JP3743534B2 - 新規な塩素イオン測定方法およびその試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、液体中の塩素イオン濃度の測定方法およびそのための試薬に関し、詳細にはザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を使用する塩素イオン濃度の測定方法ならびにその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ザルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.1）は、臨床的に筋疾患、腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン、クレアチニンの測定用酵素として、例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびペルオキシダーゼと組み合わせて使用されている。すなわち、試料中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼを作用させ、生成するクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させ、さらに生成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼを作用させ、かつ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび発色剤（例えば４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体）により発色させ、その発色強度を吸光度測定して、試料中のクレアチニン量を測定する。
【０００３】
ザルコシンオキシダーゼは、基質であるザルコシンに水または酸素の存在下で作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。このようなザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開昭54-52789号公報）、コリネバクテリウム属（J. Biochem. 89, 599 (1981)）、シリンドロカルボン属（特開昭56-92790号公報）、シュードモナス属（特開昭60-43379号公報）等の細菌が生産することが知られている。とりわけ、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄第１０６３７号）の生産するザルコシンオキシダーゼは、従来のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつKm値の小さい実用的な酵素であることが既に知られている（特開平2-265478号公報）。これらのザルコシンオキシダーゼは、活性発現に対し塩素イオンや種々の金属イオン等を要求しない。
【０００４】
本発明者らは、既に、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６より抽出した染色体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し（Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) に記載）、該ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給することを可能にしている（特開平6-113840号公報）。
このザルコシンオキシダーゼも塩素イオンや種々の金属イオン等を要求しない。
【０００５】
一方、塩素イオンは生体内にあってはナトリウムイオンと共に塩化ナトリウムとして、大部分は細胞外液中に存在し、血漿総陰イオン中の７０％を占め、他の電解質との相互関係のもとに、水分平衡、浸透圧の調節、酸塩基平衡の調節などに重要な役割を演じている。
塩素イオンの定量法としては、塩素イオン測定用電極の利用が主流である。しかし、電極では生化学自動分析装置への組み込みが困難である。また、イオン特異性の点でも問題があり、生体中に存在するレベルの重炭酸イオン等の他イオンも計測してしまうことはよく知られている。
そこで、哺乳類由来のアミラーゼを用いた酵素法が開発された（特開昭63-126497 号公報など）。これは、アミラーゼとカルシウムイオンとの親和性が塩素イオンにより変化する性質を利用した方法であり、イオン特異性の点で電極利用の場合より優れている。しかしながら、その測定原理よりカルシウムイオンの影響を受けることは避けられない。ヒト検体中に存在する唾液及び膵液由来アミラーゼの影響やアミラーゼの基質である麦芽糖やオリゴ糖の影響も、当然受けることとなる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、塩素イオンのより正確な定量法として、試料中の夾雑物質の影響が少ない酵素法、すなわち試料中に存在する酵素やその基質の影響およびカルシウムイオンを含めたイオン特異性の点で問題がない酵素法が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６得られたザルコシンオキシダーゼの性質をその活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるように、改変した改変ザルコシンオキシダーゼを利用して、塩素イオン測定を行うことを見い出した。
【０００８】
すなわち、本発明は試料に、ザルコシンおよびザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を水および酸素の存在下に作用させ、生成する過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドまたは消費する酸素を測定することにより、試料中の塩素イオン濃度を測定することを特徴とする塩素イオン測定方法である。
【０００９】
また、本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはアニリン誘導体を含む塩素イオン測定用試薬でる。
【００１０】
さらに、本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびホルムアルデヒド測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬である。
【００１１】
本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびグリシン測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬である。
【００１２】
【発明の実施態様】
本発明において、測定しようとする液体とは、体液、例えば血液、唾液などに限られない。天然水、海水、廃液、研究用試料など、各種化合物の塩酸塩、緩衝液成分などを含む。
塩素イオンとしては、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの金属塩に由来するものなどがある。
【００１３】
本発明のザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質とは、水および酸素の存在下にザルコシンに作用して、過酸化水素、グリシンおよびアンモニアを生成するザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質であって、その発現に塩素イオンを必要とし、しかも塩素イオン濃度に比例してザルコシンオキシダーゼ活性が発現する蛋白質（以下、改変ザルコシンオキシダーゼと称する）を意味する。
