JP3169927B2 - 水素光産生収率を向上したロドバクタースフェロイデスＲＶのポリヒドロキシアルカノイン酸類（ＰＨＡｓ）欠損株の単離 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヒドロキシア
ルカン酸エステル類（ＰＨＡｓ）を蓄積できないロドバ
クター スフェロイデス ＲＶ ＣＢＳ １００４６７
(Rhodobacter sphaeroides RV CBS 100467)の変異株、
および該変異株を使用して水素を産生する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】水素は、太陽に含まれる最も豊富な元素
であり、エネルギーの発生に重要な役割を演じている。
しかしながら、地球における水素は、酸素と共に、生物
学的エネルギーサイクルの基本的な化合物である。

【０００３】大気圏の最低層に含まれる水素量は、約
２．２×１０^９トンと推定され、これは空気の体積にし
て約０．５５ｐｐｍの濃度に等しい。Ｏ_２が１．１×１
０^１５トンであるのと比較すれば、地球における水素
は、確かに希少ガスと見なし得る。しかし、水素は不活
性ガスとは異なるものであり、好気好気性および嫌気性
の何れの条件においても、光の存在下または非存在下
で、広範な微生物により絶えず産生され使用されてい
る。

【０００４】水素の発熱能力は他の何れのエネルギー源
よりも高いため、エネルギーの観点から見た場合、水素
は確かに理想的なエネルギー源である。加えて、保存が
容易で、環境汚染を伴なわず、酸化による最終産物であ
る水は、毒性がないだけでなく、地球における生命維持
に欠くことのできない化合物である。

【０００５】微生物の水素を産生する能力は、従来のエ
ネルギー資源の枯渇の進行およびこれらに関連して生じ
る深刻な環境問題と共に、長年に亘って、このエネルギ
ー源を生物学的に得るための多くの研究努力に活気を与
えてきた。

【０００６】自発的に水素を産生することができる多数
の微生物が、自然環境に存在している。

【０００７】これら生物の中で、非酸素発生型の光合成
細菌、例えば紅色非硫黄細菌［とりわけロドシュードモ
ナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobac
ter）属およびロドスピリルム（Rhodospirillum）属を
含む］は、水素を産生するのに特に適している。実際
に、これらは、コストがゼロのエネルギー源である光を
使用できるだけでなく、増殖のための基質として廃棄物
質を使用できるので、重大な環境問題である廃物処理と
エネルギーの産生とを同時に行うことができる。

【０００８】紅色非硫黄細菌 しかし、これらの細菌に
は、水素生産量が少ないことから生じる欠点がある。そ
の結果、これらの微生物を使用する限り、実用面および
経済面の両観点から見て興味深いにもかかわらず、生物
学的水素産生方法を開発することは困難である。

【０００９】実際、文献において、紅色非硫黄細菌は、
不均衡な増殖条件下において、多量の蓄積物質［ポリヒ
ドロキシアルカン酸エステル（ＰＨＡ）の用語で一般的
に示される］を合成する能力を有することでも特徴付け
られることが知られている。ＰＨＡ類は、細胞質封入体
の形態で蓄積され、細胞重量のかなりの割合（７０％ま
で）を占めている。また水素を過剰に産生する菌株Ｒ．
スフェロイデス ＲＶでは、ポリヒドロキシアルカン酸
エステル類（ＰＨＡｓ）の蓄積と水素光産生との間に、
増殖条件に依存した拮抗的関係が存在することも証明さ
れた。

【００１０】事実、ガス状水素の発生とＰＨＡｓ合成と
は、細胞の還元力を消費する２者択一的な代謝経路に相
当する。

【００１１】Ｈ_２産生の持続時間、従ってＨ_２の総産生
量の点で、Ｒ．スフェロイデス ＲＶの水素産生能を改
善するために、ポリヒドロキシアルカン酸エステル類
（ＰＨＡｓ）を蓄積する能力を持たない変異株を創製し
た。

【００１２】ＳＭＶ０７１と呼ばれるこの変異株は、特
許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペス
ト条約の規定に従って、１９９８年２月１６日に、寄託
番号ＣＢＳ１００４６７でオランダ国真菌培養中央局(C
entraal Bureau voor Schimmelcultures)に寄託され
た。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】故に、本発明の目的
は、ポリヒドロキシアルカン酸エステル類（ＰＨＡｓ）
を蓄積する能力を持たないＲ．スフェロイデス ＲＶ
ＣＢＳ １００４６７の変異体に関する。

【００１４】本発明の更なる目的は、変異株Ｒ．スフェ
ロイデス ＲＶ ＣＢＳ １００４６７を用いた水素産
生方法に関する。

【００１５】

【発明の実施の形態】ＰＨＡｓを蓄積することが可能な
大部分の細菌、特にＲ．スフェロイデス ＲＶにおい
て、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）は最
も広く産生されるポリマーに相当する。

【００１６】文献では、最も広く研究されている細菌で
あるアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）におけるＰＨＢの合成
が、異なる３つの酵素、即ちβ−ケトチオレート、アセ
トアセチル−ＣｏＡ還元酵素、およびシンターゼ（モノ
マーの重合を触媒してＰＨＢポリエステルを得る）連続
して関与する代謝経路により達成されることが知られて
いる。

【００１７】本発明は、シンターゼが該代謝経路の重要
な酵素であるという考察に基づいている。実際に、この
酵素の基質特異性は比較的低いので、２者択一的な代謝
経路から生じる種々の中間体を基質として使用できる。

【００１８】そのため、我々は、この酵素をコードする
遺伝子（ｐｈａＣ）がＲ．スフェロイデス ＲＶのゲノ
ムに存在することを確認した後、該遺伝子（ｐｈａＣ）
を不活性化することにより、ＰＨＢの生物学的合成の最
終ステップをなくすことを考えた。

【００１９】ランダム突然変異誘導（トランスポゾンの
使用を基礎とする）または特異的突然変異誘導（インタ
ーポゾンを使用する）のような従来の方法を使用するこ
とにより、該遺伝子は不活性化できる。これらの成分
は、該ゲノムに挿入され、遺伝子配列の分断が引き起こ
す（表現型突然変異の手段により明らかになる）と共
に、ホストに特定の抗生物質に対する耐性を与える。

