JP3515108B2 - 二本鎖rnaの製法とその応用 - Google Patents
二本鎖rnaの製法とその応用Info
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Description
る。
イルスのようなある種の微生物中のみに実際に存在す
る。最近まで、二本鎖RNAは本質的に理論的興味のある
分子としてのみ考えられていて、これの応用は基礎研究
にのみ関連していた。
合成の開始と同様、発現の制御現象に一時的に関与でき
ること[デクラークら、メソッド イン エンザイモロ
ジー(DECLERQ et al.,Methods in Enzymology),1981,
78,291及びWU−L1,ジェイ.バイオル.ケム(J.Biol.Ch
em.),1990,265,5470]及びそれらが治療への応用を考
えることができる抗増殖性を有すること〔オーベルら、
プロク.ナット.アカッド.サイ.(AUBEL et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.),USA 1991,8,906〕が例証されてい
る。
NA)を実際上に合成できることが重要である。
る。今日まで記載された少ない方法は3つの範疇に分け
ることができる。
ド ジー.(BACCARDO G.)ら〔ダブル ストランデッ
ド RNA ウイルス(Double stranded RNA viruses),19
83,ビショップ編(Bishop Eds.)エルゼイラー(Elseri
er),ニューヨーク(NY)〕及びより最近ではドュリウ
(DULIEU)ら〔ジェイ.バイオル.メソッズ(J.Virol.
Methods),1989,24,77−84〕に記載されている。
RIED)ら〔プロック.ナット.アカッド.サイ.(Pro
c.Natl.Acad.Sci.)USA,1978,75 4225〕及びアル−ハー
キム(AL−HAKEEM)ら〔アナル.バイオケム.(Anal.B
iochm.),1987,163,433−4139〕によって示されてい
る。
あるが、dsRNAの配列と長さは、微生物自体で決まるの
はいうまでもない。酵母は、dsRNA生産の原料としては
よいルートではあるが、所定配列の合成が全くできな
い。
NAの合成が、サドハー(SADHER)ら〔バイオケム.イン
ト.(Biochem.Int.),1987,14,1015〕によって報告さ
れている。次いで、各RNA鎖は、DNA−依存性RNAポリメ
ラーゼのプロモータ配列の下流に、転写されるDNA配列
を含有する組換えプラスミドをインビトロ転写で合成さ
れる。次で、一本鎖RNAを精製、定量し、結合させてハ
イブリッド化で二本鎖RNAを形成する。
A)、ネイチャー(Nature),1990,343,484〕は、合成DN
A鋳型をRNAへ転写することからなるミリガン(MILLIGA
N)のRNA合成〔ヌクレ イック アシッド レス.(Nu
cleic Acids Res.),1987,21 8783〕を用いている。次
いで、この一本鎖RNAを結合させ互いにハイブリッド化
する。
イブリッド化の前に作られた2つのRNA鎖を精製するこ
とを必要とするために、実施するには比較的長くかつ困
難である。
403号)は、規定された長さではあるが、繰返し又はホ
モポリ マー配列をもった二本鎖RNAの製法を記載して
いる。しかし、何れの場合も、この技術をより複雑な配
列を有するRNAの合成に応用できない。
ら二本鎖RNAの合成をしうる方法をここに開発した。DNA
