JP3592794B2

JP3592794B2 - Low-temperature alkaline protease, microorganism producing the same, and method for producing the alkaline protease

Info

Publication number: JP3592794B2
Application number: JP13505695A
Authority: JP
Inventors: 啓一渡邊; 勝久佐伯; 啓森; 徹小林; 進伊藤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: JPH08322562A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く分布している。その応用範囲としては、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤あるいは消炎剤があり、多分野で盛んに利用されてきた。
【０００３】
その中で最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及びプロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）などが知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの大半は最適温度が高温側にあるため、水道水をそのまま用いて低温領域で衣料等の洗浄を行う場合には、その酵素特性が充分に発揮されているとは言いがたい。また、前述のプロテアーゼは、その応用分野のほとんどにおいて、体温、室温又は低温条件下で使用されるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いて高温処理工程を行うことは、省エネルギーの観点からも好ましいとは言えない。一方、低温至適プロテアーゼは、反応系に熱を加えられないようなケース、すなわちチーズの熟成や肉の軟化等の食品の改質に有効であると思われる。
【０００５】
近年、洗剤をはじめとしてプロテアーゼの商品への配合や工業的プロセスなどにおける利用が考えられているが、この場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を十分発揮させるうえで、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌等の寒冷環境に棲息する生物、海水あるいは冷蔵中のミルク等から分離されたプロテアーゼ生産菌及び生産されるプロテアーゼに関しては数多くの報告例がある。すなわち、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．５４８株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒアフロインディ（Ｅｓｃｈｒｅｉｃｈｉａｆｒｅｕｎｄｉｉ）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナスマルトフィラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）０４７／０８株（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７９巻，２５７頁，１９９１年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｔ１６が（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＦＴ３６株（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）１４５−２株（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．，３６巻，７頁，１９８２年）、アエロモナスサルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモナスパウシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｎｏｍｏｂｉｌｉｓ），バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１巻，３７７頁，１９９１年）、ビブリオエスピー（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）ＳＡ１株（ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４４巻，１５７頁，１９７８年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＣＤＯ２０８５株（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，９７頁，１９８６年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＧＲ８３株（Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ．ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセスマルクアンディ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｍａｒｑｕａｎｄｉｉ）（ＷＯ８８／０３９４８）及びキサントモナスエスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−１（特開平５−２１１８６８号）などの低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。また、好冷細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈ）が生産するプロテアーゼに関しては、Ｆａｉｒｂａｉｎらが要領よく総説にまとめている（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，１３９頁，１９８６年）。しかしこれらのプロテアーゼについても、低温域における作用は、必ずしも満足できるものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、低温条件下においても高い活性を保持するプロテアーゼ、及びこれを生産する微生物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、斯かる問題点を解決するため、低温領域において十分作用するプロテアーゼを自然界に求め、探索してきた。その結果、南氷洋に生息する貝類の一種であるシロバイから、３℃という低温条件下においても良好な生育を示す好冷細菌を分離し、これらの中で菌体外に、低温領域においても活性を有するプロテアーゼを分泌する微生物を見出し、更に得られたプロテアーゼは低温領域で優れた活性を有するだけでなく、アルカリ側に至適ｐＨを有するものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有する低温アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法を提供するものである。
【０００９】
１）作用温度及び最適温度
０〜７０℃で作用し、最適温度は約４０℃にある。Ｃａ^２＋イオンが存在すると作用最適温度は５０℃に移行する。１０℃においても最適温度活性値の約２０％、０℃においても最適温度活性値の約１０％の活性を保持する。
２）温度安定性
ｐＨ８．０、１５分間の処理条件で４５℃まで安定であり、Ｃａ^２＋イオンが存在すると５０℃まで安定である。
３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
作用ｐＨ範囲は４〜１２以上で、最適ｐＨは１１である。ｐＨ１２においても、最大活性値の７０％以上の活性を保持する。
４）ｐＨ安定性
２０℃、１５分間の処理条件でｐＨ５〜１２までの各ｐＨで極めて安定である。
５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約５４，０００である。
６）基質特異性
天然基質であるカゼイン、尿素変性ヘモグロビン及び卵黄に対して作用する。合成基質であるＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＬ−ｐＮＡ）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＶＡ−ｐＮＡ）、Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（ｚ−ＡＡＬ−ｐＮＡ）（ここでＳｕｃはサクシニル基を、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリニル基を、Ｚはカルボベンゾイル基を示す）に対して作用し、ｐ−ニトロアニリンを遊離させる。
７）金属イオンの影響
Ｈｇ^２＋及びＺｎ^２＋イオンによって阻害される。
８）阻害剤
ＥＤＴＡ、フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、キモスタチン及びｐ−クロロマーキュリ安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害される。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン及びホスホラミドンによって阻害を受けない。
９）界面活性剤の影響
アルカン硫酸ナトリウム（ＳＡＳ）、α−オレフィン硫酸ナトリウム（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム（ＥＳ）、ソフタノール７０Ｈ及びα−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）によって２〜７倍の活性促進を受ける。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対しても安定である。
【００１０】
本発明の低温アルカリプロテアーゼは、例えばアルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【００１１】
かかるアルテロモナス属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、アルテロモナス属に属し、上記の本発明プロテアーゼを生産する限り特に制限されないが、例えば次の分類学的性質を示すＫＳＭ−ＳＰ１１１株が挙げられる。
【００１２】
本発明のプロテアーゼ生産菌の分離に用いられる培地を以下に示す。
【００１３】
使用培地の組成（重量％で表示）
培地１．ニュートリエントブロス，０．８；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地２．ニュートリエントブロス，０．８
培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，２．０；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地４．バクトリトマスミルク，１０．５