【００２０】本発明の好ましい態様に従って、Ｒ．スフ
ェロイデス ＲＶ野生型のシンターゼ遺伝子ｐｈａＣの
不活性化は、予め単離して特徴を明らかにされているシ
ンターゼ遺伝子（配列表；配列番号１および２は、最初
の３０塩基と最後の６０塩基のないＲ．スフェロイデス
ＲＶ野生型のシンターゼ遺伝子ｐｈＣのヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列）の内部に、カナマイシン耐性
遺伝子をコードした遺伝子カセット（インターポゾン）
を挿入することにより行われ、次に該抗生物質を添加し
た培地上で突然変異株を選択した。

【００２１】実際、理論的には、該菌株のゲノムＤＮＡ
にインターポゾンの組込まれたクローンのみが、この選
択培地で増殖できる。

【００２２】該インターポゾンの構築は、第１に、大腸
菌株ＴＧ１をホストとして使用し、ｐＵＣ１８をベクタ
ーとして使用することにより実施した。

【００２３】形質転換の後に得たコロニーを制限分析し
て、単離した陽性クローンに、シンターゼ遺伝子ｐｈａ
Ｃに挿入されたカナマイシン耐性遺伝子が含まれること
を確認した。このクローンのヌクレオチド配列により、
該インターポゾンがシンターゼ遺伝子ｐｈａＣの転写方
向に対して反対の配向で挿入されていることが明らかに
なった。

【００２４】次に、分断されたシンターゼ遺伝子を、自
殺ベクター（即ち、Ｒ．スフェロイデス内で自己複製で
きないベクター）の中にクローン化し、その最終構築物
を、接合によって、抗生物質リファンピシンに対する耐
性を与えた大腸菌株Ｓ１７−１および野生型菌株Ｒ．ス
フェロイデス ＲＶに導入した。

【００２５】Ｒ．スフェロイデス ＲＶの突然変異株の
選択を２つのステップにより実施した。第１ステップ
は、カナマイシンで選択することにより、自殺ベクター
に保持された遺伝子ｐｈａＣの突然変異誘発コピーと、
ゲノムＤＮＡ上の機能的なコピーとの間で組換えが成功
したことを確認することであり、第二ステップは、ゲン
タマイシンで選択することにより、突然変異を誘発する
ために使用した自殺ベクターが喪失したことを証明する
ことである。

【００２６】サザンブロット解析によって該クローンの
特徴を明らかにし、この突然変異誘導の性質および位置
を確認した。ゲノムＤＮＡｓを抽出し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化し、遺伝子ｐｈａＣの特異的合成オリゴヌク
レオチドとハイブリダイズさせた。野生型ゲノムＤＮＡ
を同様の条件下で製造し、陰性対照として使用した。

【００２７】これらのクローンの１つは、予想された大
きさのハイブリダイズバンドを示した。このクローンは
ＳＭＶ０７１と呼ばれ、異なる培地を用いた増殖により
生理学的特徴を調べた。このクローンは野生型菌株に類
似しており、例えばａＳｙ（Ｊ．ミヤケ、Ｘ．Ｙ．マオ
およびＳ．カワムラ、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．、６２：５３１−５３５、１９８４）培地のよう
な完全な培地および自治体の固体廃棄物に由来する基質
において同様の増殖能が得られ、ＰＨＢの合成を促進す
る培地においては増殖が見られなかった。この結果によ
り、この代謝経路を活性化する能力を有していないこと
が間接的に確認された。加えて、ＰＨＢ産生量を決定す
るために実施したガスクロマトグラフィー分析は、クロ
ーンＳＭＶ０７１について、何れのピークも示していな
かったことから、該変異株はＰＨＢの蓄積能力を有して
いないことが立証された。

【００２８】その結果、本発明の該変異株Ｒ．スフェロ
イデス ＲＶは、水素を産生するための発酵方法の開発
に特に適している。

【００２９】該発酵は、同化可能な炭素源および窒素
源、並びに種々のカチオン、アニオンおよび任意の微量
ビタミンまたはアミノ酸をを含む水性培地中で実施する
ことが可能である。

【００３０】同化可能な炭素源には、ピルビン酸塩、リ
ンゴ酸塩、乳酸塩、琥珀酸塩または他の慣習的な炭素源
等が含まれる。窒素源には、例えば、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム若しくは炭酸
アンモニウム等の無機アンモニウム塩および尿素、また
はペプトン、酵母抽出物若しくは肉抽出物等の有機窒素
または無機窒素を含有する物質から選択することが可能
である。

【００３１】カチオンおよびアニオンの例は、カリウ
ム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸性
リン酸、硫酸塩、塩化物、マンガンおよび硝酸塩から選
択することが可能であるが、これらに限定されるもので
はない。

【００３２】本発明の方法の好ましい態様に従えば、自
治体の固体廃棄物の制御された酸発酵に由来する物質が
基質として用いられるが（Ｅ．Ｄ’Ａｄｄａｒｉｏら、
（１９９２）、Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２７，１８
３−１９２）、その組成は例７に示されている。

【００３３】該発酵は、アルゴンを持続的に流入させる
ことにより保証される建機的条件下で、光度が６，００
０から２０，０００ルクスの範囲の光を照射し、２５℃
から４０℃、好ましくは３０℃から３７℃の範囲の温度
が維持された環境において実施する。

【００３４】該発酵培地のｐＨは、６．５０から８．
０、好ましくは６．８から７．３までの範囲内に維持す
る。ｐＨの調節は、例えば、アンモニア、水酸化カリウ
ム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリ
ウムの水溶液等のような、塩基性水溶液の添加によって
行うことができる。１−５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液
が好ましく使用される。

【００３５】発酵が進行する間、水素は従来技術によっ
て回収される。

【００３６】この方法は、図５に図示した種類の装置に
おいて連続的に実行することができる［ここで、１＝基
質タンク；２＝アルゴンガス（流入により嫌気的条件を
維持する）；３＝蠕動ポンプ（光バイオリダクター内へ
の培地の引入れを調節する）；４＝光バイオリアクタ
ー；５＝磁気プレート（光リアクター内部の攪拌を維持
する）；６＝ハロゲンランプ（光バイオリアクター内部
に位置する）の電気接合部；７＝使用済み培地、バイオ
マスおよびバイオガスの共通流出口；８＝トラップ；９
＝放出されたバイオガスのデジタルメーター；１０＝バ
イオガス放出；１１＝蠕動ポンプ（使用済み培地および
バイオマスを排出するため）；１２＝培地およびバイオ
マスの放出および滅菌である］。

