JP3686977B2 - Anti-uracil monoclonal antibody and hybridoma producing the same - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発明はさらに該モノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法に関する。
【０００２】
本発明のモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫化学的測定法によれば、血液や尿などの生体試料中に存在するウラシルを特異的に検出測定することができ、これにより、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼが遺伝的に欠損している者を選別することができる。
【０００３】
該酵素欠損者に対して、フッ化ピリミジン系抗腫瘍剤の投与は禁忌である。従って、本発明は、癌患者に対する抗腫瘍剤治療において安全な治療法を選択するツールとしての意味において特に有用である。
【０００４】
背景技術
現在、抗腫瘍剤の一つとして、フルオロウラシルなどのフッ化ピリミジン系化合物が利用されている。しかしながら、癌患者の中には、その化合物の分解系代謝に関与する酵素であるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：以下、ＤＰＤと略する。）が遺伝的に欠損している者が存在しており（白人乳ガン患者の約３％）、該ＤＰＤ欠損患者にフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤を投与した場合には、死にいたる副作用がおこることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６３３，４００−４０９（１９８０））。
【０００５】
通常、生体内において、ウラシル又はチミンは、ＤＰＤの働きによって、それぞれジヒドロウラシル又はジヒドロチミンに代謝されるが、ＤＰＤ欠損患者はそれらが代謝されずに、血液又は尿中に多量のウラシル及びチミン、特にウラシルが多量に排出されることが知られている（Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２５３Ａ，１１１−１１８（１９８９））。
【０００６】
従って、フッ化ピリミジン系抗腫瘍剤を癌患者に投与する前に、血液中又は尿中のウラシル又はチミン、特にウラシルの存在を測定することができれば、予めＤＰＤ欠損癌患者を選別することができ、その結果、抗腫瘍剤の投薬量を減量または中止して重篤な副作用の発生を回避することが可能となる。
【０００７】
従来、ウラシルを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６７２（１９９５），２３３−２３９）。しかし、この方法ではサンプルの調製が煩雑で多大の手間と修練を必要とする。また、多検体を測定するには非常に長時間を要し、更に測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の欠点がある。従って、検出感度が高く、迅速性、簡便性及び経済性を具備した新しいウラシル測定法が求められる。
【０００８】
また、本発明の類似技術として、特公平４−２１４７９号公報にはシュードウリジン（ｐｓｅｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）に対するモノクローナル抗体を用いた免疫測定法が記載されている。ここで用いられるモノクローナル抗体は、ウラシルに対して３０〜４０％の反応性を有するが、元来進行癌患者の尿中に増加するシュードウリジンを腫瘍マーカーとして検出するために開発されたものであり、シュードウリジンに対して９５〜９９％もの高い反応性を示す。このため、かかるウラシルとシュードウリジンとの間で交差反応性を有するモノクローナル抗体を用いては、癌患者を対象としてＤＰＤ欠損者とＤＰＤを欠損していない正常者とを区別することは不可能である。
【０００９】
従って、特に癌患者においてＤＰＤ欠損者と正常者とを選別するためには、ウラシルの生体内代謝物であるジヒドロウラシル、並びに腫瘍マーカーとして用いられるシュードウリジンに対して交差反応することなく、ウラシルを特異的に検出できる方法が求められる。
【００１０】
本発明は、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体、並びに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とするものである。
【００１１】
本発明はさらに該抗ウラシルモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、簡便、迅速でかつ特異的なウラシルの免疫化学的測定法を提供することを目的とする。
【００１２】
発明の開示
本発明者は、免疫原としてウラシル若しくはその誘導体にシュレッパー（Ｓｃｈｌｅｐｐｅｒ）を結合した抗原を用いて抗体産生細胞を調製し、これから細胞融合技術によってハイブリドーマを作成して、該ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の特性を調べていたところ、得られたモノクローナル抗体が、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては反応せず、ウラシルに対して特異的に反応する性質を有していることを見出した。かかる知見に基づいて、本発明者は、更なる研究により、該モノクローナル抗体のかかる特性を利用することによって、尿中に排泄されるウラシルを、該サンプルを前処理することなく、免疫化学的測定法によって選択的に、しかも迅速かつ簡便に測定することができることを確認して本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、第一に、本発明は、ウラシルに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生しかつ分泌するハイブリドーマ、並びにその調製方法に関する。
【００１４】
具体的には、該ハイブリドーマは、ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を免疫原として用いて作成される動物由来の抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させて得られるものであって、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する性質を有するものである。
【００１５】
なお、かかる本発明のハイブリドーマの態様として次のものが挙げられる。
（１）産生されるモノクローナル抗体が、ウラシルに反応しシュードウリジン及びジヒドロウラシルに反応しない特性を有するものである、上記ハイブリドーマ。
（２）用いられる抗体産生細胞が、インビトロで動物由来の脾細胞にウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を接触させ、免疫化して調製されるものである、上記ハイブリドーマ。
（３）動物由来の抗体産生細胞が、マウス由来の脾細胞を起源とするものである、上記ハイブリドーマ。
（４）シュレッパーに結合するウラシル若しくはその誘導体が、ウラシル；ウラシル−４−酢酸；１−カルボキシメチルウラシル、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル又は５−フルオロ−１−カルボキシメチルウラシル等のカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体；ウラシル−５−カルボン酸、ウラシル−６−カルボン酸又はウリジン−６−カルボン酸等のカルボキシル基を有するウラシル誘導体；ウリジンジアルデヒド、ウリジン５’−リン酸、ポリウリジン酸、Ｎ−カルバミル−β−アラニン、オロチジン５’−リン酸及びウリジン５’−ジホスホグルクロン酸からなる群から選択される少なくとも１種である、上記ハイブリドーマ。
（５）シュレッパーが、スカシガイのヘモシアニン又はウシ血清アルブミンである、上記ハイブリドーマ。
（６）免疫原として用いるウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物が、ウラシル−ヘモシアニン複合体、ウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、１−カルボキシメチルウラシル−ヘモシアニン複合体、１−カルボキシメチルウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ヘモシアニン複合体、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、ウリジンジアルデヒド−ヘモシアニン複合体及びウリジンジアルデヒド−ウシ血清アルブミン複合体からなる群から選択される少なくとも１種である、上記ハイブリドーマ。
（７）用いられるミエローマがマウスから得られる骨髄腫株化細胞である上記ハイブリドーマ。
（８）通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（日本国）に寄託されているものであって、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−６１４１である上記ハイブリドーマ。
【００１６】
第二に、本発明は、上記いずれかのハイブリドーマによって産生される、ウラシルに対して特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。好適には、ウラシルに反応し、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに反応しない特性を有するモノクローナル抗体である。
【００１７】
第三に、本発明は、上記いずれかの抗ウラシルモノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法に関する。
【００１８】
かかるウラシルの免疫化学的測定法の具体的な態様としては、上記抗ウラシルモノクローナル抗体とウラシルの存在が疑われる被検試料とを接触させ、放射性同位元素免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光抗体法又は凝集反応法のいずれかの方法を用いて、被検試料中のウラシルを検出又は定量することを特徴とする方法；
又は下記：
（ａ）ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物からなる抗原を任意の担体に固定化した固相化物（以下、固相化抗原ともいう。）を含む反応系に、疑ウラシル含有被験試料及び上記モノクローナル抗体を配合する工程、
（ｂ）抗原−抗体複合体を形成させる条件下で、上記反応物をインキュベーションする工程、
（ｃ）固相化抗原−抗体複合体に第二抗体を反応させる工程、及び
（ｄ）第二抗体と結合した固相化抗原−抗体複合体を検出する工程
を含むウラシルの免疫化学的測定法が挙げられる。
【００１９】
まず、第一の発明である、ウラシルに対して特異的なモノクローナル抗体を合成し分泌する特性を有するハイブリドーマ、並びにその調製法について説明する。
【００２０】
本発明のハイブリドーマの調製にあたり、免疫原として用いられるウラシル若しくはその誘導体は、特に制限されないが、それ自体では免疫原性が非常に弱いため、適当なシュレッパーに結合させてウラシル（若しくはその誘導体）−シュレッパー複合体として用いられることが望ましい。
【００２１】
ここでシュレッパーとは、担体のことであり、免疫原性が非常に弱いか、またはハプテン基のように単独では抗体生産能をもたない物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）と結合して、免疫原性を増強するか、または発現させる物質をいう。
【００２２】
シュレッパーとしては、一般には分子量の比較的大きなタンパク質が用いられるが、その他、赤血球などの細胞や、多糖体なども用いられる。シュレッパーの例としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミンなどが挙げられるが、特にＫＬＨ又はＢＳＡが好ましい。
【００２３】
本発明では、免疫原として、ウラシル−シュレッパー複合体のウラシルに替えてウラシル誘導体を用いたウラシル誘導体−シュレッパー複合体を用いることもできる。ウラシル誘導体としては、特に制限されないが、通常ウラシル−４−酢酸、１−カルボキシメチルウラシル，５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル及び５−フルオロ−１−カルボキシメチルウラシル等のように置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体、ウラシル−５−カルボン酸，ウラシル−６−カルボン酸及びウリジン−６−カルボン酸等のように置換基としてカルボキシル基を有するウラシル誘導体のほか、ウリジンジアルデヒド、ウリジン５’リン酸、ポリウリジン酸、Ｎ−カルバミル−β−アラニン、オロチジン５’−リン酸、ウリジン５’−ジホスホグルクロン酸等を例示することができる。好適なウラシル誘導体としては、置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体、置換基としてカルボキシル基を有するウラシル誘導体、ウリジンジアルデヒド及びウリジン５’−リン酸を挙げることができ、より好適には置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体及びウリジンジアルデヒドを挙げることができる。また特に好適なウラシル誘導体としては、１−カルボキシメチルウラシル、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル、ウリジンジアルデヒドを挙げることができる。
【００２４】
ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合は、特に制限はされないが、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０−１０９４（１９５４））または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））等の公知の方法によって行うことができる。また、簡便な方法として、イムジェクト イムノーゲン ＥＤＣ コンジュゲーション キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、添付のマニュアルに従って結合させる方法を挙げることもできる。
【００２５】
抗体産生細胞は、上記免疫原を常法に従って動物に接種するか又は動物細胞と接触させて、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化することによって調製できる。本発明において好適にはインビトロ免疫法（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）が用いられる〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６），１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，Ｐｔ．Ｉ），２７−３３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８２），５３，２６１−２９１等〕。
【００２６】
かかるインビトロ免疫法として、具体的には、３〜１０週令の動物から脾臓を取り出して、脾臓から調製した脾細胞をインビトロで、ウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体とともにインキュベーションして感作させる方法を挙げることができる。このとき、細胞の免疫性能を高めるためにロムルチド，ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）等のムラミルジペプチド誘導体、又はリポ多糖等を用いることが好ましい。より好ましくは、ムラミルジペプチド誘導体の使用である。
【００２７】
上記脾臓の由来は特に制限されず、広くマウス、ラット、ウマ、ヤギ又はウサギ等の動物に由来する脾臓を用いることができる。すなわち、本発明で用いる抗体産生細胞の由来細胞は、上記動物の脾細胞の中から、ミエローマとの適合性等を考慮して適宜選択して用いることができる。好ましくは、マウス由来の脾細胞である。
【００２８】
上記抗体産生細胞と融合されるミエローマ細胞としては、特に制限されることなくマウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギ又はヒト等に由来するものを広く挙げることができる。好適には、用いる抗体産生細胞と同種の動物に由来するものであることが望ましく、例えばマウスに由来するミエローマ細胞を挙げることができる。
【００２９】
例えば、抗体産生細胞がマウスの脾細胞に由来する場合、その融合の相手としては、マウスから得られた骨髄腫株化細胞を用いることが好ましい。具体的には８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であり、かかるものとしては、例えばＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）〕、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１ １−７（１９８７）〕、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）〔Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等を挙げることができる。好ましくは、Ｐ３Ｕ１細胞である。
【００３０】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、公知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８，５１２２−５１２６（１９８１）に記載の方法又はこれらに準する方法によって行うことができる。
【００３１】
より具体的には、細胞融合は、上記抗体産生細胞及びミエローマ細胞を、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中に共存させることによって行われる。融合促進剤としては、特に制限されることなく通常用いられるもの、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等を使用することができるが〔細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）等〕、好ましくは細胞毒性が比較的少なく、融合操作が簡単なＰＥＧである。また所望により、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を併用することもできる。
【００３２】
また、上記融合促進剤を用いた融合法（例えば、前述するポリエチレングリコール法）に代えて、電気処理による融合方法（電気融合法）を適宜採用することもできる。
【００３３】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との使用比率としては、通常の方法と同様の割合を使用することができ、例えばミエローマ細胞に対して抗体産生細胞を２〜１０倍程度用いればよい。好ましくは４〜７倍程度を挙げることができる。
【００３４】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体生産能および増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、通常の選択用培地を用いる培養によって行うことができる。
【００３５】
ここで選択用培地としては、例えば、ミエローマ細胞株として８−アザグアニン耐性株を使用する場合には、ＨＡＴ培地を挙げることができる。かかるＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の未融合細胞等が死滅するのに十分な期間、通常３〜１０日間行えばよい。
【００３６】
かくして得られるハイブリドーマは、次いで、通常の方法に従って、目的とする抗ウラシルモノクローナル抗体を産生する株のスクリーニング、クローニングの工程に供される。
