JP4042454B2 - 光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルは、天然物や医薬などの合成において不斉炭素導入原料として有用な化合物である。
従来、かかる光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを製造する方法としては、化学的不斉合成、光学分割、酵素による合成法が知られている。
化学的不斉合成法としては、例えばビスオキサゾリン系の不斉触媒を用いてシリルエノラートとエチリデンマロネートとを付加させた後２工程を経て目的化合物を得る方法（J. Am. Chem. Soc. (2000), 122(38), 9134-9142.）、化学修飾されたシンコナアルカロイドを用いて３−メチルグルタル酸無水物をアルコール存在下開環させる方法（J. Am. Chem. Soc. (2000), 122(39), 9542-9543.）、光学活性なルイス酸を用いて３−メチルグルタル酸無水物を開環させる方法（J. Org. Chem. (1998), 63(4), 1190-1197.）、光学活性な１−ナフチルエタノールを３−メチルグルタル酸無水物に反応させた後２工程を経て目的化合物を得る方法（J. Org. Chem. (1993), 58(1), 142-6.）、光学活性スルホキシドを用いる不斉マイケル付加反応を利用し多段階を経て目的化合物を得る方法（Tetrahedron (1986), 42(11), 2919-29.）等が挙げられる。これら化学的不斉合成法は高価で合成方法が複雑な試剤が必要であったり、また工程数が長く低収率であったり、更には得られる光学純度も必ずしも充分なものではなかった。
光学分割法としてはラセミの３−メチルグルタル酸モノエステルからシンコニンを用いてＲ体を、キーニネを用いてＳ体をそれぞれ取得する方法（Tetrahedron (1985), 41(3), 627-33. 、J. Chem. Soc., (1950), 3333-5.）が知られている。これらの光学分割法は充分な光学純度を得るために複数回の再結晶を必要とするなどの問題があった。
酵素を用いた方法としては、原料に３−メチルグルタル酸無水物を用いてリパーゼＰ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）、またはリパーゼＰＳ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）により加アルコール分解反応を行い目的化合物を得る方法（JP 01091789 A2、Agric. Biol. Chem. (1988), 52(12), 3087-92.、Liebigs Ann. (1996), (9), 1443-1448.）、あるいは原料に３−メチルグルタル酸ジエステルを用いてブタ肝臓リパーゼ、またはリパーゼＰ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）により加水分解を行い目的化合物を得る方法（US 5262313 A、Tetrahedron (1988), 44(5), 1477-87.、J. Am. Chem. Soc. (1982), 104(25), 7294-9.、Agric. Biol. Chem. (1988), 52(12), 3087-92.）が知られている。これら酵素法による反応においてはいずれも通常の酵素反応条件下では目的化合物の光学純度は必ずしも充分なものではなかった。
光学純度を向上させるために特殊な手法として、２０％メタノール水溶液中、−１０℃という低温で３−メチルグルタル酸ジエステルにブタ肝臓リパーゼを作用させることで高いｅｅの目的化合物を得る方法（J. Org. Chem. (1986), 51(11), 2047-50.）、または繊維状の層を有するフィルターエレメントに固定化されたブタ肝臓リパーゼを用い高いｅｅの目的物を得る方法（JP 09501565 T2）が知られている。上記の特殊な方法のうち前者は目的を達するためには低温を必要とするため酵素の活性が低くなり通常の反応温度と比べて反応時間が長くまた酵素量も多く必要となる。さらに反応終了後目的物を酵素から分離するには一旦メタノールを留去してから有機溶媒への抽出操作が必要となり通常のメタノールを使用しない反応より不利である。後者は複雑手法で固定化された酵素を使用する必要があるといった問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、３−メチルグルタル酸ジエステルを原料として通常の酵素反応条件下、種々の酵素を用いて光学選択的に加水分解することにより光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを製造する方法について鋭意検討した結果、光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの両異性体をそれぞれ容易に効率よく製造できることを見い出し、本発明に至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼまたはキラザイム（登録商標）Ｌ−５(Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製、商標品)を用いて一般式（１）
（式中、Ｒは同一または相異なり、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを５〜６５℃で加水分解することを特徴とする一般式（２）
（式中、Ｒは前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明方法において用いられる原料である一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルは、例えば、Tetrahedron (1988), 44(1), 119-26.に記載の方法に準じて得ることができるが、この方法に限定されるわけではなく、他の方法により得られたものでも使用することができる。
【０００６】
本発明の一般式で示される化合物におけるＲで示される炭素数１〜４の低級アルキル基として、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が例示される。
【０００７】
かかる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルとして、具体的には３−メチルグルタル酸ジメチル、３−メチルグルタル酸ジエチル、３−メチルグルタル酸ジｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸ジイソプロピル、３−メチルグルタル酸ジｎ−ブチル、３−メチルグルタル酸ジイソブチル、３−メチルグルタル酸ジｓｅｃ−ブチル、３−メチルグルタル酸ジｔｅｒｔ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸エチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−プロピル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−プロピル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−イソブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−イソブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【０００８】
本発明において用いることのできる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有し、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノエステルを選択的に生成する酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素を挙げることができる。
【０００９】
本発明において用いることのできる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有し、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸モノエステルを選択的に生成する酵素としては、キラザイム（登録商標）Ｌ−５ (Candida antarctica 由来、ロシュ・ダイアグノスティックス (Roche Diagnostics) 社製、商標品 ) （以下、キラザイム （登録商標）Ｌ−５と記す）を挙げることができる。
【００１０】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素（以下、本酵素と記す）としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）から突然変異剤もしくは紫外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