【００３７】好ましい条件下で操作した場合、菌株によ
るＨ_２の光生成は、野生型菌株では１６日間持続したの
に比較して、変異株では更に１０日間長く持続した（全
部で２６日）ので、該変異株により生成されたＨ_２の量
は、野生型菌株に対して約２６％多く得られることが観
察された。

【００３８】以下の例は、本発明を更に詳細に記述する
ことを目的とするものに過ぎず、如何なる意味でもその
範囲を制限するものとと見なされるべきものではない。

【００３９】

【実施例】例１： Ｒ．スフェロイデス ＲＶからのゲ
ノムＤＮＡの抽出 １００ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ
／ｌ 酵母抽出物、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ）を含有する
５００ｍｌのフラスコに、菌株Ｒ．スフェロイデス Ｒ
Ｖ［ナショナル・インスティテュート・オブ・バイオサ
イエンス・アンド・ヒューマンテクノロジー（ＮＩＢ
Ｈ：筑波、日本）から入手］を接種し、得られた混合物
を３０℃で４８時間、好気性／暗所の条件の下で、攪拌
（２２０ｒｐｍ）下に維持した。

【００４０】次に、培養ブイヨンをＳＳ３４ローターモ
デルＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂで遠心（４℃、５００
０ｒｐｍで１０分間）することにより該細胞を回収し、
次いでＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した（２×１２０ｍ
ｌ）。得られた懸濁液を再度上記の条件で遠心し、該細
胞を回収し、９．５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。０．
５ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）およ
びプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、
該懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。

【００４１】次に、５ＭのＮａＣｌを１．８ｍｌと、
０．７ＭのＮａＣｌ中に１０％の臭化ヘキサデシルトリ
メチルアンモニウムを含有する溶液とを添加し、得られ
た溶液を６５℃で２０分間、インキュベートした。

【００４２】続いて、該溶液を、同体積のクロロホル
ム：イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ／Ｖ）で除タ
ンパクし、イソプロパノールの０．６体積を用いてＤＮ
Ａを沈澱させた。

【００４３】該ＤＮＡを１ｍｌのエタノール（７０％）
で洗浄し、ガラス棒で回収した。最終的に回収したＤＮ
Ａを４ｍｌのＴＥに溶解し、その濃度を２６０ｎｍで分
光光度測定により決定した。

【００４４】該ゲノムＤＮＡを、０．１ｍｇ／ｍｌの臭
化エイチジウムを含有するＣｓＣｌ勾配液（１％）上で
遠心（５５，０００ｒｐｍ、１６時間、ベックマンＶ６
５Ｔｉローター）することによって再度精製した。

【００４５】ＤＮＡバンドをＵＶ光の下で可視化し、臭
化エチジウムをブタノール飽和水で抽出することにより
除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析した後、該ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、所望の体積に再懸濁した。

【００４６】例２： 遺伝子シンターゼｐｈａＣの単
離 例１に記述した通りに得たゲノムＤＮＡを、ルーングら
（Ｌｅｕｎｇ Ｄ．Ｗ．、Ｃｈｅｎ Ｅ．、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ Ｄ．Ｖ．、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ−ａ ｊｏｕｒａ
ｎａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎ
ｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、１、（１９
８９）：頁１１−１５）の指示に従ったポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）技術により、プライマーとして以下の
一組のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した： （１）５’ＣＧＴＧＡＣＧＣＴＣ ＡＧＴＴＣＧＡＧＣ
Ｇ ＴＣＴＧＡＡＣ ３’（フォワード） （２）５’ＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣ ＴＣＧＧＧＡＴＧＴ
Ｔ ＴＣＧＡＡＴＣ ３’（リヴァース） これらのオリゴヌクレオチドは、細菌シンターゼの保存
されたアミノ酸配列に基づいて、Ｒ．スフェロイデス
ＲＶにおけるコドンの選択的な使用を考慮しして合成さ
れたものである。

【００４７】該増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー４８
０装置（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）にて、
以下の成分を含有する反応混合液（１００μｌ）を使用
して実行した： − ５００ｎｇ ゲノムＤＮＡ − １０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３ − ２ｍＭ ＭｇＳＯ_４ − ２５ｍＭ ＫＣｌ − ５ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ − １００ピコモルの２プライマー − ２００μＭのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｃＴＴＰ） − ２，５ユニットのＰｗｏポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ）。

【００４８】９８℃で２分間の変性の後、以下からなる
サイクリックプログラムを開始した： １分間、９８℃（変性） １分間、６０℃（アニーリング） ２分間、７２℃（伸長） を全２５サイクル、続いて８分間、７２℃（最終伸
長）。

【００４９】こうして得られた該増幅生成物を、フェノ
ール−クロロホルム（１：１）で処理し、ＮａＣｌ（１
／１０ｖｏｌ／ｖｏｌ）とＥｔＯＨ（２ｖｏｌ）により
沈澱し、２０μｌのＨ_２Ｏに再懸濁した。次に、約１７
００ｂｐの断片を０．６％の低融点ゲル（シープラー
ク、ＦＭＣ バイオプロダクツ）上で精製し、該ゲルか
ら溶出させた後、予め制限酵素ＳｍａＩで消化したプラ
スミドｐＵＣ１８（ベーリンガー）中にクローニングし
た。

【００５０】実際には、該プラスミドｐＵＣ１８および
該断片を、３０μｌの反応混合液（ＤＮＡ ５μｌ／ｍ
ｌ）中でライゲートし、この混合液の２μlを使用し
て、エレクトロコンピテントにした大腸菌ＴＧ１細胞
（Ｄｏｗｅｒ Ｗ．Ｊ．ら、ヌクレイックアシッドリサ
ーチ、１６、６１２７−６１４５、１９８８）を形質転
換した。該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有するＬＢ寒天培地の培養皿上で選択した。