【００３７】
抗ウラシルモノクローナル抗体産生株のスクリーニングは、上記の如くして得られたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、これを試料として、一般に抗体検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁〜第５３頁、昭和５７年３月５日）、例えば、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）を用いて、その中に含まれるウラシルを検出、確認することによって行うことができる。なお、抗体検出方法としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応及びオクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等を挙げることができるが、感度、迅速性、正確性、安全性、自動化等の観点から、ＥＬＩＳＡ法を利用することが好ましい。
【００３８】
抗ウラシルモノクローナル抗体産生株のスクリーニングは、より具体的には、例えば、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）抗原としてウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体を担体に吸着させ、固相化する。
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）この中にウラシルを含む試料とハイブリドーマ培養上清液を加え、ハイブリドーマ培養上清液に含まれるモノクローナル抗体を固相化抗原及び遊離ウラシルと競合的に結合させて、固相化抗原−抗体複合体及び遊離ウラシル−抗体複合体を生成させる。
（ｄ）遊離ウラシル−抗体複合体を洗浄除去して、固相化抗原−抗体複合体に酵素で標識化された第二抗体を反応させる。
（ｅ）該酵素に対して適当な基質を用いて酵素反応させ、吸光度を測定する。
【００３９】
なお、上記（ａ）工程において、固相化抗原として用いられるウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体としては、前述する各種の免疫原を利用することができる。
【００４０】
尚、固相化抗原として、基本的には抗体産生細胞の調製に用いた免疫原と同一物を用いるのが好ましい。しかし、ウラシル又はウラシル誘導体と結合してなるシュレッパーは、固相化抗原と免疫原とで必ずしも同一でなくてもよく、例えばウラシル−ＢＳＡ複合体を免疫原として用いる一方で、ウラシル−ＫＬＨを固相化抗原に用いることも可能である。
【００４１】
抗原を固相化する担体としては、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン又はポリビニール製のマイクロプレート又はビーズが挙げられるが、９６穴マイクロプレートを用いるのが好ましい。抗原の濃度は特に制限されず広い範囲から適宜選択できるが、通常０．０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５〜５μｇ／ｍｌの範囲が適している。また、その容量は、担体として９６穴マイクロプレートを使用する場合にはウエルの底面を覆うのに十分な量であればよく、通常１ウエルあたり２０〜１５０μｌ程度が望ましい。
【００４２】
吸着条件は、特に制限はないが、通常４〜４０℃程度で１時間〜一晩程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で２時間程度の静置である。
【００４３】
（ｂ）工程において、ブロッキングに使用されるタンパクとしては、例えば、子牛血清、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等が使用でき、好ましくは子牛血清である。ブロッキングの条件は、特に制限はないが、通常４〜４０℃程度で１時間〜一晩程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で２時間程度の静置である。ブロッキング後、マイクロプレートを緩衝液で洗浄する。ここで用いられる緩衝液としては、特に制限はされないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３〜７．７）が適している。
【００４４】
（ｃ）工程において、具体的条件としては特に制限はないが、通常室温〜４０℃程度で０．５〜３時間程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で１時間程度である。反応後、マイクロプレートを緩衝液で洗浄する。ここで用いられる緩衝液としては、特に制限はされないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７）が適している。
【００４５】
（ｄ）工程において、第二抗体としては、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＳ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ウレアーゼなどの酵素で標識した酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体が使用できる。好ましくは、ＡＰ標識抗マウス免疫グロブリン抗体である。第二抗体は通常希釈して使用されるが、ウラシル−シュレッパー複合体を介してマイクロプレートに結合したモノクローナル抗体（第一抗体）に対して約１００〜１０，０００倍、好ましくは約２００〜５００倍となるように希釈した第二抗体を用いることが望ましい。その希釈には例えば１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７）を用いることが望ましい。反応は、特に制限されないが通常約３７℃で約１時間程度行なわれ、反応後、緩衝液で洗浄する。
【００４６】
以上の反応により、第二抗体が、固相化抗原を介してマイクロプレートに結合したモノクローナル抗体に結合する。
【００４７】
（ｅ）工程において、結合した第二抗体の酵素と基質との反応によって、基質を発色させるか又は該反応系に更に発色試薬を加えて、吸光度の変化を測定する。より具体的には、例えば、第二抗体に結合させる標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として用いて酵素反応によって発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。一方、第二抗体に結合させる標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用することが望ましい。この場合、特に制限されないが、通常、発色試薬溶液を加え約２５℃で約１０分間反応させた後、４Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる方法が用いられる。発色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、ここで、アビジン−ビオチンシステムによる増感法を利用することもできる。
【００４８】
次いで、以上述べたスクリーニングによりウラシルに特異的なモノクローナル抗体を産生することが判明したハイブリドーマについて、クローニングを行う。
【００４９】
クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法、軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法、マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。簡単であることから限界希釈法が好適に用いられる。
【００５０】
抗体価の認められたハイブリドーマを含むウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１〜４回繰り返して、安定して抗体価が認められたものを、抗ウラシルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００５１】
上記方法によって取得される本発明のハイブリドーマは、例えば１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、例えば５×１０６細胞／ｍｌ以上において、必要に応じて凍結安定化剤として１０％ジメチルスルホキシドを用いて、凍結することによって−８０℃以下、例えば液体窒素中に−１９５℃で保存することができる。
【００５２】
本発明のハイブリドーマは、後述するようにＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、ウラシルに対して特異的反応性を有するモノクローナル抗体を産生、分泌する。更に、これらの細胞系は液体窒素中に安定に貯蔵し、それから容易に回収することができる。すなわち、本発明のハイブリドーマは、ウラシル抗原に対して反応する純粋なモノクローナル抗体の、入手容易な供給物として有用である。
【００５３】
なお、かかるハイブリドーマは、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に住所を有する通商産業省工業技術院生命工学技術研究所に、１９９７年１０月１４日に微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＵ−１」、（受託番号）「ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４１」として寄託されている。
【００５４】
次に、第二の発明であるウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体について説明する。
【００５５】
当該モノクローナル抗体は、上記方法によって得られる本発明のハイブリドーマにより産生されるものである。
【００５６】
かかるモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを培養することによって調製することができる。
【００５７】
ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ等を基本培地として挙げることができる。好ましくはＲＰＭＩ１６４０である。また、該培地に細胞増殖・分化を促進させるためにウシ胎児血清、ヒトトランスフェリン等を添加し、細胞増殖の促進のために１０％ＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）及び／又はエネルギー源の補給のためにＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム等を添加することが可能である。
【００５８】
ハイブリドーマの培養は、例えばＣＯ２濃度４〜６％程度及び３６〜３８℃で培養するが好ましい。大量培養は大型培養ビンを用いた回転培養等によって行われる。
【００５９】
この培養上清液をそのまま抗ウラシルモノクローナル抗体ソースとして使用することもできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、イムノグロブリン画分を集め、また所望により更に該画分を精製することによって抗ウラシルモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６０】
上記する画分の精製方法としては、特に制限されないが、ＤＥＡＥ−セファロースカラム等を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ−セファロースカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィー等を含む高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用方法を使用することができる。
【００６１】
上述の操作により得られる本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体は、上述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法等を利用して、その交差反応性を評価することができる。該評価は、具体的には上記ＥＬＩＳＡ法において競合反応の際にウラシルに代えて交差反応を調べる化合物をウェルに添加することによって行うことができる。
【００６２】
かかる交差反応性の評価によって、実施例で述べるように、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体は、ウラシルに反応するものの、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対してはほとんど交差反応せず、ウラシルに対して特異性を有していることが判明した。
【００６３】
このように本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対して高い反応性を有しており、さらにそれは本発明のハイブリドーマを培養することによって均一かつ大量に供給できるため、ウラシルを免疫化学的に特異的に検出測定するための試薬として有用である。また当該モノクローナル抗体は、ウラシルの精製にも用いることができる。
【００６４】
特に本発明のモノクローナル抗体が有する反応特異性は、癌患者の尿中に夾雑物質として存在し得るシュードウリジン及びジヒドロウラシルに対して反応しないというものであるため、本発明のモノクローナル抗体は、特に癌患者を対象として、ＤＰＤの欠損に起因してウラシルを尿中に排泄するＤＰＤ欠損者とＤＰＤを欠損していない正常者とを選別するのに有用である。
【００６５】
従って、本発明の第三は、上記本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法である。
【００６６】
免疫化学的測定法は、抗体が抗原を特異的に認識することに起因する抗原−抗体反応に基づいて、被験試料中に含まれる抗原を検出測定する方法であり、精度、簡便性、迅速性、経済性において優れているため、生化学的試験や臨床診断等の分野で広く採用されている。
【００６７】
免疫化学的測定法としては、公知の方法を広く挙げることができ、具体的には前述するように、例えばＲＩＡ法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、血液凝集反応法等を例示することができる。好適には、ＥＬＩＳＡ法であり、その有用性については〔Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，”Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮＯ−７２０４−４２００−１（１９９０）〕に詳細に記述されている。
【００６８】
なお、各免疫化学的測定法における操作、手順は、第一抗体として本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を使用する以外は、基本的に常法に従って行うことができる。
【００６９】
本発明の免疫化学的測定法は、ウラシルの存在が疑われる被検試料を対象として、それに含まれるウラシルを特異的に検出若しくは測定（定量）するものであれば、その具体的な目的及び適用対象等を問うものではない。例えばジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）欠損者をそれを欠損しない正常者と識別する等といった臨床診断を目的とする場合は、被験試料として尿、血清、血漿等の体液が用いられる。
【００７０】
尿等の生体被験試料は、そのまま本発明の免疫化学的測定法に供することもできるが、予めイオン交換樹脂等で処理しておくこともできる。
【００７１】
本発明の免疫化学的測定法として、好適には、被験者の生体試料を本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体とともに、抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベーションする工程、及び形成された抗原−抗体複合体を検出する工程を基本的に包含する測定法を挙げることができる。かかる免疫化学的測定法の設計は、直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法等といった本発明の技術分野で通常行われている多くの改変を伴うことができる。
【００７２】
より具体的には、ヒト尿サンプルを被験試料とする固相化ＥＬＩＳＡ法を例にすると、ウラシルの検出測定法は例えば次の方法で行うことができる。
【００７３】
まず、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を任意の担体に固相化しておき、抗原と無関係な蛋白質により、該抗体で覆われていない固相表面を覆う。該表面を洗浄後、被験試料としての尿サンプルと酵素標識抗原、例えば酵素で標識されたウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体を加え、競合反応させる。これに酵素基質を加え、被験試料の添加による吸光度の減少を測定する。具体的には、被験試料の添加による吸光度の減少の有無を測定することにより尿サンプル中のウラシルの存在の有無が判定でき、また被験試料の添加による吸光度の減少の程度を測定することによって、予め既知量のウラシルを用いて作成した標準線から、尿サンプル中のウラシルの量を定量することができる。
【００７４】
また、すでに述べた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、ウラシルを含む試料の代わりに尿サンプルを、またハイブリドーマ培養上清液の代わりに本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を用いる方法を用いることもできる。かかる間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば、本発明のモノクローナル抗体は、被験試料中のウラシルの量を、１００〜１０００μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。
【００７５】
上記免疫化学的測定法を実施するに際しては、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を含有する試薬キットを利用することが簡便である。
【００７６】
従って、本発明は、上記本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を含むウラシルの免疫化学的測定用の試薬キットに関連するものでもある。
【００７７】
具体的には、被検試料中のウラシルを検出又は定量するために用いられる試薬キットであって、上記いずれかのモノクローナル抗体を少なくとも含むことを特徴とするウラシルの免疫化学的測定用試薬キット、または上記いずれかの抗ウラシルモノクローナル抗体に加えて更にウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を含むことを特徴とするウラシルの免疫化学的測定用試薬キットである。なお、ここで被検試料としては尿サンプルが好適に用いられる。
【００７８】
本発明の試薬キットは、抗ウラシルモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とするものであるが、当該有効成分に加えて、固相担体、標識剤、標識剤に応じた基質（検出用試薬）、抗原、二次抗体（例えば抗マウスイムノグロブリンなど）の中から選択される少なくとも一乃至五を組み合わせたもののセットであってもよい。なお、ここで抗原として、好適にはウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの複合体が挙げられる。また固相担体、標識剤、標識剤に応じた基質（検出用試薬）、二次抗体としては、前述するものを用いることができる。
【００７９】
セット中に標識剤が含まれる場合は、該標識剤は予め二次抗体等の任意成分にコンジュゲートされていてもよい。なお、標識剤としては放射性同位元素、酵素、蛍光物質などの種々の化合物が挙げられるが、操作性等の種々の観点から酵素が好ましい。
【００８０】
さらに、当該試薬キットには、測定の実施の便宜のために、適当な抗体若しくは抗原の希釈液、反応希釈液、緩衝駅、洗浄剤、基質溶解剤、反応停止液、固相吸着抑制剤等が含まれていてもよい。
