JP3980884B2 - プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチン - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、２０００年２月１５日出願の米国特許出願番号第６０／１８２，４７６号の優先権を主張し、その内容を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、ワクチン製造の分野にある。タンパク質に基づくワクチンに一般的に応用できる、新しい、そしてインフルエンザに対するワクチンの製造についての改良された技術を説明する。
【０００３】
本発明の背景
インフルエンザの発生
ワクチンは、インフルエンザに関連した高い疾病率及び死亡率の減少、並びに甚大な社会的、及び経済的影響の減少の最も有効な方法である。界面活性剤含有分解インフルエンザ・ワクチンが可能ではあるが、特に危険性の高いグループ、例えば幼児及び高齢者においてワクチン接種承諾のレベルが低い。例えば、６５歳超に当たる人々の半分未満しか実際にワクチンを受けていないと推測されている。さらに、健常成人における免疫増強に７０〜９０％有効であるにもかかわらず、現在の注射可能なインフルエンザ・ワクチンは幼児及び老人の人々において単回投与のときに乏しい免疫原性である。高齢者の間で２０〜２５％まで低い血清変換率が報告された。高齢者におけるこの低下した応答は、この年齢層における細胞傷害性Ｔリンパ球活性を含めた１型Ｔ細胞応答の衰えによると考えられている。減少した承諾と乏しい免疫原性の組合せが、依然として一般の人々の多くがインフルエンザに起因する感染症及び合併症の高い危険性であることを裏付ける。それらをアジュバントと一緒に同時投与することにより注射可能なインフルエンザ・サブユニット・ワクチンの免疫原性を高めるための多くの試みは、ヒトによる動物モデルにおいて見られた、免疫が後に続く局所反応誘発性の受容できない速度及び強い免疫賦活効果を再現できないことのために検証に失敗した。
【０００４】
経鼻ワクチンの利点
インフルエンザ感染は上気道及び下気道に限られるため、経鼻デリバリーされるインフルエンザ・ワクチンは、人々の全ての年齢層で免疫承諾を高めるであろうワクチン接種に対するより緩やかな方法を与える。さらに、注射可能なインフルエンザ・ワクチンが粘膜型ＩｇＡ誘導で役に立たない一方で、上気道における局所分泌型ＩｇＡの産生はインフルエンザ感染を保護しうるため経鼻経路による免疫は、筋中注射に比べてより有効であろう。インフルエンザ特異的分泌型ＩｇＡは、ウイルスの変異株について広い交差反応性を示すので、インフルエンザ・ウイルス変異体からのより有効な保護を提供する。特に経鼻インフルエンザ・ワクチンは、高齢者により有効であろう、なぜなら全身性免疫系と異なり粘膜型免疫応答は年齢と共に低下しないからである。全身性免疫応答をも刺激する経鼻インフルエンザ・ワクチンは、血清からの抗体の滲出により下気道（肺）を保護する。加えて、鼻に関連したリンパ組織におけるインフルエンザ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、感染からの回復に貢献しうる。
【０００５】
低温馴化弱毒生（ＣＡＶ）インフルエンザ・ワクチンは、伝統的にヒトにおいて鼻を介して使用されてきた。これらのインフルエンザ株は、それにより鼻咽気道において最小限複製させた低温（２５℃）での生育に馴化したインフルエンザ・ドナー・ウイルスからの他の内部及び構造タンパク質をコードする６の遺伝子をもつｆｌｕウイルスの流行の株のＨＡ及びＮＡ遺伝子を組合わせる遺伝子再集合体である。これらのワクチンは、インフルエンザによる自然の感染症により誘導される、鼻腔洗浄液中の分泌型ＩｇＡの増加、再刺激ＰＭＮＣ’ｓによるインターフェロン・ガンマ産生、及び同じサブタイプのウイルスに対して交差反応を広げる内部ウイルス・タンパク質に特異的なＣＴＬの活性化を含めたものに類似した保護免疫応答の誘導に利点をもつ。ＣＡＶインフルエンザ・ワクチンは商品化寸前であり、そして子供及び健常成人において十分に許容的で、そして免疫原性であることが証明されている。健常な子供における最近の研究において、１又は２回服用のＣＡＶ ｆｌｕワクチンは、注射可能な分解ｆｌｕワクチンと等量の全身性抗体を誘導することが示された。血清反応陰性の子供において＞８０％保護を誘導するためのＣＡＶの単回服用の能力は、この年齢層における同様の保護を達成するために２度の免疫を必要とする注射可能な分解ワクチンより有利である。健常成人及び高齢者において既存の循環抗原がこれらの年齢層における有効な血清変換を防げる（以下を参照のこと）のに反して、ＣＡＶ’ｓは、プラシーボに比べ熱性疾患の数、欠勤日数、及び医療サービス提供者への訪問の有意な減少を証明した。高齢者において、注射可能な分解サブユニットワクチンとの組合わせたＣＡＶ’ｓはプラシーボに比べて研究室レベルで記録されたインフルエンザが有意に減少した。
【０００６】
インフルエンザに対する前記ＣＡＶワクチンの利益にもかかわらずいくつかの不利益を有する：以前にインフルエンザ・ウイルスに哂された健常成人及び高齢者はＣＡＶワクチンにわずかにしか反応せず、そしてしばしば保護に関連する血清の血球凝集阻害（ＨＡＩ）のレベルに達しない。これは特に最も高い危険性のグループ、及び現在全体的なワクチン接種が勧められる唯一のグループの中の高齢者に顕著である。加えて、野生型株への逆戻り及び／又は循環株による組換えの可能性のある問題であるために、ＣＡＶ’ｓは免疫抑制された人又は妊婦における使用に勧めない。２０年のＣＡＶインフルエンザ・ワクチンの臨床評価にもかかわらず、製造及び品質管理の問題から認可は遅れている。
【０００７】
ＣＡＶインフルエンザ・ワクチンに関する潜在的な安全性問題を回避するために、現在経鼻不活化「分解」インフルエンザ・ワクチン（ＩＳＩＶ）の開発の試みがある。不活化分解インフルエンザ・ワクチンは精製インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）を含む。単独で又はさまざまな粒子状デリバリー媒体、若しくはエンテロトキシンに基づくアジュバントと共に与えられる不活化分解インフルエンザ・ワクチンは、動物及びヒトにおけるインフルエンザ特異的粘膜及び全身性免疫応答を誘導する。
【０００８】
ＩＳＩＶの経鼻製剤
それらが注射可能な経路により与えられるのと等量の用量で、抗原を単独で含む経鼻ＩＳＩＶは、動物及びヒトにおける制限実験において鼻ＩｇＡの有意に高いレベルの再現性のある誘導をする。しかしながら、より大量のＨＡでの２以上の服用の経鼻ＩＳＩＶは、商業的に実行可能性を欠く前述のワクチンを作る注射可能なＩＳＩＶと等量の血清ＨＡＩの誘導レベルが必要とされる。
【０００９】
エンテロトキシンの添加
誘導されたインフルエンザ特異的粘膜及び血清免疫応答は、マウスにおいてエンテロトキシン、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Tamura, et al., J. Immunol. (1992) 149 : 981-988（これらの研究ではＣＴＢの組換え起源を使用しないため、ＣＴＢと呼ばれるものでさえかなりの量の活性コレラ毒素を含んだ）、及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの組換え熱不安定性毒素（ｒＬＴ）、Barchfield, et al., Vaccine (1999) 17 : 695-704 を伴う経鼻的なＩＳＩＶ投与により達成されうる。
【００１０】
マウスにおいて、これらのエンテロトキシンは、不活化分解インフルエンザ・ワクチンを含む対応の抗原に対する強化された粘膜ＩｇＡ及び血清免疫応答の両方の誘導を可能にする強力な粘膜アジュバントである。ｒＬＴは、ヒトにおいてＩＳＩＶに対する局所性及び全身性ＨＡ特異的反応の促進をも示した（Hashigucci, et al., Vaccine (1996) 14 : 113-119 ）。しかしながら、ヒトにおける経鼻的エンテロトキシンに基づくアジュバントの評価は、経鼻投与後にエンテロトキシンがＣＮＳの嗅球部に達し、そしてその組織において強い炎症反応を誘発したことを示す、マウスにおける前臨床毒性試験の結果のために米国ＦＤＡにより中止された。この裁定はこれらのアジュバントを伴うｆｌｕワクチン（McGhee, et al., J. Immunol. (2000) 165 : 4778-4782）の開発を著しく妨げ、そして当面の間ヒト・ワクチンにおけるこのタイプのアジュバントの使用をおそらく不可能にするであろう。
【００１１】
脂質ベースの配合
