JP3313117B2

JP3313117B2 - ウイルス粒子の効率の高い生産および単離

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Publication number: JP3313117B2
Application number: JP52482495A
Authority: JP
Inventors: マイケルイー．ヘリンダ，; クリストファーピー．プライアー，; ジョナサンジェイ．ミッチェレン，; トーマスダブリュー．アイリッシュ，; デイビッドエム．ウェーバー，; リチャードエス．ゴーア，; ジェイムズジェイ．ハーター，; ピエレエム．ベイ，; ジョージシー．タル，
Original assignee: ザイミューンリスポンスコーポレイション
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 2002-08-12
Anticipated expiration: 2017-08-12
Also published as: CA2186034C; DE69515028D1; CA2186034A1; JPH10500286A; EP0751988B1; DE69515028T2; ES2141929T3; EP0751988A1; US6080571A; PT751988E; GR3033268T3; ATE189697T1; WO1995025789A1; US5661023A; EP0751988A4; AU2127395A; DK0751988T3

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、灌流バイオリアクターシステムを使用して
非溶菌細胞からウイルス粒子を生産するプロセスに関
し、このウイルス粒子は免疫原および／またはワクチン
として有用である。本発明はまた、陰イオン交換クロマ
トグラフィーを使用してレトロウイルス粒子を単離する
プロセスに関する。

報告されている開発非溶菌細胞から大量のウイルス粒子を生産するための
古典的な研究室手順は、主に多段階のバッチ培養の拡張
およびプールを包含する。スケールアップ法は、考慮す
べき安全尺度、および労賃、（特に、感染性の高いウイ
ルスの生産を伴う場合）政府の生物学的危険封じ込めの
基準を満たすための装置および老廃物の処理を必要とす
るという問題がある。さらに、ウイルスワクチンの生産
は、一般に感染細胞を低密度で培養する工程を包含す
る。これはレトロウイルスHIV−１（レンチウイルス）
（lentiviridae）のような低生産システムのためであ
り、比較的低いウイルス力価を生じる。

HIV感染の流行の現状は、HIVおよび他のレトロウイル
ス粒子由来の多数の抗原を構築するために、HIVおよび
他のレトロウイルス粒子を調製する多大な努力を導い
た。Jonas SalkおよびDennis J.CarloのPCT国際公開番
号第WO 88/09670号は、非感染性で不活性なHIV免疫原
（本明細書では以後ソーク型免疫原という）の調製に関
しており、このHIV免疫原は、エンベロープ糖タンパク
質gp160またはgp120を欠損している。これらの免疫原お
よびHIVワクチン（HIV−１およびHIV−２の両方を含
む）を調製するための通常の方法は、HIV感染細胞の多
段階のバッチ培養、ならびに不活性化、濾過、および超
遠心（ショ糖勾配における等密度遠心）工程を使用する
HIV粒子の単離（本明細書では以後「古典的プロセス」
という）を包含し、この方法は、図１に示されている。
後者の技術は特に容量に限界があり、労働集中的であ
り、そしてスケールアップのために高価な設備投資が必
要である。この方法はまた、細胞培養懸濁液１リットル
あたり約100μg/mLの総タンパク質含有量またはp24に基
づくELISAにより８〜10μg/mLを有する約10用量のソー
ク型免疫原を生産するのみである。従って、投与形態を
導くプロセッシングは、ヒトへの投与に適切な極めて高
い程度の純度を有するワクチンを達成する必要性は言う
までもなく、その低い収量および感染液の多段階単位の
操作を扱う必要のために、工業的生産に役立たない。そ
れゆえ、より安全で、より労働集中的でなく、そして高
い分離性を伴うよりコスト効率の良いスケールアッププ
ロセスが、ウイルス粒子の生産、そしてより詳細には、
スケールアップ生産のために必要とされている。

灌流バイオリアクターシステムは、高細胞密度および
それらの分泌生体分子を生産するための従来の多段階の
バッチ培養の代替方法として記載されている。W.R.Tolb
ertら，「生産のための灌流培養システム」,97頁,Large
−Scale Mammalian Cell Culture,J.FederおよびW.R.To
lbert編,Academic Press,Inc.（1985）は、灌流バイオ
リアクターシステムを使用して灌流中に代謝老廃物を除
去しながら、そして回収流中に部分的に細胞を回収しな
がら高細胞密度を生成することを開示している。W.R.To
lbertらはまた、灌流中に分泌生体分子および代謝老廃
物を同時に取り出しながら灌流バイオリアクターシステ
ムを使用して高細胞密度を生成し、および維持すること
を開示している。G.Schmidら,J.Biotech.,22,31（199
2）は、ハイブリドーマ懸濁培養を部分的に保持する、
または保持しない灌流バイオリアクターシステムの使用
がほとんど同一の抗体濃度および特異的な生産性を生み
出すが、生存細胞数の増加および2.5の要素による時空
収量の増加をもたらすことを開示している。M.Klopping
erら、「バッチ培養および灌流培養におけるハイブリド
ーマ細胞のフローサイトメトリーによるプロセス調
整」,125頁,Advances in Animal Cell Biology and Tec
hnology for Bioprocesses,R.E.Spierら編,Butterworth
＆ Co.Ltd.（1989）は、灌流バイオリアクターが、バ
ッチ培養と比較して６倍高いIgGの生産を有する無細胞
含有培地中のIgGを灌流することを開示している。M.Tok
ashikiら、「高分子量成分を再利用するハイブリドーマ
の高密度培養」,355頁,Advances in Animal Cell Biolo
gy and Technology for Bioprocesses,R.E.Spierら編,B
utterworth ＆ Co.Ltd.（1989）は、灌流バイオリアク
ターシステムを使用して、代謝老廃物を含む低分子量の
基質を培養培地から灌流しながらハイブリドーマにより
生産された高分子量成分を同時に維持するハイブリドー
マの高密度培養を生成することを開示している。しか
し、これらの参考文献はいずれも、ウイルス粒子の生産
のために灌流バイオリアクターを使用することを開示ま
たは示唆していない。