【００８１】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の説明のために実施例を記載するが、当該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１
１：免疫原の調製
イムジェクト イムノーゲン ＥＤＣ コンジュゲーション キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、ウラシル−ＢＳＡ複合体又はウラシル−ＫＬＨ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
（Ａ）ウラシル−ＢＳＡ複合体の作製
１）キットに添付されているＢＳＡを注射用水（大塚製薬工場社製）２００μｌに溶解した。
【００８２】
２）ウラシル２ｍｇをキットに添付されている緩衝液（５００μｌ）に溶解させた。
【００８３】
３）１）の溶液に２）の溶液を加えた。
【００８４】
４）３）の溶液をキットに添付の１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１０ｍｇに加えた。
【００８５】
５）４）の溶液を室温で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【００８６】
６）５）で得られた溶液をキットに添付されているＤ−ソルト デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウラシル−ＢＳＡ複合体溶液とした。
【００８７】
７）得られた複合体について、蛋白質分解酵素で分解し、その分解物をＨＰＬＣを用いて分析することにより複合体の組成を求めた。その結果、ＢＳＡ：ウラシル（モル比）＝１：０．１６〜０．７２であることが確認された。
（Ｂ）ウラシル−ＫＬＨ複合体の作製
１）キットに添付されているＫＬＨを注射用水（大塚製薬工場社製）２００μｌに溶解した。
【００８８】
２）ウラシル２ｍｇをキットに添付されている緩衝液（５００μｌ）に溶解させた。
【００８９】
３）１）の溶液に２）の溶液を加えた。
【００９０】
４）ＥＤＣ１０ｍｇを注射用水１ｍｌに溶解させ、その溶液の５０μｌを３）の溶液に加えた。
【００９１】
５）４）の溶液を室温で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【００９２】
６）５）で得られた溶液をキットに添付されているＤ−ソルト デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウラシル−ＫＬＨ複合体溶液とした。
【００９３】
７）得られた複合体について、蛋白質分解酵素で分解し、その分解物をＨＰＬＣを用いて分析することにより複合体の組成を求めた。その結果、ＫＬＨ：ウラシル（モル比）＝１：２であることが確認された。
２：インビトロ免疫法による免疫細胞（抗体産生細胞）の作製
（Ａ）脾細胞の調整
ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹から脾臓を摘出し、直径６ｃｍのプラスチックシャーレに入れた。このプラスチックシャーレにＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ注ぎ入れ、摘出した脾臓を洗った。別に５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を入れた直径６ｃｍのプラスチックシャーレを２枚用意し、この中でさらに２回洗った。以上の洗浄操作をさらにクリーンベンチ内で同様に繰り返した。最後に移したシャーレの中で脾臓をつぶし、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させた。この細胞懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌに懸濁させ、そのまま３分間室温で静置した。遠心管の底に沈んだ組織片を吸い取らないように細胞懸濁液を５０ｍｌの遠心管に移した。以上の操作で調製した細胞を次のインビトロ免疫法に用いた。
（Ｂ）インビトロ免疫法
（Ａ）で調製した脾細胞の細胞数を血算板を用いて算定し、生細胞で１×１０７細胞／ｍｌになるよう、ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。この細胞懸濁液を６ウェル平底プレートに２．５ｍｌ／ウェルで播いた。そこに２５０μｇ／ｍｌのノピア（登録商標、一般名：ロムルチド、第一製薬製）を１００μｌ／ウェルで加え混和し、上記１：（Ｂ）で得られ、系列希釈したウラシル−ＫＬＨ複合体溶液を１００μｌ／ウェル加え混和した後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間静置した。
【００９４】
なお、系列希釈は、２５００ｎｇ／ｍｌ，５００ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，２０ｎｇ／ｍｌ，４ｎｇ／ｍｌとなるように行った。
【００９５】
その後、４０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２．５ｍｌ／ウェル加え、混和し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養し、感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）を得た。
３：細胞融合
（Ａ）ミエローマ細胞の調整
ミエローマとして８−ダザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株化細胞であるＰ３Ｕ１細胞を用いた。Ｐ３Ｕ１細胞は予め１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日おきに継代培養しておいた。
【００９６】
継代培養１日目のＰ３Ｕ１細胞を５０ｍｌ遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清液を取り除き、沈殿したＰ３Ｕ１細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。かかる操作で調製したミエローマ（Ｐ３Ｕ１細胞）を細胞融合に用いた。
（Ｂ）感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の調整
上記２：（Ｂ）で５日間培養し、免疫した脾細胞（抗体産生細胞）をピペツトで懸濁し、プレートに付着していない脾細胞を５０ｍｌの遠心管にひとまとめにして回収した。これを１０００ｒｐｍ、４℃で７分間遠心した。上清液を取り除き、沈殿した細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。以上の操作で調製した感作細胞群を次の細胞融合に用いた。
（Ｃ）細胞融合
（Ａ）で調製したＰ３Ｕ１細胞と（Ｂ）で調製した感作細胞群の細胞数を数え、Ｐ３Ｕ１細胞（細胞数）：感作細胞群（細胞数）＝１：５の割合で混和し、室温にて１５分間静置した。その後、１０００ｒｐｍ、室温で遠心し（７分間）、上清を除去した。遠心管をたたいて沈殿した細胞をほぐした。ほぐれた細胞の入った遠心管を回転させながら、１０秒間、総細胞数２×１０８個あたり１ｍｌ容量の５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を添加し、そのまま５０秒間回転を続けた。引き続き遠心管を回転させながら、１５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３分間で添加し、さらに２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１分間で添加した。遠心管のスクリューキャップを閉じ、上下に２〜３回転倒させ、内容液を均一にし、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心した。上清を取り除き、沈殿を１０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地に懸濁させた（感作細胞として１．６×１０６個／ｍｌとした）。この細胞懸濁液を２００〜２５０μｌ／ウェルとなるように９６穴平底プレートにまいた。３７℃、５％ＣＯ２下で静置しながら、１２日間培養した。
４：ハイブリドーマの選択
３：で得られたハイブリドーマ細胞について、以下の操作を行った。
（Ａ）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
９６穴イムノプレートに１：（Ａ）で得られたウラシル−ＢＳＡ複合体２０μｇ／ｍｌ（ＢＳＡ換算）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で２時間放置した。放置後、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬工業製、Ｔｗｅｅｎ２０相当品）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７、日水製薬製；以下、ＰＢＳ−Ｔと称する。）で７回洗浄した後、６０％子牛血清２００μｌを入れ、３７℃で２時間放置した。
【００９７】
その後ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、ウェルに、
（ｉ）３：で得られたハイブリドーマ培養上清液３０μｌとＰＢＳ３μｌとを混合し、３７℃で１時間反応させた液、
（ｉｉ）予めハイブリドーマ培養上清液３０μｌと１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解させたウラシル溶液３０μｌとを混合し、３７℃で１時間反応させた液、または
（ｉｉｉ）１μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で入れ、３７℃、１時間放置した。次いで該ウェルをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡで３００倍希釈したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウス多価免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）を基質緩衝液に溶解した溶液を１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で３０分放置した後、２Ｎ ＮａＯＨ５０μｌ／ウェル入れてプレートミキサーで混合して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９８】
なお、吸収率は、以下の式により計算した。
【数１】
（ｉｉ）ＯＤｕｒａｃｉｌ ：ハイブリドーマ培養上清をウラシルで前処理した時のＥＬＩＳＡの吸光度
（ｉｉｉ）ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ：正常マウスＩｇＧのみで処理した時のＥＬＩＳＡの吸光度
上記測定により、測定感度の高いものを選別した。
（Ｂ）上記スクリーニングによる選別の結果、５種のモノクローナル抗体産生細胞（３Ｃ１０、１Ｃ４、４Ｅ３、３Ｄ５、１Ｃ５）が得られた。そのうちの１つである４Ｅ３を「Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＵ−１」として、ブタペスト条約に基づき、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号：微工研条寄第６１４１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４１））。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。
【００９９】
具体的には、４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１００】
得られたクローンを４：（Ａ）に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、数個のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマがウラシルに特異的な抗体を産生する細胞としてクローン化された。
６：抗ウラシルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの保存
得られたハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ１６４０培地において１×１０７細胞／ｍｌとなるように調製し、クライオチューブ（ヌンク社製）に１ｍｌずつ分注した。これを−９０℃のディープフリーザーで凍結後、液体窒素中に保存した。
実施例２ モノクローナル抗体の調製及びその評価
実施例１の４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＵ−１」の細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（ベーリンガー社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１０１】
得られたハイブリドーマ培養上清液を用いて、実施例１の４：（Ａ）に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に準じて、本発明のモノクローナル抗体ＳＵ−１の反応性を調べた。
【０１０２】
具体的には、ウラシル−ＢＳＡ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を５０μｌづつ９６穴イムノプレート（イムノプレートＩ、Ｎｕｎｃ社製）に分注し、３７℃で２時間放置した後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有したＰＢＳ−Ｔを２００μｌ／ウエル用いて、合計７回洗浄した。次いで、ブロッキングとして、上記ウェルに３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜静置した後、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄して、プレートを調製した。
【０１０３】
一方、（ｉ）３０μｌのハイブリドーマ培養上清にＰＢＳを３０μｌ加えたもの、（ｉｉ）３０μｌのハイブリドーマ培養上清にウラシル（３０−１０００μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳを３０μｌ加えて３７℃で１時間放置したもの、または（ｉｉｉ）１μｌ／ｍｌの正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で上記の抗原を吸着させた９６穴プレートに添加し、３７℃１時間放置した。次に、これをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウス抗体（二次抗体、Ｓｉｇｍａ社製）５０μｌ／ウェルを添加し、３７℃で１時間放置した。次にＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、酵素基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェル加え、３７℃で３０分間放置した。次いで、２Ｎ ＮａＯＨを５０μｌ／ウェル加え、反応を停止させ、プレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０４】
なお、吸収率は前述の式により求めた。
【０１０５】
結果を図１に示す。図からわかるように、ウラシルの量を１００〜１０００μｇ／ｍｌの範囲で検出できることが分かった。
実施例３ 交差反応性試験
実施例２と同様にして、他のウラシル系化合物と本発明のモノクローナル抗体（ＳＵ−１）との反応性を調べた。具体的には、実施例２において、ウラシルとの阻害を調べるために行った（ｉｉ）の工程で、ウラシル（１ｍｇ／ｍｌ）の代わりに、シュードウリジン、ジヒドロウラシル、チミン、シトシン（１ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ用いて、同様にして実験を行って、ウラシル系化合物と本発明のモノクローナル抗体（ＳＵ−１）との反応性を調べた。結果を表１に示す。
【表１】
この結果から分かるように、本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対し特異的に反応し、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては全く反応性を示さなかった。
実施例４ 免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−１
１：免疫原（１−カルボキシメチルウラシル−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にして、イムジェクト イムノーゲン ＥＤＣ コンジュゲーション キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、１−カルボキシメチルウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体又は１−カルボキシメチルウラシル−ＫＬＨ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１０７】
１）１−カルボキシメチルウラシル６ｍｇを、１．５ｍｌ容量のｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）に溶解した。
【０１０８】
２）ＢＳＡ又はＫＬＨ１０ｍｇを１ｍｌのｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１０９】
３）２）で調製したＢＳＡ又はＫＬＨ溶液２００μｌに、１）の１−カルボキシメチルウラシル溶液５０μｌ及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１２５μｌ（ＫＬＨの場合は５０μｌ）を加えた。
【０１１０】
４）３）の溶液を３７℃で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【０１１１】
５）４）で得られた溶液をゲル濾過カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５）にかけて、未反応の１−カルボキシメチルウラシルと低分子物質を除去した。
【０１１２】
６）５）で得られた溶液をＤ−ソルト デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（またはＫＬＨ）複合体溶液とした。
【０１１３】
７）複合体の確認は、１−カルボキシメチルウラシルのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２７０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、ＢＳＡ又はＫＬＨ１分子あたりにそれぞれ４．９８個又は２２．９個の１−カルボキシメチルウラシルが結合したと推定された。
２：インビトロ免疫法による免疫細胞（抗体産生細胞）の作製
（Ａ）脾細胞の調整
実施例１の２：に記載する方法に従って、ＢＡＬＢ／ｃマウスから無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を単離して１×１０７細胞／ｍｌ（血清非含有ＲＰＭＩ１６４０培地、日水製薬製）の濃度に調製し、この細胞懸濁液を６ウェル平底プレートに２．５ｍｌ／ウェルで播いた。そこに最終濃度２５μｇ／ウェルになるようにＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したＭＤＰ１００μｌ（２５０μｇ／ｍｌ）及び１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体（系列希釈終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間静置した後、４０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２．５ｍｌ／ウェル加え、混和し、３７℃、５％ＣＯ２下で４〜５日間培養し、感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）を得た。