【００１４】
このような蛋白質としては、ザルコシンオキシダーゼの補酵素結合に関与する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼがある。具体的な例としては、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼ（Jounal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載）を構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニン、第１６番目のセリンおよび／または第１７番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼが挙げられる。
【００１５】
さらに具体的な一例として、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼの改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｌが挙げられる。これは、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列の第１４番目のアラニンがロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼである。
別な例としては、上記アミノ酸配列の第１４番目のアラニンがイソロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗがある。
さらに別な例としては、上記アミノ酸配列の第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＳ１６Ｐあるいは第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＭ１７Ｇがある。
【００１６】
該改変ザルコシンオキシダーゼの製造法としては、ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、改変蛋白質の遺伝子情報を有するＤＮＡを作成する。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(TransformerTM; Clonetech 製、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 製) の使用、あるいはポリメラーゼチェインリアクション法の利用が挙げられる。
【００１７】
作成された改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変蛋白質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には pBluescript 、ｐＵＣ１８などが使用できる。
【００１８】
宿主微生物としては、例えばエシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーKM109 、エシェリヒア・コリー DH5αなどが使用できる。
【００１９】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いてもよい。
【００２０】
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変蛋白質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２１】
培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変蛋白質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は 6〜48時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ 6.0〜9.0 程度である。
【００２２】
培養物中の改変蛋白質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般的には常法に従って改変蛋白質が培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、改変蛋白質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変蛋白質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤および界面活性剤を添加して改変蛋白質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２３】
このようにして得られた改変蛋白質含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せいめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーにより、精製された活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを得ることができる。
【００２４】
本発明の塩素イオンの定量法としては、改変ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる物質である過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドを直接或いは間接的に測定する方法であれば、如何なる方法も利用することができる。例えば、改変ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる過酸化水素に対し、ペルオキシダーゼの作用によりキノン色素を生成させ、その発色量より定量する方法などがある。
【００２５】
また該酵素反応により生じるグリシンにＮＡＤおよびグリシン脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部の吸光度により測定する方法などがある。
【００２６】
さらには該酵素反応により生じるホルムアルデヒドにＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部の吸光度により測定する方法などがある。
【００２７】
本発明の塩素イオン測定用試薬としては、改変ザルコシンオキシダーゼとその基質、すなわちザルコシンを含み、ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる物質を直接或いは間接的に測定するための試薬を含んでなるものであれば、如何なる方法も利用することができる。
生成する過酸化水素を測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、などのカプラー、フェノール誘導体またはアニリン誘導体などの色原体を含む。該試薬に使用するカプラーとしては４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾン等が使用される。
【００２８】
また色原体としてはフェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン類が用いられる。
【００２９】
生成するグリシンを測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ＮＡＤおよびグリシン脱水素酵素を含む。
【００３０】