粒子状種、例えばビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（インフルエンザ抗原によるリポソーム製剤）は、不活化インフルエンザ抗原のための有効な経鼻デリバリー媒体として動物実験及びヒトにおいて研究されてきた。粒子状抗原は鼻の感作リンパ組織内の抗原提示細胞による取り込みを促進しうる。ビロソームは脂質を含む体球を伴ったインフルエンザ・ウイルス抗原を含むリポソームである。これらのワクチンは注射可能なものとして欧州において認可されている。マウスにおいて、経鼻ビロソームは、有意に高いレベルの粘膜分泌型ＩｇＡと一緒に等量の注射可能な分解抗原と同じレベルまで血清力価を誘導する。ビロソームはヒトにおいて経鼻免疫の直後に免疫原性であることを示したが、しかし２の治験において、２回服用により与えられる３０μｇの総ＨＡによる経鼻免疫直後に注射可能なワクチンと等しい血清抗原の規定の力価を達成するために組換えＬＴが必須であることが証明された（Gluck, et al., J. Infect. Dis. (2000) 181 : 1129-1132 ）。スイスにおいて現在は認可されたが、注射可能なｆｌｕワクチンと免疫原性当量を達成するための、潜在的に神経毒のｒＬＴに関する要件は、北米を含む多くの地域においてワクチンを不可能にする。開発中の他の粒状デリバリー媒体は、脂質エンベロープに囲まれた炭水化物の内核を含むバイオベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）システムである。治験において、バイオベクターを伴う経鼻ＩＳＩＶは、プラシーボに比べて高い血清ＨＡＩ及び粘膜ＩｇＡを証明した。しかしながら、バイオベクターを伴うインフルエンザ抗原の試験した最も高いレベルの２回服用はＨＡＩ力価の増加を誘発し、そしてそれはこの技術による協力関係を廃止した主要なワクチン製造のパートナーによるこの製品の開発継続を正当化するために有意に十分ではなく、データ検討の結果、保護に関係する血清ＨＡＩレベルを達成するための免疫刺激物を有するバイオベクターの添加の必要性を示唆された。
【００１２】
脂質に基づく乳剤ＭＦ５９により処方されたＩＳＩＶは、開発継続の正当化に十分な対象インフルエンザ物件から有意に異った反応を誘発しなかった。他の技術であるモノホスホリル・リピドＡ（ＭＰＬＡ）は、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５のリポポリサッカライドから分離した脂質のオイルに基づく又は水性製剤から成るリポポリサッカライド・アジュバントである。この技術も前臨床試験において中程度成功したマウスにおける経鼻インフルエンザ・ウイルスの作製に使用された。
【００１３】
プロテオソーム技術
「プロテオソーム」は髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）の外膜タンパク質の製剤及び他の細菌からの類似の製剤を説明するために使用される。
【００１４】

【００１５】
ワクチン処方のためのプロテオソームの使用は、Lowell, G.H., in“New Generation Vaccines”2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong (1997) pages 193-206、により参照され、この内容を本明細書中に援用する。プロテオソームはあるウイルスに匹敵するサイズであると説明され、疎水性であり、そしてヒトの使用に関して安全である。プロテオソームはさまざまなタンパク質及びペプチドによるワクチンの処方に有用であると言われる。前記の総説は、可溶性界面活性剤が徹底的な透析技術を用いて選択的に除去される時に形成される多種抗原とプロテオソームの間の非共有複合体を含む組成物の製剤を説明する。細菌性赤痢・ワクチンに関して、限外ろ過が良好であると報告されている。ワクチンは、ここでは抗原が赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ）リポポリサッカライド、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）リポポリサッカライド、スタフィロコッカル（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢトキソイド、ヒト免疫不全ウイルス・エンベロープ・タンパク質、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛接着性タンパク質、並びにさまざまなペプチド、例えばマウス及びインフルエンザ・ウイルス由来のペプチドである。これらの製剤は粘膜適用が意図される。非経口ワクチンをも処方する。特に、（抗原全体ではなく）インフルエンザ由来のペプチドをワクチン製造のために使用した。Levi, R., et al., Vaccine (1995) 13 : 1353-1359を参照のこと。インフルエンザ・ウイルス抗原のための粘膜アジュバントとして働く髄膜炎菌からの外膜小胞の補足的な説明は、Dalseg, R., et al., Vaccines (1998) 96 : 177-182に記載される。
【００１６】
良好なワクチンの処方のための多数の尽力にもかかわらず、個々の免疫、特にインフルエンザによる感染症に対する効率的な方法及び有効な組成物に関する必要性は残っている。
【００１７】
本発明の開示
本発明は、プロテオソーム−インフルエンザ・ウイルス組成物、及びそれらの製造方法を説明する。これらのワクチンは製造が簡単で、そしてインフルエンザ感染症を保護しうる。好ましい態様は不活化インフルエンザ抗原、好ましくはグラム陰性細菌、例えばナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の外膜タンパク質の精製により形成されるプロテオソームによる非共有的に形成されたＨＡを含む経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンである。インフルエンザに対するワクチンは本明細書中に例示したが、適用された方法は一般的にウイルス・タンパク質抗原を含むワクチン製造に有用である。
【００１８】
したがって、１の側面において、本発明はワクチン組成物の製造方法に向けられ、上記方法は、界面活性剤の存在下、少なくとも１のウイルス・タンパク質抗原とプロテオソーム製剤の混合物を準備し、そしてその界面活性剤を上記混合物から限外ろ過により除去することを含む。好ましい態様において、前記混合物中のプロテオソーム対ウイルス抗原の比は１超：１、好ましくは２超：１、より好ましくは３超：１、そしてより好ましくは４超：１である。
【００１９】
他の側面において、本発明は前記の方法により製造されたワクチン、特に、凝集がウイルス抗原、好ましくはインフルエンザ血球凝集素とプロテオソームの間で形成されるワクチンに向けられる。好ましいサイズの範囲をも記載する。
【００２０】
本発明の詳細な説明
プロテオソームと複合体を形成したさまざまな病原生物からのペプチド及びリポポリサッカライド抗原は、さまざまな動物種において経鼻又は非経口免疫の結果高められた粘膜及び全身性免疫応答を誘導することを証明した。本発明は、インフルエンザ感染症の保護のために設計されたワクチンにより説明されるプロテオソーム−タンパク質に基づくワクチンの改良された製造方法、及び改良された組成物を本明細書中で説明する。注射可能なワクチンのそれと等量のＨＡ、ここではＨＡ−インフルエンザ抗原の用量で、説明されるプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、プロテオソームが十分に低い血清反応を誘導することなしに、匹敵するか又は高められた血清ウイルス特異的免疫応答を誘導する。プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンは高いレベルの特異的な粘膜、鼻、及び肺ＩｇＡをも産生するが、これに反してインフルエンザ抗原単独の注射又は経鼻投与はわずかな又はとても低いレベルの呼吸粘膜ＩｇＡしか誘導しなかった。加えて、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を主に２型応答からより平衡のとれた１型／２型応答又は主に１型応答に変換したが、一方で粘膜的又は注射により与えられるインフルエンザ抗原単体は主に２型応答を誘発する。１型応答は、インフルエンザ感染症の消散に重要な細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を促進する。従来、１型応答には、生病原性又は弱毒化ＣＡＶ経鼻インフルエンザ・ワクチンを必要とした。先に報告した単独で又はバイオベクター若しくはビロソーム（ｒＬＴの有無にかかわらず）のいずれかで投与されるＩＳＩＶは、好ましくは２型免疫応答を誘導する。
【００２１】
加えて、プロテオソーム経鼻ｆｌｕワクチンは、マウス及びヒトにおいて非常に良好に許容されることを示した。プロテオソーム・ワクチンにより実施したＧＬＰマウス実験において、嗅球又は他の中枢神経系（ＣＮＳ）への影響は見られず、前記エンテロトキシンに基づきアジュバントしたｆｌｕワクチンよりもプロテオソーム−ｆｌｕワクチンの方が明らかに本質的に安全であることを示した。
