JP3997441B2

JP3997441B2 - 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase and process for producing the same

Info

Publication number: JP3997441B2
Application number: JP33933596A
Authority: JP
Inventors: 収生足立; 一信松下
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2016-12-19
Also published as: JPH10179153A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＫｍ値の低い新規な３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその製造法に関するものである。
胆汁酸は、生体内では肝臓でコレステロールより合成され、一次胆汁酸であるコール酸、ケノデオキシコール酸が生成する。しかし、これらは腸内細菌により更に代謝され、デオキシコール酸、リトコール酸等の二次胆汁酸やウルソデオキシコール酸等の二次胆汁酸となって存在している。
胆汁中に分泌された、これらのコール酸は、一般に腸管により再吸収され、門脈を経て肝臓にもどる腸肝循環を営んでいるが、肝外側副血行、肝臓での輸送障害、胆汁うっ滞などを起こす病態で血清中に漏出してくる。このため、血清胆汁酸は肝胆道疾患のスクリーニングや経過観察に有用なマーカーとなっている。
上記胆汁酸は３αにＯＨ基を有しており、この水酸基を酸化する酵素、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが測定に利用されている。
【０００２】
【従来の技術】
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.50)の存在は古くから知られており、１９５２年には該酵素がテストステロンで誘導されたシュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）で生産されることが報告されている。また、該酵素は既に市販されている。更に、該酵素の起源としては、ノカルディア（Nocardia）属由来の酵素（特開昭620151199 号公報) 、セルロモナス・ツルバータ(Cellulomonas turubata) 由来の酵素（特公平3-23154 号公報) が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、血清胆汁酸の濃度レベルは低く、正常値は１０μＭ以下、肝胆道疾患でも５０μＭ程度に過ぎない。このため、胆汁酸を精度良く測定するには胆汁酸に対するＫｍ値の低い３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが求められていた。
【０００４】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス（Pseudomonas)に属する微生物から、胆汁酸に対するＫｍ値の低い３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである。
作用：次の反応を触媒する。
３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケトステロイド＋ＮＡＤＨ
基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコール酸、リトコール酸に作用する。
至適温度：４５℃
至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）
ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ
分子量：２５，０００（ゲルろ過法）
２５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【０００６】
また、本発明はシュードモナス属に属し、上記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養物より３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの製造法である。
【０００７】
本発明の酵素の起源は、上記性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生するものであれば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良い。好ましくは、上記性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生しうるシュードモナス（Pseudomonas)属細菌であって、好適な例としては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＴＥ３６２０が挙げられる。シュードモナス・プチダＴＥ３６２０の菌学的性質は以下の通りである。
【０００８】
（ａ）形態
（１）菌形：短かん菌
（２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ
（３）細胞の多形性：無し
（４）運動性：有り
（５）胞子の有無：無し
（ｂ）各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で黄白色のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁状（Entire）であり、クッション状（Pulvinate ）である。表面は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。
（２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。沈さはないが、菌環を若干認めた。
（３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸状（Filiform）に生育する。ゼラチン液化力は弱い。
（４）リトマスミルク：アルカリ性に変化する。ミルクは固化しない。
【０００９】
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陰性（−）
（２）硝酸塩の還元：陽性（＋）
（３）脱窒反応： −
（４）ＭＲテスト： −
（５）ＶＰテスト： −
（６）インドールの生成： −
（７）硫化水素の生成： −
（８）デンプンの分解： −
（９）ゼラチンの分解： −
（１０）チロシンの分解＋
【００１０】
（１１）クエン酸の利用：
koser の培地＋
Christensen の培地＋
（１２）無機窒素源の利用
硝酸ナトリウム −
硫酸アンモニウム＋
グルタミン酸ナトリウム＋
（１３）色素の生成：キングＢ培地中で蛍光色素を生成する。
（１４）ウレアーゼ −
（１５）オキシダーゼ＋
（１６）カタラーゼ＋
（１７）β−ガラクトシダーゼ −
（１８）アルギニンジヒドロラーゼ＋
（１９）リジンカルボキシラーゼ −
（２０）オルニチンカルボキシラーゼ −
（２１）トリプトファンデアミナーゼ −
（２２）β−グルコシダーゼ −
【００１１】
（２３）生育の範囲：

