have confirmed a change in gene expression profile after bleeding (particularly, subarachnoid hemorrhage), and as a result, have found heat shock protein as a substance capable of suppressing vasospasm.
Furthermore, the general formula (1)
[Chemical 3]

In order to complete the present invention, it is found that the compound represented by the formula is effective against vasospasm by inducing the expression of heat shock protein at the site of bleeding causing injury. It came.
[0010]
That is, the first invention is a vascular disorder condition-improving agent that improves the pathological condition related to vascular disorders by inducing the expression of heat shock protein at the disordered site where bleeding has occurred.
[0011]
In the present invention, the “damaged site causing bleeding” is, for example, the brain (in this case, bleeding is, for example, subarachnoid hemorrhage). In the present specification, “heat shock protein” means a protein expressed by stress (shock) such as heat, active oxygen, and radiation, and includes families such as HSP60 family, HSP70 family, and HSP90 family. Including. In particular, among these families, the HSP70 family (HSP70, HSP72, HSP73, etc.) is preferable, and among them, HSP72 is more preferable.
[0012]
“Disease related to vascular disorder” includes, for example, early or late vasospasm that occurs after bleeding. In this case, the “vasopathological condition improving agent” is a vasospasm inhibitor.
[0013]
In the first invention, the vascular disorder condition improving agent or vasospasm inhibitor is represented by the general formula (1)
[Formula 4]

6, 10,14,18-tetramethyl-5,9,13,17-nonadecatetraen-2-one (also known as geranylgeranylacetone, generic name: teprenone, hereinafter referred to as “GGA”). ) As an active ingredient. GGA is a prenyl ketone compound, and various isomers can be considered in view of its structure. The present invention includes these various isomers. For example, the 5, 9 and 13 positions may be either E-form or Z-form, respectively, or a single product consisting of only one kind of isomer, or two or more kinds. It may be a mixture of isomers. However, it is preferably a (5E, 9E, 13E) isomer alone, a (5Z, 9E, 13E) isomer alone, or a mixture of these two isomers at an arbitrary mixing ratio, and more preferably (5E, 9E). , 13E) and (5Z, 9E, 13E) isomers in a mass ratio of 3: 2. GGA can be produced according to the production method described in, for example, JP-A No. 53-145922.
[0014]
The compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for vasospasm by inducing the expression of heat shock protein, preferably as a prophylactic and / or therapeutic agent for cerebral vasospasm, more preferably subarachnoid. It can be used as a preventive and / or therapeutic agent for delayed cerebral vasospasm that develops after bleeding. The administration form of the compound according to the present invention is not particularly limited, and can be administered, for example, orally or parenterally. The dosage forms for oral administration are solid or liquid dosage forms, specifically tablets, coated tablets, pills, fine granules, granules, powders, capsules, syrups, emulsions, suspensions, An injection or the like is preferable. The dosage form for parenteral administration is preferably an injectable preparation, an instillation, an external preparation, a suppository and the like.
[0015]
Further, the above compound can be formulated by a commonly used method, and commonly used excipients (eg, lactose, sucrose, starch, mannitol, etc.), binders (eg, pregelatinized starch, gum arabic) , Carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, etc.), colorants, flavoring agents, etc., and if necessary, stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, etc. In general, it is formulated by a conventional method by blending ingredients used as raw materials for pharmaceutical preparations. The dose of the above compound is appropriately determined depending on conditions such as symptoms, age, and body weight, and is 20 mg to 2000 mg, preferably 50 mg to 1000 mg, more preferably 100 mg to 500 mg per day for an adult.
[0016]
The second invention is a method for screening the agent according to the first invention, characterized in that expression of heat shock protein (particularly HSP72) is used as an index.
In the present invention, “expression induction” means (1) induction of heat shock protein from a state in which substantially no heat shock protein is expressed, and (2) heat that has already been expressed. Includes both increasing the amount of shock protein. “Agent” includes relatively low molecular weight compounds, nucleic acids (including DNA and RNA), proteins, and the like.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings, but the technical scope of the present invention is not limited by the following embodiment, without changing the gist thereof, Various modifications can be made. Further, the technical scope of the present invention extends to an equivalent range.