【００２２】
最後に、経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、ヒトにおいて免疫原性であり、そしてＣＡＶを与えられたこの年齢層の被験者において観察されなかった頻度及びレベルで健常成人における血清ＨＡＩを有意に高める誘導をする。注射可能なＩＳＩＶワクチンにより与えられるのと同じ用量で、プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンはヒトの鼻腔洗浄液中に有意なレベルの分泌型ＩｇＡを誘導する。したがって、経鼻プロテオソーム−インフルエンザ・ワクチンは、生ＣＡＶワクチン及び他の経鼻的にデリバリーされる又はアジュバントされる不活化インフルエンザ・ワクチンより優れた免疫原性及び安全特性を有する不活化経鼻インフルエンザ・ワクチンとしての有用性をもつ。
【００２３】
不活化インフルエンザ抗原を有するプロテオソーム製剤の前記利点の証明は、他の抗原タンパク質を含むプロテオソーム組成物に典型的であり、そして上記組成物はウイルス又は非ウイルス抗原を用いた他の呼吸器系疾患又は非呼吸器系疾患に対する保護にも同様に有効であろう。
【００２４】
本発明のワクチン及び組成物は２の主要な成分を含む。第１の成分はプロテオソームの製剤である。第２の成分はタンパク質抗原、好ましくはウイルス抗原である。故に、天然のタンパク質である細菌由来抗原は、ウイルス抗原と同様に好ましい処方中に使用されうる。前記組成物は部分的に又は完全に精製されたインフルエンザ・ウイルス抗原の製剤の使用により本明細書中に説明される。前記抗原は、定量化しうる量のインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）を含むために界面活性剤抽出、そしてショ糖密度勾配遠心分離を用いて精製されうる。細胞培養、例えばバキュロウイルス又は哺乳動物細胞株中に発現され、そしてそこから精製される組換えインフルエンザ・タンパク質、例えば血球凝集素タンパク質を使用することもできる。前記インフルエンザ成分は一般的に（天然起源から精製された抗原に関しては）インフルエンザ分解産物又は分解ｆｌｕ、あるいは組換えＨＡ（ｒＨＡ）と称される。
【００２５】
「プロテオソームの製造」は、例えば米国特許第５，７２６，２９２号（本明細書中に援用）又は同第４，７０７，５４３号中で所望される疎水性粒子又は小胞の獲得をもたらす精製工程を受ける外膜タンパク質の抽出を意味する。プロテオソーム製造のための代替の、そして改良された方法は以下の実施例に記載され、そしてフロー図により説明される。小胞の形状の外壁タンパク質成分をもたらすあらゆる製造方法が「プロテオソームの製造」の定義の中に含まれる。
【００２６】
前記２の成分同士の大部分の非共有結合を生じるその成分間の相互作用を最適化するために上記２の成分を記載の方法により特定の初期割合で処方する。前記方法は、選ばれた界面活性剤溶液中での前記成分の混合、そして次に本発明のワクチンのために最適化した流量及び膜のパラメーターを用いたダイアフィルトレーション／限外ろ過法による上記界面活性剤の除去を一般的に含む。
【００２７】
本発明の１の特徴は、製剤中に含まれるプロテオソーム対抗原の比が好ましくは１超：１、より好ましくは３超：１、より好ましくは４超：１であることである。前記の比は８以上：１でもありうる。前記２の成分の界面活性剤に基づく溶液は、同じ界面活性剤か又は異なる界面活性剤を含み、そして１以上の界面活性剤が限外ろ過／ダイアフィルトレーションを受ける前記混合物中に存在しうる。好適な界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ，Ｅｍｐｉｇｅｎ、及びＭｅｇａ−１０を含む。他の界面活性剤を使用することもできる。前記界面活性剤は、組成物の製造に使用される成分を溶解させるために働く。界面活性剤の混合物の使用は特に有利である。当然、この混合物は最終的な処方の前にダイアフィルトレーション／限外ろ過により除去される。
【００２８】
後にワクチンに処方される本発明の組成物の製造方法の他の特徴は、得られる組成物が０．８μフィルター、０．４５μフィルター、又は０．２μフィルターを通してろ過されることである。これはろ過により行われる滅菌を可能にし、防腐剤、例えばチメロサール添加の必要を未然に防ぐ。前述の汚染物質の存在によるあらゆる合併症を排除するために望ましいので、これは大きな利点である。
【００２９】
本発明の方法により製造された組成物は、所望の場合は前記のとおりのろ過、希釈剤及び担体、バッファー等の添加により最終的にワクチンに処方される。
【００３０】
以下に説明されるとおり、ＨＡを抗原とするワクチン、又は実際にはいずれかのタンパク質抗原を含むワクチンは多価ワクチンとして作製されうる。これは２の方法により達成されうる。ダイアフィルトレーション／限外ろ過前の初期混合物は、場合により異なる界面活性剤の存在下又は同じ界面活性剤の存在下、別々の成分として最初に提供される所望の抗原の混合物を含む；次に、抗原の混合物は界面活性剤−無汚染プロテオソーム製剤と混合し、そして前記のとおり処理する。あるいは、１価（又は多価）抗原からダイアフィルトレーションにより得られた組成物を、１以上のさらなる抗原から同様に調製された製剤と混合しうる。故に以下に説明されるものは、３の異なるＨＡ抗原から作られた３価ワクチンである。
【００３１】
ワクチンに処方される組成物の製造方法の特徴に加え、プロテオソーム組成物自体が改良された方法により製造されうる。故に、従来技術により示されたさまざまなステップを避け、付加的なステップ又は代替ステップを利用する。１の重要な態様において、前記製造方法は、以下の実施例に記載のとおりエタノールの存在下で１回以上沈殿し、続いて０．１〜１％界面活性剤溶液により、典型的にはＥｍｐｉｇｅｎを用いてプロテオソームを再抽出し、それによりより均一な産物を得ることを含む。加えて、エタノール沈殿ステップを利用しないにしても、従来技術の方法として記載の硫安沈殿を排除する。
【００３２】
故に、本発明の方法により製造される組成物は、血清及び粘膜両方の抗体、並びに免疫応答を誘導するために粘膜（例えば鼻、口、口腔咽頭、又は直腸の粘膜）、非経口（例えば筋中又は皮下）、あるいは経皮経路によりデリバリーされるワクチンに処方されうる。
【００３３】
以下に示すとおり、マウスに対して液体又はスプレーによりデリバリーされる経鼻ワクチンは、血清ＩｇＧ抗体及び血球凝集阻害（ＨＡＩ）抗体を含む特異的な抗インフルエンザ免疫応答を誘導する。これらの誘導はヒトにおいてインフルエンザの保護と相互に関連することが知られているため、ＨＡＩ応答は大きな意義を有する。前記ワクチンは鼻腔又は肺から集められる粘膜分泌によるＩｇＡを含めた粘膜抗体を生じ、そしてＩｇＧ１／ＩｇＧ２比及びＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−５を伴わないＴｈ１サイトカイン、例えばインターフェロン・ガンマの誘導により計測される、主に２型応答から均衡した又は主に１型応答への変化をも生じる。前記の応答は、他の細胞性応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）の発達の前兆となる。本発明の経鼻ワクチンのこれらの３タイプの応答を誘発する能力は、（ＨＡＩ抗体を含む）活性血清抗体、インフルエンザ・ウイルスを中和しうる鼻咽頭及び肺ＩｇＡ抗体、並びに残存又は細胞内ウイルスの排除を助けるＴｈ１応答が全てインフルエンザ・ウイルス感染症の保護の重要なメディエイターであるため、前記ワクチンがより完全な免疫を提供しうることを示す。これは、前記ワクチンがマウスの病原性インフルエンザ・ウイルスを接種に関連した体重減少及び死亡からマウスを守ることを説明することを示す結果による。
【００３４】
粘膜経路、例えば経鼻投与による投与に加え、本発明のワクチンを、非経口的に、例えば注射（例えば筋中又は皮下）により投与することもできる。筋中注射がプロテオソームなしの分解ｆｌｕワクチン投与により提供されるよりも高いレベルの血清抗体を提供することを以下に証明する。
【００３５】
以下に示されるとおり、臨床適用（１又は２回免疫）に典型的であるより多数の免疫（３回）を用いても、そして２０倍までの用量、つまり最も高い要求されるヒト用量を用いてもマウスに対する経鼻経路による本発明のワクチンの投与は十分に許容された。重要なことに、前記の他のエンテロトキシジェニック粘膜アジュバントとは異なり、ＣＮＳの嗅球部における炎症の徴候がなかった。
【００３６】