【００５１】陽性クローンから抽出したプラスミドＤＮ
Ａの分析により、予想されたサイズと一致する約１７０
０ｂｐの断片の存在が明らかとなった。該陽性クローン
に含まれるプラスミドはｐＳＭ７７４と呼ばれる（図
１）。

【００５２】次に、該プラスミドを、ＤＮＡシーケンサ
ーＡＢＩ３７３（パーキン・エルマー）を用いた配列分
析に供した。該配列は、最初の３０塩基および最後の６
０塩基が欠失したシンターゼ遺伝子ｐｈａＣに一致す
る、１７３８ｂｐの断片であることが確認された（配列
番号１）。

【００５３】例３： 遺伝子シンターゼｐｈａＣの不
活性化 カナマイシン耐性をコードする遺伝子（ｎｅｏ）を含む
プラスミドＰＳＵＰ２０２１（Ｒ．Ｓｉｍｏｎら、１９
８３、バイオ／テクノロジー、１：７８４−７９１）
（5μｇ）を、５単位の制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩ（ベーリンガー）のにより、３７℃で１時間消
化した。次に、０．５ｍＭのｄＮＴＰｓと８単位のクレ
ナウポリメラーゼ（登録商標）（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ）を該消化混合物に添加し、３０℃で１
５分間インキュベートした。

【００５４】７５℃で１０分間、該酵素反応を停止し、
該消化混合物を０．６％の低融点アガロースゲル（シー
プラーク；Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）にチャージし、７０ボ
ルトで４時間泳動させた。

【００５５】続いて、カナマイシン耐性をコードする構
造遺伝子と、この遺伝子の上流に位置するプロモーター
領域とを含む、約１５００塩基対（ｂｐ）のＳａｌＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を該ゲルから溶出した。

【００５６】上述の条件と等しい操作条件下において、
プラスミドｐＳＭ７７４（２μｇ）に、酵素ＳｔｙＩに
よる消化とクレナウポリメラーゼ（登録商標）による処
理とを並行して行った。

【００５７】続いて、消化したプラスミドｐＳＭ７７４
と断片ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩとを、プラスミド：断
片＝１：３の割合を用いて、１ユニットのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを含む２０μｌのリガーゼ緩衝液中で結合し
た。該リガーゼ反応は、２３℃で約１６時間、実施し
た。

【００５８】次に、該リガーゼ混合物を用いて、大腸菌
ＴＧ１のエレクトロコンピテント細胞を形質転換し
た。該形質転換体の選択は、２０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ寒天培地の培養皿上で行った。

【００５９】陽性クローンの分析によって、カナマイシ
ン遺伝子がシンターゼ遺伝子ｐｈａＣに予想通り挿入さ
れたクローン（番号５６）の存在が明らかになった。制
限分析および塩基配列解析によって、該遺伝子ｎｅｏが
遺伝子ｐｈａＣに関して反対の配向で挿入されたことが
示された。

【００６０】例４： クローン番号５６を、制限酵素Ａｓｐ７１８およびＸｂ
ａＩにより３７℃で消化した。自殺ベクターｐＷＫＲ１
０２Ａ（Ｃｏｌｏｎｎａ−Ｒｏｍａｎｏ，Ｓ．ら、１９
９０、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，１３８
−１４７）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次
に、該消化生成物を混合し、クレナウポリメラーゼを用
いて、ｄＮＴＰｓの存在下、２５℃で３０分間処理し、
適合性の末端を作成した。

【００６１】次に、該試料を、フェノール／クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱させた。該ペレットを、
５単位／μｇ（ＤＮＡ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有
するリガーゼ緩衝液中に再懸濁した。該反応を、２３
℃、１６時間で行った。

【００６２】該リガーゼ混合物を使用して、エレクトロ
ポレーションにより大腸菌ＴＧ１のコンピテント細胞を
形質転換した。形質転換体の選択は、２０μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールと２０μｇ／ｍｌのカナマイシン
を含有するＬＢ寒天培地上で実施した。陽性クローンの
中から、正しい挿入を有するプラスミド［ｐＳＭ５８３
と示される（図２）］を含有するクローンを単離した。

【００６３】該プラスミドｐＳＭ５８３を大腸菌株Ｓ１
７−１（接合に不可欠な遺伝子を有する）に移入し、Ｓ
ＭＣ４９０と称する菌株を得た。

【００６４】例５： 大腸菌とＲ．スフェロイデス
ＲＶの接合 大腸菌株ＳＭＣ４９０を、２０μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールと２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する
５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。

【００６５】菌株Ｒ．スフェロイデス ＲＶ野生型を、
最高１５０μｇ／ｍｌまでの抗生物質で選択圧を加える
ことにより、抗生物質リファンピシン（Ｒｉｆ）に対す
る耐性を与えた。

【００６６】該菌株Ｒ．スフェロイデス ＲＶ（Ｒｉｆ
^Ｒ）を以下の組成を有する４０ｍｌのａＳｙ培地に接種
し：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １．２５ｇ／ｌ；琥珀酸ナト
リウム ９．８ｇ／ｌ；酵母抽出物 １ｇ／ｌ；Ｋ_２Ｈ
ＰＯ_４ ０．７５ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．８５ｇ／
ｌ；ＥＤＴＡ ２ｍｇ／ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３ ２．８ｍｇ／
ｌ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；Ｚ
ｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２４ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４・
４Ｈ_２Ｏ １．６ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ
０．０４１ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．７５
ｍｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ；Ｆ
ｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．０：３０
℃で、好気性条件下の暗所において、２日間培養した。

【００６７】３ｍｌのＲ．スフェロイデス ＲＶ（Ｒｉ
ｆ^Ｒ）の培養菌を、ファルコン^Ｒチューブ内で、Ｒ．ス
フェロイデス ＲＶ培養菌の光学的密度の１／１０に相
当する容量のＳＭＣ４９０と混合した。

【００６８】該細菌を、室温において、３０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心により回収し、１００μｌのａＳｙ培
地に再懸濁し、この懸濁液のアリクオートを同様の寒天
培地の培養皿に分配した。

【００６９】その培養皿を、３５℃で６時間インキュベ
ートし、２種類の細胞間の遺伝子物質の交換を可能にし
た。その細胞を培養皿から回収し、４００μｌのａＳｙ
培地に再懸濁し、リファンピシン（１５０μｇ／ｍｌ）
およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有するａＳ
ｙ培地の培養皿に分配した。

