JP3218318B2 - Ｄｎａ領域における長さ多型を分析する方法 - Google Patents
Ｄｎａ領域における長さ多型を分析する方法Info
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Description
【０００１】 本発明は単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の領域
の長さ多型に基づいて生物体の同一性および血族関係を
決定するための方法に関する。
の長さ多型に基づいて生物体の同一性および血族関係を
決定するための方法に関する。
【０００２】 DNAの長さ多型に基づいて同一性および血族関係を決
定する通常の方法はすべて、制限エンドヌクレアーゼの
使用に基づいている。したがって、以後にハイブリダイ
ゼーション法によって検出される特定のDNA断片を調製
する。これらの方法によれば、制限エンドヌクレアーゼ
に対する相当する認識部位間で形成されるいずれかの長
さの変種を検出するか、または特定の制限開裂部位の欠
如に基づいて形成される長さの変種を検出する。最初の
方法では、いわゆるミニサテライト領域における長さ変
種（３、４、4a、4b）、および／または特定の単純なDN
A配列を有する領域の長さ変種（５）を利用する。制限
断片長多型（RFLP）を検出する第２の方法は、経験に基
づいて見いだされる特定の場合にしか適用できず、また
本発明に遺伝子疾患の分析においてのみ適切に使用する
ことができる。
定する通常の方法はすべて、制限エンドヌクレアーゼの
使用に基づいている。したがって、以後にハイブリダイ
ゼーション法によって検出される特定のDNA断片を調製
する。これらの方法によれば、制限エンドヌクレアーゼ
に対する相当する認識部位間で形成されるいずれかの長
さの変種を検出するか、または特定の制限開裂部位の欠
如に基づいて形成される長さの変種を検出する。最初の
方法では、いわゆるミニサテライト領域における長さ変
種（３、４、4a、4b）、および／または特定の単純なDN
A配列を有する領域の長さ変種（５）を利用する。制限
断片長多型（RFLP）を検出する第２の方法は、経験に基
づいて見いだされる特定の場合にしか適用できず、また
本発明に遺伝子疾患の分析においてのみ適切に使用する
ことができる。
【０００３】 これらの既知の方法は、ハイブリダイゼーション反応
を行って長さ多型領域を視覚化しなければならないとい
う欠点がある。これは、操作に時間を要し、高価にす
る。さらに、従来の方法を利用する単一の分析では通
常、十分に確証ある結果を得ることができないので、さ
らに別の独立した分析が必要となる。したがって、これ
らの反応は連続した実験およびルーチン試験にとっては
非常に適切な試験とはいえない。さらに、上記の方法は
自動化には不適切である。
を行って長さ多型領域を視覚化しなければならないとい
う欠点がある。これは、操作に時間を要し、高価にす
る。さらに、従来の方法を利用する単一の分析では通
常、十分に確証ある結果を得ることができないので、さ
らに別の独立した分析が必要となる。したがって、これ
らの反応は連続した実験およびルーチン試験にとっては
非常に適切な試験とはいえない。さらに、上記の方法は
自動化には不適切である。
【０００４】 ヒグチら（5a）は、ある種のミトコンドリアDNA配列
を、プライマー制御の重合反応に付すことからなる、長
さ多型部位を分析する更なる方法について記載してい
る。この方法はそこで使用するミトコンドリアのマーカ
ーの為に父系を決定するのに用いことはできない。 したがって、本発明の目的は、高い感受性のあるDNA
領域の長さ多型を分析するための方法を提供し、時間を
浪費することなく、信頼できる結果が得られ、さらに連
続実験とルーチン試験とに適切であり、要すれば自動化
も行うことのできる方法を可能にしようとするものであ
る。
を、プライマー制御の重合反応に付すことからなる、長
さ多型部位を分析する更なる方法について記載してい
る。この方法はそこで使用するミトコンドリアのマーカ
ーの為に父系を決定するのに用いことはできない。 したがって、本発明の目的は、高い感受性のあるDNA
領域の長さ多型を分析するための方法を提供し、時間を
浪費することなく、信頼できる結果が得られ、さらに連
続実験とルーチン試験とに適切であり、要すれば自動化
も行うことのできる方法を可能にしようとするものであ
る。
【０００５】 本発明によれば、以下の工程： （ａ）分析しようとするDNAと少なくとも１つのプライ
マー対とのアニーリング［ここに、プライマー対の分子
の一方は単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列における
５′または３′のフランキングの相補鎖の１つの実質的
に相補的であり、またアニーリングは、該プライマーの
一方によるプライマー−制御重合反応によって得られる
合成産物が、変性後に、他方のプライマーとアニーリン
グする鋳型となり得るような方法で起こるものであ
る］、 （ｂ）プライマー制御した複製連鎖反応（PCR）、およ
び （ｃ）複製連鎖反応の反応産物の分離および分析 からなることを特徴とする、DNA領域の長さ多型に基づ
いて、生物体の同一性および血族関係を決定するための
方法が提供されることにより、上記の問題が解決され
る。 この方法では、プライマー対の個々のプライマー分子
は、それらが分析しようとするDNA領域を一定の距離で
包む様に、50〜500ヌクレオチド離れたところでそのDNA
とアニーリングする。
マー対とのアニーリング［ここに、プライマー対の分子
の一方は単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列における
５′または３′のフランキングの相補鎖の１つの実質的
に相補的であり、またアニーリングは、該プライマーの
一方によるプライマー−制御重合反応によって得られる
合成産物が、変性後に、他方のプライマーとアニーリン
グする鋳型となり得るような方法で起こるものであ
る］、 （ｂ）プライマー制御した複製連鎖反応（PCR）、およ
び （ｃ）複製連鎖反応の反応産物の分離および分析 からなることを特徴とする、DNA領域の長さ多型に基づ
いて、生物体の同一性および血族関係を決定するための
方法が提供されることにより、上記の問題が解決され
る。 この方法では、プライマー対の個々のプライマー分子
は、それらが分析しようとするDNA領域を一定の距離で
包む様に、50〜500ヌクレオチド離れたところでそのDNA
とアニーリングする。
【０００６】 プライマー制御した連鎖反応は、EP−A2 0 200 362
（１）、EP−A1 0 237 362（1a）および（２）などから
知られている。これは、PCR（複製連鎖反応）を行うこ
とを特徴とする、特定のDNA断片の増幅方法を説明する
ものである。この方法では、逆平行の態様で標的分子を
フランキング（flanking）するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用することによって特定の増幅を行う。した
がって、ポリメラーゼによるプライマーの鋳型−依存性
伸長反応においては、それ自身が新たなサイクルにおけ
る鋳型として再度利用され得るDNA断片を合成させる。
このDNA合成は、出発分子の熱変性から始まり、対応す
るプライマーのハイブリダイズ、およびポリメラーゼに
