Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP3515108B2 - 二本鎖rnaの製法とその応用 - Google Patents

二本鎖rnaの製法とその応用

Info

Publication number
JP3515108B2
JP3515108B2 JP51068493A JP51068493A JP3515108B2 JP 3515108 B2 JP3515108 B2 JP 3515108B2 JP 51068493 A JP51068493 A JP 51068493A JP 51068493 A JP51068493 A JP 51068493A JP 3515108 B2 JP3515108 B2 JP 3515108B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
double
rna
transcription
stranded rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51068493A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH07505762A (ja
Inventor
リバシュ,チレー
フュクエ,ブリギイト
テオール,ロバート
Original Assignee
シス バイオ インターナショナル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シス バイオ インターナショナル filed Critical シス バイオ インターナショナル
Publication of JPH07505762A publication Critical patent/JPH07505762A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3515108B2 publication Critical patent/JP3515108B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28N-glycosides
    • C12P19/30Nucleotides
    • C12P19/34Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、二本鎖RNAの合成法とその応用に関す
る。
二本鎖リボ核酸は天然にはまれに存在し、酵母又はウ
イルスのようなある種の微生物中のみに実際に存在す
る。最近まで、二本鎖RNAは本質的に理論的興味のある
分子としてのみ考えられていて、これの応用は基礎研究
にのみ関連していた。
しかし、二本鎖RNAが細胞によるインターフェロンの
合成の開始と同様、発現の制御現象に一時的に関与でき
ること[デクラークら、メソッド イン エンザイモロ
ジー(DECLERQ et al.,Methods in Enzymology),1981,
78,291及びWU−L1,ジェイ.バイオル.ケム(J.Biol.Ch
em.),1990,265,5470]及びそれらが治療への応用を考
えることができる抗増殖性を有すること〔オーベルら、
プロク.ナット.アカッド.サイ.(AUBEL et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.),USA 1991,8,906〕が例証されてい
る。
そのため、所定の配列と長さを有する二本鎖RNA(dsR
NA)を実際上に合成できることが重要である。
しかし、二本鎖RNAの製造は困難であると考えられ
る。今日まで記載された少ない方法は3つの範疇に分け
ることができる。
1)生物学的材料からの二本鎖RNAの抽出。
ウイルスからの二本鎖RNAの抽出は、例えば、バカル
ド ジー.(BACCARDO G.)ら〔ダブル ストランデッ
ド RNA ウイルス(Double stranded RNA viruses),19
83,ビショップ編(Bishop Eds.)エルゼイラー(Elseri
er),ニューヨーク(NY)〕及びより最近ではドュリウ
(DULIEU)ら〔ジェイ.バイオル.メソッズ(J.Virol.
Methods),1989,24,77−84〕に記載されている。
ある種の酵母にdsRNAが存在することが、フリード(F
RIED)ら〔プロック.ナット.アカッド.サイ.(Pro
c.Natl.Acad.Sci.)USA,1978,75 4225〕及びアル−ハー
キム(AL−HAKEEM)ら〔アナル.バイオケム.(Anal.B
iochm.),1987,163,433−4139〕によって示されてい
る。
dsRNAの酵母からの抽出は、定量的観点から有利では
あるが、dsRNAの配列と長さは、微生物自体で決まるの
はいうまでもない。酵母は、dsRNA生産の原料としては
よいルートではあるが、所定配列の合成が全くできな
い。
2)2つの単一鎖RNAのハイブリッド化。
2つの相補的な一本鎖RNAのハイブリッド化によるdsR
NAの合成が、サドハー(SADHER)ら〔バイオケム.イン
ト.(Biochem.Int.),1987,14,1015〕によって報告さ
れている。次いで、各RNA鎖は、DNA−依存性RNAポリメ
ラーゼのプロモータ配列の下流に、転写されるDNA配列
を含有する組換えプラスミドをインビトロ転写で合成さ
れる。次で、一本鎖RNAを精製、定量し、結合させてハ
イブリッド化で二本鎖RNAを形成する。
ごく最近では、〔バハッタカルヤ(BHATTACHARYY
A)、ネイチャー(Nature),1990,343,484〕は、合成DN
A鋳型をRNAへ転写することからなるミリガン(MILLIGA
N)のRNA合成〔ヌクレ イック アシッド レス.(Nu
cleic Acids Res.),1987,21 8783〕を用いている。次
いで、この一本鎖RNAを結合させ互いにハイブリッド化
する。
この技術は、2つの組換又は合成鋳型DNAを作り、ハ
イブリッド化の前に作られた2つのRNA鎖を精製するこ
とを必要とするために、実施するには比較的長くかつ困
難である。
3)ホモポリマー二本鎖RNAの製造 ジェイ.ヤノ(J.YANO)ら(フランス特許出願第2617
403号)は、規定された長さではあるが、繰返し又はホ
モポリ マー配列をもった二本鎖RNAの製法を記載して
いる。しかし、何れの場合も、この技術をより複雑な配
列を有するRNAの合成に応用できない。
しかし、この出願の発明者は、所定配列のDNA鋳型か
ら二本鎖RNAの合成をしうる方法をここに開発した。DNA
配列の2つの相補鎖の同時転写が、定められた条件下で
同じ反応中で行われると、形成された2つの転写物が、
その間で直ちにハイブリッド化され、二本鎖RNAを生ず
ることを実際に観察した。
この発明の主題は、同時転写が、同じ反応混合物中に
存在するDNA配列の2つの相補鎖で行われることを特徴
とする二本鎖RNAの製法である。この目的のために、該D
NA鎖の各々上で転写される配列は、プロモータ配列のコ
ントロール下に置かれる。
