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JP3013902B2 - ヘモグロビンおよびその類似体の細菌および酵母での生成 - Google Patents

ヘモグロビンおよびその類似体の細菌および酵母での生成

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JP3013902B2
JP3013902B2 JP2508220A JP50822090A JP3013902B2 JP 3013902 B2 JP3013902 B2 JP 3013902B2 JP 2508220 A JP2508220 A JP 2508220A JP 50822090 A JP50822090 A JP 50822090A JP 3013902 B2 JP3013902 B2 JP 3013902B2
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human
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エル． ステットラー、ゲイリー
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ソマトジェン、インコーポレーテッド
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Description

【発明の詳細な説明】 本願は、LookerとHoffmanの米国特許願第07/374161号
と２αと２βのグロビン様ポリペプチドおよびその用
途、1989年７月13日出願のStetlerとWagenbachの米国特
許願第07/379116号形質転換酵母細胞によるヒトヘモグ
ロビンの生成、1989年５月10日出願のHoffman,Looker,R
osendahlおよびStetlerの米国特許願第07/349623号α−
β−グロビンのポリシストロニック同時発現と生物学的
に活性な４量体ヘモグロビンのインビボアッセンブリー
（全部ソフトジェネッティックス インターナショナ
ル、インコーポレーテッド所有）の一部継続出願であ
る。
関連出願情報 現在ソフトジェネッティックス インターナショナ
ル、インコーポレーテッドが所有する1988年５月10日出
願のHoffmanとNagaiの米国特許願第07/194338号は、代
用血液として低い酸素親和性の突然変異ヘモグロビンを
使用すること、および非血球細胞中のαとβのグロビン
発現に関する。
発明の分野 本発明は、生物学的に官能性の実質的に溶解性形式の
ヘモグロビン様タンパク質の、細菌細胞または酵母細胞
中のα−とβ−グロビン様ポリペプチドの同時発現によ
る細胞内アッセンブリーに関する。
また、ヘモグロビン様タンパク質へと導く部分的にア
ッセンブリーされた中間体と考えられる新規なポリペプ
チド、２αグロビンを形成するヘモグロビンの２個のα
サブユニットの遺伝架橋、ならびに無ストローマのヘモ
グロビンに比較し増加した血管内半減期を有する合成ヘ
モグロビンの生成にこの化合物を使用することに関す
る。
情報開示 患者に献血血液を輸血することは必ずしも実際的でな
い場合がある。そのような場合には、赤血球代替物の使
用が好ましい。しかるに代替物は、赤血球がするのと同
様に効果的に酸素を運搬するものでなければならない。
（デキストランやアルブミンのような「血漿拡張剤」は
酸素を運搬しない）これまでよく研究されてきた代替物
の２タイプはヘモグロビン溶液とフッ化炭素乳濁液であ
る。
A.ヘモグロビンの構造と機能 ヘモグロビン（Hgb）は血液の酸素運搬体である。ヘ
モグロビンは赤血球と呼ばれる小さな脱核細胞内で血流
循環する。ヘモグロビンは４個の関連するポリペプチド
鎖から構成されるタンパク質で、ヘムと呼ばれる補欠分
子族を有する。赤血球はヘモグロビンを還元された機能
的な形に維持することを補助するが、赤血球内の２つの
酵素系、即ちシトクロムb5系とグルタチオン還元系、の
１つによって再び還元される。
平均的成人のヘモリセートの約92％がヘモグロビンＡ
である（２つのα鎖と２つのβ鎖を有するのでα２β２
と呼ばれる）。α鎖は141のアミノ酸で構成される。ヘ
ムの鉄原子（フェロプロトポルフィリン IX）基は、Hi
s 87（「近位ヒスチジン」）のイミダゾールに共有結合
する。β鎖は146残基長でヘムはHis92でそれに結合して
いる。アポヘモグロビンはヘモグロビンのヘムがない相
似体で、主にαβ−グロビン２量体として存在する。
分離されたヘムのないα−とβ−のグロビンがヘムを
有するヘモグロビンのαとβのサブユニットを有するヘ
ムから分離されている。その分離されたヘムのないグロ
ビン鎖は、ヘムを有するサブユニットが２次構造と塩基
の折り畳み特性の点で極めて類似しているにも拘わらず
全然違って折り畳まれている。このことはヘムの補欠分
子族のグロブリンサブユニットへの結合がαグロブリン
やβグロブリンに与える影響が全然別のものであること
を示している。Yip等,J.Biol Chem.,247:7237−44（197
2） 天然ヒトヘモグロビンは分離されたヘムのないαグロ
ブリンおよびβグロブリンと、ヘミンとから完全に再構
築されている。好ましくはヘムが最初にαグロブリンの
サブユニットに付加されるのがよい。ヘムの付いたαグ
ロブリンは次にヘムのないβサブユニットに複合する。
そして最後にヘムが半分充填されたグロブリン２量体に
付加され、４量体ヘモグロビンが得られる。Yip等 PNA
S（USA）,74:64−68（1977） 壊されていないラビット網状赤血球ヘモリセートから
分離された無細胞系では、グロビンは約５分間で活性に
合成され、その後はタンパク質合成は突然止まる。ヘミ
ンを前以て付加しておくと、「ヘミン制御のインヒビタ
ー（HRI）」として知られる抑制性タンパク質へのヘミ
ン効果の結果、合成活動の中止を妨げたり遅らせたりす
る。ヘミンの欠失は、ポリペプチド鎖合成を開始するの
にαグロビンmRNAはβグロビンmRNAより有効ではないの
で、β鎖合成への効果よりα鎖合成への効果により厳し
いものをもっている。α鎖は、自由β鎖が存在する場合
だけ、α鎖の合成部位から放出され、自由β鎖は放出さ
れたα鎖と即座に複合してαβ−グロビン２量体を形成
すると考えられている。これらは次にヘムと結合し、４
量体ヘモグロビンを形成する。Wintrehalter、Huehns,
J.Biol.Chem.,239:3699（1964）。
αβ−グロビン２量体（アポヘモグロビン）ヘヘムを
付加すればヘモグロビンを急速に形成することが確実に
知られている。
ヒトαβグロビン遺伝子は染色体16と11とに各々存在
している。Bunn、Forget、supra at 172。両遺伝子とも
クローニングされ、配列された。Liebhaber等,PNAS 77:
7054−58（1980）（α−グロビン ゲノムDNA）;Marott
a等、J.Biol.Chem.,252:5040−53（1977）（βグロビン
cDNA）;Lawn等、Cell,21:647（1980）（βグロビン
ゲノムDNA） ヘモグロビンは、ヘモグロビン分子の４つのサブユニ
ット（Hgb Aの場合、２つのα−グロビングロビンと２
つのβ−グロビン）によって酸素の協同的結合を示すの
であって、この協同的結合性は酸素の効果的な運搬をお
おいに促進する。いわゆるヘムとヘムとの相互作用によ
ってもたらされる協同的結合性は、ヘモグロビンの酸素
への親和性を変化させる。ヘモグロビンはHgb1モル当た
り酸素４モルまで可逆的に結合する。
酸素を運搬する成分は酸素解離曲線として知られる方
法でしばしば比較対照されている。この曲線は所与の酸
素運搬体についての酸素飽和率つまり酸素含量の酸素の
分圧に対してのグラフによって得られる。Hgbにとって
飽和の程度はＳ字形相関による分圧とともに増加する。
P50とは、酸素を運搬する溶液が酸素で半分飽和してい
る分圧である。このようにそれは酸素結合の親和性を測
定する方法であって、P50が高ければ高い程、酸素が緩
やかに保持されていることを示す。
酸素運搬溶液の酸素解離曲線は、P50が全血液のそれ
より小さいときには、「左寄り」と呼ばれる。
ヘモグロビンの酸素親和性は2,3−ジホスホグリセレ
ート（2,3−DPG）とか、塩化物イオンとか水素イオンの
存在によって低められる。呼吸組織は二酸化炭素を血液
中に出してそのpHを低め（即ち水素イオン濃度を高
め）、こうして酸素をヘモグロビンから分離させ、酸素
を個々の細胞中に分散させる。
生体中の酸素運搬効率を高めるヘモグロビンの酸素親
和性変更能力は、代謝物2,3−DPGの存在に左右される。
赤血球中には2,3−DPGがヘモグロビンと殆ど同じぐらい
の濃度で存在する。2,3−DPGが存在しないときには、
「通常の」ヘモグロビンは酸素と極めて緊密に結合し、
呼吸組織に酸素を殆ど放出しない。
古くなった赤血球は血漿中に自由なヘモグロビンを少
ししか放出せず、純化するタンパク質のハプトグロビン
によって急速に結合される。ヘモグロビンとハプトグロ
ビンとの複合体は血液から除去され、脾臓と肝臓によっ
て分解される。
B.代用血液について−−一般論 上述したことからフリー天然ヘモグロビンＡは、血流
中に直接注射されたとき、体内に循環する十分な酸素運
搬体を支持していないことが明らかである。必須のアロ
ステリックレギュレータ2,3−DPGは、ヘモグロビンが静
脈酸素力で大量の酸素を放出するのに十分な濃度でプラ
ズマ血漿中に存在しない。
それにも拘わらず通常のヘモグロビン溶液が赤血球の
代用物として使用されてきた。ヘモグロビン溶液調整の
古典的方法は、古い血液を用いるものである。赤血球が
溶解され細胞の破片が除去され、こうして「ストローマ
のないヘモグロビン」（SFH）が好条件の場合には得ら
れる。
しかしこの方法にはいくつか基本的に問題あることが
認められている。即ちヘモグロビン溶液は、大規模生産
に不都合な面倒で冗長な工程を経由せずに赤血球毒物を
除去されなければならない。DeVenuto,“Appraisal of
Hemoglobin Solution as a Blood Substitute",Surger
y,Gynecology and Obstetrics,149:417−436（1979） 第二に、予想された通りこのような溶液は血液自体と
比較し「左寄り」（低P50）である。Gould,et al.,“Th
e Development of Polymerized PyridoxylatedHemoglob
in Solution as a RedCell Substiture",Ann.Emerg.Me
d.15:1416−1419（Dec.3,1986）． 第三に、ストローマのないヘモグロビン（SFH）は循
環系中ではたった２〜４時間という半減期しか持たな
い。これはオキシヘモグロビンが一部、腎臓で濾過され
るのに十分に小さい２量体（αβ）へと解離するからで
ある。
最後に、ストローマのないヘモグロビン（SFH）は高
いコロイド浸透圧（COD）がある。したがってパックさ
れた赤血球ユニットと同一の酸素運搬能を有する１服用
量でSFHを投与することは、高い浸透圧（60mm Hg）が血
流中へ大量の細胞からの水を流入させることになり好ま
しくなく、患者の組織を脱水してしまう。この点への配
慮があるため1dl当たり約６〜8gm Hgbの最終濃度を実現
するそれへのSFHの服用を困難なものにしている。
所望のP50を確保しようとして、研究者たちはヘモグ
ロビン溶液へ2,3−DPGを添加してみた。しかし残念なが
ら2,3−DPGは循環系から急速に消散してしまった。次に
研究者等は別の有機ホスファート、特にピリドキサール
リン酸を試みてみた。しかし2,3−DPGと同様、これらの
合成物も２個のβ鎖のＮ末端間に塩橋を形成してヘモグ
ロビンの「Ｔ状態」を安定させてしまった。ピリドキサ
ール化されたヘモグロビンは、SFHの10トル、血液自体
の28トルに比較し、20〜22トルのP50を有していた。こ
れはSFHより優れているが、ピリドキサール化されたヘ
モグロビンは血液自体に比し「高い親和性」を依然有し
ている。
C.ヘモグロビンサブユニットの化学的クロスリンク ヘモグロビンの諸特性はα１のLys99とα２のLys99間
のα鎖を特異化学的にクロスリンクすることにより変更
されている。Walder,U.S.4,600,531 and 4,598,064;Sny
der,et al.,PNAS（USA）84:7280−84（1987）;Chaterje
e,et al.,J.Biol.Chem.,261:9927−37（1986）P50は29m
m Hgで、腎排出はクロスリンクにより行われなくなった
が、血漿の半減期はちょうど２〜３倍増加した。
この化学的クロスリンクはビス（3,5−ジブロモサリ
チル）フマラートをイノシトールヘクサホスファートの
存在下にデオキシヘモグロビンと反応させることによっ
て達成された。この反応は、しかし低い収率（10〜20
％）しかない。さらに、他の部位で修飾された誘導体を
除去するため精製が要求される（競争反応が生ずる42個
のその他のリシン残基と４鎖のアミノ末端アミノ基があ
る）。
「ジアスピリン」クロスリンク剤を使用することによ
る別の問題は、発癌物質のハロフェノールを産生する副
作用に寄与するおそれがあるという点である。
本発明のヘモグロビン類似体では、αグロビンのＮ末
端バリンとＣ末端アルギニンとが特別なカップリング剤
を用いずにアミノ酸またはペプチドリンカーによって結
合される。
β鎖もまた化学的にクロスリンクされてきた。Kavana
ugh,et al.,Biochemistry,27:1804−８（1988） Kavan
aughはβのＮ末端がＴ状で16Å離れ、Ｒ状で20Å離れて
いることを発見している。驚くべきことではないが、Ｔ
状ヘモグロビンのＮ末端のDIDS架橋の導入はＲ状への移
行を阻害し、したがって分子のO2親和性を減少させる。
Kavanaughと類似体が好ましい酸素結合能および腎臓に
負担をかけない特性を持っているが、これもまた低い生
産性しかない。
D.遺伝子発現についての一般論 遺伝子発現はDNAのメッセンジャRNAへの転写、ならび
にメッセンジャRNAのタンパク質への転写を包含する。
転写過程は、DNA指向のRNAポリメラーゼの酵素がDNAに
結合するときから始まる。この酵素の結合部位は「プロ
モーター」と呼ばれ、酵素のプロモーターへの結合は種
々のリプレッサーや転写誘導物質によって制御されてい
る。RNAポリメラーゼはDNA分子に沿ってスライドし、メ
ッセンジャRNAの転写を行う。それが第二の制御要素、
即ち「ターミネーター」に遭遇したとき、酵素は落ち、
mRNA転写が形成される。
メッセンジャRNAは細胞のタンパク質工場であるリボ
ソームにより、対応タンパク質の構築の鋳型として使用
される。リボソーム結合部位はいわゆるShine Delgarno
（SD）配列ならびに正しく間隔の空けられた開始（スタ
ート）コドンでできている。開始コドンとして知られる
特定のRNAトリプレットで開始し、転移RNAがメッセンジ
ャの対応するコドンに結合する。各転移RNAは２本の腕
を持ち、それは相補的アンチコドンによってメッセンジ
ャコドンに結合し、一方、対応するアミノ酸を成長する
ポリペプチド鎖中にリンクするべく所定位置に保持す
る。この鎖はリボソームが「ストップ」コドンとして知
られる３個の特別なトリプレットの１つに遭遇したとき
落ちる。開始コドンからストップコドン前の最後のコド
ンまでのメッセンジャ配列に対応する元の遺伝子の該当
部分は、コードする配列として知られている。またそこ
にはプロモータで始まる５′−フランキング配列、およ
びターミネータで終わる３′−フランキング配列があ
る。
E.ポリシストロニック発現 単一のメッセンジャRNA転写が１つのプロモータを持
つことは可能だが、翻訳可能な配列を明確に限定するス
タートコドンおよびストップコドンの２個またはそれ以
上の対は持たない。このような各配列は「シストロン」
と呼ばれ、このシストロンに対応するポリペプチドは単
一プロモータの制御下に同時発現する。
細菌オペロンの大半はポリシストロニックであるが、
ということは、幾つかの異なる遺伝子がそのオペロンか
らの単一メッセージとして転写されるということであ
る。幾つかの実施例は、３個のリンクされた遺伝子（la
cZ,lacY,lacA）を持ったラクトースオペロンと、５個の
会合遺伝子（trpE,TrpD,TrpC,TrpB,TrpA）を持ったトリ
プトファンオペロンとを含んでいる。これらのオペロン
では、メッセンジャRNA合成はプロモータで開始され、
転写内でコードする領域が種々の長さのインターシスト
ロニック領域によって分離される。（１個のオペロンは
単一の転写遺伝子ユニットとして制御される遺伝子群で
ある）転写効率はシストロンごとに異なる。Kastelein,