培地５．ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮＯ_３，０．１
培地６．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；ブドウ糖，０．５
培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地９．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５；可溶性澱粉，２．０；Ｋ_２ＨＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地１０．Ｋｏｓｅｒの培地（栄研化学社製），指示量
培地１１．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地（栄研化学社製），指示量
培地１２．
（１）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；Ｎａ_２ＳＯ_４，０．１
（２）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，０．０５；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．００１；ＭｎＳＯ_４・４−６Ｈ_２Ｏ，０．００１；窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを各々０．２５，０．２，０．１６，０．２％となるように、上記（１）及び（２）の培地に加えて用いた。
培地１３．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１４．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１５．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１６．チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙（日水製薬社製）
培地１７．３％過酸化水素水
培地１８．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２
培地１９．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．５；ブドウ糖，０．５；Ｋ_２ＨＰＯ_４，０．１；ブロムチモールブルー，０．０６；寒天末
（和光純薬社製），１．５
培地２０．（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４，０．１；ＫＣｌ，０．０２；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ _２Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．０５；糖１．０
培地２１．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５
【００１４】
ＫＳＭ−ＳＰ１１１株の分類学的性質を以下に示す。
【００１５】
［分類学的性質］
（ａ）顕微鏡的観察結果：
菌体の大きさは、０．５〜０．８μｍ×１．５×８．０μｍの桿菌であり、極鞭毛を有し、運動性がある。
（ｂ）グラム染色性：
陰性。
（ｃ）各種培地における育成状態：
（１）肉汁寒天平板培養（培地１）；
生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑で光沢がある。また、集落の色調は、淡紅色で半透明又は不透明である。
（２）肉汁寒天斜面培養（培地１）；
生育する。
（３）肉汁液体培養（培地２）；
生育は良好で、菌膜は形成しない。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）；
生育状態は良い。ゼラチンの液化がわずかに認められる。
（５）リトマスミルク培地（培地４）；
わずかに酸の生成が認められる。
（ｄ）生理学的性質
（１）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）；
硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。
（２）ＭＲテスト（培地６）；
陰性。
（３）ＶＰテスト（培地６）；
陰性。
（４）インドールの生成（培地７）；
陰性。
（５）硫化水素の生成（培地８）；
陰性。
（６）澱粉の加水分解（培地９）；
陽性。
（７）クエン酸の利用（培地１０、１１）；
陰性。
（８）無機窒素源の利用（培地１２）；
アンモニウム塩及び硝酸塩を利用する。
（９）色素の生成（培地１３、１４）；
陰性。
（１０）ウレアーゼ（培地１５）；
陰性。
（１１）オキシダーゼ（培地１６）；
陰性。
（１２）カタラーゼ（培地１７）；
陽性。
（１３）生育の範囲（培地１８）；
生育の温度範囲は３〜３７℃である。
生育のｐＨ範囲は６〜１０である。
（１４）酸素に対する態度（培地１９）；
好気的。
（１５）Ｏ−Ｆテスト（培地２０）；
酸化型。
（１６）糖の利用性；
Ｄ−ガラクトース、シュクロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトール、マルトース、Ｄ−マンノース、ラフィノース及び可溶性澱粉を利用することができる。
（１７）食塩含有培地における生育（培地１中）；
食塩濃度５％では生育するが、１０％では生育できない。
（１８）カゼインの分解（培地２１）；
陽性。
【００１６】
以上の分類学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属の一種と判断された。また、Ｍｏｒｉｔａらの定義（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３９巻，１４４頁，１９７５年）に基づけば、好冷細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈ）の範疇にはいると考えられる。なお、Ｆｅｌｌｅｒらによって南氷洋から分離されたアルテロモナス属細菌は、熱不安定なα−アミラーゼを生産するものであり（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，５２１７頁，１９９２年）、本菌株とは明らかに異なる。
【００１７】
従って、本菌株をアルテロモナスエスピー（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＳＭ−ＳＰ１１１と命名し、ＦＥＲＭＰ−１４８３８号として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１８】
上記の菌株を用いて、本発明のプロテアーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００１９】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例えば炭素源として可溶性澱粉、グルコース、マンノース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンニトール、ラフィノースや資化しうる有機酸、例えばクエン酸などが挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティプリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕やカルチベータなどの有機窒素源が有効である。更に、燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要とあれば、無機又は有機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【００２０】
培養温度は３〜３０℃、特に１０℃前後が好ましく、ｐＨは６〜８、特に７が好ましく、この条件下において通常３〜５日間で培養が完了する。
【００２１】
斯くして得られた培養液の中から目的の酵素であるアルカリプロテアーゼを採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行うことができる。すなわち、培養後、菌体を遠心分離又は濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的な手段、例えば、適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲル濾過などを適宜組み合せることによって精製することができる。
【００２２】
斯くして得られる本発明低温アルカリプロテアーゼの酵素化学的性質について以下に説明する。
【００２３】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン法；
カゼイン１％を含む５０ｍＭの各種緩衝液１ｍｌを０．１ｍｌの酵素溶液と混合し、２０℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５頁，１９５１年）によって測定した。
また、上記反応条件下において、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００２４】
合成基質法；
４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に０．４μｇの精製酵素と１０ｍＭＣａＣｌ_２を含む０．６ｍｌの反応系に、５μｌの基質溶液（例えばＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加えて反応を開始した（最終基質濃度０．１ｍＭ）。２５℃で、１５分間反応させた後、分光光度計を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１単位は、上記反応条件において、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００２５】
〔酵素学的性質〕
（１）基質特異性：
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、基質を１％になるように調製し、本酵素を添加して、２０℃で１５分間反応を行い、天然基質に対する作用を調べた。その結果、表１に示すように、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、卵黄に対して分解活性を示した。
【００２６】
また、４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中で、ｐ−ニトロアニリンが結合したオリゴペプチド基質を０．１ｍＭになるように調製し、本酵素を添加して、２５℃で１５分間反応を行い、分解活性を検討した。その結果、表１に示すように、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ，Ｓｕｃ−ＡＡＰＬ−ｐＮＡ，Ｓｕｃ−ＡＡＶＡ−ｐＮＡ及びｚ−ＡＡＬ−ｐＮＡに作用し、ｐ−ニトロアニリンの遊離が観察された。
【００２７】
【表１】