配列の2つの相補鎖の同時転写が、定められた条件下で
同じ反応中で行われると、形成された2つの転写物が、
その間で直ちにハイブリッド化され、二本鎖RNAを生ず
ることを実際に観察した。
存在するDNA配列の2つの相補鎖で行われることを特徴
とする二本鎖RNAの製法である。この目的のために、該D
NA鎖の各々上で転写される配列は、プロモータ配列のコ
ントロール下に置かれる。
る結合部位を有するDNAの二本鎖配列を意味するものと
理解されている。RNAポリメラーゼは、このプロモータ
配列が結合すると転写を開始する。
は、例えば、ファージT7,T3又はSP6のRNAポリメラーゼ
で認識される配列を挙げることができる。しかし、これ
に限定されるのでなく、当業者であれば、このように同
定される何れかのプロモータ配列であり、入手できるRN
Aポリメラーゼに対応するものが、使用しうることは明
らかであろう。
るDNAの2つの鎖は、2つの異なるジュプレックス(dup
lex)に属し、これらは、それぞれ少なくとも部分的に
相補的な配列を有するDNA鎖を形成している。
するDNAの2つの鎖は、同じジュプレックス中で結合し
ている。
のプロモータ(一つは鎖の1つの転写をコントロール
し、他方は、相補鎖のそれである)を有する。これらの
プロモータは、同一又は異なってもよい。発明者らは、
各末端にプロモータ配列を備えたDNAジュプレックスが
所定長さのRNAを直接的に生成でき、対で結合して二本
鎖RNAを形成できることを実際に観察した。
と非常に驚くべきことである。すなわち、酵素はプロモ
ータ配列に結合し、DNA鋳型にそって動き、相補RNA鎖を
合成する。今日まで、DNA鋳型で2つのプロモータ配列
を含むとすると、酵素の反対方向への動きが分断され、
不完全な配列ができ、従って対になることが不可能でな
くとも困難であると推測されていた。
の2つの相補鎖を同時にかつ完全に転写しうることを観
察し、すなわち、形成されるRNAの2つの相補鎖のハイ
ブリッド化は即時である。
るRNAは、DNA鋳型とヌクレアーゼに関して、一本鎖RNA
より不活性であることから、二本鎖DNAの合成収率は一
本鎖の収率より良好である。
各種の方法が使用できる。
を直接ハイブリッド化することにより作ることができ、
このヌクレオチドは化学合成に由来する。各オリゴヌク
レオチドは、各末端に、RNAポリメラーゼに特異的なプ
ロモータの配列、好ましくは、T7ファージからのRNAポ
リメラーゼのような、ファージ由来のRNAポリメラーゼ
についてのものを保持する。このような配列は〔チャン
ベルリン(CHAMBERLIN)、ザ エンザイムズ(The Enzy
mes)、1982、XV、アカデミック出版(Academic Pres
s)〕に記載されている。
で互いにハイブリッド化される。DNAの二本鎖RNAが得ら
れ、これは合成ヌクレオチドの場合に、好ましくは40〜
100塩基対の長さを有し、各末端にプロモータ配列を備
えている。
つのオリゴヌクレオチドの部分的ハイブリッド化、次い
でDNAポリメラーゼによる3'末端の拡長によって得るこ
とができる。この技法は、前に報告されたものより長さ
がより大で安価であるDNA鋳型を得ることができる。
(Polymerace Chain Reaction)〕、LCR〔リガーゼ チ
ェーン 反応(Ligase Chain Reaction〕、NASBA〔核酸
配列−基礎増幅(Nucleic Acid Sequence−Based Ampli
fication)〕など、〔リチャード(RICHARD),カレ.