【００１１】
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２００１−４６０８４号公報、特開平１０−２１０９７５号公報、特開平７−１６３３６４号公報、または特開平５−５６７８７号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（特開平７−１６３３６４号公報）を挙げることができる。
【００１２】
また、遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、 例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990） の方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２０００−７８９８８号公報、または特開平７−２１３２８０号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型エステラーゼを挙げることができる。
【００１３】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどを使用することができる。
また、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいは一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを適宜培地に添加してもよい。
【００１４】
培養は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度は、２０〜４０℃程度、好ましくは、２５〜３５℃程度で、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルの不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
【００１５】
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋曹達工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００１６】
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物などの種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００１７】
かかる本酵素またはキラザイム（登録商標）Ｌ−５（以下、使用酵素と記す）の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常は０．０１〜２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００１８】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常０．５モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられ、通常は２００重量倍以下である。
【００１９】
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍程度の範囲である。
【００２１】
不斉加水分解反応は、例えば水、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルおよび使用酵素を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルおよび使用酵素を混合すればよい。
【００２２】
反応系のｐＨは使用酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４〜１０程度、好ましくはｐＨ６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることによりｐＨを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムなどのリン酸塩、トリエチルアミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニアなどが使用される。かかる塩基は単独もしくは２種類以上を混合して用いてもよい。かかる塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するもと同じものを使用することができる。さらに塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。
【００２３】
反応温度は、高すぎると使用酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、５〜６５℃であり、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。
【００２４】
かくして一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの溶液が得られるが、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは反応が未完結であった場合の原料などと分離するためにさらに後処理操作を行ってもよい。
かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後蒸留により分離精製する方法、分液操作により分離精製する方法などが挙げられる。
【００２５】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。
また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。
【００２６】
反応終了後、反応が未完結で原料である一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルが残存した場合あるいは中性の不純物が生成した場合は疎水性有機溶媒を用いて有機層に抽出し水層と分液することで目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルと分離することができる。
かかる疎水性有機溶媒としては例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。かかる中性成分除去のための分液操作時のｐＨは通常６〜１０程度の範囲、好ましくは７〜９程度の範囲である。
溶液をかかるｐＨに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。
かかる酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸などの無機酸およびその塩、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸などの有機酸およびその塩などが挙げられる。かかる塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
水層からの中性成分の除去が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
【００２７】
目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルと酵素や緩衝剤などの水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを抽出し水層と分液すればよい。
かかる疎水性有機溶媒としては中性成分除去のための分液操作時に用いたものと同様のものを用いることができる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は、通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
かかる目的物の抽出時のｐＨは通常１〜７程度の範囲、好ましくは２〜５程度の範囲である。
溶液をかかるｐＨに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。
かかる酸および塩基としては中性成分除去のための分液操作時に用いたものと同様のものを用いることができる。
水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
【００２８】
次いで得られた油層中の有機溶媒を留去することで目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを単離することができる。
得られた一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルはさらにカラムクロマトグラフィーや蒸留などによって精製されてもよい。
