JP3970811B2

JP3970811B2 - リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法

Info

Publication number: JP3970811B2
Application number: JP2003190568A
Authority: JP
Inventors: 泰生隅田; 明男荒野; 正一楠本; ソベールマイケル
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: AU2003261988A8; CA2500190A1; KR20050057270A; EP1538156A1; US7320867B2; CA2500190C; JP2004157108A; WO2004022583A1; EP1538156A4; US20060030699A1; AU2003261988A1; KR100710808B1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモン共鳴のセンサチップ等のタンパク質分析用の支持体にオリゴ糖等の糖を固定することが可能なリンカー化合物、及び該リンカー化合物に糖を導入してなるリガンド、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内に存在する種々の糖は、生物の活動や生命を維持するためのメカニズムの中で重要な役割を果たしている。このような糖の機能を精密に解明するためには、糖の複雑な構造に基づいてそれらの機能を解析する必要がある。糖の機能解析には、構造が解明されているオリゴ糖を用いて、糖の構造を一部ずつ再現し、これによって糖全体の構造と機能との関係を明らかにする手法が用いられる。
【０００３】
上記糖の機能解析の手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記載する）が知られている。すなわち、糖の一部を模擬したオリゴ糖を含んでなるリガンドをセンサチップ表面上に導入し、このリガンドが導入されてなるセンサチップを用いて、オリゴ糖と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定する。これにより、オリゴ糖の構造に基づく生物活性の正しい評価を行うことができる。
【０００４】
ところが、オリゴ糖は、１分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生物活性を評価する場合には、オリゴ糖をセンサチップ上に集合化させることが必要となる。つまり、集合化したオリゴ糖を用いて、タンパク質との相互作用を解析することにより、オリゴ糖の生物活性の評価を行うことが可能になる。
【０００５】
そこで、本発明者らは、これまでに、センサチップ表面に固定可能な部位及びオリゴ糖を導入可能な部位を分子内に有するリンカー化合物を得、このリンカー化合物に１単位又は２単位のオリゴ糖を導入してなるリガンドを得ている。そして、このリガンドを用いることによって、センサチップ上に、オリゴ糖を集合化して導入することができることを見出している（例えば、非特許文献１等を参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００３−８３６９６９号公報（２００３年３月１９日公開）
【０００７】
【非特許文献１】
「日本化学会第７９回春季年会−講演予稿集II」、社団法人日本化学会、２００１年３月１５日、ｐ．１０４２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記非特許文献１に記載のリガンドでは、オリゴ糖の糖鎖をセンサチップ表面に２次元的に配列させることは可能であるが、その配列を再現性よく得ることが困難であるという技術的課題が残されている。
【０００９】
すなわち、上記のように、センサチップ表面に複数分子のオリゴ糖を集合化させ、オリゴ糖の生物活性を解析する場合には、オリゴ糖の糖鎖の集合化状態を同一にし、オリゴ糖とタンパク質との間の相互作用を再現性よく観測することが求められる。特に、オリゴ糖の生物活性を観測するためには、センサチップ表面に３単位〜４単位のオリゴ糖を集合化し、これらのセンサチップ上にて再現性よく２次元的に配列させることによって、オリゴ糖の生物活性を再現性よく評価することが重要になる。
【００１０】
ところが、上記非特許文献１に記載のリガンドでは、１つのリガンドが有するオリゴ糖は１単位又は２単位となっている。言い換えれば、上記のリガンドは、１つのリンカー化合物に対して、１つ又は２つのオリゴ糖が結合してなるものである。そのため、オリゴ糖の生物活性を観測するためには、上記リガンドをセンサチップ表面に配列させる際に、リガンド濃度を高めてリガンド同士を集合化させることによって、センサチップ表面上に３単位以上のオリゴ糖を集合化させる必要がある。
【００１１】
このような手法によってオリゴ糖を集合化させた場合、オリゴ糖の糖鎖間を所定の間隔にて制御してオリゴ糖の配列を再現性よく得ることは困難である。それゆえ、上記従来のリガンドでは、オリゴ糖の生物活性を再現性よく観測することができず、糖の構造の解明や、オリゴ糖の生物活性の評価を行う場合に困難を伴う可能性がある。
【００１２】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的は、センサチップ表面上にオリゴ糖を再現性よく２次元的に配列し得る新規なリンカー化合物、及び、該リンカー化合物に糖分子が導入されてなる新規なリガンド、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、３単位又は４単位の糖分子を導入可能な部位を有し、かつ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位を有する新規なリンカー化合物を用いることによって、上記支持体に３単位又は４単位の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明のリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、一般式（１）
【００１５】
【化６】

【００１６】
（式中、ｎは１以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘは、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、３鎖又は４鎖含んでなる多分岐構造部位である構造を備えていることを特徴としている。
【００１７】
上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が、他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものを指すものとする。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものを指す。
【００１８】
上記の構成によれば、上記リンカー化合物は、糖分子を簡便に導入できる部位として、芳香族アミノ基を有している。上記芳香族アミノ基は、各炭化水素誘導鎖に含まれているので、上記リンカー化合物には、３単位又は４単位の糖分子を導入することができる。また、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位として、Ｓ−Ｓ結合を有している。
【００１９】
従って、上記リンカー化合物を介して、上記支持体に３単位又は４単位の糖分子を集合化させて導入することができる。また、３単位又は４単位の糖分子が１つのリンカー化合物に導入されているので、上記支持体表面に、３単位又は４単位の糖分子を再現性よく配列させることができる。これにより、上記支持体表面上にて、糖分子とタンパク質との相互作用の観測が可能になるとともに、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００２０】
上記一般式（１）にて表される構造を備えているリンカー化合物において、上記Ｘは、一般式（２）
【００２１】
【化７】

【００２２】
（式中、ｍ¹，ｍ²，ｍ³は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００２３】
上記リンカー化合物のＸは、上記炭化水素誘導鎖を３鎖有しているので、このリンカー化合物を介して、上記支持体上に３単位の糖分子を導入することが可能である。そのため、上記支持体表面にて３単位の糖分子間の間隔を制御して、糖分子の配列を再現性よく得ることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００２４】
また、上記一般式（１）にて表される構造を備えているリンカー化合物において、上記Ｘは、一般式（３）
【００２５】
【化８】

【００２６】
（式中、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷，ｐ¹，ｐ²は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００２７】
上記リンカー化合物のＸは、上記炭化水素誘導鎖を４鎖有しているので、このリンカー化合物を介して、上記支持体上に４単位の糖分子の導入が可能である。そのため、上記支持体表面にて４単位の糖分子間の間隔を制御して、糖分子の配列を再現性よく得ることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００２８】
また、本発明のリガンドは、上記の課題を解決するために、上記したいずれかのリンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなるものであることを特徴としている。
【００２９】
上記リガンドは、具体的には、一般式（４）
【００３０】
【化９】

【００３１】
（式中、ｍ¹，ｍ²，ｍ³，ｎは、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００３２】
あるいは、上記リガンドは、一般式（５）
【００３３】
【化１０】