et al.Gene,23:245−54（1983） インターシストロニック領域がリボソームのスパン
（約35塩基）より長いときは、ストップコドンでのシス
トロン１個の解離が次のシストロンで独立に開始され
る。比較的短いインターシストロニック領域、あるいは
重なり合うシストロンでは、最終リボソームの30Sサブ
ユニットがポリシストロニックmRNAから解離できなく
て、次の翻訳開始部位に即座に引き付けられる。Lewin,
Gene Expression,143−148 細菌性mRNAと異なり、真核mRNAは一般に本質上モノシ
ストロニックである。Lewin,Expression,157 合成ポリシストロニックオペロンは原核生物および真
核生物のいずれにも構築され発現される。
Lee,et al.,Nucletic Acids Res.,12:6797（1984）は
シストロン全部が同一のポリペプチドを発現する合成ポ
リシストロニックオペロンの珍しい例につき記述してい
る。このホモポリシストロニック構造は遺伝子量効果を
最大にするように構築されていた。
Schoner,et al.,PNAS,83:8506−10（1986）は大腸菌
中に合成の２−シストロンmRNAを翻訳した。最初のシス
トロンは短く、でたらめなAUに富む配列であったのに対
し、２番目のシストロンは哺乳類の遺伝子（dGH）であ
った。もし最初のシストロンのストップコドンが２番目
のシストロンのSDエレメントに続き、２番目シストロン
のスタートコドン近くにあるときは、翻訳「解読」が行
われることが発見された。Schonerの目的は、おそらく
はローカルな２次構造で翻訳することの抑制の結果とし
て高いレベルにある天然コドンでMet−GHを発現するこ
とに失敗したことを克服することにあった、最初のシス
トロンはリボソーム結合を有利にするように作られた
（SD配列およびローカルな２次構造のないAUに富む領域
にAUG開始コドンを置くことによって）。Schoner,et a
l.,Meth.Enzymol.,153:401−416（1987）参照。この文
献は、この技術によりbGHを過度に産生することはタン
パク質顆粒の形成に関連していることを明らかにした。
Saito,et al.J.Biochem.,101:1281−88（1987）は、
２シストロン系を使用して大腸菌中に合成ソマトメジン
Ｃ遺伝子を発現させた。そしてソマトメジンＣ、塩基性
ポリペプチドの不安定性は、それを酸性ポリペプチドと
一緒に混合することで克服できるかもしれないと理論展
開した。こうして両ポリペプチドを発現できる２シスト
ロン系を構築した。最初のシストロンの最終コドンは二
番目のシストロンの最初のコドンに重なり合った。形質
転換細胞はソマトメジンＣを高レベルで蓄積した。しか
しソマトメジンＣは不溶性のペレット状で再生された
（1282頁参照）。
哺乳類細胞のリボソームも同様に、最終コドンから開
始コドンで翻訳を再会することができる。こうしてBoel
et al.,FEBS Lett.,219:181（1987）は２シストロンの
転写ユニットを哺乳類（CHO）細胞中に発現させた。こ
のユニットはヒト膵臓ポリペプチドおよび選択性遺伝子
マーカー（マウスDHFR）の両方の前駆体を合成する。
CODON,WO88/05486は関心あるタンパク質（例えば、組
織プラスミノーゲンアクチベータ）および選択的表現型
（例えばネオマイシン抵抗）の両者をコードするジシス
トロンmRNAの生成につき記載している。共通のプロモー
ターは各実施例ともにHarveyマウス肉腫ウイルスの誘導
体で、ジシストロンmRNAは妥当な真核細胞に翻訳されて
いる。
GENENTECH,欧州特許出願第117058号は、１シストロン
が所望のタンパク質（例えばHbsAg）をコードし、２番
目のものが環境的な制御（例えばメトトレキセートで）
がなければ合成できない２番目のタンパク質（例えばDH
FR）をコードするジシストロン発現ベクターを脊椎動物
宿主細胞に発現させることにつき開示している。
F.融合遺伝子とタンパク質についての一般論 遺伝子は第１遺伝子のストップコドンを除去し、それ
を第２遺伝子に位相を合わせて結合することによって一
緒に融合することができる。遺伝子の断片も融合できる
し、位相を維持するスペーサーDNAも融合配列間に介入
させることができる。融合遺伝子生成物は単一ポリペプ
チドであって、ポリシストロニックオペロンに発現され
るような複数のポリペプチドではない。異なる遺伝子が
様々な目的で一緒に融合されている。こうしてGilbert
の米国特許第4338397号は、ラットのプレプロインシュ
リン遺伝子を大腸菌のペニシリナーゼ遺伝子のフラグメ
ント裏に挿入している。彼の目的は大腸菌の形質転換細
胞が融合遺伝子の発現生成物を分泌するよう仕向けるこ
とだった。非抗原ポリペプチドが免疫原運搬タンパク質
に既に抱合して発現されるように、融合遺伝子は調整さ
れてもいる。しかし本発明は同一遺伝子の２つのコピー
を結合することにつき考察するものである。
２つの異なるDNA配列を結合することを目的とするリ
ンカーDNA配列の使用は公知である。ここでのリンカー
はDNA分割の制御部位を提供するために使用されるか、
コードされた融合タンパク質またはそのフラグメントの
精製を行う特殊な性質を持つペプチドをコードするため
使用される。Rutter,米国特許第4769326号参照。
Pisum sativum種子のレクチンは、最初にβ鎖次にα
鎖が続くシグナル配列からなる単一275アミノ酸のプリ
プロプロテインとして合成される。このシグナル配列は
小胞体中で除去され、タンパク質体中でその得られた
「プロレクチン」が187−AAβ鎖と58−AAα鎖に分割さ
れる。（さらに工程を進めカルボキシル末端で切断す
る）豆種子単離体はヘテロ２量体であるのに対し、非分
割の生のままの「プロレクチン」も炭水化物と結合し、
この「プロレクチン」は大腸菌中に発現することがで
き、機能的形態で回収することができることが分かっ
た。Stubbs,et al.,J.Biol.Chem.,26:6141−44（1986） Tothの米国特許第4774180号は、ポリプロテインの発
現について開示する。ここにポリプロテインは、グリシ
ンのATPとの反応を触媒してグリシル／アデニル酸を形
成する第一ポリペプチドと、グリシンがチャージされた
tRNAを得るためtRNAGLYとグリシル／アデニル酸を反応
させる第二ポリペプチドの両者をコードする融合DNA配
列から作られている。これら二つのポリペプチドはα２
β24次構造を持つグリシンtRNAシンテターゼのαとβの
サブユニットである。これら２サブユニットは大腸菌ゲ
ノム中で単一のジシストロン遺伝子によりコードされ
る。Tothは６個のアミノ酸をコードするリンカーによっ
てα鎖のコード領域とβ鎖のコード領域をつないだ。To
thとSchimmel,J.Biol.Chem.,261:6643−46（1986年５
月） Ladnerの米国特許第4704692号は二つの自然に集合し
ているが化学的に分離させられたポリペプチド鎖を単一
のポリペプチド鎖に折り畳んだ後に類似のコンフォメー
ションで変換するのに使用することができるリンカーを
見付けるためのエキスパートシステムにつき記載してい
る。このシステムは３次元構造が知られているアミノ酸
配列が記録されたデータベースに依存するもので、この
データベースは架橋される鎖相互間のギャップに相当す
る間隔で候補となるアミノ酸配列につき調べるものであ
る。候補ペプチドの方向ならびに指向が次に調べられ
る。ここでのアルゴリズムは、これらのペプチドが周囲
の配列の如何に拘わらず同一長さと同一方向を維持する
ものとの仮定に立っている。
LadnerのWO99/06601は、２量体リプレッサータンパク
質の「擬２量の」類似体を調整することに関する仮定的
方法を記載している。これは要するに、アミノ酸リンカ
ーが２量体分子を単一鎖中に変換するため導入させられ
る、というものである。Ladnerによれば、このリンカー
は上記米国特許第4704692号の方法で直接設計できるも
ので、その代わりにこのリンカーをコードするDNAがラ
ンダムなオリゴヌクレオチドで、リンカーが分子の正し
い折り畳みとDNAへの配列特異性をできるようにする擬
２量体を見付けるのにin vivo選択が利用されている。
Hallewell,et al.,J.Biol.Chem.,264:5260−68（198
9）はCuZnスーパーオキシドジスムターゼの類似体を調
整している。各ジムスターゼ分子は２つの同一サブユニ
ットの２量体で、銅イオンと亜鉛イオンがそのサブユニ
ットにリガンドされている。この２量体のCuZnスーパー
オキシドジスムターゼ中の相互作用は、きわめて激しい
のでサブユニットは酵素を不活性化することなしに分離
される。この酵素は免疫グロブリンにきわめて類似する
コンフォメーションを有する。Hallewell,et al.は２個
のヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を、直接、
または19残基のヒト免疫グロブリンIgAlヒンジ部をコー
ドするDNAと共に、結合させ、形質転換した宿主中に融
合遺伝子を発現させている。直接に結合した遺伝子を発
現させる試みの中で、あるプラスミド分子中の双頭遺伝
子の一つを除去するような組換えが生じた。Hallewell
等は、やがて毒性を発揮するようになる疎水性領域を露
出させる直接の結び付けは２量体を歪めると仮定した。
これは遺伝子欠失の傾向ある選択圧力を提供した可能性
がある。組換えはどれもIgAlリンカー構造を持っていな
かったのである。
残念ながら、ペプチドリンカーを有する擬２量体の融
合タンパク質が、その親の異種２量体と機能的に等しく
なるように正しく折り畳むものと、仮定することはでき
ない。
G.溶解性タンパク質の発現 形質転換細胞中での異種起源［heterologous］タンパ
ク質を産生しょうとする努力は、リフラクティル［refr
actile］物質とも呼ばれる所の不溶解性封入体としての
タンパク質の一部または全部の沈澱という結果に終わっ
た。Paul,et al.,Eur.J.Cell Biol.,31:171−174（198
3）（ヒトプロシンシュリン／大腸菌trpE融合タンパク
質）;Denefle,et al.,Gene,56:61−70（1987）（アンゴ
ジェニン）;Langley,et al.,Eur.J.Biochem.,163:313−
321（1987）（ウシ成長ホルモン）;Petrov,et al.,Biol
ogy of the Cell,61:1−４（1987）（カルシトニン）;R
ichardson,et al.,Biochim.Biophys.Acta,950:385−94
（1988）（リシンＢ鎖）;Davis,et al.,Biochemistry,2
6:1322−26（1987）（腫瘍壊死因子）;Lee,et al.,Bioc
him.Biophys.Res.Commun.,151:598−607（1988）（λイ
ンターフェロン）;Meng,et al.,J.Chromatogr.,443:183
−92（1988）（ソマトメジンＣ）:Tsuji,et al.,Bioche
mistry,26:3129−34（1987）（インターロイキン−
２）．「リフラクティル」という用語は位相差顕微鏡で
これら物質を観察することができることを言う。しばし
ばこの不溶解性タンパク質は予想される生物学的活動の
フラクションしか保持していないが、これは誤った折り
畳みに起因している可能性がある。封入体は部分的に折
り畳まれたタンパク質分子が、自己の天然で活性あるコ
ンフォメーションに折り畳むことができるよりも早く相
互作用するとき形成されるのであろうと示唆されてい
る。Kruger,etal.,Biopharm,40（1989年３月）;Haase−
Pettingell and King,J.Biol.Chem.,263:4977−83（198
8）「組換え体細胞中における封入体形成の貢献要素は
未だ不明であって、大腸菌中に新たに発現される真核遺
伝子の生成過程につき説明することは容易ではない」と
上記Petrovは述べている。
これら封入体の形成は組換え体タンパク質を増やし、
したがって場合によっては好ましいのであるが、それは
また細胞塊の化溶化やタンパク質の生物学的活性の再生
化を要請するものでもある。Petrovは上記４で、「こう
した障害物は組換え体術にとって最大の問題点であるよ
うに思える」とコメントしている。
こうしたタンパク質を可溶化し再生しょうとする試み
が為された。Wetzelの米国特許第4599197号;Builderの
米国特許第46120948号、Olsonの米国特許第4511503号、
Jonesの米国特許第4512922号。しかしこうした努力は困
難で成功の見込みがつかないものである。Giantiniおよ
びShatkin,Gene,56:153−160（1987）参照。WeirとSpar
ks,Biochem.J.,245:85−91（1987）に「タンパク質は最
適条件下では再生に向けて活発に変化する。pH、塩濃度
および塩のタイプ、変性体の除去率、目標タンパク質の
濃度、あるいは汚染物質とかの様々な要素が真正なタン
パク質の回収に大いに影響する」と述べられている通り
である。こうした障害物は目標とするタンパク質が溶解
された形態で発現されていれば回避できるのである。
Gatenby,et al.は,Eur.J.Biochem.,168:227−31（198
7）で高次の植物酵素リブロースビスリン酸カルボキシ
ラーゼの調整上の困難につき述べている。この酵素はL8
S8のサブユニット構造を持つ。ここでＬは大きなサブユ
ニットでＳ小さいサブユニットとする。天然中では結合
タンパク質はＳとのアッセンブリ［assembly］に先立ち
溶解態でＬを維持することが明らかである。活性のより
高次の植物RuBPCaseを大腸菌中でアッセンブリさせよう
とする試みは不溶性の不活性なＬの細胞塊が形成された
ため困難であった。
H.ヒトα、βグロビンの細菌への発現 NagaiとThorgersonは、（Nature,309:810−812、198
4）でλc IIタンパク質、Ile−Glu−Gly−Argリンカ
ー、および完全ヒトβグロビン鎖の31のアミノ末端残基
からなるハイブリッドタンパク質を大腸菌中に発現させ
ている。このハイブリッドをリンカーのすぐ後で血液凝
析ファクターXaで分割し、こうしてβグロビン鎖を解放
している。後にNagaiらは、P.N.A.S（米国）82:7252−5
5（1985）で組換え体DNA起源のヒトβグロビン、天然起
源のヒトαグロビンおよびヘム源を採用して活性ヒトヘ
モグロビンの生成に成功している。αグロビンは赤血球
起源であるため、最終生成物は好ましくない赤血球膜成
分を含有していることが考えられる。
さらに細菌のことだが、ヒトαグロビンの効率的な細
菌性発現系について報告されている。1987年５月16日出
願の英国特許第8711614号；米国特許出願第07/194338号
およびWO88/09179参照。これは、異なる細菌細胞系にお
ける不溶性グロビンサブユニットを別々に発現すること
によって総体的に合成のヒトヘモグロビン生成、ならび
に４量体ヘモグロビンを得るため酸化ヘム共同因子の存
在下に鎖のin situ再折り畳みへと導くものである。こ
の工程もまた困難であって生産性が低い。この工程は変
性溶剤（尿素およびグアニジン）の使用および、フェリ
ック［ferric］イオンのフェロス［ferrous］態への化
学還元を必要とする（実施例参照）。本発明の１目的は
こうした欠点を解消することにある。
ヒトのα、βグロビンを大腸菌で別々に発現すること
ができるが、Walder,Proceedings,Biotech米国1988（サ
ンフランシスコ、1988年11月 14〜16）はその第360頁
で「分離したαβグロビン鎖は不安定であって沈澱し勝
ちである」と警告している。もしヒトのα、βグロビン
が溶解態で生成されないのなら、変性溶剤で可溶化され
次に活性維持のため再生されなければならない。それに
野生型αグロビン遺伝子が大腸菌に発現されるときは、
αグロビンは緩慢にしか蓄積されない。これが不十分な
翻訳に起因するものなのか宿主プロテアーゼの作用に起
因するものなのか明確でないが、WO88/09179はこの問題
がハイブリッドタンパク質が生成されるようにβグロビ
ン遺伝子の短い部分をαグロビン遺伝子に融合すること
によって克服できることを開示している。このハイブリ
ッドタンパク質は次に、グロビンを放出するために例え
ばプロテアーゼで分割されなければならない。もしプロ
テアーゼが完全に選択的でないなら（おそらくは他のプ
ロテアーゼによる汚染のために）、所望の分割生成物だ
けが得られる唯一のものとはならない。いずれにしても
そのような生成物は他の大腸菌ポリペプチド、その他プ