【００２９】
かくして得られた一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルとして、具体的には（Ｒ）−３−メチルグルタル酸メチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸エチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸イソプロピル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｎ−ブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸イソブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸メチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸エチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸イソプロピル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｎ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸イソブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、特定の酵素を用いることによって、一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを、容易に効率よく製造することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１〜９
３−メチルグルタル酸ジメチル２５ｍｇを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解させた溶液を、表１に示した種々の酵素をそれぞれ表２に示した量を量り取ったところへ加えた。この溶液を２５℃で、２０時間攪拌した後、３.４％リン酸水溶液１ｍｌ、塩化ナトリウム２.１ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍｌを加え混合した。油層をＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノメチルの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表２に示す
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
比較例１
酵素をＰＬＥ−Ａ（天野エンザイム社製）１.０ｍｇ用いた以外は実施例１〜２７と同様にして、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９１％、鏡像異性体過剰率は６８％ｅｅであった。
【００３６】
実施例１０
リン酸水素２カリウム１.１６ｇを水６６.６ｇに溶解させ、リン酸０.２３ｇを加えてｐＨ６.９とした。この溶液に３−メチルグルタル酸ジメチル１０．０ｇと特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含む培養物０.５０ｇを加え、２５℃で２６時間攪拌した。さらに前記と同じクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含む培養物９.５０ｇを加え、２５℃で１３時間攪拌した。この反応の間は１０％炭酸ナトリウム水溶液３８.４ｇを反応溶液のｐＨが７.０になるように連続的に滴下し続けた。得られた反応混合物に塩化ナトリウム３７０.７ｇ、酢酸エチル５００.０ｍｌを加えた後、３５％塩酸４９.９ｇを加えてｐＨを４.０とした。更にこの溶液にセライトを加えて１０分間攪拌し、ろ過により固形物を除去した後、分液により油層と水層に分離した。水層に酢酸エチル５００.０ｍｌを加えて、再度抽出、分液操作を行い水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。合一した油層を飽和食塩水２００ｇで洗浄後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノメチル５４.６ｇを油状物質として得た。得られた油状物質をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９１.０％、鏡像異性体過剰率は１００％ｅｅであった。
【００３７】
比較例２
リン酸水素２カリウム６.８６ｇを水３９３.６ｇに溶解させ、リン酸１.１５ｇを加えてｐＨ７.０とした。この溶液に３−メチルグルタル酸ジメチル５９.１ｇとＰＬＥ−Ａ（天野エンザイム社製）１.００ｇを加え、２５℃で２２時間攪拌した。この反応の間は７％炭酸水素ナトリウム水溶液６３２.６ｇを反応溶液のｐＨが７.０になるように連続的に滴下し続けた。得られた反応混合物に塩化ナトリウム３０.０ｇ酢酸エチル５０.０ｇを加えた後、３５％塩酸６.５３ｇを加えてｐＨを４.０とした。更にこの溶液にセライト５.０ｇを加えて１０分間攪拌し、ろ過により固形物を除去した後、分液により油層と水層に分離した。水層に酢酸エチル５０.０ｇを加えて、再度抽出、分液操作を行い水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。合一した油層を飽和食塩水５０ｇで洗浄後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノメチル９.２ｇを油状物質として得た。得られた油状物質をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９８.７％、鏡像異性体過剰率は８１.１％ｅｅであった。
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルは、天然物や医薬などの合成において不斉炭素導入原料として有用な化合物である。
従来、かかる光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを製造する方法としては、化学的不斉合成、光学分割、酵素による合成法が知られている。
化学的不斉合成法としては、例えばビスオキサゾリン系の不斉触媒を用いてシリルエノラートとエチリデンマロネートとを付加させた後２工程を経て目的化合物を得る方法（J. Am. Chem. Soc. (2000), 122(38), 9134-9142.）、化学修飾されたシンコナアルカロイドを用いて３−メチルグルタル酸無水物をアルコール存在下開環させる方法（J. Am. Chem. Soc. (2000), 122(39), 9542-9543.）、光学活性なルイス酸を用いて３−メチルグルタル酸無水物を開環させる方法（J. Org. Chem. (1998), 63(4), 1190-1197.）、光学活性な１−ナフチルエタノールを３−メチルグルタル酸無水物に反応させた後２工程を経て目的化合物を得る方法（J. Org. Chem. (1993), 58(1), 142-6.）、光学活性スルホキシドを用いる不斉マイケル付加反応を利用し多段階を経て目的化合物を得る方法（Tetrahedron (1986), 42(11), 2919-29.）等が挙げられる。これら化学的不斉合成法は高価で合成方法が複雑な試剤が必要であったり、また工程数が長く低収率であったり、更には得られる光学純度も必ずしも充分なものではなかった。
光学分割法としてはラセミの３−メチルグルタル酸モノエステルからシンコニンを用いてＲ体を、キーニネを用いてＳ体をそれぞれ取得する方法（Tetrahedron (1985), 41(3), 627-33. 、J. Chem. Soc., (1950), 3333-5.）が知られている。これらの光学分割法は充分な光学純度を得るために複数回の再結晶を必要とするなどの問題があった。
酵素を用いた方法としては、原料に３−メチルグルタル酸無水物を用いてリパーゼＰ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）、またはリパーゼＰＳ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）により加アルコール分解反応を行い目的化合物を得る方法（JP 01091789 A2、Agric. Biol. Chem. (1988), 52(12), 3087-92.、Liebigs Ann. (1996), (9), 1443-1448.）、あるいは原料に３−メチルグルタル酸ジエステルを用いてブタ肝臓リパーゼ、またはリパーゼＰ（天野エンザイム(Amano enzyme)社製）により加水分解を行い目的化合物を得る方法（US 5262313 A、Tetrahedron (1988), 44(5), 1477-87.、J. Am. Chem. Soc. (1982), 104(25), 7294-9.、Agric. Biol. Chem. (1988), 52(12), 3087-92.）が知られている。これら酵素法による反応においてはいずれも通常の酵素反応条件下では目的化合物の光学純度は必ずしも充分なものではなかった。