【００３４】
（式中、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷，ｎ，ｐ¹，ｐ²は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることが好ましい。
【００３５】
上記リガンドのいずれかを用いることにより、上記タンパク質分析用の支持体表面に３単位（一般式（４）に示される構造を備えているリガンドを用いた場合）又は４単位（一般式（５）に示される構造を備えているリガンドを用いた場合）の糖分子を集合化して固定化することができる。このように、一つのリガンドが３単位又は４単位の糖分子を有しているので、上記リガンド同士を上記支持体表面に集合化することなく、一つのリガンドを用いることによって、３単位又は４単位の糖分子を集合化させることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく測定することが可能になる。また、上記支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができる。従って、本発明のリガンドが固定されてなるタンパク質分析用の支持体を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００３６】
また、本発明のリンカー化合物の製造方法は、上記の課題を解決するために、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖又は４鎖有するアミン化合物との縮合反応を行うステップと、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴としている。
【００３７】
上記の方法によれば、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位としてのＳ−Ｓ結合と、糖分子を簡便に導入できる部位としての芳香族アミノ基とを有している、本発明のリンカー化合物を得ることができる。
【００３８】
また、本発明のリガンドの製造方法は、上記の課題を解決するために、上記のリンカー化合物と、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴としている。
【００３９】
上記の方法によれば、還元アミノ化反応により、リンカー化合物に簡便に糖分子を導入して、本発明のリガンドを得ることができる。
【００４０】
また、本発明の糖分子の導入方法は、上記の課題を解決するために、上記リガンドを含む溶液と、支持体表面の金属とを接触させることを特徴としている。
【００４１】
上記の方法によれば、上記リガンド（リガンドに含まれるリンカー化合物）のＳ−Ｓ結合を、上記支持体表面の金属との結合に変換し、支持体表面に上記リガンドを固定することができる。従って、リガンドを含む溶液と支持体とを接触させるという簡便な方法で、リンカー化合物に結合した糖分子を支持体の表面に配列させることができる。
【００４２】
また、本発明のリガンド担持体は、上記の課題を解決するために、上記リガンドを、表面に金属を有する支持体上に、固定化させてなることを特徴としている。
【００４３】
上記の構成によれば、硫黄−金属結合を介して、支持体表面にリガンドを強固に固定することができるので、支持体表面に複数の糖分子を再現性よく配列させてなるリガンド担持体を提供することができる。従って、上記リガンド担持体を用いれば、リガンドに含まれる糖分子と、該糖分子と相互作用するタンパク質等の物質との相互作用を再現性よく観測することができるので、糖分子の生物活性の定量的な評価が可能になる。
【００４４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００４５】
本発明のリンカー化合物は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体とオリゴ糖等の糖（以下、糖分子と記載する）との間に介在して、上記支持体上に糖分子を固定化するために用いられる。そのため、上記リンカー化合物は、上記支持体に固定可能な部位、及び、糖分子を簡便に導入できる部位を分子内に有している必要がある。
【００４６】
また、上記ＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィでは、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定することや分離することを目的としている。そのため、上記リンカー化合物は、タンパク質等の物質との非特異的な相互作用を有していないものでなければならない。
【００４７】
そこで、本発明のリンカー化合物は、上記支持体に固定可能な部位として、前記一般式（１）にて示すように、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を有している。このジスルフィド結合の硫黄（Ｓ）は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金（Ａｕ）と、硫黄−金結合（Ｓ−Ａｕ結合）を形成し、上記支持体に強固に結合することができる。
【００４８】
また、上記リンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を配列するとともに、個々の糖分子の糖鎖間の距離を制御するために、糖分子を簡便に導入できる部位として、複数のアミノ基を含んでなる多分岐部位を有している。すなわち、本発明のリンカー化合物の多分岐部位は、前記一般式（１）のＸで表される構造を備えている部位であり、該Ｘは、前記したように、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合やアミド結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を３鎖又は４鎖含んでいる構造を備えている。なお、上記一般式（１）において、ｎは、１以上６以下の整数であれば限定されない。
【００４９】
上記芳香族アミノ基のアミノ基（−ＮＨ₂基）は、オリゴ糖等の糖分子との還元アミノ化反応により、上記リンカー化合物に糖分子を導入するための反応基となる。つまり、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基（−ＣＨＯ基）又はケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に容易に糖分子を導入することができる。
【００５０】
従って、前記一般式（１）のＸは、上記のような炭化水素誘導鎖を３鎖又は４鎖含むことにより、糖分子を導入可能な芳香族アミノ基を複数併せ持った多分岐型部位である構造を備えている。この多分岐型部位に含まれる各芳香族アミノ基に、オリゴ糖等の糖分子が導入されるので、前記一般式（１）にて表される構造を備えているリンカー化合物を介して、タンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することが可能になる。
【００５１】
具体的には、上記Ｘは、前記一般式（２）にて示すように、３鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香族アミノ基とは反対側の末端にて、１つの炭素（Ｃ）に結合することによって分岐構造を形成している。そして、この炭素に−ＮＨ−が結合している。これにより、上記Ｘは、３鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位となる。なお、上記一般式（２）において、ｍ¹，ｍ²，ｍ³は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記ｍ¹〜ｍ³は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。
【００５２】
あるいは、上記Ｘは、前記一般式（３）にて示すように、２鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香族アミノ基とは反対側の末端にて、１つの窒素（Ｎ）に結合した２分岐構造を２つ有している構造を備えていてもよい。この場合、２つの２分岐構造の上記窒素が、−ＣＯ−ＣＨ₂−を介して、１つの窒素（Ｎ）に結合することによって分岐構造を形成する。これにより、上記Ｘは、４鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位である構造を備えることになる。なお、上記一般式（３）において、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷は、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記ｍ⁴〜ｍ⁷は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。またｐ¹，ｐ²は、１以上６以下の整数であれば特に限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、ｐ¹，ｐ²は、互いに同じ整数であることが好ましく、特に１であることが好ましい。
【００５３】
このように、上記Ｘは、炭素や窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結合して分岐構造を形成している多分岐型部位である構造を備えている。なお、上記Ｘに含まれる複数の炭化水素誘導鎖は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳香族アミノ基を有していれば、互いに異なる構造であってもよい。
【００５４】
以上のように、一般式（１）にて表される構造を備えているリンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体に結合可能なＳ−Ｓ結合と、オリゴ糖鎖等の糖分子に結合可能なアミノ基とを有している。従って、例えばＳ−Ａｕ結合により上記リンカー化合物が、タンパク質分析用の支持体上に固定されるので、上記リンカー化合物を介して、上記支持体上に糖分子を強固にかつ簡単に結合させることができる。
【００５５】
また、上記リンカー化合物は、多分岐型部位を有し、該多分岐型部位の各末端に芳香族アミノ基を有している。そのため、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるリガンド（後述）を用いることにより、上記支持体表面に効率よく糖分子を集合化させることができる。また、多分岐型部位を有しているので、リンカー化合物を含んでなるリガンドを支持体表面に結合させた場合に、２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列させることができる。
【００５６】
さらに、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができる。それゆえ、本発明のリンカー化合物を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【００５７】
上記リンカー化合物は、以下に示す製造方法によって製造される。すなわち、上記リンカー化合物は、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖又は４鎖有する多分岐構造を含んでなるアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。
【００５８】
上記チオクト酸は、下記一般式（６）
【００５９】
【化１１】

【００６０】
にて表される構造を備えている。
【００６１】
また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する分岐鎖を含んでいれば特に限定されるものではなく、上記したリンカー化合物の多分岐部位に相当する構造を含んでいればよい。
【００６２】
従って、上記分岐鎖は、上記した炭化水素誘導鎖に含まれる芳香族アミノ基の代わりに、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有する以外は、上記炭化水素誘導鎖に含まれる構造を有していればよい。つまり、上記分岐鎖は、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものである。より具体的には、上記分岐鎖は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するとともに、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、また炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）に置き換わっていてもよいものである。
また、上記保護基とは、芳香族アミノ基のアミノ基が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、二級アミノ基の保護基を脱保護する際に影響を受けないものであれば、特に限定されるものではない。上記保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ₃）₃基；Ｂｏｃ基と記載する）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。
【００６３】
上記アミン化合物としては、例えば、下記一般式（７）や下記一般式（８）
【００６４】
【化１２】