【００２８】
（２）作用ｐＨ及び至適ｐＨ：
各種緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、２５℃で１５分間反応を行い、各ｐＨでの活性を相対的に表した。図１から明らかなように、本プロテアーゼの至適ｐＨは１１である。また、その作用ｐＨは、ｐＨ４〜１２以上と幅広く、ｐＨ１２においても最大活性の７０％以上の活性を保持している。尚、使用した各種緩衝液及びそのｐＨ範囲は次のとおりである。
【００２９】
酢酸緩衝液：ｐＨ３〜６
リン酸緩衝液：ｐＨ６〜８
ホウ酸緩衝液：ｐＨ７〜１２
【００３０】
（３）ｐＨ安定性：
（１）で用いたものと同じ緩衝液（２５ｍＭ）中に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置した。この処理液について、カゼインを基質として残存活性の測定を行った。その結果、図２に示すとおり、本酵素はｐＨ５〜１２の範囲で極めて安定であった。
【００３１】
（４）作用温度及び至適温度：
基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行った。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、本酵素の至適温度は４０℃であった。また、Ｃａ^２＋イオンが存在すると、至適温度は５０℃に移行した。
【００３２】
（５）温度安定性：
５０ｍＭホウ酸緩衝液に本酵素を加え、各温度で１５分間熱処理した後、氷冷した。カゼインを基質として、残存活性を求め、その結果を図４に示した。本酵素はＣａ^２＋非存在下で４５℃、Ｃａ^２＋存在下で５０℃まで安定であった。
【００３３】
（６）分子量：
本酵素の分子量をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子蛋白質（ベーリンガー・マンハイム社製）である、フルクトース−６−リン酸キナーゼ（分子量：８５，０００）、牛血清アルブミン（分子量：６６，０００）、オボアルブミン（分子量：４５，０００）、アルドラーゼ（分子量：３９，０００）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量：２５，０００）、チトクロムｃ（分子量：１４，４００）を用いた。図６から明らかなように、本精製プロテアーゼ標品は、ＳＤＳ電気泳動的に単一であり、その分子量は約５４，０００と推定される。
【００３４】
（７）等電点：
ｐＨ６．０において、陰イオン交換体に結合し、陽イオン交換体に結合しないことから、本酵素の等電点は６以下であると推察される。
【００３５】
（８）金属イオンの影響：
各種金属塩を１ｍＭ含む４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中で、本プロテアーゼを２０℃で２０分間処理した。合成基質（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を用いて、残存プロテアーゼ活性を測定した。残存活性は、金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性に対する相対値で表した（表２）。表２より、酵素活性は、Ｈｇ^２＋又はＺｎ^２＋イオンにより強く阻害されることがわかる。
【００３６】
【表２】

【００３７】
（９）阻害剤の影響：
４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８，１０ｍＭＣａＣｌ_２含有、但しＥＤＴＡを用いる場合には、ＣａＣｌ_２を含まず）に各種阻害剤を所定の濃度になるように加え、そこに本酵素溶液を添加し、２０℃で６０分間放置した後、合成基質（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を用いて残存プロテアーゼ活性を測定した。結果を表３に示す。表３から、本酵素はＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ又はキモスタチンによって強い阻害を受けることから、金属セリンプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ）であると考えられる。
【００３８】
【表３】

【００３９】
（１０）界面活性剤の影響：
本酵素を、０．０５％の界面活性剤を溶解した４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、（１０ｍＭＣａＣｌ_２含有）に加えて、２５℃で６０分間放置した後、合成基質（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を用いて残存プロテアーゼ活性を測定した。結果を表４に示す。表４から、本プロテアーゼは、ＳＡＳ、ＡＯＳ、ＥＳ、ソフタノール７０Ｈ、α−ＳＦＥにより２〜７倍の活性促進を受け、また、ＳＤＳに対しても安定であることがわかった。
【００４０】
【表４】