（２４）酸素に対する態度：好気性（２５）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：Ｏ（酸化）
【００１２】
（２６）糖から酸およびガスの生成

【００１３】
（２７）有機化合物の利用
Ｄ−グルコース＋
Ｌ−アラビノース＋
Ｄ−マンノース＋
Ｄ−マンニトール −
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン −
マルトース −
グルコン酸カリウム＋
ｎ−カプリン酸＋
アジピン酸 −
ｄｌ−リンゴ酸＋
酢酸フェニル＋
【００１４】
上記菌学的性質同定のための実験法は、主として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学会出版センター（１９８５年）によって行った。また分類同定の基準として「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９８４年）を参考にした。
以上の文献および菌学的性質を参考にすると、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に属すると考えられ、それぞれシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＴＥ３６２０と命名した。本菌は微生物寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６００７として寄託されている。
【００１５】
本発明の酵素を製造するにあたっては、上記３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物から３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取することにより製造できる。３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの生産誘導として、コール酸等の３α−ヒドロキシステロイドを添加しておくことが望ましい。
【００１６】
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、菌体内および菌体外に３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが生産蓄積される。
本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１７】
次に本発明の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、２５℃で約５分予備加温する。
０．９６ｍｌ５０ｍＭグリシン・ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．０
０．０２ｍｌ２０ｍＭＮＡＤ⁺
０．０１ｍｌ酵素溶液
次に基質溶液（１００ｍＭコール酸ナトリウム）０．０１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に℃で制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵素希釈液を加え、上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。上記条件下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によって３α−ヒドロキシステロイドに対するＫｍ値の小さい３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例１
０．２％硝酸ナトリウム、０．２％硫酸アンモニウム、０．０５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸二カリウム、０．１％リン酸一カリウム、０．２％コール酸ナトリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、ｐスードモナス・プチダＴＥ３６２０（ＦＥＲＭＰ−１６００７）を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体を超音波破砕後、硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−５０によるゲルろ過により比活性１７．５Ｕ／ｍｇにまで精製した。得られた３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは下記の特性を有していた。
【００２０】
作用：下記の反応を触媒した。
３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケトステロイド＋ＮＡＤＨ
【００２１】
【表１】

【００２２】
本酵素はＮＡＤ⁺のみ利用し、ＮＡＤＰ⁺は利用しなかった。
【００２３】
【表２】

【００２４】
至適ｐＨ：
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、５０ｍＭグリシン−ＮＡＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜９．５）、５０ｍＭリン酸二ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８〜１１）、５ｍＭＡＰＢ（ｐＨ１１〜１１．５）中での酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す通りであって、至適ｐＨは１０〜１１であった。
【００２５】
安定ｐＨ：
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．２〜７．８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８〜１１）中で、酵素を２５℃、１６時間保存し、残存活性を測定した。その結果は第２図に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ６〜９であった。
【００２６】
至適温度：
各温度における酵素活性を測定した。その結果は第３図に示す通りであって、至適温度は４５℃であった。
【００２７】
熱安定性：
本発明の酵素をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で１０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は第４図に示す通りであって、４０℃まで安定であった。
【００２８】