【００６５】
にて表される構造を備えている化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（７）、（８）中のｎ，ｍ¹〜ｍ⁷，ｐ¹，ｐ²は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数である。これらのアミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。
【００６６】
上記チオクト酸とアミン化合物との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）と、アミン化合物のアミノ基（−ＮＨ₂基）とが縮合して、アミド結合が形成される。その後、芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香族アミノ基にすることによって、上記したリンカー化合物を得ることができる。
【００６７】
次に、上記リンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子が導入されてなるリガンドについて説明する。本発明のリガンドにおいては、リンカー化合物のアミノ基が、糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基又はケトン基と反応し、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に糖分子を導入することができる。すなわち、この還元アミノ化反応により、上記リンカー化合物と糖分子とが結合する。
【００６８】
本発明のリガンドに含まれる糖分子は、還元末端を有する還元糖であれば、特に限定されない。例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース等の単糖類、結合している糖の数が２糖〜１０糖であるマルトース、ラクトース、後述する硫酸化オリゴ糖等のオリゴ糖類、単糖類やオリゴ糖類が組み合わされて糖数が１１以上であるヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等の多糖類を挙げることができる。
【００６９】
また、上記オリゴ糖類として、抗血液凝固活性を有することで知られている硫酸化多糖ヘパリン中の下記一般式（９）
【００７０】
【化１３】

【００７１】
にて表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を有する硫酸化オリゴ糖、該硫酸化オリゴ糖の還元末端である水酸基にグルコースを導入してなる下記一般式（１０）
【００７２】
【化１４】

【００７３】
にて表される構造を備えているオリゴ糖を挙げることができる。
【００７４】
なお、上記オリゴ糖類や多糖類は、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖や単一多糖であってもよく、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質や、種々の単糖分子やその誘導体、オリゴ糖類を含んでなる複合多糖類であってもよい。また、上記糖分子は、いずれも、自然界から単離・精製して得られる種々の天然の糖であってもよく、人工的に合成された糖であってもよい。
【００７５】
具体的には、本発明のリガンドは、前記一般式（４）にて表される構造を備えているものである。この一般式（４）にて表される構造を備えているリガンドは、前記一般式（１）にて表され、Ｘが前記一般式（２）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、上記一般式（１０）にて表される構造を備えている糖分子を導入してなるものである。一般式（２）にて表されるＸは、３鎖の炭化水素誘導鎖を有している構造を備えているので、一般式（４）にて表される構造を備えているリガンドは、上記リンカー化合物に３単位の糖分子が結合したものである。なお、上記一般式（４）において、ｍ¹〜ｍ³は、一般式（２）中のｍ¹〜ｍ³と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、ｎは１以上６以下の整数であれば特に限定さない。
【００７６】
また、本発明の他のリガンドは、前記一般式（５）にて表される構造を備えているものである。この一般式（５）にて表される構造を備えているリガンドは、前記一般式（１）にて表され、Ｘが前記一般式（３）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、上記一般式（１０）にて表される構造を備えている糖分子を導入してなるものである。一般式（３）にて表されるＸは、４鎖の炭化水素誘導鎖を有している構造を備えているので、一般式（５）にて表される構造を備えているリガンドは、上記リンカー化合物に４単位の糖分子が結合したものである。なお、上記一般式（５）において、ｍ⁴〜ｍ⁷は、一般式（３）中のｍ⁴〜ｍ⁷と同様に、１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、ｐ¹，ｐ²は、一般式（３）中のｐ¹，ｐ²と同様に、１以上６以下の整数であれば特に限定されず、互いに異なる整数であってもよく、互いに同じ整数であってもよい。また、ｎは１以上６以下の整数であれば特に限定さない。
【００７７】
上記のリガンドは、いずれもリンカー化合物と糖分子とを含んでなっているので、リンカー化合物内のＳ−Ｓ結合にて、タンパク質分析用の支持体表面の金属と、硫黄（Ｓ）−金属結合、例えば硫黄−金（Ｓ−Ａｕ）結合により結合することができる。これにより、このＳ−Ａｕ結合を介して、上記支持体表面に３単位又は４単位の糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。それゆえ、上記リガンドを用いることによって、例えばタンパク質分析用の支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列してリガンド担持体を得、該リガンド担持体を用いることによって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。なお、上記支持体表面の金属としては、上記Ａｕの他、Ｃｕ、Ａｇ、Ｐｔ等の金属が用いることができるが、特にＡｕが好ましく用いられる。
【００７８】
このように、本発明のリガンドを、Ｓ−金属結合を介して支持体の表面に固定化させてなるリガンド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク質分析の用途に限定されず、糖分子との相互作用を調べるために、タンパク質以外の物質の分析用として用いることもできる。
【００７９】
上記リガンド担持体は、該リガンドを含むリガンド溶液と表面に金属膜を有する支持体とを接触させることにより、リガンドのＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、支持体表面の金属とＳ−金属結合によって結合して、支持体表面に上記リガンドが導入される。具体的には、上記リガンド溶液に、タンパク質分析用の支持体を所定時間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド溶液を注入する（支持体表面にリガンド溶液を流す）ことによって、上記リガンド（リガンドに含まれるリンカー化合物）のＳ−Ｓ結合を、上記支持体表面の金等とのＳ−Ａｕ結合に変換して、支持体表面に上記リガンドを固定することができる。
【００８０】
リガンド溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、水、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）や、これらの混合溶媒等を挙げることができる。また、浸漬時間は、０．５時間〜１２時間程度であればよく、注入量は、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ程度であればよい。
【００８１】
このように、本発明のリガンドは、Ｓ−Ｓ結合を有しているので、タンパク質分析用の支持体表面に簡単に固定化することができ、上記支持体上に糖分子を簡単に導入することができる。
【００８２】
なお、上記のように支持体に糖分子を導入する方法も本発明に含まれる。
【００８３】
本発明のリガンド担持体は、糖分子と、例えばタンパク質等の他の物質との相互作用の分析に、利用可能である。具体的には、上記リガンド担持体は、ＳＰＲ測定、アフィニティクロマトグラフィ等に適用することができる。
【００８４】
例えば、タンパク質分析として、ＳＰＲ測定を行うには、以下のようにすればよい。すなわち、金薄膜等の金属薄膜を蒸着した支持体に、本発明のリガンドを固定化してなるリガンド担持体を用い、該リガンド担持体とタンパク質とを接触させ、常法に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担持体とタンパク質との結合挙動を観測することができる。なお、ＳＰＲ測定に用いる上記支持体（センサチップ）としては、例えば、ガラス、プラスチック等を用いることができ、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例えば、タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に流入することにより行えばよい。このランニングバッファーとしては、例えば、リン酸緩衝溶液等を挙げることができる。
【００８５】
本発明のリガンド担持体は、上記リガンドを有しているので、支持体表面に２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができる。それゆえ、糖分子の生物活性を再現性よく観測でき、糖分子の構造の解明や、糖分子の生物活性について定量的な評価を行うことができる。
【００８６】
また、本発明のリガンド担持体として、リガンドを導入したセンサチップは、例えば、以下のようなＳＰＲ測定に使用することができる。すなわち、第１の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第１のセンサチップと、上記第１の糖分子とは末端構造が異なる第２の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第２のセンサチップとを用いて、第１のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果と、第２のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を観測することがすることができる。これらのセンサチップは、固定化される糖分子が異なっているリガンドを用いればよい。比較する糖分子には、例えば、ラクトースとグルコース、マルトースとグルコース、コージビオースとグルコース等が挙げられる。ここでは、２つのセンサチップを用いたが、これ以上の数の、導入される糖分子の種類が異なるセンサチップを用いてもよい。なお、糖分子の末端とは、センサチップに固定されていない側のことである。
【００８７】
上記ＳＰＲ測定では、第１の糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測定条件を一定にして、上記２つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糖分子とタンパク質等との特異的な相互作用として測定することができる。
【００８８】
また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。
【００８９】
上記では、２つの種類のセンサチップ同時に測定したが、これに限定されることはなく、２種類以上のセンサチップを測定してもかまわなし、同時に測定しなくてもかまわない。また、少なくとも１つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用いてもよい。例えば、リンカー化合物のみを固定化したものを用いてもよい。
【００９０】
上記のようなＳＰＲ測定を行うと、糖分子以外は同じ構造のリガンドを有する少なくとも２つのセンサチップを用いて、測定をすることができるため、少なくとも２つのセンサチップ相互作用の差は、糖分子に起因したものとして観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質との非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観測することができる。
【００９１】
【実施例】
以下、本発明のリンカー化合物及びリガンドの合成について、より詳細に説明する。
【００９２】
〔実施例１・リンカー化合物の合成〕
本発明のリンカー化合物である、前記一般式（１）にてｎが１であり、Ｘが前記一般式（２）にて表され、ｍ¹，ｍ²，ｍ³が２である構造を備えているリンカー化合物は、以下の手順にて合成した。
【００９３】
下記一般式（１１）にて示すように、６５℃−７０℃のジメトキシエタン中、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムの存在下にて、ニトロメタン（化合物１）に対し、３単位のｔ−ブチルアクリレート（化合物２）をマイケル付加させ、９１％の収率にて化合物３を得た。次いで、水素雰囲気下（６ｋｇ／ｃｍ²）、５０℃のエタノール中にて、ラネーニッケル（Raney Ni）を用いて、上記化合物３のニトロ基を還元して、９８％の収率にて化合物４を得た。
【００９４】
その後、ＣＨ₂Ｃｌ₂中、１．１当量の１−ヒドロキシ−７−アザペンゾトリアゾール（式中、ＨＯＡｔ）、１．１当量の水溶性カルボジイミド塩酸塩（式中、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）の存在下にて、上記化合物４に１．１当量のＺ−グリシンを縮合させ、８５％の収率にてＺ−グリシン体（化合物５）を得た。
【００９５】
【化１５】