バイオリアクターシステムにおけるウイルス粒子の生
産は、以下の参考文献に記載されている。L.Fabryら、
「ウイルスワクチン生産のための高密度マイクロキャリ
アー細胞培養」,361頁,Advances in Animal Cell Biolo
gy and Technology for Bioprocesses,R.E.Spierら編,B
utterworth ＆ Co.Ltd.（1989）は、同時に代謝老廃物
の灌流をしながら、密集に達するまで足場依存性細胞株
を増殖するために灌流バイオリアクターを使用し、その
後、細胞株をポリオウイルス世代で感染させることを開
示している。L.Fabryらはまた、ウイルス複製の速度論
および灌流バイオリアクターについてのウイルス粒子生
産の比速度が、従来の培養で調製されたものと類似する
ことを開示している。L.Fabryらは、同時にウイルス粒
子の生産を有する細胞システムの増殖のために、灌流バ
イオリアクターを使用することを開示または示唆してい
ない。J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffiths,Cytotechnolog
y,４,145（1990）は、HIVのバッチ様式の生産のために
懸濁培養を使用する２つのバイオリアクターシステムの
操作を開示している。J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffiths
はまた、固定化ベッドバイオリアクターシステムの操作
を開示しており、ここではキャリア中に保持されている
HIV生産細胞は、増殖培地中に懸濁され、そこから取り
出され、そして新鮮な増殖培地に再懸濁される。しか
し、J.B.ClarkeおよびJ.B.Griffithsは、増殖培地がバ
イオリアクターから灌流され、細胞およびウイルスを含
む増殖培地がバイオリアクターから回収され、そして新
鮮な増殖培地がバイオリアクターに添加される条件下
で、増殖培地およびウイルス感染された非溶菌細胞を含
む灌流バイオリアクターにおいてウイルス粒子を生産す
ることを開示していない。

細胞培養からのウイルス粒子の生産に続いて、ウイル
ス粒子、特にレトロウイルス粒子を単離するためのプロ
セスは、問題をはらんでいる。従来の多段階のバッチ培
養では低いウイルス力価を有する大量の溶液を生産す
る。大量の溶液においてこれらの低ウイルス力価を扱う
ことは、老廃物処理の重大な問題である。さらに、これ
らの溶液は所望のウイルス粒子から大量の細胞破片、代
謝老廃物、および増殖培地要素を除去するために高純度
に精製されなければならない。さらに、培養培地は代表
的には、高い割合のウシ胎児血清を増殖因子として含有
し、この培養培地は単離プロセスを不利に要求する成分
の複雑な混合物である。HIVレトロウイルスの単離は、
特に問題である。なぜなら、ウイルスは高価で血清含量
の高い培地中に低い力価で生産され、およびその単離は
処理量が高度に制限されており、そして労働集中的であ
る多段階の超遠心工程を必要とするからである。従っ
て、高い人力の必要、大量の精製物質、高度な維持装置
の使用、および高価なBSL3施設におけるかなりの床面積
を、レトロウイルス粒子の単離のために必要とする。さ
らに、レトロウイルス粒子が生産される増殖培地中の外
来基質を制御する必要がある。従って、レトロウイルス
粒子を単離するための代替となるコスト効率の良い、そ
してスケールアップが可能な方法が必要である。

多数の参考文献が、個々のウイルスタンパク質を単離
するための方法を開示している。国際公開第WO9113906
号は、非融合組換えHIVウイルスタンパク質gp120をイオ
ン交換クロマトグラフィーで分画し、そしてCD4特異的
結合親和性を示す画分を疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製す
ることを開示している。米国特許第4,531,311号は、組
換えHIV逆転写酵素タンパク質を、混入する細胞性タン
パク質から陽イオン交換樹脂を使用することにより分離
することを開示している。日本国特許第61051571号は、
ブタヘルペスウイルス抗原をイオン交換樹脂に対するそ
の抗原の吸着、その後の緩衝液を使用するこの抗原の選
択的溶出により精製することを開示している。C.M.Nali
nら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87（19） 7593（1990）
およびC.M.Nalinら,J.Cell Biochem.Suppl.14D,108（19
90）は、組換えHIV Revタンパク質のイオン交換クロマ
トグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによる
精製を開示している。J.Rittenhouseら,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.171（１） 60（1990）は、組換えHIV−１
およびHIV−２プロテアーゼを、Mono Sにおけるイオン
交換クロマトグラフィー、その後のペプスタチンアガロ
ースクロマトグラフィーにより精製することを開示して
いる。A.Billichら,Biol.Chem.Hoppe−Seyler 371
（３） 265（1990）は、組換えHIV−１プロテアーゼ
を、予めSuperose Rにおけるゲル濾過クロマトグラフィ
ーおよび限外濾過を行ってから、Mono Sにおける陽イオ
ン交換クロマトグラフィーにより精製することを開示し
ている。J.K.K.Liら,J.Cell Biochem.Suppl.11C,181（1
987）は、マウス乳房腫瘍ウイルス、Ｂ型ウイルスの勾
配精製、その後のウイルスの破壊、および一連のアフィ
ニティークロマトグラフィーおよびイオン交換カラムク
ロマトグラフィーを用いるウイルス構造ポリペプチドの
分離を開示している。J.E.Newmanら,Abstr.Annu.Meet.A
m.Soc.Microbiol.86 Meet.,329 T−43（1986）は、HTLV
−３構造タンパク質をレンズマメレクチンアフィニティ
ー樹脂に通し、その後HPLCイオン交換クロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過工程を使用してさらに精製することに
より単離することを開示している。しかし、これらの参
考文献は、レトロウイルス粒子、より詳細にはHIV粒子
が陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製され得る
ことを開示または示唆していない。