３：細胞融合 細胞融合に用いるミエローマとして実施例１と同様にＰ３Ｕ１細胞を、また感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）として上記の感作Ｂ細胞を更に実施例１の３：に従って調製した感作細胞群を用いた。
【０１１４】
細胞融合は、実施例１と同様にポリエチレングリコール法を用いて行った。具体的には、Ｐ３Ｕ１細胞と感作細胞群とを細胞数が１：５の割合になるように混和し、５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を添加し、穏やかに混ぜた。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地に分散させ、遠心分離（１０００ｒｐｍ、室温、７分間）して細胞を沈殿させて上清を取り除いた。これを１０％ＦＢＳ含有ＨＡＴ培地で希釈し（感作細胞として１．６×１０６個／ｍｌ）、この細胞懸濁液を２５０μｌ／ウェルとなるように９６穴平底プレートにまき、３７℃、５％ＣＯ２下で静置培養した。
４：ハイブリドーマの選択
上記の静置培養に用いたＨＡＴ培地では細胞融合したハイブリドーマのみが増殖しコロニーを形成する。これを利用して、上記静置培養の１０〜１４日後に得られたハイブリドーマについて、その培養上清中に目的の性質を有する抗体が産生されているか否かを、免疫抗原を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした。
（Ａ）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
９６穴イムノプレートに１：で得られた１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体１０μｇ／ｍｌ（ＢＳＡ換算）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で２時間放置した。放置後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業製）を含むＰＢＳ（日水製薬製、ＰＢＳ−Ｔ）で７回洗浄した後、ブロッキングとして３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜静置し、更にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄して、抗原吸着プレートを調製した。
【０１１５】
一方、（ｉ）ハイブリドーマ培養上清３０μｌにＰＢＳ３０μｌを加えて３７℃で１時間放置したもの、（ｉｉ）ハイブリドーマ培養上清３０μｌにウラシル（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ３０μｌを加えて３７℃で１時間放置したもの、または（ｉｉｉ）１μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で、上記で調製した抗原吸着９６穴プレートに添加し、３７℃で１時間放置した。次いで、該ウェルをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウス多価免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）を基質緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解した溶液を１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で３０分放置した後、２Ｎ ＮａＯＨ５０μｌ／ウェル入れてプレートミキサーで混合して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１６】
吸収率は、実施例１の方法に従って求めた。
【０１１７】
上記スクリーニングによる選別の結果、３種のモノクローナル抗体産生細胞（３Ｈ５、５Ｃ９及び５Ｄ１０）が得られた。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。
【０１１８】
具体的には、４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１１９】
得られたクローンを４：に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、数個のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマがウラシルに特異的な抗体を産生する細胞としてクローン化された。
実施例５ 免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−２
１：免疫原（ウリジンジアルデヒド−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にしてイムジェクト イムノーゲン ＥＤＣ コンジュゲーション キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ウリジンジアルデヒドにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合させ、ウリジンジアルデヒド−ＢＳＡ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１２０】
１）ＢＳＡ２００μｇを０．５ｍｌの０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解した。
【０１２１】
２）ウリジンジアルデヒド２ｍｇを０．５ｍｌの０．３Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、そのうちの１０７μｌを上記１）で調製したＢＳＡ溶液に加えた。
【０１２２】
３）２）で調製した溶液を４℃で一晩攪拌した。
【０１２３】
４）これにウリジンジアルデヒドの１．５当量（２．６６μｍｏｌ）のＮａＢＨ４を加え、氷上で３時間静置した。
【０１２４】
５）次いで、更にウリジンジアルデヒドの１．５当量（２．６６μｍｏｌ）のＮａＢＨ４を加えて、再び４℃で一晩攪拌した。
【０１２５】
６）酢酸を用いてｐＨ４．５に調整し、該溶液をゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にかけて、未反応のウリジンジアルデヒドと低分子物質を除去した。
【０１２６】
７）６）で得られた溶液をＤ−ソルト デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウリジンジアルデヒド−ＢＳＡ複合体溶液とした。
【０１２７】
８）複合体の確認は、ウリジンジアルデヒドのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２６０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、ＢＳＡ１分子あたり２７．８個のウリジンジアルデヒドが結合したと推定された。
【０１２８】
かかる複合体は、実施例４と同様にハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の取得に利用することができる。
実施例６ 免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−３
１：免疫原（５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にしてイムジェクト イムノーゲン ＥＤＣ コンジュゲーション キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（又はＫＬＨ）複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１２９】
１）５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル４ｍｇを、１ｍｌ容量のｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ４．７）に溶解した。
【０１３０】
２）ＢＳＡ（又はＫＬＨ）１０ｍｇを１ｍｌのｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１３１】
３）２）で調製したＢＳＡ（又はＫＬＨ）溶液２００μｌに、１）の５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル溶液５０μｌ及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１２５μｌ（ＫＬＨの場合は５０μｌ）を加えた。
【０１３２】
４）３）の溶液を３７℃で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【０１３３】
５）４）で得られた溶液をＤ−ソルト デキストラン 脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（またはＫＬＨ）複合体溶液とした。
【０１３４】
６）複合体の確認は、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシルのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２８０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体に関して、ＢＳＡ１分子あたりに７．３１個のウリジンアルデヒドが結合したと推定された。
【０１３５】
かかる複合体は、実施例４と同様にハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の取得に利用することができる。
【０１３６】
産業上の利用可能性
本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対して特異的に反応することより、試料中のウラシルを簡便、迅速、且つ選択的に測定することができる。更に当該モノクローナル抗体は、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては全く反応性を示さないので、ヒト尿試料を検査することにより、ＤＰＤ欠損者の選定に有用であり、これは特にフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤の投与が禁忌であるＤＰＤ欠損癌患者のスクリーニングに極めて有用である。
【０１３７】
本発明は、癌患者に対する抗腫瘍剤治療において安全な治療法を選択する方法並びにそれに用いられるツールを提供する。
【０１３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で得られた本発明のモノクローナル抗体について、ウラシルに対する反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である（実施例２）。横軸はウラシルの量（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は吸収率（％）を示す。[0001]
Technical field
The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically reacts with uracil and a hybridoma that produces the monoclonal antibody. The present invention further relates to an immunochemical assay for uracil, characterized by using the monoclonal antibody.
[0002]
According to the monoclonal antibody of the present invention and the immunochemical measurement method using the same, it is possible to specifically detect and measure uracil present in a biological sample such as blood and urine, whereby the dihydropyrimidine dehydrogenase is inherited. Can be screened.
[0003]
Administration of fluorinated pyrimidine antitumor agents is contraindicated for the enzyme deficient. Therefore, the present invention is particularly useful in the sense as a tool for selecting a safe treatment method in the treatment of an antitumor agent for cancer patients.
[0004]
Background art
Currently, fluorinated pyrimidine compounds such as fluorouracil are used as one of antitumor agents. However, some cancer patients are genetically deficient in dihydropyrimidine dehydrogenase (hereinafter abbreviated as DPD), which is an enzyme involved in the degradation metabolism of the compound. (About 3% of Caucasian breast cancer patients), it has been reported that when a fluoropyrimidine antitumor agent is administered to DPD-deficient patients, side effects leading to death occur (Biochim. Biophys. Acta 633, 400- 409 (1980)).
[0005]
Usually, in vivo, uracil or thymine is metabolized to dihydrouracil or dihydrothymine, respectively, by the action of DPD, but DPD-deficient patients do not metabolize them, and a large amount of uracil and thymine in the blood or urine, In particular, it is known that a large amount of uracil is excreted (Adv. Exp. Med. Biol., 253A, 111-118 (1989)).
[0006]
Therefore, if the presence of uracil or thymine, particularly uracil, in blood or urine can be measured before administering a fluoropyrimidine antitumor agent to a cancer patient, a patient with DPD-deficient cancer can be selected in advance. As a result, it is possible to reduce or discontinue the dosage of the antitumor agent to avoid the occurrence of serious side effects.
[0007]
Conventionally, as a method for measuring uracil, a method using high performance liquid chromatography (HPLC) is known (Journal of Chromatography B, 672 (1995), 233-239). However, in this method, sample preparation is complicated and requires a lot of labor and training. In addition, it takes a very long time to measure a large number of specimens, and there are other disadvantages such as high costs for measuring devices and equipment. Accordingly, there is a need for a new uracil measurement method that has high detection sensitivity and is quick, simple, and economical.
[0008]
In addition, as a similar technique of the present invention, Japanese Patent Publication No. 4-21479 discloses an immunoassay method using a monoclonal antibody against pseudouridine. The monoclonal antibody used here has been developed to detect pseudouridine as a tumor marker, which has 30-40% reactivity to uracil but originally increases in the urine of patients with advanced cancer. It exhibits a high reactivity of 95 to 99% with respect to pseudouridine. For this reason, it is impossible to distinguish a DPD deficient person from a DPD deficient person and a normal person who is not deficient in a cancer patient by using a monoclonal antibody having cross-reactivity between uracil and pseudouridine. is there.
[0009]
Therefore, in order to select DPD deficient and normal in cancer patients in particular, uracil is used without cross-reacting with dihydrouracil, which is an in vivo metabolite of uracil, and pseudouridine, which is used as a tumor marker. A method capable of specific detection is required.
[0010]
An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically reacts with uracil, and a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
[0011]
Another object of the present invention is to provide a simple, rapid and specific immunochemical assay for uracil, characterized by using the anti-uracil monoclonal antibody.
