JP3114838B2 - 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼおよびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ、その製法及び該酵素を使用するクレ
アチン定量用試薬およびクレアチニン定量用試薬に関す
る。

【０００２】クレアチニンおよびクレアチンは血液また
は尿中に見いだされ、その量を迅速かつ正確に検出測定
することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎
炎、巨人症、強直性筋異栄養症等を診断するのに非常に
重要である。このような診断を行うために、血液または
尿中のクレアチニンおよびクレアチンを定量することが
一般的に行われている。

【０００３】従来のクレアチンの定量法としては、試料
中のクレアチンにクレアチンアミジノハイドロラーゼ、
ザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水
素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレ
アチンを定量する。またクレアチニンの定量法として
は、試料中のクレアチンを消去してから、試料中のクレ
アチニンに、クレアチニンアミドハイドロラーゼ、クレ
アチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手
段により測定して、試料中のクレアチニンを定量する方
法などがある。

【０００４】一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシ
ダーゼは微生物界に広く見いだされており、既に工業的
に製造され、臨床検査薬として使用されている。

【０００５】

【発明の解決しようとする課題】しかしながら公知の各
種菌体から製造されたクレアチンアミジノハイドロラー
ゼは熱安定性が低く、またクレアチンに対するＫｍ値も
大きかった。例えばバチルス属由来の酵素（特公昭61-1
7465号公報) は、熱安定性は40℃以下と低い。さらにシ
ュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチンに対す
るＫｍ値が1.33mMと低い。コリネバクテリウム属、マイ
クロコッカス属、アクチノバチルス属、アシネトバクタ
ー属、バチルス属由来の酵素（特公平 3-76915号公報)
は、熱安定性は50℃以下であり、クレアチンに対するＫ
ｍ値は20mMと比較的に小さい。しかしながら、さらに熱
安定性に優れ、かつクレアチンに対するＫｍ値が20mM以
下である新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼが求
められていた。

【０００６】

【発明を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アルカリゲネス
（Alcaligenes)属に属する細菌から熱安定性に優れ、か
つクレアチンに対するＫｍ値のより小さいクレアチンア
ミジノハイドロラーゼを見いだし、本発明を完成する至
った。

【０００７】すなわち本発明は、下記理化学的性質を有
する新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼである。
次の反応を触媒する。

【０００８】

【化２】 至適温度：約４０〜４５℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ｐＨ安定性：ｐＨ約５〜８（４０℃、１８時間） クレアチンに対するＫｍ値：約１５．２ｍＭ 分子量：約６７，０００（ゲル濾過法） 約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５

【０００９】また本発明は、アルカリゲネス属に属し、
上記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノハ
イドロラーゼ生産能を有する菌体を栄養培地にて培養
し、培養物から該クレアチンアミジノハイドロラーゼを
採取することを特徴とするクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼの製造法である。

【００１０】さらに本発明は、試料に上記理化学的性質
を有する新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼを作
用させ、生成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼ
を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴
とする試料中のクレアチンの定量法である。

【００１１】また本発明は、試料にクレアチニンアミド
ハイドロラーゼを作用させ、得られたクレアチンに上記
理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノハイド
ロラーゼを作用させ、生成するザルコシンにザルコシン
オキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定す
ることを特徴とする試料中のクレアチニンの定量法であ
る。

【００１２】本発明は、上記理化学的性質を有するクレ
アチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼおよび過酸化水素測定試薬を含有することを特徴とす
る試料中のクレアチン定量用試薬である。

【００１３】また本発明は、クレアチニンアミドハイド
ロラーゼ、上記理化学的性質を有するクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸
化水素測定試薬を含有することを特徴とする試料中のク
レアチン定量用試薬である。

【００１４】本発明のクレアチンアミジノハイドロラー
ゼの起源は、上記理化学的性質を有するクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを産生するものであれば、動物、植
物、微生物など如何なる起源のものを用いても良い。好
ましくは、上記性質を有するクレアチンアミジノハイド
ロラーゼを産生しうるアルカリゲネス(Alcaligenes)属
細菌であって、より好適な例としては、アルカリゲネス
・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１な
どが挙げられる。なお、アルカリゲネス・フェカリス
（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１は京都府北桑田
郡美山町の土壌より分離した菌株であり、その菌学的性
質は以下の通りである。