【００９６】
より具体的に説明すれば、上記化合物４は、文献（G. R. Newkomeら、OPPI BRIEFS, 28巻, p.495, 1996）の方法に従って、まず、ニトロメタン（１２．２ｇ，２００ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン５０ｍＬに溶解して、６５−７０℃に加熱し、４０％水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム−メタノール溶液（２ｍＬ）を加えて、ニトロメタン溶液とした。次いで、このニトロメタン溶液の温度を７５℃まで上昇させ、ｔ−ブチルアクリレート（９０．８ｍＬ，６２０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、溶液温度を７０−７５℃に保ちながら、４０％水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム−メタノール溶液を１ｍＬずつ４回に分けて加えて２．５時間攪拌し、ニトロメタン／ｔ−ブチルアクリレート反応溶液を得た。このニトロメタン／ｔ−ブチルアクリレート反応溶液中の不溶物をデカンテーションにより取り除いて濃縮し、得られた残渣をジエチルエーテルに溶かして、氷冷した１０％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び水で２回ずつ洗浄して残渣溶液を得た。その後、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて、該残渣溶液を乾燥させ、セライトを用いて該乾燥剤を除去して、減圧濃縮した後、濃縮残渣をエタノールに溶解して再結晶を行い、化合物３（８１．８ｇ，９１％）を白色針状結晶として得た。
【００９７】
続いて、化合物３の結晶（１０ｇ，２２．４ｍｍｏｌ）とＴ−１ラネーニッケル（６．０ｇ）とを無水エタノール５０ｍＬに加え、６ｋｇ／ｃｍ²の水素雰囲気下、５０℃で２３時間攪拌した後、セライトを用いてＴ−１ラネーニッケルを濾去することによって得られた化合物３反応溶液を減圧濃縮した。この化合物３反応溶液の減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を、分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、化合物４（収量９．２ｇ、収率９８％）を白色固体として得た。
【００９８】
より具体的には、Ｚ−グリシン（１．２６ｇ，６．６２ｍｏｌ）と、ＨＯＡｔ（０．９０ｇ，６．６２ｍｍｏｌ）と、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ（１．２７ｇ，６．６２ｍｍｏｌ）とを無水ジクロロメタン（２８ｍＬ）に溶かしたＺ−グリシン溶液に、０℃の温度条件下、化合物４（２．５０ｇ，６．０２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした化合物４溶液を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で３６時間攪拌して、Ｚ−グリシン／化合物４反応溶液を得た。このＺ−グリシン／化合物４反応溶液に、ジクロロメタンと１０％クエン酸水溶液とを加えてジクロロメタンで抽出し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および水で１回ずつ洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。この減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム）で精製し、化合物５（収量３．０９ｇ、収率８５％）を白色固体として得た。
【００９９】
得られた上記化合物５のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定（飛行時間型質量分析計測定）を行ったところ、ｍ／ｚ（質量／電荷比）６２９．４[(M+Na)⁺]であった。これにより、化合物５の構造を確認することができた。
【０１００】
次に、下記一般式（１２）にて示すように、ＣＨ₂Ｃｌ₂／Ｈ₂Ｏ＝１０／１の混合溶媒中にて、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと記載する）を用いて、上記化合物５のｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ₃）₃基；一般式（１２）中、ｔＢｕ）を脱保護して、収率９５％にて化合物６を得た。
【０１０１】
その後、４．５当量のペンタフルオロフェニルジフェニルホスフェート（式中、ＦＤＰＰ）、１１当量のジイソプロピルエチルアミン（式中、ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下にて、上記化合物６とＢｏｃ基によってアミノ基が保護されたｍ−フェニレンジアミン誘導体（化合物７、１０当量）とを縮合させ、収率９９％にてＮ−Ｂｏｃアミン誘導体（化合物８）を得た。続いて、メタノール（図中、ＭｅＯＨ）中、Ｐｄ／Ｃ（活性炭担持パラジウム）の存在下にて接触水素還元を行い、化合物８に縮合した上記Ｚ−グリシンのベンジルオキシカルボニル基（式中、Ｚ基）を脱保護して、収率７９％にて化合物９を得た。
【０１０２】
【化１６】