【００７０】好気好気性条件下での暗所における６−７
日の培養の後、約４０−５０カナマイシン耐性（Ｋ
ｍ^Ｒ）コロニー、リファンピシン耐性（Ｒｉｆ^Ｒ）コロ
ニーを得た。

【００７１】これらのコロニーの約２００を採取し、カ
ナマイシン（２０μｌ）を含有する２００μｌのａＳｙ
培地中、９６穴プレート（コーニング）に接種した。こ
のプレートを、３０℃、暗所、好気性条件下でインキュ
ベーションした。

【００７２】２日後、コロニーを採取し、５μｇ／ｍｌ
のゲンタマイシンを添加したａＳｙ培地を添加して希釈
し（１０μｌの培養菌を１９０μｌの新鮮な培地に添加
した）、３枚の９６穴プレートに接種した。

【００７３】３０℃でのインキュベーションを１日行っ
た後、２００コロニーのうちの５０コロニーは増殖して
いないことが観察された。後者のコロニーのフェノタイ
プ（Ｋｍ^ＲおよびＧｍ^Ｒ）は、二重交差によるゲノムへ
のインターポゾンの挿入、およびその結果としての自殺
プラスミドの欠失と合致していた。

【００７４】突然変異誘導部位を確認するための試験
を、これらの１０のコロニーから単離したゲノムＤＮＡ
についてのサザンブロット分析により行った。

【００７５】菌株Ｒ．スフェロイデス ＲＶ野生型（Ｒ
ｉｆ^Ｒ）およびその変異株を、２０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含有する５ｍｌのＬＢに接種し、３０℃で２日
間、好気性条件下の暗所でインキュベートした。

【００７６】次に、該ゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化した。この酵素は、シンターゼ遺伝子
（ｐｈａＣ）およびカナマイシン（ｎｅｏ）を切断しな
い。

【００７７】該消化生成物を、アガロースゲル上での電
気泳動により分析した。電気泳動による分離の後、サザ
ンブロットを標準的方法により行い、ＤＮＡを固定した
膜を用いて、遺伝子ｐｈａＣの特異的プローブとハイブ
リダイズした。

【００７８】オートラジオグラフィーを現像することに
より、変異株番号１０における約１．６ｋｂ（野生型株
に見られるものよりも大きい）のシングルバンドの存在
が明らかになった（図３）。これにより、二重交差が生
じ、その結果、ゲノムＤＮＡ上に存在する遺伝子ｐｈａ
Ｃが、インターポゾン変異誘導により不活性化されたこ
とが立証された。

【００７９】他方、他の変異株は、ゲノムＤＮＡにおけ
る遺伝子の重複を生じる単回交差で理由付けされ得るプ
ロフィール（即ち、変異された遺伝子が野生型遺伝子の
隣に存在する）を示した。

【００８０】変異株番号１０を、ＳＭＶ０７１の略語を
もって表示した。

【００８１】例６： 変異菌株ＳＭＶ０７１の増殖 変異菌株ＳＭＶ０７１を、種々の培地で培養し、その増
殖を野生型菌株の増殖と比較した。

【００８２】使用した培地は、以下の組成であった： （Ａ）：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １．２５ｇ／ｌ；琥珀酸
Ｎａ ９．８ｇ／ｌ；酵母抽出物 １ｇ／ｌ；Ｋ_２ＨＰ
Ｏ_４ ０．７５ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．８５ｇ／
ｌ；ＥＤＴＡ ２ｍｇ／Ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３ ２．８ｍｇ／
ｌ；Ｎａ_２ＭｏＯ _４・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；Ｚ
ｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２４ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４・
４Ｈ_２Ｏ １．６ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ
０．０４１ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．７５
ｍｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ;Ｆ
ｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／ｌ。

【００８３】（Ｂ）：窒素源としてＮＨ_４Ｃｌ ０．２
ｇ／ｌ；炭素源として酢酸ナトリウム ５０ｍＭ；Ｋ_２
ＨＰＯ_４ ０．７５ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．８５ｇ
／ｌ；ＥＤＴＡ ２ｍｇ／ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３ ２．８ｍｇ
／ｌ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ _２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２４ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ _４
・Ｈ_２Ｏ １．６ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ
０．０４１ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．７５
ｍｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ；Ｆ
ｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／ｌ。

【００８４】（Ｃ）：Ｂと同様、ただし更に炭素源とし
て琥珀酸Ｎａ（９．８ｇ／ｌ）。

【００８５】（Ｄ）：炭素源として乳酸Ｎａ９８％
７．４ｍｌ；窒素源としてＮａ−Ｌ−グルタミン酸
１．８８ｇ／ｌ；ＨａＨＣＯ_３ １．５ｇ／ｌ；Ｋ_２Ｈ
ＰＯ_４０．７５ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．８５ｇ／
ｌ；ＥＤＴＡ ２ｍｇ／Ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３ ２．８ｍｇ／
ｌ；ＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；Ｚｎ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２４ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４・４
Ｈ_２Ｏ １．６ｍｇ／ｌ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．
０４１ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ
／ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ；ＦｅＳ
Ｏ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／ｌ。

【００８６】該培地は、０．２μナルゲンフィルターを
用いて濾過することにより滅菌し、僅少の全酸素を、３
０分間、アルゴンを曝気することにより除去した。

【００８７】該培養菌を、９，５００ルクスの強度のタ
ングステンランプを用いた光照射の下、３０℃で３日
間、２４ｍｌの培地を含有する嫌気的条件下、試験管中
でインキュベートした。その増殖の終了時、光学濃度を
６００ｎｍで測定した。その結果を表１に示した。

【００８８】

【表１】

【００８９】表１に示した値から、遺伝子ｐｈａＣにお
ける突然変異は、培地Ｂ（利用可能な炭素源は酢酸ナト
リウムのみであり、これはＰＨＡ産生を誘導する培地の
特徴である）中においてのみ、該変異菌株の増殖は否定
的な影響を受けたことが観察された。