【００１５】（ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：０．５×０．８〜１．５μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：有り、周鞭毛を有する。 （５）胞子の有無：無し （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、４８時間培養で灰色
から灰黄色のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全
縁（Entire）であり、凸状（Convex）である。表面は円
滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は良くないが一様に混濁す
る。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸
状（Filiform）に生育する。ゼラチンは液化しない。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
しない。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育しな
い。 （ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性： −（陰性） （２）硝酸塩の還元： − （３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの加水分解： − （９）Ｔｗｅｅｎ８０の分解： − （１０）クエン酸の利用：Koser の培地 − Christensenの培地 ＋ （１１）無機窒素源の利用： 硝酸ナトリウム ＋ 硫酸アンモニウム ＋ グルタミン酸ナトリウム ＋ （１２）色素の生成： − （１３）ウレアーゼ： − （１４）オキシダーゼ： ＋ （１５）カタラーゼ： ＋ （１６）β−ガラクトシダーゼ： − （１７）アルギニンジヒドラーゼ： − （１８）リジンカルボキシラーゼ： − （１９）オルニチンカルボキシラーゼ： − （２０）トリプトファンデアミナーゼ： − （２１）β−グルコシダーゼ： − （２２）プロテアーゼ： − （２３）ＤＮａｓｅ： − （２３）酸素に対する態度：好気性 （２４）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：−（糖を分
解せず）

【００１６】 （２５）糖から酸およびガスの生成 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − − デンプン − − ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − − （２６）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン− マルトース − グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸塩 ＋ アジピン酸 ＋ ｄｌ−リンゴ酸 ＋ 酢酸フェニル ＋

【００１７】上記菌学的性質同定のための実験法は、主
として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」
学会出版センター（１９８５年）によって行った。また
分類同定の基準として「バージェーズ・マニュアル・オ
ブ・システマチック・バクテリオロジー」（１９８４）
を参考にした。

【００１８】以上の文献および菌学的性質を参考にする
とグルコース非発酵性グラム陰性菌で色素を生成しない
こと、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性、β−グルコシ
ダーゼ、プロテアーゼが陰性であること，更にＤ−グル
コース、Ｌ−アラビノース等の糖を利用しないことより
本菌はアルカリゲネス（Alcaligenes)属に属するとみな
される。またアルカリゲネス中では硝酸から亜硝酸を生
成しないこと、Ｄ−グルコースをＣ源として利用できな
いこと、土壌より単離されたことを考えるとアルカリゲ
ネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）に属すると
考えられアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes fa
ecalis）ＴＥ３５８１と命名した。なお本菌は受託番
号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７として寄託されている。

【００１９】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産菌を栄養培地
に培養し、該培養物からクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼを採取することにより製造できる。クレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ生産菌の培養にあたって使用する栄
養培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素
源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するもので
あれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素
源としては、例えばリンゴ酸、コハク酸等が使用され
る。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵
母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用され
る。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム等が使用される。またクレアチン
アミジノハイドロラーゼの生産誘導物質として、クレア
チンを培地に添加しておくことが望ましい。

【００２０】本発明では通常、振盪培養あるいは通気撹
拌培養を行う。培養温度は約２０〜４０℃、好ましくは
約２５〜３７℃、培養ｐＨは約５〜９の範囲で、好まし
くは約６〜８に制御するのが良い。これら以外の条件下
でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は
通常、約１〜７日で生育し、菌体内にクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼが生産蓄積される。

【００２１】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いれば良い。例えば抽出法としては超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性化剤などいずれを用いても良い。さらに抽
出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグ
ネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミ
ンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡ
Ｅ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カ
ルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロ
マト法などにより精製することができる。またこれらの
方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレ
ードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当
な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。

【００２２】本発明のクレアチンアミジノハイドロラー
ゼは、下記理化学的性質を有する。次の反応を触媒す
る。

【００２３】

【化３】

【００２４】至適温度：約４０〜４５℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ｐＨ安定性：ｐＨ約５〜８（４０℃、１８時間） クレアチンに対するＫｍ値：約１５．２ｍＭ 分子量：約６７，０００（ゲル濾過法） 約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５

【００２５】本発明のクレアチンアミジノハイドロラー
ゼは、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組
成物と組み合わせてクレアチンの測定に使用することが
できる。またクレアチニンアミドハイドロラーゼを共存
させて、クレアチニンを定量することができる。

【００２６】本発明の試料中のクレアチンの定量法は、
試料に上記新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼを
作用させ、生成するザルコシンにザルコシンオキシダー
ゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する。

【００２７】本発明の試料中のクレアチンの定量法は、
試料にクレアチニンアミドハイドロラーゼを作用させ、
得られたクレアチンに上記新規なクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを作用させ、生成するザルコシンにザルコ
シンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測
定する。試料中のクレアチンはクレアチニンアミドハイ
ドロラーゼを作用させる前に消去しておくことが好まし
い。

【００２８】本発明の試料中のクレアチン定量用試薬
は、上記新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ、ザ
ルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を
含有する。