【００４１】
前述したように、低温至適を有するプロテアーゼに関しては、数多くの報告があり、その中には金属セリンプロテアーゼについての報告もある。しかし、低温至適、高アルカリ至適を示し、界面活性剤により活性促進を受ける金属セリンプロテアーゼについての報告はないことから、本酵素は新しいタイプのプロテアーゼであると考えられる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、種々の界面活性剤によって活性促進（２〜７倍）を受け、低温領域においても活性を保持する（１０℃で最大活性の１８％）という特徴を有する。また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安定であるため、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分あるいは肉の軟化剤などの広い分野で低温下で有利に使用できるものである。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
好冷細菌の分離、採取：
南氷洋に生息する貝類シロバイに滅菌人工海水２０ｍｌを添加し、ホモゲナイザーで粉砕した。生じた懸濁液を、各種人工海水平板培地に塗抹し、２０℃で７２〜９６時間培養した。なお、用いた人工海水培地の組成は、以下に示すとおりであり、プロテアーゼ生産の判定を行うために、スキムミルクを添加した。培養後、生育した集落（コロニー）の周囲にスキムミルク分解に基づく透明帯を形成したものを選抜した。
【００４５】
【表５】
人工海水培地（ｐＨ７．６）
（成分）（配合量）
バクトペプトン（ディフコ社製）２．５ｇ
酵母エキス（ディフコ社製）１．２５ｇ
肉エキス（ディフコ社製）１．２５ｇ
グルコース０．５ｇ
寒天２０．０ｇ
人工海水（ジャマリン・ラボラトリー社製）１０００ｍｌ
【００４６】
実施例２
実施例１で得られたアルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株を以下に示す液体培地に接触し、５℃で９６時間培養を行い、本酵素を生産させた。
【００４７】
【表６】
液体培養培地（ｐＨ７．６）
（成分）（配合量）
バクトペプトン（ディフコ社製）５ｇ
酵母エキス（ディフコ社製）２．５ｇ
グルコース１０ｇ
人工海水（八洲薬品社製）１０００ｍｌ
【００４８】
培養終了後、得られた培養液（活性１０７Ｕ／ｌ）を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，５分間）して菌体を除去した。本培養上清に飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析を行った後、担体としてＧＣＬ−３００ｍを用いたゲル濾過クロマトグラフィー、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを用いた陰イオン交換体クロマトグラフィー、ＰＨＥＮＹＬ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅを用いた疎水性クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱを用いた陰イオン交換体クロマトグラフィーにより、ＳＤＳ電気泳動により単一なバンドにまで精製した結果、比活性は、６４３倍上昇し、活性回収率は５％であった。
得られた酵素は前記の酵素学的性質を有していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株が産するプロテアーゼのｐＨ−活性曲線を示す図である。
【図２】アルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株が産するプロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】アルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株が産するプロテアーゼの温度−活性曲線を示す図である。
【図４】アルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株が産するプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図５】アルテロモナスエスピーＫＳＭ−ＳＰ１１１株が産するプロテアーゼの分子量測定結果を示す図であり、（ａ）は分子量とＳＤＳ電気泳動距離の相関を示す図、（ｂ）は完全精製標品のＳＤＳ電気泳動写真（１２％アクリルアミドゲル）を示す図である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a novel alkaline protease, a microorganism producing the same, and a method for producing the alkaline protease.
[0002]
[Prior art]
Protease is a general term for a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds, and is widely distributed in microorganisms, animals and plants. Its application range is detergents for clothing, detergents for automatic dishwashers, contact lens cleaners, bath agents, exfoliating cosmetics, food modifiers (bread making, meat softening, seafood processing), beer There are fining agents, leather tanning agents, gelatin removers for photographic films, digestion aids and anti-inflammatory agents, and have been widely used in various fields.
[0003]
Among them, proteases for detergents which are industrially produced in the largest quantities and have a large market scale are, for example, Alcalase, Sabinase (Novo Nordisk), Maxacal (Gist Brocades), API-21 (Showa Denko) And Klap (produced by Henkel) and Protease K (KAP; manufactured by Kao Corporation).
[0004]
However, most of them have an optimum temperature on the high temperature side, and it is hard to say that the enzyme properties are sufficiently exhibited when washing clothing or the like in a low temperature region using tap water as it is. Moreover, since the above-mentioned proteases are used under the conditions of body temperature, room temperature or low temperature in most of the application fields, the use of high-temperature-optimized enzymes is not compatible. In addition, performing a high-temperature treatment step using a high-temperature-optimized enzyme is not preferable from the viewpoint of energy saving. On the other hand, the low-temperature-optimized protease is considered to be effective in the case where heat is not applied to the reaction system, that is, in the modification of food such as aging of cheese and tenderization of meat.
[0005]
In recent years, the use of detergents and other proteases in commercial products and in industrial processes has been considered. In this case, finding enzymes that work effectively in the range from room temperature to low temperature requires not only energy saving but also enzyme use. It is an indispensable condition to fully demonstrate the function of. To date, there have been many reports on protease-producing bacteria isolated from living organisms living in cold environments such as cold district soil, seawater or refrigerated milk, and proteases produced. In other words, Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) No. 548 shares (Agric. Biol. Chem., 36 , pp. 1185, 1970), Escherichia freundii (Eschreichia freundii) (Eur. J. Biochem., 44 , pp. 87 pp., 1974), hexane Tomo eggplant Marthe Philadelphia (Xanthomonas maltophila ) strain 047/08 ( FEMS Microbiol. Lett. , Vol . 79, p . 257, 1991), Pseudomonas fluorescens T16 ( Appl. Environ. 33, Vol. 33, pp . 1973, Appl. Environ. , Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) AFT36 shares (Biochim. Bi phys. Acta, 717, pp. 376 pp., 1982), Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) 145-2 strain (Microbios., 36, pp. 7, pp., 1982), Aeromonas salmonicida (Aeromonas salmonicida) (J. Appl. Bacteriol., 53, pp. 289 pp., 1983), Pseudomonas paucimobilis (Pseudomonas paucinomobilis), Bacillus sp. (Bacillus sp.) (J. Basic Microbiol., 31 , pp. 377 pp., 1991), Vibrio sp. (Vibrio sp. ) SA 1 strain (Antonie van Leeuwenhoek, 44, pp. 157 pp., 1978), Shudomo Scan fluorescens (Pseudomonas fluorescens) NCDO 2085 strain (J. Dairy Res., 53, pp. 457 pp., 1986), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) (J. Dairy Res ., 53 , pp. 97 pp., 1986 year), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) GR83 shares (Lebensm.-Wiss. u.-Technol ., 23 , pp. 106 pp., 1990), Paecilomyces Marc Andy (Paecilomyces marquandii) (WO 88/03948) and Xanthomonas SP ( Xanthomonas sp. ) Microorganisms that can grow at low temperatures, such as S-1 (JP-A-5-212868), produce various proteases. The proteases produced by psychrotrophs are summarized in a comprehensive review by Fairbain et al . ( J. Dairy Res. , 53, 139, 1986). However, the action of these proteases in the low temperature range is not always satisfactory.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a protease that retains high activity even under low temperature conditions, and a microorganism that produces the protease.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve such a problem, the present inventors have naturally searched for and searched for a protease that works sufficiently in a low-temperature region. As a result, psychrophilic bacteria showing good growth under low temperature conditions of 3 ° C were isolated from white flies, a kind of shellfish that inhabits the Antarctic Ocean. The present inventors have found a microorganism that secretes a protease having the same, and have further found that the obtained protease not only has excellent activity in a low-temperature region, but also has an optimum pH on the alkali side, and has completed the present invention. .