いくつかの参考文献はウイルス粒子の精製のためのイ
オン交換クロマトグラフィーの適用を開示している。欧
州特許第0302,692号は、陰イオン交換クロマトグラフィ
ーでDNAを除去することによりＡ型肝炎ウイルス（HAV）
を精製することを開示している。日本国公開番号第2195
877号は、レトロウイルスまたはその成分をセルロース
硫酸ゲルまたは架橋した多糖硫酸ゲル（陽イオン性吸着
剤）と接触させ、続いてそこから溶出することにより精
製することを開示している。欧州特許第0459,842号は、
レトロウイルス粒子を精製するために陽イオン交換クロ
マトグラフィー工程を使用することを開示している。し
かし、これらの参考文献は、レトロウイルス粒子、より
詳細にはHIV粒子が、粒子を樹脂に結合させることによ
り陰イオン交換クロマトグラフィーで精製され得ること
を開示または示唆していない。

発明の要旨本発明は、ウイルス粒子を生産する連続プロセスに関
し、灌流増殖培地においてウイルス感染された生存可能
な非溶菌細胞の集団を提供する工程、および上記細胞を
含有する培地を上記灌流増殖培地中に残存する細胞の定
常状態の対数期増殖を維持する速度で取り出す工程を包
含する。

本発明はまた、レトロウイルス粒子を精製するプロセ
スに関し、レトロウイルス粒子および不純物を含む溶液
を陰イオン交換樹脂に通す工程、およびレトロウイルス
粒子を樹脂から溶出する工程を包含する。

図面の簡単な説明図１は、多段階のバッチ培養システムを使用する上流
の生産成分および不活化工程、濾過工程、および限外濾
過工程を使用する下流の単離成分を有する「古典的プロ
セス」によりHIV粒子を得るための図である。

図２は、灌流バイオリアクターシステムを使用する上
流の生産成分および不活化工程、濾過工程、および陰イ
オン交換クロマトグラフィー工程を使用する下流の単離
成分を有するプロセスによりHIV粒子を得るための図で
ある。

図３は、C4逆相HPLCカラム（Vydac）における以下
についてのHIV−１の分画クロマトグラフを示す：「古
典的プロセス」の多段階のバッチ培養システムにより調
製されたHIV−１粒子の参考標準ロット（クロマトグラ
フＡ）；「古典的な」多段階のバッチ培養システムによ
り調製されたHIV−１粒子のロット（クロマトグラフ
Ｂ）；そして灌流バイオリアクターシステムにより調製
されたHIV−１粒子の２つのロット（クロマトグラフＣ
およびＤ）。それぞれのクロマトグラフは、6Mグアニジ
ン−HCl（Gu−HCl）および10mMジチオトレイトール（DT
T）中で15分間、80℃で加熱することにより変性させた
約100μｇの産物である。溶出パターンは、任意の吸光
単位（AU）に対して測定した1mL/分の流速でのアセトニ
トリル勾配を使用することにより得られた。

図４は、ウェスタンブロットであり、0.1、0.25、0.
5、および１μg/mMの濃度のHIV−１粒子のロットの抗原
染色プロフィールを示す（HIV感染患者から単離したHum
an New York抗血清を使用する）。HIV−１粒子は、灌流
バイオリアクターシステムにより調製し、そして不活化
工程、濾過工程、および陰イオン交換クロマトグラフィ
ー工程（それぞれレーン２〜５）を使用して単離した。
そして濃度１μg/mMのHIV−１粒子の参考標準ロットに
ついての染色プロフィールを低分子量マーカー（レーン
１）に対して「古典的プロセス」により調製した（レー
ン６）。

図５は、SDS Pageであり、「古典的プロセス」により
調製したHIV−１粒子の参考標準ロットについての染色
プロフィール（レーン７）、５週間操作された灌流バイ
オリアクターシステムの最終回収物から単離されたHIV
−１粒子の染色プロフィール（レーン６）、ならびに灌
流バイオリアクターシステムの操作の第１週、第２週、
第３週、第４週、および第５週の間の回収物から単離さ
れたHIV−１粒子の染色プロフィール（それぞれレーン
１〜５）、ならびに低分子量マーカーの染色プロフィー
ル（レーン８）を示す。

図６は、同時にHIV−１生産を伴うHIV感染細胞を増殖
するための52日間の灌流バイオリアクターの運転を示
す。ここで、10日目〜24日目の間、28日目〜43日目の
間、および最後の46日目〜51日目の間、３つの定常状態
条件が維持された。生産性の尺度（p24濃度）が３相の
定常状態（SS）条件についての平均細胞密度の関数とし
て示される。

発明の詳細な説明先に使用したように、そして発明の説明を通して、以
下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有するこ
とが理解されるものとする：定義「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する。

「ウイルス粒子」は、完全なビリオン（ウイルス）な
らびに関連するウイルス粒子を包含するが、個々のウイ
ルスタンパク質は包含しない。細胞培養のためのウイル
ス粒子の供給源はウイルスに感染した患者に由来し得る
か、または感受性の細胞系で繰り返し継代することによ
り実験室で増殖させたウイルスに由来し得る。ウイルス
の例としては、カプシド、コア粒子、１以上のエンベロ
ープタンパク質が涸渇したビリオン、核カプシドコアを
伴わないビリオンエンベロープ、ビリオンエンベロープ
フラグメント、および欠損ビリオンまたは不完全なビリ
オンが挙げられる。好ましいウイルス粒子はレトロウイ
ルス粒子である。

「レトロウイルス粒子」は、RNAをゲノム物質として
有するウイルスを意味し、HIV−１およびHIV−２のよう
なヒト免疫不全ウイルス（HIV）、gp 120および／また
は160タンパク質が涸渇したHIV、HTLV−１、HTLV−２、
AKRウイルスAKR−Ｌ＃１、サル白血病ウイルス、および
BLVを包含する。好ましいレトロウイルス粒子として
は、HIV、gp 120および／または160タンパク質が涸渇し
たHIV、HTLV−１およびHTLV−２が挙げられ、さらに好
ましくはHIV−１である。