以下にさらに示すとおり、ヒトにおいて、経鼻スプレーにより与えられた分解インフルエンザ抗原により製造された本発明のワクチンは、いかなる深刻な副作用もなく十分に許容された。最適な用量で前記ワクチンは、（試験したインフルエンザ株に全く血清反応陰性であるボランティアの中でさえ）５０％以上のボランティアで、その大部分がインフルエンザ・ウイルスに起因する疾患の保護に関連するのと等価か又はそれを上回る力価を有する血清ＨＡＩ応答を誘導した。血清ＨＡＩ力価は、ボランティアの１３％未満でＨＡＩ応答を誘導した。経鼻的に与えられた分解抗原単体により誘導されたものより有意に高かった。前記ワクチンは、鼻腔洗浄液分泌型ＩｇＡを、経鼻的に又は注射により与えられた分解抗原単体による免疫の結果として産生されたものより有意に多くのボランティアで、そして有意に高いレベルでも誘導した。ヒトにおいて粘膜及び全身性免疫応答を誘導するプロテオソーム−ｆｌｕワクチンの用量（７．５〜３０μｇ）は、最新の注射可能なワクチンのそれ（１５μｇ）に近く、そしてそれは予想できなかった。ヒトにおいて経鼻免疫の結果、最適な血清及び粘膜の免疫応答を得るためにプロテオソーム赤痢菌ワクチンを用いた人体研究において、本発明の方法によるプロテオソーム−ｆｌｕワクチンのために用いたインフルエンザ血球凝集素抗原の平均用量より（５０〜１００倍）多い１，０００μｇ〜１，５００μｇの赤痢菌抗原の用量でプロテオソーム−赤痢菌ワクチンを与えることが必要であった。
【００３７】
前述のとおり、本発明は１価及び（２又は３価を含む）多価ワクチンを含む。前記多価製剤を、別々の１価プロテオソーム−ｆｌｕワクチンを組合せるか又は１価のインフルエンザ抗原を組合せて多価抗原混合物を形成し、次にプロテオソームと複合体を形成させて多成分プロテオソーム−ｆｌｕワクチンとして処方される組成物を製造するかにより得ることができる。
【００３８】
非経口的、経鼻的、経口的又は坐剤用途のために、前記ワクチンは、所望のデリバリー形態において製品の安定なデリバリーを提供するために潜在的に大量の、オイル、乳液、ナノ乳液、脂肪、ワックス、緩衝剤又は糖を含む賦形剤又はアジュバントを本技術分野の慣例の希釈剤又は媒質として加えた、活性成分を含みうる。
【００３９】
本技術分野で周知のとおり、本発明のワクチンを投与するためにさまざまなプロトコールが適用されうる。前記ワクチンは、本発明のワクチンのいくつかの投与方法を含む別々のプロトコールにより使用されうるか又は本発明のワクチンは他の製剤と一緒に併用プロトコールにより使用されうる。抗原の選択は、感染性物質の性質により決定される；用量レベル及び服用の時期を含む投与に関する特定のプロトコールの設計は、当業者に周知の決まりきったやり方を用いた当該手順の最適化により決定される。インフルエンザ・ワクチン接種について説明する一方で、例示されたがしかし他の抗原を含むものに類似のワクチンは、粘膜経路により、すなわち吸入、並びに摂取又は性感染により取得したウイルス性又は細菌性疾患、あるいは特定の毒素又は生物学的な脅威物質又はアレルギーからのヒト又は（獣医の使用による）動物の保護に成功する。本発明は、細菌性疾患、アレルギー又は癌に対するワクチンのための細胞表面又は細胞内タンパク質抗原を用いた粘膜的又は非経口的経路によりデリバリーされる予防的又は治療的ワクチンを含む。
【００４０】
本発明の方法から得られる組成物は、本技術分野で知られる技術と明らかに異なる。例えば弱毒化生低温馴化ワクチン（ＣＡＶ）と異なり、本明細書に記載のワクチンは、精製されるか又は組換え成分である死んだ抗原を含む。プロテオソームが細菌外膜タンパク質を本来構成し、そしてごくわずかな又は少量の天然の細菌脂質を含むのに対して、ＭＦ５９脂質乳液、リポソーム又はビロソームが大量の脂質から成る一方でＭＰＬＡ及びバイオベクター技術は少量（ＭＰＬＡ）又は大量（バイオベクター）のサッカライドが存在する脂質サッカライドであるため、前記組成物はＭＦ５９乳液、リポソーム、ビロソーム、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）又はバイオベクター技術と異なる。これらのアジュバントは、大量の（細菌の又は他の）タンパク質を含まない。
【００４１】
本発明のワクチンと前記Dalseg, R., et al., Vaccines (1998) 96 : 177-182に記載のものとの性質及び特性の比較は、本発明の利点を証明する。前記のＤａｌｓｅｇの組成物は弱毒化ウイルスに関する前述の欠点に悩まされる；Ｄａｌｓｅｇワクチン中の抗原成分は、本発明のワクチンに使用した精製タンパク質に対抗する、ホルマリン不活化全インフルエンザ・ウイルスである。不特定の方法によりナイセリア・メニンギチジスからの抽出された外膜調製物として得られた小胞をホルマリン不活化インフルエンザ・ウイルスと混合し、そして超音波処理するか又は単に混合した。前記混合物に対してダイアフィルトレーション又は限外ろ過処理を適用しないため、界面活性剤が、その中に残存する小胞を含む組成物中に存在する。故にＤａｌｓｅｇにより調製された組成物は本発明のワクチンのそれより劣った結果を提供する；効果を観察するためにＤａｌｓｅｇ組成物の４回投与を必要とした。
【００４２】
前記のＬｏｗｅｌｌによる総論において解説されたとおりプロテオソームを使った先に報告した組成物は１以下：１のプロテオソーム対抗原の比を利用した；１：２０位低い比を用いた。そこに記載の最適の効果を示す従来技術のワクチンは、最適の効果が１，０００μｇ又は１５，０００μｇまでの抗原用量を必要とすることを要求した一方で、本発明のワクチンは７．５〜３０μｇの範囲の抗原用量を用いてヒトにおいて有効である。
【００４３】
調製方法自体については、ダイアフィルトレーション／限外ろ過手順により１００，０００の分画分子量の使用であるために高められた効率をもたらすことが示される；同様に、より効率的なものは、プロテオソームの存在下、いくつかの抗原を同時にワンステップ・ダイアフィルトレーション／限外ろ過手順に供する可能性である。
【００４４】
以下の実施例は本発明を説明することを意図し、本発明を制限するものではない。
【００４５】
実施例１
プロテオソームの調製
外膜タンパク質プロテオソームの調製を、フェノールで死滅させた細菌ペーストの１Ｍ塩化カルシウム含有６％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（ＥＢＢ）（Albright and Wilson, Whithaven, UK）溶液を用いた抽出によるＢ群２型ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）からの精製を実施し、引き続きエタノールにより沈殿させ、１％ ＥＢＢ−Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ生理食塩水中に溶解し、そして次に硫安により沈殿させた。その沈殿物を１％ ＥＢＢバッファー中に再溶解し、透析し、−７０℃、０．１％ ＥＢＢ中で保存した。前記方法のフロー図（フロー図１）を以下のページに示す。プロテオソームは、工程を短縮するために硫安沈殿のステップの省略によっても得られうる（フロー図１Ａ）。それでも成功する代替方法をフロー図１Ｂに示す。
【００４６】
実施例２
定量化された量のインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）を含むインフルエンザ抗 原（インフルエンザＨＡ又はＦｌｕ−ＨＡ）の調製
分解抗原：
調製をフロー図２に概説したとおり実施した。簡単に言えば、調製はウイルス接種した卵から尿膜腔液を採取し、続いてウイルスを清澄し、不活性化し、ダイアフィルトレーション／限外ろ過により濃縮し、そのウイルスをショ糖密度勾配遠心分離によりバンドにし、ペレットを形成させ、再懸濁したペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００若しくはＮＰ−４０又は他の好適な界面活性剤により抽出し、そして遠心分離して上清を回収することを含む。必要であればこの工程をくり返し、前記上清をフロー図２に記載のとおり分析し、蓄積し、そして２〜８℃で保存した。
【００４７】
組換えバキュロウイルスが発現したインフルエンザＨＡ：
簡単に言えば、インフルエンザＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１）を発現させ、そして（Gail Smith, et al.を参照のこと）に記載のとおり慣甲の技術により精製した。得られたタンパク質を、ＰＡＧＥ還元ゲルにより測定し＞９５％ＨＡであった。ＨＡを、濃度計を用いて確定的な複合体の状態で定量化し、そしてその複合体の組換えＨＡバンドの強度を既知の濃度の組換えタンパク質のバンドの強度と比較した。
【００４８】
実施例３
プロテオソーム・インフルエンザＨＡワクチンの製造