生成するホルムアルデヒドを測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を含む。
【００３１】
本発明の試薬中の酵素の添加量は、特に限定されるものではないが、好適には１０〜１００Ｕ／ｌである。該酵素の基質濃度は塩素イオンの測定に支障をきたさない限り、限定されるものではない。
【００３２】
本発明の試薬のｐＨは、酵素反応を阻害しない範囲であれば、特に限定されるものではないが、好適には緩衝液によりｐＨ５〜１０に保たれているのが好ましい。また緩衝液の種類は、塩素イオンを含有しないものであれば、いかなるものでもよい。たとえばリン酸緩衝液、酢酸グアニジン緩衝液、各種ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。
【００３３】
本発明の試薬には必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤などを使用してもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤など、特に限定されるものではなく、約０．０１〜０．５％で用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、抗生物質が用いられる。安定化剤としては、安定化効果を示すものであれば、特に限定されないが、グルコース、マンニトール、トレハロース、グルセロールなどの糖類またはアミノ酸類、アルブミンなどが用いられる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例１ ザルコシンオキシダーゼの改変
ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プラスミドｐＳＡＯＥＰ３（図１参照）を Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載の方法に従い、以下に示すようにして調製した。
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１００ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））で３７℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm, 10分) により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、０．５ｍｌのリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて、３７℃、３０分間保温した。次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％、塩化セシウムを約１００％加え、撹拌混合し、５５，０００ｒｐｍ、２０時間の超遠心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。
【００３５】
精製ＤＮＡ標品１μｇを制限酵素 Sau3AI （東洋紡製）で部分分解反応させ、３ｋｂｐ以上の断片に分解した後、SalIII（東洋紡製）で切断したｐＵＣ１８ ０．５μｇと M.G.Loftus らのＢＡＣＫＦＩＬＬＩＮＧ法（Biotechniques Vol12,No.2(1992)) に従い、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは Hanahanの方法により作成したエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤＮＡ１μg 当たり約 1×106 個の形質転換体のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５％ザルコシン、０．００５％パラロースアニリンおよび０．０２５％ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）で３７℃、１８時間培養し、赤色コロニーを指標にザルコシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスクリーニングした。
【００３６】
その結果、約１，０００個のコロニーのうち１株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が保有するプラスミドには、約８．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＳＡＯ１とした。次いでｐＳＡＯ１より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断してｐＵＣ１８にサブクローニングし、約１．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を有するｐＳＡ０ＥＰ３を得た。
配列表の配列番号５にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片中にコードされているザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列をそれぞれ記載している。
【００３７】
該組換えプラスミドｐＳＡＯＥＰ３を基に、配列表の配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５の１０種のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ中の塩基を変換するキットである TransformerTM（Clonetech 製）を用い、TransformerTM のプロトコールに従い変異処理操作を行った。その結果、配列表の配列番号１記載の第１４番目のアラニンがバリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、リジンにそれぞれ置換された改変蛋白質Ａ１４Ｖ、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ａ１４Ｄ、Ａ１４Ｋ（配列表の配列番号２記載）、第１６番目のセリンがプロリンに置換された改変蛋白質Ｓ１６Ｐ（配列表の配列番号３記載）、第１７番目のメチオニンがグリシンに置換された改変蛋白質Ｍ１７Ｇ（配列表の配列番号４記載）、およびＳ１６ＰとＭ１７Ｇの二重変異である改変蛋白質Ｓ１６Ｐ＋Ｍ１７Ｇの合計１０種の改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持するプラスミドをそれぞれ作成した。
【００３８】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを種々の制限酵素で切断してサブクローンを調製し、常法に従い、SEQUENING PRO 7-deaza-dGTP kit（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定し、改変されていることを確認した。
【００３９】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持する組換え体プラスミドでエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、形質転換体をそれぞれ得た。
【００４０】
参考例２ 形質転換体の培養と改変蛋白質の精製