オプジェ.バイオテック(Curr.Opj.Biotec.),1991,2,
76〜85参照〕のような増幅方法により、転写されるべき
DNA中に少なくとも1つのRNAポリメラーゼの5'プロモー
タ配列中に保持するプライマーを組込むことからなる。
そのようにして、反応の終りに得られる二本鎖DNAは、
好ましくは50〜100の間の塩基対の長さを有し、各末端
にRNAポリメラーゼ用のプロモータ配列を備えている。
1985,230,1350及びScience,1988,239,487〕に記載され
ている。プロ モータのPCRによる組込みは、一本鎖RNA
の合成に関する方法を記載するムラカワ(MURAKAWA)
(DNA,1988,7,287)および国際特許WO 89/07149(SOMME
R),および国際特許出願89/01050(BURG)に記載され
ている。
たDNA鋳型は、これらの鋳型により保持されるプロモー
タを認識するRNAポリメラーゼ(又はRNAポリメラーゼ
類)とリボヌクレオチド 三リン酸の存在下でインキュ
ベートされる。反応条件は、選択されたRNAポリヌラー
ゼの型によって決められる。
ド 三リン酸(1〜5mMM)を使用するのが特に有利で
ある。
単位の酵素と2.5mMの各リボヌクレオチド 三リン酸を
使用するのが好ましい。
鎖は直ちにハイブリッド化され、一本鎖RNAより安定で
より不活性な二本鎖RNAを形成する。各鋳型DNAは少なく
とも100又はそのようなRAN鎖を生ずる。
本鎖RNAは、プロモータのそれと相補的な配列の一本鎖
からなる3'末端を有する、鋳型DNAのRNAの形でコピーと
して存在する。
できる。すなわち、この結合は、例えば、アビジンでコ
ートした支持体に付着できるビオチンのようなリガンド
について、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの5'末
端への付加で行われうる。この付着は、合成した二本鎖
RNAのよりすみやかな精製を可能とするのみならず、支
持体に付着した鋳型の再使用を可能とする。
Aは、DNAから分離し、任意に精製(この操作はDNA鋳型
が支持体に付着していると簡略化される)するか、又
は、分析手段として使用されるときは、直接使用又は定
量できる。
多数の応用ができる。
の長さと配列の二本鎖RNAフラグメントの大量を実際に
得ることが可能となる。
〔例えば、デクラーク,WU−LI及びオーベル(上述で引
用)の刊行物〕、基礎研究に関する各種応用又は治療に
勿論使用できる。
用の二本鎖RNAフラグメントの使用、特に生体サンプル
中のターゲットの核酸配列の検出に関して、これまで示
唆されていなかった完全に新しい応用ができる。この発
明の目的に、ターゲット配列とは、分析すべきサンプル
中で検出することが望まれる何れの核酸配列をも意味す
る。
の検出が含まれる。
と相補的な一本鎖核酸フラグメントからなるプローブが
含まれる。加えて、このプローブは、標的配列/プロー
ブハイブリッド化産物を直接的に可視化させるためラベ
ル化さている。
の産生をするのに十分に多数のコピーが表された配列の
検出のみできる。
ー数を増加さすことが提案された。
ラーゼ鎖増幅又はPCR(ポリメラーゼチェーン 反応)
の原理に基づくものである。この技術は、二本鎖DNA配
列の選択的増幅をする。
われ、そのサイクルは、増幅さすべき配列からなるDNA
の変性、増幅さすべき鎖の各々の3'末端での該配列の側
でのプライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによ
りプライマーの3'での伸長新しいサイクルを開始する、
プライマーの伸長から得られるDNA二重鎖の変性からな
る。
れる。実際に、指数的増殖フェーズの後に、プラトーフ
ェーズになり、30増幅サイクル後に、約105コピーが得
られる。
トは、標識化した特異プローブでのハイブリッド化、又
はエチジウム ブロミドなどの介在剤(intercalating
agent)の存在下でのアガロースゲル電気泳動後の直接
の可視化によって同定できる。
ついて、その使用が複雑であるというある種の問題があ
る。
般に、プローブが標的配列のみ認識しうるよう選択され
ることから、非常に特異的であると考えられる。しか
し、高価である標識化プローブの使用を必要とし、ハイ