光学純度を向上させるために特殊な手法として、２０％メタノール水溶液中、−１０℃という低温で３−メチルグルタル酸ジエステルにブタ肝臓リパーゼを作用させることで高いｅｅの目的化合物を得る方法（J. Org. Chem. (1986), 51(11), 2047-50.）、または繊維状の層を有するフィルターエレメントに固定化されたブタ肝臓リパーゼを用い高いｅｅの目的物を得る方法（JP 09501565 T2）が知られている。上記の特殊な方法のうち前者は目的を達するためには低温を必要とするため酵素の活性が低くなり通常の反応温度と比べて反応時間が長くまた酵素量も多く必要となる。さらに反応終了後目的物を酵素から分離するには一旦メタノールを留去してから有機溶媒への抽出操作が必要となり通常のメタノールを使用しない反応より不利である。後者は複雑手法で固定化された酵素を使用する必要があるといった問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、３−メチルグルタル酸ジエステルを原料として通常の酵素反応条件下、種々の酵素を用いて光学選択的に加水分解することにより光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを製造する方法について鋭意検討した結果、光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの両異性体をそれぞれ容易に効率よく製造できることを見い出し、本発明に至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼまたはキラザイム（登録商標）Ｌ−５(Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製、商標品)を用いて一般式（１）
で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを５〜６５℃で加水分解することを特徴とする一般式（２）
で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明方法において用いられる原料である一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルは、例えば、Tetrahedron (1988), 44(1), 119-26.に記載の方法に準じて得ることができるが、この方法に限定されるわけではなく、他の方法により得られたものでも使用することができる。
【０００６】
本発明の一般式で示される化合物におけるＲで示される炭素数１〜４の低級アルキル基として、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が例示される。
【０００７】
かかる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルとして、具体的には３−メチルグルタル酸ジメチル、３−メチルグルタル酸ジエチル、３−メチルグルタル酸ジｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸ジイソプロピル、３−メチルグルタル酸ジｎ−ブチル、３−メチルグルタル酸ジイソブチル、３−メチルグルタル酸ジｓｅｃ−ブチル、３−メチルグルタル酸ジｔｅｒｔ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸エチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−プロピル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−メトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−プロピル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−エトキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソプロピル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ｎ−プロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｎ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−イソプロピルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸イソブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−ｎ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−イソブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｓｅｃ−ブチル、４−イソブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル−３−メチルブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【０００８】
本発明において用いることのできる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有し、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノエステルを選択的に生成する酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素を挙げることができる。
【０００９】
本発明において用いることのできる一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有し、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸モノエステルを選択的に生成する酵素としては、キラザイム（登録商標）Ｌ−５ (Candida antarctica 由来、ロシュ・ダイアグノスティックス (Roche Diagnostics) 社製、商標品 ) （以下、キラザイム （登録商標）Ｌ−５と記す）を挙げることができる。
【００１０】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の酵素（以下、本酵素と記す）としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）から突然変異剤もしくは紫外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して不斉加水分解能を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
【００１１】
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばJ.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２００１−４６０８４号公報、特開平１０−２１０９７５号公報、特開平７−１６３３６４号公報、または特開平５−５６７８７号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（特開平７−１６３３６４号公報）を挙げることができる。
【００１２】
また、遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、 例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990） の方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２０００−７８９８８号公報、または特開平７−２１３２８０号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型エステラーゼを挙げることができる。
【００１３】
クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどを使用することができる。
また、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいは一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを適宜培地に添加してもよい。
【００１４】