【００２９】本発明の試料中のクレアチニン定量用試薬
は、クレアチニンアミドハイドロラーゼ、上記新規なク
レアチンアミジノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダ
ーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有する。

【００３０】本発明のクレアチンまたはクレアチニンの
定量に使用するザルコシンオキシダーゼは、アースロバ
クター属、コリネバクテリウム属、アルカリゲネス属、
シュードモナス属、マイクロコッカス属、バチルス属等
の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつか
は既に市販されている。クレアチニンアミドハイドロラ
ーゼとしては、シュードモナス属、フラボバクテリウム
属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属等の起源の微生
物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販さ
れている。

【００３１】過酸化水素検出用組成物はペルオキシダー
ゼ活性を有する酵素及び色原体よりなる。ペルオキシダ
ーゼ活性を有する酵素としては、ペルオキシダーゼ、ハ
ロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼ、ラクト
ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等が挙げら
れる。色原体は更に水素受容体およびカプラーよりな
る。水素受容体は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、カプ
ラーとの反応に際し、水素を受容する化合物であれば良
く、例えば４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリン−ヒドラジン誘導体等が挙げられる。
またカプラーとしてはアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アンシジン、
Ｎ−エチル−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチル
エチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシ
エチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２ーヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−
エチル−スルホプロピル−３，５−メトキシアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン、フェノール、ρ−クロロフェノール、２、４−ジ
クロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，
４，６−トリクロロフェノール等がある。

【００３２】本発明のクレアチン定量用試薬中、各成分
の好ましい量はクレアチンアミジノハイドロラーゼ約１
０〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ約１〜１
００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０１〜５０Ｕ／
ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カプラー約０．
１〜５０ｍＭである。本発明のクレアチニン定量用試薬
中、各成分の好ましい量はクレアチニンアドドヒドロラ
ーゼ、１０〜３００Ｕ／ｍｌ、クレアチンアミジノハイ
ドロラーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシ
ダーゼ約１〜１００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．
０１〜５０Ｕ／ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、
カプラー約０．１〜５０ｍＭである。

【００３３】本発明のクレアチン定量用試薬またはクレ
アチニン定量用試薬は、通常、ｐＨ約６〜８の緩衝液と
ともに使用する。例えばリン酸緩衝液、グッド緩衝液、
トリス緩衝液等が挙げられる。本発明の試薬には必要に
よりアスコルビン酸オキシダーゼまたはカタラーゼを添
加しても良い。更に本発明の試薬には酵素反応または呈
色反応を円滑に行わせるために他の化合物を添加しても
良い。このような化合物として例えば安定化剤、界面活
性化剤、賦形剤等が挙げられる。

【００３４】本発明は以下の測定反応を利用する。

【００３５】

【化４】

【００３６】

【化５】

【００３７】

【化６】

【００３８】生成したキノン色素は通常、５００〜６５
０ｎｍの波長で吸光度測定で行う。クレアチンを定量法
としては、エンド法およびレート法で行われるが、エン
ド法を用いるのが一般的である。

【００３９】次に本発明のクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼの活性測定法を示す。まず試験管に基質溶液（ク
レアチンを０．１Ｍとなるように５０ｍＭリン酸緩衝
液、ｐＨ７．５に溶解したもの）０．９ｍｌをとり、３
７℃で約５分予備加温する。次に酵素溶液０．１ｍｌを
加え、反応を開始し、３７℃で正確に１０分間反応させ
た後、ＤＡＢ溶液（２．０ｇのジメチルアミノベンズア
ルデヒドを１００ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解さ
せた後、濃塩酸１５ｍｌを加える。）２．０ｍｌを加え
て反応を停止させる。２５℃で２０分間放置後、生成し
た尿素がジメチルアミノベンズアルデヒドと縮合して生
成した黄色色素（Ehrich反応生成物）を４２５ｎｍにお
ける吸光度で測定する。盲検は基質溶液０．９ｍｌを３
７℃で１０分間放置後、ＤＡＢ溶液２．０ｍｌを加えて
混和し、ついで酵素溶液０．１ｍｌを加えて調製し、以
下同様に２５℃で２０分間放置後、吸光度を測定する。
上記条件下で１分間に１マイクロモルの黄色色素を生成
する酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００４０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。 実施例１ クレアチン１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５
％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００
ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１
５分間オートクレーブを行った。種菌として、アルカリ
ゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５
８１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７）を一白金耳植菌し、
３０℃で時間培養し、種培養液とした。次に同培地６リ
ットルを１０リットル容ジャーファーメンターに移し、
１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種
培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２リッ
トル／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離に
て集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
した。

【００４１】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで処理
し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液
を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィ
ー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セファ
デックスＧ−２００によるゲル濾過により比活性１９Ｕ
／ｍｇにまで精製した。得られたクレアチンアミジノハ
イドロラーゼは下記特性を有していた。 １．酵素反応：下記反応を触媒する。