ロテアーゼに付着している汚染物質から分離されなけれ
ばならない。
細菌は補欠分子ヘム族をクローニングした真核遺伝子
から発現したタンパク質に組み入れることができること
を示す精子のクジラミオグロビンが大腸菌中に発現され
ている。SpringerとSligar,PNAS（米国）84:8961−65
（1987）またWalderは「もしα鎖とβ鎖の両方が同一細
胞中に発現するなら、ヘモグロビンは同様に作ることが
できるかどうかが分かる」と言っている。ミオグロビン
（単一鎖タンパク質）と個々のα、βグロビンサブユニ
ット間には３次構造上の高い類似性があるが、ヘモグロ
ビンは異種４量体タンパク質であって、グロビンの主要
配列は27％相同以下でミオグロビンは、αグロビンまた
はβグロビンのいずれよりもかなり高い安定性を享受し
ていることが今日では知られている。このように同一細
胞中にαグロビンとβグロビンが同時発現することは、
α鎖とβ鎖の正しい折り畳みおよびヘムの組み入れを要
求する機能的ヘモグロビンの細胞内アッセンブリをもた
らすだろうことは予言し得ないことである。
I.酵母におけるヒト遺伝子発現についての一般論 細胞質的に、あるいは培養基への分泌によって数多く
のヒトタンパク質が形質転換酵母細胞中に発現されてい
る。特にSaccharomyces cerevisiaeがそうである。Kin
g,et al.,Biochem.Soc.Transac.,16:1083−1086（198
8）．しかし成功は保証されていない。Thim,et al.,FEB
S Lett.,212:307−312（1987）は、無傷なプロインシュ
リンをコードする遺伝子が挿入された酵母細胞から正し
くクロスリンクされたインシュリンを得ることの難しさ
を経験している。彼らはヘクサペプチドスペーサーでリ
ンクされたＢ鎖とＡ鎖をコードする改造プロインシュリ
ン遺伝子を構築することによりこの問題を克服した。こ
の遺伝子の生成物は分割され２つの鎖は正しく折り畳ま
れ細胞によってクロスリンクされた。
Richardson,et al.,Biochim.Biophys.Acta,950:385−
94（1988）は、大腸菌中に異種２量体タンパク質リシン
のＢ鎖を発現させた。彼らはリシンＢ鎖融合タンパク質
に対して酵母α因子リーダーの分泌を高いレベルで得る
ことは困難であったと報告している。リシンＡ鎖とＢ鎖
を同時発現しアッセンブリさせる試みは行われていな
い。
Murakami,et al.,DNA,6:189−97（1987）は、ヘム含
有の融合酵素の形質転換酵母細胞での生成について報告
している。
Horwitz,et al.,PNAS（USA）,85:8678−82（Nov.198
8）は、機能的マウス可変部／ヒトIgGl不変部キメラ抗
体を培養基に分泌する酵母株の構築について記載してい
る。彼らは自分達の文献が酵母における外部からの多量
体または異種２量体タンパク質の分泌に関する最初の報
告であると述べている。しかしCarlson,Mol.Cell.Bio
l.,8:2638−46（June 1988）は、抗原に付着し結合する
ポリペプチドに重鎖軽鎖cDNAを転写し翻訳することにつ
き示している。
Beggs,et al.,Nature,283:835（1980）は、S.cerevis
iaeに染色体ラビットβグロビン遺伝子を発現させよう
と試みている。しかしこうした酵母はイントロン含有の
グロビンmRNA転写産物を正しくスプライスすることがで
きない。
ここに引例した参考文献のいずれも先行技術ではな
い。これら文献ならびに公表日に関する記述は公表され
た情報にのみ基づくもので、出願人はそれら情報の正確
さに関し問題となったときは調査する権利を保留する。
発明の要旨 本発明の目的は、従来技術の上記欠点を解消すること
にある。例えば出願人は、現実にはヘモグロビンを産生
しない細胞中で４量体ヘモグロビンを初めて完全に発現
し、かつ、４量体ヘモグロビンを組合せる［assembly］
ことに成功した。一方、従来技術はαグロビンとβグロ
ビンの別々の発現、ならびにそれらを細胞外でヘムと結
合させヘモグロビンを形成することに関してのものであ
った。
本発明の中心的特徴は、αおよびβグロビン様のポリ
ペプチドを細胞内でアッセンブリさせ、ヘムを細胞内に
組み入れて生物学的に機能的なヘモグロビン様タンパク
質を形成するにある。この細胞内におけるアッセンブリ
は、ヘムを一緒に折り畳み組み入れるようにαおよびβ
グロビン様のポリペプチドを同一細胞内に発現させるこ
とによって行われる。本発明の重要な特徴は、グロビン
が大腸菌またはS.cerevisiae中で別々に発現したとき観
察されるものに比較し、不溶性グロビンの非細胞塊、特
にβグロビンの非細胞塊の形成を著しく減少させること
にある。同時発現は、同一細胞中の２個別々だが両立し
うるプラスミド上の遺伝子、または同一プラスミド上の
２個の異なるオペロン、あるいは単一のポリシストロニ
ックオペロンから行われる。
１実施例において、αおよびβグロビン様ポリペプチ
ドは細菌細胞中で同時発現されている。対応する遺伝子
は同一の合成オペロン（すなわち１つのプロモーターで
操作された）中に含まれるか、異なるプロモーターによ
る別々のオペロン（同一でも別々のものでも）中に置か
れる。好ましくはαおよびβグロビンの発現は、以下各
グロビン遺伝子の前に記載されるであろう「リボソーム
ローダー」［ribosomal loader］配列を置くことによ
って促進される。これは量的に生産が困難なαグロビン
の場合に特に有利である。
別の実施例では、αおよびβグロビン様ポリペプチド
は、酵母細胞中に同時発現される。αグロビンの収率お
よびβグロビンの可溶性の両者につき改善されている。
本発明のもう一つの側面は、１細胞中に発現され得、
相互にアッセンブリさせるか、あるいはヘモグロビン様
タンパク質へとβおよびαグロビン様ポリペプチドと各
々アッセンブリさせて新規な中間体、すなわちdi−αグ
ロビンおよびdi−βグロビン（ならびにそれらの突然変
異体）を産生することにある。細胞内の組合せは厳密に
要求されるものではないが、di−αグロビンおよびdi−
βグロビンは、機能的ヘモグロビンの細胞内アッセンブ
リに特に適合するものと考えられる。というのは例えば
di−αグロビンの発現は、２個のαグロビンサブユニッ
トの細胞内組合せに、ある面で相似的で、ただ会合が、
サブユニットの非共有相互作用ではなく共有ペプチドリ
ンカーの発現によって達成されるという点で記述の通り
アッセンブリとは異なるのである。di−αグロビンおよ
びdi−βグロビン様ポリペプチドは、好ましくは細菌細
胞または酵母細胞中で発現されるのがよい。
本発明のこうした局面については以下に詳細に説明す
る。
ヘモグロビン様タンパク質の酵母発現 出願人はヒトヘモグロビン（またはその突然変異体）
を酵母中、特にSaccharomyces cerevisiae中に産生する
ことが可能なことを発見した。酵母発現系の使用はヘモ
グロビンを細菌の内毒素から分離する必要性をなくす
る。正しいＮ末端アミノ酸をもつαグロビンおよびβグ
ロビンは、選択的に分割可能な融合タンパク質の一部と
してそのグロビンを最初に発現することなしに得られる
ことも発見した。これは酵母酵素のメチオニルアミノペ
プチダーゼが、所望のＮ末端アミノ酸（バリン）を露出
させるためにMet−αグロビンおよびMet−βグロビンか
らＮ末端メチオニンを除去することができるからだと信
じている。変化させられた酸素親和性突然変異体の産生
は、WO88/09179に記載されているように、大きな関心事
である。そのような突然変異体は、グロビン遺伝子の部
位特異性ある変種生成と、それに続くクローニングと酵
母中での発現によって産生できる。
好ましい実施例では、以下に定義される所の「gal−g
ap49」ハイブリッドプロモーターによって発現が制御さ
れている。
αグロビン遺伝子およびβグロビン遺伝子の酵母細胞中
での同時発現 好ましい実施例では、αグロビン遺伝子およびβグロ
ビン遺伝子は両者とも同一の母細胞中で発現される。β
グロビン遺伝子単独の発現は、全細胞タンパク質の２％
以下しかないきわめて不溶性の抽出困難なタンパク質で
あるβグロビンを産生することになる。一方αグロビン
遺伝子単独の発現は、きわめて低いレベルのαグロビン
収率（全細胞タンパク質の0.5％以下）となる。いずれ
にしてもヘムは組み入れられない。しかしαグロビン遺
伝子およびβグロビン遺伝子が同時発現されるときは、
形質転換酵母細胞がαおよびβグロビン鎖を一緒に折り
畳んでおり、機能的な組換え体ヒトヘモグロビンを可溶
態で得るためヘムグループを取り込み、操作可能に遺伝
子にリンクされたプロモーター中に変化なしに全細胞タ
ンパク質の約10％まで蓄積する。
αおよびβグロビン遺伝子は次に、宿主細胞内で別の
プラスミドまたは同じプラスミドで輸送される。
細菌細胞におけるα、βグロビン遺伝子のポリシストロ
ニック同時発現 出願人はα、βグロビン遺伝子を小さくて消費できる
ペプチドをコードする小さな「リボソームローダー」遺
伝子に翻訳的にカップリングした。このペプチドは、リ
ボソームを所望のα、βグロビンメッセージのATGへ直
接導き翻訳的効果を促進するものである。出願人はま
た、α、βグロビン遺伝子を同一オペロン中に入れ、そ
れら遺伝子が単一のポリシストロニックmRNA転写体へ転
写されるようにした。これらグロビンは次に、異なるポ
リペプチド鎖として翻訳され、続いて一緒に折り畳まれ
て形質転換細胞によって細胞内ヘムに結合されヘモグロ
ビン４量体を形成する。出願人の方法は沈降したα、β
グロビンの別々の精製に伴う問題点を解消するものであ
る。
異種オリゴマーヒトタンパク質のポリシストロニック
発現と、その可溶性で活性な形態での異種宿主における
アッセンブリは、これまでに報告されていない。これが
原核生物（細菌）宿主中での哺乳類タンパク質の発現で
あることは特に注目されるべきである。このタンパク質
は補欠分子族を取り込むもので、正しい翻訳後工程の目
標にさらなる改良をもたらすものであることが注目され
るべきである。
１実施例では、Met−FX−αグロビンとMet−FX−βグ
ロビンが同時発現される。ここでFXはファクターXa分割
作用の制限部位を有するリーダーペプチドを指す。FX−
αグロビンとFX−βグロビンは組合わさって、天然ヘモ
グロビンよりも酸素親和性が高いけれど可逆酸素結合活
動のある突然変異体ヘモグロビンを形成する。それとも
なければ、FXリーダーまたは他の融合リーダーは天然ヘ
モグロビンの重複体を得るために分割される。
別の実施例ではMet−αグロビンとMet−βグロビンが
同時発現される。これは分割工程を不要にする。
第３実施例ではdes−val−αグロビンとdes−val−β
グロビンが同時発現される。天然α、βグロビンは共に
バリンを有している。しかしバリンは同様な疎水性を有
するメチオニンと置き換えられる。
その他の実施例では、天然遺伝子の１または２以上の
コドンが、天然のものとは１又は２以上の点でアミノ酸
が相違（挿入、欠失または置換）することを特徴とする
α及び／又はβグロビン関係タンパク質が産生されるよ
うに、変化させられる。
di−α、di−βグロビン 好ましくは１または２以上のアミノ酸の中間体リンカ
ーを介して、ペプチド結合によって共有連結された２つ
のαグロビンアミノ酸配列で構成されるdi−αグロビン
が調整される。驚くべきことにこれらの「遺伝子的にク
ロスリンクされた」αグロビン鎖はβグロビンならびに
ヘムを適切に折り畳み結合することができ、機能的ヘモ
グロビン類似体を産生した。「遺伝子的にクロスリンク
された」という用語はこの産生方法を指す。グロビン遺
伝子の２つのコピーが、好ましくはアノン酸リンカーを
コードするスペーサーDNAと一緒に融合され、構築物が
直接所望のdi−αグロビンをコードするようにされる。
「類似体」の語が用いられるのは、天然ヘモグロビンで
はα１とα２サブユニットが非共有結合されるからであ
る。di−βグロビン類似体の調整もまた視覚化されてい
る。
「遺伝子的にクロスリンクされた」ヘモグロビンの調
整は化学的クロスリンクの欠点を回避するものである。
後者は非効率的でヘモグロビン溶液の脱酸素をしばしば
必要とし、また競争反応を阻止するため別の分子（例え
ばイノシトールヘキサホファートまたは2,3−DPG）の存
在を必要とする。
好ましい実施例ではdi−αグロビン及び／又はβグロ
ビンは、血液全体の酸素結合特性に近付くように溶液状
でヘモグロビン類似体の酸素結合親和性を減少させる突
然変異を有する。
di−αヘモグロビンは、都合の良いことに通常の（de
s−val）組換え体ヘモグロビンよりも循環系における実
質的に長い半減期を示す。できればヒトにおいて、半減
期が少なくとも1gm/kgm体重の服用量で９時間を超える
ことが好ましい。これは相当量の服用を与えたラットで
約３時間の半減期に相当すると考えられる。
di−α、di−βグロビンは細菌および酵母の両方に発
現させることができる。
図面の簡単な説明 図1:FX−αグロビン（pDL II−62m）、FX−βグロビ
ン（pDL II−10a）、およびFX−ヘモグロビン（pDL 11
−66a）の発現プラスミドの構造を示すフローチャート
である。
図2:Tacプロモータに制御されているジシストロンのD
es−Val−αグロビン遺伝子を有するpDL III−1a（2a）
のプラスミド、およびポリシストロンdi−α／β同時発
現プラスミドpDL III−47a（2b）の構造を示すフローチ
ャートである。
図3:Met−αMet−βグロビンの同時発現のためのプラ
スミド、pDL III−13eの構造を示すフローチャート。
図4:合成FX−αおよびFX−βグロビン遺伝子構築のた
めのオリゴヌクレオチドである。トップ鎖は５′→３′
と、ボトム鎖は３′→５′と示されている。補足合成オ
リゴヌクレオチドの間の重なり部分は、両鎖が同じ文字
で示される領域として示される。FX−αおよびFX−βに
結び付くPst I部位はSJH I−35aとSJH I−36bとの重な
り部分に生じている。
図5:Met−FX−αおよびMet−FX−βグロビンの発現用
合成遺伝子。領域Ａはαグロビン遺伝子を、および領域
Ｂはβグロビン遺伝子を有する。両領域におけるファク
ターＸ配列および２つのShine−Delgarno配列（SD＃１
およびSD＃２）の位置が示されている。選択された制限
部位も見つけられている。リボソームローダーおよびMe
t−FX−αおよびMet−FX−βグロビンの翻訳されたアミ
ノ酸配列が示されている。
図6:FX−ヘモグロビンの溶出プロフィルおよび吸収ス
ペクトル。
図7:突然変異ヘモグロビンのオリゴヌクレオチド構造
（通常のヘモグロビンとはアミノ酸配列が異なってい
る） 図8:ファクターXa基質認識部位をコードしないプラス
ミドを構築するオリゴヌクレオチド。
図10:Des−FXヘモグロビンの酸素結合。
図11:プラスミドpDL III−14cとpDL III−38b。
図12:（des−Val）−α−（Gly−Gly）−αおよびdes
−Valβグロビンの発現のための好ましい合成遺伝子の
配列を示す。ＡはShine−Delgarnoリボソーム結合部位
（SD＃１およびSD＃２）を含む領域（EcoR IからPst
I）を示し、その配列は同時翻訳カップラーとして働く
オクタペプチド（Met...Glu）を発現し、またその配列
は二つの非常によく似たαグロビン様ポリペプチドとそ
れらの中間にあるGly−Glyリンカーをコードする。はじ
めのαグロビン配列は“Met−Leu"ではじまり、それは
人工メチオニンを含有し、成熟αグロビンの正常第一残
基であるバリンを省き、第二残基ロイシンにつづく。２
番目のαグロビン配列は下線をほどこした“Gly−Gly"
リンカーのすぐあとに“Val−Leu"ではじまる。スター
トおよびストップコドンには下線をほどこしてある。Ｂ
はdes−Valβグロビンをコードする配列を含む類似の領
域（Pst IからHind III）を示す。ＡとＢはPst I部位で
連結して単一ポリシストロンを形成する。
図13:最終発現ベクターpDL III−47aの構造を示す。
“PTac"はTacプロモーターであり、“アムピシリン”は
アムピシリン抗遺伝子である。図13aはPDL III−47aのX
ba I−BamH Iフラグメントを示す。
図14:プラスミドpSGE0.0E4 図15:プラスミドpSGE1.1E4 図16:プラスミドpDL IV−67a 図17:プラスミドpJR VI−54a 図18:プラスミドpDL di−α／β／β 図19:種々のポリシストロングロビンオペロンのλPL
制御を行う種々の表現ベクターの構成を示すフローチャ
ート。
図20:制限部位が示されたGAL−GAPプロモーターのヌ
クレオチド配列を示す。Sph IからEcoR Vまでの領域は
合成GAL1-10制御領域を含む（M.Johnston and R.Davis.