[0012]
Disclosure of the invention
The inventor Immunogen As an antibody-producing cell was prepared using an antigen in which schizper was bound to uracil or a derivative thereof, a hybridoma was prepared from the cell fusion technique, and the characteristics of the monoclonal antibody produced from the hybridoma were examined. It was found that the obtained monoclonal antibody did not react with pseudouridine and dihydrouracil, but had the property of reacting specifically with uracil. Based on this finding, the inventor has made further studies to use this property of the monoclonal antibody to measure uracil excreted in the urine without pretreatment of the sample. The present invention has been completed by confirming that the measurement can be carried out selectively and quickly and conveniently by a method.
[0013]
That is, first, the present invention relates to a hybridoma that produces and secretes a monoclonal antibody that specifically reacts with uracil, and a method for preparing the same.
[0014]
Specifically, the hybridoma comprises a conjugate of uracil or a derivative thereof and a shreper. Immunogen It is obtained by cell fusion of an antibody-producing cell derived from an animal prepared by using and myeloma, and has a property of producing a monoclonal antibody that specifically reacts with uracil.
[0015]
In addition, the following are mentioned as an aspect of this hybridoma of this invention.
(1) The hybridoma described above, wherein the produced monoclonal antibody has a characteristic of reacting with uracil and not reacting with pseudouridine and dihydrouracil.
(2) The hybridoma as described above, wherein the antibody-producing cells used are prepared by bringing an animal-derived spleen cell into contact with a conjugate of uracil or a derivative thereof and a shreper and immunizing it in vitro.
(3) The above hybridoma, wherein the animal-derived antibody-producing cells originate from mouse-derived spleen cells.
(4) Uracil or a derivative thereof that binds to a shredder is uracil; uracil-4-acetic acid; carboxymethyl such as 1-carboxymethyluracil, 5-bromo-1-carboxymethyluracil, or 5-fluoro-1-carboxymethyluracil. Uracil derivatives having a group; uracil derivatives having a carboxyl group such as uracil-5-carboxylic acid, uracil-6-carboxylic acid or uridine-6-carboxylic acid; uridine dialdehyde, uridine 5'-phosphate, polyuric acid, N The hybridoma as described above, which is at least one selected from the group consisting of carbamyl-β-alanine, orotidine 5′-phosphate and uridine 5′-diphosphoglucuronic acid.
(5) The hybridoma as described above, wherein the shreper is mussel hemocyanin or bovine serum albumin.
(6) Immunogen Uracil or a derivative thereof used as a conjugate of shreper is uracil-hemocyanin complex, uracil-bovine serum albumin complex, 1-carboxymethyluracil-hemocyanin complex, 1-carboxymethyluracil-bovine serum albumin complex, Group consisting of 5-bromo-1-carboxymethyluracil-hemocyanin complex, 5-bromo-1-carboxymethyluracil-bovine serum albumin complex, uridine dialdehyde-hemocyanin complex and uridine dialdehyde-bovine serum albumin complex The above hybridoma, which is at least one selected from
(7) The above hybridoma, wherein the myeloma used is a myeloma cell line obtained from a mouse.
(8) The above hybridoma deposited at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Biotechnology (Japan) and having a deposit number of FERM BP-6141.
[0016]
Second, the present invention relates to a monoclonal antibody that reacts specifically with uracil produced by any of the hybridomas described above. Preferred are monoclonal antibodies that have the property of reacting with uracil and not reacting with pseudouridine and dihydrouracil.
[0017]
Thirdly, the present invention relates to a method for immunochemical measurement of uracil characterized by using any of the above anti-uracil monoclonal antibodies.
[0018]
As a specific embodiment of such an immunochemical assay for uracil, the anti-uracil monoclonal antibody is brought into contact with a test sample suspected of having uracil, and a radioisotope immunoassay, an enzyme immunoassay, a fluorescent antibody A method comprising detecting or quantifying uracil in a test sample using any one of a method and an agglutination method;
Or the following:
(A) A test system containing suspect uracil and a reaction system comprising a solid phase (hereinafter also referred to as solid phase antigen) in which an antigen comprising a conjugate of uracil or a derivative thereof and a shreper is immobilized on an arbitrary carrier A step of blending the monoclonal antibody,
(B) incubating the reaction product under conditions that form an antigen-antibody complex;
(C) reacting the second antibody with the immobilized antigen-antibody complex, and
(D) a step of detecting the immobilized antigen-antibody complex bound to the second antibody.
And an immunochemical assay for uracil.
[0019]
First, a hybridoma having the characteristic of synthesizing and secreting a monoclonal antibody specific for uracil, which is the first invention, and a method for preparing the same will be described.
[0020]
In preparing the hybridoma of the present invention, Immunogen The uracil or its derivative used as is not particularly limited, but by itself Immunogen Since the property is very weak, it is desirable to be used as a uracil (or a derivative thereof) -shreper complex by binding to an appropriate shreper.
[0021]
Here, the shreper is a carrier, Immunogen Binds to a material that is very weak or has no ability to produce antibodies alone, such as a hapten group, Immunogen A substance that enhances or expresses sex.
[0022]
As a shredder, a protein having a relatively large molecular weight is generally used, but cells such as erythrocytes, polysaccharides, etc. are also used. Examples of shredders include mussel hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin and the like, with KLH or BSA being particularly preferred.
[0023]
In the present invention, Immunogen As an alternative, a uracil derivative-shipper complex using a uracil derivative in place of the uracil of the uracil-shipper complex can also be used. The uracil derivative is not particularly limited, but is usually carboxy as a substituent such as uracil-4-acetic acid, 1-carboxymethyluracil, 5-bromo-1-carboxymethyluracil and 5-fluoro-1-carboxymethyluracil. In addition to uracil derivatives having a carboxyl group as a substituent such as uracil derivatives having a methyl group, uracil-5-carboxylic acid, uracil-6-carboxylic acid and uridine-6-carboxylic acid, uridine dialdehyde, uridine 5 ′ Examples thereof include phosphoric acid, polyuric acid, N-carbamyl-β-alanine, orotidine 5′-phosphate, uridine 5′-diphosphoglucuronic acid and the like. Suitable uracil derivatives include uracil derivatives having a carboxymethyl group as a substituent, uracil derivatives having a carboxyl group as a substituent, uridine dialdehyde, and uridine 5′-phosphate, and more preferably a substituent. Examples thereof include uracil derivatives having a carboxymethyl group and uridine dialdehyde. Particularly suitable uracil derivatives include 1-carboxymethyluracil, 5-bromo-1-carboxymethyluracil, and uridine dialdehyde.
[0024]
The binding of uracil or a derivative thereof to shreper is not particularly limited, but for example, mixed acid anhydride method (BF Erlanger et al .: J. Biol. Chem. 234 1090-1094 (1954)) or activity It can carry out by well-known methods, such as the esterification method (AEKARU et al.:J.Agric.Food Chem.42 301-309 (1994)). Further, as a simple method, there can be mentioned a method of binding according to the attached manual using an Immunogen EDC conjugation kit (Immune Immunogen EDC Conjugation Kit, manufactured by Pierce).
[0025]
Antibody producing cells Immunogen Can be prepared by inoculating animals according to conventional methods or by contacting them with animal cells and immunizing in vivo or in vitro. In the present invention, in vitro immunization is preferably used [Methods Enzymol. (1986), 121 (Immunochem. Tech., Pt. I), 27-33, J. Am. Immunological Methods (1982), 53, 261-291 etc.].
[0026]
As such in vitro immunization method, specifically, spleen is taken out from an animal of 3 to 10 weeks of age, and spleen cells prepared from the spleen are incubated with uracil (or a derivative thereof) -shreper complex in vitro and sensitized. Can be mentioned. At this time, it is preferable to use muramyl dipeptide derivatives such as romultide, muramyl dipeptide (MDP), lipopolysaccharide, or the like in order to enhance the immune performance of the cells. More preferably, muramyl dipeptide derivatives are used.
[0027]
The origin of the spleen is not particularly limited, and spleens derived from animals such as mice, rats, horses, goats or rabbits can be widely used. That is, the antibody-derived cell-derived cells used in the present invention can be appropriately selected from the spleen cells of the above animals in consideration of compatibility with myeloma and the like. Spleen cells derived from mice are preferred.
[0028]
Examples of myeloma cells fused with the antibody-producing cells include, but are not limited to, those derived from mice, rats, horses, goats, rabbits or humans. Preferably, it is derived from the same animal species as the antibody-producing cell to be used, and examples include myeloma cells derived from mice.
[0029]
For example, when antibody-producing cells are derived from mouse spleen cells, it is preferable to use myeloma cell lines obtained from mice as fusion partners. Specifically, it is an 8-azaguanine resistant mouse (BALB / c-derived) myeloma cell line, and examples thereof include P3 / X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495-497 (1975)], P3. / X63-Ag8. U1 (P3U1) [Current Topics. in Microbiology and Immunology, 81 1-7 (1987)], P3 / NSI-1-Ag4-1 (NS-1) [Eur. J. et al. Immunol. , 6, 511-519 (1976)], Sp2 / O-Ag14 (Sp2 / O) [Nature 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immuno. Meth. 35, 1-21 (1980)], MPC-11, X63.653, S194, and the like. P3U1 cells are preferable.
[0030]
Cell fusion between the antibody-producing cells and myeloma cells can be performed by a known method, for example, the method described in Nature 256, 495-497 (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5122-5126 (1981) or a method analogous thereto.
[0031]
More specifically, cell fusion is performed by allowing the antibody-producing cells and myeloma cells to coexist in a normal nutrient medium in the presence of a fusion promoter, for example. As the fusion promoter, those usually used without particular limitation, for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus and the like can be used. [Cell tissue chemistry (Shinji Yamashita et al. Interdisciplinary project, 1986), etc.], preferably PEG with relatively little cytotoxicity and easy fusion operation. If desired, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) can be used in combination in order to increase the fusion efficiency.
[0032]
Further, instead of the fusion method using the above fusion accelerator (for example, the above-described polyethylene glycol method), a fusion method by electric treatment (electrofusion method) can be appropriately employed.
[0033]
As a use ratio of the antibody producing cell and the myeloma cell, the same ratio as in a normal method can be used. For example, the antibody producing cell may be used about 2 to 10 times the myeloma cell. Preferably about 4-7 times can be mentioned.
[0034]
Selection of a hybridoma group in which antibody-producing cells and myeloma cells have fused to acquire antibody-producing ability and proliferative ability can be performed by culturing using a normal selection medium.
[0035]
Examples of the selection medium include a HAT medium when an 8-azaguanine resistant strain is used as the myeloma cell line. The culture in such a HAT medium may be performed for a period sufficient for killing unfused cells other than the target hybridoma, usually 3 to 10 days.
[0036]
The hybridoma thus obtained is then subjected to screening and cloning steps for a strain producing the target anti-uracil monoclonal antibody according to a conventional method.
[0037]
Screening for anti-uracil monoclonal antibody-producing strains is carried out by taking a part of the culture supernatant containing the hybridoma group obtained as described above and using this as a sample for various methods (“hybridomas” generally used for antibody detection). Method and monoclonal antibody ", published by R & D Planning, Inc., pages 30-53, March 5, 1982), for example, using uracil contained in radioisotope immunoassay (RIA) Can be detected and confirmed. Examples of antibody detection methods include enzyme immunoassay (ELISA) (Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980)), fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination. Although reaction, octalony, etc. can be mentioned, it is preferable to use the ELISA method from the viewpoint of sensitivity, rapidity, accuracy, safety, automation, and the like.
[0038]
More specifically, screening of an anti-uracil monoclonal antibody-producing strain can be performed by the following procedure, for example, by indirect competitive inhibition ELISA.
(A) A uracil (or derivative thereof) -shipper complex as an antigen is adsorbed on a carrier and immobilized.
(B) Blocking the solid phase surface on which no antigen is adsorbed with a protein unrelated to the antigen.
(C) A sample containing uracil and a hybridoma culture supernatant are added thereto, and the monoclonal antibody contained in the hybridoma culture supernatant is competitively bound to the immobilized antigen and free uracil, so that the immobilized antigen- Antibody complexes and free uracil-antibody complexes are generated.
(D) The free uracil-antibody complex is washed and removed, and the immobilized antibody-antibody complex is reacted with the second antibody labeled with the enzyme.
(E) The enzyme is reacted with an appropriate substrate for the enzyme, and the absorbance is measured.