[0018]
<Experimental example 1> Change in expression profile by fluorescence differential display method (FDD method)
The changes in gene expression profile after subarachnoid hemorrhage were confirmed by the FDD method. The FDD (fluorescent differential display) method is a gene expression analysis method for simultaneously comparing the expression of a large number of samples. First strand DNA is synthesized from a total RNA using a fluorescent anchor primer, and an arbitrary primer and a fluorescent anchor primer are used. PCR is performed to amplify a plurality of cDNA fragments. After separating the PCR product with a denaturing polyacrylamide gel, a fluorescence image is obtained, DNA bunts having different band intensities (expression levels) are cut out, re-amplified, cloned, and base sequences are determined. As a result of this FDD method, it was confirmed that the expression of HPS72 was highly increased with subarachnoid hemorrhage and vasospasm.
<Experimental example 2> Experimental animal and cerebral vasospasm model
In the following experimental examples, the experimental procedure for handling experimental animals followed the guidelines for animal experiments at Mie University School of Medicine. Sprague-Dawley rats (SD rats; 11-12 weeks old, 340-380 g; JAPAN SLC) were administered with chloral hydrate (400 mg / kg) by intraperitoneal injection and anesthetized. Rats were allowed to breathe spontaneously. A 24-gauge catheter was placed in the right radial artery and autologous arterial blood was removed. The animal was placed in the head holder with its head bent 30 degrees. The medial incision of the occipital region with a surgical microscope was used to expose the frontal atlanto-occipital membrane and puncture a cerebellar medullary tub with a 27 gauge needle. 0.1 ml of cerebrospinal fluid was removed with the needle and then 0.3 ml of autologous blood or saline was slowly infused over 5 minutes. The rats were awakened after being left for 10 minutes with their heads down.
The rat cerebral vasospasm model was performed according to a method described in the literature (The Journal of Clinical Investigation, 1999, Jul, 104 (1), 59-66). That is, a cerebral vasospasm model (single bleeding model) in which autologous arterial blood was injected once into the SD rat cisterna was used. In the single bleeding model, the amount of autologous arterial blood injected into the cisterna was 0.4 ml. As a control, the same operation was performed using physiological saline or vehicle instead of the autologous arterial blood.
[0019]
<Experiment 3> Angiography
In angiography (vertebral arteriography), 1 ml of contrast medium (IOMERON400; manufactured by Eisai Co., Ltd.) was injected into the right radial artery. The exposure data were 50 mAS, 150 kV, and 0.5 seconds. Further, the focus-object distance was 50 cm, and the focus-film distance was 100 cm.
[0020]
<Experimental example 4> Measurement of arterial diameter
The diameter of the basilar artery was measured at three locations (0.5 mm above the vertebral artery node, midpoint, and just below the posterior cerebral aortic bifurcation). Three skilled technicians measured the diameter of the basilar artery three times on a computer monitor without being informed of information about the treatment group. Average values were determined using NIH (National Medical Research Institute) image analysis software, high resolution scanner, and Macintosh computer.
[0021]
<Experimental example 5> RT-PCR analysis
Total RNA was isolated from the basilar artery using ISOGEN reagent (Nippon Gene). This RNA (0.5 μg) was reverse-transcribed using Superscripts II reverse transcriptase (GIBCO BRL) according to the supplier's protocol. The resulting cDNA was used as a template for PCR amplification.
As a primer for amplification of rat HSP72 mRNA (L16764), 5′-TGCTGACCAGATGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) was used as a forward primer, and 5′-AGAGTCGATCTCCCAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 2) was used as a reverse primer. . PCR products were detected by electrophoresis on 2% agarose gel and staining with ethidium bromide.
[0022]
<Experimental example 6> Real-time RT-PCR analysis
Real-time RT-PCR analysis was performed using TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems) according to the supplier's protocol.