「細胞系」は、Ｔ−リンパ腫、HUT−78、H9、HZ 32
1、W/Fu線維芽細胞78A1株、SC−１、ヒト単球、CEM細
胞、およびMolt−４細胞を包含する。

「増殖培地」は、哺乳動物細胞系の増殖および生存を
支える栄養混合物を含有する溶液を意味する。増殖培地
は血清またはタンパク質を含んでもよく、または含まな
くてもよい。

「テンタクル（tentacle）陰イオン交換樹脂」は、負
に帯電した粒子と結合する能力を有する樹脂の部分が、
スペーサー部分の端部またはその近傍に位置する樹脂を
意味する。ここで、このスペーサーの端部は、スペーサ
ー部分の樹脂の骨格（backbone）構成部分への付着部位
とは遠位にある。テンタクル陰イオン交換樹脂の例はE.
M.Merck製のTMAE Fractogelである。

ウイルス粒子を調製するためのプロセスにおける本発
明による好ましい局面は以下の通りである：除去した培地中に存在するウイルス粒子を細胞から分
離し；該細胞を含む該培地および該ウイルス粒子を、該細胞
が定常状態の増殖に達するする前に除去し；該増殖培地を細胞の除去速度により規定される速度で
新しく補充し；該細胞および該ウイルス粒子を含む該培地を継続的に
または断続的に除去し；１日あたり、該細胞および該ウイルス粒子を含む該培
地の約20％〜約80％を除去し、さらに好ましくは１日あ
たり該増殖培地の約20％〜約50％を採取し；該ウイルス粒子はレトロウイルス粒子であり、さらに
好ましくはレトロウイルス粒子はHTLV−１、HTLV−２、
HIV−１、HIV−２またはgp 120および／または160タン
パク質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レト
ロウイルス粒子はHIV−１であり；該増殖培地は無血清培地であり；および／または該細胞はHIV−１に慢性的に感染したヒトＴ細胞リン
パ腫である。

本発明によるレトロウイルス粒子を単離するための好
ましい局面は以下の通りである：上記レトロウイルス粒子がHTLV−１、HTLV−２、HIV
−１、HIV−２またはgp 120および／または160タンパク
質が涸渇したHIVであり、さらに好ましくは該レトロウ
イルス粒子はgp 120タンパク質またはgp 160タンパク質
が涸渇したHIVであり；上記溶出を約0.6M〜約2M NaClを用いて行い、そして
さらに好ましくは該溶出を約1M NaClを用いて行い；陰イオン交換樹脂がテンタクル陰イオン交換樹脂であ
り；該陰イオン交換樹脂がTMAE Fractogelであり；およ
び／または精製が、さらに接触工程後かつ溶出工程前に約0.1〜
約0.55M NaClで該樹脂を洗浄する工程を包含する。

本発明により使用可能な灌流バイオリアクターシステ
ムは、バイオリアクター中に細胞およびウイルス粒子の
保持を可能にし、バイオリアクター内および外への増殖
培地の継続的な灌流を維持し、そして細胞およびウイル
ス粒子を含む増殖培地の採取（除去）および増殖培地の
新たな補充（採取した増殖培地と新たな増殖培地の交
換）を容易にするように配置される。これらのバイオリ
アクターは、バイオリアクターに関する内部および／ま
たは外部の灌流のために設計され得る。本発明に従って
使用されるバイオリアクターシステムを図２に示す。

図２の灌流バイオリアクターシステムは、配管モジュ
ールを有する外部の中空繊維灌流フィルターを使用す
る。この配管モジュールは、老廃物を含む増殖培地が浸
透側から回収される一方で、フィルターメンブレンの保
持側（retentate side）からリアクターへ細胞を再循環
させる。フィルターのポアサイズは、バイオリアクター
内に完全またはほぼ完全にウイルス粒子を保持するよう
に選択し、例えば、0.1μのポアサイズのフィルターま
での500kd MWCO限外フィルターを用いる。レベルセン
サーの制御下で、供給ポンプは新鮮培地を補給してリア
クター内の一定の容量を維持する。バイオリアクター中
の液体表面下に達する傾斜チューブを通じて細胞を無菌
的に採取する。このシステムは高密度培養にかなってお
り、ここでは高い生存能と増殖速度を有する細胞を維持
し、そしてバイオリアクターにおける破片を最小化する
ことが重要である。

細胞増殖速度および生存能が顕著に低下する前に、細
胞系の最適な細胞密度を支える灌流速度で作動するよう
にバイオリアクターを調整する。さらに、最適な細胞密
度、増殖速度、および生存能を維持するために、増殖培
地は、細胞密度が最大密度を超過しないようなレベルに
細胞密度を「カット−バック」しなければならない。細
胞は定常状態増殖に到達する前に採取されるべきであ
り、そして細胞は実質的に安定した状態の対数期増殖を
示すべきである。採取は継続的または断続的であり得
る。採取されるべき増殖培地の容量のパーセントは、細
胞系の増殖速度（μ）にほぼ等しく、この増殖速度は
［In（最終細胞密度／開始細胞密度）］／（最終時間−
開始時間）×100に等しい。例えば、細胞密度が24時間
ごとに30％増加する場合、１日あたりリアクター容量の
30％が採取されなければならない。毎日の採取として、
１日あたり増殖培地の約20％〜約80％を採取し、さらに
好ましくは１日あたり増殖培地の約20％〜約50％を採取
する。この採取はまた、死細胞が溶解する前に、それら
を除去することによりバイオリアクター中の破片を減少
させる。さらに、増殖細胞の毎日の採取は１つの濃縮さ
れた生産の流れにおけるウイルス粒子の除去を提供す
る。