プロモータは、DNA依存性RNAポリメラーゼで認識され
る結合部位を有するDNAの二本鎖配列を意味するものと
理解されている。RNAポリメラーゼは、このプロモータ
配列が結合すると転写を開始する。
この発明の範囲で使用できるプロモータ配列として
は、例えば、ファージT7,T3又はSP6のRNAポリメラーゼ
で認識される配列を挙げることができる。しかし、これ
に限定されるのでなく、当業者であれば、このように同
定される何れかのプロモータ配列であり、入手できるRN
Aポリメラーゼに対応するものが、使用しうることは明
らかであろう。
この発明の好ましい具体例によれば、転写を意図され
るDNAの2つの鎖は、2つの異なるジュプレックス(dup
lex)に属し、これらは、それぞれ少なくとも部分的に
相補的な配列を有するDNA鎖を形成している。
この発明の他の好ましい具体例によれば、転写を意図
するDNAの2つの鎖は、同じジュプレックス中で結合し
ている。
この具体例で、二本鎖RNAに転写されるDNA配列は二つ
のプロモータ(一つは鎖の1つの転写をコントロール
し、他方は、相補鎖のそれである)を有する。これらの
プロモータは、同一又は異なってもよい。発明者らは、
各末端にプロモータ配列を備えたDNAジュプレックスが
所定長さのRNAを直接的に生成でき、対で結合して二本
鎖RNAを形成できることを実際に観察した。
このことは、RNAポリメラーゼの作用モードを考える
と非常に驚くべきことである。すなわち、酵素はプロモ
ータ配列に結合し、DNA鋳型にそって動き、相補RNA鎖を
合成する。今日まで、DNA鋳型で2つのプロモータ配列
を含むとすると、酵素の反対方向への動きが分断され、
不完全な配列ができ、従って対になることが不可能でな
くとも困難であると推測されていた。
しかし、発明者は、前の推測とは反対に、DNA二重鎖
の2つの相補鎖を同時にかつ完全に転写しうることを観
察し、すなわち、形成されるRNAの2つの相補鎖のハイ
ブリッド化は即時である。
このような条件の下で、ジュプレックス型で形成され
るRNAは、DNA鋳型とヌクレアーゼに関して、一本鎖RNA
より不活性であることから、二本鎖DNAの合成収率は一
本鎖の収率より良好である。
プロモータを備えた鋳型DNAの二本鎖を製造するのに
各種の方法が使用できる。
例えば、次の3つの方法が挙げられる。
鋳型二本鎖は、相補配列の2つのオリゴヌクレオチド
を直接ハイブリッド化することにより作ることができ、
このヌクレオチドは化学合成に由来する。各オリゴヌク
レオチドは、各末端に、RNAポリメラーゼに特異的なプ
ロモータの配列、好ましくは、T7ファージからのRNAポ
リメラーゼのような、ファージ由来のRNAポリメラーゼ
についてのものを保持する。このような配列は〔チャン
ベルリン(CHAMBERLIN)、ザ エンザイムズ(The Enzy
mes)、1982、XV、アカデミック出版(Academic Pres
s)〕に記載されている。
これらの2つの一本鎖DNAが等モル量加えられ、次い
で互いにハイブリッド化される。DNAの二本鎖RNAが得ら
れ、これは合成ヌクレオチドの場合に、好ましくは40〜
100塩基対の長さを有し、各末端にプロモータ配列を備
えている。
DNAの二本鎖は、3'末端の短いフラグメント上での2
つのオリゴヌクレオチドの部分的ハイブリッド化、次い
でDNAポリメラーゼによる3'末端の拡長によって得るこ
とができる。この技法は、前に報告されたものより長さ
がより大で安価であるDNA鋳型を得ることができる。
第3の方法は、PCR〔ポリメラーゼ チェーン 反応
(Polymerace Chain Reaction)〕、LCR〔リガーゼ チ
ェーン 反応(Ligase Chain Reaction〕、NASBA〔核酸
配列−基礎増幅(Nucleic Acid Sequence−Based Ampli
fication)〕など、〔リチャード(RICHARD),カレ.
オプジェ.バイオテック(Curr.Opj.Biotec.),1991,2,
76〜85参照〕のような増幅方法により、転写されるべき
DNA中に少なくとも1つのRNAポリメラーゼの5'プロモー
タ配列中に保持するプライマーを組込むことからなる。
そのようにして、反応の終りに得られる二本鎖DNAは、
好ましくは50〜100の間の塩基対の長さを有し、各末端
にRNAポリメラーゼ用のプロモータ配列を備えている。
PCR法は、サイキ(SAIKI)〔サイエンス(Science),
1985,230,1350及びScience,1988,239,487〕に記載され
ている。プロ モータのPCRによる組込みは、一本鎖RNA
の合成に関する方法を記載するムラカワ(MURAKAWA)
(DNA,1988,7,287)および国際特許WO 89/07149(SOMME
R),および国際特許出願89/01050(BURG)に記載され
ている。
この発明を構成する方法の実施では、かくして得られ
たDNA鋳型は、これらの鋳型により保持されるプロモー
タを認識するRNAポリメラーゼ(又はRNAポリメラーゼ
類)とリボヌクレオチド 三リン酸の存在下でインキュ
ベートされる。反応条件は、選択されたRNAポリヌラー
ゼの型によって決められる。
10〜50単位の低濃度の酵素と高濃度のリボヌクレオチ
ド 三リン酸(1〜5mMM)を使用するのが特に有利で
ある。
例えば、T7ファージ、RNAポリメラーゼの場合に、20
単位の酵素と2.5mMの各リボヌクレオチド 三リン酸を
使用するのが好ましい。
これらの条件下で、形成されているRNAの2つの相補
鎖は直ちにハイブリッド化され、一本鎖RNAより安定で
より不活性な二本鎖RNAを形成する。各鋳型DNAは少なく
とも100又はそのようなRAN鎖を生ずる。
各鎖上のプロモータからなるDNA鋳型から得られた二
本鎖RNAは、プロモータのそれと相補的な配列の一本鎖
からなる3'末端を有する、鋳型DNAのRNAの形でコピーと
して存在する。
全てのDNA鋳型ジュプレックスは任意に支持体と結合
できる。すなわち、この結合は、例えば、アビジンでコ
ートした支持体に付着できるビオチンのようなリガンド
について、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの5'末
端への付加で行われうる。この付着は、合成した二本鎖
RNAのよりすみやかな精製を可能とするのみならず、支
持体に付着した鋳型の再使用を可能とする。
この発明に従って上記のようにして得られた二本鎖RN
Aは、DNAから分離し、任意に精製(この操作はDNA鋳型
が支持体に付着していると簡略化される)するか、又
は、分析手段として使用されるときは、直接使用又は定
量できる。
この発明による方法は、実施することが容易なため、
多数の応用ができる。
先行技術の方法ではできなかった、単一工程で、所定
の長さと配列の二本鎖RNAフラグメントの大量を実際に
得ることが可能となる。
かくに得られたフラグメントは、先行技術で推奨され
〔例えば、デクラーク,WU−LI及びオーベル(上述で引
用)の刊行物〕、基礎研究に関する各種応用又は治療に
勿論使用できる。
加えて、この発明による二本鎖RNAの合成法は、診断