【００９０】例７： 水素の光産生 変異菌株ＳＭＶ０７１による水素の光産生を、野生型菌
株Ｒ．スフェロイデスＲＶと並行して実施した発酵試験
により評価した。

【００９１】２つの菌株を、磁性スターラー、ｐＨを調
整するモジュール、該培養菌の照度を保証するために内
部に設置された２つの１００ワットハロゲンランプ、更
に３０℃で温度を維持するための冷却システムを具備し
た１リッターの２つのケモスタット中で培養した（図
５）。

【００９２】発酵のための前接種を以下に記述する２つ
の逐次的な方法により準備した： １．２５ｍｌのａＳｙ培地中の５０μｌのグリセリン酸
塩を、３０℃、好気性／暗所において、２日間インキュ
ベーションした； ２．先の培養菌の１：１０の希釈物を使用し、ケモスタ
ット中における増殖に使用する培地と同じ６０ｍｌの培
地を含有する試験管中、嫌気性環境で、第２の接種を行
った。該試験管を３０℃の嫌気性環境において、光存在
下（タングステンランプ、９，５００ルクス）で、２日
間、インキュベーションした。

【００９３】２つのケモスタットに、始めの光学密度は
６００ｎｍで０．２であると算出された第２の接種物
（２）の希釈物を接種した。

【００９４】該培養用培地に、自治体の固体廃棄物の調
節された酸発生発酵の由来物を使用した（Ｅ．Ｄ’Ａｄ
ｄａｒｉｏら（１９９２）、Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃ
ｈ．２７、１８３−１９２）。このタイプの培地の平均
的な構成は、以下に示す通りである： 総固体 ３．７％ 揮発性固体 ７２．０％ 乳酸 ３６ｇ／ｌ 酢酸 ２．２ｇ／ｌ 総窒素 ５９４ｍｇ／ｌ アンモニア窒素 ２６０ｍｇ／ｌ 総炭素 １５．８０ｇ／ｌ ＴＯＣ（総有機炭素） １４．９０ｇ／ｌ ＣＯＤ（化学的酸素要求量） ５．９０ｇ／ｌ カルシウム ５．９０ｇ／ｌ ナトリウム ０．２５ｇ／ｌ 硫酸塩 ０．２５ｇ／ｌ リン酸塩 ２３．００ｍｇ／ｌ ２つの菌株の発酵用のための培地を、まず蒸留水を用い
て１：１０に希釈し、３．６ｇ・ｌ^−１の乳酸濃度を得
た後に、以下の成分を添加した：ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．４
ｇ／ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３ ２．８ｍｇ／ｌ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４
・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
０．２４ｍｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ ２．１ｍ
ｇ／ｌ；Ｃｕ（ＮＯ_３）_２・３Ｈ_２Ｏ ０．０４ｍｇ／
ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．７５ｍｇ／ｌ；ＭｇＳ
Ｏ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．０。

【００９５】嫌気性環境を、継続的なアルゴンの流入に
より維持した。使用する光強度を、６，０００ルクスに
調節し、２つの発酵をバッチ内で開始した。

【００９６】約２４時間後に水素発生が開始した場合、
その発酵を続けて実施した。

【００９７】ケモスタット内の培地の流速（Ｆ）を３１
ｍｌ／時間に固定した場合、該リアクターの用量（Ｖ）
は９３０ｍｌであり、等式Ｄ＝Ｆ／Ｖに一致する［ここ
で、Ｄは希釈率に相当し、ＨＲＴ値（液圧持続時間）
（１／Ｄ）は３０に等しい。即ち、理論的に３０時間毎
に、該光生物リアクターは培地の総入替えを受けること
になる］該発酵に続き、以下の分析パラメーターを評価
する： １．光学密度を６００ｎｍで測定し、細菌の増殖を明ら
かにする； ２．ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加により７．０の値に
自動的に維持した； ３．産生された総バイオガスを、該ケモスタットの流出
口の１つに接続されたデジタルメーターの手段により測
定した； ４．バイオガスに含有される水素の割合を、カルボシー
ブ（Ｃａｒｂｏｓｉｅｖｅ）ＩＩカラム８０−１００メ
ッシュスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）２００×３ｍｍを装
備するＶＡＲＩＡＮ３４００ガスクロマトグラフィーで
決定した； ５．細胞により蓄積されたポリヒドロキシブチル酸エス
テル類の量を、ガスクロマトグラフィー分析により定量
した。

【００９８】光強度を、該リアクターの外部表面への接
種の前に、ＬＳＩルクスメーターを使用して測定した。

【００９９】放出された水素量／リアクターの容量（リ
ットル）／日数［ｍｌ Ｈ_２／ｌリアクター／ｄａｙ］
を、産生されたバイオガスの容量と水素のパーセンテー
ジを用いて算出した。

【０１００】以下の表２は、発酵中に２つの菌株によっ
て産生された総バイオガスの量を示す。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】表３は、表２の総バイオガス量とガスクロ
マトグラフィーで測定した水素のパーセンテージを基に
算出した水素産生量を示しており、その水素産生量は、
両菌株とも８０−９０％であると評価された。

【０１０３】

【表３】

【０１０４】水素の産生が有意なレベルに達していなか
った場合、菌株Ｒ．スフェロイデスＲＶ野生型の発酵は
第１７日目で停止した。変異菌株ＳＭＶ０７１の水素産
生は、第１８日目までは高い産生量を維持し、野生型菌
株に等しい最低値に至るまでに更に８日間（第２７日
目）高い産生量が継続された。産生されたバイオガス
は、約９０％の水素を含有していることから、野生型菌
株は１６日間で１６リッターの水素を産生し、それに対
して変異株ＳＭＶ０７１は２６日間で２１リッターの水
素を産生した（即ち、野生型よりも２６％多い量を産生
した）。

【０１０５】ポリヒドロキシブチル酸エステルのガスク
ロマトグラフィー分析（Ｂｒａｎｄｌら、１９８８、Ａ
ｐｐｌ．Ｅｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４、１
９７７−１９８２の方法に従う）により、変異菌株ＳＭ
Ｖ０７１ではβ−ヒドロキシブチル酸メチルエステルを
特徴付けるピークが存在しないこと、それに対して野生
型菌株では該ピークが存在することが明らかにされた
（図４）。［ここで、図４の夫々の分析チャートは以下
に示す通りである；Ａ： β−ヒドロキシブチル酸メチ
ルエステルの標準品（ＲＴ＝１０．２８でピーク）；
Ｂ： 発酵１４日後のＲ．スフェロイデス ＲＶ野生型
の細胞培養物からの抽出物（ＲＴ＝１０．９６でピー
ク）；Ｃ： 発酵１５日後の変異株ＳＭＶ０７１の細胞
培養物からの抽出物（β−ヒドロキシブチル酸を示すＲ
Ｔにピークがない）。］