【０１０３】
上記化合物６〜９を得るために、具体的には、以下の操作を行った。
【０１０４】
すなわち、化合物６を得るために、化合物５（２．９８ｇ，４．９０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶かし、−１０℃でＴＦＡ（１５ｍＬ）と水（１．５ｍＬ）とを加えた後、室温で１．５時間攪拌して化合物５反応溶液を得た。該化合物５反応溶液を減圧濃縮した後、氷浴中で濃縮残渣にｐＨが５になるまで１０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、さらにｐＨが２になるまで濃塩酸を加えて、白色固体を析出させた。得られた白色固体を水で洗浄し、化合物６（収量２．０４ｇ、収率９５％）を白色固体として得た。
【０１０５】
得られた上記化合物６のＥＳＩ−ＭＳ（negative）測定を行ったところ、ｍ／ｚ４３７．１[(M-H)^-]であった。また、核磁気共鳴（¹Ｈ−ＮＭＲ、４００ＭＨｚ，ｄ₆−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、δ＝7.34-7.14 (6H, m), 5.00 (1H, s), 3.55 (2h, d, J = 5.9 Hz), 3.33 (3H, bs), 2.11 (6H, m), 1.81 (6H, m)であった。これらにより、化合物６の構造を確認することができた。
【０１０６】
また、化合物７を得るために、ｍ−フェニレンジアミン（０．５０ｇ，４．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（３５ｍＬ）に溶かし、０℃で（Ｂｏｃ）₂Ｏ（１．０６ｍＬ，４．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．６５ｍＬ，４．６５ｍｍｏｌ）とを加えた後、室温で２４時間攪拌して、減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／アセトン＝１０／１）で精製し、化合物７（収量６６５ｍｇ、収率６８％）を白色固体として得た。
【０１０７】
上記化合物７のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ２３１．２[(M+Na)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、δ＝7.02 (1H, t, J = 8.0 Hz), 6.95 (1H, bs), 6.54 (1H, dd, J = 2.0 Hz, J = 8.0 Hz), 6.41 (1H, bs), 6.35 (1H, dd, J = 2.2 Hz, J = 7.9 Hz), 3.66 (2H, bs), 1.53, 1.50 (9H, s, s)であった。これらにより、化合物７の構造を確認することができた。
【０１０８】
また、化合物８を得るために、上記化合物６（１００ｍｇ，２２８μｍｏｌ）、上記化合物７（４７５ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）、ＦＤＰＰ（３９４ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（４４７μＬ，２．５７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶かし、アルゴン雰囲気下で、室温で２９時間攪拌した後、酢酸エチル及び水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を０．５Ｎ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で１回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて、乾燥反応溶液を得た。得られた乾燥反応溶液から、乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／アセトン＝３／１）で精製し、化合物８（収量２２８ｍｇ、収率９９％）を白色固体として得た。
【０１０９】
上記化合物８のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところｍ／ｚ１００９．５[(M+H)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、δ＝8.75 (3H,s), 7.67 (3H, s), 7.30-6.95 (18H, m), 6.52 (1H, bs), 5.04 (2H, s), 3.71 (2H, d, J = 5.0 Hz), 2.23 (6H, m), 1.97 (6H, m), 1.47 (27H, s)であった。これらにより、化合物８の構造を確認することができた。
【０１１０】
また、化合物９は、具体的には次のようにして得た。すなわち、化合物８（２００ｍｇ，１９８μｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（６２．３ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で１５時間攪拌した後、上記Ｐｄ／Ｃを濾去して、減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／メタノール＝８／１）で精製して、化合物９（収量１３６ｍｇ、収率７８％）を白色固体として得た。
【０１１１】
上記化合物９のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ８７５．５[(M+H)⁺]であった。これにより、化合物９の構造を確認することができた。
【０１１２】
さらに、下記一般式（１３）にて示すように、１．０当量のＷＳＣＩ・ＨＣｌ、１．０当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（一般式（１３）中、ＨＯＢｔ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂中、上記化合物９を、１．０当量のチオクト酸（化合物１０）と縮合させ、収率７５％にてチオクト酸誘導体（化合物１１）を得た。
【０１１３】
上記にて得られた化合物１１を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中、トリメチルシリルクロリド（式中、ＴＭＳＣｌ）、フェノール（ＰｈＯＨ）の存在する酸性条件下にて、上記Ｂｏｃ基を脱保護し、芳香族アミノ基を有する炭化水素誘導鎖を３鎖含んでなるリンカー化合物として、化合物１２を得た（収率３２％以上）。
【０１１４】
【化１７】

【０１１５】
具体的に、化合物１１、１２を得るために以下の操作を行った。
【０１１６】
すなわち、化合物１１を得るために、化合物１０（２３．６ｍｇ，１１４ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１５．４ｍｇ，１１４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．３ｍＬ）に溶解し、０℃の温度条件下、化合物９（２．５０ｍｇ，６．０２ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン雰囲気下で、遮光して室温で３６時間攪拌した後、１０％クエン酸水溶液とを加えてからクロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。その後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／メタノール＝４０／１）で精製して、化合物１１（収量９１．０ｍｇ、収率７５％）を白色固体として得た。
【０１１７】
上記化合物１１のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ１０８５．５[(M+H)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、δ＝9.01 (3H, bs), 7.67 (3H, s), 7.31 (1H, bs), 7.27-7.00 (12H, m), 3.71 (2H, bs), 3.64-3.39 (1H, m), 3.12-2.99 (2H, m), 2.33 (1H, m), 2.32 (6H, m), 2.20 (2H, m), 2.04 (6H, m), 1.82-1.73 (1H, m), 1.62-1.47 (4H, m), 1.47 (27H, s), 1.39-1.25 (2H, m)であった。これらにより、化合物１１の構造を確認することができた。
【０１１８】
また、化合物１２を得るために、トリメチルシリルクロリド（０．２５ｍＬ，２．６４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４９ｍＬ）に溶解し、フェノール（５４９ｍｇ，５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．４６ｍＬ）に溶解したフェノール溶液を加えて攪拌した後、さらに、化合物１１（３４．７ｍｇ，３２．６μｍｏｌ）を加え、室温で、遮光下１．５時間攪拌して、化合物１１反応溶液を得た。続いて、該化合物１１反応溶液にクロロホルムを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄して、黄色固体を析出させた。析出した黄色固体を酢酸に溶解して４℃まで冷却し、凝集した固体を濾別して、化合物１２（収量７．９ｍｇ、収率３２％）を白色固体として得た。
【０１１９】
上記化合物１２のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ７６３．６[(M+H)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ₆−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、δ＝9.57 (3H, s), 7.97 (1H, m), 6.87(6H, m), 6.67 (3H, d, J = 7.7 Hz), 6.21 (3H, d, J = 7.7 Hz), 4.98 (6H, bs), 3.67 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.56 (1H, m), 3.16-3.04 (2H, m), 2.36 (1H, m), 2.25 (6H, m), 2.19-2.07 (2H, m), 1.93 (6H, m), 1.83 (1H, m), 1.50 (4H, m), 1.33 (2H, m)であった。これらにより、化合物１２の構造を確認することができた。
【０１２０】
〔実施例２・リガンドの合成〕
実施例１にて得られたリンカー化合物１２を用いて、前記一般式（４）にて、ｍ¹，ｍ²，ｍ³が２、ｎが１である構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１２１】
下記一般式（１４）に示すように、実施例１にて得られたリンカー化合物１２と、前記一般式（１０）にて表される糖分子である化合物１３（５当量）とを、Ｈ₂Ｏ／ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃ）／酢酸（ＡｃＯＨ）＝５／２０／１の混合溶媒に溶解し、ｐＨ３〜４、３７℃にて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒をＨ₂Ｏ／ＤＭＡｃ／ＡｃＯＨ＝２０／５／２４の混合系に変え、ｐＨ３〜４、３７℃にて、３０当量のＮａＢＨ₃ＣＮを加えて還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物をSephadex G-50（アマーシャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィにより精製し、さらに脱塩処理を行って、糖分子を３単位含んでなるリガンドとして化合物１４を得た。
【０１２２】
【化１８】

【０１２３】
具体的に化合物１４を得るために、実施例１にて得られたリンカー化合物１２（０．５ｍｇ，６５５ｎｍｏｌ）と化合物１３（２．８ｍｇ，３μｍｏｌ）とを、水（２５ｍＬ）とジメチルアセトアミド（１００ｍμＬ）と酢酸（５μＬ）との混合溶媒に溶解し、封管中３７℃で終夜加熱して、リンカー化合物１２／化合物１３反応溶液を得た。ＮａＢＨ₃ＣＮ（２．７ｍｇ、３９．２μｍｏｌ）を酢酸（２０μＬ）に溶解したＮａＢＨ₃ＣＮ溶液を、上記リンカー化合物１２／化合物１３反応溶液に加え、３７℃で３日間加熱した後、減圧濃縮し、Sephadex G-50（溶媒：０．３ＭのＮａＣｌを加えたＰＢＳ）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。得られた目的画分を減圧濃縮し、濃縮残渣をSephadex G-25（溶媒：水）を用いて脱塩した。脱塩した目的画分を減圧濃縮し、水に溶かして凍結乾燥を行って、化合物１４（収量１．５ｍｇ、収率６６％）を白色粉体として得た。
【０１２４】
得られるべき化合物１４の質量は３２９１．２８ダルトン（dalton）であり、飛行時間型質量分析計測定によって得られた質量／電荷比（ｍ／ｚ）１００８．１９のピークは、上記一般式（１４）中に示される化合物１４が３価のイオン[M-12Na+9H]^3-として観測された。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）測定を行ったところ、δ＝7.20 (3H, m), 6.82 (6H, m), 6.64 (3H, m), 5.35 (3H, d, J = 3.5 Hz), 5.13 (3H, J = 2.5 Hz), 4.51 (3H, d, J = 2.4 Hz), 4.29 (6H, m), 4.18 (6H, m), 4.06(6H, m), 3.97 (9H, m), 3.87 (3H, m), 3.82 (3H, m), 3.78 (6H, m), 3.68 (9H, m), 3.56 (9H, s), 3.34 (6H, m), 3.24 (3H, dd, J = 3.4, 10.5 Hz), 3.08 (4H, m), 2.44 (6H, m), 2.33 (1H, m), 2.27 (2H, t), 1.86 (1H, m), 1.56-1.46 (2H, m), 1.35-1.14 (4H, m)であった。これらから、化合物１４の構造を確認することができた。
【０１２５】
〔実施例３・リンカー化合物の合成〕
本発明のリンカー化合物である、前記一般式（１）にてｎが１であり、Ｘが前記一般式（３）でｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷が全て２、ｐ¹及びｐ²が１である構造を備えているリンカー化合物は、以下の手順にて合成した。
【０１２６】
下記一般式（１５）にて示すように、ＭｅＯＨ中に２．３当量のトリフルオロホウ素・エーテル付加物（式中、ＢＦ₃・ＯＥｔ₂）を加えて、酸性条件下にて還流を行い、ジカルボン酸（化合物１５）をエステル化して、収率７９％にてエステル体（化合物１６）を得た。
【０１２７】
その後、１．１当量のＨＯＢｔ、１．１当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（式中、ＤＣＣ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂中にて、１．１当量のＺ−グリシンを上記化合物１６に縮合させ、収率９４％にてグリシン誘導体（化合物１７）を得た。
【０１２８】
続いて、ＭｅＯＨ中に２ＮのＮａＯＨを加えて、アルカリ条件下にて化合物１７のエステル基を加水分解し、ジカルボン酸誘導体（化合物１８）を収率９８％にて得た。
【０１２９】
【化１９】