【００４２】

【化７】

【００４３】２．Ｋｍ値：クレアチンに対するＫｍ値は
１５．２ｍＭであった。比較例としてアクチノバチルス
由来の酵素（東洋紡製）のクレアチンに対するＫｍ値を
測定した結果、２０．５ｍＭであった。 ３．至適ｐＨ：５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．
０〜８．０）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
〜９．０）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１
０．５）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨは約８．０〜９．０であっ
た。 ４．安定ｐＨ：グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢
酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜
８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で４０℃、約１８時間保存
してその残存活性を測定した。その結果は図２に示す通
りであって、安定ｐＨはｐＨ約５〜８であった。 ５．至適温度：各温度における酵素活性を測定した。そ
の結果は図３に示す通りであって、至適温度は約４０〜
４５℃であった。 ６．熱安定性：本発明の酵素を５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間保温した後、残存する
酵素活性を測定した。その結果は図４に示す通りであっ
て、約５０℃まで安定であった。 ７．分子量：約６７，０００（ゲル濾過法） 約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ８．等電点：約３．５（等電点電気泳動） ９．既知酵素との比較

【００４４】

【表１】

【００４５】実施例２ 下記組成を有する試液を調製した。 実施例１のクレアチンアミジノハイドロラーゼ ５０Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製） ２０Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡製） ２．９Ｕ／ｍｌ ＰＩＰＥＳバッファー ０．１Ｍ、ｐＨ７．０ ４−アミノアンチピリン ０．７４ｍＭ ＤＡＯＳ（同仁化学製） １ｍＭ クレアチン６ｍｇ／ｄｌを含有する試料１００μｌに上
記試液３ｍｌを添加し、吸光度変化を３７℃、波長６０
０ｎｍで測定した。測定結果を表２に示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】比較例２ 下記組成を有する試液を調製した。 アクチノバチラス属由来の クレアチンアミジノハイドロラーゼ（東洋紡製） ５０Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製） ２０Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡製） ２．９Ｕ／ｍｌ ＰＩＰＥＳバッファー ０．１Ｍ、ｐＨ７．０ ４−アミノアンチピリン ０．７４ｍＭ ＤＡＯＳ（同仁化学製） １ｍＭ クレアチン６ｍｇ／ｄｌを含有する試料１００μｌに上
記試液３ｍｌを添加し、吸光度変化を３７℃、波長６０
０ｎｍで測定した。測定結果を表３に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】表３から明らかなように、アクチノバチラ
ス属由来のクレアチンアミジノハイドロラーゼは、本発
明のクレアチンアミジノハイドロラーゼに比較して明ら
かに反応の速度は劣っていた。

【００５０】

【発明の効果】本発明のクレアチンアミジノハイドラー
ゼは熱安定性に優れ、かつクレアチンに対してＫｍ値が
低い。したがってクレアチンおよびクレアチニンの定量
用試薬として、従来の酵素に比べて安定であり、反応性
のよい試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を
示すグラフである。

【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフであ
る。

【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を
示すグラフである。

【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:05） (56)参考文献 特開 昭62−91182（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−280271（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−162174（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12Q 1/00 - 1/70 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
   チンアミジノハイドロラーゼ。次の反応を触媒する。 【化１】 至適温度：約４０〜４５℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ｐＨ安定性：ｐＨ約５〜８（４０℃、１８時間） クレアチンに対するＫｍ値：約１５．２ｍＭ 分子量：約６７，０００（ゲル濾過法） 約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
2. 【請求項２】 アルカリゲネス属に属し、請求項１記載
   の新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有
   する菌体を栄養培地にて培養し、培養物から該クレアチ
   ンアミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とする
   クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。
3. 【請求項３】 試料に請求項１記載の新規なクレアチン
   アミジノハイドロラーゼを作用させ、生成するザルコシ
   ンにザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸
   化水素を測定することを特徴とする試料中のクレアチン
   の定量法。
4. 【請求項４】 試料にクレアチニンアミドハイドロラー
   ゼを作用させ、得られたクレアチンに請求項１記載の新
   規なクレアチンアミジノハイドロラーゼを作用させ、生
   成するザルコシンにザルコシンオキシダーゼを作用さ
   せ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする試
   料中のクレアチンの定量法。
5. 【請求項５】 請求項１記載の新規なクレアチンアミジ
   ノハイドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸
   化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中
   のクレアチン定量用試薬。
6. 【請求項６】 クレアチニンアミドハイドロラーゼ、請
   求項１記載の新規なクレアチンアミジノハイドロラー
   ゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組
   成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチニン
   定量用試薬。