よる鎖伸長に至る。さらなる熱変性によって、以後のサ
イクルを開始させる。これによれば、特異的に増幅され
る領域が指数関数的に増加し、最終的に通常のゲル電気
泳動によって検出され得る断片が生成される。この断片
の長さは、プライマーの５′末端および中間領域によっ
て決められる。熱に安定な合成成分を使用することによ
り、単純かつ容易に加熱および冷却サイクルを自動的に
行う反応がなされ得る。 オリゴヌクレオチドプライマーに基づく標的分子の
「逆平行のフランキング（antiparallel flanking）」
によって、プライマー対それぞれの両プライマーの一方
が標的分子の一方の相補的鎖とハイブリダイズされるの
で、そのプライマー対の３′末端が相互に向き合うこと
は理解されよう。
（１）、EP−A1 0 237 362（1a）および（２）などから
知られている。これは、PCR（複製連鎖反応）を行うこ
とを特徴とする、特定のDNA断片の増幅方法を説明する
ものである。この方法では、逆平行の態様で標的分子を
フランキング（flanking）するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用することによって特定の増幅を行う。した
がって、ポリメラーゼによるプライマーの鋳型−依存性
伸長反応においては、それ自身が新たなサイクルにおけ
る鋳型として再度利用され得るDNA断片を合成させる。
このDNA合成は、出発分子の熱変性から始まり、対応す
るプライマーのハイブリダイズ、およびポリメラーゼに
よる鎖伸長に至る。さらなる熱変性によって、以後のサ
イクルを開始させる。これによれば、特異的に増幅され
る領域が指数関数的に増加し、最終的に通常のゲル電気
泳動によって検出され得る断片が生成される。この断片
の長さは、プライマーの５′末端および中間領域によっ
て決められる。熱に安定な合成成分を使用することによ
り、単純かつ容易に加熱および冷却サイクルを自動的に
行う反応がなされ得る。 オリゴヌクレオチドプライマーに基づく標的分子の
「逆平行のフランキング（antiparallel flanking）」
によって、プライマー対それぞれの両プライマーの一方
が標的分子の一方の相補的鎖とハイブリダイズされるの
で、そのプライマー対の３′末端が相互に向き合うこと
は理解されよう。
【０００７】 文献（15）において、MarxはPCR法の異なった応用に
ついて記載している。 Rolloらは文献（16）において、植物病原性真菌Phoma
の種々の種を区別するためのPCR法の使用について記載
している。 生物体の同一性や血族関係を決定するための、PCR法
のわく組みの中での単純なまたは潜伏的に単純なDNA配
列の使用については、これらの文献は何ら開示していな
い。
ついて記載している。 Rolloらは文献（16）において、植物病原性真菌Phoma
の種々の種を区別するためのPCR法の使用について記載
している。 生物体の同一性や血族関係を決定するための、PCR法
のわく組みの中での単純なまたは潜伏的に単純なDNA配
列の使用については、これらの文献は何ら開示していな
い。
【０００８】 単純および潜伏的に単純なDNA配列とは、ある程度は
原核生物ゲノムにも見いだすことのできるすべての真核
生物ゲノムの反復成分である。したがって、単純なDNA
配列（simple DNA sequence）は、少なくとも１つのヌ
クレオチドおよび、多くとも約６−10のヌクレオチドを
含有する短いDNAモチーフを12から約100のタンデム反復
（tandem repeat）でもって含有している。これらの単
純なDNA配列は合成DNA配列とのハイブリダイゼーショ
ン、およびこれまでに分析されたすべての真核生物ゲノ
ム、さらにヒトゲノムにおける直接配列決定によって見
いだされる（８、10）。短いモチーフの可能なすべての
置換は異なる頻度で見いだすことができると推定される
（９）。潜伏的に単純なDNA配列（cryptically simple
DNA sequence）の特徴は、偶発的な頻度よりも高いが、
不規則である短いDNAモチーフのダイレクト反復（direc
t repeat）である（９）。潜伏的に単純なDNA配列と
は、必ずしも隣接するものでないが相互に近接して反復
する短い配列群（17）を意味し、即ち短いDNAモチーフ
間に介在配列が不規則に存在し得る配列である。潜伏的
に単純なDNA配列は通常、相当するコンピュータープロ
グラムによって、すでに直列決定されているDNA領域中
に間接的にしか見いだされない。しかし、それは単純な
DNA配列の頻度と少なくとも同じか、またはそれ以上の
頻度である。単純なおよび潜伏的に単純なDNA配列は、
既に存在するあらゆるDNA配列のモチーフの短い複製物
をもう一度複製するか、またはDNA配列モチーフにおけ
る既に存在する単純なもしくは潜伏的に単純なDNA配列
のより長い領域を部分的に欠失させるという傾向を有す
る、ゲノムの機構によって形成されるようである（８−
10）。したがって、これらの領域は通常、長さ多型であ
るという仮定から研究を開始することができる。本発明
の方法では、この長さ多型を基礎としている。
原核生物ゲノムにも見いだすことのできるすべての真核
生物ゲノムの反復成分である。したがって、単純なDNA
配列（simple DNA sequence）は、少なくとも１つのヌ
クレオチドおよび、多くとも約６−10のヌクレオチドを
含有する短いDNAモチーフを12から約100のタンデム反復
（tandem repeat）でもって含有している。これらの単
純なDNA配列は合成DNA配列とのハイブリダイゼーショ
ン、およびこれまでに分析されたすべての真核生物ゲノ
ム、さらにヒトゲノムにおける直接配列決定によって見
いだされる（８、10）。短いモチーフの可能なすべての
置換は異なる頻度で見いだすことができると推定される
（９）。潜伏的に単純なDNA配列（cryptically simple
DNA sequence）の特徴は、偶発的な頻度よりも高いが、
不規則である短いDNAモチーフのダイレクト反復（direc
t repeat）である（９）。潜伏的に単純なDNA配列と
は、必ずしも隣接するものでないが相互に近接して反復
する短い配列群（17）を意味し、即ち短いDNAモチーフ
間に介在配列が不規則に存在し得る配列である。潜伏的
に単純なDNA配列は通常、相当するコンピュータープロ
グラムによって、すでに直列決定されているDNA領域中
に間接的にしか見いだされない。しかし、それは単純な
DNA配列の頻度と少なくとも同じか、またはそれ以上の
頻度である。単純なおよび潜伏的に単純なDNA配列は、
既に存在するあらゆるDNA配列のモチーフの短い複製物
をもう一度複製するか、またはDNA配列モチーフにおけ
る既に存在する単純なもしくは潜伏的に単純なDNA配列
のより長い領域を部分的に欠失させるという傾向を有す
る、ゲノムの機構によって形成されるようである（８−
10）。したがって、これらの領域は通常、長さ多型であ
るという仮定から研究を開始することができる。本発明
の方法では、この長さ多型を基礎としている。
【０００９】 本発明の方法に適切である単純な、または潜伏的に単
純なDNA配列はコンピュータープログラムを用いても、
用いなくても既知のDNA配列内に見いだすことができる
（９）。単純な、または潜伏的に単純なDNA配列は約20
から300ヌクレオチドの長さの場合、およびランダムな