本発明により使用される灌流フィルターは、細胞系お
よびウイルス粒子の両方を保持し、そして灌流を維持す
る分子量のカットオフを支持するポアサイズを有する。
分子量カットオフの決定は保持しようとするウイルス粒
子のサイズによって決定される。本発明によるHIV粒子
生産については、0.1μポアを有するSepracor,Inc.のTy
pe A中空繊維フィルターおよび500,000ダルトンの分子
量カットオフを有するA/G Technology,Inc.の中空繊維
限外濾過フィルターが、細胞系およびウイルス粒子の両
方を保持し、そして詰まりが灌流速度に影響を与えるま
で、平均５〜10日の間十分な灌流の流速を維持する。１
つのフィルターを有する代わりに、連続的に使用される
多種の灌流フィルターが継続的なウイルス生産工程の
間、灌流を支える。例えば、多種の５つの灌流フィルタ
ーにより約５週間の継続的なバイオリアクター工程が支
持される。

灌流フィルターコンポーネントはまた、フィルターの
自動的再生（例えば、水酸化ナトリウム水溶液のような
塩基性溶液での灌流フィルターのインサイチュの無菌洗
浄による）を提供する方法により使用できる。詰まりが
始まることによりフィルターの膜透過圧がある設定点に
到達する場合、コントローラーが細胞系およびウイルス
粒子を含む増殖培地のフィルターを通した再循環を中止
し、フィルターをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）でパ
ージして細胞を除去し、フィルターを塩基性溶液で洗浄
し、そしてフィルターを使用に戻す前にPBSで洗い流
す。この再生工程により、継続的な最大灌流速度である
１日あたり約４リアクター容量で高細胞密度のバイオリ
アクターでの約３ヶ月間のフィルターの操作を提供す
る。このレベルの自動化は、操作者の決定および操作を
減少させ、そして中空繊維の使用に伴うコストをも減少
させる。Trio透明化システム（Sepracor,Inc.）がこの
フィルター再生工程のために改変される。

バイオリアクターのための接種物を公知の組織培養方
法に従って調整した。例えば、細胞系を、RPMI 1640/10
％ウシ胎児血清のような細胞系の増殖を支え得る増殖培
地を含むT75組織培養フラスコに置き増殖を開始する。
続いて、培養をローラーボトルにまで拡大させバイオリ
アクター中に少なくとも約２×10⁵細胞/mLを提供する。
増殖期を約５日〜約10日へと最小化するためには、より
高い播種密度が好ましい。HIV感染細胞系を用いるバイ
オリアクターの接種後、細胞密度が約１×10⁶細胞/mLに
達すると、灌流を約１リアクター容量／日で開始させ
る。約２×10⁶細胞/mLで、灌流を約２リアクター容量／
日に増加し、そして約４×10⁶細胞/mLで、灌流を最大速
度である４容量／日に増加する。４リアクター容量／日
は８×10⁶細胞/mLを超える最大密度を支持する。

細胞およびウイルス粒子を含むバイオリアクター採取
物は公知の方法に従って単離され得る。

レトロウイルス粒子はまた、本発明に従って単離され
る。最初に、レトロウイルス粒子を通過させ、そして細
胞および他の破片を保持する約0.5μ〜約1.7μ、好まし
くは約0.7μ〜約1.5μ、さらに好ましくは約1.2μのポ
アサイズを有するフィルターを用いて細胞およびレトロ
ウイルス粒子を含むバイオリアクター採取物を透明化す
る。透明化した採取物である感染性レトロウイルス粒子
をプールし、そして充分に混合して等質性を確認する。

次いで、感染性レトロウイルス粒子を、継続撹拌しな
がらβ−プロピオラクトン（BPL）（約0.25mL BPL/L上
清）を添加し、続いてこの混合物を約２℃〜約８℃、好
ましくは約４℃〜約６℃で約18時間〜約24時間インキュ
ベートすることにより、不活性化に供する。次いで、こ
のプールを37℃に上昇させ、約２時間〜約５時間、好ま
しくは約３時間〜約４時間この温度に保って残留BPLを
加水分解する。この工程は、脂質、タンパク質、核酸な
どのような種々の構造成分をアルキル化することにより
ウイルスの感染力を化学的に低下させる役割を果たす。
BPL不活性化は決定的な不活性工程とは考えられず、BPL
だけで処理されたレトロウイルス粒子は依然感染性であ
ると考えるべきであり、そしてそれ相応に扱うべきであ
る。

次いで、BPLで処理したレトロウイルス粒子を含む溶
液を、ポリスルホン300,000MWカットオフメンブレンを
用いるタンゼンシャル（tangential）フロー限外濾過に
より約10倍〜約20倍に濃縮する。次いで、濃縮物を約５
容量〜約10容量のPBSに対してpH約７〜pH約８で、好ま
しくはpH約7.5でダイアフィルトレーションにかけて続
く陰イオン交換クロマトグラフィー工程のために必要な
バッファー条件を提供し、そしてこのクロマトグラフィ
ー工程中の結合能力を増加させる。この工程はレトロウ
イルス粒子を保持しながら浸透において90％を超えるア
ルブミンを除去する役割を果たす。

ダイアフィルトレーションにかけたレトロウイルス粒
子を含む溶液を、TMAE Fractogel（E.M Merck）また
はＱ−Sepharoseのような陰イオン交換樹脂を含む１以
上のカラムを通過させる。テンタクル陰イオン交換樹脂
が好ましい。なぜなら、陰イオン粒子と結合するための
樹脂の部位がウイルスサイズの粒子に対して最も高い結
合能を有し、従って非テンタクル陰イオン交換樹脂に比
較して最も高い倍率の精製を得るからである。陰イオン
交換樹脂の高い流速により、複数の超遠心分離機の使用
を必要とする等密度沈降に比較して１ユニットの操作に
おける大きなロットサイズの迅速な精製を容易にする。
カラムの交換時間が速いため、保管場所に備品を戻すこ
とが可能になり、限外濾過手順を包含する他の操作が可
能なスペースができる。重要なことは、殺菌、混入物の
除去、およびエンドトキシンの不活性化のために、強固
に結合した生物学的な物質をカラムから除去するために
用いられるNaOHに対する安定性を対象に樹脂を選択する
ことである。