As a primer for amplification of rat HSP72 mRNA, 5′-CCCGGAGAGAAGGAGTAACTTTGAATAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 3) was used as a forward primer, and 5′-TGGATAGTAGGCTGTTTCTGGCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4) was used as a reverse primer. In addition, 5 ′ (FAM) -TGCACCAGCAGCCATCAAGAGTCCTGT- (TAMRA) p3 ′ (SEQ ID NO: 5) was used as a probe for detecting rat HSP72 mRNA.
[0023]
As a primer for amplifying rat β-actin, 5′-TGAACACGGCATTGTAACCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was used as a forward primer, and 5′-CAGTGGGACGACCAGAGGCATA-3 ′ (SEQ ID NO: 7) was used as a reverse primer. As a probe for detecting rat β-actin mRNA, 5 ′ (FAM) -TGTACGTAGCCATCCAGGCCTCTCTTG- (TAMRA) p3 ′ (SEQ ID NO: 8) was used.
[0024]
The PCR reaction and the resulting fluorescent staining luminescence were monitored in real time using a 7700-sequence detector (Perkin-Elmer). The signal was analyzed using the sequence detector V1.6.3 program (Perkin-Elmer).
[0025]
<Experimental example 7> Injection of phosphorothioate-type oligonucleotide into the cisterna magna
As an antisense HSP72 oligonucleotide (hereinafter referred to as “ODN”) sequence, 5′-TGTTTTCTTGGCCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) was used. 5′-ATGGCCAAGAAAACA-3 ′ (SEQ ID NO: 10) was used as the sense HSP72ODN sequence. Antisense HSP72ODN and sense HSP72ODN were each diluted with physiological saline to a concentration of 200 μM.
The ODN solution was injected twice into the cisterna. The first injection (0.5 ml) was administered 48 hours before subarachnoid hemorrhage occurred. The next injection (0.5 ml) was administered 24 hours before the occurrence of subarachnoid hemorrhage. Note that no cytotoxicity was observed for each ODN solution. Sequence similarity was checked against reported DNA sequences present in Genebank.
[0026]
<Experimental example 8> Western blot analysis
50 μg equivalent of protein was separated on 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was incubated using a 1: 20000 dilution of a rabbit polyclonal antibody against rat HSP72, SPA-760 (StressGen Biotechnologies). Signal amplification was performed using an advanced chemiluminescence (ECL) detection kit.
[0027]
<Experimental example 9> Oral administration of GGA
GGA was orally administered after adding 5% by mass of gum arabic and 0.008% by mass of tocopherol to 100% by mass of GGA.
In order to investigate the time dependence of HSP72 expression in the brain or in the basilar artery, 0 hours, 4 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours after GGA was administered at a single dose (400 mg / kg) Rats were killed after hours.
[0028]
In order to examine the dose dependency of HSP72 expression, rats were killed 24 hours after administration of GGA at various doses (0,400,600,800 mg / kg).
After subarachnoid hemorrhage accompanied by treatment with GGA or vehicle administration, HSP72 induction in the basilar artery was evaluated by RT-PCR, Western blotting or angiography. GGA administration group rats were orally administered GGA (400 mg / kg) every 12 hours. Rats in the subarachnoid hemorrhage group were injected with 0.4 ml of autologous blood and orally administered the same amount (400 mg / kg) of vehicle every 12 hours. Rats in the subarachnoid hemorrhage and GGA group were injected with 0.4 ml autologous blood and orally administered GGA (400 mg / kg) every 12 hours.
[0029]
<Experimental result>
According to the RT-PCR method, the expression of HSP72 mRNA on the first and second days after subarachnoid hemorrhage increased more than 3 times compared to the case where no subarachnoid hemorrhage occurred. In addition, the expression of HSP72 mRNA on the second day after subarachnoid hemorrhage increased more than 3 times compared to the case where physiological saline was administered (FIG. 1). Constitutive HSP73 mRNA in the basilar artery after subarachnoid hemorrhage did not change with saline administration (FIG. 1). The results of the real-time RT-PCR method also revealed that HSP72 mRNA on the second day after subarachnoid hemorrhage was significantly (about 1.8 times) induced (FIG. 2). However, there was no difference in the expression level of HSP72 mRNA on the first day after administration of physiological saline or after subarachnoid hemorrhage. The expression of HSP72 protein was confirmed by Western blotting using an antibody that specifically reacts with inducible HSP72. As a result, it was found that the HSP72 protein was significantly induced (2.3 times) on the second day (FIG. 3).