保存のインフルエンザ分解産物抗原の一部をプロテオソームと複合体形成させ、そしてフロー図３に記載のダイアフィルトレーション／限外ろ過法又は透析法を用いてプロテオソームと処方した。いずれの方法についても、前記インフルエンザ分解産物を所望の界面活性剤、例えばＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（ＥＢＢ）を１％で又は０．１％〜２％のＥＢＢ、あるいは使用された界面活性剤のタイプに依存する他の好適な界面活性剤を含む生理食塩緩衝溶液中に溶解し、そして次にそれを生理食塩緩衝化１％ Ｅｍｐｉｇｅｎ溶液（又は前記のとおり適当な濃度で他の適当な界面活性剤）中のプロテオソームと１：４、１：１、２：１、４：１、及び８：１を含む４：１〜８：１の範囲をもつさまざまなプロテオソーム：ＨＡ（wt／wt）の割合で混合した。Ｅｍｐｉｇｅｎを除去するために、次に前記混合物をフロー図３に記載のとおり限外ろ過／ダイアフィルトレーション技術に供するか、又は１０，０００の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する透析膜若しくは１，０００〜３０，０００のＭＷＣＯ範囲を有する機能的に類似の膜を緩衝化生理食塩水に対して４℃で１〜２週間、毎日少なくとも５００分の１の緩衝液を交換して徹底的に透析した。
【００４９】
さまざまなステップで、有効性の計測のために一元放射免疫拡散法を用いた。さまざまな割合でプロテオソームを伴う処方の分解ｆｌｕ抗原の含量を正確に測定するためにハロ免疫拡散（ｈａｌｏ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）技術を用いた。この方法は、確定的なバイアルに入れた物質に関する血球凝集素含量に基づく分解ｆｌｕ産物についての伝統的な有効性アッセイである。試薬を国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ）、Hertfordshire, United Kingdom から得た。参考文献：Hudson, L. and Hay, F.C., Practical Immunology, ed. Blackwell Scientific Publication : Third Edition, ; pages 230-233。
【００５０】
多価ワクチンを、個々の１価プロテオソームワクチンを作り、そして次に最終的な処方の前に所望の割合でそれらを組合わせ、そして充填することにより製造しうる。多価製剤を、個々の抗体を所望の割合で合わせ、そしてフロー図３に概説のとおりプロテオソームと混合物を形成させることにより処方することもできる。ワクチンを０．８μｍのポア・サイズの薄膜フィルターに通し、そして免疫前及びその間４℃で保存した。
【００５１】
【化１】

【００５２】
【化２】

【００５３】
【化３】

【００５４】
【化４】

【００５５】
【化５】

【００５６】
【化６】

【００５７】
実施例４
本実施例は使用したマウス免疫プロトコールを説明する
最初の免疫の前日に無作為抽出したマウスを前採血した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをそれぞれ分解インフルエンザ抗原としてＡ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、あるいはバキュロウイルス組換え体としてＡ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１を０．３〜１０μｇ ＨＡで含む、単独又は１：４、１：１、２：１、４：１、及び８：１（wt／wt）の複合体開始値でのプロテオソーム：ＨＡ比でプロテオソームと処方される（プロテオソーム−ｆｌｕワクチン又はプロテオソームｒＨＡ）、２５又は１００μｌの量の抗原により１及び２１日目に鼻腔内又は筋中に免疫した。いくつかの実施例において、対照マウスをリン酸緩衝生理食塩水又は０．０４ＬＤ₅₀のマウス馴化生インフルエンザＡ／Ｔａｉｗａｎ／１２／８６のいずれかにより１日目に単回の鼻腔内免疫で与えた。動物を２０日目及び３５日目に眼窩血脈洞（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ ｖｅｉｎ）からか又は心臓穿刺により放血させた。鼻及び肺の洗浄サンプルを３５日目に採取した。各マウスの肺を外科的に露出させ、そしてカニューレを気管に挿入した。０．１％ウシ血清アルブミン及びプロテアーゼ阻害剤（０．２mM ＡＥＢＳＦ、１μｇ／mlアプロチニン、３．２５μＭベスタチン、及び１０μＭロイペプチン）を加えたリン酸緩衝生理食塩水を含んだシリンジを用いて、１の鼻洗浄サンプル（約１ml）及び２の肺洗浄サンプル（２×１ml）を回収した。前記肺洗浄液を合わせ、そして個々の動物からの洗浄液をボルテックスにかけ、そして細胞の破片を除くために遠心分離し、そして上清をＥＬＩＳＡによる分析まで−７０℃で保存した。
【００５８】
実施例５
本実施例は血清血球凝集素阻害アッセイ（ＨＡＩ）を説明する
ＨＡＩ活性の測定の前に、成分を不活化するためにマウス又はヒトの血清を５６℃で加温する。非特異的な凝集の排除をレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）によりマウス血清を処理することで達成した。０．１mlの血清に０．４mlのＲＤＥ（１００unit／ml）を加え３７℃で１２〜１８時間処理した。前記ＲＤＥの不活化のために３００mlのクエン酸ナトリウム（２．５％）を加え５６℃で３０分間処理した。前記サンプルの容量をＰＢＳにより１mlにした（１：１０の最終的なサンプル希釈倍率を得た）。２倍の連続希釈の各サンプルを標準的なＨＡＩアッセイによりＡ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６ウイルスによる０．５％ニワトリ赤血球細胞の凝集の阻害に対するそれらの活性について試験した。
【００５９】
実施例６
本実施例は、血清中、肺及び鼻腔洗浄液中の特異的な抗ｆｌｕ抗体を計測するための血清ＥＬＩＳＡアッセイを説明する
血清を各免疫の後に回収し；肺及び鼻腔洗浄液を最終免疫後に回収した。鼻腔洗浄液及び肺洗浄液の開始希釈倍率を１／４とし、そして血清の開始希釈倍率を１／１００とした。完全体のウイルスを検出抗原として用いてＥＬＩＳＡを実施した。簡単に言うと、９６ウェル平底マイクロタイター・プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を抗原によりコートし、そして一晩インキュベートした。プレート洗浄装置を用いてその抗原を吸引した後、プレートをＴｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）により１度洗浄し、そして２％粉ミルクを加えたＰＢＳ−Ｔを含むブロッキング溶液と一緒にインキュベートした。ブロッキング溶液を吸引し、そしてＰＢＳ−Ｔにより洗浄した後、ブロッキング溶液により連続的に２倍希釈された血清、肺又は鼻腔洗浄液のサンプルを加え、そしてそのプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄の後、アフィニティー精製したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＡを加え、そしてそのプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。吸引し、そしてＰＢＳ−Ｔによる２度の洗浄の後、現像溶液を加え、そしてマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いた吸光度の値の測定に先立ち室温で１５分間インキュベートした。前記ＥＬＩＳＡプレート・リーダーにより吸光度を特定の時間で測定した。図中の抗体力価を、アフィニティー精製マウスＩｇＧ及びＩｇＡ標準（Ｓｉｇｍａ）を用いたＥＬＩＳＡ捕捉アッセイを用いて作製した標準曲線から確定した特異的ＩｇＧ又はＩｇＡのng／mlとして示す。
【００６０】
実施例７
本実施例は、血清及び肺洗浄液中のインフルエンザ・ウイルス中和抗体を計測するためのインビトロ中和アッセイを説明する
ウイルスの感染性の中和を、ＭＤＣＫ細胞における細胞溶解及び細胞変性効果（ＣＰＥ）の直接的な観察により測定した。このアッセイを９６ウェル・プレートにより実施した。各サンプルを８重で供した。試験サンプル（血清又は肺洗浄液）の連続希釈物を１００ ＴＣＩＤ₅₀の、ワクチン株と相同なインフルエンザ・ウイルスと一緒に室温で９０分間インキュベートし、そして２．４×１０⁵ ＭＤＣＫ細胞／ウェルを加えた。プレートをアッセイの残りの期間、３２℃／５％ ＣＯ₂ でインキュベートした。ウイルスの中和を、倒立顕微鏡を用いたＣＰＥの評価によりウイルス増殖期（５〜７日間のインキュベーション）の間、測定した。中和力価をＫａｅｒｂｅｒの公式（ＴＣＩＤ₅₀＝Δ−δ（Ｓ−０．５））により確定した、ここで「Δ」は１００％陽性な培養となる希釈倍率のlog₁₀であり、「δ」は希釈係数のlog₁₀であり、そして「Ｓ」は１００％感染した培養となる希釈倍率でそれらを含む希釈物当たりの陽性培養の合計である。
【００６１】
実施例８
プロテオソーム−ＨＡワクチンにより誘発された向上した血清ＨＡＩ及びウイルス特異的ＩｇＧ力価により計測された向上した免疫原性及び免疫性の証明