1984.Molecular and Cellular Biology,4:1440−144
8）。UASはこの図の29−63番領域中にある。EcoR Vから
Xba I部位までの領域はコンセンサスGAP491転写スター
ト領域を含み、転写のおおよそのスタートは395番目で
ある。（L.McAlister and M.J.Holland.1983.J.Biol.Ch
em.,260:15019−15027;J.Holland,et al.1983.J.Biol.C
hem.,258:5291−5299）。
図21:βグロビン発現カセットの構成を示すフローチ
ャート（21a、21b）。
図22:βグロビン発現ベクターpGS4988（22a）とαグ
ロビン発現ベクターpGS4688（22b）の構成を示すフロー
チャート。
図23:αグロビン発現カセットおよびαグロビンとβ
グロビンの同一プラスミドからの同時発現をするベクタ
ーpGS289とpGS389の構成を示すフローチャート（23a、2
3b）。αグロビンとβグロビンは別のプロモーターから
発現していることに注意せよ。
図24:酵母から生成された組換え体と天然ヒトヘモグ
ロビンとの吸収スペクトル。
図25:di−α／βヘモグロビンの酵母発現ベクターの
構成ならびにプラスミドpGS3089（25b）の地図。
図26:プラスミドpGS3089RGV desβの地図。
好ましい実施例の詳細な説明 通常のヘモグロビンの構造はよく知られている。ここ
で出願人は次の資料に言及してその全体を本願に組み込
むこととする。Bunn and Forget,eds.,Hemoglobin:Mole
cular,Genetic and Clinical Aspects（W.B.Saunders C
o.,Philadelphia,PA:1986）and of Fermi and Perutz
“Hemoglobim and Myoglobin"in Phillips and Richard
s,Atlas of Molecular Structuresin Biology（Clarend
on Press:1981） ポリペプチドの一次構造はそのアミノ酸配列および個
々のアミノ酸の側鎖の修飾次第で特定される。
通常の大人のヒトヘモリサートの約92％はHab A（２
つのα鎖と２つのβ鎖を有するためα２β２と呼ばれ
る）である。α鎖は141個のアミノ酸でできている（図1
1）。ヘム（フェロプロトポルフィリン IX）グループ
の鉄原子はhis 87（「プロキシマル ヒスチジン」）の
イミダゾールに共有結合する。β鎖は146残基の長さで
（図12）ヘムはhis 92でそれに結合する。
知られているその他のヘモグロビン種にはHgbA2（α
２α２δ２）HgbA1a,HgbA1bおよびHgbA1cがあり、その
ほかにまれな種としてHgb F（α２γ２）,Hgb Gower−
１（ζ２ε２）,Hgb Gower−２（α２ε２）,Hgb Portl
and（ζ２γ２）,Hgb H（β４）およびHgb Bart
（γ４）がある。これらは異なるポリペプチド鎖を有す
ることでHgb Aと区別される。
ポリペプチド鎖のフラグメントは、二つの共通なコン
ホメーション、すなわちαヘリックスとβプリーツシー
トのうちの一つに折りたたまれて安定化する。変性しな
い天然状態でヘモグロビン分子の約75％はα−ヘリック
スである。α−ヘリックスセグメントは強制された形が
より少ないセグメントでつなげられている。通常、各鎖
のα−ヘリックスセグメントを文字で区別し、たとえば
α鎖の近位ヒスチジンはF8（ヘリックスＦの残基８）の
ようにする。非ヘリックスセグメントは文字の対で識別
し、それらがどのヘリックスセグメントに連結している
かを示す。すなわち、非ヘリックスセグメントBCはヘリ
ックスＢとヘリックスＣの間に存在する。ある特異なヘ
モグロビン鎖の二つの変異体を比較する場合、構造の相
同をさがすときはヘリックスセグメントをそろえて並べ
ることによってはっきりさせられるだろう。ヒトヘモグ
ロビンAoαおよびβ鎖に関するアミノ酸配列とヘリック
ス残基の記号についてはBunn and Forget,supraとそこ
にある表１を参照のこと。
ヘモグロビン分子の３次構造は、直線配列では遠く離
れているアミノ酸残基の立体的相互関係に帰せられるの
に対して４次構造はサブユニット（鎖）がつめこまれて
合体する仕方による。ヘモグロビン分子の３次ならびに
４次構造は、ヘモグロビン結晶のＸ線回折解析で明らか
になり、それによって分子内の問題にしている分子の３
次元位置を計算することができる。
酸素付加しない（“デオキシ”あるいは“tense"を示
す“T"）形では、ヘモグロビンのサブユニット（α1,α
2,β１およびβ２）は２回対称軸をもった四面体をな
す。対称軸は水のつまった“中心空洞”を貫通する。サ
ブユニットは互いにファンデルワールス力、水素結合お
よびイオン相互作用（または“塩架橋”）によって相互
作用する。α１β１とα２β２界面はかなりの流動性が
ある。酸素付加（“オキシ”あるいは“relaxed"を示す
“R"）では、サブユニット間の距離は増大する。
変性しない生のオキシヘモグロビンとデオキシヘモグ
ロビンの３次および４次構造は十分によく知られてお
り、水素以外の原子のほとんどすべてについて0.5Åか
それ以上の精度で位置も定められている。ヒトデオキシ
ヘモグロビンについてはFermi,et al.,J.Mol.Biol.,17
5:159（1984）を、ヒトオキシヘモグロビンについてはS
haanan,J.Mol.Biol.,171:31（1983）を参照。両文献と
も引用文献中にある。
ヘモグロビン構造の解析はα−β界面に集中する傾向
があり、αサブユニットのアミノ末端と他のサブユニッ
トのカルボキシル末端の間の距離はデオキシ構造で約5.
6Å、オキシ構造で約3.3Åであることがわかっている。
従属請求項の目的のために、ヘモグロビン様タンパク
質は複数の補欠分子族と少なくとも約６トル（米国特許
願07/194,338の表１のように測定したとき）のP50を有
する酸素結合タンパク質であり、それぞれがヒトα（あ
るいはdi−α）グロビン様ポリペプチドあるいはヒトβ
（あるいはdi−β）グロビン様ポリペプチドである複数
のポリペプチドからなる。ヒトαグロビン様ポリペプチ
ドは変性しない生のヒトαグロビンないしそのもとの生
配列と１個かそれ以上の置換、欠失あるいは挿入だけ異
なる変異体であり、一方、少なくとも残り75％はヒトα
グロビンと相同で、なおヘムを取り込むことができてβ
グロビンと会合できる。βグロビン様サブユニットは同
様に定義される。ヒトαあるいはβグロビンと十分に相
同な動物ヘモグロビンやそれらの変異体は“ヒトαある
いはβグロビン様ポリペプチド”の名に包含される。た
とえば、ウシヘモグロビンのサブユニットはこれらの名
称に含まれる。α−およびβ−グロビン様ポリペプチド
は一括して“グロビン”としてもよいだろう。
従属請求項の目的のために、di−αグロビン様ポリペ
プチドは第１α−グロビン様ポリペプチドの正常Ｃ末端
と第２α−グロビン様ポリペプチドのＮ末端間をペプチ
ド結合で結んだ、本質的に二つのα−グロビン様ポリペ
プチド配列から成るものである。これら二つの配列は直
接連結されるか、１個ないしそれ以上のアミノ酸のペプ
チドリンカーを通じて連結される。ペプチド結合以外の
結合（たとえばDIDS）によってＮ−とＣ−末端でクロス
リンクしたαグロビン鎖は除外する。di−αグロビン様
ポリペプチドはβグロビンと一緒に折りたたまれて機能
性のヘモグロビン様タンパク質を作るためにヘムを取り
込むことができなければならない。di−βグロビン様ポ
リペプチドは同様に定義される。di−αおよびdi−βグ
ロビン様ポリペプチドは一括して“擬ジメトリックグロ
ビン様ポリペプチド”としてもよいだろう。
“Met FXαグロビン”はＮ末端メチオニンを包含する
αグロビン様ポリペプチドであり、ファクターXaを確認
する部位として働くオリゴペプチド（たとえばIle−Glu
−Arg）であり、また野生型αグロビンあるいはそれの
変異体に対応すると考えられるαグロビン様配列（たと
えばVal−His−Ler−Thr−Pro....）である。“Met FX
αグロビン”はときには“FXαグロビン”略記する。
“FXβグロビン”は同じようにしてβグロビン様ポリペ
プチドと定義される。
“Met−αグロビン”は余分のＮ末端メチオニンをも
つαグロビン様ポリペプチドである。２番目のアミノ酸
はバリン、それは成熟野生型αグロビンの１番目のアミ
ノ酸である。Met−βグロビンは同様に定義される。“D
es−FXαグロビン”遺伝子（または“dFxαグロビ
ン”）はMet−FXαグロビン遺伝子からFXコドンを切り
取って得られるMet−αグロビン遺伝子である。“Met−
Hgb"はメチオニンαグロビンとメチオニンβグロビンか
ら作られるメチオニルHgbを呼ぶのに用いられることに
注目すること。
“Des−Val−αグロビン”（または“DVlaαグロビ
ン”）はαグロビン様ポリペプチドで、そこではメチオ
ニンが成熟野生型αグロビンの配列の始まりであるバリ
ンの代わりにメチオニンで置き換えられている。Des−V
al−βグロビンは同じように定義される。des−Val−α
／αグロビン（di−Des−Val−αグロビン）は“di−α
グロビン”であり、そこでは“Des−Val−α”配列が適
当なペプチドリンカーを通じて、バリンで始まるαグロ
ビン様配列に連結されている。
αおよびβグロビン様鎖は、配列に関して“通常”の
ヘモクロビンのαおよびβグロビンに正確に対応する必
要はない。むしろ、ヘモグロビンの酸素親和性や安定
性、あるいは発現の容易さや各鎖の集合を変えるために
突然変異を導入できるかもしれない。実施例により、そ
して制限なしに、種々のヘモグロビン変異体が本発明の
方法により調整されている。さらなる突然変異について
のガイダンスはここで引用文献に入れてあるHoffman an
d Nagai,Ser.No.07/194,338を組み入れてることにす
る。
α（あるいはdi−α）とβ（あるいはdi−β）グロビ
ン鎖のおのおのをコードするDNA配列はゲノム、cDNAお
よび合成由来か、それらの組み合わせになるだろう。ゲ
ノムグロビン遺伝子はイントロンを含むので、ゲノムDN
AはプレメッセンジャーRNAを正しくスプライスできる宿
主中で発現されるか、さもなければイントロンを切断す
ることによって修飾される。いくつかの理由によって少
なくとも部分的な合成遺伝子を用いるのが好ましい。第
１の理由は、所望のアミノ酸をコードするコドンは配列
中の便利な点における単一ないし、ほとんど単一の制限
部位を与えるという考えをもって選択され、それによっ
てカセット突然変異による迅速な配列の変更を容易にで
きるからである。第２の理由はコドンの選択は選んだ宿
主中で発現を最適にするようになされるからである。大
腸菌中のコドンの選択についてはKonigsberg,et al.,PN
AS,80:687−91（1983）を、酵母中のコドンの選択につ
いては次節をみること。最後の理由としてメッセンジャ
ーRNA転写体によって作られる２次構造が転写や翻訳に
干渉するかもしれないことである。もしそうだとすれ
ば、これらの２次構造はコドン選択を変更することによ
って除外されるだろう。
もちろん、もしサブユニットを遺伝的にクロスリンク
するのにリンカーが用いられれば，そのリンカーは通常
は合成DNAでコードされる。di−αグロビンとβグロビ
ンは別々に発現され、ついでin vitroで互いに結合しさ
らにヘムと結合するので、これらは一つのプラスミド上
に置かれるのが望ましい。
本発明はなんらか特定の宿主細胞、ベクターあるいは
プロモーターの使用に限定されない。しかしながら、望
ましい宿主細胞は細菌（とくに大腸菌）と酵母（とくに
S.cerevisiae）である。選んだプロモーターは望みの宿
主細胞中で機能しなければならない。それはできれば誘
導プロモーターで、誘導によって高速度の転写を行わせ
るものがよい。好ましい細菌プロモーターはTacプロモ
ーターでtrp/lacハイブリッドはDeboer,U.S.4,551,433
にくわしく記載されており、Pharmacia−LKB社から市販
されている。使用される他のプロモーターには温度感受
性のλPLとPRプロモーター、同じくlac,trp,trc,PIN
（リポタンパリプロモーターとlacオペレーターハイブ
リッド）,galならびに熱ショックプロモーターがある。
使用するプロモーターはなんらか天然に存在するプロモ
ーターと同じである必要はない。プロモーターを企画す
る際のガイダンスはHarley and Reynolds,Nucleic Acid
Res.,15:2343−61（1987）やそこで引用されている論
文などのようなプロモーター構造の研究から得られる。
最初の構造遺伝子に相対的なプロモーターの位置は最適
化される。Roberts,et al.,PNAS（USA）,76:760−４（1
979）．単一プロモーターを用いるのが好ましい。適当
な酵母発現系について本明細書の別の箇所で詳しく述べ
る。
使用するベクターは宿主細胞中で機能する複製の開始
点をもつものでなければならない。それはまたグロビン
遺伝子の挿入のための特別の制限部位をもつことが望ま
しく、また所望の制御成分と通常の選択マーカーをもつ
ことが望まれる。ベクターはさらにうまく操作するのに
よりよく適合するようにするために制御部位を導入した
り取り除いたりするように変えられるだろう。
αおよびβグロビンは直接あるいは融合タンパク質の
部分として発現される。融合タンパク質として発現され
る場合、融合タンパク質は一つの切断部位を有してお
り、そこで切断することによって外来ポリペプチドとは
無関係なαおよびβグロビンを遊離する。もしそうであ
れば、ここでの引用文献に含まれるNagai and Thorgens
on,EP Appl 161,937で示されているように、ファクター
Xa酵素に敏感な部位が得られるだろう。さもなければ、
αおよびβ融合タンパク質を合成し、折りたたまれてヘ
ムを取り込んでヘモグロビン類似化合物をうる。
αおよびβグロビンサブユニットの直接発現が望まし
い。ファクターXaは血液誘導体である。それゆえ、その
製剤は好ましくない血液関連物質や病原物質を含んでい
る。いずれにせよ、ヘモグロビンはファクターXaから分
離されねばならない。
ここの引用文献に取り入れられているNagai and Thor
gerson,EP Appl 161,937,は融合遺伝子の作り方を教え
ており、その遺伝子中では興味のポリペプチドをコード
するDNAのすぐ前にファクターXa、セリンプロテアーゼ
に対する切断部位をコードするDNAが存在する。ファク
ターXaによって切断されるペプチド配列のあるものを以
下に引用する（そこでは切断部位を“＝”で示す）。
上のリストで、“C II FXβ−グロビン”はλC IIタ
ンパク質の31個のアミノ酸残基、ファクターXa認識配列
“Ile−Glu−Gly−Arg"およびヒトβグロビン（“Val−
His−Leu−Thr−・・・”ではじまる）を含んでいる。