[0039]
In the step (a), uracil (or a derivative thereof) -shreper complex used as a solid-phased antigen may be any of the various types described above. Immunogen Can be used.
[0040]
In addition, as an immobilized antigen, it was basically used for the preparation of antibody-producing cells. Immunogen Are preferably the same. However, a shreper formed by binding to uracil or a uracil derivative is Immunogen For example, uracil-BSA complex Immunogen On the other hand, uracil-KLH can be used as a solid-phased antigen.
[0041]
The carrier for immobilizing the antigen is not particularly limited, and any one commonly used in ELISA can be used. For example, polystyrene or polyvinyl microplates or beads may be mentioned, but 96-well microplates are preferably used. The concentration of the antigen is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.01 to 100 μg / ml, preferably 0.05 to 5 μg / ml. In addition, when a 96-well microplate is used as a carrier, the volume may be sufficient to cover the bottom surface of the well, and is usually preferably about 20 to 150 μl per well.
[0042]
The adsorption conditions are not particularly limited, but a method of usually standing at about 4 to 40 ° C. for about 1 hour to overnight is suitable, preferably about 37 ° C. for about 2 hours.
[0043]
In the step (b), examples of the protein used for blocking include calf serum, ovalbumin, bovine serum albumin, fetal calf serum (FCS), and the like, preferably calf serum. The blocking conditions are not particularly limited, but a method of standing at about 4 to 40 ° C. for about 1 hour to overnight is suitable, preferably about 37 ° C. for about 2 hours. After blocking, the microplate is washed with buffer. Although it does not restrict | limit especially as a buffer solution used here, For example, the phosphate buffer solution (PBS) (pH 7.3-7.7) containing Tween20 is suitable.
[0044]
In the step (c), specific conditions are not particularly limited, but a method of standing at room temperature to about 40 ° C for about 0.5 to 3 hours is suitable, and preferably about 37 ° C for about 1 hour. is there. After the reaction, the microplate is washed with a buffer. The buffer used here is not particularly limited. For example, PBS (pH 7.3 to 7.7) containing Tween 20 is suitable.
[0045]
In the step (d), as the second antibody, for example, an enzyme label labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase (AP), horseradish peroxidase (HRPO), β-galactosidase (β-GS), glucose oxidase (GO), urease, etc. Anti-mouse immunoglobulin antibodies can be used. Preferably, it is an AP-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody. The second antibody is usually used after diluting, but is about 100 to 10,000 times, preferably about 200 to 500 times the monoclonal antibody (first antibody) bound to the microplate via the uracil-shipper complex. It is desirable to use a second antibody diluted to double. For the dilution, for example, PBS containing 1% bovine serum albumin (pH 7.3 to 7.7) is preferably used. Although the reaction is not particularly limited, it is usually carried out at about 37 ° C. for about 1 hour, and after the reaction, it is washed with a buffer solution.
[0046]
By the above reaction, the second antibody binds to the monoclonal antibody bound to the microplate via the immobilized antigen.
[0047]
In step (e), the substrate is colored by the reaction between the enzyme of the bound second antibody and the substrate, or a coloring reagent is further added to the reaction system, and the change in absorbance is measured. More specifically, for example, when alkaline phosphatase is used as a labeling enzyme to be bound to the second antibody, color is developed by an enzymatic reaction using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, and 2N NaOH is added to the enzyme. A method of stopping the reaction and measuring the absorbance at 415 nm is suitable. On the other hand, when peroxidase is used as a labeling enzyme to be bound to the second antibody, it is desirable to use hydrogen peroxide as a substrate and o-phenylenediamine as a coloring reagent. In this case, although not particularly limited, a method is generally used in which a coloring reagent solution is added and reacted at about 25 ° C. for about 10 minutes, and then the enzymatic reaction is stopped by adding 4N sulfuric acid. When o-phenylenediamine is used as the coloring reagent, the absorbance at 492 nm is measured. In addition, the sensitization method by an avidin-biotin system can also be utilized here.
[0048]
Subsequently, the hybridoma that has been found to produce a monoclonal antibody specific for uracil by the screening described above is cloned.
[0049]
Cloning methods include dilution by limiting dilution so that one hybridoma is contained in one well, a method of picking colonies on a soft agar medium, a method of taking out one cell with a micromanipulator, and one using a cell sorter. For example, a “sorter clone” method for separating the cells. The limiting dilution method is preferably used because of its simplicity.
[0050]
For wells containing hybridomas with recognized antibody titers, cloning is repeated 1 to 4 times, for example, by limiting dilution, and those with stable antibody titers are selected as anti-uracil monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
[0051]
The hybridoma of the present invention obtained by the above method is, for example, 5 × 10 5 in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS). 6 It can be stored at −80 ° C. or lower, for example, at −195 ° C. in liquid nitrogen by freezing at 10 cells / ml or more, using 10% dimethyl sulfoxide as a freezing stabilizer as necessary.
[0052]
As will be described later, the hybridoma of the present invention is stable in culture in a basic medium such as RPMI 1640, DMEM, IMEM, etc., and produces and secretes a monoclonal antibody having specific reactivity with uracil. Furthermore, these cell lines can be stably stored in liquid nitrogen and then easily recovered. That is, the hybridomas of the present invention are useful as readily available supplies of pure monoclonal antibodies that react against uracil antigens.
[0053]
Such a hybridoma is displayed on October 14, 1997 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, which has an address in Tsukuba City, Ibaraki Pref. 1-3-3. Displayed for identification) “Mouse hybridoma SU-1”, (Accession number) “FERM BP-6141”.
[0054]
Next, a monoclonal antibody that specifically reacts with uracil according to the second invention will be described.
[0055]
The monoclonal antibody is produced by the hybridoma of the present invention obtained by the above method.
[0056]
Such a monoclonal antibody can be prepared by culturing the above hybridoma.
[0057]
Examples of the medium for culturing the hybridoma include RPMI1640, DMEM, IMEM and the like as the basic medium. RPMI 1640 is preferable. Further, fetal bovine serum, human transferrin and the like are added to the medium to promote cell growth / differentiation, and 10% BM conmeded H1 (registered trademark, manufactured by Boehringer Mannheim) and / or energy is used to promote cell growth. L-glutamine, sodium pyruvate, etc. can be added to replenish the source.
[0058]
Hybridoma culture can be performed, for example, by CO. 2 It is preferable to culture at a concentration of about 4 to 6% and 36 to 38 ° C. Mass culture is performed by rotating culture using a large culture bottle.
[0059]
The culture supernatant can be used as an anti-uracil monoclonal antibody source as it is, but further, dialysis, salting out with ammonium sulfate, gel filtration, lyophilization, etc. are performed to collect the immunoglobulin fraction. By purifying the fraction, an anti-uracil monoclonal antibody can be obtained.
[0060]
The purification method of the above fractions is not particularly limited, but high-performance liquid chromatography (HPLC) including ion exchange chromatography using a DEAE-Sepharose column, affinity chromatography using a Protein A-Sepharose column, etc. The conventional methods can be used.
[0061]
The cross-reactivity of the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention obtained by the above-described operation can be evaluated using the above-described indirect competitive inhibition ELISA method or the like. Specifically, the evaluation can be carried out by adding to the well a compound for examining the cross-reaction instead of uracil in the competitive reaction in the ELISA method.
[0062]
Based on the evaluation of such cross-reactivity, as described in Examples, the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention reacts with uracil, but hardly reacts with pseudouridine and dihydrouracil and is specific for uracil. It was found to have sex.
[0063]
Thus, the monoclonal antibody of the present invention has high reactivity to uracil, and furthermore, it can be supplied uniformly and in large quantities by culturing the hybridoma of the present invention, so that uracil is immunochemically specific. It is useful as a reagent for detecting and measuring. The monoclonal antibody can also be used for purification of uracil.
[0064]
In particular, since the reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention is that it does not react with pseudouridine and dihydrouracil which may be present as contaminants in the urine of cancer patients, the monoclonal antibody of the present invention is particularly useful for cancer. It is useful for selecting patients with DPD deficiency who excrete uracil in urine due to DPD deficiency and normal persons without DPD deficiency.
[0065]
Accordingly, a third aspect of the present invention is an immunochemical assay for uracil characterized by using the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention.
[0066]
The immunochemical measurement method is a method for detecting and measuring an antigen contained in a test sample on the basis of an antigen-antibody reaction caused by the antibody specifically recognizing the antigen, and is accurate, simple and rapid. Because of its excellent economic efficiency, it is widely adopted in fields such as biochemical tests and clinical diagnosis.
[0067]
As the immunochemical measurement method, known methods can be widely cited. Specifically, as described above, for example, RIA method, enzyme immunoassay method (ELISA method), fluorescent antibody method, blood agglutination method, etc. It can be illustrated. The ELISA method is preferable, and the usefulness thereof is described in [Tijssen P, “Practice and theory of the enzyme-Nine-Immunoassays in 204, Bio-Immunity Assays in Biochemistry and Biomolecules in Biochemistry and Biomolecules in Biochemistry and Biomolecules in Biochemistry”. )] Is described in detail.
[0068]
The procedures and procedures in each immunochemical measurement method can be basically performed according to a conventional method except that the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention is used as the first antibody.
[0069]
The immunochemical measurement method of the present invention can be used for a test sample suspected of having uracil as long as it specifically detects or measures (quantifies) uracil contained therein. It does not ask the subject. For example, for the purpose of clinical diagnosis such as discriminating a dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) deficient person from a normal person who is not deficient, body fluids such as urine, serum, and plasma are used as test samples.
[0070]
A biological test sample such as urine can be used as it is for the immunochemical measurement method of the present invention, but can also be treated in advance with an ion exchange resin or the like.
[0071]
As the immunochemical measurement method of the present invention, preferably, a step of incubating a biological sample of a subject with the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention under conditions for forming an antigen-antibody complex, and the formed antigen-antibody A measurement method basically including a step of detecting the complex can be mentioned. The design of such an immunochemical measurement method can involve many modifications that are usually performed in the technical field of the present invention, such as a direct method, an indirect method, a competitive method, a sandwich method, and the like.
[0072]
More specifically, taking a solid-phase ELISA method using a human urine sample as a test sample, for example, the uracil detection measurement method can be performed by the following method.
[0073]
First, the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention is immobilized on an arbitrary carrier, and a solid phase surface not covered with the antibody is covered with a protein unrelated to the antigen. After washing the surface, a urine sample as a test sample and an enzyme-labeled antigen, for example, uracil (or a derivative thereof) -shreper complex labeled with an enzyme, are added to cause a competitive reaction. The enzyme substrate is added to this, and the decrease in absorbance due to the addition of the test sample is measured. Specifically, the presence or absence of uracil in the urine sample can be determined by measuring the presence or absence of absorbance decrease due to the addition of the test sample, and by measuring the degree of decrease in absorbance due to the addition of the test sample, The amount of uracil in the urine sample can be quantified from a standard line created in advance using a known amount of uracil.
[0074]
In the indirect competitive inhibition ELISA described above, a method using a urine sample instead of a sample containing uracil, and using the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention instead of a hybridoma culture supernatant can also be used. According to the indirect competitive inhibition ELISA method, the monoclonal antibody of the present invention can measure the amount of uracil in the test sample in the range of 100 to 1000 μg / ml.
[0075]
In carrying out the immunochemical assay, it is convenient to use a reagent kit containing the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention.
[0076]
Therefore, the present invention also relates to a reagent kit for immunochemical measurement of uracil comprising the anti-uracil monoclonal antibody of the present invention.
[0077]
Specifically, a reagent kit for detecting or quantifying uracil in a test sample, the reagent kit for immunochemical measurement of uracil comprising at least any one of the monoclonal antibodies described above, Alternatively, the reagent kit for immunochemical measurement of uracil, which further comprises a conjugate of uracil or a derivative thereof and a shreper in addition to any of the above anti-uracil monoclonal antibodies. Here, a urine sample is preferably used as the test sample.