用の二本鎖RNAフラグメントの使用、特に生体サンプル
中のターゲットの核酸配列の検出に関して、これまで示
唆されていなかった完全に新しい応用ができる。この発
明の目的に、ターゲット配列とは、分析すべきサンプル
中で検出することが望まれる何れの核酸配列をも意味す
る。
多数の診断法には、生体サンプル中の核酸の特異配列
の検出が含まれる。
提案された検出の第1の方法は、検出すべき標的配列
と相補的な一本鎖核酸フラグメントからなるプローブが
含まれる。加えて、このプローブは、標的配列/プロー
ブハイブリッド化産物を直接的に可視化させるためラベ
ル化さている。
しかし、この技術は、可視のハイブリッド化シグナル
の産生をするのに十分に多数のコピーが表された配列の
検出のみできる。
そのため、標的配列の検出を改良するため、そのコピ
ー数を増加さすことが提案された。
この目的に最近、最も繁用されている技術は、ポリメ
ラーゼ鎖増幅又はPCR(ポリメラーゼチェーン 反応)
の原理に基づくものである。この技術は、二本鎖DNA配
列の選択的増幅をする。
よく知られたPCRの原理を以下に簡単に説明する。
ターゲット配列の増幅は、一連のサイクルによって行
われ、そのサイクルは、増幅さすべき配列からなるDNA
の変性、増幅さすべき鎖の各々の3'末端での該配列の側
でのプライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによ
りプライマーの3'での伸長新しいサイクルを開始する、
プライマーの伸長から得られるDNA二重鎖の変性からな
る。
かくして、標的配列は、理論的には、指数的に増幅さ
れる。実際に、指数的増殖フェーズの後に、プラトーフ
ェーズになり、30増幅サイクル後に、約105コピーが得
られる。
次いで、標的配列の増幅からの二本鎖DNAフラグメン
トは、標識化した特異プローブでのハイブリッド化、又
はエチジウム ブロミドなどの介在剤(intercalating
agent)の存在下でのアガロースゲル電気泳動後の直接
の可視化によって同定できる。
しかし、PCR増幅法は、特に多数のサンプルの分析に
ついて、その使用が複雑であるというある種の問題があ
る。
標識化プローブのハイブリッド化を含む検出法は、一
般に、プローブが標的配列のみ認識しうるよう選択され
ることから、非常に特異的であると考えられる。しか
し、高価である標識化プローブの使用を必要とし、ハイ
ブリッド化が時間を増加させるいくつかの付加工程を必
要とする欠点がある。
一連の分析の枠内での、増幅フラグメントを直接目視
することは、より早く安価である。しかし、この直接目
視には、増幅フラグメントのみに結合せず、高いバック
グラウンドになる反応混合物に存在する全ての核酸と結
合する介在分子が含まれている。
この発明は、標的配列の増幅からのDNAフラグメント
についてのこの問題を、二本鎖RNAの型でコピーを検出
することを提案することにより解決するものである。
この発明の方法により、二本鎖RNAの型でのコピーを
容易に得ることができる。
標的配列の検出を改良するため、鎖の1つにプロモー
タが挿入された、標的配列の二本鎖DNAコピーから一本
鎖RNAを合成し、任意の得られた一本鎖転写物をリプリ
カーゼ(replicase)QBの活性により増幅することが既
に提案されている(例えばヨーロッパ特許第397269号。
PCT88/10315号)。
しかし、このようにして得られた一本鎖RNAの検出
は、特異プローブのハイブリッド化のみで達せられ、一
方、一本鎖RNAはヌクレアーゼで容易に分解される。対
照的に、この発明によって得られた二本鎖RNAはこのよ
うな欠点をもたない。生体サンプル中の特異配列を検出
するのにこの発明の二本鎖RNAを作る方法を使用するこ
とは、有利に、特異性と感度を増大することができるPC
R法を提供ものである。
例えば、プロモータを備えた鋳型DNAは、核酸サンプ
ルから、標的配列の増幅用プロモータ配列を含有するプ
ライマーを用いて、PCRのような方法で特異的に作るこ
とができる。標的配列を含有するポジティブサンプルの
みがDNA鋳型の合成をさせる。次いで、この鋳型は、RNA
ポリメラーゼ(類)によって二本鎖RNAの少なくとも100
又はその程度のコピーに転写される。この二本鎖RNAは
鋳型により規定され、従って、標的核酸で規定されてい
る長さと配列を有し、核酸アッセイの適当な手段で定量
できる。
確かに、媒体中に二本鎖RNAが存在することは、サン
プル中にターゲット核酸が存在することを意味すると知
るべきである。確かに、サンプルがネガティブのとき、
鋳型DNAは形成せず、次いでプロモータは、RNAポリメラ
ーゼで認識できないDNAの一本鎖の型で残る。
形成した二本鎖RNAの検出又はアツセイは、検出すべ
き配列に特異の核酸プローブでのハイブリッド化のよう
な適当手段で行うことができる。介在分子とRNAの二本
鎖との特異な相互作用で誘導されたシグナルを測定する
ことにより、均一培体中での検出を行うのが特に有利で
ある。これには、特異プローブの使用と、支持体の使用
も必要としない。従って迅速で安価である。
この発明による方法で得られる二本鎖RNAの検出に各
種の介在剤が使用できる。DNAよりもRNAにより特異的に
作用するものが好ましい。発明者らは介在剤としてエチ
ジウム ホモダイマー又はプロピオニウム ヨーダイド
を使用すると、よい感度と特異性の条件下で、得られた
RNAを検出しアッセイすることが可能となることを特に
観察している。
PCRから得られるDNAの量について介在剤の存在下での
蛍光を直接測定するのと比較して、この発明の方法は、
次の利点を示す。
DNAの各二本鎖の少なくとも100又はその程度のコピー
を生成する転写が、蛍光シグナルを100に等しいかそれ
以上の因子で増幅し、ノイズに対するシグナル比は、RN
Aに転写されないプライマーとDNAの残留一本鎖が介在分
子と有意に干渉しないので、実際により良好である。
転写による末端増幅がPCR法のより良好な定量化を上
流で行わせる。実際に、この方法は、初期PCRサイクル
の数を減少させ、そのため、純粋にRCRのタイプ(1+
X)の指数的増幅フェーズ内に止まる。その上、この
発明の方法によるdsRNAの転写からの付加的増幅は直線
的である。換言すれば、増幅因子は一定で、反応混合物
中に存在する鋳型DNAの量に従属しない。全体的に指数
的であり従って直線的である増幅現象が存在する。この
数学的機能の分析は、定量が指数的ゾーンを越えるプラ
トーの発現によって複雑化される通常のPCR技法の場合
より簡単である。
1つの工程での簡単な暴露(revealing)と合わせた
増幅の規則性が良好なことは、測定の精度を良好にし、
繰り返しを容易にさせ、定量的測定の使用を促進する。
加えて、この発明の方法のある好ましい具体例では、
標的核酸配列の検出に特に有利である改良をさせる。
特に、この発明の方法を使用することにより、二本鎖
構造をその長さの1部にのみ有し、末端の少なくとも1
つが一本鎖型であるRNAを合成することができる。
これらのRNAは、固形支持体、及び/又はその一本鎖
部分を介して、暴露プローブに付着できる。
これは、特に次の応用をさせる。