【０１０６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Eni Technologie <120> Mutant of Rhodobacter Sphaeroides RV and its Use in the Production of Hydrogen <130> B0098P0669 <140> <141> <150> IT/MI98A000810 <151> 1998-04-17 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1738 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 1 ggccgtgacg ctcagttcga gcgtctgaac gcgaatctca cccgcatcga cgagctgtcg 60 aaacggctga cggccgctct cacgaagcgc aaactgtccg accccgcgtt gcacgggccc 120 tcgagcgacg tcttcctgaa ggcgatgacg gcctacatgg ccgagatgat gcagaacccg 180 gccaagatcc tcgagcatca gatcagtttc tggggcaaga gcctgaaaca ttacgttgag 240 gcgcagcatc agctggtgaa gggcgagctg aagccgccgc cggacgtgac gccgaaggac 300 cgccgcttct cgaacccgct ctggcagacg catccgttct tcaactatct caagcagcag 360 tatctgatga acgccgaggc ggttaatcag gccgtcgagg cgctggagca tatcgagcct 420 tccgacaaga agcgggtcga gtatttctcg cgccagatcg tcgatctttt ctcgcccacc 480 aacttcttcg gcaccaatcc cgacgcgctc gagcgcgcca ttgccaccga tggcgagagc 540 ctcgtgcagg ggctggagaa tctcgtgcgc gacatcgagg ccaacaaggg cgatctgctc 600 gtcacgctgg ccgatcccga ggccttccag gtgggccaga acctcgccac caccgaaggg 660 tcggtcgtct accgcaaccg catgttcgag ctgatccagt acaagcccac gaccgagacg 720 gtccacgaga cgccgctcct gatctttccg ccctggatca acaagttcta cattctcgat 780 ctcaagccgc agaactccct gctgaagtgg ctggtggatc agggcttcac ggtcttcgtc 840 gtctcctggg tgaaccccga caagagctat gccggcatcg gcatggacga ctacatccgc 900 gatggctaca tgcgcgccat ggccgaggtg cgcgcgatca cccggcagaa gcagatcaac 960 gcggtgggct actgcatcgc gggcaccacg ctgacgctga cgctggccca cctgcagaag 1020 gcgggcgatc cgtccgtccg ctcggccacc ttcttcacca cgctcaccga cttctcggat 1080 ccgggcgagg tgggggtgtt cctcaacgac gatttcgtcg acggtatcga gcggcaggtg 1140 gcggtggacg ggatcctcga caagaccttc atgtcgcgca ccttcagcta cctgcgctcg 1200 aacgacctga tctatcagcc cgccatcaag agctacatga tgggagaggc gccccccgcc 1260 ttcgatctgc tctactggaa cggagacggc accaacctgc cggcgcagat ggcggtcgaa 1320 tatctgcgcg gcctctgcca gcaggaccgg ctggcgggcg gcaccttccc ggtgctgggc 1380 tcgcccgtgg gcctgaagga tgtgacgctg ccggtctgcg ccatcgcctg cgagaccgac 1440 catatcgcgc cgtggaaaag cagcttcaac ggcttccgcc agttcggctc gaccgacaag 1500 accttcattc tttcggaatc gggccatgtg gcgggcatcg tgaacccgcc cagccgcaac 1560 aaatacggcc attacaccaa cgagggtcct ctcgacacac ccgccgcgtt ccgcgagggg 1620 gccgagttcc acgcaggctc ctggtggccg cgctggggcg cctggctggg cgagcggtcg 1680 ggcaagcagg tcccggcgcg ccagccgggc gattcgaaac atcccgaggt cgcgccgg 1738 <210> 2 <211> 579 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 2 Gly Arg Asp Ala Gln Phe Glu Arg Leu Asn Ala Asn Leu Thr Arg Ile 1 5 10 15 Asp Glu Leu Ser Lys Arg Leu Thr Ala Ala Leu Thr Lys Arg Lys Leu 20 25 30 Ser Asp Pro Ala Leu His Gly Pro Ser Ser Asp Val Phe Leu Lys Ala 35 40 45 Met Thr Ala Tyr Met Ala Glu Met Met Gln Asn Pro Ala Lys Ile Leu 50 55 60 Glu His Gln Ile Ser Phe Trp Gly Lys Ser Leu Lys His Tyr Val Glu 65 70 75 80 Ala Gln His Gln Leu Val Lys Gly Glu Leu Lys Pro Pro Pro Asp Val 85 90 95 Thr Pro Lys Asp Arg Arg Phe Ser Asn Pro Leu Trp Gln Thr His Pro 100 105 110 Phe Phe Asn Tyr Leu Lys Gln Gln Tyr Leu Met Asn Ala Glu Ala Val 115 120 125 Asn Gln Ala Val Glu Ala Leu Glu His Ile Glu Pro Ser Asp Lys Lys 130 135 140 Arg Val Glu Tyr Phe Ser Arg Gln Ile Val Asp Leu Phe Ser Pro Thr 145 150 155 160 Asn Phe Phe Gly Thr Asn Pro Asp Ala Leu Glu Arg Ala Ile Ala Thr 165 170 175 Asp Gly Glu Ser Leu Val Gln Gly Leu Glu Asn Leu Val Arg Asp Ile 180 185 190 Glu Ala Asn Lys Gly Asp Leu Leu Val Thr Leu Ala Asp Pro Glu Ala 195 200 205 Phe Gln Val Gly Gln Asn Leu Ala Thr Thr Glu Gly Ser Val Val Tyr 210 215 220 Arg Asn Arg Met Phe Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro Thr Thr Glu Thr 225 230 235 240 Val His Glu Thr Pro Leu Leu Ile Phe Pro Pro Trp Ile Asn Lys Phe 245 250 255 Tyr Ile Leu Asp Leu Lys Pro Gln Asn Ser Leu Leu Lys Trp Leu Val 260 265 270 Asp Gln Gly Phe Thr Val Phe Val Val Ser Trp Val Asn Pro Asp Lys 275 280 285 Ser Tyr Ala Gly Ile Gly Met Asp Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Tyr Met 290 295 300 Arg Ala Met Ala Glu Val Arg Ala Ile Thr Arg Gln Lys Gln Ile Asn 305 310 315 320 Ala Val Gly Tyr Cys Ile Ala Gly Thr Thr Leu Thr Leu Thr Leu Ala 325 330 335 His Leu Gln Lys Ala Gly Asp Pro Ser Val Arg Ser Ala Thr Phe Phe 340 345 350 Thr Thr Leu Thr Asp Phe Ser Asp Pro Gly Glu Val Gly Val Phe Leu 355 360 365 Asn Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Arg Gln Val Ala Val Asp Gly 370 375 380 Ile Leu Asp Lys Thr Phe Met Ser Arg Thr Phe Ser Tyr Leu Arg Ser 385 390 395 400 Asn Asp Leu Ile Tyr Gln Pro Ala Ile Lys Ser Tyr Met Met Gly Glu 405 410 415 Ala Pro Pro Ala Phe Asp Leu Leu Tyr Trp Asn Gly Asp Gly Thr Asn 420 425 430 Leu Pro Ala Gln Met Ala Val Glu Tyr Leu Arg Gly Leu Cys Gln Gln 435 440 445 Asp Arg Leu Ala Gly Gly Thr Phe Pro Val Leu Gly Ser Pro Val Gly 450 455 460 Leu Lys Asp Val Thr Leu Pro Val Cys Ala Ile Ala Cys Glu Thr Asp 465 470 475 480 His Ile Ala Pro Trp Lys Ser Ser Phe Asn Gly Phe Arg Gln Phe Gly 485 490 495 Ser Thr Asp Lys Thr Phe Ile Leu Ser Glu Ser Gly His Val Ala Gly 500 505 510 Ile Val Asn Pro Pro Ser Arg Asn Lys Tyr Gly His Tyr Thr Asn Glu 515 520 525 Gly Pro Leu Asp Thr Pro Ala Ala Phe Arg Glu Gly Ala Glu Phe His 530 535 540 Ala Gly Ser Trp Trp Pro Arg Trp Gly Ala Trp Leu Ala Glu Arg Ser 545 550 555 560 Gly Lys Gln Val Pro Ala Arg Gln Pro Gly Asp Ser Lys His Pro Glu 565 570 575 Leu Ala Pro <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 3 cgtgacgctc agttcgagcg tctgaac 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 4 cggcgcgagc tcgggatgtt tcgaatc 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＳＭ７７４の制限地図。