ブリッド化が時間を増加させるいくつかの付加工程を必
要とする欠点がある。
することは、より早く安価である。しかし、この直接目
視には、増幅フラグメントのみに結合せず、高いバック
グラウンドになる反応混合物に存在する全ての核酸と結
合する介在分子が含まれている。
についてのこの問題を、二本鎖RNAの型でコピーを検出
することを提案することにより解決するものである。
容易に得ることができる。
タが挿入された、標的配列の二本鎖DNAコピーから一本
鎖RNAを合成し、任意の得られた一本鎖転写物をリプリ
カーゼ(replicase)QBの活性により増幅することが既
に提案されている(例えばヨーロッパ特許第397269号。
PCT88/10315号)。
は、特異プローブのハイブリッド化のみで達せられ、一
方、一本鎖RNAはヌクレアーゼで容易に分解される。対
照的に、この発明によって得られた二本鎖RNAはこのよ
うな欠点をもたない。生体サンプル中の特異配列を検出
するのにこの発明の二本鎖RNAを作る方法を使用するこ
とは、有利に、特異性と感度を増大することができるPC
R法を提供ものである。
ルから、標的配列の増幅用プロモータ配列を含有するプ
ライマーを用いて、PCRのような方法で特異的に作るこ
とができる。標的配列を含有するポジティブサンプルの
みがDNA鋳型の合成をさせる。次いで、この鋳型は、RNA
ポリメラーゼ(類)によって二本鎖RNAの少なくとも100
又はその程度のコピーに転写される。この二本鎖RNAは
鋳型により規定され、従って、標的核酸で規定されてい
る長さと配列を有し、核酸アッセイの適当な手段で定量
できる。
プル中にターゲット核酸が存在することを意味すると知
るべきである。確かに、サンプルがネガティブのとき、
鋳型DNAは形成せず、次いでプロモータは、RNAポリメラ
ーゼで認識できないDNAの一本鎖の型で残る。
き配列に特異の核酸プローブでのハイブリッド化のよう
な適当手段で行うことができる。介在分子とRNAの二本
鎖との特異な相互作用で誘導されたシグナルを測定する
ことにより、均一培体中での検出を行うのが特に有利で
ある。これには、特異プローブの使用と、支持体の使用
も必要としない。従って迅速で安価である。
種の介在剤が使用できる。DNAよりもRNAにより特異的に
作用するものが好ましい。発明者らは介在剤としてエチ
ジウム ホモダイマー又はプロピオニウム ヨーダイド
を使用すると、よい感度と特異性の条件下で、得られた
RNAを検出しアッセイすることが可能となることを特に
観察している。
蛍光を直接測定するのと比較して、この発明の方法は、
次の利点を示す。
を生成する転写が、蛍光シグナルを100に等しいかそれ
以上の因子で増幅し、ノイズに対するシグナル比は、RN
Aに転写されないプライマーとDNAの残留一本鎖が介在分
子と有意に干渉しないので、実際により良好である。
流で行わせる。実際に、この方法は、初期PCRサイクル
の数を減少させ、そのため、純粋にRCRのタイプ(1+
X)nの指数的増幅フェーズ内に止まる。その上、この
発明の方法によるdsRNAの転写からの付加的増幅は直線
的である。換言すれば、増幅因子は一定で、反応混合物
中に存在する鋳型DNAの量に従属しない。全体的に指数
的であり従って直線的である増幅現象が存在する。この
数学的機能の分析は、定量が指数的ゾーンを越えるプラ
トーの発現によって複雑化される通常のPCR技法の場合
より簡単である。
増幅の規則性が良好なことは、測定の精度を良好にし、
繰り返しを容易にさせ、定量的測定の使用を促進する。
標的核酸配列の検出に特に有利である改良をさせる。
構造をその長さの1部にのみ有し、末端の少なくとも1
つが一本鎖型であるRNAを合成することができる。
部分を介して、暴露プローブに付着できる。
は、配列の1部が共通している2つのDNA二重鎖(各々R
NAポリメラーゼのプロモータ配列を含有)の同時転写に
よって作ることができる。
鎖配列末端を有する二本鎖型である。100以上の増幅係
数で得られるこのRNAハイブリッドは、固形支持体に付
着した末端の1つの配列と相補的な配列を有する核酸
(レシピエント核酸)にハイブリッド化できる。
は支持体と共有結合又は非共有結合で付着する。配列を
異にするオリゴヌクレオチドは同じ支持体に異なる位置
で結合できる。かくして、いくつかの標的DNAは、同じ