【０１３０】
具体的には、化合物１６〜１９を得るために、以下の操作を行った。
【０１３１】
すなわち、化合物１６を得るために、化合物１５（イミノ二酢酸；１０．０ｇ，７５．１ｍｍｏｌ）とＢＦ₃・ＯＥｔ₂（三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体；２２ｍＬ，１７３ｍｍｏｌ）を無水メタノール５０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下にて５時間還流した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和し、クロロホルムで抽出した。続いて、ｐＨが９になるまで水層にトリエチルアミンを加え、さらにクロロホルムで抽出し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮して、化合物１６（収量９．６１ｇ、収率７９％）を黄色油状物として得た。
【０１３２】
上記化合物１６のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところｍ／ｚ１６２．１[(M+H)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったこところ、δ＝３．７４（6H, s），３．４８（4H, s），２．００（1H, s）であった。これらにより、化合物１６の構造を確認することができた。
【０１３３】
また、化合物１７を得るために、化合物１６（１．００ｇ，６．２１ｍｍｏｌ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（１．４１ｇ，６．８３ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（０．９２ｇ，６．８３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン２５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、０℃で０．５時間攪拌した後、Ｚ−グリシン（１．４２ｇ，６．８３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で５日間攪拌した。該撹拌によって析出した沈殿物を濾別し、濾液をクロロホルムで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで２回ずつ洗浄し、さらに水で１回洗浄して、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／アセトン＝２／１）で精製して、化合物１７（収量２．０５ｇ、収率９４％）を白色固体として得た。
【０１３４】
上記化合物１７のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ３７５．１[(M+Na)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、δ＝7.36 (5H, m), 5.69 (1H, bs t), 5.12 (2H, s), 4.22, 4.12 (4H, s, s), 4.06 (2H, d), 3.78, 3.73 (4H, s, s)であった。これらにより、化合物１７の構造を確認することができた。
【０１３５】
また、化合物１８を得るために、化合物１７（１．５０ｇ，４．２６ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、２ＮのＮａＯＨ（９ｍＬ）を加えて、０℃で２．５時間攪拌した後、Dowex 50WX-8（H⁺ form）をｐＨ６になるまで加えて中和し、該Dowex 50WX-8を濾別して減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣に水を加えて不溶物を濾別した後、減圧濃縮及び凍結乾燥を行って、化合物１８（収量１．３０ｇ、収率９８％）を白色固体として得た。
【０１３６】
上記化合物１８のＥＳＩ−ＭＳ（negative）測定を行ったところ、ｍ／ｚ３２１．１[(M-2H+Na)^-]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ₆−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、δ＝7.32 (5H, m), 7.21 (1H, m), 5.01 (2H, s), 3.93, 3.84 (4H, s, s), 3.72 (2H, d, J = 5.4 Hz)であった。これらにより、化合物１８の構造を確認することができた。
【０１３７】
次に、下記一般式（１６）に示すように、２．５当量のＦＤＰＰ、２．５当量のＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ中にて、芳香族アミノ基末端をＢｏｃ基で保護した化合物１９（２．５当量）を上記化合物１８に反応させ、収率６０％でＮ−Ｂｏｃアミン誘導体（化合物２０）を得た。
【０１３８】
続いて、ＭｅＯＨ中にて、Ｐｄ／Ｃの存在下、接触水素還元を行い、化合物２０に縮合している上記Ｚ−グリシンのＺ基を脱保護して、収率９２％にてアミン誘導体（化合物２１）を得た。
【０１３９】
【化２０】

【０１４０】
具体的に、化合物１９〜２１を得るために以下の操作を行った。
【０１４１】
すなわち、化合物１９を得るために、４−アミノ安息香酸（３．３３ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）と、ＨＯＢｔ（１．９３ｇ，１４．３ｍｍｏｌ）とを無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）に懸濁させ、アルゴン雰囲気下、０℃で１５分撹拌し、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ（２．８７ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させたＷＳＣＩ・ＨＣｌ溶液を加えて、５０分撹拌して、４−アミノ安息香酸／ＨＯＢｔ反応溶液とした。該４−アミノ安息香酸／ＨＯＢｔ反応溶液にジエチレントリアミン（０．７９ｍＬ，７．００ｍｍｏｌ）を加え、遮光下、室温で終夜撹拌し、白色結晶を得た。この白色結晶を濾取した後、メタノールから再結晶して、化合物１９を白色結晶として得た。収量は３．５３ｇ（収率９２．９％）であった。
【０１４２】
上記化合物１９のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５４２．４[(M+H)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃Ｃｌ）測定を行ったところ、δ＝7.77-7.74 (4H, d, J = 8.7 Hz), 7.50-7.48 (4H, d, J = 8.6 Hz), 3.70-3.66 (4H,m, J = 5.2 Hz), 3.34-3.28 (4H,m, J = 5.6 Hz), 1.53 (18H, s)であった。これらにより、化合物１９の構造を確認することができた。
【０１４３】
また、化合物２０を得るために、化合物１８（５０．０ｇ，１５４μｍｏｌ）と、化合物１９（２０９ｍｇ，３８６μｍｏｌ）とＦＤＰＰ（１４８ｍｇ，３８６μｍｏｌ）とを無水ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解した後、ジイソプロピルエチルアミン（６７．２μＬ，３８６μｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で２０時間攪拌して、化合物１８／化合物１９反応溶液とした。この化合物１８／化合物１９反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロロホルムで抽出し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄して、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／メタノール＝１０／１）で精製して、化合物２０（収量１２５ｍｇ、収率５９％）を白色固体として得た。
【０１４４】
上記化合物２０のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ１３９３．７[(M+Na)⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）測定を行ったところ、δ＝7.88 (1H, bs), 7.73-7.66 (10H, m), 7.56 (1H, bs), 7.38 (4H, d, J = 8.4 Hz), 7.34-7.29 (6H, m), 7.17, 7.05 (2H, bs, bs), 5.35 (1H, bs), 5.00 (2H, s), 3.96 (2H, bs), 3.64 (4H, band), 3.55 (4H, band), 3.51 (6H, band), 3.43, 3.27, 3.17 (6H, bs, bs, bs), 1.50, 1.49 (36H, s, s) であった。これらにより、化合物２０の構造を確認することができた。
【０１４５】
また、化合物２１を得るために、化合物２０（１０３ｍｇ，７４．４μｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（８４ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で４７時間攪拌した後、上記Ｐｄ／Ｃを濾去して減圧濃縮し、化合物２１（収量８４．９ｍｇ、収率９２％）を白色固体として得た。
【０１４６】
上記化合物２１のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ６３０．３[(M+H+Na)²⁺]であった。これにより、化合物２１の構造を確認することができた。
【０１４７】
さらに、下記一般式（１７）にて示すように、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ＝４／１の混合溶媒中にて、１．１当量のＨＯＢｔ、１．０当量のＷＳＣＩ・ＨＣｌの存在下、上記化合物２１を、１．１当量のチオクト酸（化合物１０）と縮合させ、収率７５％にてアミド化合物（化合物２２）を得た。
【０１４８】
さらに、上記にて得られた化合物２２を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中、ＴＦＡの存在する酸性条件下にて、Ｂｏｃ基を脱保護し、芳香族アミノ基を有する炭化水素誘導鎖を４鎖含んでなるリンカー化合物として、化合物２３を得た（収率９１％）。
【０１４９】
【化２１】