1つもしくは2つの一本鎖末端を含有する二本鎖RNA
は、配列の1部が共通している2つのDNA二重鎖(各々R
NAポリメラーゼのプロモータ配列を含有)の同時転写に
よって作ることができる。
これらの条件下、得られたRNAは1つ又は2つの一本
鎖配列末端を有する二本鎖型である。100以上の増幅係
数で得られるこのRNAハイブリッドは、固形支持体に付
着した末端の1つの配列と相補的な配列を有する核酸
(レシピエント核酸)にハイブリッド化できる。
レシピエント核酸(好ましくはオリゴヌクレオチド)
は支持体と共有結合又は非共有結合で付着する。配列を
異にするオリゴヌクレオチドは同じ支持体に異なる位置
で結合できる。かくして、いくつかの標的DNAは、同じ
ボトルで転写でき、転写は共通支持体上で検出される。
暴露は、例えば、UVに暴露された介在化合物によって発
生したRNAの二本鎖の蛍光によってもたらされる。
この手段は、いくつかの標的配列を同じ試験管で処理
でき、支持体に付着した核酸により特異的様式で検出で
きる。
この発明は、発明の方法の実施例に関する下記の付加
的記載でより明らかに理解されよう。
実施例1−二本鎖RNAの合成後の均一媒体中でのHPVウイ
ルス6/11の蛍光による分析的応用検出 DNAをPCT出願 WO10 09/15881に記載の方法のような
手順による特異な方法によって検出する。第一に、サン
プルを一対の一次プライマーで増幅し、次いでこの生成
物を十分に希釈し、5'にT7 RNAポリメラーゼについての
プロモータ配列を含んでいるプライマーで再増幅する。
次いで、二本鎖RNAへの転写を、原料として増幅生成物
を用いて直接行い、最終物の蛍光をエチジウム ブロミ
ドの介在後に測定する。
1.一次PCR 感染した、さもなければパピローマウイルス タイプ
6/11を有する細胞からのDNAの10ナノグラムを、200μ
M dATP,dATP,dTTP,dGTP,10mM Tris−HCl pH8.5;50mM KC
l;1.5mM MgCl2;0.01%ゼラチン;2,5U Taqポリメラー
ゼ、および10pmolオリゴヌクレオチド プライマーの存
在下で、50μlの容量中で増幅させる。HPV 6/11の位置
と、用いられた一次プライマーの配列は、以下の通りで
ある。
1.5分、3回(92℃,55℃,72℃)の25サイクルを行っ
た。
2.中間体1/200希釈 一次PCR反応生成物の2μlは、水400μlで希釈され
た。この溶液2μlは、二次PCR増幅に用られた。
3.二次PCR 一次増幅についてと同様な反応媒体および反応条件が
用いられ;二次プライマーの成分および量のみが変えら
れる。
HPV 6/11中での位置およびT7 RNAポリについてのプロ
モター配列5'に保持されているプライマーの配列は、以
下の通りである。
用いられたプライマーの量:反応媒体50μlにつき2p
mol(もしくは、25μlにつき1pmol)。
15増幅サイクルを行う。
3.転写反応 二本鎖RNAへの転写は、増幅された生成物において直
接行われ、滅菌DEPC水中、80mM Tris−HCl pH8.0,50m
M NaCl,20mM MgCl2,4mMスペルミジン、10mM DDT,2.5mM
NTP(リボヌクレオチド 三リン酸)および25U T7 RNA
ポリメラーゼ(BRL)を含む溶液が容量比で加えられ
る。
反応は、15分間、37℃にて行われる。
4.EtBrを用いた蛍光の解読 転写された生成物は、Tris−HCl pH7.6 5mM,NaCl 8m
M,EDTA 5mM,EtBr 0.5μg/ml(エチジウム ブロミド)
からなる測定媒体に加えられる。
Perkin−Elmer蛍光光度計における蛍光の測定のため
の条件は、以下のとおり、励起波長510nm,(sw 8nm)、
放射波長590nm(sw 8nm)、1mlのプラスチック キュベ
ット中の測定である。
5.結果 均一媒体中での二つの適用された蛍光技術が、比較さ
れた。結果は、図1および図2に示される。
図1:H33(HOECHST 33258)(0.5μG/ml)介在によるP
CR増幅後のDNAの蛍光の直接測定(360/450nm)。
−□=正のサンプル、◆=負の対照。
図2:本発明に適合した方法に従った二本鎖RNAへの転
写後のEtBrによる測定。
−□=正のサンプル、◆=負の対照。
結果は、生成物の同様なサンプルについて、(任意の
ユニットにおいて)蛍光の百分率によって表される。
図3は、得られた信号の強度間の比較を可能にする。
−■PCR増幅後直後(H33の蛍光)。
−□本発明との適合下における、二本鎖RNAへの転写後
(EtBrの蛍光)。
PCR生成物の5μlの等量に対して35ユニットのDNAの
蛍光が、H33(負に対して5)により測定される、とこ
ろが、二本鎖RNAへ転写された後の同様のサンプルおよ
びEtBr(負に対して12)を用いた測定については、蛍光
は、1800ユニットである。
実施例2−支持体上での転写による二本鎖RNAの予備の
合成 二本鎖DNA鋳型は、それぞれの鎖上にRNAポリメラーゼ
に対するプロモータと鎖のうちの一つの5'にビオチン基
を含むよう調製される。その後、この鋳型は、アビジン
でコートされた支持体に付着され、この支持体上で転写
は、直接に行われる。
1.DNA鋳型の調製 この例において調製された鋳型は、HPV 6/11のゲノム
のフラグメントを表す。
a)生物学的試料による開始 鋳型は、HPV 6/11カラノDNAフラグメントの増幅によ
り調製される。一次および二次増幅は、ROGETらの方法
〔ヌクレイック アシッド レス.、(Nucleic Acid R
es.)、1989、17、7643−7651〕による、前もって、5'
においてビオチン化されたT7aプライマーの例1に記載
された手順に従って行われる。もし、開始DNAが十分に
精製されていれば、T7aプライマー(5'においてビオチ
ン化された)またはT7bプライマーを用いる単一増幅ス
テップにより、鋳型を直接調製することができる。
b)合成DNAによる開始 DNAの二本鎖は、二つのオリゴヌクレオチドbio−T7O1
とT7O2下の部分的なハイブリッド化とその後の、二つの
鎖−bio−T7O1の延長により生産される。
2.アビジン支持体の製造 その後、ビオチンとアビジンは、BSA(ウシ血清アル
ブミン)のコートを、ポリプロピレン製のヌンク(Nun
c)のひれのある試験管中で行われる〔サウバイゴー(S
AUVAIGO)ら、ヌクレ.アシッズ.レス.(Nucl.Acids
Res.)1989、18、3175−3183〕。この試験管は、4℃で
数カ月間保存しうる。
3.支持体へのDNA鋳型の付着 前もって、合成された、10マイクロリットルのビオチ
ン化されたPCR生成物は、37℃で2時間、0.05M Tris−H
Cl緩衝液、pH9.2、0.5M NaCl 100μl中におけるインキ
ュベーションにより、支持体上に付着された。その後、
その試験管は、0.5%SDS存在下、この同じ緩衝液で3回
洗浄し、その後、1回滅菌水で洗浄する。
DNA鋳型を付与されたこの支持体は、数週間、4℃に
て保存されうる。
4.転写 二本鎖RNAへの支持のために附着した鋳型の転写のた