本発明の図４の研究から実施例１のFX−αおよびFX−β
グロビンは“Met−Ile−Glu−Gly−Arg"ではじまる変性
しない生のグロビンに対応することが明らかになるだろ
う。
細菌mRNAでは、リボソームがメッセンジャーに結合す
る部位はスタート（AUG）コドンの４−７塩基上流にあ
るポリプリンストレッチである。このストレッチのコン
センサス配列は５′・・・AG GAGG・・・３′であり、
しばしばShine Delgarno配列として引用される。Shine
Dalgarno,Nature,254:34（1975）.SD配列と翻訳スター
トコドン間の正確な距離や、この“スペーサー”領域の
塩基配列は翻訳の効率に影響し経験的に最適化されるだ
ろう。Shepard,et al.,DNA1:125（1985）;DeBoer,et a
l.,DNA2:231（1983）；（Hui,et al.,EMBO J.,3:623（1
984）． さらに、SD配列は発現を変えるようにそれ自身変えら
れる。Hui and DeBoer,PNAs（USA）,84:4762−66（198
7）.Scherer,et al.,Nucleic Acids Res.,8:3895−3907
（1907）の研究のような、リボソーム結合部位の比較研
究は適当な塩基変化に関してのガイダンスを提供するか
もしれない。もしヘモグロビンが大腸菌以外の宿主中で
発現させられるとすれば、その宿主にとって好ましいリ
ボソーム結合部位が得られるべきである。Zaghbiland D
oi,J.Bacteriol.,168:1033p35（1986）． 選択されたプロモーターとリボソーム結合部位を認識
し、ヘムを合成し取り込む能力をもつところのどんな宿
主も使用されるだろう。細菌と酵母の宿主が好ましい。
細胞内で会合したヘモグロビンは生成細胞から回収さ
れ、人工認識法（art−recognized technique）で精製
される。
αおよびβグロビンのポリシストロン同時発現とそれら
のヘモグロビンへのアッセンブリ 一つの具体実施例において、αおよびβグロビン遺伝
子の発現は単一プロモーターで行われ、単一のポリシス
トロンメッセンジャーRNA転写体が転写され、ついでそ
こからαとβグロビンポリペプチドが別々に翻訳され
る。しかしながら、当発明は別々のプロモーターからα
およびβグロビン遺伝子が同時発現される、すなわち宿
主は別々のαとβグロビンmRNAを転写することを内容と
する。
理論的基礎に立てば単一のプロモーターを使用するの
が好ましい。理想的には、αとβグロビンは化学量論的
に等量発現される。単一プロモーターの使用は等量を保
証しないが、それは一つの不均衡な影響、すなわちプロ
モーターの強度と近づき易さの違いによる転写の差異を
取り除く。もしも同じプラスミド上で二つの同じプロモ
ーターを用いることによってプロモーターの強度の差が
取り除かれれば、相同領域は組換えする傾向があるだろ
うから、プラスミドの安定性は減少するだろう。しかし
ながら、予備実験で我々は別々のプロモーターからαと
βグロビンを同時発現させたことに注目している。
単一プロモーターを使用することが正当化されるもう
一つの理由はリプレッサー結合部位の数を最小にすると
いうことである。
好ましいやり方は、αとβグロビン遺伝子を、リボソ
ームかはじめにαグロビンシストロンを翻訳するように
並べることである。その理論的基礎はαグロビンがβグ
ロビンの折れたたみに影響することを信ずべきある根拠
があるということである。それにもかかわらず、遺伝子
の位置は例６に示すように、βグロビンが最初に合成さ
れるようにスイッチされるかもしれない。
ポリシストロンmRNA転写体の安定性、そのもののαお
よびβグロビンへの翻訳の効率およびグロビン鎖の四量
体ヘモグロビンへの折れたたみは、シストロン間領域
（一つのシストロンのストップコドンとつぎのシストロ
ンのスタートコドン間の領域）の長さと塩基配列、１番
目のシストロンに対する２番目のシストロンのフェイシ
ング、および前にあるシストロンに相対的な一つのシス
トロンに対するリボソーム結合部位の位置と配列を変え
ることによって修正できるだろう。
一つの好ましい具体例では、αおよびβグロビン遺伝
子のそれぞれの前に、短い“イントロダクトリィ”［in
troductory］シストロンあるいはグロビンシストロンの
引き続いての翻訳を容易にする“リボソームローダー”
［ribosomal loader］がおかれている。図４において、
領域Ａは各シストロンの前に２つのシストロンとShine
−Delgarno配列を含んでいる。１番目のShine−Delgarn
o配列（SD＃１）にはリボソームが結合しており、つい
でそれは１番目のシストロン、すなわちオクタペプチド
をコードする短いシストロン（このシストロンはイント
ロダクトリィシストロンあるいはリボソームローダーと
呼ばれる）を翻訳する。２番目のシストロンはグロビン
遺伝子で、この場合、FXα−グロビン遺伝子である。２
番目のシストロンの翻訳を容易にするためのShine−Del
garno配列（SD＃２）は実際は１番目のシストロン内に
ある。この理由から、これら２つのシストロンは“翻訳
上カップルしている”といわれる。領域Ｂは２番目のシ
ストロンがFX−βグロビンをコードすることを除けば、
同じ構造である。領域ＡとＢの間は43−塩基シストロン
間領域である。領域ＡとＢの導入シストロンは、Schone
r,et al.,Meth.Enzymol.,153:401−16（1987）の中でPC
Z144と名づけられた２シストロン発現系の１番目のシス
トロンに対応する。しかしながら、当発明はSchonerら
が記載している特定の“スターター”シストロンに限定
されるものではなく、次のシストロンの高レベル翻訳を
再びスタートさせる他の導入シストロンも使用されるだ
ろう。
シストロン間配列の設計やSD配列の位置についてのガ
イダンスは、同じポリシストロンオペロンの偶発あるい
は人為的変異体の翻訳の効率を比較することによって得
られ、このことはSchoner,et al.,PNAS,83,8506−10（1
980）が実例で示している。また、異なるオペロンのシ
ストロン間領域中に意見の一致する特徴［consensus fe
atures］を捜すことも可能である。McCarthy,et al.,EM
BO J.,4:519−26（1985）は大腸菌atpオペロン中に翻訳
を増強するシストロン間配列を見出している。
当発明はヘモグロビンあるいはその成分ポリペプチド
が封入体中に局在するのを減少ないし回避することを意
図している。したがって、本発明の大きな特徴は、機能
的ヘモグロビンが細胞の可溶分画にたくさん（できれば
80％以上）見出されるということである。本発明による
と、本明細書中に述べたようにテトラシストロンオペロ
ンから同時発現したαおよびβグロビン鎖が会合してα
２β２ヘモグロビンができるとき、機能性ヘモグロビン
の90％以上が可溶性部分にあると思われる。di−α，β
２ヘモグロビンについては、発現が25℃で誘導されたと
き、ほとんど100％が可溶性であり、誘導の温度がより
高いと可溶性はより少ない。これらの百分率は細胞の可
溶画分に見出されるすべてのdi−αとβ鎖のパーセント
であって、細胞からのタンパク質の実際の回収ではな
い。
酵母中の発現 他の実施例において本発明は酵母中におけるヘモグロ
ビン様分子の生成に関係している。酵母中の組み換えヒ
トヘモグロビンの発現に対して好ましい宿主はSaccharo
myces Cerevisiaeである。しかしながら、目的によって
はコウジカビ属（Aspergillus）あるいは酵母菌（Pichi
a）株のような他の菌類４酵母を用いてもよい。宿主に
適した酵母としては、複製型か組み込み型のどちらかの
型の組み換えベクターで形質転換され得るのでなくては
ならない。これによって問題にしている遺伝子に関して
所望のDNA配列の組み込みを可能にする。また、所望の
反応容器から遺伝子産物の希望量を分離するのに十分な
細胞塊を供給するのに適当な容量だけの、高密度細胞増
殖もできるのでなければならない。その場合、反応容器
中では、理想的には増殖は栄養方式、撹拌、酸素転移お
よび温度を含むいくつかのパラメータで容易に制御され
るだろう。さらにまた、培地の操作、温度あるいはある
種の化学物質の添加ないし消費によってタンパク合成の
発現を誘導できることが望ましい。最後に、適した宿主
であるためには、酵母はできれば全細胞タンパク質の１
％以上、組み換えタンパク質を生成することができなけ
ればならない。これによって望みの組み換えタンパク質
をより容易に分離することができる。
S.Cerevisiaeに関して、使われる可能性のある半数体
株は以下のものを含む： 現在までのところ、GSY112,GSY113およびRSY334株が最
良のヘモグロビンプロデュサーとされている。reg1−50
1突然変異をもつRSY334ような株は、ガラクトース誘導
からのグルコース発現とカップルしないで、グルコース
の存在下でガラクトースのより低い濃度で誘導させるの
でとくに重要である。この株は胆汁変異をもっているの
でガラクトースを代謝できず、そのためガラクトース濃
度が一定のままで誘導物質として作用しつづける。
上述の適合株あるいは類似の適合株のどれでもその交
叉から作られた２倍体株もまた、半数体株よりも早い成
長速度をもつ傾向があるので有用である。
たとえば、α（あるいはdi−α）およびβグロビンを
同時発現するつぎの二倍体は次の例中に記載されてい
る： BJY350［pGS4988］×RSY330［pGS4688］ BJY3505［pGS4988］×BJY1991［pGS4688］ 本発明を実施するには他の交配も同じように用いても
よい。
プロテアーゼ欠失株の使用もまた有利である。
酵母の発現系は二つの主要なカテゴリーに分けること
ができる。それらは（１）タンパク質を分泌するよう設
計された系および（２）タンパク質の細胞質発現のため
に設計された系である。分泌系の有利はつぎの通りであ
る。
（１）タンパク質はしばしば全細胞抽出物からよりも
培養培地から精製する方が容易である。
（２）もしタンパク質が必須のジスルフィド結合をも
っっていれば、タンパク質が分泌系路を通過するときそ
の結合はよりでき易い。これは部分的には小胞体中のタ
ンパク質ジスルフィドイソメラセーゼの存在と、細胞質
中よりもより還元度の少ない環境によると考えられる。
（３）もしも一番目のアミノ酸（開始メチオニンのあ
と）がメチオニルアミノペプチダーゼであまりよくプロ
セスされないジペプチド配列を作るならば、分泌はこの
場合も有利になりうる。分泌性シグナル配列を添加すれ
ば、分泌中にシグナルペプチダーゼによるプロセッシン
グを可能にし、その結果タンパク質のアミノ末端にもと
もとのアミノ酸をもつタンパク質が得られる。
分泌系の不利はつぎの通りである： （１）一般に、発現レベルが細胞質発現によって得ら
れるそれよりもはるかに低い。これは部分的には分泌に
おける律連段階のためである。
（２）すべてのタンパク質が分泌されるわけではな
い。
（３）しばしば、とくにS.Cerevisiaeで、タンパク質
のミスプロセスした形が蓄積し、これらは正しくプロセ
スされた形から精製分離するのが難しい。
酵母で最も一般に用いられる分泌発現系は酵母α−因
子分泌シグナル配列とα−因子プロモーターである。A.
J.Brake.Yeast Genetic Engineering Eds.P.Barr,A.Bra
ke,and P.Valenzuela.Butterworth Publishing,Boston
1989参照。種々のプロモーターにカップルしたインベル
ターゼシグナル配列もまた酵母中の異種タンパク質を発
現するのに用いられる。G.Stetler et al.,Biotechnolo
gy,7:55−60（1989）,R.Smith et al.,Science,229:121
9−1229（1985）． 細胞質発現の有利はつぎの通りである。
（１）発現レベルは、全細胞タンパク質の20％以上で
発現される、通常可溶性とされているタンパク質につい
ての報告では十分高くなり得る。
（２）あるタンパク質は効率よく分泌され得ない。
（３）グリコシル化部位を含むタンパク質が酵母から
分泌されるとすれば、酵母にユニークな糖のパターンで
グリコシル化されるであろう。これらは高度に親水性で
あり、翻訳後修飾はタンパク質の表面に存在するので、
これらはタンパク質に抗原性を与えるようである。もし
そのタンパク質が炭水化物（糖）側鎖なしで機能をもつ
なら、酵母−特異的修飾によるよりもむしろ糖側鎖なし
にタンパク質を生成する方が有利かもしれない（Travis
et al.,1985.J Biol Chem 260:4384−4389）． （４）あるタンパク質は細胞質だけに起こるだろうよ
うなその他の特異的修飾、たとえばアミノ末端アセチル
化、脂質による修飾、あるいはヘム取り込みその他いろ
いろの特異的修飾を有する。
現在のところ細胞質発現が好ましい。というのはin v
ivoで酵母細胞はグロビン鎖を一緒に折りたたみ、ヘム
を取り込んでヘモグロビンを生成するからである。しか
しながら、αとβグロビン鎖を別々に発現して分泌し、
それらがin vivoで会合してヘモグロビンを作ることは
可能である。
グロビン遺伝子は適当なプロモーターの制御下におか
れなければならない。通常用いられる酵母プロモーター
は一般に二つの広いカテゴリーに分けられる：それは制
御されたものと構成的［constitutive］なものである。
広く用いられる構成プロモーターにはGAP,PGK（フォス
フォグリセレートカイネース）とα−因子プロモーター
がある。制御プロモーターもまた用いられており、これ
らとしては酵母メタロチオネインプロモーター（銅で制
御）、Gall−10プロモーター、GAL7プロモーター（ガラ
クトースとグルコースで制御）、ADH IIプロモーター
（エタノールとグルコースで制御）、PH05プロモーター
（燐制御）およびPH05−GAP,GAL−PGK,ADH II−GAR,GAL
−CYCIのようないくつかのハイブリッドプロモーターが
ある。
プラスミドの安定性のためには制御プロモーターを用
いることが重要である。組換えタンパク質の発現が高レ
ベルで起こると、しばしば宿主生体の増殖を阻害する。
この不利は結果として、存在するプラスミドのわずかの
コピーをもった細胞が集団中に蓄積することを可能に
し、増延速度の減少、そして全体としての発現レベルの
低下をもたらすことになる。遺伝子を抑制状態に保持
し、醗酵の後期に誘導することによって速い増殖速度が
保持され、高いプラスミドコピー数を妨げるような選択
を避けることができる。
酵母プロモーターの相対強度に関する正確なデータを
得るのはいくらか難しい。というのは、これを眞に測定
する唯一の方法はmRNA合成の速度論にもとづいているだ
ろうからである。現存するデータの大部分は得られた最
終のタンパク濃度だけを測定している。タンパク質の安
定性は互いに大きく違うので、同じベクター上に複数の
プロモーターをもつ同じタンパク質とmRNAを比べる必要
がある。これにアプローチする研究はVerbakelet al.