【００２９】
比較例１
本発明の酵素の性質を既知の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの性質と比較した。
【００３０】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having a low Km value and a method for producing the same.
In the living body, bile acids are synthesized from cholesterol in the liver to produce cholic acid and chenodeoxycholic acid which are primary bile acids. However, these are further metabolized by intestinal bacteria and exist as secondary bile acids such as deoxycholic acid and lithocholic acid and secondary bile acids such as ursodeoxycholic acid.
These cholic acids secreted into the bile are generally reabsorbed by the intestinal tract and enter the hepatic circulation returning to the liver via the portal vein, but the lateral hepatic accessory circulation, impaired transport in the liver, cholestasis Leakage into serum due to pathological conditions For this reason, serum bile acids are useful markers for screening and follow-up of hepatobiliary diseases.
The bile acid has an OH group at 3α, and an enzyme that oxidizes this hydroxyl group, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase, is used for the measurement.
[0002]
[Prior art]
The presence of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase (EC 1.1.1.50) has been known for a long time, and in 1952 it was reported that the enzyme was produced in Pseudomonas testosteroni, which was induced with testosterone. Yes. The enzyme is already commercially available. Further, as the origin of the enzyme, an enzyme derived from the genus Nocardia (Japanese Patent Laid-Open No. 620151199) and an enzyme derived from Cellulomonas turubata (Japanese Patent Publication No. 3-23154) are known. Yes.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In general, the concentration level of serum bile acid is low, the normal value is 10 μM or less, and it is only about 50 μM even for hepatobiliary disease. For this reason, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having a low Km value with respect to bile acids has been required to accurately measure bile acids.
[0004]
[Means for Solving the Invention]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having a low Km value for bile acids from microorganisms belonging to Pseudomonas, and have completed the present invention. It was.
[0005]
That is, the present invention is a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having the following physicochemical properties.
Action: Catalyze next reaction.
3α-hydroxysteroid + NAD ⁺ → 3-ketosteroid + NADH
Substrate specificity: Acts on cholic acid, deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, 6-ketolitocholic acid, lithocholic acid.
Optimal temperature: 45 ° C
Optimum pH: pH 10-11
Thermal stability: 40 ° C. or less (pH 8.0, 10 minutes)
pH stability: pH 6-9 (25 ° C., 16 hours)
Km value for cholic acid: 0.015 mM
Molecular weight: 25,000 (gel filtration method)
25,000 (SDS-PAGE)
[0006]
Further, the present invention is characterized in that 3α-hydroxysteroid dehydrogenase belonging to the genus Pseudomonas and having the above physicochemical properties and capable of producing 3α-hydroxysteroid dehydrogenase is cultured in a medium, and 3α-hydroxysteroid dehydrogenase is collected from the culture. -Production method of hydroxysteroid dehydrogenase.
[0007]
The origin of the enzyme of the present invention may be any origin such as animal, plant, microorganism, etc., as long as it produces 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having the above properties. Preferably, a bacterium belonging to the genus Pseudomonas that can produce 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having the above-mentioned properties, and a preferred example thereof is Pseudomonas putida TE3620. Mycological properties of Pseudomonas putida TE3620 are as follows.
[0008]
(A) Morphology (1) Bacterial form: Short bacilli (2) Cell size: 2.0-2.5 × 1.0 μm
(3) Cell polymorphism: No (4) Motility: Yes (5) Spore presence / absence: No (b) Growth state in each medium (1) Meat broth agar plate medium: Yellowish white when cultured at 30 ° C. for 24 hours Colonies form. The periphery of the colony has an entire edge (Entire) and a cushion (Pulvinate). The surface is smooth, glossy and translucent.
(2) Meat broth liquid culture: Growth is normal and turbid uniformly. There was no sedimentation, but some fungi were observed.
(3) Broth gelatin puncture culture: Growth is normal and only the upper part grows in a filamentous form. Gelatin liquefaction is weak.
(4) Litmus milk: Changes to alkaline. Milk does not solidify.
[0009]
(C) Physiological properties (1) Gram stainability: Negative (-)
(2) Reduction of nitrate: positive (+)
(3) Denitrification reaction: −
(4) MR test: −
(5) VP test: −
(6) Production of indole: −
(7) Production of hydrogen sulfide: −
(8) Starch degradation: −
(9) Degradation of gelatin: −
(10) Tyrosine degradation +
[0010]
(11) Use of citric acid:
koser medium +
Christensen's medium +
(12) Utilization of inorganic nitrogen source Sodium nitrate −
Ammonium sulfate +
Sodium glutamate +
(13) Dye production: A fluorescent dye is produced in King B medium.
(14) Urease −
(15) Oxidase +
(16) Catalase +
(17) β-galactosidase −
(18) Arginine dihydrolase +
(19) Lysine carboxylase −
(20) Ornithine carboxylase −
(21) Tryptophan deaminase −
(22) β-glucosidase −
[0011]
(23) Range of growth:

(24) Attitude toward oxygen: Aerobic (25) OF test (Hugh Leifson method): O (oxidation)
[0012]
(26) Generation of acid and gas from sugar

[0013]
(27) Use of organic compounds D-glucose +
L-arabinose +
D-Mannose +
D-mannitol-
N-acetyl-D-glucosamine −
Maltose −
Potassium gluconate +
n-Capric acid +
Adipic acid −
dl-malic acid +
Phenyl acetate +
[0014]
The experimental method for identifying the above bacteriological properties was mainly performed by Takeharu Hasegawa, revised edition “Classification and Identification of Microorganisms”, Japan Society for Publishing Society (1985). In addition, “Burgers Manual of Systematic Bacteriology” (1984) was used as a reference for classification and identification.
With reference to the above literature and mycological properties, it was considered to belong to Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) TE3620, respectively. This bacterium is deposited under the microorganism deposit number FERM P-16007.
[0015]
The enzyme of the present invention can be produced by culturing the 3α-hydroxysteroid dehydrogenase-producing bacterium in a nutrient medium and collecting 3α-hydroxysteroid dehydrogenase from the culture. As a medium used for culturing 3α-hydroxysteroid dehydrogenase-producing bacteria, both a synthetic medium and a natural medium can be used as long as they contain appropriate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used. Can be used. As the carbon source, for example, glucose, glycerol or the like is used. As the nitrogen source, for example, nitrogen-containing natural products such as peptones, meat extracts and yeast extracts, and inorganic nitrogen-containing compounds such as ammonium chloride and ammonium citrate are used. As the inorganic substance, potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate or the like is used. In addition, it is desirable to add a 3α-hydroxysteroid such as cholic acid as a production induction of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase.
[0016]
The medium is usually cultured by shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is 20 to 35 ° C., preferably 25 to 30 ° C., and the culture pH is 5 to 11, preferably 6 to 10. It can be carried out if the strain to be used grows under other conditions. The culture period usually grows in 1 to 7 days, and 3α-hydroxysteroid dehydrogenase is produced and accumulated in and outside the cells.
The purification method of the enzyme of the present invention may be a commonly used purification method. For example, after removing the cells, the salting-out method such as ammonium sulfate or sodium nitrate, the metal aggregation method such as magnesium chloride or calcium chloride, the aggregation method such as protamine or polyethyleneimine, DEAE (diethylaminoethyl) -cellulose, It can be purified by ion exchange chromatography such as CM (carboxymethyl) -Sepharose. The crude enzyme solution and purified enzyme solution obtained by these methods can be pulverized by, for example, spray drying or freeze drying. Furthermore, it can be used as an immobilized enzyme by immobilization on an appropriate carrier.
[0017]
Next, a method for measuring the activity of the 3α-hydroxysteroid dehydrogenase of the present invention will be described.
First, the following reaction mixture is prepared in a cuvette and pre-warmed at 25 ° C. for about 5 minutes.
0.96 ml 50 mM glycine / NaOH buffer, pH 10.0
0.02 ml 20 mM NAD ⁺
0.01 ml Enzyme solution Next 0.01 ml of substrate solution (100 mM sodium cholate) was added and mixed gently, and the absorbance change at 340 nm was recorded for 3 to 4 minutes using a spectrophotometer controlled at 0 ° C with water as a control. The change in absorbance per minute is determined from the initial linear portion. In the blind test, an enzyme dilution solution was added to the reaction mixture instead of the enzyme solution, and the same operation as described above was performed to determine the absorbance per minute. The amount of enzyme that produces 1 micromole of NADH per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0018]
【The invention's effect】
According to the present invention, 3α-hydroxysteroid dehydrogenase having a small Km value for 3α-hydroxysteroid can be obtained.
[0019]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
Example 1
0.2% sodium nitrate, 0.2% ammonium sulfate, 0.05% yeast extract, 0.02% magnesium sulfate, 0.2% dipotassium phosphate, 0.1% monopotassium phosphate, 0.2% call 100 ml of a medium containing sodium acid was transferred to a 500 ml Sakaguchi flask and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. As an inoculum, p-Pseudomonas putida TE3620 (FERM P-16007) was inoculated with one platinum ear and cultured at 30 ° C. for 24 hours to obtain a seed culture solution. Next, 6 L of the same medium was transferred to a 10 L jar fermenter, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, then 100 ml of the seed culture solution was transferred, and cultured at 30 ° C. for 24 hours at 300 rpm, aeration rate of 2 l / min. The obtained bacterial cells were subjected to ultrasonic disruption and then purified to a specific activity of 17.5 U / mg by ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose chromatography, and gel filtration with Sephadex G-50. The obtained 3α-hydroxysteroid dehydrogenase had the following characteristics.
[0020]
Action: The following reaction was catalyzed.
3α-hydroxysteroid + NAD ⁺ → 3-ketosteroid + NADH
[0021]
[Table 1]