配列、すなわち内部反復を有さないDNA配列にフランキ
ングされている場合には、適当である。次いで、内部配
列反復を幽さないこのフランキングDNA配列の領域から
断片を選択し、それと適切に相補する合成オリゴヌクレ
オチドを調製する。オリゴヌクレオチドにおけるヌクレ
オチド組成およびそのヌクレオチド配列は最も高い可能
性でも、調査するゲノム内に１回しか見いだすことがで
きず、したがって個々に分析するDNA領域に対して特異
的である場合に、そのオリゴヌクレオチドは本発明の目
的に適している。
純なDNA配列はコンピュータープログラムを用いても、
用いなくても既知のDNA配列内に見いだすことができる
（９）。単純な、または潜伏的に単純なDNA配列は約20
から300ヌクレオチドの長さの場合、およびランダムな
配列、すなわち内部反復を有さないDNA配列にフランキ
ングされている場合には、適当である。次いで、内部配
列反復を幽さないこのフランキングDNA配列の領域から
断片を選択し、それと適切に相補する合成オリゴヌクレ
オチドを調製する。オリゴヌクレオチドにおけるヌクレ
オチド組成およびそのヌクレオチド配列は最も高い可能
性でも、調査するゲノム内に１回しか見いだすことがで
きず、したがって個々に分析するDNA領域に対して特異
的である場合に、そのオリゴヌクレオチドは本発明の目
的に適している。
【００１０】 本発明の方法は、実質的にトリヌクレオチドのモチー
フから構成される、単純なまたは潜伏的に単純なDNA配
列の長さ多型を調査するのが好ましい。 このような単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の長
さ多型を調査する場合には、いわゆる「ずれた」人為産
物（slippage−artifacts）は排除する。このような産
物は例えば、ジヌクレオチドのモチーフから構成される
単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の場合に認めるこ
とができる。したがって、所望の主産物よりも短い反応
産物が形成される（実施例４を参照のこと）。これらの
人工のバンドはおそらく、「実際の」バンドと区別する
ことが困難であり、それは結果の解釈を複雑にする。単
純なまたは潜伏的に単純なトリヌクレオチド配列を使用
する場合には、これら人為産物は存在しないか、または
存在してもごく僅かである（実施例３を参照のこと）。
フから構成される、単純なまたは潜伏的に単純なDNA配
列の長さ多型を調査するのが好ましい。 このような単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の長
さ多型を調査する場合には、いわゆる「ずれた」人為産
物（slippage−artifacts）は排除する。このような産
物は例えば、ジヌクレオチドのモチーフから構成される
単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の場合に認めるこ
とができる。したがって、所望の主産物よりも短い反応
産物が形成される（実施例４を参照のこと）。これらの
人工のバンドはおそらく、「実際の」バンドと区別する
ことが困難であり、それは結果の解釈を複雑にする。単
純なまたは潜伏的に単純なトリヌクレオチド配列を使用
する場合には、これら人為産物は存在しないか、または
存在してもごく僅かである（実施例３を参照のこと）。
【００１１】 本発明の方法において特に好ましい態様では、単純な
または潜伏的に単純なDNA配列がトリヌクレオチドのモ
チーフ５′CAG3′/5′CTG3′から実質的に構成されるも
のである。 本発明の方法では、プライマー対であって、その個々
の分子が50から500ヌクレオチドの距離だけ離れて、分
析しようとするDNA領域とアニーリングし、すなわちそ
れら分子が特定の距離だけ離れてその領域を取り囲むプ
ライマー対を使用するのが好ましい。 本発明の方法では、２つのプライマー対を使用するの
が好ましい。特に好ましい態様では、２から50個のプラ
イマー対を使用する。 本発明の方法で使用するプライマーは15から25ヌクレ
オチドの長さを有するのが好ましい。
または潜伏的に単純なDNA配列がトリヌクレオチドのモ
チーフ５′CAG3′/5′CTG3′から実質的に構成されるも
のである。 本発明の方法では、プライマー対であって、その個々
の分子が50から500ヌクレオチドの距離だけ離れて、分
析しようとするDNA領域とアニーリングし、すなわちそ
れら分子が特定の距離だけ離れてその領域を取り囲むプ
ライマー対を使用するのが好ましい。 本発明の方法では、２つのプライマー対を使用するの
が好ましい。特に好ましい態様では、２から50個のプラ
イマー対を使用する。 本発明の方法で使用するプライマーは15から25ヌクレ
オチドの長さを有するのが好ましい。
【００１２】 幾つかのプライマー対を使用する場合における本発明
の方法の好ましい態様では、個々のプライマー対は、そ
の個々のプライマー対に相当する特定の複製連鎖反応
（PCR）産物が適当なゲル上で個々のバンドに分離でき
るように選択する。 本発明方法のさらに好ましい態様では、放射活性標識
化または非−放射活性標識化、例えば蛍光性色素剤を使
用して特定の複製連鎖反応産物の検出を行う。 このオリゴヌクレオチド対の標識化は、（12）に記載
されているようにして放射活性または蛍光性色素剤を使
用して行うことができる。 さらに、本発明の方法を実施することのできるキット
も本発明の目的である。それに含まれるプライマーは所
望により放射活性的に、例えば35Sまたは14Cによって、
または蛍光的に標識する。
の方法の好ましい態様では、個々のプライマー対は、そ
の個々のプライマー対に相当する特定の複製連鎖反応
（PCR）産物が適当なゲル上で個々のバンドに分離でき
るように選択する。 本発明方法のさらに好ましい態様では、放射活性標識
化または非−放射活性標識化、例えば蛍光性色素剤を使
用して特定の複製連鎖反応産物の検出を行う。 このオリゴヌクレオチド対の標識化は、（12）に記載
されているようにして放射活性または蛍光性色素剤を使
用して行うことができる。 さらに、本発明の方法を実施することのできるキット
も本発明の目的である。それに含まれるプライマーは所
望により放射活性的に、例えば35Sまたは14Cによって、
または蛍光的に標識する。
【００１３】 本発明の方法によって得られる合成産物は、通常の配
列決定用のゲルなどの高融解性ゲルシステムを使用して
分離することができる。同時に、合成産物の長さも決め
ることができる。単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列
の個々のまたは幾つかのモチーフを挿入し、または欠失
させることにより形成される多型は、ゲル上におけるそ
の合成産物の変更した位置によって認知することができ
る。適当なプライマー対を選択し、適当なゲルシステム
の融解能を使用すれば、約20から50個の独立した多型領
域を同時に調査することができる。したがって、得られ
た合成産物の長さ分布の個々の組合わせに応じて個体が
何であるかを信頼性をもって確認することができる。
列決定用のゲルなどの高融解性ゲルシステムを使用して
分離することができる。同時に、合成産物の長さも決め
ることができる。単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列