この実施例は、透析法によりＡ／Ｔａｉｗａｎ／９１インフルエンザ分解抗原（図１及び２）又は精製バキュロウイルス組換えＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１）（表１）に対して製造された単価ワクチンによる経鼻免疫の結果としてプロテオソーム−ｆｌｕワクチンにより誘導される血清及び粘膜抗体応答を示す。同様の結果を測定可能なダイアフィルトレーション法により製造したプロテオソーム−ｆｌｕワクチンを用いて得た（実施例１２以降を参照のこと）。
【００６２】
ここでＨＡＩにより分析される血清中の抗インフルエンザＩｇＧ抗体；血清中のＩｇＧ、並びに肺及び鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体をＥＬＩＳＡにより分析し；そして血清中のＩｇＧ、並びに肺洗浄液中のＩｇＡ及びＩｇＧをウイルス中和活性について試験した。前記応答を、生理食塩水で免疫した動物及びプロテオソームなしに単独でデリバリーされたインフルエンザ分解産物により免疫された動物からのサンプル、あるいはプロテオソーム及び無関係の抗原（ＨＢｓ Ａｇ）を含む対照ワクチンにより免疫された動物によるサンプルのコレクションと比較した。結果を図１〜２、及び表１に示し、そしてまとめた。簡単に言うと：プロテオソーム対ＨＡの最適な割合での経鼻プロテオソーム−ｆｌｕ及びプロテオソームｒＨＡワクチン、すなわち最適の免疫応答が、４：１〜８：１のプロテオソーム：ＨＡ配合割合の時に得られた。
【００６３】
１．経鼻的に単独で与えられた分解Ｆｌｕよりも６〜３２倍高い血清ＨＡＩ応答、そして注射により単独で分解作製ＨＡワクチンが与えられることで誘発されたＨＡＩ力価と等価の力価が誘発され（図１Ａ及び表１）、
２．経鼻的に単独で与えられた分解Ｆｌｕよりも２５０倍高い血清ＩｇＧ応答、そして経鼻生ワクチンに匹敵する、あるいは注射（筋中）により与えられた分解ｆｌｕと等価か又は５倍高い誘発応答が誘発され（図１Ｂ及び表１）、
３．注射可能な分解インフルエンザ・ワクチンと等価の、そして経鼻経路による単独の分解ｆｌｕ抗原よりも＞１００倍高い血清中和力価が誘導され（図１Ｃ）、
４．注射（筋中）によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Ｆｌｕより＞１，０００倍高いＩｇＡ応答が鼻において誘発され（図２Ａ）、
５．注射（筋中）によるか又は経鼻的に単独で与えられた分解Ｆｌｕより２０〜１，０００倍高いＩｇＡ応答が肺において誘発され（図２Ｂ及び表１）、
６．生ウイルスと同じか又は優れた応答が誘発され（図１〜２）、
７．肺洗浄液分泌物の状態で中和抗体が誘発され、経鼻免疫により、４：１プロテオソーム−ｆｌｕワクチンだけが＜１／２希釈で８／８反復、ウイルスの細胞変性効果を完全に阻害しうる機能的な抗体を肺洗浄液中に誘導した。経鼻又は筋中免疫のいずれの結果でも、単独でＦｌｕ抗原により免疫されたマウスからの肺洗浄液についてインビトロでの中和は観察されず、そして
８．非経口免疫の結果単独の分解抗原に比べ向上した血清ＩｇＧ及び等価の血清ＨＡＩ力価が誘発された（表２）。
【００６４】
【表１】

【００６５】
【表２】

【００６６】
実施例９
本実施例はマウス免疫生ウイルス接種プロトコール及び結果を説明する
生ウイルス接種に対するワクチン誘導される保護を証明するために、（前記実施例４に記載のとおり経鼻プロテオソーム−ｆｌｕ（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１２／８６）ワクチンにより処理した）ワクチン免疫した動物の群及び対照動物に３６日目に特定の４ＬＤ₅₀の生マウス馴化インフルエンザを接種した。マウスの保護を、接種後１４日間にわたる動物の体重変化の観察により評価した。開始体重からの３０％以上の減少したマウス及び臨床的病的な状態の深刻な徴候を示したマウスを屠殺した。プロテオソーム−ｆｌｕワクチンにより誘発された保護を示すデータを図３に示し、そしてまとめた。
【００６７】
簡単に言えば、悪性の相同ウイルスの接種による有意な又は致命的な体重減少に対する完璧な保護を４：１〜８：１のＰｒ：ＨＡ比で製造された経鼻プロテオソーム−ｆｌｕワクチンについて示した一方で、プロテオソームなしのＨＡは実験の間に有意な体重減少を示した。さらに、誘導された保護は、注射により単独で与えられた分解ｆｌｕワクチンにより誘導されたのと同じであった。たとえその製剤が最適下の血清及び粘膜免疫応答を誘導するとしてもより低いＰｒ：ＨＡ比（例えば１：１）において処方されたワクチンについて得られうる保護は、最適下の開始配合比で製造された製剤の間で有効に変化することに対して上記動物保護モデルが効率的に変化できないために存在する。
【００６８】
実施例１０
本実施例は経鼻プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンによる２型から１型への免疫応答の変化を説明する。
【００６９】
マウス血清におけるＩｇＧ１／ＩｇＧ２比は、ワクチンにより誘導されたＴ細胞応答のタイプの代替マーカーである。Ｔｈ１（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２比＜１）は（血清抗体に加えて）強い細胞性免疫応答の誘導に関連し；一方Ｔｈ２（ＩｇＧ／ＩｇＧ２比＞１）は強い体液性免疫応答の誘導を予測させる。プロテオソーム−ｆｌｕワクチン又は１価の分解インフルエンザ・ワクチン若しくは組換えバキュロウイルス誘導ＨＡのいずれかを用いた単独のｆｌｕ抗原により経鼻又は筋中免疫に伴う血清中のマウスＩｇＧサブタイプであるＩｇＧ１及びＩｇＧ２のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ・キット（ＳＢＡ Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ／ＨＲＰ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃ．）を用いて測定した。
【００７０】
図４及び表３に示すとおり、そのワクチンがプロテオソームを含む場合、分解ｆｌｕ抗原に対する経鼻及び注射されたワクチンの両者に関してＩｇＧ１／ＩｇＧ２比を１４〜２０（Ｆｌｕ抗原単独について）から１〜２の範囲まで下げる変化をさせ；そしてバキュロＨＡ抗原に関して６〜６０から１．７まで下げる変化をさせた。Ｔｈ２からＴｈ１応答への免疫性のこの変化は、不活化精製インフルエンザ・ウイルスにより免疫された動物からの脾臓細胞の再刺激に伴い産生されたサイトカインの計測により組換えＨＡ抗原に関して確認された。簡単に言うと、Ｂａｌｂ／ｃマウスを２次免疫の１４日後安楽死させ、そして各群からの５のマウスから脾臓を採取し、そして細胞を１００μｍナイロン細胞ろ過器（Becton Dickinson NJ ）を用いて単細胞懸濁液の状態にそいだ。脾臓細胞を、８％ウシ胎児血漿（５６℃で１時間加熱し不活化；Gibco BRL）、２mMグルタミン（Gibco BRL）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール（Sigma Chemical Co., St-Louis, MO）及び５０μｇ／mlゲンタマイシン（Gibco BRL)含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco BRL, Life technologies, Burlington, ON）中、２．０×１０⁶ 細胞／ml（２００μｌ／ウェル）で、ＵＶ不活化Ｘ−１１３（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９４（Ｈ１Ｎ１）及びＸ−３１（Ｈ３Ｎ２）再集合体）；インフルエンザ・ウイルス（NIBSC, Hertfordshire, UK）を伴うか又はそれなしに９６ウェル細胞培養クラスター（Corning, NY ）中で培養した。細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、そして上清を採取し、そして−８０℃で冷凍した。マウスのサイトカイン・レベルをPharmingen (San Diego, CA ）から購入したサンドイッチＥＬＩＳＡｓ（Ｏｐｔ ＥＩＡセット）を用いて製造業者の指示に従って計測した。組換えサイトカインを標準物質として用いた。
【００７１】
【表３】

【００７２】
ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を群当たり５のマウスから集めた血清について計測した：^**ＩＮＦγ及びＩＬ−５を全不活化ウイルス（ＩＬ−５用に１．２５μｇ／mL、ＩＮＦγ用に０．６２５μｇ／mL）で、実施例１１に記載のとおり再刺激したマウス脾臓細胞の上清について測定し、そしてpg／ml培養上清で表した。結果は３の培養の平均である。
【００７３】