２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））５０ｍｌを５００ｍｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）を０．１％添加した。この培地に上記と同一組成の培地で予め３７℃で１８時間振盪培養した形質転換体の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で通気撹拌培養した。
培養液より改変蛋白質を、Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) 記載のザルコシンオキシダーゼの精製法に従い、超音波破砕、除核酸処理、硫酸アンモニウム塩析、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈｄｅｘカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの工程を順次、実施し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一のバンドを形成するまで精製した。
【００４１】
参考例３ 改変蛋白質の評価
精製された各改変ザルコシンオキシダーゼと野生型ザルコシンオキシダーゼの、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または１０ｍＭ塩化カリウム含有0.1Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）におけるミハエル数Ｋｍ、ｋｃａｔ測定値を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１から明らかなように、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ｓ１６Ｐ、Ｍ１７Ｇの特性は、該酵素の活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることを示している。
酵素の反応性を示す指標であるＫｍ、ｋｃａｔを見ると、野生型ザルコシンオキシダーゼは活性測定系中の塩素イオンの有無にかかわらず、同等の値を示すが、Ａ１４Ｖは塩素イオン存在下で非存在下の約１．３倍、Ａ１４Ｉは塩素イオン存在下で非存在下の約３．７倍、Ａ１４Ｌは塩素イオン存在下で非存在下の約１３０倍、Ａ１４Ｙは塩素イオン存在下で非存在下の約１８０倍、Ａ１４Ｗは塩素イオン存在下で非存在下の約３４倍、Ｓ１６Ｐは塩素イオン存在下で非存在下の約８８倍、Ｍ１７Ｇは塩素イオン存在下で非存在下の約４６００倍であった。
すなわち、改変蛋白質はザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることが明らかとなった。
【００４４】
実施例１ 改変ザルコシンオキシダーゼを用いた塩素イオンの測定
検体中の塩素イオン濃度を、下記試薬を用いて下記測定法により測定した。
試薬
第１試薬（Ｒ１）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ０．１Ｍ
４−アミノアンチピリン ０．０１２％
フェノール ０．０２３％
ペルオキシダーゼ ６．３Ｕ／ｍｌ
ザルコシン ０．１Ｍ
第２試薬（Ｒ２）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５） ２０ｍＭ
改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｌ １Ｕ／ｍｌ
【００４５】
測定方法
ＫＣｌ水溶液３００ｍＭまたはＮａＣｌ水溶液３００ｍＭの１０段階希釈液を試料として、各試料を５μｌ採取し、これに上記第１試薬（Ｒ１）３１０μｌを加えて、３７℃で２分間加温後、上記第２試薬（Ｒ２）８５μｌを加えて、３７℃で３分間反応させて、５００ｎｍにおける吸光度変化を求めた。なお、ブランクは塩素イオン含有被検液の代わりに蒸留水を用いた。
塩濃度と吸光度との関係（希釈直線性）を図２，３に示す。図２はＫＣｌ、図３はＮａＣｌの場合を示す。
図２，３から明らかなように、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを用いる塩素イオンの定量法により、短時間に正確かつ簡単に塩素イオンを測定することが可能となる。
【００４６】
実施例２ 他イオンの影響
実施例１の塩素イオンの測定系における他イオンの影響を調査した。表１に示すように、検体（ＫＣｌ，１００ｍＭ水溶液）に種々のイオンを含有させ、塩素イオン濃度を測定したところ、カルシウムイオンを含めて、他のイオンの測定値への影響は見られなかった。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【発明の効果】
本発明のザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を利用した新規な塩素イオンの定量法により、試料中の塩素イオン量を正確、迅速に測定することができる。
【００４９】
【配列表】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pSAOEP3の制限酵素地図を示す。
【図２】塩素イオン（ＫＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
【図３】塩素イオン（ＮａＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、液体中の塩素イオン濃度の測定方法およびそのための試薬に関し、詳細にはザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を使用する塩素イオン濃度の測定方法ならびにその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ザルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.1）は、臨床的に筋疾患、腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチン、クレアチニンの測定用酵素として、例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびペルオキシダーゼと組み合わせて使用されている。すなわち、試料中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼを作用させ、生成するクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させ、さらに生成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼを作用させ、かつ、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび発色剤（例えば４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体）により発色させ、その発色強度を吸光度測定して、試料中のクレアチニン量を測定する。
【０００３】
ザルコシンオキシダーゼは、基質であるザルコシンに水または酸素の存在下で作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。このようなザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開昭54-52789号公報）、コリネバクテリウム属（J. Biochem. 89, 599 (1981)）、シリンドロカルボン属（特開昭56-92790号公報）、シュードモナス属（特開昭60-43379号公報）等の細菌が生産することが知られている。とりわけ、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄第１０６３７号）の生産するザルコシンオキシダーゼは、従来のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつKm値の小さい実用的な酵素であることが既に知られている（特開平2-265478号公報）。これらのザルコシンオキシダーゼは、活性発現に対し塩素イオンや種々の金属イオン等を要求しない。