の個々のまたは幾つかのモチーフを挿入し、または欠失
させることにより形成される多型は、ゲル上におけるそ
の合成産物の変更した位置によって認知することができ
る。適当なプライマー対を選択し、適当なゲルシステム
の融解能を使用すれば、約20から50個の独立した多型領
域を同時に調査することができる。したがって、得られ
た合成産物の長さ分布の個々の組合わせに応じて個体が
何であるかを信頼性をもって確認することができる。
【００１４】 適当である単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列が調
査するDNA領域中に認められない場合は、それらは以下
のようにすれば同定することができる： 調査するゲノムDNAを部分的制限酵素分析にかける。
単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列中では普通は開裂
を起こさない制限酵素を使用する。得られたDNA断片を
適当なベクター、例えばλファージ誘導体またはM13フ
ァージにクローンし、次いで常法によって単純なまたは
潜伏的に単純なDNA配列の配列決定を行う（（11）を参
照のこと）。使用するプローブ分子は、単純なまたは潜
伏的に単純なDNA配列の種々の置換物（permutations）
を含有する合成DNA分子である。したがって、プラーク
をハイブリダイズすれば同定することができる。次い
で、プラークに含有されている組換えDNAを単離し、配
列決定によって特性化すればよい。このようにして得ら
れたDNA配列を、本発明に従った試験操作に適切であるD
NA配列に関してスクリーニングすればよい。
査するDNA領域中に認められない場合は、それらは以下
のようにすれば同定することができる： 調査するゲノムDNAを部分的制限酵素分析にかける。
単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列中では普通は開裂
を起こさない制限酵素を使用する。得られたDNA断片を
適当なベクター、例えばλファージ誘導体またはM13フ
ァージにクローンし、次いで常法によって単純なまたは
潜伏的に単純なDNA配列の配列決定を行う（（11）を参
照のこと）。使用するプローブ分子は、単純なまたは潜
伏的に単純なDNA配列の種々の置換物（permutations）
を含有する合成DNA分子である。したがって、プラーク
をハイブリダイズすれば同定することができる。次い
で、プラークに含有されている組換えDNAを単離し、配
列決定によって特性化すればよい。このようにして得ら
れたDNA配列を、本発明に従った試験操作に適切であるD
NA配列に関してスクリーニングすればよい。
【００１５】 モデル系としてショウジョウバエ（Drosophila）−DN
Aを使用し、本発明の方法を実施した。単純なおよび潜
伏的に単純なDNA配列はすべての真核生物ゲノムに存在
し、さらに原核生物ゲノムにもある程度存在しているの
で、ショウジョウバエモデル系を使用して得られる結果
は、他のゲノムの分析、特にヒトゲノムの調査でも得ら
れる結果であると推定することができる。 したがって、本発明の方法は生物、例えばヒトの同一
性と血縁関係の決定に適している。
Aを使用し、本発明の方法を実施した。単純なおよび潜
伏的に単純なDNA配列はすべての真核生物ゲノムに存在
し、さらに原核生物ゲノムにもある程度存在しているの
で、ショウジョウバエモデル系を使用して得られる結果
は、他のゲノムの分析、特にヒトゲノムの調査でも得ら
れる結果であると推定することができる。 したがって、本発明の方法は生物、例えばヒトの同一
性と血縁関係の決定に適している。
【００１６】 ヒトの場合は、本発明の方法によって犯罪者の同一性
を確かめるための父子試験および法廷試験を実施するこ
とができる（実施例４も参照のこと）。 個体の同一性の決定に加えて、本発明の方法は、遺伝
子座が知られており、配列決定されている遺伝子疾患の
遺伝的伝播の経緯を決定するにも適している。この目的
のためには、分析する遺伝子座内の、またはその隣に位
置する１つまたは幾つかの単純なまたは潜伏的に単純な
配列を選択する。これらの領域の特定の長さパターン
を、既知のRFLP−マーカーを使用して通常行うようにし
て、突然変異された遺伝子座と相関させる［（14）を参
照］。この情報に基づいて家系を考察すれば、遺伝学的
な忠告を与えることができ、またはRFLP−マーカーにつ
いて知られている同様の手法によって胎児期診断を行う
ことができる。この目的に本発明方法を適用すれば、予
知できる多型の可能性あるすべてのDNA領域が基礎とな
る一方で、RFLP分析では遺伝子座自身から遠く離れてい
ることの多い偶発的に見いだされる変動部に依存してい
るために診断の確実性が減少しており、したがってこの
場合は特に、本発明方法が意義深いものとなる。
を確かめるための父子試験および法廷試験を実施するこ
とができる（実施例４も参照のこと）。 個体の同一性の決定に加えて、本発明の方法は、遺伝
子座が知られており、配列決定されている遺伝子疾患の
遺伝的伝播の経緯を決定するにも適している。この目的
のためには、分析する遺伝子座内の、またはその隣に位
置する１つまたは幾つかの単純なまたは潜伏的に単純な
配列を選択する。これらの領域の特定の長さパターン
を、既知のRFLP−マーカーを使用して通常行うようにし
て、突然変異された遺伝子座と相関させる［（14）を参
照］。この情報に基づいて家系を考察すれば、遺伝学的
な忠告を与えることができ、またはRFLP−マーカーにつ
いて知られている同様の手法によって胎児期診断を行う
ことができる。この目的に本発明方法を適用すれば、予
知できる多型の可能性あるすべてのDNA領域が基礎とな
る一方で、RFLP分析では遺伝子座自身から遠く離れてい
ることの多い偶発的に見いだされる変動部に依存してい
るために診断の確実性が減少しており、したがってこの
場合は特に、本発明方法が意義深いものとなる。
【００１７】 本発明の方法はさらに、動物および植物の単純なまた
は潜伏的に単純なDNA配列における多型を決定するにも
適している。したがって、例えばウマ、イヌまたはウシ
などの動物の血統の調査において、等級の高い血統の個
体までの血縁関係を信頼性高く証明することができる。 総合すれば、本発明方法の利点は、従来知られている
方法と比較して、その広範な適応性、迅速な実施可能
性、およびその高い感受性にあると言うことができる。
長さ多型である単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の
ために採用する本発明方法における増幅工程により、個
別に確かめる工程、例えば以後のハイブリダイゼーショ
ン反応が不要になる。したがって、本発明の方法は、自
動化、およびルーチン試験と連続実験とに特に適してい
る。
は潜伏的に単純なDNA配列における多型を決定するにも
適している。したがって、例えばウマ、イヌまたはウシ
などの動物の血統の調査において、等級の高い血統の個
体までの血縁関係を信頼性高く証明することができる。 総合すれば、本発明方法の利点は、従来知られている
方法と比較して、その広範な適応性、迅速な実施可能
性、およびその高い感受性にあると言うことができる。
長さ多型である単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列の