表３に示されるとおり、経鼻プロテオソームＨＡワクチンはＴｈ２サイトカインであるＩＬ−５を伴わずＴｈ１サイトカインであるインターフェロン・ガンマを誘導し；一方で経鼻又は筋中経路のいずれかにより投与された組換え抗原はＩＬ−５とインターフェロン・ガンマの両方を誘導した。これらのデータは、経鼻プロテオソームＨＡワクチンが免疫の他の武器、例えば細胞傷害性Ｔ細胞の惹起を助けるサイトカイン環境を作り上げていることを示唆する。ＣＴＬが感染細胞からのウイルスの排除によるウイルス感染からの回復、及び変異型インフルエンザ株に対する交差保護に関して重要であることから、これは有益である。
【００７４】
実施例１１
３価の製剤の免疫原生
３価のプロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンを、インフルエンザ・ウイルスのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６／９５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／０５／９７（Ｈ３Ｎ２）、及びＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８サブタイプからの界面活性剤分解抗原を用いて実施例３に概説した手順を用いて製造した。各菌株個別に、及び３価となるようにそれらを組合せて作製したプロテオソーム−ｆｌｕワクチンについて図５Ａ〜Ｆに示されるとおり、それらの無プロテオソーム複合体対照に比べ菌株特異的な血清ＩｇＧ（図５Ａ、Ｃ、及びＥ）並びに経鼻ＩｇＡ（図５Ｂ，Ｄ、及びＥ）応答を増強する。１価及び３価のプロテオソーム−ｆｌｕワクチンにより誘導されたイムノグロブリン力価は有意に異なることはなかった。したがって、多価のインフルエンザ抗原を含むワクチンは各成分に対して個々の１価のワクチンにより誘導されるのと等価の血清及び粘膜免疫応答を誘発する。
【００７５】
ワクチンを、所望の量のそれぞれ個別の抗原を３価の抗原プールに組合せ、そして続けて組合せた抗原プールをプロテオソームと複合体を形成させて多価のプロテオソーム−ｆｌｕワクチンを作り出すことにより製造することもできる。前述のワクチンに好適な粒子サイズの均一性及び一貫性の証明を以下の実施例１４に示す。前述のワクチンの有効性の証明をインフルエンザ・ワクチンについての標準的な有効性試験、すなわち実施例３に記載のＳＲＩＤ試験を用いて見出した。ＳＲＩＤ試験の使用により、ろ過していないサンプル、並びに０．８μｍ又は０．２μｍフィルターを用いてろ過したサンプルの両者において、８：１、４：１又は２：１のいずれかのプロテオソーム：ＨＡ比で作製された多価ワクチンに使用された３の菌株のそれぞれに対して有効なＨＡの十分な保持率を認めた。例えばそれぞれ３の異なるプロテオソーム：ＨＡ比（８：１、４：１、及び２：１）で０．８μｍフィルターの使用により、８０％〜８６％のＨＡ平均保持率を３の３価ワクチンにおいて３のインフルエンザ菌株、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＢから認めた。これらのデータは、多価ワクチンがこの方法を用いて作製されうることを示している。
【００７６】
実施例１２
ヒトにおける血清ＨＡＩ及び鼻洗浄液中ｓＩｇＡの誘導
フェーズＩ用量増加安全性及び免疫原性試験を健常の血清反応陰性の成人において実施した。被験者（群当たり８〜１３人）の群は、１４日おきに、ＧＭＰグレードのプロテオソーム−Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５ワクチン又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５抗原単体として７．５、１５又は３０μｇＨＡのいずれかの２回の経鼻服用を受けた。ＨＡＩ ＧＭＴを実施例５に記載のとおり測定した。ヒト鼻腔洗浄液標本中の着目の抗原に対して特異的な分泌型ＩｇＡを下記のとおり計測した。鼻腔洗浄液標本を激しく混合し、そして次に５０kDの分画分子量の膜を用いた遠心濃縮器により４〜５倍濃縮した。総分泌型抗体（圧倒的に二量体分泌型ＩｇＡ、つまりｓＩｇＡ）を、精製ヒトｓＩｇＡ標準物質を用いたヒト分泌型要素に対する抗体を含むアガロースによる一元放射免疫拡散法により計測した。抗原特異的ｓＩｇＡを動的酵素結合免疫測定法（ＫＥＬＩＳＡ）により検出した。マイクロタイター・プレートを規定の濃度の抗原によりコードした。前記プレートの洗浄後、各濃縮鼻腔洗浄液サンプルを（典型的な標本の＞９５％に関して前記アッセイのダイナミック・レンジ内にシグナルを生じるための予備実験により選ばれた）１の希釈倍率での３のウェル中に加えた。インキュベーションの後、そのプレートを洗浄し、そして結合したｓＩｇＡをビオチン化ヤギ抗ヒト分泌型要素と、そしてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合したアビジンと一緒に連続的にインキュベートすることで検出した。最後の洗浄に続いて、ＴＭＢ基質を加え、そして９秒ごとに５分間６５０nmで吸光度を計測した。過剰な検出試薬の存在下、抗原に結合したｓＩｇＡの濃度にちょうど比例する着色の速度（ mOD／分）を計算した。各標本についての結果を以下の式：
標準化ＫＥＬＩＳＡ速度＝（標本ＫＥＬＩＳＡ速度×１５０）÷
標本の総ｓＩｇＡ濃度
により１５０μｇ／mLの標準ｓＩｇＡ濃度に標準化する。
【００７７】
得られた標準化速度は、鼻腔洗浄液中標準濃度の総ｓＩｇＡ中に含まれる抗原特異的ｓＩｇＡの量に比例する線形（例えば力価のように動的でない）の読みを提供した。
【００７８】
前記プロテオソーム・ワクチンを全投与計画の完了を認め各抗原用量で十分に許容した。表４及び図６ＡはＧＭＴ血清ＨＡＩ力価の結果を示し、そして図６Ｂは４２日目、及び０〜４２日目それぞれの鼻腔洗浄液中分泌型ＩｇＡの計測を示す。簡単に言うと、この全く血清反応陰性の人々でさえ、被験者の約５０％はＧＭＴ血清ＨＡＩが上昇し、そして大部分が保護に関連する≧４０の免疫力価を示した（表４）。さらに図６Ａの血清ＨＡＩ免疫応答の時間的経過により示されるとおり、２次服用を投与する前の１４日目において３の用量レベルのそれぞれにより免疫された被験者から得た血清中に強い応答を認め、ワクチンの１回服用が大部分の個人で十分でありうることを示した。
【００７９】
【表４】

【００８０】
血清ＨＡＩに加え、プロテオソーム・インフルエンザ・ワクチンは、最も低い（７．５μｇ）用量のワクチンを受けていた人の７５％を含む全被験者の８５％超において粘膜ｓＩｇＡ（≧２．９倍）の有意な上昇を誘導した（図６Ｂ）。これらのデータは、ヒトにおいて保護的な免疫応答を誘導する前記発明の可能性を証明する。これらの応答は、経鼻免疫に伴い粘膜応答は誘導したが血清応答に乏しかったこの年齢層におけるＣＡＶインフルエンザ・ワクチンに関して得られたそれを上回る。
【００８１】
ヒトにおいて有意な免疫応答を与えるプロテオソーム−ｆｌｕワクチンの用量は、低く、そしてここでプロテオソーム赤痢菌ＬＰＳワクチンによる経鼻免疫に伴う有意な全身性及び粘膜応答のために６７〜１００倍高い用量の抗原を必要とする従来の結果からは予測できないであろう（要約又は刊行物に投稿された原稿を参照のこと）。
【００８２】
実施例１３
プロテオソームとインフルエンザＨＡ抗原の複合体形成を証明するプロテオソームＨＡワクチン複合体についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
複合体を形成していないプロテオソームは、界面活性剤の不存在下で水系に不溶であり；水溶性抗原との複合体形成がプロテオソームを溶解化する。サンプルの遠心分離により不溶画分を可溶画分から分離し、そして各成分の正体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する。可溶抗原を伴う上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在は、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｏｒ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の不存在下、抗原により複合体形成していない時、プロテオソーム・タンパク質は溶解性でないため抗原との複合体形成の証明となる。抗原−プロテオソーム複合体の凝集状態を決定するために、複合体サンプルを遠心分離により沈降させ存在しうる粒子を沈殿させたペレットとした。その上清を他の容器に移し、そしてそのペレットをＴＮＳバッファーにより洗浄する。次に前記上清とペレットの両方を基準として同じゲル上に泳動した非複合体形成抗原を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。そのゲルをクーマシー・ブルー染色法により染色し、写真撮影し、そして感度を増すために銀染色法により染色した。
【００８３】
