JP3392865B2

JP3392865B2 - 固定化酵素調製物およびＤ―α―アミノ酸の製造法

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Publication number: JP3392865B2
Application number: JP51079792A
Authority: JP
Inventors: 勇喜雄山田; 弘憲難波; 昌行 ▲高▼野; 康裕池中; 里美 ▲高▼橋; 一真大窪; 和彦山田; 芳朗平石
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1991-06-12
Filing date: 1992-06-10
Publication date: 2003-03-31
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: SG54305A1; EP0543021B1; EP0543021A4; EP0543021A1; WO1992022643A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、固定化酵素調製物およびそれを使用するＤ
−α−アミノ酸の製造法に関する。本発明の固定化酵素
調製物は、特に、抗生物質アモキシシリンの製造に用い
るＤ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンなどのよう
な抗生物質の中間原料となるＤ−α−アミノ酸の製造に
役立つ。

従来の技術Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸誘導体をＤ−α−
アミノ酸に変換できる酵素（以下「脱カルバミル酵素」
という）が存在することは、例えば、特公昭57−18793
号、特公昭63−20520号、特公平１−48758号などですで
に知られている。

酵素または酵素産生細胞を不溶化すなわち固定化して
使用すると、不純物が少ない酵素反応液が調製でき、生
成物の回収が容易になること、酵素の反復使用が可能に
なるためコスト回収に有利であることなどがすでに他の
多数の酵素について知られており、また、工業生産にも
使用して効果をあげている。

しかし、脱カルバミル酵素の場合、全細胞、トルエン
化菌体、細胞のアセトン処理粉末または無細胞抽出液と
して使用した例はあるが、固定化酵素としての使用は、
特公昭63−20520号に使用態様としての可能性が一般的
に示唆されているに過ぎない。

脱カルバミル酵素のこれらの使用例は、酵素活性は示
すが、活性の維持に問題がある。特に、反復使用の点で
劣っており、商業的ベースで使用できるものではない。

発明の目的本発明は、反復使用に耐えうる安定性を備えた、脱カ
ルバミル酵素の固定化調製物を得、工業生産への使用を
はかるものである。

本発明者らは、前記事情に鑑みて鋭意研究を重ねた結
果、酸化防止剤が脱カルバミル酵素の安定化に有効であ
り、これの存在下に脱カルバミル酵素を固体支持体と接
触させることにより反復使用の可能な脱カルバミル酵素
の固定化調製物を得ることができることを見いだし、本
発明を完成させるに至った。

発明の概要本発明は、Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸を加水
分解してＤ−α−アミノ酸を生成させる酵素（脱カルバ
ミル酵素）、酸化防止剤および適当な固定化支持体から
なることを特徴とする固定化酵素調製物、脱カルバミル
酵素を酸化防止剤の存在下、固定化支持体に接触させる
ことを特徴とする該固定化酵素調製物の製造法、および
Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸に該固定化酵素調製
物を作用させることを特徴とするＤ−α−アミノ酸の製
造法を提供するものである。

発明の詳細な説明本発明で用いる脱カルバミル酵素としては、Ｎ−カル
バミル−Ｄ−α−アミノ酸のＮ−カルバミル基を脱離す
る作用のある酵素であればいずれでもよく、Ｄ−アミノ
酸に立体特異的な作用があるものでもＤまたはＬ−アミ
ノ酸いずれに作用するものでもよい。使用する態様にも
よるが、普通はＤ−アミノ酸に特異的な酵素が有用なこ
とが多い。

酵素源については、動物、植物、微生物など特に制限
はないが、工業生産のためには微生物が適している。か
かる微生物としては、例えば、特公昭57−18793号、特
公昭63−20520号および特公平１−48758号に開示された
アグロバクテリウム属、シュードモナス属、アースロバ
クター属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、モ
ラキセラ属、パラコッカス属、アエロバクター属、アエ
ロモナス属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、フラ
ボバクテリウム属、セラチア属などの天然の微生物や、
特願平２−400848号に記載されるごとき遺伝子組換えに
よって脱カルバミル酵素産生能を付与された、あるいは
増強された人工微生物が挙げられる。これらの微生物の
代表的な例としては、アグロバクテリウム・スピーシー
ズKNK712（FERM BP−1900）、シュードモナス・スピー
シーズKNK003A（FERM BP−3181）、シュードモナス・
スピーシーズKNK505（FERM BP−3182）、エシェリヒア
・コリJM109pAD108（FERM BP−3184）、エシェリヒア
・コリJM109pPD304（FERM BP−3183）などが挙げられ
る本発明においては、該脱カルバミル酵素は精製酵素、
部分精製酵素または粗酵素として、場合によっては菌体
のままで固定化酵素調製物中に存在していてよく、脱カ
ルバミル活性を発揮できる状態にあれば、存在型態や共
存物を問わない。