ために採用する本発明方法における増幅工程により、個
別に確かめる工程、例えば以後のハイブリダイゼーショ
ン反応が不要になる。したがって、本発明の方法は、自
動化、およびルーチン試験と連続実験とに特に適してい
る。
【００１８】 以下に実施例を挙げて本発明を例示する。 実施例１ 単純なDNA配列を含有するクローンの単離 ショウジョウバエ−DNAを制限エンドヌクレアーゼEco
R Iによって完全に開裂させ、得られた断片をλベクタ
ー641にクローンする。ここに使用した方法についての
詳細は（11）に見いだすことができる。この方法によっ
て、約20,000個のファージがプレートされている遺伝子
ライブラリーを得る。対応する独立したプラークをニト
ロセルロース膜に移し、単純なDNA配列モチーフCAG/CTG
を含有するプローブ分子とハイブリダイズする。 この膜をハイブリダイズし、65℃で洗浄する。このハ
イブリダイズ溶液は、５×SSPE、５×Denhardt′ｓ溶
液、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、およびプロ
ーブ分子としての約１×106cpm/mlの放射活性標識化（
32P）DNAを含有している。洗浄溶液は、２×SSPE、およ
び0.1％SDSを含有している（Denhardt′ｓ溶液およびSS
PEの組成は（11）に記載されている）。 形成された約300から400個のプラークは陽性シグナル
を示す（第１図参照）。これらのプラークの幾つかを精
製し、DNAの単離して配列決定する。得られたDNA配列領
域において単純なDNA配列CAG/CTGが含有されていること
を同定すればよい［（７）を参照のこと］。
R Iによって完全に開裂させ、得られた断片をλベクタ
ー641にクローンする。ここに使用した方法についての
詳細は（11）に見いだすことができる。この方法によっ
て、約20,000個のファージがプレートされている遺伝子
ライブラリーを得る。対応する独立したプラークをニト
ロセルロース膜に移し、単純なDNA配列モチーフCAG/CTG
を含有するプローブ分子とハイブリダイズする。 この膜をハイブリダイズし、65℃で洗浄する。このハ
イブリダイズ溶液は、５×SSPE、５×Denhardt′ｓ溶
液、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、およびプロ
ーブ分子としての約１×106cpm/mlの放射活性標識化（
32P）DNAを含有している。洗浄溶液は、２×SSPE、およ
び0.1％SDSを含有している（Denhardt′ｓ溶液およびSS
PEの組成は（11）に記載されている）。 形成された約300から400個のプラークは陽性シグナル
を示す（第１図参照）。これらのプラークの幾つかを精
製し、DNAの単離して配列決定する。得られたDNA配列領
域において単純なDNA配列CAG/CTGが含有されていること
を同定すればよい［（７）を参照のこと］。
【００１９】 実施例２ 長さ多型の検出 この実験のため、第２図に示した、（13）に記載され
ているDNA配列を選択した。以下の配列を有する２つの
オリゴヌクレオチドを合成した： これらDNA配列を第２図に示す配列の始点または終点
に素早く配置する。プライマーとして使用するため、合
成した上記のオリゴヌクレオチドの５′末端を32Pで標
識する。次いで、この標識したプライマーを用いてPCR
法を行う。95℃における90秒間の変性、45℃における90
秒間のハイブリダイズ、次いで72℃における120秒間の
合成というサイクルをだいたい20サイクル行う。調査す
るDNAとして、全世界にわたる種々の地域から得た11種
のキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaste
r）野生型種のゲノムDNAを使用する。これらショウジョ
ウバエ野生型種は始めは個々の受精雌の子孫であり、こ
こ10年来採取されている。PCR反応を行った後、増幅し
た断片を制限エンドヌクレアーゼHae IIIで開裂する。
これにより、通常、それぞれ長さが202および177ヌクレ
オチドの２つの断片が得られる。通常、この工程はルー
チン実験では必要ない。ここでは、分析の評価のために
のみ行う。得られた断片を５％配列決定用ゲル上で分離
し、次いでそのゲルを乾燥し、Ｘ−線フィルムを乾燥し
たゲルに当てる。期待されるこれら両DNA断片は、種々
のショウジョウバエ野生型種で顕著な多型を示す。単純
なDNA配列を含有する202ヌクレオチド断片は４つの異な
るサイズカテゴリーを示す（第３図参照）。これらのサ
イズカテゴリーはそれぞれ３つのヌクレオチドだけが変
化している。トリヌクレオチドの反復配列内ではフレー
ムシフトが始まるので、これは予期されるものである。
３つの場合に、２つの異なるバンドが同時に見いだされ
る（第３図の５、８および９列参照）。このことは、２
倍体生物では、遺伝子座がそれぞれ２回見いだされ、異
なる対立遺伝子によって表され得るという事実（いわゆ
る均衡多型現象（balanced polymorphism））から説明
できる。177ヌクレオチド断片のバンドは、５または８
ヌクレオチド離れている３つの異なるサイズカテゴリー
を示している（第３図参照）。８ヌクレオチドだけ短い
バンドは、DNA配列を標識した８ヌクレオチドの反復配
列の欠失により得られたものと推定される。長いほうの
バンドの由来は不明である。これらの欠失または挿入体
は、潜伏的に単純なDNA配列の領域内に期待され得るも
のに相当している。 この単純な実験で調査した種の大部分は、既に相互に
区別することができる。種２、および11ならびに３およ
び４のみが互いに区別することができない。したがっ
て、実際の試験では、さらにプライマー対を使用するで
あろう。例えば、同定を確実にするためには、20から50
個の個々のDNA領域を試験すればよい。個々のショウジ
ョウバエ野生型種のフラグメントのサイズカテゴリーは
それ自身で均一であり、したがって観察される多型はそ
れほど頻繁でないので、もはや血縁関係を調査すること
はできないであろう、という仮定から始まらなければな
らない。ショウジョウバエ野生型種はすべて単一の起源
の対からの子孫であり、この試験のために数百の個体の
DNAを混合した。これらの「家系」内にパターンの変化
が起こっているなら、最大２つ以上のバンドを期待する
ことができよう。しかし、ここで行った場合はそうでな
い。この場合は、観察される長さカテゴリーは少なくと
も数10世代で安定である。
ているDNA配列を選択した。以下の配列を有する２つの
オリゴヌクレオチドを合成した： これらDNA配列を第２図に示す配列の始点または終点
に素早く配置する。プライマーとして使用するため、合
成した上記のオリゴヌクレオチドの５′末端を32Pで標
識する。次いで、この標識したプライマーを用いてPCR
法を行う。95℃における90秒間の変性、45℃における90
秒間のハイブリダイズ、次いで72℃における120秒間の
合成というサイクルをだいたい20サイクル行う。調査す
るDNAとして、全世界にわたる種々の地域から得た11種
のキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaste
r）野生型種のゲノムDNAを使用する。これらショウジョ