めの反応は、0.04M Tris−HCl、pH8.0;8mM MgCl2:スペ
ルミジン;25mM NaCl;5mM DTTおよび2mM ATP,CTP,UTP,GT
Pの100μl中で、50UのT7 RNAポリメラーゼ(BRL)によ
り引き起こされる。
反応は、30分間、37℃にて行われた。
5.合成されたRNAの単離と制御 転写のための100マイクロリットルの反応培地は、回
収され、400μlの冷エタノールと混合された。その
後、RNAは、−20℃で沈殿され、遠心分離により単離さ
れた。得られた沈殿は滅水に溶解され、その後、UV分光
光度計により定量された。この二本鎖RNAの完全性は、
アガロースゲル上での電気泳動的操作により制御され
た。その電気泳動的パターンは、図4に表される。二本
鎖構造は、熱による変性(100℃への加熱)により示さ
れた。リボヌクレオチドの性質は、高温でのアルカリ溶
解により、確認された。
約50マイクログラムのRNA(260nmでの0Dの1ユニッ
ト)が、それぞれの反応中で合成された。
洗浄され、4℃で保存された支持体は、その後、あま
り活性の損失無く、数度使用されうる。
実施例3−標的DNAに対して特異的な配列の単一鎖端を
含む二本鎖RNAの合成:HPV 6−IIウイルスの検出 用いられた手順は、それぞれのサンプル上で平行して
行われた2つのPCR反応による、2つの二重鎖のDNA(そ
れぞれは、T7 RNAポリメラーゼに対するプロモター配列
を備えている)の形成からなる。
これらの2つの画分は、混合され、その後、部分的に
二本鎖型にあるRNAに転写される。
得られたRNAは、141塩基の一本鎖部分を後ろに持つ、
159塩基長の二本鎖部分を含む。この後、この生成物
は、ナイロン膜に付着したオリゴヌクレオチドにハイブ
リッド化され、そして蛍光により検出される。
1.DNA二重鎖の形成 DNAサンプルは、2つの試験管に分配される。その
後、2つのPCR増幅は、次のプライマーの対を用いて、
例1に記載の条件下で独立に行われる。
30サイクル(92−55−72、1、30)が、行われる。
2.転写 2つのPCR生成物は1容対1容にて混合され、また、2
5UのT7 RNAポリメラーゼを含む転写培地の2容が加えら
れる(例1参照)。
転写は、42℃にて30分間行われる。
3.固体支持体上のRNA半−二重鎖の検出 RNAの単一鎖端の部分に相補的な配列をするオリゴヌ
クレオチドは、サイキら、プロク.ナット.アカド.サ
イ.(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、86、6230−6234(19
89)により記載された技術に従って、ナイロン膜に付着
される。
支持体上に付着されたオリゴヌクレオチド RNAの半−二重鎖は、この支持体上で1時間ハイブリ
ッド化される(55℃にて、5xSSPE、0.1%SOS)。その
後、膜は、同じ培地中で55℃にて5分間洗浄され、次
に、素早く5mMリン酸緩衝液、pH7.0中で洗浄される。
次に、暴露は、0.5μg/mlエチジウム ホモ二量体に
て溶液中でインキュベート(2分間)により行われ、そ
の後、5mMリン酸緩衝液中で、簡単な洗浄が行われる。
次に、蛍光スポットは、260nmおよび520nmにおける放射
下で、直接観察される。
正のサンプルは、明確なオレンジ色の蛍光を有し、し
かしながら、負のものは、バックグラウンドと区別し得
ない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平3−7583(JP,A) Biochem.Int.,Vol. 14,No.6(1987),p.1015−1022 Nucleic Acids Re s.,Vol.17,No.23(1989), p.10109 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 JICSTファイル(JOIS) BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】同時に起こる転写が、同じ反応混合物中に
    存在するDNA配列の2つの相補的な鎖について行われ、
    迅速なハイブリッド化が、2つの得られた転写物につい
    て行われる方法からなる二本鎖RNAの製法。
  2. 【請求項2】転写を意図するDNAの2つの鎖が、同じ、
    又は2つの異なるRNAポリメラーゼにより認識されるプ
    ロモータ配列の制御下にある請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】転写を意図するDNAの2つの鎖が、2つの
    異なる二重鎖に属するか、又は同じ二重鎖で結合される
    請求項1または2に記載の方法。
  4. 【請求項4】転写を意図するDNAの鎖が、固体支持体に
    付着されている請求項1〜3のいずれか1つに記載の方
    法。
  5. 【請求項5】さらに、得られた二本鎖RNAの検出、およ
    び/もしくはアッセイのための工程を有する請求項1〜
    4のいずれか1つに記載の方法。
  6. 【請求項6】該標的配列の2つの相補的な鎖の全部もし
    くは部分の同時に起こる転写が、請求項1〜5のいずれ
    か1つに記載の方法によって行われることを含む工程か
    らなる、生体サンプル中の標的DNA配列の検出、および
    /もしくはアッセイのための方法。
  7. 【請求項7】転写工程に先立って、標的配列の増幅が行
    われる少なくとも一つの工程を含む請求項6に記載の方
    法。
  8. 【請求項8】検出される標的配列の転写生成物の少なく
    とも一つの断片が、単一鎖RNAの型であり、該転写生成
    物が単一鎖断片により固体支持体に付着される請求項6
    又は請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項9】幾つかの異なる標的配列が転写され、同じ
    サンプル中において同時に検出される請求項6〜8のい
    ずれか1つに記載の方法。
JP51068493A 1991-12-18 1992-12-18 二本鎖rnaの製法とその応用 Expired - Lifetime JP3515108B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR91/15710 1991-12-18
FR9115710A FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1991-12-18 Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
PCT/FR1992/001209 WO1993012229A1 (fr) 1991-12-18 1992-12-18 Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH07505762A JPH07505762A (ja) 1995-06-29
JP3515108B2 true JP3515108B2 (ja) 2004-04-05