酸化防止剤としては、ジチオスレイトール、２−メル
カプトエタノール、Ｌ−システイン塩酸塩、システアミ
ン塩酸塩、ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール
とジチオエリスリトールの混合物、還元型グルタチオン
などが使用できる。

用いる固定化支持体は、脱カルバミル酵素の固定化時
の態様によって異なるが、無細胞抽出液のような粗酵素
液や硫安分画等を行った部分精製酵素液を固定化に供す
る場合は、イオン交換基や共有結合基をもったポリマー
支持体が使用できる。

イオン交換基を持ったポリマー支持体としては、陰イ
オン交換樹脂、例えば、第１、２、３、４級アミンを交
換基とするデュオライト（登録商標）Ａやアムバーライ
トIRA（登録商標）のシリーズ、あるいはジエタノール
型の官能基を持つポリスチレン樹脂、例えば、ダイアイ
オンEXなどが使用できる。

共有結合基を持つものとしてはアルデヒドを結合基と
して持つ置換ポリメタクリル酸ポリマー、ポリエチレン
イミン／グルタルアルデヒド複合体で被覆された高密度
アルミナなどが使用できる。

また、生菌体や乾燥菌体のような全細胞を固定化する
には、ポリアクリルミド、ポリウレタンまたはアルギン
酸カルシウムなどのポリマーや軽石、アルミナのような
多孔質材料を使用することができる。

本発明の固定化酵素調製物は以下のようにして製造さ
れる。

まず、微生物を培養し、菌体を採取して超音波破砕、
機械的破砕（ホモゲナイザーなど）、酵素処理などによ
って無細胞抽出液を調製する。この場合、0.1mM〜20m
M、通常5mM程度の酸化防止剤を存在させる。

無細胞抽出液より酵素を部分精製するには当業者が通
常使用する手段が用いられる。例えば、硫酸プロタミン
を蛋白量の1/5〜1/10量加えて核酸を沈澱させ、50〜60
℃の温度で約20分間加熱した後、４℃に冷却して熱に不
安定な蛋白を沈澱させ、これを遠心分離して核酸と熱不
安定な蛋白を除去する。さらに、必要に応じて硫安分画
を行い、支持体と接触させる酵素溶液とする。この間、
酸化防止剤を0.1mM〜20mMの範囲、通常5mM程度存在せし
める。

支持体は交換基を食塩水などで活性化した後、0.1〜2
0mM、通常5mM程度の酸化防止剤を含む緩衝液中で平衡化
させたものを使用する。支持体と酵素溶液を0.1〜20m
M、通常5mM程度の酸化防止剤の存在下で接触させ、４〜
30℃、好ましくは25℃で攪拌する。酵素の吸着量が所期
の量に達した後（通常８〜48時間）、濾取し、架橋剤で
処理して不溶化し、安定化させる。架橋剤としては、例
えば、１％以下（好ましくは0.2％）のグルタルアルデ
ヒドなど公知のものが使用できる。この間も酸化防止剤
を0.1mM〜20mM存在させるのが好ましい。架橋された固
定化酵素調製物は蒸留水や緩衝液（酸化防止剤を含むの
が好ましい）で洗浄し、低温（約４℃）にて密閉容器中
に湿潤状態で保存する。

可能な限り全操作は窒素など不活性ガスの雰囲気下で
行うのがよい。酵素の負荷量は、酵素の精製の度合いな
どにより異なるが、一般には、10〜80単位/g支持体であ
る（ここに、１単位の脱カルバミル酵素は、Ｎ−カルバ
ミル−Ｄ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシン１μmo
lを１分間でＤ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシン
に転換するに必要な酵素量である）。固定化酵素調製物
中の酸化防止剤の量５〜10mg/g調製物になるようにする
ことが好ましい。

つぎに、脱カルバミル酵素の固定化調製物を使用した
Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸からＤ−α−アミノ
酸を製造する工程について説明する。

反応は、酸化防止剤の存在下で行われ、反応式：［式中、Ｒは、所望により、水酸基、アルキルチオ基、
カルボキシル基、アミノ基、アミド基などの基で置換さ
れていてもよい炭素数１〜４のアルキル基、所望によ
り、芳香環が水酸基などで置換されていてもよい炭素数
７〜８のアラルキル基（ベンジル、フェネチル基など）
または、所望により、水酸基やハロゲンで置換されてい
てもよいフェニル基を意味する］で表される。