陰イオン交換樹脂はまた、精製を受けるウイルス粒子
の構造全体を保存しながら混入物の除去を容易にすべき
である。DNAおよびエンドトキシンのような陰イオン性
混入物は、ウイルス粒子と共に濃縮されるが、しかしこ
れらの特定の混入物は樹脂と強く結合し、約1.0MのNaCl
のような高塩濃度によるウイルス粒子の選択的な溶出を
可能にする。各陰イオン交換クロマトグラフィー工程に
より、２つの工程についての陰イオン性混入物の累積的
な減少について、少なくとも２桁または４桁の減少を達
成する。溶出したウイルス粒子のサイズ排除HPLC、ウエ
スタンブロットおよびSDS−PAGE分析もまた、少なくと
も約24時間は溶出したウイルス粒子の検出可能な構造変
化を示さない。数日間の溶出緩衝液中の溶出ウイルス粒
子を保存すると検出可能な構造変化を生じる。従って、
解離現象を防ぎ、そして構造成分の整合性（consistenc
y）を維持するために直ちに希釈することが、産物が不
完全フロイントアジュバント中で乳化される場合、特に
免疫原性プロフィールの維持のために提案される。

レトロウイルス粒子を含むダイアフィルトレート溶液
を、テンタクル陰イオン樹脂TMAE Fractogelを含有す
るカラムを介して通過させる場合、樹脂を、続いて、pH
約６〜約7.5、好ましくはpH約6.2〜6.8、より好ましく
はpH約6.5で、約0.1〜0.55M NaCl、好ましくは0.3〜0.5
M NaCl、より好ましくは0.5M NaClを用いて洗浄し、そ
してpH約６〜7.5で、好ましくはpH約6.2〜約6.8で、よ
り好ましくはpH約6.5で約0.6〜2M NaCl、好ましくは約
0.8〜約1.4M NaCl、より好ましくは約1M NaClのより高
いNaCl濃度を使用して溶出する。カラムを約0.7〜約1.3
M NaOH、好ましくは約1M NaOHで殺菌し得る。

レトロウイルス粒子（特に、HIV）を含有する溶出溶
液を、約４倍〜約８倍、好ましくは約６倍に十分に希釈
して塩濃度を、pH約6.2〜約7.7、好ましくはpH約6.6〜
約7.5で、約0.05M〜約0.25M、好ましくは約0.1M〜約0.2
M NaClの範囲内に減少させ、長期間の間（例えば、18時
間より長く）、溶出の高NaCl濃度下に曝露された場合、
HIV−１粒子の部分的な分解を防止する。この第一のカ
ラムは、全タンパク質の比率に対して約40倍の精製を達
成するプロセスにおいて最も重要で効率的な精製工程で
ある。SDS−PAGE分析により、培地成分の大部分がカラ
ム素通り中に存在し、さらに混入物がNaCl洗浄液の洗浄
により除去され、そしてHIV粒子について、HIV−１参照
標準と比較した認識可能なタンパク質パターンが、溶出
画分から決定できることが示される。

希釈および混合して均質性を確認した後、レトロウイ
ルス粒子の溶液を第二の陰イオン交換樹脂（例えば、Ｑ
−Sepharoseカラム）にかけた。第二の適用は、第一
の樹脂の使用に比べて約２分の１量の樹脂を用いて行
う。Ｑ−Sepharoseを使用するクロマトグラフィーを
樹脂を約0.3M〜約0.8M NaCl、より好ましくは約0.6M Na
Clで洗浄し、そしてウイルス粒子を第一の樹脂の適用に
おいて記載したように溶出液を使用して溶出する。

第二の陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて、約
1Mのウイルス粒子溶出画分をポリスルホン300,000MWカ
ットオフメンブレンを含む限外濾過プレートおよびフレ
ームシステムを用いて５倍濃縮する。次いで、濃縮物を
生理食塩水に対して透析して、塩濃度を等張強度に減少
させ、そして製品製剤の調製物中のリン酸レベルを減少
させる。精製産物を−70℃で凍結し、そして約24時間の
コバルト照射（約２〜約4.5メガラド）に供する。この
手順は、核をPCR分析により測定されるように約200塩基
対の断片に剪断することによる最終的な不活性化工程と
して作用する。

産物を注射のために0.9％生理食塩水で必要とされる
濃度の抗原（p24濃度）に達するように希釈して処方
し、そして振とうデバイスを用いて、約１時間、等容量
の不完全フロイントアジュバントと無菌的に混合する。
（無菌量として今回用意された）最終物質（大量の免疫
原）は、粘性の灰白色の乳濁液のような外観である。

本発明はさらに例証されるが、本発明に従うプロセス
を例示する以下の実施例により制限されない。

ウイルスの粒子の生成に使用する宿主細胞株は、IPL
−１と称されるＴリンパ腫で慢性的に感染される。この
ために、無血清増殖培地（IMAT）を、優れたウイルスの
産生を維持し、そして10％ウシ胎児血清（FBS）におい
て培養された細胞に匹敵する増殖速度を維持するように
改良する。IMATは、以下のリスト：成分濃度トランスフェリン，ヒト（HOLO）HI（Miles） 0.010g/L インスリン，ヒト組換え体,Zn 0.010g/L アルブミン，ヒト血清（25％） 5.0mL/L コレステロール 0.00045g/L DL−α−酢酸トコフェロール 0.0002g/L タラ肝油 0.001g/L リノレイン酸 0.000021g/L DL−α−リポ酸 0.0000515g/L Tween 80 0.0025mL/L エタノールアミンF.B. 0.000611g/L プルロニックＦ−68,NF用 1.000g/L に由来する成分を4g/Lのグルコースおよび0.3g/LのＬ−
グルタミンを含有するRPMI 1640に添加することにより
形成される。無血清培地のタンパク質含量の減少は、下
流のプロセシングの効率を補助する。