[0008]
That is, the present invention provides a low-temperature alkaline protease having the following enzymatic properties, a microorganism producing the same, and a method for producing the alkaline protease.
[0009]
1) Operating temperature and optimum temperature 0-70 ° C, the optimum temperature is about 40 ° C. When Ca ²⁺ ions are present, the optimum temperature for operation shifts to 50 ° C. The activity of about 20% of the optimum temperature activity value at 10 ° C. and about 10% of the optimum temperature activity value at 0 ° C. are maintained.
2) Temperature stability It is stable up to 45 ° C under treatment conditions of pH 8.0 and 15 minutes, and up to 50 ° C in the presence of Ca ²⁺ ions.
3) Working pH and optimum pH
The working pH range is 4 to 12 or more, and the optimum pH is 11. Even at pH 12, the activity is maintained at 70% or more of the maximum activity value.
4) pH stability It is extremely stable at each pH from 5 to 12 under treatment conditions of 20 ° C. and 15 minutes.
5) Molecular weight The estimated molecular weight by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis is about 54,000.
6) Substrate specificity It acts on natural substrates such as casein, urea-modified hemoglobin and egg yolk. Synthetic substrates Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA), Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA (Suc-AAPL-pNA), Suc-Ala-Ala-Val- Ala-pNA (Suc-AAVA-pNA), Z-Ala-Ala-Leu-pNA (z-AAL-pNA) (where Suc represents a succinyl group, pNA represents a p -nitroanilinyl group, and Z represents a carbobenzoyl group. ) To release p -nitroaniline.
7) Influence of metal ions Inhibited by Hg ²⁺ and Zn ²⁺ ions.
8) Inhibited by the inhibitors EDTA, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), chymostatin and p -chloromercury benzoic acid (PCMB). Not inhibited by dithiothreitol (DTT), N -ethylmaleimide (NEM), 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), bestatin, leupeptin, pepstatin and phosphoramidon.
9) Influence of surfactant 2 to 7 depending on sodium alkane sulfate (SAS), α-olefin sodium sulfate (AOS), sodium polyoxyethylene alkyl sulfate (ES), sophanol 70H and α-sulfo fatty acid ester (α-SFE). Receives twice the activity boost. It is also stable to sodium dodecyl sulfate (SDS).
[0010]
The low-temperature alkaline protease of the present invention can be produced, for example, by culturing a protease-producing bacterium belonging to the genus Alteromonas and collecting from the culture.
[0011]
The protease-producing bacterium of the present invention belonging to the genus Alteromonas is not particularly limited as long as it belongs to the genus Alteromonas and produces the above-described protease of the present invention, and examples thereof include a KSM-SP111 strain exhibiting the following taxonomic properties.
[0012]
The medium used for separating the protease-producing bacteria of the present invention is shown below.
[0013]
Composition of medium used (expressed in weight%)
Medium 1. Nutrient broth, 0.8; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5
Medium 2. Nutrient broth, 0.8
Medium 3. Nutrient broth, 0.8; gelatin, 2.0; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5
Medium 4. Bactri Thomas Milk, 10.5
Medium 5. Nutrient broth, 0.8; KNO ₃ , 0.1
Medium 6. Bactopeptone, 0.7; NaCl, 0.5; glucose, 0.5
Medium 7. 7. SIM agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 8. TSI agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium Bacto peptone, 1.5; yeast extract, 0.5; soluble _{_{starch, 2.0; K 2 HPO 4,}} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , 1.5
Medium 10. 10. Koser's medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 11. Christensen's medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium
(1) Yeast extract, 0.05; glucose, 1.0; KH ₂ PO ₄ , 0.1; Na ₂ SO ₄ , 0.1
(2) Yeast extract, 0.05; glucose, 1.0; KH ₂ PO ₄ , 0.1; MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.02; CaCl ₂ .2H ₂ O, 0.05; FeSO _4. _{_{_{7H 2 O, 0.001; MnSO 4}}} · 4-6H 2 O, 0.001; as the nitrogen source, sodium nitrate, sodium nitrite, ammonium chloride and ammonium phosphate respectively 0.25,0.2,0 0.16 and 0.2% were used in addition to the above-mentioned media (1) and (2).
Medium 13. 13. King A medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 14. King B medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 13. Urea medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium Cytochrome oxidase test paper filter paper (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
Medium 17.3% aqueous hydrogen peroxide 18. Bacto peptone, 1.5; yeast _{_{extract, 0.5; KH 2 PO 4,}} 0.1; _{_{glucose, 1.0; MgSO 4 · 7H 2}} O, 0.02
Medium 19. Bactopeptone, 2.7; NaCl, 5.5; Glucose, 0.5; K ₂ HPO ₄ , 0.1; Bromthymol blue, 0.06; Agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 1.5
Medium 20. (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ , 0.1; KCl, 0.02; MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.02; yeast extract, 0.05;
Medium 21. Casein, 0.5; yeast extract, 0.05; _{_{glucose, 1.0; KH 2 PO 4,}} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 .5
[0014]
The taxonomic properties of the KSM-SP111 strain are shown below.
[0015]
[Taxonomic properties]
(A) Microscopic observation results:
The size of the cells is 0.5 to 0.8 μm × 1.5 × 8.0 μm bacillus, having polar flagella and having motility.
(B) Gram stainability:
negative.
(C) Growth conditions in various media:
(1) gravy agar plate culture (medium 1);
The growing condition is good. The shape of the settlement is circular and the surface is smooth and shiny. The color of the settlement is light red, translucent or opaque.
(2) gravy agar slope culture (medium 1);
Grow.
(3) broth liquid culture (medium 2);
It grows well and does not form a pellicle.
(4) gravy gelatin stab culture (medium 3);
The growing condition is good. Slight liquefaction of gelatin is observed.