ウバエ野生型種は始めは個々の受精雌の子孫であり、こ
こ10年来採取されている。PCR反応を行った後、増幅し
た断片を制限エンドヌクレアーゼHae IIIで開裂する。
これにより、通常、それぞれ長さが202および177ヌクレ
オチドの２つの断片が得られる。通常、この工程はルー
チン実験では必要ない。ここでは、分析の評価のために
のみ行う。得られた断片を５％配列決定用ゲル上で分離
し、次いでそのゲルを乾燥し、Ｘ−線フィルムを乾燥し
たゲルに当てる。期待されるこれら両DNA断片は、種々
のショウジョウバエ野生型種で顕著な多型を示す。単純
なDNA配列を含有する202ヌクレオチド断片は４つの異な
るサイズカテゴリーを示す（第３図参照）。これらのサ
イズカテゴリーはそれぞれ３つのヌクレオチドだけが変
化している。トリヌクレオチドの反復配列内ではフレー
ムシフトが始まるので、これは予期されるものである。
３つの場合に、２つの異なるバンドが同時に見いだされ
る（第３図の５、８および９列参照）。このことは、２
倍体生物では、遺伝子座がそれぞれ２回見いだされ、異
なる対立遺伝子によって表され得るという事実（いわゆ
る均衡多型現象（balanced polymorphism））から説明
できる。177ヌクレオチド断片のバンドは、５または８
ヌクレオチド離れている３つの異なるサイズカテゴリー
を示している（第３図参照）。８ヌクレオチドだけ短い
バンドは、DNA配列を標識した８ヌクレオチドの反復配
列の欠失により得られたものと推定される。長いほうの
バンドの由来は不明である。これらの欠失または挿入体
は、潜伏的に単純なDNA配列の領域内に期待され得るも
のに相当している。 この単純な実験で調査した種の大部分は、既に相互に
区別することができる。種２、および11ならびに３およ
び４のみが互いに区別することができない。したがっ
て、実際の試験では、さらにプライマー対を使用するで
あろう。例えば、同定を確実にするためには、20から50
個の個々のDNA領域を試験すればよい。個々のショウジ
ョウバエ野生型種のフラグメントのサイズカテゴリーは
それ自身で均一であり、したがって観察される多型はそ
れほど頻繁でないので、もはや血縁関係を調査すること
はできないであろう、という仮定から始まらなければな
らない。ショウジョウバエ野生型種はすべて単一の起源
の対からの子孫であり、この試験のために数百の個体の
DNAを混合した。これらの「家系」内にパターンの変化
が起こっているなら、最大２つ以上のバンドを期待する
ことができよう。しかし、ここで行った場合はそうでな
い。この場合は、観察される長さカテゴリーは少なくと
も数10世代で安定である。
【００２０】 実施例３ 再現性試験 観察される長さの変動は、実験中のポリメラーゼのエ
ラーによっても生じ得る。この可能性を排除し、同時に
全体の再現性を向上させるため、10個の独立した反応混
合物におけるショウジョウバエ種３番の２つの異なるDN
A調製物を用いて実施例２で実施した実験を繰り返す。
第４図から、すべての反応混合物により同じバンドが導
かれると考察することができる。同様の実験を異なる遺
伝子座についても行った。しかし、バンドの長さの変化
はいずれの場合も観察することができなかった。このこ
とは、本発明の反応が信頼できる程に再現性を有してい
ることを示している。
ラーによっても生じ得る。この可能性を排除し、同時に
全体の再現性を向上させるため、10個の独立した反応混
合物におけるショウジョウバエ種３番の２つの異なるDN
A調製物を用いて実施例２で実施した実験を繰り返す。
第４図から、すべての反応混合物により同じバンドが導
かれると考察することができる。同様の実験を異なる遺
伝子座についても行った。しかし、バンドの長さの変化
はいずれの場合も観察することができなかった。このこ
とは、本発明の反応が信頼できる程に再現性を有してい
ることを示している。
【００２１】 実施例４ ヒトの父子試験（paternity test） 常染色体のヒト心筋アクチン遺伝子由来の連続した領
域をフランキングするプライマー対を使用する。この配
列はGT/CAジヌクレオチドの反復構造を有する単純な配
列を含有している（第５図）。プライマーとして以下の
オリゴヌクレオチドを使用する： プライマー２の５′末端を32Pで標識し、次いで両オ
リゴヌクレオチドをPCR反応に使用する。94℃１分間の
変性相、45℃２分間のハイブリダイズ相、および72℃１
分間の合成相（最後の合成相は５分間）からなるサイク
ルを全体で25サイクル行う。次いで、得られた反応産物
を６％変性アクリルアミドゲル上で分離し、得られたゲ
ルを乾燥し、暴露する。 結果を第６図に示す。試験した個体はそれぞれ、２つ
の主要バンドを示しており（それ以外のバンドの説明は
以下で行う）、すなわちそれはこの遺伝子座の異なる長
さ変異種に対してヘテロ接合である。母方および父方は
普通「109nt」の長さ変異種を有しているが、しかしそ
れらは他の変異種とは、母方が「127nt」、父方が「121
nt」の変異種を有している点で異なっている。その子供
は、父方および母方由来のこれら変異種のいずれか１つ
を遺伝的に受け継ぐはずである。２人の子供について、
実際このような場合が起こったが、第３子（「？」と命
名）は新たな「113nt」変異種を示し、これは母方また
は試験した父方のいずれからも誘導することができない
ものである。したがって、この子供は別の父をもつと推
定しなければならない。 「Ｃ］列では、１つの長さ変異種しか有していない、
クローンした制御−DNAも処置している。他の試料と同
様に、これも主要なバンドの幾つかの副次的バンドを示
す。これらは、増幅期に生成されるPCRの産物に由来す
る。本明細書では、これら２つのタイプの人為産物が存
在する。第１のタイプは、Taq−ポリメラーゼがさらな
るヌクレオチドを相補的に合成したDNA鎖と結合させる
傾向にあることに由来するものである。これにより、主
要バンドの上方にヌクレオチドを移動させるバンドが形
成される。この効果は反応毎に異なっているが、バンド
のパターン分析の障害になるものではない。第２のタイ
プの産物は、増幅反応期の「ずれ」によって生成され
る。これは、主要バンドからジヌクレオチドの距離だけ
下方に認めることのできるバンドを導く。これらの産物
のバンドは実際の長さ変異種と重複する場合には、分析
を妨害しかねない。 トリヌクレオチドの反復モチーフを有する単純な配列
では、増幅期に起こる配列の「ずれ」の頻度が低いの
で、上記の人為産物バンドを示さない（実施例２参
照）。
域をフランキングするプライマー対を使用する。この配
列はGT/CAジヌクレオチドの反復構造を有する単純な配
列を含有している（第５図）。プライマーとして以下の
オリゴヌクレオチドを使用する： プライマー２の５′末端を32Pで標識し、次いで両オ
リゴヌクレオチドをPCR反応に使用する。94℃１分間の
変性相、45℃２分間のハイブリダイズ相、および72℃１
分間の合成相（最後の合成相は５分間）からなるサイク
ルを全体で25サイクル行う。次いで、得られた反応産物
を６％変性アクリルアミドゲル上で分離し、得られたゲ
ルを乾燥し、暴露する。 結果を第６図に示す。試験した個体はそれぞれ、２つ
の主要バンドを示しており（それ以外のバンドの説明は
以下で行う）、すなわちそれはこの遺伝子座の異なる長
さ変異種に対してヘテロ接合である。母方および父方は
普通「109nt」の長さ変異種を有しているが、しかしそ