培養は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度は、２０〜４０℃程度、好ましくは、２５〜３５℃程度で、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルの不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
【００１５】
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋曹達工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００１６】
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物などの種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００１７】
かかる本酵素またはキラザイム（登録商標）Ｌ−５（以下、使用酵素と記す）の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、その使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常は０．０１〜２００重量倍程度、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００１８】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して通常０．５モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられ、通常は２００重量倍以下である。
【００１９】
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍程度の範囲である。
【００２１】
不斉加水分解反応は、例えば水、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルおよび使用酵素を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルおよび使用酵素を混合すればよい。
【００２２】
反応系のｐＨは使用酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４〜１０程度、好ましくはｐＨ６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることによりｐＨを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムなどのリン酸塩、トリエチルアミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニアなどが使用される。かかる塩基は単独もしくは２種類以上を混合して用いてもよい。かかる塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するもと同じものを使用することができる。さらに塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。
【００２３】
反応温度は、高すぎると使用酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、５〜６５℃であり、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。
【００２４】
かくして一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの溶液が得られるが、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは反応が未完結であった場合の原料などと分離するためにさらに後処理操作を行ってもよい。
かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後蒸留により分離精製する方法、分液操作により分離精製する方法などが挙げられる。
【００２５】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。
また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。
【００２６】
反応終了後、反応が未完結で原料である一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルが残存した場合あるいは中性の不純物が生成した場合は疎水性有機溶媒を用いて有機層に抽出し水層と分液することで目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルと分離することができる。
かかる疎水性有機溶媒としては例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。かかる中性成分除去のための分液操作時のｐＨは通常６〜１０程度の範囲、好ましくは７〜９程度の範囲である。
溶液をかかるｐＨに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。
かかる酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸などの無機酸およびその塩、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸などの有機酸およびその塩などが挙げられる。かかる塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
水層からの中性成分の除去が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
【００２７】
目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルと酵素や緩衝剤などの水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを抽出し水層と分液すればよい。
かかる疎水性有機溶媒としては中性成分除去のための分液操作時に用いたものと同様のものを用いることができる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は、通常一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルに対して０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
かかる目的物の抽出時のｐＨは通常１〜７程度の範囲、好ましくは２〜５程度の範囲である。
溶液をかかるｐＨに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。
かかる酸および塩基としては中性成分除去のための分液操作時に用いたものと同様のものを用いることができる。
水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
【００２８】
次いで得られた油層中の有機溶媒を留去することで目的物である一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを単離することができる。
得られた一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルはさらにカラムクロマトグラフィーや蒸留などによって精製されてもよい。
【００２９】
かくして得られた一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルとして、具体的には（Ｒ）−３−メチルグルタル酸メチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸エチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸イソプロピル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｎ−ブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸イソブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸メチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸エチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｎ−プロピル、３−メチルグルタル酸イソプロピル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｎ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸イソブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｓｅｃ−ブチル、（Ｓ）−３−メチルグルタル酸ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、特定の酵素を用いることによって、一般式（２）で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルを、容易に効率よく製造することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１〜９