[0030]
A vasospasm test after subarachnoid hemorrhage in the basilar artery was performed by angiography (FIG. 7). In rats with subarachnoid hemorrhage, vasospasm was observed from the first day, peaked on the second day, and arterial diameter decreased to 86% compared to baseline (the diameter before the start) . Thereafter, vasospasm gradually disappeared and returned to baseline on the seventh day.
[0031]
In order to confirm the importance of HSP72 expression in the basilar artery, antisense oligonucleotide (ODN) against HSP72 was used to suppress the expression of HSP72 protein. According to the results of the RT-PCR method, it was found that when antisense HSP72-ODN was administered, the increase in expression of HSP72 mRNA on the second day was suppressed (FIG. 4). According to the analysis using a densitometer, when the antisense HSP72-ODN was administered, the expression level of HSP72 mRNA was reduced to 63% compared to the case where the sense HSP72-ODN was administered. Further, the results of the real-time RT-PCR method also revealed that when antisense HSP72-ODN was administered, the expression level of HSP72 mRNA on the second day was significantly suppressed (0.74 times) ( FIG. 5).
[0032]
In order to confirm whether the suppression at the transcription stage by antisense HSP72-ODN suppressed the expression at the protein level, Western blot analysis was performed. As a result, antisense HSP72-ODN was found to suppress the expression of HSP72 protein (FIG. 6). According to the analysis using a densitometer, the antisense HSP72-ODN suppressed the HSP72 protein to about 75% compared to the sense HSP72-ODN.
[0033]
According to angiography, when antisense HSP72-ODN or sense HSP72-ODN was administered to the cisterna, the arterial diameter on the second and third days after subarachnoid hemorrhage was significantly Differences were observed (Figure 7). That is, when antisense HSP72-ODN was administered into the cisterna, vasospasm was significantly exacerbated. In contrast, when sense HSP72-ODN was administered, vasospasm after subarachnoid hemorrhage was not affected. In either group, vasospasm recovered on day 7 after subarachnoid hemorrhage.
[0034]
To confirm the dose-dependent effect of GGA on HSP72 expression in the brain or basilar artery, an evaluation at 24 hours after oral administration was performed (FIG. 8). In both the brain and basilar artery, HSP72 expression was observed at a dose of 400 mg / kg and peaked at a dose of 600 mg / kg depending on the dose.
[0035]
In addition, in order to confirm the time-dependent effect of GGA on the expression of HSP72 in the brain or basilar artery, evaluation over time after administration of a single dose (400 mg / kg) was performed (FIG. 9). . The expression of HSP72 in the brain reached a peak at 4 hours after GGA administration, and then gradually decreased and disappeared at 48 hours. On the other hand, the expression of HSP72 in the basilar artery was observed from 4 hours after GGA administration, reached a peak at 12 hours, and then gradually decreased and disappeared at 48 hours.
[0036]
In the basilar artery, the change in the expression of HSP72 by GGA administration was examined using the RT-PCR method and the Western blot method (FIGS. 10 and 11). On the second day after oral administration of 4 times GGA after administration in the saline basin, the expression level of HSP72 mRNA in the basilar artery was significantly increased compared to the first day after administration of GGA twice. It was. This was also dose-dependently elevated after subarachnoid hemorrhage. Furthermore, when each group on the second day was compared, the expression level of HSP72 mRNA was significantly increased in SAH as compared to administration in the saline basin. In both GGA oral administration and vehicle oral administration, significant induction of HSP protein was observed on the second and third days after subarachnoid hemorrhage.
On the second day after GGA administration, the expression level of HSP72 protein was similar in the administration in the saline cistern and in the subarachnoid hemorrhage, but on the third day, the expression of HSP72 protein was significantly increased in the subarachnoid hemorrhage. It was.