(5) litmus milk medium (medium 4);
Slight acid formation is observed.
(D) physiological properties (1) reduction and denitrification of nitrate (medium 5);
Nitrate reduction is positive. Denitrification is negative.
(2) MR test (medium 6);
negative.
(3) VP test (medium 6);
negative.
(4) production of indole (medium 7);
negative.
(5) Production of hydrogen sulfide (medium 8);
negative.
(6) hydrolysis of starch (medium 9);
Positive.
(7) Utilization of citric acid (medium 10, 11);
negative.
(8) Use of an inorganic nitrogen source (medium 12);
Utilize ammonium salts and nitrates.
(9) production of pigment (medium 13, 14);
negative.
(10) urease (medium 15);
negative.
(11) oxidase (medium 16);
negative.
(12) catalase (medium 17);
Positive.
(13) Growth range (medium 18);
The temperature range for growth is 3-37 ° C.
The pH range for growth is 6-10.
(14) Attitude toward oxygen (medium 19);
Aerobic.
(15) OF test (medium 20);
Oxidation type.
(16) availability of sugar;
D-galactose, sucrose, D-glucose, D-fructose, D-mannitol, maltose, D-mannose, raffinose and soluble starch can be used.
(17) growth in medium containing salt (in medium 1);
It grows at a salt concentration of 5% but cannot grow at 10%.
(18) Casein degradation (medium 21);
Positive.
[0016]
Based on the taxonomic study described above, the strain was compared and examined with reference to the Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Eighth Edition), and as a result, the strain was found to be Alteromonas ( Alteromonas). ) It was determined to be a genus. Also, based on the definition of Morita et al . ( Bacteriol. Rev. , 39, 144, 1975), it is considered to fall into the category of psychrotrophic bacteria. The Alteromonas bacteria isolated from the Antarctic Ocean by Feller et al. Produce heat-labile α-amylase ( J. Biol. Chem ., 267, 5217, 1992). Obviously different.
[0017]
Therefore, this strain was named Alteromonas sp. KSM-SP111, and was deposited as FERM P-14838 with the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology.
[0018]
In order to obtain the protease of the present invention using the above strains, the medium may be inoculated with the strains and cultured according to a conventional method.
[0019]
It is desirable that the medium used for the cultivation contain appropriate amounts of assimilable carbon and nitrogen sources. The carbon source and the nitrogen source are not particularly limited. Examples of the carbon source include soluble starch, glucose, mannose, galactose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, raffinose, and assimilating organic acids such as citric acid. In addition, as a nitrogen source, corn gluten meal, soy flour, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, fumamedia, meat extract, tryptone, soytone, polypeptone, soybean meal, organic nitrogen sources such as cottonseed oil cake and cultivator Is valid. Further, inorganic salts such as phosphates, magnesium salts, calcium salts, manganese salts, zinc salts, cobalt salts, sodium salts, potassium salts, and if necessary, inorganic or organic micronutrients and vitamins are appropriately added to the medium. can do.
[0020]
The culture temperature is preferably from 3 to 30 ° C, particularly around 10 ° C, and the pH is preferably from 6 to 8, particularly preferably 7. Under these conditions, the culture is usually completed in 3 to 5 days.
[0021]
The alkaline protease, which is the target enzyme, can be collected from the culture solution obtained in this manner according to a general enzyme collection method. That is, after culturing, the cells are removed from the culture solution by ordinary separation means such as centrifugation or filtration to obtain a crude enzyme solution. This crude enzyme solution can be used as it is, but if necessary, it can be recovered by means such as ultrafiltration or precipitation, and then powdered using an appropriate method. In addition, a general means of enzyme purification, for example, appropriate cation exchange resin, anion exchange resin, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography and gel filtration can be appropriately combined by appropriately combining. Can be.
[0022]
The enzymatic properties of the low-temperature alkaline protease of the present invention thus obtained will be described below.
[0023]
(Enzyme activity measurement method)
Casein method ;
After mixing 1 ml of various buffer solutions of 50 mM containing 1% of casein with 0.1 ml of the enzyme solution and reacting at 20 ° C. for 15 minutes, a reaction stop solution (0.11 M trichloroacetic acid-0.22 M sodium acetate-0. 2M (33M acetic acid) was added, and the mixture was left at 30 ° C for 20 minutes. Next, the mixture was filtered through filter paper (manufactured by Whatman, No. 2), and the protein hydrolyzate in the filtrate was analyzed by the Foreign-Lowry method (Lowry, OH et al., J. Biol. Chem. , 193, 265, 1951). Year).
Further, under the above reaction conditions, the amount of an enzyme that produces an acid-soluble proteolysate corresponding to 1 μmol of tyrosine per minute was defined as 1 unit (1 U).
[0024]
Synthetic substrate method ;
The reaction was started by adding 5 μl of a substrate solution (for example, Suc-AAPF-pNA) to a 0.6 ml reaction system containing 0.4 μg of the purified enzyme and 10 mM CaCl ₂ in a 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8). (Final substrate concentration 0.1 mM). After reacting at 25 ° C. for 15 minutes, the absorbance at 405 nm was measured using a spectrophotometer, and the released p- nitroaniline was quantified. One unit of the enzyme was an amount that produced 1 μmol of p -nitroaniline per minute under the above reaction conditions.
[0025]
(Enzymatic properties)
(1) Substrate specificity:
The substrate was adjusted to 1% in a 50 mM borate buffer (pH 8.0), the enzyme was added thereto, and the reaction was carried out at 20 ° C. for 15 minutes to examine the effect on the natural substrate. As a result, as shown in Table 1, it showed a decomposing activity for casein, urea-modified hemoglobin, and egg yolk.
[0026]
In a 40 mM Tris buffer (pH 7.8), an oligopeptide substrate to which p- nitroaniline is bound is adjusted to 0.1 mM, the enzyme is added, and the reaction is performed at 25 ° C. for 15 minutes. The decomposition activity was examined. As a result, as shown in Table 1, it acted on Suc-AAPF-pNA, Suc-AAPL-pNA, Suc-AAVA-pNA and z-AAL-pNA, and release of p- nitroaniline was observed.
[0027]
[Table 1]