[0078]
The reagent kit of the present invention comprises an anti-uracil monoclonal antibody as an active ingredient. In addition to the active ingredient, a solid phase carrier, a labeling agent, and a substrate corresponding to the labeling agent (detection reagent) ), A combination of at least one to five selected from antigens and secondary antibodies (for example, anti-mouse immunoglobulin). Here, the antigen preferably includes a complex of uracil or a derivative thereof and a shreper. Further, as the solid phase carrier, the labeling agent, the substrate (detection reagent) corresponding to the labeling agent, and the secondary antibody, those described above can be used.
[0079]
When a labeling agent is included in the set, the labeling agent may be conjugated in advance to an optional component such as a secondary antibody. Examples of the labeling agent include various compounds such as a radioisotope, an enzyme, and a fluorescent substance, and an enzyme is preferable from various viewpoints such as operability.
[0080]
Further, for the convenience of carrying out the measurement, the reagent kit includes an appropriate antibody or antigen diluent, reaction diluent, buffer station, detergent, substrate solubilizer, reaction stop solution, solid phase adsorption inhibitor, etc. May be included.
[0081]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, examples will be described for explaining the present invention, but the examples do not limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and they are all included in the technical scope of the present invention.
Example 1
1: Immunogen Preparation of
Using an immunoimmunogen EDC conjugation kit (Immune Immunogen EDC Conjugation Kit, manufactured by Pierce), uracil was bound with bovine serum albumin (BSA) or mussel hemocyanin (KLH) according to the attached manual, or uracil-BSA complex or A uracil-KLH complex was prepared. Specifically, it was prepared by the following method.
(A) Preparation of uracil-BSA complex
1) BSA attached to the kit was dissolved in 200 μl of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory).
[0082]
2) 2 mg of uracil was dissolved in a buffer solution (500 μl) attached to the kit.
[0083]
3) The solution of 2) was added to the solution of 1).
[0084]
4) The solution of 3) was added to 10 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) attached to the kit.
[0085]
5) The solution of 4) was allowed to stand at room temperature for 2 hours and then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate.
[0086]
6) The solution obtained in 5) was added to a D-salt dextran desalting column attached to the kit, and the eluate was fractionated at 0.5 ml / tube. Absorption at 280 nm and 260 nm of each fraction was measured, and the first peak fraction was collected and used as a uracil-BSA complex solution.
[0087]
7) About the obtained composite_body | complex, it decomposed | disassembled with the protease and analyzed the decomposition product using HPLC, and calculated | required the composition of the composite_body | complex. As a result, it was confirmed that BSA: uracil (molar ratio) = 1: 0.16-0.72.
(B) Preparation of uracil-KLH complex
1) KLH attached to the kit was dissolved in 200 μl of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory).
[0088]
2) 2 mg of uracil was dissolved in a buffer solution (500 μl) attached to the kit.
[0089]
3) The solution of 2) was added to the solution of 1).
[0090]
4) 10 mg of EDC was dissolved in 1 ml of water for injection, and 50 μl of the solution was added to the solution of 3).
[0091]
5) The solution of 4) was allowed to stand at room temperature for 2 hours and then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate.
[0092]
6) The solution obtained in 5) was added to a D-salt dextran desalting column attached to the kit, and the eluate was fractionated at 0.5 ml / tube. Absorption at 280 nm and 260 nm of each fraction was measured, and the first peak fraction was collected and used as a uracil-KLH complex solution.
[0093]
7) About the obtained composite_body | complex, it decomposed | disassembled with the protease and analyzed the decomposition product using HPLC, and calculated | required the composition of the composite_body | complex. As a result, it was confirmed that KLH: uracil (molar ratio) = 1: 2.
2: Preparation of immune cells (antibody producing cells) by in vitro immunization
(A) Preparation of splenocytes
Spleens were extracted from two BALB / c mice and placed in a plastic petri dish having a diameter of 6 cm. 5 ml of RPMI 1640 medium was poured into this plastic petri dish, and the extracted spleen was washed. Separately, two 6 cm diameter plastic petri dishes containing 5 ml of RPMI 1640 medium were prepared and further washed twice. The above washing operation was further repeated in a clean bench. The spleen was crushed in the last transferred petri dish, and the splenocytes were suspended in RPMI1640 medium. This cell suspension was transferred to a 15 ml centrifuge tube, centrifuged at 1000 rpm at room temperature for 7 minutes, and the supernatant was removed. The precipitated cells were suspended in 10 ml of RPMI 1640 medium and allowed to stand at room temperature for 3 minutes. The cell suspension was transferred to a 50 ml centrifuge tube so that tissue pieces sinking to the bottom of the centrifuge tube were not sucked out. The cells prepared by the above operation were used for the next in vitro immunization.
(B) In vitro immunization
The number of spleen cells prepared in (A) was calculated using a blood count plate, and 1 × 10 6 viable cells. 7 The cells were diluted with RPMI1640 medium so as to be cells / ml. This cell suspension was seeded in a 6-well flat bottom plate at 2.5 ml / well. 250 μg / ml of NOPIA (registered trademark, general name: Romultide, Daiichi Pharmaceutical) was added and mixed at 100 μl / well, and the uracil-KLH complex solution obtained in the above 1: (B) and serially diluted After adding 100 μl / well and mixing, the plate was incubated at 37 ° C., 5% CO 2. 2 Let stand under for 15 minutes.
[0094]
The serial dilution was performed to 2500 ng / ml, 500 ng / ml, 100 ng / ml, 20 ng / ml, and 4 ng / ml.
[0095]
Thereafter, RPMI1640 medium containing 40% fetal bovine serum (FBS) was added at 2.5 ml / well, mixed, and incubated at 37 ° C., 5% CO2. 2 The cells were cultured for 5 days to obtain sensitized B cells (antibody-producing cells).
3: Cell fusion
(A) Preparation of myeloma cells
As myeloma, 8-dazaguanine resistant mouse (BALB / C-derived) myeloma cell line P3U1 cells were used. P3U1 cells were previously subcultured every 2 days in RPMI 1640 medium containing 10% FBS.
[0096]
P3U1 cells on the first day of subculture were transferred to a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed and the precipitated P3U1 cells were suspended in 10 ml of RPMI 1640 medium. Myeloma (P3U1 cells) prepared by this procedure was used for cell fusion.
(B) Preparation of sensitized B cells (antibody producing cells)
The spleen cells (antibody-producing cells) that had been cultured in the above 2: (B) for 5 days and immunized were suspended with a pipette, and spleen cells not attached to the plate were collected together in a 50 ml centrifuge tube. This was centrifuged at 1000 rpm and 4 ° C. for 7 minutes. The supernatant was removed and the precipitated cells were suspended in 10 ml of RPMI 1640 medium. The sensitized cell group prepared by the above operation was used for the next cell fusion.
(C) Cell fusion
Count the number of cells in the P3U1 cells prepared in (A) and the sensitized cell group prepared in (B), and mix at a ratio of P3U1 cells (cell number): sensitized cell group (cell number) = 1: 5, The mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 1000 rpm at room temperature (7 minutes), and the supernatant was removed. The precipitated cells were loosened by tapping the centrifuge tube. While rotating the centrifuge tube containing loose cells, the total number of cells is 2 × 10 for 10 seconds. 8 A 1 ml volume of 50% polyethylene glycol (average molecular weight 1000) was added, and the rotation was continued for 50 seconds. Subsequently, while rotating the centrifuge tube, 15 ml of RPMI1640 medium was added in 3 minutes, and further 25 ml of RPMI1640 medium was added in 1 minute. The screw cap of the centrifuge tube was closed and turned up and down 2-3 times to make the content liquid uniform and centrifuged at 1000 rpm for 7 minutes at room temperature. The supernatant was removed, and the precipitate was suspended in HAT medium containing 10% fetal bovine serum (1.6 × 10 6 as sensitized cells). 6 Pcs / ml). This cell suspension was spread on a 96-well flat-bottom plate at 200 to 250 μl / well. 37 ° C, 5% CO 2 The culture was continued for 12 days while still standing below.
4: Selection of hybridoma
The following operation was performed on the hybridoma cells obtained in 3: above.
(A) Screening by ELISA
In a 96-well immunoplate, 20 μg / ml of uracil-BSA complex obtained in 1: (A) (BSA equivalent) was added at 50 μl / well and left at 37 ° C. for 2 hours. After standing, PBS containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, equivalent to Tween 20) (pH 7.3 to 7.7, manufactured by Nissui Pharmaceutical; hereinafter referred to as PBS-T) After washing 7 times, 200 μl of 60% calf serum was added and left at 37 ° C. for 2 hours.
[0097]
After washing 7 times with PBS-T,
(I) a solution obtained by mixing 30 μl of the hybridoma culture supernatant obtained in 3: and 3 μl of PBS and reacting at 37 ° C. for 1 hour;
(Ii) A solution obtained by mixing 30 μl of a hybridoma culture supernatant in advance with 30 μl of a uracil solution dissolved in PBS so as to be 1 mg / ml, and reacting at 37 ° C. for 1 hour, or
(Iii) 1 μg / ml normal mouse IgG (manufactured by Biological) was added at a rate of 50 μl / well and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Next, the wells were washed 7 times with PBS-T, and alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-mouse multivalent immunoglobulin antibody (manufactured by Sigma) diluted 300-fold with 1% BSA was added at 50 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. I left it alone. Then, after washing 7 times with PBS-T, a solution of p-nitrophenyl phosphate disodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in a substrate buffer so as to be 1 mg / ml was added at 100 μl / well, and 37 ° C. Then,
[0098]
The absorption rate was calculated by the following formula.
[Expression 1]
(Ii) ODuracil: Absorbance of ELISA when hybridoma culture supernatant is pretreated with uracil
(Iii) ODcontrol: ELISA absorbance when treated with normal mouse IgG only
Those having high measurement sensitivity were selected by the above measurement.
(B) As a result of selection by the above screening, five types of monoclonal antibody-producing cells (3C10, 1C4, 4E3, 3D5, 1C5) were obtained. One of them, 4E3, was designated as “Mouse hybridoma SU-1” and deposited with the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry based on the Budapest Treaty (Accession No .: MIKEN Article 6141 (FERM BP-6141)).
5: Cloning
The monoclonal antibody-producing hybridoma obtained above was cloned using a known and common limiting dilution method.
[0099]
Specifically, the number of the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 4: was counted, and 10% FBS and 10% BM conmeded H1 (registered trademark, manufactured by Boehringer Mannheim) at 0.8 cells / 0.25 ml / well. Incorporated with RPMI1640 medium containing 2 The cells were cultured at a concentration of 5% and 37 ° C. for 10 to 14 days.
[0100]
The obtained clones were selected using an ELISA method similar to the method described in 4: (A). As a result, several monoclonal antibody-producing hybridomas were cloned as cells producing an antibody specific for uracil.
6: Preservation of anti-uracil monoclonal antibody-producing hybridoma
The obtained hybridoma was 1 × 10 3 in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and 10% DMSO. 7 It prepared so that it might become a cell / ml, and it dispensed 1 ml at a time to a cryotube (made by Nunk). This was frozen in a deep freezer at −90 ° C. and stored in liquid nitrogen.
Example 2 Preparation of monoclonal antibody and its evaluation
The number of cells of the monoclonal antibody-producing hybridoma “Mouse hybridoma SU-1” obtained in 4: of Example 1 was counted, and 10% FBS and 10% BM condensed H1 (Boehringer, Inc., 0.8 cells / 0.25 ml / well). In) using RPMI1640 medium containing 2 The cells were cultured at a concentration of 5% and 37 ° C. for 10 to 14 days.
[0101]
Using the obtained hybridoma culture supernatant, the reactivity of the monoclonal antibody SU-1 of the present invention was examined according to the indirect competitive inhibition ELISA method described in 4: (A) of Example 1.
[0102]
Specifically, 50 μl of uracil-BSA complex (10 μg / ml) was dispensed into 96-well immunoplates (Immunoplate I, manufactured by Nunc) and left at 37 ° C. for 2 hours. Washing was performed a total of 7 times using 200 μl / well of PBS-T containing Tween20. Next, as blocking, 200 μl / well of 3% BSA-containing PBS was added to the wells, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then washed 3 times with PBS-T to prepare a plate.