れらは他の変異種とは、母方が「127nt」、父方が「121
nt」の変異種を有している点で異なっている。その子供
は、父方および母方由来のこれら変異種のいずれか１つ
を遺伝的に受け継ぐはずである。２人の子供について、
実際このような場合が起こったが、第３子（「？」と命
名）は新たな「113nt」変異種を示し、これは母方また
は試験した父方のいずれからも誘導することができない
ものである。したがって、この子供は別の父をもつと推
定しなければならない。 「Ｃ］列では、１つの長さ変異種しか有していない、
クローンした制御−DNAも処置している。他の試料と同
様に、これも主要なバンドの幾つかの副次的バンドを示
す。これらは、増幅期に生成されるPCRの産物に由来す
る。本明細書では、これら２つのタイプの人為産物が存
在する。第１のタイプは、Taq−ポリメラーゼがさらな
るヌクレオチドを相補的に合成したDNA鎖と結合させる
傾向にあることに由来するものである。これにより、主
要バンドの上方にヌクレオチドを移動させるバンドが形
成される。この効果は反応毎に異なっているが、バンド
のパターン分析の障害になるものではない。第２のタイ
プの産物は、増幅反応期の「ずれ」によって生成され
る。これは、主要バンドからジヌクレオチドの距離だけ
下方に認めることのできるバンドを導く。これらの産物
のバンドは実際の長さ変異種と重複する場合には、分析
を妨害しかねない。 トリヌクレオチドの反復モチーフを有する単純な配列
では、増幅期に起こる配列の「ずれ」の頻度が低いの
で、上記の人為産物バンドを示さない（実施例２参
照）。
【００２２】 文 献 1. EP−A2 0 200 362 1a. EP−A1 0 237 362 2. サイキ（R.K.Saiki）らのScience 239（1988）,487
−491 3. ジェフレイス（A.J.Jeffreys）らのNature 314（19
85）,67−73 4. ジェフレイス（A.J.Jeffreys）らのNature 316（19
85）,76−79 4a. Gillら、Nature 318（1985）,577−579 4b. Nakamuraら、Sience 235（1987）,1616−1622 5. EP 87 11 6408.3 5a. Higuchiら、Nature 332（1988）,543−546 6. トーツ（D.Tautz）,PhD−Thesis（学位論文）チュ
ービンゲン大学 7. トーツ（D.Tautz）およびレンツ（M.Renz）のJ.Mo
l.Biol.172（1984）,229−235 8. トーツ（D.Tautz）およびレンツ（M.Renz）のNucle
ic Acids Research 12（1984）,4127−4138 9. トーツ（D.Tautz）らのNature 322（1986）,652−6
56 10. レビンソン（G.Levinson）およびグットマン（G.
A.Gutman）のMol.Biol.and Evolution 4（1987）,203−
221 11. マニアチス（T.Maniatis）、フリッチェ（E.F.Fri
tsch）およびサンブルック（J.Sambrook）の「Molecula
r Cloning,A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbar
Laboratories,ニューヨーク,1982 12.スミス（L.M.Smith）らのNature 321（1986）,674−
679 13. ワートン（K.A.Wharton）らのCell 40（1985）,55
−62 14. カン（Y.M.Kan）およびドジー（A.M.Doxy）のPro
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75（1978）,5631−5635 15. Marx,Sience 240（1988）,1408−1410 16. Rolloら、Chem.Abstr.108（１）（1988）,154,Abs
tract No.1552s 17. Smillieら、J.theor.Biol.（1990）142,463−471 以下に図面の簡単な説明を行う。 図面の簡単な説明 第１図：プローブ分子としての単純なDNA配列と遺伝子
ライブラリーとのハイブリダイゼーション 約20,000個の独立したファージクローンを12×12cmの
平板上にプレートし、単純なトリヌクレオチド配列CAG/
CTGを含有するプローブ分子とハイブリダイズする。こ
のようにして300から400個の陽性のシグナルを得る。陽
性シグナルは黒部分として認識できる。 第２図：実施例２において多型について試験した領域の
配列 合成したオリゴヌクレオチドと相補する領域に波線で
下線を引いている。単純なDNA配列の領域には二重線で
下線を引いている。８ヌクレオチドのダイレクト反復に
２つの矢印を付している。Hae III−開裂部位はイタリ
ック文字で示している。 第３図:11種のショウジョウバエ野生型種の長さ変動の
分析 PCR法によって増幅し、Hae IIIで開裂させたDNA配列
を１列から11列までに示している。右側には、長さマー
カーとして役立つ配列決定反応物を示している。目的と
する断片の位置は左側に矢印で示している。さらに観察
されたこの断片のクラスの位置を横線で示している。 第４図：再現性についての試験 ショウジョウバエ種３番のDNA調製物「Ａ」を使用
し、10個の独立したPCR−反応混合物を左側に適用し、
またショウジョウバエ種３番のDNA調製物「Ｂ」を使用
し、10個の独立したPCR−反応混合物を右側に適用し
た。配列決定反応物から得たマーカー断片を右側に適用
する。観察された試験バンドはすべて同一である。 第５図：実施例４で使用しているDNA領域の配列 合成したオリゴヌクレオチドと相補的な領域を波線で
下線を引いている。 第６図：ヒトの父子分析 PCR法によって増幅させ、ゲル上で分離させたDNA断片
を示している。最初の列には、母親のDNA、次ぎの列に
は試験する父親のDNA、および試験した３人の子供のDNA
を適用した。６番目の列（Ｃで示される列）には、サイ
ズカテゴリーのみを表すための対照−DNAを適用してい
る。主要なバンドおよびそのサイズカテゴリーには右側
に印を付けている。
−491 3. ジェフレイス（A.J.Jeffreys）らのNature 314（19
85）,67−73 4. ジェフレイス（A.J.Jeffreys）らのNature 316（19
85）,76−79 4a. Gillら、Nature 318（1985）,577−579 4b. Nakamuraら、Sience 235（1987）,1616−1622 5. EP 87 11 6408.3 5a. Higuchiら、Nature 332（1988）,543−546 6. トーツ（D.Tautz）,PhD−Thesis（学位論文）チュ
ービンゲン大学 7. トーツ（D.Tautz）およびレンツ（M.Renz）のJ.Mo
l.Biol.172（1984）,229−235 8. トーツ（D.Tautz）およびレンツ（M.Renz）のNucle
ic Acids Research 12（1984）,4127−4138 9. トーツ（D.Tautz）らのNature 322（1986）,652−6
56 10. レビンソン（G.Levinson）およびグットマン（G.