【図２】 プラスミドｐＳＭ５８３の制限地図。

【図３】 制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、遺伝子ｐｈａ
Ｃの特異的プローブでハイブリダイズした変異株クロー
ン番号１−１０（ライン１−１０）および野生型株Ｒ．
スフェロイデス ＲＶのゲノムＤＮＡのサザンブロット
分析。

【図４】 菌株Ｒ．スフェロイデス ＲＶ野生型および
変異株ＳＭＶ０７１のガスクロマトグラフィ（夫々、Ｐ
ＨＢを示すピークの有無を示す）。

【図５】 バイオリアクターのスキーム図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 3/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 エリサベッタ・フランキ 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 財団法人 地球環境 産業技術研究機構 ＣＯ２ 固定化等プ ロジェクト室内 (72)発明者 クラウディオ・トージ 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 財団法人 地球環境 産業技術研究機構 ＣＯ２ 固定化等プ ロジェクト室内 (72)発明者 ジュゼッペ・スコッラ 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 財団法人 地球環境 産業技術研究機構 ＣＯ２ 固定化等プ ロジェクト室内 (72)発明者 フランチェスコ・ロドリゲツ 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 財団法人 地球環境 産業技術研究機構 ＣＯ２ 固定化等プ ロジェクト室内 (72)発明者 パオラ・ペドローニ 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 財団法人 地球環境 産業技術研究機構 ＣＯ２ 固定化等プ ロジェクト室内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/20 - 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 番号ＣＢＳ１００４６７で寄託された、
   ポリヒドロキシアルカン酸エステル類を蓄積できないロ
   ドバクター スフェロイデス ＲＶの変異株。
2. 【請求項２】 水素光産生の連続的な方法であって： ａ）炭素および窒素、並びに種々のカチオン、アニオン
   の同化可能な栄養源を含有する水性培地中で、嫌気性条
   件下、２５℃から４０℃の範囲の温度で、ｐＨ６．５か
   ら８．０の範囲で、および６，０００ｌｕｘから２０，
   ０００ｌｕｘの範囲の光度の存在下において、変異株ロ
   ドバクター スフェロイデス ＲＶ ＣＢＳ １００４
   ６７を培養することと、 ｂ）生産された水素を単離して回収することとを具備す
   る方法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、前記同
   化可能な炭素源が、ピルビン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸
   塩、琥珀酸塩からなる群より選択される方法。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の方法であって、前記窒
   素源が、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
   ンモニウムおよび炭酸アンモニウム、尿素、ペプトン、
   酵母抽出物および肉抽出物から選択される方法。
5. 【請求項５】 請求項２に記載の方法であって、前記カ
   チオンおよびアニオンが、カリウム、ナトリウム、マグ
   ネシウム、鉄、カルシウム、酸性リン酸塩類、硫酸塩
   類、塩化物類、マンガンおよび硝酸塩類から選択される
   方法。
6. 【請求項６】 請求項２に記載の方法であって、前記発
   酵培地が、自治体の固形廃棄物の制御された酸産生発酵
   に由来する物質である方法。
7. 【請求項７】 請求項２に記載の方法であって、前記水
   性培地がビタミンまたはアミノ酸を含有する方法。
8. 【請求項８】 請求項２に記載の方法であって、前記ｐ
   Ｈを６．８から７．３までの間で選択する方法。
9. 【請求項９】 請求項２に記載の方法であって、前記温
   度を３０℃から３７℃までの間で選択する方法。