（Gene,61:207−215（1987））によってなされた。かれ
らはGAPDH,CYC1,GAL7,PHO5,およびPGKプロモーターを比
較し、β−ガラクトシダーゼ／ポリオウイルスVP2タン
パク質融合体の発現を測定した。CYC1は全細胞タンパク
質の0.14％の発現レベルであり、GAPDH,0.22％TCP;PH0
5,0.26％TCP;PGK,0.9％TCP;およびGAL7,0.96％TCPであ
った。
われわれはGALGAPハイブリッドプロモーターを用い
て、ヘモグロビンの発現レベルについて全細胞タンパク
質の≧15％を得た。これはおそらく大半は非常に安定な
タンパク質産物に沿ってプロモーター強度が増大したこ
とと、mRNAの半減期が長くなったことによると思われ
る。
GAL−GAPハイブリッドプロモータを使用することが好
ましい。両要素（GALUASとGAP転写開始部位）はよくわ
かっている。GALレギュロンの転写制御の機構に関する
研究は広く展開されてきた。ガラクトースレギュロンは
ガラクトースの利用に必要な酵素をコードする５つの遺
伝子を含んでいる。これら遺伝子のうちの４つ（GAL1,G
AL7,GAL10およびGAL2）はガラクトースの存在下のみで
発現する。酵母株がREG1遺伝子中に突然変異をもたない
限り、グルコースの存在下ではガラクトース誘導は起こ
らない。GAL1,7,10および２遺伝子は少なくとも２つの
他の遺伝子、GAL80とGAL4によって制御されている。GAL
4遺伝子はGAL1,7,10および２上流活性化因子配列（UAS
GAL）からのmRNA合成を活性化する転写活性化因子タン
パク質である。GAL4は構成的に発現されるけれども、ガ
ラクトースが存在しないと機能的に作用しない。GAL4活
性の抑制は、ガラクトースのないときはGAL80遺伝子の
産物によって保持される。GAL80タンパク質は転写活性
化を妨害するために明らかにGAL4と物理的に相互作用す
る。おそらく、ガラクトースあるいはその誘導体はGAL4
介在誘導を行わせるためにこの相互作用を妨害する。
S.Cerevisiaeの半数体株は酵素グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロナーゼ（GAP）をコードする三つの
異なる遺伝子をもっている。これらの遺伝子はTDH1,TDH
2およびTDH3と名づけられ、それぞれが半数体ゲノムあ
たり１個のコピーをもっている。TDH3遺伝子は細胞のGA
P酵素の約60％を生成し、TDH1と２はそれぞれ約12％と2
8％を生成する（McAllister,L and M.J.Holland,1985.
J,Biol Chem,260:15019−15027）.Hollandのグループ
（Holland et al.1981.J.Biol Chem,256:1385−1395;お
よびHolland et al.1983.J.Biol Chem 258:5291−529
9）はS.Cerevisiaeの３つのGAP遺伝子をクローン化し、
特定した。これらのクローンはPGAP11,PGAP63およびPGA
P491と命名された。PGAP491はTDH3遺伝子に対応し、そ
れゆえ最もよく発現する。このプロモーターは以下のも
のを含む酵母中で広く各種タンパク質を発現するのに用
いられている。
タンパク質 参照番号 αインターフェロン （１） HB抗原［hepatitis B antigen］ （１） タウマチン （２） HB抗原 （３） HIV III逆転写酵素 （４） ヒトSOC （５） α１抗プロテアーゼ （６） （１）Bitter,G.and K.M.Eagan.1984.Gene,32.263−27
4. （２）Edens,L.et al.1984.Cell,37:629−633. （３）Kitano,K.et al.1987.Biotechnology 5:281−28
3. （４）Hallewell,R.A.et al.1987.Biotechnology 5:363
−366. （５）Barr,P.J.et al.1987.Biotechnology 5:486−48
9. （６）Travis,J.et al.1985.J Biol Chem 260:4384−43
89. このプロモーターは一般に600−850bpフラグメントと
して用いられており、本質的に制御はうけない。長い形
のときにこれは非常に強力なプロモーターである。われ
われが用いている形は翻訳開始部位のわずか〜200bp
5′から成っている。エンハンサー配列を加えないこの
形は、より長い形のプロモーターよりは実質的に活性は
小さい（Edens,L.et.al.Cell,37:629（1984））.GALハ
ンサー領域を加えると制御と高レベルの発現の両方が付
与される。GAP491プロモーターのみではαとβグロビン
が全細胞タンパク質の0.2％以下のレベルでしか生成し
ない;GAL−GAP491ハイブリッドプロモーターでは発現が
全細胞タンパク質の７−10％に上昇した。
次のような他のいくつかのハイブリッドプロモーター
はとくに興味があるものである。
GAL−SIGMA σ転写スタート部位を有する強力なガラクトース制御
プロモーター。
SIGMA−GAP GAP491転写スタート部位を有する強力なペプチドホル
モン制御プロモーター。
GAL−EF III 延長因子III転写スタート部位を有する強力なガラク
トース制御プロモーター。
SIGMA−EF III 延長因子III転写スタート部位を有する強力なペプチ
ドホルモン制御プロモーター。
以上のほかにも作動するようなプロモーター系は容易
に考えることができる。それは種々の構成プロモーター
を含むが、それに限定されるわけではない。たとえば、
酵母交配因子α（MFα）プロモーターあるいは交配因子
ａプロモーターMF（ａ）、フォスホグリセレートキナー
ゼプロモーター（PGK）、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキ
ナーゼ２、グルコキナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリ
オーズリン酸イソメラーゼ、リン酸グリセレートイソメ
ラーゼ、リン酸グリセレートムターゼ、リン酸フラクト
ースキナーゼあるいはアルドラーゼプロモーターはすべ
て使用できるだろう。つまり、よく発現する酵母プロモ
ーターはどんなものでも、酵母中でヘモグロビンの発現
に関して作動するだろう。広い範囲の天然の、制御プロ
モーターもまた使用することができる：たとえばGAL1−
10,GAL7,PH05,ADH IIはすべて酵母中での異種タンパク
質の生成に使用されている。GAL−PGK,GAL−MFα−1,GA
L−MFa1,GAL−SIGMAのような種々の合成ないし半合成酵
母プロモーターもまた使用することができる。ADH II制
御配列もまた種々のプロモーターから導かれた強い転写
開始部位とカップルすることができる。PH05制御配列あ
るいはσエレメント制御配列もまた強力なハイブリッド
プロモーターを構成するのに用いられる。酵母プロモー
ターに加えて、T7プロモーターのような強力な原核プロ
モーターを用いることも考えられる。この場合、しっか
り制御された酵母プロモーターのコントロールのものと
でT7ポリメラーゼを置くこともできる。T7プロモーター
の制御下でヘモグロビン遺伝子を有する酵母細胞中での
ファージポリメラーゼの誘導は、この非常に効率のよい
ファージポリメラーゼによって遺伝子の転写を可能にす
るだろう。
上述の酵母制御配列の大部分は、転写の正調節子であ
るタンパク質に対する標的として働くので、たくさんの
コピー中に標的配列が存在するような状況でこれらのタ
ンパク質は転写を制限するだろうということが考えられ
る。このような状況は細胞あたり200コピー以上存在す
るPC1B,PCIT,PC1UあるいはPCINのようなベクターによっ
て得られるだろう。正調節子（たとえばGAL4）の過剰発
現によって発現が増強されるだろう。GAL4遺伝子がそれ
のプロモーターを取り除くように変えられた株を作るこ
とは可能であり、この取り除かれたGAL4プロモーターの
代わりに、それよりもより効率よく転写するGAL7あるい
はGAL1−10プロモーターで置き換えられる。この状況の
中で、正の転写活性化因子タンパク質GAL4は、ヘモグロ
ビン発現が誘導されたときに高められたレベルで発現さ
れるだろう。
より高い真核リボソーム結合部位に関するコンセンサ
ス配列はKozackにより（Cell,44:283−292（1986））G
AA GCCAUGGと定められている。この配列からの偏位、と
くに−３位置（ＡあるいはＧ）での偏位は特別のmRNAの
翻訳に大きな影響を及ぼす。事実上、すべての高発現哺
乳動物遺伝子はこの配列を用いている。他方、高発現酵
母mRNAはこの配列と異なっており、その代わりに配列AA
AAAUGU（C:ganand Donahue,Gene,59:1−18（1987））を
用いている。αとβグロビンの発現のためにわれわれが
用いているリボソーム結合部位はより高い眞菌リボソー
ム結合部位に対応する。このRBSを組織的に変えて、酵
母のRBSによりよく似るようにしたときのその変化の影
響をしらべることは当発明の計画の範囲内である。しか
しながら、一般に、−2,−１および＋３位置での変更
は、酵母、哺乳動物ともに翻訳の効率に僅かしか影響し
ないことが見出されている。
S.Cerevisiae中の遺伝子の細胞内発現は主としてその
遺伝子に関連したプロモーターの強度、プラスミドコピ
ー数（プラスミドのもつ遺伝子のための）、転写ターミ
ネーター、宿主株およびその遺伝子のコドンプレファレ
ンスパターンによって影響される。遺伝子産物の分泌を
望む場合、分泌リーダー配列が重要になる。重複コピー
プラスミドにより、分泌効率は強力なプロモーター構成
によって低下させられるだろうということを知るべきで
ある。Ernst,DNA5:483−491（1986）． 種々の染色体外複製ベクター（プラスミド）がトラン
スフォーム酵母細胞のために利用されている。最も有用
な重複コピー染色体外酵母ベクターは、大腸菌プラスミ
ドと結合した全長２μ−サークルを用いるシャトルベク
ターである。これらのベクターは、適当な酵母変異体中
にプラスミドを保持することのできる遺伝子や大腸菌中
での選択を可能にする抗生物質抵抗マーカーをもってい
る。部分的な２μ配列だけを含むベクターに比べて、全
長２μ−サークルを用いると、内因性の２μプラスミド
がよく保存されている酵母株でとくに、一般的にぐんと
高いプラスミド安定性が得られる。ここで述べたPCシリ
ーズのベクターはこの型のものである。
GALGAPヘモグロビン発現カセットを、酵母組み込みベ
クターを用いることによって染色体中に組み込むような
やり方で株を作り上げることもできる。ヘモグロビン遺
伝子のコピー数はプラスミドベクターに対するよりは低
いだろうが、それらは十分安定で宿主細胞中で保持され
るような選択はおそらく必要ないであろう。酵母組込み
ベクターはYip5（Struh1,et al,PNAS,76:1035−39,198
9）,Yip1（Id.）とPGT6（Tchumper and Carbon,Gene,1
0:157−166,1980）を含む。これらおよびその他の酵母
ベクターに関する情報に関してはPouwels,et al.,Croni
ng Vecter,VI−I,et seq.（Elsevier,1985）参照。
αおよびβグロビン遺伝子は別々のプラスミドオによ
って導入されてもよく、あるいは同じプラスミドによっ
てもよい。ダブルプラスミド系に対するシングルプラス
ミド系の有利さは理論的なものである。細胞あたりのプ
ラスミドコピーの総数には上限があると一般に考えられ
ている。たとえば、もしそれが1000だとすれば、二つの
プラスミド系はα鎖プラスミドのコピー、β鎖プラスミ
ドのコピーそれぞれわずかに500しか持ち得ない。細胞
あたり1000コピーのシングルプラスミドは、それぞれα
鎖とβ鎖遺伝子の1000コピーをもつだろう。しかし、も
し、他の因子が制限されていれば、コピー数は無関係に
なるだろう。実際、いくつかのグループは種々の染色体
座位に組込まれた遺伝子を有する株を好んで用いてい
る。このような株は外来遺伝子を非常に安定に保持し、
プラスミドの選択を保持するための特別の培地を必要と
しない。
高度に発現された酵母遺伝子は非常に高いコドンバイ
アスを示す。たとえば、グリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼとADH−１をコードする遺伝子は25
コドンの組について90％のバイアスを示す。高度に発現
された酵母遺伝子（全mRNAの１％以上）は0.90以上の酵
母コドンバイアス指数を有する。中等度に発現された遺
伝子（全mRNAの0.1〜0.05％）は0.6〜0.8のバイアス指
数を有し、低レベルで発現した遺伝子（全細胞タンパク
質の0.05％以上）のコドンバイアスは0.10〜0.50である
（Bennetzen and Hall,J.Biol.Chem.,257:3026−3031
（1982）．ヒトα−グロビンcDNAのコドンについての計
算値は0.23である。同様の値がβグロビンcDNAについて
も計算できる。一般に使用されている大部分のコドンの
間には非常に高い相関があるので、酵母中のヒトcDNAか
らのヘモグロビンの発現は適当なtRNA分子を入手できる
かどうかで制限をうけるだろう。もしそうであれば、最
高に好ましい酵母コドンを用いての遺伝子の完全合成に
よって発現レベルを改善できるだろう。tRNAが少ないこ
とで代表されるcDNA中で用いられるコドンが豊富にあれ
ば、有害コドン使用の最大のネガティヴ効果になるだろ
うということは十分にありうることである。このような
場合、ヘモグロビンの高レベル発現はｔ−RNA分子のそ
のプールを完全に排出することができ、それによってヘ
モグロビンだけでなく、たまたまその同じコドンを用い
ている酵母タンパク質の翻訳も低下させることになる。
αグロビンヒトcDNAの場合には、最もよく用いられるロ
イシンコドンはCTG（21のうち14）であるが、このコド
ンは高度に発現された酵母遺伝子中では決して用いられ
ない（Guthrieand Abelson,The Molecular Biology of
the Yeast Saccharomyces,Eds.Strate−rn,Jones and B
roach,1982.Cold Spring Harbor,NY）．グロビンcDNA中
にコドンバイアス指数が低いことと、稀少酵母コドンが
存在することは、われわれにとって、好ましい酵母コド
ンを用いてα及びβグロビン遺伝子の少し変えた形を合
成することへの十分な刺激になっている。
“Di−α”および“di−β”ヘモグロビン ある実施例の中で本発明はさらに以下のことを企図し
ている。（ａ）di−αグロビン様ポリペプチドの１分子
とβグロビン様ポリペプチドの２分子をアッセンブリさ
せて“di−α”ヘモグロビン様タンパク質をつくる；
（ｂ）αグロビン様ポリペプチドの２分子とdi−βグロ
ビン様ポリペプチドの１分子をアッセンブリさせて“di
−β”ヘモグロビン様タンパク質を作る；あるいは
（ｃ）di−αグロビン様ポリペプチドの１分子とdi−β
グロビン様ポリペプチドの１分子をアッセンブリさせて
“di−α/di−β”ヘモグロビン様タンパク質をつく
る。
さらに、δ，γおよびε鎖がβ鎖とかなりな相同性を
有すること、またζ鎖はα鎖とかなり相同性を有するこ
とは注目すべきである。それゆえ、di−δ,di−γ,di−
εおよびdi−ζポリペプチドは本発明の範囲内にあり、
Hgb A1以外の新しいタイプのヘモグロビンの調製に用い
られるだろう。
Di−αリンカー（もし一つが使われるなら）は、同じ
でもよく、あるいは異なってもよい１個から３個のアミ
ノ酸から成るのがよい。Mono−Glyリンカーはとくに好
ましい。このようなリンカーを指定するにあたっては、
二つのサブユニットを意のままに結びつけ、それらをシ
ングルdi−αグロビンポリペプチドの領域内に形質転換
するような１個あるいはそれ以上のアミノ酸を用いるこ
とが望ましいことを認識するのが重要である。
“di−β”特異体の調整もまた企画されている。デオ
キシ構造では１つのβサブユニットのＮ末端と他のβサ
ブユニットのＣ末端は18.4Åであり、オキシ型では5.2
Åである。Di−βリンカーは、同じかあるいは異なる４
個から９個のアミノ酸から成るのが好ましい。
リンカーはαヘリックスやβシートのような２次構造
を作らないものでなければならない。ある種のアミノ酸
はこのような構造をつくる傾向が大きい。引用文献に含
めたChou and Fasman,Biochemistry,13:222−245（197
4）参照。下にアミノ酸を２次構造への参加が減少する
順番に列べた。好ましいリンカーは面と面を相対して結
びつけるものである。この目的のために最も適したアミ
ノ酸はグリシンである。最も好ましいdi−αリンカーは
GlyかGly−Glyである。
（文字記号は以下の通り。Ｈα，強力なα生成体;hα，
α生成体;Iα，弱いα生成体;iα，αに無関係;bα，α
ブレーカー；βα，強力なαブレーカー。β記号もこれ
に同じ。Trpは、もしβシート領域のＣ末端の近くにあ
ればｂβである。） ポリペプチド鎖αヘリックスは１ターンあたり平均3.