[0028]
(2) Working pH and optimum pH:
Casein was added to various buffers (50 mM) to a final concentration of 0.91%, and the reaction was performed at 25 ° C. for 15 minutes, and the activity at each pH was relatively expressed. As is clear from FIG. 1, the optimal pH of the present protease is 11. Further, its action pH is as wide as pH 4 to 12 or more, and at pH 12, it maintains an activity of 70% or more of the maximum activity. The various buffers used and their pH ranges are as follows.
[0029]
Acetate buffer: pH 3-6
Phosphate buffer: pH 6-8
Borate buffer: pH 7-12
[0030]
(3) pH stability:
This enzyme was added to the same buffer (25 mM) as used in (1) and left at 20 ° C. for 15 minutes. The residual activity of this treatment solution was measured using casein as a substrate. As a result, as shown in FIG. 2, the present enzyme was extremely stable in the pH range of 5 to 12.
[0031]
(4) Working temperature and optimum temperature:
This enzyme was added to a 50 mM borate buffer (pH 8.0) containing 0.91% casein as a substrate, and the reaction was carried out at each temperature for 15 minutes. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 3, the optimum temperature of the present enzyme was 40 ° C. When Ca ²⁺ ions were present, the optimum temperature shifted to 50 ° C.
[0032]
(5) Temperature stability:
The enzyme was added to a 50 mM borate buffer, heat-treated at each temperature for 15 minutes, and then cooled on ice. The residual activity was determined using casein as a substrate, and the results are shown in FIG. The enzyme ^{Ca 2+} 45 ° C. in the absence, was stable up to 50 ° C. with ^{Ca 2+} presence.
[0033]
(6) Molecular weight:
The molecular weight of this enzyme was measured by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis. As molecular weight markers, fructose-6-phosphate kinase (molecular weight: 85,000), bovine serum albumin (molecular weight: 66,000), and ovalbumin (molecular weight: 45), which are low molecular proteins (manufactured by Boehringer Mannheim), are used. 000), aldolase (molecular weight: 39,000), chymotrypsinogen A (molecular weight: 25,000), and cytochrome c (molecular weight: 14,400). As apparent from FIG. 6, the purified protease preparation is single by SDS electrophoresis, and its molecular weight is estimated to be about 54,000.
[0034]
(7) Isoelectric point:
At pH 6.0, the enzyme binds to an anion exchanger and does not bind to a cation exchanger, so that the isoelectric point of the present enzyme is estimated to be 6 or less.
[0035]
(8) Effect of metal ions:
This protease was treated at 20 ° C. for 20 minutes in a 40 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 1 mM of various metal salts. The residual protease activity was measured using a synthetic substrate (Suc-AAPF-pNA). The residual activity was expressed as a relative value to the enzyme activity similarly treated in the system without the addition of a metal salt (Table 2). Table 2 shows that the enzyme activity is strongly inhibited by Hg ²⁺ or Zn ²⁺ ions.
[0036]
[Table 2]