ボトルで転写でき、転写は共通支持体上で検出される。
暴露は、例えば、UVに暴露された介在化合物によって発
生したRNAの二本鎖の蛍光によってもたらされる。
でき、支持体に付着した核酸により特異的様式で検出で
きる。
的記載でより明らかに理解されよう。
ルス6/11の蛍光による分析的応用検出 DNAをPCT出願 WO10 09/15881に記載の方法のような
手順による特異な方法によって検出する。第一に、サン
プルを一対の一次プライマーで増幅し、次いでこの生成
物を十分に希釈し、5'にT7 RNAポリメラーゼについての
プロモータ配列を含んでいるプライマーで再増幅する。
次いで、二本鎖RNAへの転写を、原料として増幅生成物
を用いて直接行い、最終物の蛍光をエチジウム ブロミ
ドの介在後に測定する。
6/11を有する細胞からのDNAの10ナノグラムを、200μ
M dATP,dATP,dTTP,dGTP,10mM Tris−HCl pH8.5;50mM KC
l;1.5mM MgCl2;0.01%ゼラチン;2,5U Taqポリメラー
ゼ、および10pmolオリゴヌクレオチド プライマーの存
在下で、50μlの容量中で増幅させる。HPV 6/11の位置
と、用いられた一次プライマーの配列は、以下の通りで
ある。
た。
た。この溶液2μlは、二次PCR増幅に用られた。
用いられ;二次プライマーの成分および量のみが変えら
れる。
モター配列5'に保持されているプライマーの配列は、以
下の通りである。
mol(もしくは、25μlにつき1pmol)。
接行われ、滅菌DEPC水中、80mM Tris−HCl pH8.0,50m
M NaCl,20mM MgCl2,4mMスペルミジン、10mM DDT,2.5mM
NTP(リボヌクレオチド 三リン酸)および25U T7 RNA
ポリメラーゼ(BRL)を含む溶液が容量比で加えられ
る。
M,EDTA 5mM,EtBr 0.5μg/ml(エチジウム ブロミド)
からなる測定媒体に加えられる。
の条件は、以下のとおり、励起波長510nm,(sw 8nm)、
放射波長590nm(sw 8nm)、1mlのプラスチック キュベ
ット中の測定である。
れた。結果は、図1および図2に示される。
CR増幅後のDNAの蛍光の直接測定(360/450nm)。
写後のEtBrによる測定。
ユニットにおいて)蛍光の百分率によって表される。
(EtBrの蛍光)。
蛍光が、H33(負に対して5)により測定される、とこ
ろが、二本鎖RNAへ転写された後の同様のサンプルおよ
びEtBr(負に対して12)を用いた測定については、蛍光
は、1800ユニットである。
合成 二本鎖DNA鋳型は、それぞれの鎖上にRNAポリメラーゼ
に対するプロモータと鎖のうちの一つの5'にビオチン基
を含むよう調製される。その後、この鋳型は、アビジン
でコートされた支持体に付着され、この支持体上で転写
は、直接に行われる。
のフラグメントを表す。
り調製される。一次および二次増幅は、ROGETらの方法
〔ヌクレイック アシッド レス.、(Nucleic Acid R
es.)、1989、17、7643−7651〕による、前もって、5'
においてビオチン化されたT7aプライマーの例1に記載
された手順に従って行われる。もし、開始DNAが十分に
精製されていれば、T7aプライマー(5'においてビオチ
ン化された)またはT7bプライマーを用いる単一増幅ス
テップにより、鋳型を直接調製することができる。
とT7O2下の部分的なハイブリッド化とその後の、二つの
鎖−bio−T7O1の延長により生産される。
ブミン)のコートを、ポリプロピレン製のヌンク(Nun
c)のひれのある試験管中で行われる〔サウバイゴー(S
AUVAIGO)ら、ヌクレ.アシッズ.レス.(Nucl.Acids
Res.)1989、18、3175−3183〕。この試験管は、4℃で
数カ月間保存しうる。
ン化されたPCR生成物は、37℃で2時間、0.05M Tris−H
Cl緩衝液、pH9.2、0.5M NaCl 100μl中におけるインキ
ュベーションにより、支持体上に付着された。その後、
その試験管は、0.5%SDS存在下、この同じ緩衝液で3回
洗浄し、その後、1回滅菌水で洗浄する。
て保存されうる。
めの反応は、0.04M Tris−HCl、pH8.0;8mM MgCl2:スペ
ルミジン;25mM NaCl;5mM DTTおよび2mM ATP,CTP,UTP,GT