Family

ID=9420171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51068493A Expired - Lifetime JP3515108B2 (ja) 1991-12-18 1992-12-18 二本鎖rnaの製法とその応用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5795715A (ja)
EP (1) EP0618966B1 (ja)
JP (1) JP3515108B2 (ja)
AT (1) ATE164883T1 (ja)
DE (1) DE69225074T2 (ja)
FR (1) FR2685346B1 (ja)
WO (1) WO1993012229A1 (ja)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605712B1 (en) * 1990-12-20 2003-08-12 Arch Development Corporation Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions
FR2706465B1 (fr) * 1993-06-11 1995-08-25 Heliosynthese Sa Procédé de production et d'extraction de superoxyde-dismutases thermostables à partir d'une culture de micro-organismes photosynthétiques.
US20030055240A1 (en) * 1995-06-06 2003-03-20 Roberts Peter C. HPV specific oligonucleotides
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US6458940B2 (en) * 1995-06-06 2002-10-01 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US6274369B1 (en) * 1996-02-02 2001-08-14 Invitrogen Corporation Method capable of increasing competency of bacterial cell transformation
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
CN1375004A (zh) * 1999-04-21 2002-10-16 惠氏公司 抑制多核苷酸序列的功能的方法和组合物
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1235842A4 (en) * 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts GENESIS OF THE RNA INTERFERENCE PATH AS AID OF TARGETED GENTIAN INTERFERENCE
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
US7700359B2 (en) * 2000-06-02 2010-04-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gene products differentially expressed in cancerous cells
US6465217B1 (en) * 2000-07-05 2002-10-15 Paradigm Genetics, Inc. Methods and compositions for the modulation of chorismate synthase and chorismate mutase expression or activity in plants
US20080242627A1 (en) * 2000-08-02 2008-10-02 University Of Southern California Novel rna interference methods using dna-rna duplex constructs
US20020173478A1 (en) * 2000-11-14 2002-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Post-transcriptional gene silencing by RNAi in mammalian cells
HU230458B1 (hu) * 2000-12-01 2016-07-28 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák
US20020132257A1 (en) * 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US8034791B2 (en) 2001-04-06 2011-10-11 The University Of Chicago Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics
US20040242523A1 (en) * 2003-03-06 2004-12-02 Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago Chemo-inducible cancer gene therapy
US20030082685A1 (en) * 2001-04-06 2003-05-01 WEICHSELBAUM Ralph R. Chemotherapeutic induction of egr-1 promoter activity
US7838270B2 (en) * 2001-05-22 2010-11-23 The University Of Chicago Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
TWI335938B (en) * 2001-08-15 2011-01-11 Rna replication and amplification
EP2189524A3 (en) 2001-11-09 2010-07-07 BASF Plant Science GmbH Protein kinase stress-related polypetides and methods of use in plants
WO2003040344A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Basf Plant Science Gmbh Transcription factor stress-related polypeptides and methods of use in plants
EP2075346A3 (en) * 2002-01-08 2009-11-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Gene products differentially expressed in cancerous breast cells and their methods of use
WO2003064621A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
EP2213737B1 (en) 2002-02-01 2012-11-07 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
WO2003106630A2 (en) * 2002-06-12 2003-12-24 Ambion, Inc. Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference
US20040248094A1 (en) * 2002-06-12 2004-12-09 Ford Lance P. Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression
EP1572956A2 (en) * 2002-08-01 2005-09-14 City of Hope Methods and kits for synthesis of sirna expression cassettes
US7618948B2 (en) 2002-11-26 2009-11-17 Medtronic, Inc. Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA
US7829694B2 (en) * 2002-11-26 2010-11-09 Medtronic, Inc. Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA
US6852494B2 (en) * 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
WO2004078941A2 (en) * 2003-03-06 2004-09-16 Oligo Engine, Inc. Modulation of gene expression using dna-rna hybrids
CA2521754A1 (en) 2003-04-15 2004-10-28 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
CN1812776A (zh) * 2003-05-21 2006-08-02 得克萨斯州大学系统董事会 抑制蛋白激酶c-mu(pkd)用作心脏肥大和心力衰竭的疗法
WO2005095622A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 Van Andel Research Institute c-met siRNA ADENOVIRUS VECTORS INHIBIT CANCER CELL GROWTH, INVASION AND TUMORIGENICITY
EP1737957A1 (en) * 2004-04-22 2007-01-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem UNIVERSAL TARGET SEQUENCES FOR siRNA GENE SILENCING
NL1026335C2 (nl) * 2004-06-04 2005-12-06 Univ Delft Tech Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde, alsmede een werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengs polynucleotidenconstruct en een toepassing.
CA2579927A1 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
WO2006032708A2 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
US20060142228A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
EP1907546A2 (en) * 2005-05-31 2008-04-09 Devgen N.V. Rnai for control of insects and arachnids
AU2006259019B2 (en) 2005-06-17 2011-09-01 Basf Plant Science Gmbh Lecitin-like protein kinase stress-related polypeptides and methods of use in plants
EP1907555A2 (en) 2005-07-18 2008-04-09 BASF Plant Science GmbH Yield increase in plants overexpressing the shsrp genes
AU2006270321B2 (en) 2005-07-18 2012-03-08 Basf Plant Science Gmbh Yield increase in plants overexpressing the ACCDP genes
MX2008001513A (es) 2005-08-12 2008-04-04 Basf Plant Science Gmbh Secuencias de acidos nucleicos que codifican proteinas asociadas con respuesta a estres abiotico y celulas vegetales y plantas con aumento de tolerancia a estres ambiental.