Manufacture's Working Cell Bank（MWCB）由来の細
胞を、Ｔフラスコ中で増殖後、スピナーまたはローラー
ボトル（T25→T75→T150→850cm²ローラーボトルへと進
行する）中で増殖させ、バイオリアクターのための接種
物を提供する。２×10⁵細胞/mLの最少密度で播種の際
は、細胞は65％よりも高い生存率で指数関数的に増殖す
る。これらの必要条件は、バイオリアクター中の遅滞期
（lag phase）を、最初の播種後５日以内に最小化する
ために必要である。細胞が増殖し始め、播種後24時間で
５×10⁵〜９×10⁵に密度が達成される場合、新鮮な培地
の連続的な供給を提供し、そして使用済みの培地を連続
的に除去する。培地交換の速度は約0.5リアクター容量
／日で開始し、細胞密度が約２×10⁶〜約４×10⁶細胞/m
Lに達する場合、４リアクター容量／日に増加させる。
この連続的な灌流の状態において、約８×10⁶個の細胞
密度が達成される。これは連続的な栄養物の送達、およ
び老廃物の除去の結果である。それゆえ、灌流は、代表
的にスピナーにおいて得られる毎日の平均細胞密度（こ
こでは細胞がバッチモードで増殖される）よりも約10倍
〜約20倍高い細胞密度を達成する。

連続的な灌流を維持しながら細胞の保持を可能にする
リアクターの構成を図２に表す。原理は、使用済み培地
を浸透側から回収しながら、フィルターメンブレンの保
持側（retentate side）からリアクターへ細胞を再循環
する配管モジュールを有する外部の中空繊維濾過デバイ
スを含む。老廃物を除去するために中空繊維フィルター
を0.1ミクロンポアサイズで使用すると、ほとんど完全
にウイルス粒子をバイオリアクター中に維持する。した
がって、毎日の採取において細胞とともにウイルス粒子
を除去することを容易にする。フィードポンプはレベル
センサーの制御下で一定の容量を維持して新鮮な培地を
供給する。本発明者らはIPL1B MWCBについて４リアクタ
ー容量／日の灌流速度が、約６×10⁷〜約８×10⁷細胞/m
Lの密度を支持するとしている。この時点で細胞増殖は
定常期に近づく。この条件の結果、培養物の生存率およ
び／または増殖速度の減少を生じる。最適な増殖速度で
細胞を維持するために、リアクター液の毎日の採取が、
「カット−バック」密度（例えば、約３×10⁶〜約６×1
0⁶細胞/mL）で要求され、この密度は採取リアクター容
量／日のおよそ３分の１に等しい。このことはまた、高
い生存率を維持し、そして死細胞の除去により細胞破片
を減少する。最も重要なことに、リアクターの内側から
の毎日の採取容量がウイルス粒子の除去を可能にする。

毎日の採取からのウイルス粒子の回収および精製にお
ける最初の工程は、精密濾過（micro−filtration）手
順を用いる細胞および細胞破片の除去を必要とする。こ
のことは、約0.65ミクロン〜0.8ミクロンの範囲のポア
サイズを有するメンブレンを利用するデットエンド（de
ad−end）濾過のデバイスの使用を包含する。この手順
はウイルス粒子から細胞および細胞破片を分離する役割
を果たす。

この手順は代表的に、分類された採取物にβプロピオ
ラクトン（BPL）を１リットルの上清あたり最終濃度0.2
5mL BPLで添加した後、４℃で18〜24時間インキュベー
ションし、次いで37℃で５時間インキュベートしてBPL
を不活性化する工程を包含する。続いてこのプールを、
さらなるプロセスを行うまで、４℃で０〜６日間保持す
る。この不活性化工程は、ウイルスの種々の構造組成
（例えば、脂質、タンパク質、核酸など）をアルキル化
することによりウイルス粒子の感染力を化学的に減少す
る役割を果たす。本発明者らはこのBPL不活性化工程
は、最終的なウイルスの不活性化ではないことを指摘
し、そして本物質はさらに感染性であると思われ、なら
びにそのように処理される。

BPLで処置される物質は、周囲温度に達することが可
能であり、そして300,000MWカットオフメンブレンを用
いるタンゼンシャルフロー限外濾過により10倍〜20倍濃
縮される。次いで、濃縮プールを５〜10容量のリン酸緩
衝化生理食塩水（PBS）pH7.5に対して透析する。この工
程で使用されるメンブレンのポアサイズは、増殖培地か
ら90％より多くのヒト血清アルブミンおよび他のタンパ
ク質、ならびに浸透における他の比較的小さな分子を除
去しながら、HIV粒子を保持する役割を果たす。

濃縮され透析された物質のpHを、pH7.5に合わせ、そ
して50cm/時間の直線フロー速度でTMAE Fractogel樹
脂を含有するカラム上に載せる。このカラムを約３〜５
のカラム容量の0.5M NaCl pH6.5で洗浄する。次いで、
結合産物を1.0M NaCl pH6.5を用いて溶出し、そして280
nMで吸収する全ピークを回収する。続いてカラムを、1.
0N NaOHで１〜２カラム容量の洗浄をした後、殺菌す
る。1.0M NaCl溶出画分に含まれる産物を６倍希釈し、
0.1M〜0.2M NaClの塩濃度およびpH6.5〜7.5の範囲内に
減少した。次いで、これをTMAE Fractogelカラムに比
べて約２分の１量の樹脂を含むＱ−Sepharose Fast Flo
wカラムに、100cm/時間の直線フロー速度で適用す
る。カラムを３〜５カラム容量の0.6M NaCl pH6.5で洗
浄する。結合産物を再び、1.0M NaCl緩衝液で溶出す
る。