【０１５０】
具体的に、化合物２２、２３を得るために、以下の操作を行った。
【０１５１】
すなわち、化合物２２を得るために、化合物１０（１２．８ｇ，６２．２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（８．４ｍｇ，６２．２μｍｏｌ）とを無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、０℃で遮光して攪拌して、化合物１０／ＨＯＢｔ反応溶液とした。次いで、化合物２１（７０．０ｍｇ，５６．５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）に溶解して、上記化合物１０／ＨＯＢｔ反応溶液に滴下した後、室温で１９時間攪拌した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで１回ずつ洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（溶媒：クロロホルム／メタノール＝１５／１）で精製して、化合物２２（収量６０．８ｍｇ、収率７５％）を白色固体として得た。
【０１５２】
上記化合物２２のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ７３５．３[(M+2Na)²⁺]であった。また、¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，CDCl₃）測定を行ったところ、δ＝7.76-7.79 (11H, m), 7.55 (1H, bs), 7.42 (4H, d, J = 8.6 Hz), 7.35 (5H, m), 7.13, 7.00, 6.97 (3H, bs, bs, bs), 5.84 (1H, bs), 4.04 (2H, bs), 3.67 (4H, band), 3.55 (4H, band), 3.48 (8H, band), 3.41, 3.29, 3.22 (6H, bs, bs, bs), 3.16-3.03 (2H, m), 2.39 (1H, m), 2.02 (2H, m), 1.84 (1H, m), 1.58-1.52 (4H, m), 1.51, 1.49 (36H, s, s), 1.35 (2H,
m)であった。これらにより、化合物２２の構造を確認することができた。
【０１５３】
また、化合物２３を得るために、化合物２２（４８．２ｍｇ，３３．８μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えて遮光下０℃で１時間攪拌した後、減圧濃縮を行い、得られた残渣をメタノールに溶解してDowex Marathon A（OH^- form）を加えて中和した。中和後、該Dowex Marathon Aを濾別して、減圧濃縮し、化合物２３（収量３１．６ｍｇ、収率９１％）を白色固体として得た。
【０１５４】
上記化合物２３のＥＳＩ−ＭＳ（positive）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５３４．２[(M+2Na)²⁺]であった。これにより、化合物２３の構造を確認することができた。
【０１５５】
〔実施例４・リガンドの合成〕
実施例３にて得られたリンカー化合物２３を用いて、前記一般式（５）にて、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷が全て２、ｎが１、ｐ¹とｐ²とが１である構造を備えているリガンドを以下の手順にて合成した。
【０１５６】
下記一般式（１８）に示すように、実施例３にて得られたリンカー化合物２３と、下記一般式（１８）にて表される糖分子である化合物１３（５当量）とを、Ｈ₂Ｏ／ＤＭＡｃ／ＡｃＯＨ＝５／２０／１の混合溶媒に溶解させ、ｐＨ３〜４、３７℃にて、シッフ塩基（式中、imine form）を形成させた。次いで溶媒をＨ₂Ｏ／ＤＭＡｃ／ＡｃＯＨ＝９／２０／２２の混合系に替えて、ｐＨ３〜４、３７℃にて、６４当量のＮａＢＨ₃ＣＮを加えて還元反応（式中、reduction）を行った。その後、得られた化合物をSephadex G-50を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィにより精製し、さらに脱塩処理を行って、糖分子を４単位含んでなるリガンドとして化合物２４を得た。
【０１５７】
【化２２】