酸化防止剤の量は、0.1〜20mM、好ましくは2.0〜5.0m
Mである。

反応基質であるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸の
濃度は、５〜25w/v％、好ましくは15w/v％で使用され
る。固定化酵素調製物の使用量は、10〜80単位/g支持体
のもので対基質当り10〜20単位、好ましくは15単位/g基
質の範囲で用いられ、反応はpH6.5〜8.0の範囲、通常pH
7.0にpHを制御しつつ行う。温度は酵素によって異る
が、一般には30℃〜60℃、特に耐熱性の酵素ではさらに
高い温度で使用することもできる。反応は、カラム法
や、反応器中に懸濁して行うが、後者ではバッチ反応が
普通に行われ、通常１バッチ当たり６〜48時間程度の反
応時間である。本発明の固定化酵素調製物は、非常に安
定で、例えば、15回以上の使用でも活性低下はほとんど
なく、30回以上の反復使用も可能であった。

反応容器中は不活性ガスで置換して、酸素不在の状態
にしておくのが好ましい。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する
が、本実施例は本発明の例示に過ぎず、何らこれらに限
定されるものではない。

実施例１脱カルバミル酵素はつぎの方法を用いて細菌発酵によ
り生産した。

培地成分：シュークロース 300g 尿素 25.5g KH₂PO₄ 30g Na₂HPO₄ 30g MgSO₄・7H₂O 15g MnCl₂・4H₂O 150mg 酵母エキス 75g Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルグリシン 15g 消泡剤 15g これらの成分を含む発酵培地15リットルを用意し、pH
7.0に調整した。この培地を18リットルの発酵槽に入
れ、121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。尿素およ
びＮ−カルバミル−Ｄ−フェニルグリシン溶液を別々に
ミリポアフィルターにて除菌し、それぞれ500ミリリッ
トルずつを無菌条件下で発酵槽に加えた。

発酵槽には、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルグリシン
を除いた同様な培地で30℃30時間生育させたアグロバク
テリウム・スピーシーズKNK712（FERM BP−1900）の種
培養物を接種した。発酵は33℃に保ち通気した。pHは硫
酸と可性ソーダー溶液を用いて7.0に制御した。

発酵を30時間行ったあと、細胞を遠心分離により採取
した。この細胞沈殿物を0.2Mリン酸緩衝液1.5リットル
（pH7.0）中に再懸濁し、ジチオスレイトール5mMになる
よう加え、超音波処理して溶液中に脱カルバミル酵素を
放出させた。

酵素の部分精製はつぎのように行った。

３％硫酸プロタミン水溶液76ミリリットルを攪拌しな
がら徐々に添加し、核酸を沈澱させ、その酵素溶液を50
℃で20分間加熱処理し、その後４℃に冷却した。４℃で
一夜貯蔵後、核酸と蛋白質を沈澱させ、遠心分離して細
胞破砕物を除いた。この調製物の脱カルバミル活性を測
定するために検定した。１％Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェ
ニルグリシン/0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）に酵素調製物
を加え40℃条件下反応を行ない、Ｄ−フェニルグリシン
の生成を調べた。

一方、この酵素調製物にジチオスレイトール5mMとな
るよう添加し、さらに硫安による分画を実施した。氷
冷、攪拌しながら硫安を少量ずつ添加し、蛋白を沈澱さ
せた。硫安飽和15〜35％の活性画分を採取し、リン酸緩
衝液100ミリリットル（pH7.0）に溶解させ、同様の活性
検定を行った。

実施例２商業的供給源から入手した３種の陰イオン交換樹脂
（デュオライト、アンバーライトおよびダイアイオン）
のサンプルを1M NaCl中で１時間洗浄したのち、ジチオ
スレイトール5mMを含む0.2Mリン酸緩衝液中で一夜平衡
化した。平衡化した樹脂は濾過して必要になるまで貯蔵
した。実施例１に記載のごとく調製した部分精製酵素を
固定化に使用した。樹脂1g（湿潤重量）当たり実施例１
の酵素の熱処理後のものおよび硫安分画後のものそれぞ
れ５ミリリットルおよび10ミリリットル（10〜80単位/g
樹脂）を、25℃で24時間混合することにより、酵素を樹
脂に吸着させた。この酵素−樹脂複合体を濾過し、pH7.
0にて１％グルタルアルデヒドで処理した。１時間後、
樹脂サンプルを再度濾過し、蒸留水で３回洗浄した。最
後に、酵素−樹脂複合体を0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）
で洗い、N₂ガスを注入した密閉容器中に４℃で湿った状
態のまま貯蔵した。