6個の残基から成る。球状タンパク質では、11残基つま
り３ヘリックスターンに対応して平均約17Åである。α
およびβグロビンでは、ヘリックスの長さの範囲は７個
から21個のアミノ酸（A.A.）である。βプリーツシート
は１ターンあたり2.3個の残基から成る；平均の長さは
約20Å、つまり６残基である。
ChouとFasmanはαヘリックス核を、４個のヘリックス
生成体と１個よりは多くないヘリックスブレーカーを含
むヘキサペプチドと定義し、βシート核を、３個のβシ
ート生成残基と１個よりは多くないシートブレーカーを
含むペンタペプチドと定義した。
Di−αリンカーの付近におけるアミノ酸配列はつぎの
通りである。
Di−αリンカーはできれば僅か１−３個のアミノ酸が
好ましい。というのは、それはリンカー“ターミニ［te
rmini］”と結合したときだけαヘリックスを生成する
ことができるからである。１個あるいは２個の残基から
なるリンカーは、たとえそれが２次構造をつくる強い傾
向をもっていたとしても、２次構造をこわすArg141やSe
r3の影響のためにαヘリックスやβシート構造をとると
は考えられないからである。もしリンカーが３残基の長
さであれば、それが強力なαヘリックスブレーカーを含
まない限り、１個の強力なαヘリックス生成体を含むこ
とが望ましい。
Di−βリンカー付近のアミノ酸配列はより強い影響を
及ぼすだろう。
Di−βリンカーはより長いので（できれば４〜９個の
アミノ酸）、２次構造を生成しやすい。Val−His−Leu
がαヘリックスをつくり易い傾向があることから、Val
−１の隣りのアミノ酸はαヘリックスブレーカーである
ことが望ましい。より一般的には、リンカーはαヘリッ
クス核やβシート核を含まない（あるいは近くで結合し
ているアミノ酸と協力して作る）ことが望ましい。
もし“ヘリックスブレーキング”アミノ酸と一緒なら
ば、αヘリックス生成の傾向の強いアミノ酸も使用して
よい。同じように、βシート生成は“シート崩壊”アミ
ノ酸によって妨げるだろう。
もちろん、CnouとFasmanのアプローチを用いて２次構
造を予見するのには限界があり、あるリンカーが許容で
きるものかどうかの最終的なテストは、di−αあるいは
di−βヘモグロビンが望むような酸素親和性をもってい
るかどうかである。とくにポリ−アラニンリンカーは、
αヘリックス生成の傾向をもつと思われるにもかかわら
ず、アラニン基はコンパクトであり、それゆえもし２次
構造が生成しなければリンカーは非常に柔軟に違いない
ので、大変有用であろう。
とくに好ましい１つの具体例では、di−αとβグロビ
ン遺伝子が単一のポリシストロンオペロン中に組み合わ
されている。しかしながら、本発明を実施するのにポリ
シストロンオペロンを用いる必要はなく、α（あるいは
di−α）およびβ（あるいはdi−β）グロビン遺伝子
は、別々のプロモーターによって発現されるだろう。そ
してこの場合のプロモーターは同じものか異なるもの、
いずれでもよい。
本発明の好ましい“遺伝的にクロスリンクしたヘモグ
ロビン”はdi−αおよび／またはdi−βグロビンを含む
ものであるが、他のグロビン鎖を遺伝的にクロスリンク
させ、これらをHgb A1（α２β２）以外のヘモグロビン
種の生成に用いてもよい。
好ましい実施例として、請求項への追加を引用文献に
よって取り入れる。すべて引用した文献は、現在あるい
は今後の発明実施に必要な範囲で取り込むものとする。
本明細書中に示唆した方法によってわれわれは以下の
ような成果を得た。
（１）Tacプロモーターから転写された導入シトロン
とMet−Fx−αグロビン遺伝子を含むジシストロンオペ
ロンからの大腸菌中でのMet−Fx−αグロビンの発現
（実施例２）。
（２）同じ方法による大腸菌中でのMet−Fx−βグロ
ビンの発現（実施例２）。
（３）すべて単一のTacプロモーターによって制御さ
れた、導入シストロン、Fx−αグロビン遺伝子、シスト
ロン間配列、２番目の導入シストロンおよびFx−βグロ
ビン遺伝子を含むテトラシストロンオペロンからの、大
腸菌中でのMet−Fx−αグロビンとMet−Fx−βグロビン
の同時発現。αおよびβグロビンは細胞内で会合して機
能性ヘモグロビンになった。FxHgbは酵素的にHgbに変換
した（実施例３）。
（４）βグロビンサブユニットがBeth Israel,Chever
ly,Providence/MSR,Kansasまたはβ67Val→Ile変異を有
するようなFxヘモグロビンの変異体の、上記（３）にお
けるような同時発現（実施例４） （５）Met−αグロビンとMet−βグロビンの上記
（３）におけるような同時発現とMet−Hgb（a.k.a.Des
−Fx−Hgb）への細胞内アッセンブリ（実施例５）。
（６）des−Val−αグロビンとdes−Val−βグロビン
の上記（３）におけるような同時発現（実施例６）。
（７）上記（６）におけるような同時発現。ただしオ
ペロン内でDes−Val−βグロビン遺伝子がDes−Val−α
グロビン遺伝子の前にある場合（実施例６）。
（８）（Des−Val）−α−（Gly−Gly）−αグロビン
とβグロビンの、上記（３）におけるような同時発現と
細胞内でのdi−αHgbへのアッセンブリ（実施例８）。
（９）（Des−Val）−α−（Gly−Gly）−αグロビン
とβグロビンの変異体（Nagai,Arg−Nagai,or Kansas）
の上記（８）におけるような同時発現と変異体di−αHg
bへの細胞内アッセンブリ（実施例９）。
（10）Des−Val−αグロビンとPresbyterian変異を有
するDes−Val−βグロビンの、上記（３）におけるよう
な同時発現と変異体Des−Val Hgbへの細胞内アッセンブ
リ（実施例11）。
（11）（Des−Val）−α−（Gly−Gly）−αグロビン
とPresbyterian変異を有するβグロビンの、上記（８）
におけるような同時発現（実施例11）。
（12）同一プラスミド上での別々のプロモーターから
のdi−αグロビンとβグロビンの発現（実施例12）。
（13）Di−αグロビンと同じオペロンからのβグロビ
ンの２つのコピーの同時発現に関して考案された仮説的
プロトコル（実例13）。
（14）di−βHgbの同時発現に関して考案された仮説
的プロトコル（実施例14）。
（15）同一プラスミド上で別々プロモーターの制御下
でのαグロビンとβグロビンの同時発現に関して考案さ
れた仮説的プロトコル（実施例16）。
（16）異なるプラスミド上で別々のプロモーターの制
御下でのαおよびβグロビンの同時発現に関して考案さ
れた仮説的プロトコル（実施例17）。
（17）S.Cerevisiae中でのαおよびβグロビンの同時
発現（実施例19）。
（18）S.Cerevisiae中でのdi−αおよびβグロビンの
同時発現（実施例23）。
（19）λPL制御下、大腸菌中でのdes−Val−αグロビ
ンとDes−Val−βグロビンの構築。
（20）λPL制御下、大腸菌中でのdes−αグロビンとD
es−Val−βグロビンの同時発現。
（21）S.Cerevisiaeの二倍体株中での別々のプラスミ
ドからのαとβグロビンの同時発現。
（22）S.Cerevisiae中でのdi−αグロビンとPresbyte
rian変異体を有するβグロビンの同時発現。
（23）−Gly−あるいは−Pro−リンカーを有するdi−
αグロビンの発現のためのベクターの調製。
（24）大腸菌中でのdi−αHgbの発現に関する異なる
株ならびに誘導温度の評価。
（25）低親和性Hgb変異体をつくるように会合する、
αおよび変異βグロビンのS.Cerevisiae中での同時発
現。
ヘモグロビンのＮ末端バリンをメチオニンで置換する
と、酸素結合特性に予期しなかった驚くべき変化が観察
された。実例11に示したように、血液から精製したヘモ
グロビンA0のP50値は4.03でＮ＝2.7であった。大腸菌中
で生成したDesFx−Hgbはα鎖とβ鎖のＮ末端にメチオニ
ンを付加していることを除けばA0と同じヘモグロビンで
あるが、これは本質的にA0と同じP50とＮ値をもってい
る（実例７）。すなわち、メチオニンを付加するだけ
で、隣りのバリン残基を変えない限り、酸素結合能には
何の影響もない。他方、各鎖の正常Ｎ末端バリンをメチ
オニンで置換したヘモグロビン、すなわち大腸菌中で生
成したdesVal−hgbについては２倍高いP50値、7.04が観
察された。しかしながら、Ｎで測られる協同性［cooper
ativity］は、この分子については他と同じであった。
同様の比較を、大腸菌中で作られ（実施例11）、クロス
リンクしたα鎖を有するヘモグロビンと、酵母中で作ら
れ、Presbyterian変異を含むヘモグロビンについて行っ
た。大腸菌ヘモグロビンはdes−Valα鎖で構築されてお
り、Ｎ末端は正常のバリンがメチオニンで置換されてい
る。酸素結合能はP50＝33とＮ＝2.4（実施例11）という
特性を持つ。対応する酵母コーディング領域は、正常バ
リンコドンの前方にメチオニンコドンが加わっている。
この開始メチオニンはin vivoでは翻訳後に取り除かれ
るので、精製したヘモグロビンは正常のＮ末端バリンを
もっている。この分子についてはP50＝23から25,N＝2.5
である。こうして、二つの全く異なるケースにおいて、
Ｎ末端バリンをＮ末端メチオニンで置換するとP50値が
増加した。生理条件下では、大腸菌中で精製し、クロス
リンクしたPresbyterianヘモグロビンは、酵母中で生成
し、Ｎ末端が変えられた類似のヘモグロビンよりも、20
〜30％多い酸素を放出するだろうということが期待され
る。
非常に多数の異なるプラスミドが以下に示す実例中に
引用されている。これらのプラスミド間の相互関係をく
っきりさせるためにベクターをまとめて表にしてある
（表100参照）。
実施例1:Fx−αグロビン（pDL II−62m）及びβグロビ
ン（pDL II−10a）発現ベクターの構築実験材料及び方
法 別に特記するもの以外、電気溶離、フェノール／クロ
ロホルム抽出、エタノール（EtOH）沈殿、アルカリ−SD
Sプラスミド精製、アガローズ電気泳動及びDNA組換え操
作等のすべての実験操作は実質的にManiatis et al.,の
方法（Maniatis et al:“Molecular Cloning"Cold Spri
ng Harbor,New York,1982）によった。
用いた略語及び定義は次に示したとおりである： エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA），ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS），ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（PAGE），ジメチルスルホキシド（DMSO），ジチ
オスレイトール（DTT），イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（IPTG）;2xYT倍地（バクトトリプ
トン16g,バクト酵母抽出物10g及びNaCl5gを水10に溶
かす）;SDS−PAGE用緩衝液（0.125Mトリス−塩酸緩衝
液,pH6.8,20％（v/v）グリセリン,2％SDS,2％２−メル
カプトエタノール,0.01％ブロムフェノール含有）；リ
ン酸塩緩衝TB培地（酵母抽出24g,トリプトン12g,グリセ
リン4mL,1M KH2PO4 17mL,1M K2PO4 72mL、水１に溶か
す）；トリス−EDTA緩衝液（TE:10mMトリス緩衝液,pH8.