【０１５８】
具体的に化合物２４を得るために、リンカー化合物２３（０．５ｍｇ，４８８ｎｍｏｌ）と化合物１３（２．１ｍｇ，２．４μｍｏｌ）とを、水（２５μＬ）とジメチルアセトアミド（１００μＬ）と酢酸（５μＬ）との混合溶媒に溶解し、封管中３７℃で３時間加熱して、リンカー化合物２３／化合物１３反応溶液を得た。ＮａＨ₃ＣＮ（２．１８ｍｇ，３１．２μｍｏｌ）を酢酸（４５μＬ）に溶解して、上記リンカー化合物２３／化合物１３反応溶液に加え、３７℃で３日間加熱した後、減圧濃縮して、Sephadex G-50（1.6 x 80 cm、PBS-0.3N NaCl）を用いて精製した。該精製によって得られた目的画分を減圧濃縮し、濃縮残渣をSephadex G-25（1.6 x 40 cm、水）を用いて脱塩した。該脱塩により得られた目的画分を減圧濃縮し、水に溶かして凍結乾燥を行い、化合物２４（収量１．０ｍｇ、収率４７％）を白色粉体として得た。
【０１５９】
得られるべき化合物２４の質量は４３９６．３７ダルトンであり、飛行時間型質量分析計測定によって得られた質量／電荷比（ｍ／ｚ）１３６８．９３のピークは、上記一般式（１８）中に示される化合物２４が３価のイオン[M-13Na+10H]^3-として観測された。また、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、δ＝7.70-7.55 (8H, m), 6.78-6.64 (8H, m), 5.34 (4H, s), 5.20 (8H, d, J = 3.3 Hz), 5.15 (4H, bs), 4.52 (4H, bs), 4.29 (8H, m), 4.19 (8H, m), 4.05 (4H, m), 3.99 (4H, band), 3.87-3.80 (16H, band), 3.73-3.66 (24H, m), 3.87 (3H, m), 3.57 (12H, s), 3.49 (4H, dd, J = 3.8, 9.7), 3.39-3.34 (14H, m), 3.26-3.19 (12H, m), 2.60 (1H, m), 2.21-2.13 (2H, m), 1.77 (1H, m), 1.50-1.13 (4H, m)であった。これらによって、化合物２４の構造を確認することができた。
【０１６０】
〔実施例５・リガンド化合物を用いたＳＰＲ測定〕
実施例２で得られた、前記一般式（４）にて、ｍ¹，ｍ²，ｍ³が全て２、ｎが１である構造を備えているリガンドである化合物１４を用いて、ＳＰＲ測定を行った。
【０１６１】
すなわち、金薄膜を蒸着したガラス基板表面に下記の操作を行うことにより、リガンド（化合物１４）を固定化し、化合物１４とヘパリン結合性タンパク質であるリコンビナントフォンビルブラント因子（以下、ｒｖＷＦと略する）との結合挙動を観測した。
【０１６２】
（５−１リガンド導入チップの調製）
初めに、１３×２０×０．７ｍｍのガラス基板に５０ｎｍの金薄膜を蒸着したセンサチップ（日本レーザー電子株式会社製）を、ＵＶオゾンクリーナー（商品名：NL-UV253、日本レーザー電子株式会社）に入れて紫外線を２０分間照射し、オゾンでセンサチップの金表面を洗浄した。次に、このセンサチップを、セル内のテフロン（登録商標）製セルホルダーに装着し、該セルに０．１ｍＭの化合物１４のメタノール溶液を５０μＬ加えて密封し、室温で、Bio Dancer（商品名、New Brunswick Scientific社）を使用し、終夜緩やかに振とうさせた。その後、上記セルをメタノール１００μＬで６回洗浄して、上記センサチップをテフロン（登録商標）製セルホルダーから取り外した。続いて、取り外されたセンサチップをメタノールで満たされたシャーレに浸漬させ、穏やかに振とうして洗浄する操作を２回繰り返した後、水、メタノールの順で上記と同様にしてセンサチップを洗浄して、リガンド導入チップ（リガンド担持体）を得た。このリガンド導入チップを風乾後、表面プラズモン共鳴装置SPR670（商品名、日本レーザー電子株式会社）のセンサチップカートリッジ（ガラスプリズム）に取り付けた。
【０１６３】
（５−２リガンド導入チップとタンパク質との疎水性相互作用による非特異的相互作用の検討）
上記にて得られたリガンド導入チップ上に、２５℃の温度条件下、流速１５μＬ／ｍｉｎにて、上記表面プラズモン共鳴装置を用いて測定される共鳴角度変化が一定になるまで、ランニングバッファーとしてのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を流した。その後、ＳＰＲ測定に用いられるタンパク質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、該ＢＳＡをランニングバッファーに溶解したＢＳＡ溶液を調製し、該ＢＳＡ溶液６０μＬを、流速１５μＬ／ｍｉｎにてリガンド導入チップ表面に注入した。
【０１６４】
上記ＢＳＡ溶液を流入したリガンド導入チップ表面の金と、タンパク質であるＢＳＡとの疎水性相互作用に基づく非特異的相互作用を検討するために、表面プラズモン共鳴装置を用いて測定を行ったところ、共鳴角度変化はほとんど観測されなかった。このことから、化合物１４が導入されてなるリガンド導入チップを用いた場合、タンパク質とリガンド導入チップとの非特異的な相互作用による影響を低減することができるので、タンパク質と糖との結合相互作用の定量的な評価を行うことができると考えられる。
【０１６５】
（５−３ｒｖＷＦの解離定数の解析）
前記（５−１）にて得られたリガンド導入チップ上に、上記（５−２）のＢＳＡ溶液に代えて、ｒｖＷＦ溶液を用いた以外は、上記（５−２）と同様の手順にて、リガンド導入チップ表面にｒｖＷＦ溶液を注入した。なお、ｒｖＷＦ溶液は、１２５ｎＭ〜１６００ｎＭの範囲の濃度になるように、ｒｖＷＦを上記ランニングバッファーに溶解して調製した。
【０１６６】
上記ｒｖＷＦ溶液の濃度を変えて、リガンド導入チップ表面にｒｖＷＦ溶液を注入し、ｒｖＷＦ溶液の注入時間（time（sec））経過に対する、化合物１４とｒｖＷＦとの結合に基づくレスポンス（Response（ＲＵ；Response Unit））を、表面プラズモン共鳴装置を用いて測定することによって調べた。その結果を図１に示す。
【０１６７】
なお、上記ｒｖＷＦが導入されたリガンド導入チップは、該リガンド導入チップ表面に、流速６０μＬ／ｍｉｎで、１０ｍＭのＮａＯＨを１分間以上流すことによって再生させて、再使用した。
【０１６８】
また、表面プラズモン共鳴装置（SPR670）に付属のソフトウェアを用い、リガンドである化合物１４とｒｖＷＦとの結合挙動の観測結果（図１）に基づいて、解離定数（Ｋ_D）、結合速度定数（ｋ_a）、解離速度定数（ｋ_d）の値を算出した。その結果を表１に示す。
【０１６９】
【表１】

【０１７０】
〔比較例〕
特許文献１に記載の手順に従って、前記した一般式（１０）にて表される構造を備えているオリゴ糖を１単位有し、下記一般式（１９）によって示される構造を有するリガンドである化合物２５を調製した。
【０１７１】
【化２３】

【０１７２】
次いで、前記化合物１４に代えて、上記化合物２５を用いた以外は、前記実施例５の（５−１）と同様の手順にて、リガンド導入チップを得た。このリガンド導入チップを用いて、前記実施例５の（５−２）と同様の手順にて、リガンド導入チップとタンパク質との疎水性相互作用に基づく非特異的相互作用が起こらないことを確認した。その後、前記実施例５の（５−３）と同様の手順にて、リガンド導入チップ表面にｒｖＷＦ溶液を注入し、ｒｖＷＦ溶液の注入時間経過に伴う共鳴角度変化を、表面プラズモン共鳴装置を用いて測定して、化合物２５とｒｖＷＦとの結合挙動を調べた。その結果を図２に示す。
【０１７３】
また、図２に基づいて、前記実施例５の（５−３）と同様の手順にて、解離定数（Ｋ_D）、結合速度定数（ｋ_a）、解離速度定数（ｋ_d）の値を算出した。その結果を上記表１に示す。
【０１７４】
上記表１に示すように、本実施例のリガンドである化合物１４を用いたリガンド導入チップの方が、化合物２５を用いたリガンド導入チップよりも、ｒｖＷＦに対して高い親和性を示すことがわかった。このように、本実施例のリガンド導入チップを用いれば、糖分子の生物活性を再現性よく観測できるので、上記リガンド導入チップは、糖分子の構造の解明や、糖分子の生物活性の評価を行うのに、非常に優れていることがわかる。
【０１７５】
【発明の効果】
本発明のリンカー化合物は、以上のように、３単位又は４単位の糖分子を導入可能な部位として、芳香族アミノ基末端を有している。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可能な部位として、Ｓ−Ｓ結合を有している。
【０１７６】
それゆえ、上記リンカー化合物を用いることによって、上記支持体表面上に、３単位又は４単位の糖分子を再現性よく２次元的に配列させることができるという効果を奏する。また、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができるので、糖分子とタンパク質との相互作用を観測する際に、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
【０１７７】
また、本発明のリガンドは、上記リンカー化合物に糖分子を導入してなるものである。
【０１７８】
それゆえ、上記リガンドをタンパク質分析用の支持体表面に導入することにより、２次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物１４を固定化したリガンド導入チップとｒｖＷＦとの結合をＳＰＲ測定した結果を示すグラフである。
【図２】化合物２５を固定化したリガンド導入チップとｒｖＷＦとの結合をＳＰＲ測定した結果を示すグラフである。

Claims

一般式（１）

（式中、ｎは１以上６以下の整数）にて表される構造を備え、
上記Ｘが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、３鎖又は４鎖含んでなる多分岐構造部位である構造を備えていることを特徴とするリンカー化合物。
上記Ｘは、一般式（２）

（式中、ｍ¹，ｍ²，ｍ³は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とする請求項１記載のリンカー化合物。
上記Ｘは、一般式（３）

（式中、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷，ｐ¹，ｐ²は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とする請求項１記載のリンカー化合物。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリンカー化合物の芳香族アミノ基に、糖分子を導入してなることを特徴とするリガンド。
一般式（４）

（式中、ｍ¹，ｍ²，ｍ³，ｎは、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とするリガンド。
一般式（５）

（式中、ｍ⁴，ｍ⁵，ｍ⁶，ｍ⁷，ｎ，ｐ¹，ｐ²は、それぞれ独立して、１以上６以下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とするリガンド。
チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖又は４鎖有するアミン化合物との縮合反応を行うステップと、
上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴とするリンカー化合物の製造方法。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリンカー化合物と、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴とするリガンドの製造方法。
糖分子を支持体の表面に配列させる糖分子の導入方法であって、
請求項４ないし６の何れか１項に記載のリガンドを含む溶液と表面に金属を有する支持体とを接触させることを特徴とする糖分子の導入方法。
請求項４ないし６の何れか１項に記載のリガンドを、表面に金属を有する支持体上に、固定化させてなることを特徴とするリガンド担持体。