Ｑ−Sepharose Fast Flowカラムからの1.0M NaCl画
分を、100,000−300,000MWカットオフメンブレンを含む
限外濾過プレートおよびフレームデバイス用いて約５倍
濃縮する。次いで、濃縮物をPBS p7.5に対して透析して
塩濃度を減少させる。濃縮後のデットスペース中の産物
の損失を最小化するために、器具に１デットスペース容
量の生理食塩水（0.9％ NaCl）を流し込み、そして洗浄
物を透析画分に添加する。物質を−70℃に凍結し、そし
てコバルト照射（２〜4.5メガラド、約24時間）に供す
る。これは最終的なウイルス不活性化工程として働く。

この段階で前もって処方された産物を注射のために0.
9％生理食塩水で、必要とされる濃度の抗原（p24濃度）
に達するように希釈し、そして振盪デバイスを用いて、
約15分〜20分間、等容量の不完全フロイントアジュバン
トと無菌的に混合する。

本研究は、多くの整合性（consistency）濃度を制御
するための新規の参照標準を確立するために、および
「古典的プロセス」により調製される物質との同等性を
示すために、必要不可欠である本発明に従って調製され
るgp120の減少されるHIV−１の特徴づけを包含する。特
徴づけのデータは、公知のHPLC手順（図３）、ウェスタ
ンブロット手順（図４）およびSDS−PAGE手順（図５）
を用いることによるバッチ培養／スクロース勾配方法論
によって調製される物質に対する産物同等性、バイオリ
アクター工程のウエスタンブロット（図４）の開始時に
または終了時から出発物質が単離されるかどうかの産物
整合性、そして異なるバイオリアクター工程のHPLC間の
産物整合性（図３）を示す。

代表的なバイオリアクター工程の実施（図６）は、増
殖期が６日目まで続き、６日目に生産期が毎日の細胞採
取を始めることにより開始されたことを示す。生産期は
48日間続いた。図６はバイオリアクターが、３つの異な
る安定状態の細胞密度で採取容量を制御することにより
維持されたことを示す。この工程（図６）において安定
状態の細胞密度が、約3.5×10⁶細胞/mLで10日間〜24日
間維持され；約６×10⁶細胞/mLで28日間〜43日間維持さ
れ；および約７×10⁶で46日間〜51日間維持される。生
産性（p24濃度）の測定は各定常状態期間についての平
均細胞密度の関数として示される。明らかに、高い細胞
密度の上昇がp24を生じる。さらに、より速い増殖速度
が、これがより大きな採取容量を安定状態の細胞密度を
維持するために必要であるので望ましい。産物が毎日の
細胞の採取から回収されるので、このことは毎日のウイ
ルス粒子のより高い生産と解釈される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者プライアー，クリストファーピー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19087，ウェイネ，ワーナーロード 279 (72)発明者ミッチェレン，ジョナサンジェイ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 18074，パーキオメンビル，ヒルデブランドロード 652 (72)発明者アイリッシュ，トーマスダブリュー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19464，ポッツタウン，ディアーリッジドライブ 2136 (72)発明者ウェーバー，デイビッドエム. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19460，フェニックスビル，サウスメインストリート 308 (72)発明者ゴーア，リチャードエス. アメリカ合衆国ペンシルバニア 18966，サウザンプトン，クッシュモアロード 1388 (72)発明者ハーター，ジェイムズジェイ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19063，メディア，ウエストバルチモアパイク 1016，アパートメントシー−11 (72)発明者ベイ，ピエレエム. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19130，フィラデルフィア，バトンウッドストリート 1801，アパートメント 1718 (72)発明者タル，ジョージシー. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19403，ノーリスタウン，エジプトロード 87 (56)参考文献特開昭60−102187（ＪＰ，Ａ) 特表平５−502581（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/02 C12M 3/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】レトロウイルス粒子を精製するためのプロ
セスであって、該レトロウイルス粒子をテンタクル陰イ
オン交換樹脂と接触させる工程、および該レトロウイル
ス粒子を該テンタクル陰イオン交換樹脂から溶出させる
工程を包含する、プロセス。
【請求項２】請求項１に記載のプロセスであって、前記
テンタクル陰イオン交換樹脂からの前記レトロウイルス
粒子を、Ｑ−SEPHAROSE（登録商標）樹脂と接触させる
工程、および該レトロウイルス粒子を該Ｑ−SEPHAROSE
（登録商標）樹脂から溶出させる工程をさらに含む、プ
ロセス。
【請求項３】前記溶出工程が、0.6〜2M NaClで行われ
る、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】前記溶出工程が、1M NaClで行われる、請
求項１に記載のプロセス。
【請求項５】前記テンタクル陰イオン交換樹脂がTMAE
FRACTOGEL（登録商標）である、請求項１に記載のプロ
セス。
【請求項６】前記精製工程が、前記接触工程後で、かつ
前記溶出工程の前に、前記テンタクル陰イオン交換樹脂
を0.1M〜0.55M NaClで洗浄する工程をさらに含む、請
求項１に記載のプロセス。
【請求項７】前記レトロウイルス粒子が、HTLV−１、HT
LV−２、HIV−１、HIV−２またはgp120タンパク質およ
び／もしくはgp160タンパク質の欠損したHIVである、請
求項１に記載のプロセス。
【請求項８】前記レトロウイルス粒子が、HIV−１であ
る、請求項２に記載のプロセス。
【請求項９】前記レトロウイルス粒子がgp120タンパク
質またはgp160タンパク質を欠損したHIVである、請求項
１に記載のプロセス。