[0037]
(9) Effect of inhibitor:
Various inhibitors are added to a 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8, containing 10 mM CaCl ₂ , but not using CaCl ₂ when EDTA is used) to a predetermined concentration, and the enzyme solution is added thereto. After the addition, the mixture was left at 20 ° C. for 60 minutes, and the residual protease activity was measured using a synthetic substrate (Suc-AAPF-pNA). Table 3 shows the results. From Table 3, this enzyme is strongly inhibited by EDTA, PMSF or chymostatin, and thus is considered to be a metalloserine protease.
[0038]
[Table 3]

[0039]
(10) Influence of surfactant:
The enzyme was added to 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) and (containing 10 mM CaCl ₂ ) in which 0.05% of a surfactant was dissolved, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes. -AAPF-pNA) was used to measure residual protease activity. Table 4 shows the results. From Table 4, it was found that the protease was enhanced by 2 to 7 times its activity by SAS, AOS, ES, sophthanol 70H, and α-SFE, and was also stable to SDS.
[0040]
[Table 4]

[0041]
As mentioned above, there are many reports on proteases having a low-temperature optimum, including those on metal serine proteases. However, since there is no report on a metal serine protease which shows a low-temperature optimum and a high-alkali optimum and whose activity is promoted by a surfactant, this enzyme is considered to be a new type of protease.
[0042]
【The invention's effect】
The alkaline protease of the present invention is characterized in that it is promoted in activity (2 to 7 times) by various surfactants and retains its activity even in a low temperature region (18% of the maximum activity at 10 ° C). In addition, since the enzyme is widely stable in acidic to highly alkaline solutions, the enzyme can be advantageously used at a low temperature in a wide range of fields such as components of a detergent composition or a meat softener.
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0044]
Example 1
Isolation and collection of psychrophilic bacteria:
20 ml of sterilized artificial seawater was added to a shellfish, Shirobai inhabiting the Southern Ocean, and pulverized with a homogenizer. The resulting suspension was spread on various artificial sea horizontal plate media and cultured at 20 ° C. for 72 to 96 hours. The composition of the artificial seawater medium used was as shown below, and skim milk was added in order to determine protease production. After cultivation, those that formed a clear zone based on the decomposition of skim milk were selected around the grown colonies (colonies).
[0045]
[Table 5]
Artificial seawater medium (pH 7.6)
(Components) (Blending amount)
Bactopeptone (manufactured by Difco) 2.5g
Yeast extract (manufactured by Difco) 1.25 g
Meat extract (Difco) 1.25g
0.5g glucose
Agar 20.0g
Artificial seawater (manufactured by Jamarin Laboratory) 1000ml
[0046]
Example 2
The Alteromonas sp. KSM-SP111 strain obtained in Example 1 was brought into contact with the following liquid medium and cultured at 5 ° C for 96 hours to produce the enzyme.
[0047]
[Table 6]
Liquid culture medium (pH 7.6)
(Components) (Blending amount)
Bactopeptone (Difco) 5g
2.5 g yeast extract (manufactured by Difco)
10 g of glucose
Artificial seawater (Yasu Pharmaceutical) 1000ml
[0048]
After completion of the culture, the obtained culture solution (activity: 107 U / l) was centrifuged (8,000 rpm, 5 minutes) to remove cells. Saturated ammonium sulfate was added to the main culture supernatant to carry out salting out, followed by gel filtration chromatography using GCL-300m as a carrier, anion exchanger chromatography using QAE-Toyopearl, and hydrophobicity using PHENYL-Cellulofine. As a result of purification to a single band by SDS electrophoresis by means of affinity chromatography and anion exchanger chromatography using Mono Q, the specific activity increased 643 times and the activity recovery rate was 5%.
The resulting enzyme had the enzymatic properties described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a pH-activity curve of a protease produced by Alteromonas sp. KSM-SP111.
FIG. 2 is a view showing the pH stability of a protease produced by Alteromonas sp. KSM-SP111.
FIG. 3 is a diagram showing a temperature-activity curve of a protease produced by Alteromonas sp. KSM-SP111 strain.
FIG. 4 is a diagram showing the temperature stability of a protease produced by Alteromonas sp. KSM-SP111.
5 shows the results of measuring the molecular weight of protease produced by Alteromonas sp. KSM-SP111 strain, (a) showing the correlation between molecular weight and SDS electrophoresis distance, and (b) showing SDS of a completely purified sample. It is a figure which shows an electrophoresis photograph (12% acrylamide gel).

Claims

A cold-active alkaline protease with the following enzymatic properties:
1) Operating temperature and optimum temperature 0-70 ° C, the optimum temperature is about 40 ° C. When Ca ²⁺ ions are present, the optimum operation temperature shifts to 50 ° C. The activity of about 20% of the optimum temperature activity value at 10 ° C. and about 10% of the optimum temperature activity value at 0 ° C. are maintained.
2) Temperature stability
It is stable up to 45 ° C under treatment conditions of pH 8.0 and 15 minutes, and is stable up to 50 ° C in the presence of Ca ²⁺ ions.
3) Working pH and optimum pH
The working pH range is 4 to 12 or higher, and the optimum pH is 11. Even at pH 12, the activity is maintained at 70% or more of the maximum activity value.
4) pH stability It is extremely stable at each pH from 5 to 12 under treatment conditions of 20 ° C. for 15 minutes.
5) Molecular weight The estimated molecular weight by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis is about 54,000.
6) Substrate specificity It acts on natural substrates such as casein, urea-modified hemoglobin and egg yolk.
Synthetic substrates Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA, Suc-Ala-Ala-Val-Ala-pNA and Z-Ala-Ala-Leu-pNA ( here Suc is succinyl group, pNA is p - a Nitoroaniriniru group, Z is acts on showing a carbobenzoyl group), p - to liberate nitroaniline.
7) Influence of metal ions Inhibited by Hg ²⁺ and Zn ²⁺ ions.
8) Inhibited by inhibitors EDTA, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), chymostatin and p-chloromercury benzoic acid (PCMB). Not inhibited by dithiothreitol (DTT), N -ethylmaleimide (NEM), 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), bestatin, leupeptin, pepstatin and phosphoramidon.
9) Influence of surfactant 2 to 7 depending on sodium alkane sulfate (SAS), α-olefin sodium sulfate (AOS), sodium polyoxyethylene alkyl sulfate (ES), sophanol 70H and α-sulfo fatty acid ester (α-SFE). Receives twice the activity boost. It is also stable to sodium dodecyl sulfate (SDS).

The microorganism producing a low-temperature alkaline protease according to claim 1, which is named Alteromonas sp. KSM-SP111 and deposited as FERM P-14838.

The method for producing a low-temperature alkaline protease according to claim 1, wherein the microorganism according to claim 2 is cultured, and the low-temperature alkaline protease is collected from the culture.