[0037]
According to angiography, when subarachnoid hemorrhage occurred after administration of GGA or vehicle, a significant change in arterial diameter was observed from the first day to the third day (FIG. 12). As is clear from the figure, vasospasm was improved when GGA was orally administered.
[0038]
【The invention's effect】
Analysis of changes in gene expression profiles after subarachnoid hemorrhage revealed that a substance capable of suppressing vasospasm after subarachnoid hemorrhage was successfully screened by screening for substances that induce heat shock protein expression.
Moreover, by administering GGA found by this screening, heat shock protein was induced in the basilar artery, and cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage could be suppressed.
[0039]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 RT-PCR in the basilar artery to confirm the expression levels of HSP72, HSP73, and β-actin after injecting physiological saline or autologous arterial blood (subarachnoid hemorrhage model) into the cisterna magna It is a SDS-PAGE photograph figure of the sample which performed.
FIG. 2 is a graph showing the HSP72 / β-actin expression ratio when a real-time RT-PCR method is performed after injecting physiological saline or autologous arterial blood (subarachnoid hemorrhage model) into the cisterna magna. .
FIG. 3 is a photograph when Western blotting is performed on HSP72 after injecting physiological saline or autologous arterial blood (subarachnoid hemorrhage model) into the cisterna magna.
FIG. 4 shows an RT-PCR sample in which the expression level of HSP72 mRNA after subarachnoid hemorrhage was confirmed when antisense HSP72-ODN or sense HSP72-ODN was administered into the cisterna magna before subarachnoid hemorrhage occurred. It is a SDS-PAGE photograph figure.
FIG. 5: Real-time RT-PCR confirms the expression of HSP72 mRNA after subarachnoid hemorrhage when antisense HSP72-ODN or sense HSP72-ODN is administered into the cisterna magna before subarachnoid hemorrhage occurs It is a graph which shows HSP72 / (beta) actin expression level ratio when doing.
FIG. 6 is a photograph when Western blotting for HSP72 is performed after subarachnoid hemorrhage when antisense HSP72-ODN or sense HSP72-ODN is administered into the cisterna magna before subarachnoid hemorrhage occurs. It is.
FIG. 7 shows angiography over time of vasospasm after subarachnoid hemorrhage when antisense HSP72-ODN or sense HSP72-ODN was administered into the cisterna before subarachnoid hemorrhage occurred. It is a graph which shows a result when confirmed by the method.
FIG. 8 is an SDS-PAGE photograph when the expression of HSP72 in the brain or basilar artery is confirmed by RT-PCR at 24 hours after administration of GGA (0,400,600,800 mg / kg). is there.
FIG. 9 is an SDS-PAGE photograph showing the time-dependent expression of HSP72 in the brain or basilar artery after administration of GGA (400 mg / kg) by RT-PCR.
FIG. 10 is a photograph of SDS-PAGE when the expression of HSP72 was confirmed by RT-PCR method when each treatment (subarachnoid hemorrhage + vehicle, physiological saline + GGA, subarachnoid hemorrhage + GGA) was performed. is there.
FIG. 11 is a photograph when HSP72 protein expression is confirmed by Western blotting when each treatment (subarachnoid hemorrhage + vehicle, physiological saline + GGA, subarachnoid hemorrhage + GGA) is performed.
FIG. 12 is a graph showing the results when vasospasm after subarachnoid hemorrhage was confirmed by angiography over time when vehicle or GGA was pre-administered.

Claims (2)

By inducing the expression of HSP72 in subarachnoid hemorrhage site, it is one that inhibit vasospasm in the brain, the formula (1)

A cerebral vasospasm inhibitor comprising, as an active ingredient, 6,10,14,18-tetramethyl-5,9,13,17-nonadecatetraen-2-one represented by: The screening method of the cerebral vasospasm inhibitor which is characterized in that the screening of cerebral vasospasm inhibitor to inhibit vasospasm in the brain inducing the expression as an indicator of HSP72.

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