【０００４】
本発明者らは、既に、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６より抽出した染色体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定し（Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) に記載）、該ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給することを可能にしている（特開平6-113840号公報）。
このザルコシンオキシダーゼも塩素イオンや種々の金属イオン等を要求しない。
【０００５】
一方、塩素イオンは生体内にあってはナトリウムイオンと共に塩化ナトリウムとして、大部分は細胞外液中に存在し、血漿総陰イオン中の７０％を占め、他の電解質との相互関係のもとに、水分平衡、浸透圧の調節、酸塩基平衡の調節などに重要な役割を演じている。
塩素イオンの定量法としては、塩素イオン測定用電極の利用が主流である。しかし、電極では生化学自動分析装置への組み込みが困難である。また、イオン特異性の点でも問題があり、生体中に存在するレベルの重炭酸イオン等の他イオンも計測してしまうことはよく知られている。
そこで、哺乳類由来のアミラーゼを用いた酵素法が開発された（特開昭63-126497 号公報など）。これは、アミラーゼとカルシウムイオンとの親和性が塩素イオンにより変化する性質を利用した方法であり、イオン特異性の点で電極利用の場合より優れている。しかしながら、その測定原理よりカルシウムイオンの影響を受けることは避けられない。ヒト検体中に存在する唾液及び膵液由来アミラーゼの影響やアミラーゼの基質である麦芽糖やオリゴ糖の影響も、当然受けることとなる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、塩素イオンのより正確な定量法として、試料中の夾雑物質の影響が少ない酵素法、すなわち試料中に存在する酵素やその基質の影響およびカルシウムイオンを含めたイオン特異性の点で問題がない酵素法が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６得られたザルコシンオキシダーゼの性質をその活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるように、改変した改変ザルコシンオキシダーゼを利用して、塩素イオン測定を行うことを見い出した。
【０００８】
すなわち、本発明は試料に、ザルコシンおよびザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を水および酸素の存在下に作用させ、生成する過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドまたは消費する酸素を測定することにより、試料中の塩素イオン濃度を測定することを特徴とする塩素イオン測定方法である。
【０００９】
また、本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはアニリン誘導体を含む塩素イオン測定用試薬でる。
【００１０】
さらに、本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびホルムアルデヒド測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬である。
【００１１】
本発明はザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびグリシン測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬である。
【００１２】
【発明の実施態様】
本発明において、測定しようとする液体とは、体液、例えば血液、唾液などに限られない。天然水、海水、廃液、研究用試料など、各種化合物の塩酸塩、緩衝液成分などを含む。
塩素イオンとしては、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの金属塩に由来するものなどがある。
【００１３】
本発明のザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質とは、水および酸素の存在下にザルコシンに作用して、過酸化水素、グリシンおよびアンモニアを生成するザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質であって、その発現に塩素イオンを必要とし、しかも塩素イオン濃度に比例してザルコシンオキシダーゼ活性が発現する蛋白質（以下、改変ザルコシンオキシダーゼと称する）を意味する。
【００１４】
このような蛋白質としては、ザルコシンオキシダーゼの補酵素結合に関与する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼがある。具体的な例としては、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼ（Jounal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載）を構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニン、第１６番目のセリンおよび／または第１７番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼが挙げられる。
【００１５】
さらに具体的な一例として、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼの改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｌが挙げられる。これは、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６が産生するザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列の第１４番目のアラニンがロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼである。
別な例としては、上記アミノ酸配列の第１４番目のアラニンがイソロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗがある。
さらに別な例としては、上記アミノ酸配列の第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＳ１６Ｐあるいは第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＭ１７Ｇがある。
【００１６】
該改変ザルコシンオキシダーゼの製造法としては、ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、改変蛋白質の遺伝子情報を有するＤＮＡを作成する。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(TransformerTM; Clonetech 製、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 製) の使用、あるいはポリメラーゼチェインリアクション法の利用が挙げられる。