この方法で製造したそれぞれの酵素−樹脂複合体は、
実施例１に記載のようにその活性を測定すべく検定し
た。表１はこの方法で処理した一連の市販のイオン交換
樹脂に対して得られた比活性を示す。

デュオライト（Duolite）およびアンバーライト（Amb
erlite）樹脂は米国フィラデルフィア、ローム・アンド
・ハース社の商品であり、ダイアイオン（Diaion）樹脂
は日本、三菱化成工業の製品である。

実施例３実施例１で調製した熱処理後の部分精製酵素液（活
性:2.5単位／ミリリットル）100ミリリットルをデュオ
ライトA568樹脂15gに添加した。この混合物を25℃で24
時間穏やかに攪拌して脱カルバミル酵素を支持体に吸着
させた。ついで、酵素−樹脂複合体を濾過により分離
し、ジチオスレイトール5mMを含む0.2％グルタルアルデ
ヒド溶液中（pH7.0）で１時間攪拌した。蒸留水で３回
洗い、最後に0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）で洗った。こ
の酵素−樹脂は密閉容器中に４℃で湿った状態のまま貯
蔵した。一方、硫安分画後の酵素液（活性:9.3単位／ミ
リリットル）30ミリリットルをデュオライトA568樹脂3g
に添加し、以下同様に調製した。固定化酵素液は実施例
１のようにして検定し、その比活性はそれぞれ9.8単位/
g、70単位/g樹脂であった。

Ｎ−カルバミル−Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシン10
gおよびジチオスレイトール8mg（0.5mMとなる）をジャ
ケット付きの容器中の蒸留水100ミリリットルに加え攪
拌しながら10N NaOHを加え、pHを7.0に調製した。窒素
ガスを連続的に吹き込みながら温度を40℃に制御した。
この系を平衡化した後、147単位の酵素−樹脂複合体（1
5g）を加え反応させた。その間、塩酸溶液でpH7.0に調
整した。24時間後Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンの収
率は97％である事がHPLCにより測定された。この方法で
製造した生成物は慣用手段で単離する事ができ、高い光
学純度をもつことが判明した。一方、硫安分画後の酵素
−樹脂では、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ヒドロキシフェニル
グリシン15gおよびジチオスレイトール8mgをジャケット
付き容器中の蒸留水100ミリリットルに加え、以下同様
の操作を行ない210単位の酵素−樹脂3gを加え、同様に
反応させ、高光学純度のものを得た。

この方法で使用した酵素−樹脂は、反応の終了時に酵
素を窒素雰囲気下に保つように注意しながら、Ｄ−ヒド
ロキシフェニルグリシン溶液を吸引し、その代わりに予
め平衡化しておいた基質懸濁液を新たにセットすること
により、30回再利用した。これらのサイクル全体を通じ
て、Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンへの転化率は95％
またはそれ以上であった。

実施例４実施例１に記載の培地でシュードモナス・スピーシー
ズKNK003A（FERM BP−3181）を生育させ、細胞を遠心
分離により発酵ブロス９リットルから収穫した。この細
胞を0.2Mトリス／塩酸緩衝液（pH7.0）300ミリリットル
中に再懸濁し、ジチオスレイトール5mMとなるよう加
え、超音波処理して溶液中に脱カルバミル酵素を放出さ
せた。これに３％硫酸プロタミン水溶液20ミリリットル
を攪拌しながら徐々に添加し、核酸を沈澱させた。その
酵素溶液を65℃、20分間加熱処理し、その後、４℃に冷
却した。４℃で一夜貯蔵後、核酸と蛋白質で沈澱させ、
遠心分離して細胞破砕物を除いた。この熱処理後の部分
精製酵素液（活性:0.06単位／ミリリットル）100ミリリ
ットルをデュオライトA568樹脂10gに添加した。この混
合物を25℃で24時間攪拌して脱カルバミル酵素を支持体
に吸着させた。酵素−樹脂複合体を濾別し、ジチオスレ
イトール5mMを含む0.2％グルタルアルデヒド溶液中（pH
7.0）で穏かに１時間攪拌架橋した。蒸留水で３回洗
い、最後に0.2Mトリス／塩酸緩衝液（pH7.0）で洗っ
た。その比活性は0.38単位/g樹脂でＮ−カルバミル−Ｄ
−アラニンを基質とした場合の活性は4.2単位/gであっ
た。