非複合体形成を基準ゲージとして泳動する。プロテオソームの基準ゲージ及び分子量マーカーは：ＯＭＰ００１基準ゲージ：ＧＭＰプロテオソームの混合物ロット：０１７５、０５６６、０６２１、０６２１である。
【００８４】
分子量マーカー：Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄ
１：４〜８：１の範囲をとるＰｒ：ＨＡ比を含む複合体を有するプロテオソーム−ｆｌｕワクチンを作製した。ワクチンを、免疫原性及び前記のとおり遠心分離されたサンプル上清中のプロテオソーム・タンパク質の存在により示される複合体形成の生化学的証明に関して試験した。プロテオソーム・タンパク質の特徴的なバンドがＨＡインフルエンザ抗原を伴って上清中にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより認められたため、そのデータはプロテオソームとＨＡ ｆｌｕ抗原の複合体形成の証拠を示す。前記上清中のプロテオソームの存在は、複合体を形成しないとプロテオソームが水性基質中で不溶であるため複合体形成の証明となる。驚いたことに、高いプロテオソーム対ＨＡ比、例えば４：１（特に）又は８：１を含む好ましい態様を使用した時、上清中にそれに比例したさらなるプロテオソームを確認した一方で、低い比を使用した時、減少したプロテオソームを確認した。明らかに、高いＰｒ：ＨＡ比（例えば４：１）での製剤は高い複合体形成を可能にし、そして低い比ではインフルエンザ・抗原との効果的な複合体形成を可能にする用量限度量のプロテオソームを含まなかった。
【００８５】
実施例１４
プロテオソームのインフルエンザＨＡ抗原との複合体形成を証明するプロテオソームＨＡワクチン複合体の粒子サイズ分析
さまざまな割合のＰｒ−ＨＡ複合体を説明する数加重log 分析粒子サイズをBrookhaven Instruments model 90 plus粒子サイズ分析装置により計測した。図８に示されるとおり、１超：１のＰｒ：ＨＡ比をもつ１価及び３価のプロテオソーム−ｆｌｕワクチンは、プロテオソームを伴わない分解ｆｌｕ ＨＡ対照ワクチンのそれよりも明らかに大きな粒子サイズ分布を含んだ。各ワクチン製剤が入るサイズの範囲は狭く、そしてそのワクチン製剤のパラメーターに特徴的であったことに留意のこと。有効平均サイズは、プロテオソーム：ＨＡに依存した、これらの平均値を囲む典型的なベル形曲線の粒子サイズ分布をもつ約１５０〜１，０００nmの範囲をとり、そして固有の抗原、並びに剤パラメーター、例えば使用した界面活性剤のタイプ又はろ過フィルターのサイズに特徴的である。
【００８６】
実施例１５
電子顕微鏡による複合体形成の証明
標識プロテオソーム−ｆｌｕ（１価Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）複合体のＥＭ像を得た。抗ＨＡモノクローナル抗体及びプロテインＡ−金により標識した場合の４：１ Ｐｒ：ＨＡワクチン複合体の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像は、大部分のＨＡが複合体ワクチンの粒子又は粒子凝集体の小胞構造に結合されている。いくつかの標識跡は粒子に結合されていない。
【００８７】
抗ＨＡモノクローナル抗体と一緒にインキュベートし、続いてプロテインＡ−金と一緒にインキュベートした４：１ Ｐｒ−ＨＡ複合体の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像は、小胞の三次元構造の証拠を示す。金粒子の見かけの明るさは、小胞の裏の方が不鮮明に、そして小胞の表よりも弱く見え、小胞−金粒子内のそれらの位置に依存する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ〜Ｃは、本発明のワクチンにより誘導された血清免疫応答を示す。
【図２】 これらのワクチンにより誘導された粘膜免疫応答を示す。
【図３】 本発明のワクチンの組換え型により免疫したマウスの保護を示すグラフである。
【図４】 マウスにおける２型応答から均衡した１型／２型応答への分解抗原ワクチンにより誘導された免疫応答の変化を示すグラフである。
【図５】 Ａ〜Ｆは３価の分解インフルエンザ・ワクチンに対する血清及び鼻粘膜における応答をグラフで示したものである。
【図６】 Ａ及びＢは、本発明のワクチンにより免疫したヒトからの血清ＨＡＩ、及び鼻腔洗浄液中のＩｇＡシグナルそれぞれを示すグラフである。
【図７】 プロテオソーム−ＨＡワクチン複合体の粒子サイズ分析を示す。

Claims (18)

1. ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であって、以下の：
   界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも１のインフルエンザ血球凝集素抗原とを少なくとも４：１の重量対重量比で混合した混合物を用意し；
   界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得；そして
   上記組成物をワクチンに配合する、
   ことを含む上記方法。
2. ２以上のインフルエンザ血球凝集素抗原を含む、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法により製造されたワクチン。
4. 請求項１に記載の方法により製造された、プロテオソームを配合されて少なくとも１のインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）を含むインフルエンザ・ワクチン。
5. 前記ＨＡとプロテオソームが、光散乱により計測されるとき１５０〜１，０００nmの範囲のメジアン径をもつ粒子の形態である、請求項４に記載のワクチン。
6. ウイルス感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であって以下の：
   界面活性剤の存在下、プロテオソーム製剤と少なくとも２のインフルエンザ血球凝集素抗原とを少なくとも４：１の重量対重量比で混合した混合物を用意し；
   界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−多価抗原組成物を得；そして
   上記組成物をワクチンに配合する、
   ことを含む上記方法。
7. ウイルス感染症に対して有効なワクチンの製造方法であり、請求項１に記載のとおり製造した、少なくとも１のインフルエンザ血球凝集素抗原をそれぞれ含む少なくとも２の組成物を混合し、そして上記組成物をワクチンに処方することを含む上記方法。
8. 感染症に対して有効な多価ワクチンの製造方法であり、以下の：
   請求項１に記載のとおり製造した、少なくとも１のインフルエンザ血球凝集素抗原をそれぞれ含む組成物を混合し、そして
   上記混合物をワクチンに処方し、
   ここで上記混合物においてプロテオソーム対インフルエンザ血球凝集素抗原の重量対重量比が少なくとも４：１である、
   ことを含む上記方法。
9. 対象におけるインフルエンザに対する免疫応答の誘発のための医薬組成物であり、上記応答の誘発に有効な一定量の請求項４に記載のワクチンを含む上記医薬組成物。
10. 前記対象がヒトである、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 経鼻経路により投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
12. 非経口経路により投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 筋中注射により投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記界面活性剤が２以上の界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
15. ０．２又は０．８μｍフィルターによりろ過される、請求項１に記載のとおり製造した組成物。
16. ０．２又は０．８μｍフィルターによりろ過される、請求項６に記載のとおり製造した組成物。
17. ウイルス感染症に対する免疫応答の２型応答から１型応答に向けた転換に有効なワクチンの製造方法であって、以下の：
    界面活性剤の存在下、少なくとも１のインフルエンザ血球凝集素抗原とプロテオソーム製剤との混合物を用意し、ここで、当該プロテオソーム対インフルエンザ血球凝集素の重量対重量比が少なくとも４：１であり；
    界面活性剤を上記混合物からダイアフィルトレーション又は限外ろ過により除去してプロテオソーム−抗原組成物を得；そして
    上記組成物をワクチンに配合する、
    ことを含む上記方法。
18. 請求項１又は６のいずれか１項に記載の方法により製造した組成物を含む、動物における感染症の予防又は治療のための医薬組成物。

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