【００１７】
作成された改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変蛋白質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には pBluescript 、ｐＵＣ１８などが使用できる。
【００１８】
宿主微生物としては、例えばエシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーKM109 、エシェリヒア・コリー DH5αなどが使用できる。
【００１９】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いてもよい。
【００２０】
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変蛋白質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２１】
培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変蛋白質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は 6〜48時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ 6.0〜9.0 程度である。
【００２２】
培養物中の改変蛋白質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般的には常法に従って改変蛋白質が培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、改変蛋白質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変蛋白質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤および界面活性剤を添加して改変蛋白質を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２３】
このようにして得られた改変蛋白質含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せいめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーにより、精製された活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを得ることができる。
【００２４】
本発明の塩素イオンの定量法としては、改変ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる物質である過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドを直接或いは間接的に測定する方法であれば、如何なる方法も利用することができる。例えば、改変ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる過酸化水素に対し、ペルオキシダーゼの作用によりキノン色素を生成させ、その発色量より定量する方法などがある。
【００２５】
また該酵素反応により生じるグリシンにＮＡＤおよびグリシン脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部の吸光度により測定する方法などがある。
【００２６】
さらには該酵素反応により生じるホルムアルデヒドにＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部の吸光度により測定する方法などがある。
【００２７】
本発明の塩素イオン測定用試薬としては、改変ザルコシンオキシダーゼとその基質、すなわちザルコシンを含み、ザルコシンオキシダーゼの酵素反応により生じる物質を直接或いは間接的に測定するための試薬を含んでなるものであれば、如何なる方法も利用することができる。
生成する過酸化水素を測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、などのカプラー、フェノール誘導体またはアニリン誘導体などの色原体を含む。該試薬に使用するカプラーとしては４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾン等が使用される。
【００２８】
また色原体としてはフェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン類が用いられる。
【００２９】
生成するグリシンを測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ＮＡＤおよびグリシン脱水素酵素を含む。
【００３０】
生成するホルムアルデヒドを測定する塩素イオン測定用試薬は、例えば、ザルコシン、改変ザルコシンオキシダーゼ、ＮＡＤおよびホルムアルデヒド脱水素酵素を含む。
【００３１】
本発明の試薬中の酵素の添加量は、特に限定されるものではないが、好適には１０〜１００Ｕ／ｌである。該酵素の基質濃度は塩素イオンの測定に支障をきたさない限り、限定されるものではない。
【００３２】
本発明の試薬のｐＨは、酵素反応を阻害しない範囲であれば、特に限定されるものではないが、好適には緩衝液によりｐＨ５〜１０に保たれているのが好ましい。また緩衝液の種類は、塩素イオンを含有しないものであれば、いかなるものでもよい。たとえばリン酸緩衝液、酢酸グアニジン緩衝液、各種ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。
【００３３】
本発明の試薬には必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤などを使用してもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤など、特に限定されるものではなく、約０．０１〜０．５％で用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、抗生物質が用いられる。安定化剤としては、安定化効果を示すものであれば、特に限定されないが、グルコース、マンニトール、トレハロース、グルセロールなどの糖類またはアミノ酸類、アルブミンなどが用いられる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例１ ザルコシンオキシダーゼの改変
ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プラスミドｐＳＡＯＥＰ３（図１参照）を Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載の方法に従い、以下に示すようにして調製した。