[0103]
On the other hand, (i) 30 μl of PBS was added to 30 μl of hybridoma culture supernatant, (ii) 30 μl of PBS containing uracil (30-1000 μg / ml) was added to 30 μl of hybridoma culture supernatant for 1 hour at 37 ° C. Those left standing or (iii) 1 μl / ml normal mouse IgG (manufactured by Biologicals) was added to the 96-well plate adsorbed with the above antigen at a rate of 50 μl / well, and left at 37 ° C. for 1 hour. Next, this was washed 7 times with PBS-T, and 50 μl / well of an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse antibody (secondary antibody, manufactured by Sigma) diluted 1000-fold with PBS containing 1% BSA was added at 37 ° C. Left for 1 hour. Next, the plate was washed 7 times with PBS-T, 100 μl / well of enzyme substrate solution (1 mg / ml p-nitrophenyl phosphate, pH 9.8) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Next, 50 μl / well of 2N NaOH was added to stop the reaction, and the absorbance at 415 nm was measured with a plate reader.
[0104]
In addition, the absorption rate was calculated | required by the above-mentioned formula.
[0105]
The results are shown in FIG. As can be seen from the figure, it was found that the amount of uracil can be detected in the range of 100 to 1000 μg / ml.
Example 3 Cross-reactivity test
In the same manner as in Example 2, the reactivity of other uracil compounds with the monoclonal antibody (SU-1) of the present invention was examined. Specifically, in Example 2, in order to check inhibition with uracil (ii), instead of uracil (1 mg / ml), pseudouridine, dihydrouracil, thymine, cytosine (1 mg / ml) ) Were used in the same manner, and the reactivity between the uracil-based compound and the monoclonal antibody (SU-1) of the present invention was examined. The results are shown in Table 1.
[Table 1]
As can be seen from the results, the monoclonal antibody of the present invention reacted specifically with uracil and did not show any reactivity with pseudouridine and dihydrouracil.
Example 4 Immunogen Use of uracil derivative-shreper complex as
1: Immunogen Preparation of (1-Carboxymethyluracil-Shipper Complex)
In the same manner as in Example 1, using an Immun Immunogen EDC conjugation kit (Immunoimmunogen EDC Conjugation Kit, manufactured by Pierce), bovine serum albumin (BSA) or mussel hemocyanin ( KLH) was bound to prepare 1-carboxymethyluracil-BSA complex or 1-carboxymethyluracil-KLH complex. Specifically, it was prepared by the following method.
[0107]
1) 6 mg of 1-carboxymethyluracil was dissolved in a 1.5 ml volume of a conjugation buffer (0.1 M MES (2- (N-Morpholino) -ethane sulfonic acid), 0.15 M NaCl, pH 4.7).
[0108]
2) 10 mg BSA or KLH was dissolved in 1 ml conjugation buffer.
[0109]
3) To 200 μl of the BSA or KLH solution prepared in 2), 50 μl of 1-carboxymethyluracil solution of 1) and 125 μl of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (50 μl in the case of KLH) ) Was added.
[0110]
4) The solution of 3) was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours and then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate.
[0111]
5) The solution obtained in 4) was applied to a gel filtration column (Sephadex G25) to remove unreacted 1-carboxymethyluracil and low molecular weight substances.
[0112]
6) The solution obtained in 5) was added to a D-Salt Dextran Desalting Column and the eluate was fractionated at 0.5 ml / tube. Absorption at 280 nm and 260 nm of each fraction was measured, and the first peak fraction was collected and used as a 1-carboxymethyluracil-BSA (or KLH) complex solution.
[0113]
7) Confirmation of the complex was performed by analyzing the absorbance at OD 270 nm derived from the pyrimidine skeleton structure of 1-carboxymethyluracil. As a result, it was estimated that 4.98 or 22.9 1-carboxymethyluracil bound to each BSA or KLH molecule.
2: Preparation of immune cells (antibody producing cells) by in vitro immunization
(A) Preparation of splenocytes
According to the method described in Example 1, 2 :, the spleen is aseptically removed from BALB / c mice, and the spleen cells are isolated to 1 × 10 6. 7 The cell suspension was adjusted to a concentration of cells / ml (serum-free RPMI 1640 medium, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and this cell suspension was seeded on a 6-well flat bottom plate at 2.5 ml / well.
3: Cell fusion P3U1 cells as in Example 1 as myeloma for cell fusion, and sensitized B cells as sensitized B cells (antibody producing cells) were further prepared according to 3: in Example 1. A cell population was used.
[0114]
Cell fusion was performed using the polyethylene glycol method in the same manner as in Example 1. Specifically, P3U1 cells and the sensitized cell group were mixed so that the number of cells was 1: 5, 50% polyethylene glycol (average molecular weight 1000) was added, and gently mixed. Next, the resultant was dispersed in RPMI 1640 medium, centrifuged (1000 rpm, room temperature, 7 minutes) to precipitate cells, and the supernatant was removed. This was diluted with HAT medium containing 10% FBS (1.6 × 10 6 as sensitized cells). 6 Cells / ml), this cell suspension was seeded on a 96-well flat bottom plate at 250 μl / well, and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 Under static culture.
4: Selection of hybridoma
In the HAT medium used for the stationary culture, only cell-fused hybridomas grow and form colonies. Using this, for the hybridoma obtained 10 to 14 days after the stationary culture, an ELISA method using an immune antigen is used to determine whether or not an antibody having the desired properties is produced in the culture supernatant. Were used to screen.
(A) Screening by ELISA
50 μl / well of 1-carboxymethyluracil-BSA complex 10 μg / ml (BSA equivalent) obtained in 1: was placed in a 96-well immunoplate and left at 37 ° C. for 2 hours. After standing, the plate was washed 7 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., PBS-T), and PBS containing 3% BSA was added at 200 μl / well for blocking. The plate was allowed to stand overnight at 0 ° C. and further washed three times with PBS-T to prepare an antigen adsorption plate.
[0115]
On the other hand, (i) 30 μl of PBS was added to 30 μl of the hybridoma culture supernatant and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. (Ii) 30 μl of PBS containing uracil (1 mg / ml) was added to 30 μl of the hybridoma culture supernatant and left at 37 ° C. for 1 hour. Or (iii) 1 μg / ml normal mouse IgG (manufactured by Biological) was added to the antigen-adsorbed 96-well plate prepared above at a rate of 50 μl / well, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. The wells were then washed 7 times with PBS-T, and alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-mouse multivalent immunoglobulin antibody (manufactured by Sigma) diluted 1000-fold with PBS containing 1% BSA was added at 50 μl / well. It was left at 1 ° C. for 1 hour. Thereafter, after washing 7 times with PBS-T, a solution obtained by dissolving p-nitrophenyl phosphate disodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a substrate buffer (pH 9.8) so as to be 1 mg / ml was added at 100 μl / ml. The wells were allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes, then
[0116]
The absorption rate was determined according to the method of Example 1.
[0117]
As a result of selection by the above screening, three types of monoclonal antibody-producing cells (3H5, 5C9 and 5D10) were obtained.
5: Cloning
The monoclonal antibody-producing hybridoma obtained above was cloned using a known and commonly used limiting dilution method.
[0118]
Specifically, the number of monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in 4: was counted, and 0.8% / 0.25 ml / well, 10% FBS and 10% BM conmeded H1 (registered trademark, manufactured by Boehringer Mannheim) Incorporated with RPMI1640 medium containing 2 The cells were cultured at a concentration of 5% and 37 ° C. for 10 to 14 days.
[0119]
The obtained clones were selected using the same ELISA method as described in 4 :. As a result, several monoclonal antibody-producing hybridomas were cloned as cells producing an antibody specific for uracil.
Example 5 Immunogen Use of uracil derivative-shreper complex-2
1: Immunogen Preparation of (uridine dialdehyde-shipper complex)
In the same manner as in Example 1, an immunogen EDC conjugation kit (Immunimmun Immuno EDC Conjugation Kit, manufactured by Pierce) was used to bind bovine serum albumin (BSA) to uridine dialdehyde according to the attached manual. A BSA complex was prepared. Specifically, it was prepared by the following method.
[0120]
1) 0.5 μl of 0.3M NaHCO in 200 μg of BSA 3 Dissolved in buffer (pH 8.4).
[0121]
2) 2 mg of uridine dialdehyde and 0.5 ml of 0.3 M NaHCO 3 3 It melt | dissolved in the buffer solution (pH 8.4), 107 microliters of them was added to the BSA solution prepared by said 1).
[0122]
3) The solution prepared in 2) was stirred overnight at 4 ° C.
[0123]
4) 1.5 equivalent (2.66 μmol) NaBH of uridine dialdehyde 4 And left on ice for 3 hours.
[0124]
5) Then, further 1.5 equivalents (2.66 μmol) NaBH of uridine dialdehyde 4 And stirred again at 4 ° C. overnight.
[0125]
6) The pH was adjusted to 4.5 using acetic acid, and the solution was applied to a gel filtration column (Sephadex G25) to remove unreacted uridine dialdehyde and low-molecular substances.
[0126]
7) The solution obtained in 6) was added to a D-Salt Dextran Desalting Column and the eluate was fractionated at 0.5 ml / tube. Absorption at 280 nm and 260 nm of each fraction was measured, and the first peak fraction was collected and used as a uridine dialdehyde-BSA complex solution.
[0127]
8) Confirmation of the complex was performed by analyzing the absorbance at OD 260 nm derived from the pyrimidine skeleton structure of uridine dialdehyde. As a result, it was estimated that 27.8 uridine dialdehydes were bound per molecule of BSA.
[0128]
Such a complex can be used for obtaining a hybridoma and a monoclonal antibody in the same manner as in Example 4.
Example 6 Immunogen Use of uracil derivative-shreper complex as
1: Immunogen Preparation of (5-Bromo-1-carboxymethyluracil-Shipper complex)
In the same manner as in Example 1, using an Immunogen EDC Conjugation Kit (Immunimmune EDC Conjugation Kit, manufactured by Pierce), bovine serum albumin (BSA) or hemocyanin was added to 5-bromo-1-carboxymethyluracil according to the attached manual. (KLH) was coupled to prepare a 5-bromo-1-carboxymethyluracil-BSA (or KLH) complex. Specifically, it was prepared by the following method.
[0129]
1) 4 mg of 5-bromo-1-carboxymethyluracil was added to a 1 ml volume of conjugation buffer (0.1 M MES (2- (N-Morpholino) -ethane sulphonic acid), 0.9 M NaCl, 0.02% NaN 3 , PH 4.7).
[0130]
2) 10 mg of BSA (or KLH) was dissolved in 1 ml of conjugation buffer.
[0131]
3) To 200 μl of BSA (or KLH) solution prepared in 2), 50 μl of 1) 5-bromo-1-carboxymethyluracil solution and 125 μl of 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) (50 μl for KLH) was added.
[0132]
4) The solution of 3) was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours and then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate.
[0133]
5) The solution obtained in 4) was added to a D-Salt Dextran Desalting Column, and the eluate was fractionated at 0.5 ml / tube. Absorption at 280 nm and 260 nm of each fraction was measured, and the first peak fraction was collected to give a 5-bromo-1-carboxymethyluracil-BSA (or KLH) complex solution.
[0134]
6) Confirmation of the complex was performed by analyzing the absorbance at OD 280 nm derived from the pyrimidine skeleton structure of 5-bromo-1-carboxymethyluracil. As a result, regarding the 5-bromo-1-carboxymethyluracil-BSA complex, it was estimated that 7.31 uridine aldehydes were bound per BSA molecule.
[0135]
Such a complex can be used for obtaining a hybridoma and a monoclonal antibody in the same manner as in Example 4.
[0136]
Industrial applicability
Since the monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with uracil, uracil in a sample can be measured easily, rapidly and selectively. Furthermore, since the monoclonal antibody does not show any reactivity to pseudouridine and dihydrouracil, it is useful for selection of DPD deficient by examining human urine samples. This is extremely useful for screening DPD-deficient cancer patients who are contraindicated in the administration of tumor agents.
[0137]
The present invention provides a method for selecting a safe treatment method in anti-tumor agent treatment for cancer patients, and a tool used therefor.
[0138]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of examining the reactivity against uracil by the indirect competitive inhibition ELISA method for the monoclonal antibody of the present invention obtained in Example 1 (Example 2). The horizontal axis indicates the amount of uracil (μg / ml), and the vertical axis indicates the absorption rate (%).
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