A.Gutman）のMol.Biol.and Evolution 4（1987）,203−
221 11. マニアチス（T.Maniatis）、フリッチェ（E.F.Fri
tsch）およびサンブルック（J.Sambrook）の「Molecula
r Cloning,A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbar
Laboratories,ニューヨーク,1982 12.スミス（L.M.Smith）らのNature 321（1986）,674−
679 13. ワートン（K.A.Wharton）らのCell 40（1985）,55
−62 14. カン（Y.M.Kan）およびドジー（A.M.Doxy）のPro
c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75（1978）,5631−5635 15. Marx,Sience 240（1988）,1408−1410 16. Rolloら、Chem.Abstr.108（１）（1988）,154,Abs
tract No.1552s 17. Smillieら、J.theor.Biol.（1990）142,463−471 以下に図面の簡単な説明を行う。 図面の簡単な説明 第１図：プローブ分子としての単純なDNA配列と遺伝子
ライブラリーとのハイブリダイゼーション 約20,000個の独立したファージクローンを12×12cmの
平板上にプレートし、単純なトリヌクレオチド配列CAG/
CTGを含有するプローブ分子とハイブリダイズする。こ
のようにして300から400個の陽性のシグナルを得る。陽
性シグナルは黒部分として認識できる。 第２図：実施例２において多型について試験した領域の
配列 合成したオリゴヌクレオチドと相補する領域に波線で
下線を引いている。単純なDNA配列の領域には二重線で
下線を引いている。８ヌクレオチドのダイレクト反復に
２つの矢印を付している。Hae III−開裂部位はイタリ
ック文字で示している。 第３図:11種のショウジョウバエ野生型種の長さ変動の
分析 PCR法によって増幅し、Hae IIIで開裂させたDNA配列
を１列から11列までに示している。右側には、長さマー
カーとして役立つ配列決定反応物を示している。目的と
する断片の位置は左側に矢印で示している。さらに観察
されたこの断片のクラスの位置を横線で示している。 第４図：再現性についての試験 ショウジョウバエ種３番のDNA調製物「Ａ」を使用
し、10個の独立したPCR−反応混合物を左側に適用し、
またショウジョウバエ種３番のDNA調製物「Ｂ」を使用
し、10個の独立したPCR−反応混合物を右側に適用し
た。配列決定反応物から得たマーカー断片を右側に適用
する。観察された試験バンドはすべて同一である。 第５図：実施例４で使用しているDNA領域の配列 合成したオリゴヌクレオチドと相補的な領域を波線で
下線を引いている。 第６図：ヒトの父子分析 PCR法によって増幅させ、ゲル上で分離させたDNA断片
を示している。最初の列には、母親のDNA、次ぎの列に
は試験する父親のDNA、および試験した３人の子供のDNA
を適用した。６番目の列（Ｃで示される列）には、サイ
ズカテゴリーのみを表すための対照−DNAを適用してい
る。主要なバンドおよびそのサイズカテゴリーには右側
に印を付けている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】（ａ）分析しようとするDNAと少なくとも
１つのプライマー対とのアニーリング［ここに、プライ
マー対の分子の一方は、３から６のヌクレオチドを含有
する短いDNAモチーフを12から100のタンデム反復でもっ
て含有している単純なDNA配列、または偶発的な頻度よ
りも高いが、不規則である短いDNAモチーフのダイレク
ト反復である潜伏的に単純なDNA配列における５′また
は３′フランキング領域の相補鎖の１つと実質的に相補
的であり、一方該プライマー対分子の他方は該DNA配列
における３′または５′フランキング領域の相補鎖の他
方と実質的に相補的であり、そして 50〜500ヌクレオチド離れた距離での、分析しようとす
るDNAとプライマー対とのアニーリングは、プライマー
の１つによるプライマー−制御重合反応によって得られ
る合成産物が、変性後に、他のプライマーとアニーリン
グする鋳型となり得るような方向で起こるものであ
る］、 （ｂ）プライマー制御したPCR反応、および （ｃ）PCR反応の反応産物の分離および分析 からなることを特徴とする、DNA領域の長さ多型に基づ
いて生物体の同一性および血族関係を決定するための方
法。 - 【請求項２】単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列が実
質的にトリヌクレオチドのモチーフから構成されている
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】単純なまたは潜伏的に単純なDNA配列がCAG
/CTGの配列モチーフを含有している請求項１または２に
記載の方法。 - 【請求項４】少なくとも２つのプライマー対を使用する
請求項１から請求項３までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】２から50個のプライマー対を使用する請求
項１から請求項３までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】プライマーが15から25ヌクレオチドの長さ
を有する請求項１から請求項５までのいずれかに記載の
方法。 - 【請求項７】プライマー対の特定のPCR反応産物が適当
なゲルにおいて個々のバンドに分離することができるよ
うにプライマー対の位置を選択する請求項１また請求項
６までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】特定のPCR反応産物を放射活性標識または
蛍光性色素剤などの非−放射活性標識によって検出する
請求項１から請求項７までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】分析しようとする単純なまたは潜伏的に単
純なDNA配列を、遺伝学的に規定された遺伝子座内、ま
たはその隣に配置させて、見いだされる多型がその遺伝
子座のマーカーとして利用できるようにする請求項１か
ら請求項８までのいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】（ａ）３から６のヌクレオチドを含有す
る短いDNAモチーフを12から100のタンデム反復でもって
含有している単純なDNA配列、または偶発的な頻度より
も高いが、不規則である短いDNAモチーフのダイレクト
反復である潜伏的に単純なDNA配列を50〜500ヌクレオチ
ド離れた距離でフランキングする、放射活性または蛍光
的に標識されていてもよい１から50個のオリゴヌクレオ
チドプライマー対の等モル混合物を含有する１つまたは
幾つかの管、 （ｂ）複製のための酸素を含有する管、 （ｃ）４つのデオキシヌクレオシド３リン酸を含有する
管、 （ｄ）適当な緩衝化保存溶液を含有する管、および要す
れば （ｅ）キットの成分を試験するのに適した対照DNAを含
有する管、 からなる請求項１から請求項９までのいずれかに記載の
方法を実施するためのキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3834636A DE3834636A1 (de) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen |
| DE3834636.2 | 1988-10-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501207A JPH04501207A (ja) | 1992-03-05 |
| JP3218318B2 true JP3218318B2 (ja) | 2001-10-15 |
Family
ID=6364896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51115289A Expired - Lifetime JP3218318B2 (ja) | 1988-10-11 | 1989-10-11 | Ｄｎａ領域における長さ多型を分析する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | USRE37984E1 (ja) |
| EP (1) | EP0438512B2 (ja) |
| JP (1) | JP3218318B2 (ja) |
| AT (1) | ATE161585T1 (ja) |
| DE (2) | DE3834636A1 (ja) |
| HK (1) | HK1004341A1 (ja) |
| WO (1) | WO1990004040A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US8211476B2 (en) | 2003-03-14 | 2012-07-03 | Meiji Co., Ltd. | Compositions against rotavirus infection and processes for producing the same |
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| US20050112591A1 (en) * | 2003-11-25 | 2005-05-26 | Applera Corporation | Novel method for isolating single stranded product |
| WO2007123391A1 (en) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene. |
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