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１００ｍｌの２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））で３７℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm, 10分) により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、０．５ｍｌのリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて、３７℃、３０分間保温した。次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％、塩化セシウムを約１００％加え、撹拌混合し、５５，０００ｒｐｍ、２０時間の超遠心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。
【００３５】
精製ＤＮＡ標品１μｇを制限酵素 Sau3AI （東洋紡製）で部分分解反応させ、３ｋｂｐ以上の断片に分解した後、SalIII（東洋紡製）で切断したｐＵＣ１８ ０．５μｇと M.G.Loftus らのＢＡＣＫＦＩＬＬＩＮＧ法（Biotechniques Vol12,No.2(1992)) に従い、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは Hanahanの方法により作成したエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤＮＡ１μg 当たり約 1×106 個の形質転換体のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５％ザルコシン、０．００５％パラロースアニリンおよび０．０２５％ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）で３７℃、１８時間培養し、赤色コロニーを指標にザルコシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスクリーニングした。
【００３６】
その結果、約１，０００個のコロニーのうち１株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が保有するプラスミドには、約８．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＳＡＯ１とした。次いでｐＳＡＯ１より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断してｐＵＣ１８にサブクローニングし、約１．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を有するｐＳＡ０ＥＰ３を得た。
配列表の配列番号５にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１にｐＳＡＯＥＰ３の挿入ＤＮＡ断片中にコードされているザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列をそれぞれ記載している。
【００３７】
該組換えプラスミドｐＳＡＯＥＰ３を基に、配列表の配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５の１０種のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ中の塩基を変換するキットである TransformerTM（Clonetech 製）を用い、TransformerTM のプロトコールに従い変異処理操作を行った。その結果、配列表の配列番号１記載の第１４番目のアラニンがバリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、リジンにそれぞれ置換された改変蛋白質Ａ１４Ｖ、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ａ１４Ｄ、Ａ１４Ｋ（配列表の配列番号２記載）、第１６番目のセリンがプロリンに置換された改変蛋白質Ｓ１６Ｐ（配列表の配列番号３記載）、第１７番目のメチオニンがグリシンに置換された改変蛋白質Ｍ１７Ｇ（配列表の配列番号４記載）、およびＳ１６ＰとＭ１７Ｇの二重変異である改変蛋白質Ｓ１６Ｐ＋Ｍ１７Ｇの合計１０種の改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持するプラスミドをそれぞれ作成した。
【００３８】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを種々の制限酵素で切断してサブクローンを調製し、常法に従い、SEQUENING PRO 7-deaza-dGTP kit（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定し、改変されていることを確認した。
【００３９】
それぞれの改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを保持する組換え体プラスミドでエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、形質転換体をそれぞれ得た。
【００４０】
参考例２ 形質転換体の培養と改変蛋白質の精製
２×ＹＴ培地（１．６％ポリペプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））５０ｍｌを５００ｍｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）を０．１％添加した。この培地に上記と同一組成の培地で予め３７℃で１８時間振盪培養した形質転換体の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で通気撹拌培養した。
培養液より改変蛋白質を、Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) 記載のザルコシンオキシダーゼの精製法に従い、超音波破砕、除核酸処理、硫酸アンモニウム塩析、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈｄｅｘカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの工程を順次、実施し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一のバンドを形成するまで精製した。
【００４１】
参考例３ 改変蛋白質の評価
精製された各改変ザルコシンオキシダーゼと野生型ザルコシンオキシダーゼの、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）または１０ｍＭ塩化カリウム含有0.1Mリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）におけるミハエル数Ｋｍ、ｋｃａｔ測定値を表１に示す。
【００４２】
【表１】
表１から明らかなように、Ａ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４Ｙ、Ａ１４Ｗ、Ｓ１６Ｐ、Ｍ１７Ｇの特性は、該酵素の活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることを示している。
酵素の反応性を示す指標であるＫｍ、ｋｃａｔを見ると、野生型ザルコシンオキシダーゼは活性測定系中の塩素イオンの有無にかかわらず、同等の値を示すが、Ａ１４Ｖは塩素イオン存在下で非存在下の約１．３倍、Ａ１４Ｉは塩素イオン存在下で非存在下の約３．７倍、Ａ１４Ｌは塩素イオン存在下で非存在下の約１３０倍、Ａ１４Ｙは塩素イオン存在下で非存在下の約１８０倍、Ａ１４Ｗは塩素イオン存在下で非存在下の約３４倍、Ｓ１６Ｐは塩素イオン存在下で非存在下の約８８倍、Ｍ１７Ｇは塩素イオン存在下で非存在下の約４６００倍であった。