Pの100μl中で、50UのT7 RNAポリメラーゼ(BRL)によ
り引き起こされる。
収され、400μlの冷エタノールと混合された。その
後、RNAは、−20℃で沈殿され、遠心分離により単離さ
れた。得られた沈殿は滅水に溶解され、その後、UV分光
光度計により定量された。この二本鎖RNAの完全性は、
アガロースゲル上での電気泳動的操作により制御され
た。その電気泳動的パターンは、図4に表される。二本
鎖構造は、熱による変性(100℃への加熱)により示さ
れた。リボヌクレオチドの性質は、高温でのアルカリ溶
解により、確認された。
ト)が、それぞれの反応中で合成された。
り活性の損失無く、数度使用されうる。
含む二本鎖RNAの合成:HPV 6−IIウイルスの検出 用いられた手順は、それぞれのサンプル上で平行して
行われた2つのPCR反応による、2つの二重鎖のDNA(そ
れぞれは、T7 RNAポリメラーゼに対するプロモター配列
を備えている)の形成からなる。
二本鎖型にあるRNAに転写される。
159塩基長の二本鎖部分を含む。この後、この生成物
は、ナイロン膜に付着したオリゴヌクレオチドにハイブ
リッド化され、そして蛍光により検出される。
後、2つのPCR増幅は、次のプライマーの対を用いて、
例1に記載の条件下で独立に行われる。
5UのT7 RNAポリメラーゼを含む転写培地の2容が加えら
れる(例1参照)。
クレオチドは、サイキら、プロク.ナット.アカド.サ
イ.(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、86、6230−6234(19
89)により記載された技術に従って、ナイロン膜に付着
される。
ッド化される(55℃にて、5xSSPE、0.1%SOS)。その
後、膜は、同じ培地中で55℃にて5分間洗浄され、次
に、素早く5mMリン酸緩衝液、pH7.0中で洗浄される。
て溶液中でインキュベート(2分間)により行われ、そ
の後、5mMリン酸緩衝液中で、簡単な洗浄が行われる。
次に、蛍光スポットは、260nmおよび520nmにおける放射
下で、直接観察される。
かしながら、負のものは、バックグラウンドと区別し得
ない。
Claims (9)
- 【請求項1】同時に起こる転写が、同じ反応混合物中に
存在するDNA配列の2つの相補的な鎖について行われ、
迅速なハイブリッド化が、2つの得られた転写物につい
て行われる方法からなる二本鎖RNAの製法。 - 【請求項2】転写を意図するDNAの2つの鎖が、同じ、
又は2つの異なるRNAポリメラーゼにより認識されるプ
ロモータ配列の制御下にある請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】転写を意図するDNAの2つの鎖が、2つの
異なる二重鎖に属するか、又は同じ二重鎖で結合される
請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】転写を意図するDNAの鎖が、固体支持体に
付着されている請求項1〜3のいずれか1つに記載の方
法。 - 【請求項5】さらに、得られた二本鎖RNAの検出、およ
び/もしくはアッセイのための工程を有する請求項1〜
4のいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項6】該標的配列の2つの相補的な鎖の全部もし
くは部分の同時に起こる転写が、請求項1〜5のいずれ
か1つに記載の方法によって行われることを含む工程か
らなる、生体サンプル中の標的DNA配列の検出、および
/もしくはアッセイのための方法。 - 【請求項7】転写工程に先立って、標的配列の増幅が行
われる少なくとも一つの工程を含む請求項6に記載の方
法。 - 【請求項8】検出される標的配列の転写生成物の少なく
とも一つの断片が、単一鎖RNAの型であり、該転写生成
物が単一鎖断片により固体支持体に付着される請求項6
又は請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】幾つかの異なる標的配列が転写され、同じ
サンプル中において同時に検出される請求項6〜8のい
ずれか1つに記載の方法。
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