実施例５実施例４に記載の方法で製造した酵素−樹脂5gを用い
て、ジチオスレイトール0.5mMを含む蒸留水40ミリリッ
トル中でＮ−カルバミル−Ｄ−アラニン2gを加水分解し
た。加水分解反応はこの混合物にN₂を吹き込んで酸素を
排除しながら45℃、pH6.7〜7.0で24時間行った。反応終
了時のＤ−アラニンの収率は96.5％であると測定され
た。

その後、５％Ｎ−カルバミル−Ｄ−アラニンを35回加
水分解して平均収率96.1％を得た。

実施例６実施例４に記載の方法で製造した酵素−樹脂1gをカラ
ムに充填し、1mMの酸化防止剤を含む２％Ｎ−カルバミ
ル−Ｄ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシン溶液を上
記のカラムに通液し連続加水分解反応を行った。酸化防
止剤としてはジチオスレイトール、Ｌ−システイン塩酸
塩、システアミン塩酸塩を使用し、通液速度1ml/分、40
℃、N2シール下で４日間連続反応を行った。

これらの酸化防止剤を使用すると４日間の酵素失活が
30〜35％に抑えられたが、酸化防止剤を使用しない場合
は80％以上の酵素失活が認められた。

以上記載したごとく、本発明によれば抗生物質の中間
原料等として重要なＤ−α−アミノ酸類を製造する脱カ
ルバミル酵素の固定化調製物が提供される。この調製物
を使用することにより、30回以上の反復使用が可能にな
り、工業生産への使用が期待できる。

フロントページの続き (72)発明者 ▲高▼橋里美兵庫県神戸市垂水区神和台１―13―13 (72)発明者大窪一真兵庫県加古川市別府町新野辺795―１ (72)発明者山田和彦兵庫県明石市大久保町江井島248―３ (72)発明者平石芳朗兵庫県姫路市船津町5306―19 (56)参考文献特公昭63−20520（ＪＰ，Ｂ１) 特公平１−48758（ＪＰ，Ｂ２) ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，1979 年，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３，ｐｐ．201 −204 ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，1979年，Ｖｏｌ．12，ｐｐ．57−68 ＴｈｅＷｏｒｌｄＢｉｏｔｅｃｈＲｅｐｏｒｔ 1984，1948年，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．379−390 Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ，1975年８月18 日，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．33，ｐｐ．33− 34 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 11/00 - 11/18 C12P 13/04 - 13/24 C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）アグロバクテリウム・スピーシーズKN
K712（FERM BP−1900）、シュードモナス・スピーシー
ズKNK003A（FERM BP−3181）およびエシェリヒア・コ
リJM109 pAD108（FERM BP−3184）からなる群より選
択される少なくとも１種の微生物に由来する、Ｎ−カル
バミル−Ｄ−α−アミノ酸を加水分解してＤ−α−アミ
ノ酸を生成させる酵素、ｂ）陰イオン交換樹脂、および
ｃ）酸化防止剤からなる、30回以上反復使用できること
を特徴とする固定化酵素調製物。
【請求項２】陰イオン交換樹脂が、アミンを交換基とす
るフェノール型イオン交換樹脂である請求項１記載の固
定化酵素調製物。
【請求項３】酸化防止剤が、ジチオスレイトール、２−
メルカプトエタノール、Ｌ−システイン塩酸塩、システ
アミン塩酸塩、ジチオエリスリトール、ジチオスレイト
ールとジチオエリスリトールの混合物、または還元型グ
ルタチオンである請求項１記載の固定化酵素調製物。
【請求項４】アグロバクテリウム・スピーシーズKNK712
（FERM BP−1900）、シュードモナス・スピーシーズKN
K003A（FERM BP−3181）およびエシェリヒア・コリJM1
09 pAD108（FERM BP−3184）からなる群より選択され
る少なくとも１種の微生物に由来する、Ｎ−カルバミル
−Ｄ−α−アミノ酸を加水分解してＤ−α−アミノ酸を
生成させる酵素と、陰イオン交換樹脂を酸化防止剤の存
在下で接触させることを特徴とする固定化酵素調製物の
製造法。
【請求項５】陰イオン交換樹脂を、酸化防止剤を含む緩
衝溶液中で平衡化せしめた後、酵素と接触させる請求項
４記載の製造法。
【請求項６】請求項１〜３のいずれか１項記載の固定化
酵素調製物を、酸化防止剤の存在下にＮ−カルバミル−
Ｄ−α−アミノ酸と接触させることを特徴とするＤ−α
−アミノ酸の製造法。
【請求項７】固定化酵素調製物を30回以上反復使用する
ことを特徴とする請求項６記載の製造法。