すなわち、改変蛋白質はザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であることが明らかとなった。
【００４４】
実施例１ 改変ザルコシンオキシダーゼを用いた塩素イオンの測定
検体中の塩素イオン濃度を、下記試薬を用いて下記測定法により測定した。
試薬
第１試薬（Ｒ１）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５） ０．１Ｍ
４−アミノアンチピリン ０．０１２％
フェノール ０．０２３％
ペルオキシダーゼ ６．３Ｕ／ｍｌ
ザルコシン ０．１Ｍ
第２試薬（Ｒ２）
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５） ２０ｍＭ
改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｌ １Ｕ／ｍｌ
【００４５】
測定方法
ＫＣｌ水溶液３００ｍＭまたはＮａＣｌ水溶液３００ｍＭの１０段階希釈液を試料として、各試料を５μｌ採取し、これに上記第１試薬（Ｒ１）３１０μｌを加えて、３７℃で２分間加温後、上記第２試薬（Ｒ２）８５μｌを加えて、３７℃で３分間反応させて、５００ｎｍにおける吸光度変化を求めた。なお、ブランクは塩素イオン含有被検液の代わりに蒸留水を用いた。
塩濃度と吸光度との関係（希釈直線性）を図２，３に示す。図２はＫＣｌ、図３はＮａＣｌの場合を示す。
図２，３から明らかなように、活性発現が塩素イオン濃度に依存的である改変ザルコシンオキシダーゼを用いる塩素イオンの定量法により、短時間に正確かつ簡単に塩素イオンを測定することが可能となる。
【００４６】
実施例２ 他イオンの影響
実施例１の塩素イオンの測定系における他イオンの影響を調査した。表１に示すように、検体（ＫＣｌ，１００ｍＭ水溶液）に種々のイオンを含有させ、塩素イオン濃度を測定したところ、カルシウムイオンを含めて、他のイオンの測定値への影響は見られなかった。
【００４７】
【表２】
【発明の効果】
本発明のザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を利用した新規な塩素イオンの定量法により、試料中の塩素イオン量を正確、迅速に測定することができる。
【００４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pSAOEP3の制限酵素地図を示す。
【図２】塩素イオン（ＫＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
【図３】塩素イオン（ＮａＣｌ）測定の希釈直線性を示す。
Claims (10)
- 試料に、ザルコシンおよびザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を水および酸素の存在下に作用させ、生成する過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドあるいは消費する酸素を測定することにより、試料中の塩素イオン濃度を測定することを特徴とする塩素イオンの測定方法であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼである塩素イオンの測定方法。
- ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗである請求項１記載の塩素イオンの測定方法。
- 試料に、ザルコシンおよびザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を水および酸素の存在下に作用させ、生成する過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドあるいは消費する酸素を測定することにより、試料中の塩素イオン濃度を測定することを特徴とする塩素イオンの測定方法であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＳ１６Ｐである塩素イオンの測定方法。
- 試料に、ザルコシンおよびザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を水および酸素の存在下に作用させ、生成する過酸化水素、グリシンまたはホルムアルデヒドあるいは消費する酸素を測定することにより、試料中の塩素イオン濃度を測定することを特徴とする塩素イオンの測定方法であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＭ１７Ｇである塩素イオンの測定方法。
- ザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフェノール誘導体またはアニリン誘導体を含む塩素イオン測定用試薬であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列、第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列、または第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する、塩素イオン測定用試薬。
- ザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびホルムアルデヒド測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列、第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列、または第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する、塩素イオン測定用試薬。
- ザルコシン、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質およびグリシン測定用試薬を含む塩素イオン測定用試薬であって、ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンが他の中性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列、第１６番目のセリンがプロリンに置換されたアミノ酸配列、または第１７番目のメチオニンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有する、塩素イオン測定用試薬。
- ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗである請求項７記載の塩素イオン測定用試薬。
- ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗである請求項５記載の塩素イオン測定用試薬。
- ザルコシンオキシダーゼ活性発現が塩素イオン濃度に依存的であるザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質が、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）由来のザルコシンオキシダーゼを構成するアミノ酸配列（配列表・配列番１）の第１４番目のアラニンがイソロイシン、ロイシン、チロシンまたはトリプトファンに置換されたアミノ酸配列を有する改変ザルコシンオキシダーゼＡ１４Ｉ、Ａ１４Ｌ、Ａ１４ＹまたはＡ１４Ｗである請求項６記載の塩素イオン測定用試薬。
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