３−メチルグルタル酸ジメチル２５ｍｇを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに溶解させた溶液を、表１に示した種々の酵素をそれぞれ表２に示した量を量り取ったところへ加えた。この溶液を２５℃で、２０時間攪拌した後、３.４％リン酸水溶液１ｍｌ、塩化ナトリウム２.１ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍｌを加え混合した。油層をＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノメチルの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表２に示す
【００３３】
【表１】
【表２】
比較例１
酵素をＰＬＥ−Ａ（天野エンザイム社製）１.０ｍｇ用いた以外は実施例１〜２７と同様にして、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９１％、鏡像異性体過剰率は６８％ｅｅであった。
【００３６】
実施例１０
リン酸水素２カリウム１.１６ｇを水６６.６ｇに溶解させ、リン酸０.２３ｇを加えてｐＨ６.９とした。この溶液に３−メチルグルタル酸ジメチル１０．０ｇと特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作製したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含む培養物０.５０ｇを加え、２５℃で２６時間攪拌した。さらに前記と同じクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含む培養物９.５０ｇを加え、２５℃で１３時間攪拌した。この反応の間は１０％炭酸ナトリウム水溶液３８.４ｇを反応溶液のｐＨが７.０になるように連続的に滴下し続けた。得られた反応混合物に塩化ナトリウム３７０.７ｇ、酢酸エチル５００.０ｍｌを加えた後、３５％塩酸４９.９ｇを加えてｐＨを４.０とした。更にこの溶液にセライトを加えて１０分間攪拌し、ろ過により固形物を除去した後、分液により油層と水層に分離した。水層に酢酸エチル５００.０ｍｌを加えて、再度抽出、分液操作を行い水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。合一した油層を飽和食塩水２００ｇで洗浄後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノメチル５４.６ｇを油状物質として得た。得られた油状物質をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９１.０％、鏡像異性体過剰率は１００％ｅｅであった。
【００３７】
比較例２
リン酸水素２カリウム６.８６ｇを水３９３.６ｇに溶解させ、リン酸１.１５ｇを加えてｐＨ７.０とした。この溶液に３−メチルグルタル酸ジメチル５９.１ｇとＰＬＥ−Ａ（天野エンザイム社製）１.００ｇを加え、２５℃で２２時間攪拌した。この反応の間は７％炭酸水素ナトリウム水溶液６３２.６ｇを反応溶液のｐＨが７.０になるように連続的に滴下し続けた。得られた反応混合物に塩化ナトリウム３０.０ｇ酢酸エチル５０.０ｇを加えた後、３５％塩酸６.５３ｇを加えてｐＨを４.０とした。更にこの溶液にセライト５.０ｇを加えて１０分間攪拌し、ろ過により固形物を除去した後、分液により油層と水層に分離した。水層に酢酸エチル５０.０ｇを加えて、再度抽出、分液操作を行い水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。合一した油層を飽和食塩水５０ｇで洗浄後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−３−メチルグルタル酸モノメチル９.２ｇを油状物質として得た。得られた油状物質をガスクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＢ−Ｈ、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（ダイセル社製）〕にて分析し、得られた光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率９８.７％、鏡像異性体過剰率は８１.１％ｅｅであった。
Claims (6)
- クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼまたはキラザイム（登録商標）Ｌ−５(Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製、商標品)を用いて一般式（１）
（式中、Ｒは同一または相異なり、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを５〜６５℃で加水分解することを特徴とする一般式（２）
（式中、Ｒは前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法。 - クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼを用いて一般式（１）
（式中、Ｒは同一または相異なり、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを５〜６５℃で加水分解することを特徴とする一般式（２）
（式中、Ｒは前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルのＲ体の製造方法。 - キラザイム（登録商標）Ｌ−５(Candida antarctica由来、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社製、商標品)を用いて一般式（１）
（式中、Ｒは同一または相異なり、炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
で示される３−メチルグルタル酸ジエステルを５〜６５℃で加水分解することを特徴とする一般式（２）
（式中、Ｒは前記と同じ意味を示し、＊は不斉炭素原子であることを示す。）
で示される光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルのＳ体の製造方法。 - クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼが、その特定のアミノ酸が１個ないしは複数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型エステラーゼである請求項１または２に記載の製造方法。
- クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼが、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選ばれる変異型エステラーゼである請求項１または２に記載の製造方法。
（Ａ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がセリンに、１８９番目のアミノ酸がフェニルアラニンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ）
（Ｂ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がアラニンに、１８９番目のアミノ酸がチロシンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ）
（Ｃ）クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来の野生型エステラーゼのアミノ酸配列において、１６０番目のアミノ酸がセリンに、１８９番目のアミノ酸がチロシンに、それぞれ置換された変異型エステラーゼ（１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ） - 一般式（１）で示される３−メチルグルタル酸ジエステルにおいて、Ｒがメチルである請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
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