[0022]
This enzyme used only NAD ⁺ and not NADP ⁺ .
[0023]
[Table 2]

[0024]
Optimum pH :
In 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8-9), 50 mM glycine-NAOH buffer (pH 9-9.5), 50 mM disodium phosphate-NaOH buffer (pH 8-11), 5 mM APB (pH 11-11.5) The enzyme activity was measured. The result was as shown in FIG. 1 and the optimum pH was 10-11.
[0025]
Stable pH :
In 0.1 M acetate buffer (pH 4-6), K-phosphate buffer (pH 6.2-7.8), Tris-HCl buffer (pH 8-9), glycine-NaOH buffer (pH 8-11) The enzyme was stored at 25 ° C. for 16 hours, and the residual activity was measured. The result was as shown in FIG. 2, and the stable pH was pH 6-9.
[0026]
Optimal temperature :
Enzyme activity at each temperature was measured. The result was as shown in FIG. 3, and the optimum temperature was 45 ° C.
[0027]
Thermal stability :
After incubating the enzyme of the present invention in Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 10 minutes, the remaining enzyme activity was measured. The result was as shown in FIG. 4 and was stable up to 40 ° C.
[0028]

[0029]
Comparative Example 1
The properties of the enzyme of the present invention were compared with those of known 3α-hydroxysteroid dehydrogenases.
[0030]
[Table 3]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between reaction pH and relative activity of the enzyme of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the pH stability of the enzyme of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the reaction temperature and relative activity of the enzyme of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the thermal stability of the enzyme of the present invention.

Claims

3α-hydroxysteroid dehydrogenase having the following physicochemical properties:
Action: Catalyze next reaction.
3α-hydroxysteroid + NAD ⁺ → 3-ketosteroid + NADH
Substrate specificity: Acts on cholic acid, deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, 6-ketolitocholic acid, lithocholic acid.
Optimal temperature: 45 ° C
Optimum pH: pH 10-11
Thermal stability: 40 ° C. or less (pH 8.0, 10 minutes)
pH stability: pH 6-9 (25 ° C., 16 hours)
Km value for cholic acid: 0.015 mM
Molecular weight: 25,000 (gel filtration method)
25,000 (SDS-PAGE)

A 3α-hydroxysteroid dehydrogenase comprising 3α-hydroxysteroid dehydrogenase, which belongs to the genus Pseudomonas and has a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase-producing ability having the following physicochemical properties, is cultured in a medium: Manufacturing method.
Action: Catalyze next reaction.
3α-hydroxysteroid + NAD ⁺ → 3-ketosteroid + NADH
Substrate specificity: Acts on cholic acid, deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, 6-ketolitocholic acid, lithocholic acid.
Optimal temperature: 45 ° C
Optimum pH: pH 10-11
Thermal stability: 40 ° C. or less (pH 8.0, 10 minutes)
pH stability: pH 6-9 (25 ° C., 16 hours)
Km value for cholic acid: 0.015 mM
Molecular weight: 25,000 (gel filtration method)
25,000 (SDS-PAGE)