US20070202515A1 (en) * 2005-10-12 2007-08-30 Pathologica, Llc. Promac signature application
US8808698B2 (en) * 2006-02-03 2014-08-19 The Regents Of The University Of California Methods for inhibition of lymphangiogenesis and tumor metastasis
US20090172834A1 (en) 2006-03-24 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Proteins Associated With Abiotic Stress Response And Homologs
AU2007283022B2 (en) 2006-08-08 2011-07-28 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universitat Bonn Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
CN101589148B (zh) 2006-10-13 2014-07-02 巴斯福植物科学有限公司 产量提高的植物
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
BRPI0811838A2 (pt) 2007-05-22 2014-10-07 Basf Plant Science Gmbh Método para a produção de uma célula de planta transgênica ou uma parte da mesma, célula de planta transgênica, uma planta ou uma parte da mesma, semente, molécula de ácido nucleico isolada, construto de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, processo para a produção de um polipeptídeo, polipeptídeo, anticorpo, tecido de planta, material de propagação, material colhido ou uma planta, processo para a identificação de um composto, método para produção de uma composição agrícola, composição, método para produção de uma planta transgênica, e, uso de uma molécula de ácido nucleico de codificação de srp
EP2152890A1 (en) * 2007-05-23 2010-02-17 MannKind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design
AU2008300579B2 (en) 2007-09-18 2014-11-13 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
EP2594645A3 (en) 2007-09-21 2013-11-06 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield
DE112008003318T5 (de) 2007-12-19 2011-04-21 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag und erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress (IY-B)
CN102066937A (zh) 2008-01-25 2011-05-18 P53股份有限公司 P53生物标记物
US8709393B2 (en) 2008-01-30 2014-04-29 Wound Engineering Llc Methods and compositions for wound healing
AR070719A1 (es) 2008-02-27 2010-04-28 Basf Plant Science Gmbh Plantas con mayor rendimiento, en terminos de crecimiento, desarrollo, acumulacion de biomasas y generacion de semillas en comparacion con una planta silvestre, y un metodo para producirlas.
WO2009141146A1 (en) 2008-05-21 2009-11-26 Gunther Hartmann 5' triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
EP2352822A2 (en) 2008-08-19 2011-08-10 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof
AU2009295982A1 (en) 2008-09-23 2010-04-01 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (LT)
AU2009306369A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Basf Plant Science Gmbh A method for producing a transgenic cell with increased gamma-aminobutyric acid (GABA) content
US20110321197A1 (en) 2008-10-23 2011-12-29 Basf Plant Science Gmbh Plants with Increased Yield (NUE)
EP2186822A1 (en) 2008-11-07 2010-05-19 Sanofi-Aventis Use of inhibitors of Plac8 activity for the modulation of adipogenesis
EP2236607A1 (en) 2009-04-02 2010-10-06 Sanofi-Aventis Use of inhibitors of St3Gla6 activity for modulation of adipogenesis
EP2253705A1 (en) 2009-05-20 2010-11-24 Sanofi-Aventis Use of inhibitors of Zdhhc2 activity for modulation of adipogenesis
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US20120117867A1 (en) 2009-07-23 2012-05-17 Basf Plant Science Company Gmbh Plants with Increased Yield
EP2308892A1 (en) 2009-10-01 2011-04-13 Sanofi-Aventis Use of siRNA targetting Sipa1l1 for the reduction of adipogenesis
CN102770543A (zh) 2009-11-17 2012-11-07 巴斯夫植物科学有限公司 具有增加的产量的植物
CN102781517B (zh) 2010-02-01 2015-11-25 小利兰·斯坦福大学托管委员会 诊断和治疗非胰岛素依赖性糖尿病的方法
WO2013005211A2 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
US9993522B2 (en) 2012-09-18 2018-06-12 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of USP5 de-ubiquitinase
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
US20150283287A1 (en) 2012-11-06 2015-10-08 Imbed Biosciences, Inc. Methods and compositions for wound healing
EP2961853B1 (en) 2013-02-28 2018-09-19 The Board of Regents of The University of Texas System Methods for classifying a cancer as susceptible to tmepai-directed therapies and treating such cancers
WO2015070009A2 (en) 2013-11-08 2015-05-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vh4 antibodies against gray matter neuron and astrocyte
WO2016025629A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 The Regents Of The University Of California Molecular composition for enhancing and rejuvenating maintenance and repair of mammalian tissues
US10278986B2 (en) 2014-08-14 2019-05-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Antibody-siRNA conjugates and uses therefor
EP3297702A4 (en) 2015-05-18 2019-01-16 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CONDITIONS ASSOCIATED WITH AGING
EP3144014A1 (en) 2015-09-21 2017-03-22 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives A synthetic lethal drug combination for treating renal cell carcinoma
KR20190059266A (ko) 2016-07-29 2019-05-30 임베드 바이오사이언시스 아이엔씨. 상처 치유를 위한 방법 및 조성물
CA3053392A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antifibrotic activity of cd47 blockade
US11733242B2 (en) 2018-10-31 2023-08-22 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Biomarkers and methods of use for radiation-induced lung injury
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766072A (en) * 1985-07-17 1988-08-23 Promega Corporation Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence
WO1990014090A1 (en) * 1989-05-19 1990-11-29 Hem Research, Inc. SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE
JPH05503422A (ja) * 1990-01-10 1993-06-10 バイエル コーポレイション 核酸ハイブリダイゼーションアッセイでの信号増幅用レポーター分子としてのdna依存性rnaポリメラーゼ転写産物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochem.Int.,Vol.14,No.6(1987),p.1015−1022
Nucleic Acids Res.,Vol.17,No.23(1989),p.10109

Also Published As

Publication number Publication date
DE69225074T2 (de) 1998-10-29
JPH07505762A (ja) 1995-06-29
EP0618966B1 (fr) 1998-04-08
US5795715A (en) 1998-08-18
FR2685346B1 (fr) 1994-02-11
DE69225074D1 (de) 1998-05-14
FR2685346A1 (fr) 1993-06-25
EP0618966A1 (fr) 1994-10-12
ATE164883T1 (de) 1998-04-15
WO1993012229A1 (fr) 1993-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3515108B2 (ja) 二本鎖rnaの製法とその応用
US5169766A (en) Amplification of nucleic acid molecules
JP2846018B2 (ja) 核酸配列の増幅および検出
JP4651386B2 (ja) 二重鎖プロモーターの一本鎖をコードするプライマーの使用法
US5652107A (en) Diagnostic assays and kits for RNA using RNA binary probes and a ribozyme ligase
AU647411B2 (en) Enhanced nucleic acid amplification process
KR960015744B1 (ko) 핵산을 증폭시키는 방법
Zhang et al. Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification
JP3080178B2 (ja) 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット
AU772693B2 (en) Detection of nucleic acid amplified products
CA2877368C (en) Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template
JP3403405B2 (ja) 核酸伸長検定
NZ225077A (en) Transcription based nucleic acid amplification/detection systems, having use in the detection of specific sequences on an hiv virus
US20010000077A1 (en) Novel process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
Asadi et al. The mechanism and improvements to the isothermal amplification of nucleic acids, at a glance
JPH09163991A (ja) Hcv核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー
CN107075585B (zh) 具有锁核酸的序列转换和信号扩增dna以及使用其的检测方法
JP4621197B2 (ja) 非標準塩基を用いた核酸増幅
HU223384B1 (hu) Primerek HIV-1 kimutatására
WO2023246033A1 (zh) 一锅法滚环转录和CRISPR/Cas介导的核酸检测方法及试剂盒
JP2024506277A (ja) 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法
US20060019353A1 (en) Protein-nucleic acid conjugate for producing specific nucleic acid
US20110097791A1 (en) Novel process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
Ghosh et al. The Self-Sustained Sequence Replication Reaction and Its Application in Clinical Diagnostics and Molecular Biology
Sweden et al. Lizardi et al.

Legal Events

Date Code Title Description
A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040115

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090123

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100123

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100123

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110123

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120123

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130123

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term