0,1mM EDTA含有）；トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液（TBE:
0.089Mトリス緩衝液,0.089Mホウ酸,0.002M EDTA含
有）：トリス−酢酸−EDTA緩衝液（TAE:0.04Mトリス緩
衝液,0.04M酢酸,0.001M EDTA含有） タンパク質電気泳動はLaemmli;U.K.の方法（Nature 1
970,227,680〜685）に従い15％SDS−ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて行った。
大腸菌JM109株（大腸菌JM109）のコンピテント細胞の
調整は下記の方法によった。2xYT培地200mLに大腸菌JM1
09株１晩培養液2mLを接種し、37℃で１時間振とう培養
する。培養液をベックマンJS13.1型スウィング バケツ
ローター遠心分離機（Beckman Inst.,Palo Alto,CA）
を用い、6000rpm,4℃で４分間遠心分離して細胞を集
め、次いで45mM MnC12 60mM CaCl2,40mM KOAc,pH6.2,1
5％ショ糖（w/v）,1.3％ RbCl（w/v）及び7.5％グリセ
ロール（v/v）を含む全量50mLの緩衝液に再懸濁させ
る。上記の方法で再び遠心分離を行い、集めた細胞を同
じ緩衝液20mLに再懸濁させ、０℃で30分間培養する。得
られたコンピテント細胞を1mLづつに分け、−80℃に保
存して使用に供する。
別に特記するものを除き、すべての制限酵素分解反応
の操作は試薬製造元推奨の条件に従って行った。又,DNA
濃度は水を対称とし、260nmにおける吸光度（A260）を
測定し、ベアーの法則を適用して求めた。計算に使用し
た比吸光度（E260）はそれぞれ次のとおりである： 合成オリゴヌクレオチド:0.05mL/μg/cm 二本鎖 DNA :0.02mL/μg/cm グロビン遺伝子の合成 各グロビン遺伝子は50〜85個の範囲の長さの塩基対よ
りなる14個のオリゴヌクレオチドを組合わせて合成し
た。そのうちFx−αグロビン遺伝子の合成にはオリゴヌ
クレオチドSJH I−33a−f,SJH I−34−ａ−ｆ及びSJH I
−35a,bを、Fx−βグロビン遺伝子の合成にはSJH I−36
a−f,SJH I−37a−ｆ及びSJH J−38a,bを用いた。グロ
ビン遺伝子の合成に先だち、前記の方法に従い、短鎖負
荷体遺伝子を調整した。オリゴヌクレオチドの合成には
Biosearch社製8000型DNA合成装置を使用し、試薬として
β−シアノホスホルアミダイトを、カラムに1000オング
ストロームCPGカラムを用いた（0.2mM）．（Beaucage,
S.L.and Caruthers,M.H.Tet.Lett.,1981,22,1859〜1862
参照）得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列を図４に
示した。
特に断らない限り、下記の方法によりカラムからオリ
ゴヌクレオチドを開裂、溶離させた：新たに調整した強
アンモニア水（NH4OH）約0.5mLを1mLのシリンジを用い
てカラムに注入し、20分間反応させた後、ガラスバイア
ル（内容積約4mL）に移して発現させる。この操作を２
回繰り返した後、ガラスバイアルの75％以上になるま
で、NH4OHを入れて55℃で１晩加熱する。次いでバイア
ル内容物を凍結乾燥し、H2O 0.1mLに再懸濁させ、A260
を測定して定量を行った。
各オリゴヌクレオチドの200μｇづつを下記の尿素ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて精製した：等
容量の2xロード緩衝液（90％ホルムアミド（v/v）,0.5x
TBE,0.05％（w/v）ブロモフェノールブルー,0.05％キ
シレン シアノール含有）をオリゴヌクレオチドに加
え、95℃で10分間加熱した後、7M尿素及び1xTBEを含む1
0％アクリルアミドゲルにチャージし、800ホルトで約２
時間電気泳動を行う。紫外線を照射して分離したオリゴ
ヌクレオチドのバンドを検出し、アクリルアミドゲルか
らバンドを切り取り,100mMトリス緩衝液、pH7.8及び500
mM NaCl,5mM EDTA緩衝液よりなる溶液3mL中、60℃で１
晩培養する。得られたオリゴヌクレオチドの溶液を下記
の逆相系カラムクロマトグラフィーにより精製する:C18
−セップパックカートリジ（Waters Associates）を100
％メタノール10mL,次いで水10mLを流して洗浄した後、
上記もオリゴヌクレオチド溶液を加え、水20mLを流して
粗い、３×1mLの50mM酢酸トリエチルアンモニウム（pH
7.3）・メタノール混液（1:1）で溶離させる。得られた
精製オリゴヌクレオチド溶液は凍結乾燥後、100％エタ
ノールで洗い、乾燥させる。目的物のオリゴヌクレオチ
ドの定量はA260の測定によった。
合成Fx−β遺伝子の塩基配列（図５に示す）の組立て
は下記の方法によって行った。次のオリゴヌクレオチド
100pmoleをそれぞれ三つのキナーゼ反応に付し、反応液
１にはオリゴヌクレオチドSJH I−36b,c,d,e及びｆを、
反応液２にはSJH I−37a,b,c,d及びｅを、又、反応液３
にはSJH I−37d.f及びSJH I−38aを基質とした。適当な
オリゴヌクレオチドを組合わせた混液を凍結乾燥後、水
16μＬに再懸濁させ、次いで10xキナーゼ緩衝液（0.5M
トリス−塩酸緩衝液,pH7.4及び0.1M MgCl2含有）２μL,
100mM DTT 0.5μＬ及び1.0mM ATTを加える。更にT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（IBI,Inc.,New Haven,CT）１μ
Ｌを加えて反応を開始させ、37℃で１時間インキュベー
トした後、反応液を95℃に10分間加熱してキナーゼを失
活させる。次いで３種類の反応液をあわせ、オリゴヌク
レオチドSJHI−36a及びSJH I−38b 100pmoleづつを加え
る。更に100mMトリス緩衝液pH7.8,100mM MgCl2を含む溶
液を加えた後、オリゴヌクレオチドを65℃で30分間、次
いで37℃で30分間、最後に15℃で１時間インキュベート
してアニーリングを行う。アニーリング後のオリゴヌク
レオチドにATP（1mM,最終濃度）,DTT（10mM,最終濃度）
及びTADNAリガーゼ４μＬ（20 U）（IBI,New Haven,C
T）を加え、15℃で１時間培養してリガーゼ反応を起こ
させる。この反応液の１部を用いて直接M13mp19へのク
ローンを行う（下記参照）。
Fx−αグロビンの合成に用いるオリゴヌクレオチドは
上記と同様に操作して精製し、キナーゼ反応、アニーリ
ング並びにリガーゼ反応に付した。M13mp19へのリゲー
ションを行う前にFx−αグロビン遺伝子をManiatisらの
方法に従い、0.8％アガローズを含む1xTAE緩衝液中で電
気泳動を、次いで0.5xTBEを電気溶離緩衝液に用いて透
析チューブ中で電気溶離を行って精製した。溶離したDN
Aをフェノールで抽出し、EtOHで沈澱させた後、TE緩衝
液20μＬに再懸濁させ、その１部をM13mp19へのクロー
ニングに供した。
ファージベクター クローニングを行うため、Fx−α及びFx−βグロビン
遺伝子塩基配列の2,5又は10倍モル過量を二重切断後、
ゲル精製したM13mp19−RF（New England Biolabs,Inc,B
everly,MD）200ngとを結合させた後、T4リガーゼ2Uを含
むリゲーション緩衝液（IBI,Inc,New Haven,CT）50μＬ
中、15℃で１晩リゲーションを行わせる。その際、Fx−
αグロビンはM13mp19のXma I/Pst I側の部位に、Fx−β
グロビンはPst I/Hind III側の部位にクローン化され
る。
大腸菌JM198株を下記に示した方法を用いてFx−α又
はFx−βグロビン遺伝子を含むM13mp19リゲーション混
液と形質転換させた：大腸菌JM109株のコンピテンス細
胞にDMSO 9μＬを加え、氷上で10分間培養した後、Fx−
α又はFx−βグロビンリゲーション反応液の１部を添加
し、氷上で40分間、次いで42℃で３分間培養を継続し
た。各形質転換反応液にJM109の１晩培養液100μＬを添
加し、更にジメチルホルムアミド中２％（W/V）５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクトピラノシド
50μＬを含む溶液60μＬ及び100mMイソプロピルチオガ
ラクトシド10μＬを加え、更に融解したＢ−トップ寒天
（１中ガラクトトリペプトン10g,NaCl 8g及び寒天6g
を含有）2.5mLを加え、得られた溶液をＢ−ボトム寒天
平板培地（１中ガラクトトリペプトン10g,NaCl8g及び
寒天12g含有）上に注ぎ、37℃で１晩培養した。生じた
無色のプラーク即ち、挿入DNAを含むクローンを寒天平
板培地から移し、2xYT培地を加えて1:100に希釈したJM1
09の１晩培養液1mLに接種した。
バクテリオファージのクローンを37℃で６〜８時間生
育させた後、ミクロ遠沈管中で５分間遠沈して得られた
細胞ペレットをアルカリ−SDS法で処理してM13mp19RFと
し、DNA分解酵素を含まないRNA分解酵素（Sigma,St.Lou
is,MO）20μg/mLを含有するTE緩衝液20μＬに再び懸濁
させた。RF調整液の１部（１〜３μＬ）を適当な制限酵
素分解（上記参照）に付し、0.8％アガローズ電気泳動
ゲルを用いて精製した（上記参照）。
塩基配列決定に使用する試料に供するため、下記の方
法により正しいサイズの挿入部分を含むM13mp19のクロ
ーンを大量に培養して一本鎖ファージDNAの調整を行っ
た。JM109の１晩培養液0.3mLを2xYT培地35mLに接種し、
37℃で１時間培養した後、ファージを含む上清200μＬ
を接種して37℃で６時間培養を続けた。次いでJS 13.1
ロータ遠心分離機を用いて9000rpmで10分間遠心分離し
て上清分画を集め、4M NaCl 5mL及び40％（w/w）ポリエ
チレングリコール6000（4mL）を加えてファージを沈澱
させた後、上記と同じ条件で遠心分離を行い、得られた
ファージペレットをTE緩衝液0.4mLに再懸濁させ、フェ
ノール・クロロホルム・イソアミルアルコール混液（5
0:49:1（v/v））で３回、クロロホルム・イソアミルア
ルコール混液（49:1（v/v））で１回抽出し、次いでエ
タノールを加えて沈澱させた。この様にして得られたDN
AペレットをTE 20μＬに再懸濁させ、分光学的方法によ
り、260nmにおける吸光度A260を測定して定量した。
又、一連の塩基配列決定反応の試料として１回当たり、
このもの１μｇを供した。
塩基配列はSangerのジデオキシ法によった（Sanger.
F.S.et al:Proc.Nat.Acad.Si.USA,1977,74,5463〜536
7）。なお、塩基配列決定の実験にはユニバーサルプラ
イマーM13−20及びM13−40（New England Biolabs,Beve
rly,MA）並びに遺伝子特異性プライマーとしてFx−αグ
ロビンにはα−15′−CGTATGTTCCTGTCTTT−３′及びα
−25′−ACAAACTGCGTGTTGAT−３′をFx−βグロビンに
はβ−15′−GCTGGTTGTTTACCCGT−３′及びβ−25′−A
CCCGGAAAACTTCCGTC−３′を用いた。
発現ベクターpDL II−62m及びpDL II−10a M13mp19ベクターから適当な塩基配列部分を切り出
し、Tacプロモーター（Brosius,J and HO1Y,A:Prac.Na
t.Aced.sci.USA.1984,81,6929〜6933）の存在でpkk−23
3−３発現ベクター（Pharmacia/LKB,Piskataway,NJ）へ
のクローニングを行った。制限酵素EcoR I及びPst Iを
用いてDNA塩基配列コード化αグロビンを切り取り、グ
ロビンを含む断片をゲル精製した後、前記の方法によ
り、EcoR I及びPst Iで二重切断した後、ゲル精製に付
したpkk−233−３へのクローニングを実施した。大腸菌
JM 109株の細胞をアンピシリン（100μg/mL）を含む培
地で生育させたFx−αグロビンの塩基配列部分（pDL II
−62m）（図１）とのリゲーション反応によって形質転
換させた。使用したプラスミドはアルカリ−SDS精製し
た後、前記の方法により制限酵素EcoR I及びPst Iを用
いて分析し、目的とする挿入部分が得られたかどうかを
確かめるため、生成したクローンのスクリーニングを行
った（pDL II−62mを生じる）。同様にしてpkk−233−
３発現へのFx−βグロビン塩基配列部分のクローニング
によってpDL II−10a（図１）を生成させたが制限酵素
分析及びクローニングにはPst I及びHind IIIを用い
た。
実施例2:合成Fx−α及びFx−βグロビン発現の別法 Fx−グロビン遺伝子生成物の発現を評価するため、pD
L II−62m又はpDL II−10aのいずれかと形質転換させた
大腸菌JM109株のクローンをアンピシリン含有（100μg/
mL）TB倍地2mLに接種し、37℃で３〜４時間培養した
後、試料溶液1mLのアリコートを２つ調整した。試料溶
液の１つにIPTG（1mM,最終濃度）を加えて更に３〜４時
間培養を継続し、増殖した細胞を遠心分離して集め、SD
S−PAGE用緩衝液0.5mLに再懸濁させ、85℃で10分間加熱
した。生成した細胞タンパク質の全量を15％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に付し、分子量マーカーと
してヘモグロビンの標品を使用した。
実施例3:オペロン（pDL II−66a）より誘導されるFx−
α及びFx−βグロビン遺伝子生成物のポリシストロン同
時発現並びにFx−ヘモグロビンよりヘモグロビンへの変
換 単一のポリシストロン オペロンからFx−α及びFx−
βグロビンの同時発現を可能とするため、Fx−βグロビ
ンの塩基配列部分pDL II−10aを制限酵素Hind III及びP
st Iを用いて切り出し、ゲル精製後、Pst I/Hind III切
断，ゲル精製pDL II−62mへのリゲーションを行った。
リゲーション及び形質転換反応の条件は前記とおりであ
る。前述したように、各グロビン シストロンは“誘
導”シストロンをもつのでTacプロモーター全体で作動
するオペロンには計４個のシストロンが存在する。それ
ぞれのクローンのFx−α及びFx−βグロビン遺伝子の存
在を確認するため、プラスミドをEcoR I制限酵素分解に
付し、0.8％アガローズゲル電気泳動法により、生じた
断片を分離した。遺伝子の両者（pDL II−66a,図１）を
含むプラスミドからEcoR I酵素分解により、約1.0kbの
断片が生じた。
pDL II−66aを含むクローンをアンピシリン含有（100
μg/mL）TB培地2mL中、37℃で４時間培養し、培養液を1
mLづつのアリコートに分けた。その片方に1mM IPTGを加
え、更に４時間培養を続行した。IPTG添加試料及び未添
加試料の両者から細胞タンパク質を抽出し、SDS−PAGE
電気泳動に付してFx−α及びFx−βグロビンの両者の発
現を視認できた。
遺伝子生成物両者の同時発現によりタンパク質の四量
体、即ち、（Fx−αグロビン）２（Fx−βグロビン）２
を与えるかどうかを調べるため、次の実験を行った。ア
ンピシリン含有（100μg/mL）TB培地2lにFx−α/Fx−β
発現大腸菌クローンの１晩培養液20mLを接種し600nmに
おける吸光度（OD600）が2.1になるまで37℃で培養し、
次いでIPTG（2.5mM,最終濃度）を添加しOD600:3.5とな
るまで培養を続けた。
増殖した細胞（40g）を10,000×ｇで遠心分離して集
め、溶菌緩衝液（50mMトリス−塩酸緩衝液、pH8.0,25％
ショ糖,1mM EDTA含有）80mLに懸濁し、リゾチーム溶液
（濃度：溶菌緩衝液中,18mg/ml）10mLを加え、氷上で30
分間培養した。これに最終濃度がそれぞれ、10mM,1mM及
び10μg/mLになるようにMgCl2,MnCl2及びDNA分解酵素１
（Sigma,St.Louis,MO）を添加して室温で１時間培養し
た後、溶菌液に１％デオキシコール酸、１％ノニデート
ｐ−450,20mMトリス−塩酸緩衝液,pH7.5及び2mM EDTAを
含む溶液を等量加えた。
不溶液異物の微粒子を10,000×ｇで10分間遠沈して除
去した後、上清分画（約200mL）に５分間一酸化炭素を
吹き込み、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0（４）
を用いて透析を行った。細胞を含まない抽出物を更に1
0,000×ｇで10分間遠沈して清澄化し、上清にDE−52（W
hatman,U.K.）20gを加え、pH7.0に調整した後、遠沈し
てイオン交換樹脂を除いた。再びpH6.0とした後、４℃
で10mM Na3PO4 pH6.0を用いて平衡化したMC−セルロー
ズカラムに注入し、２倍量の10mM Na3PO4 pH6.0を流し
てカラムを洗浄し、次いで10mM Na3PO4 pH6.9〜20mM Na
3PO4 pH9.0のリニアーグラジェンド溶離液（全量400m
L）で溶出させた。赤色の分画36〜42をあわせてその一
部をとり、吸収スペクトル測定に供した。400〜650nmの
範囲でスキャンしたところ、カルボキシヘモグロビンに
一致するスペクトルが得られた（図６）。更に試料溶液
の一部につき、ヘモグロビンの標品を分子量マーカーに
用いてSDS−PAGE電気泳動を行い、分子量約15,000及
び、16,200に相当するタンパク質のバンドを検出した。
予期したようにこれらのバンドはヘモグロビンの標品
（αNW:15,100,βMW:15,800）よりやや遅い速度で移動
したが、これは多分Ｘ因子再認識遠基配列にアミノ酸５
個分が延長したためと思われ、本品をFx−ヘモグロビン
と命名した。
Fx−ヘモグロビン（2.0mg）をトリプシン（Sigma,St.
Louis,MO.,10,000単位/mg）2mg,0.1M NaCl及び10mM CaC
l2を含む20mM HEPES pH7.4（3mL）中で酵素分解した
後、生成物をSDS−PAGE電気泳動に付したところ、Fx−
ヘモグロビンから天然ヘモグロビンへの変換が起ったこ
とが確認された。
実施例3A:大腸菌の発現で得られたFx−グロビン生成物
の分布 Fx−αグロビン（プラスミドpDL II−62m）,Fx−βグ
ロビン（プラスミドpDL II−10a）及びFx−ヘモグロビ
ン（プラスミドpDL II−66a）を発現する大腸菌クロー
ンの培養液100mLにその１晩培養液の原液1mLを接種し、
４時間培養した後、最終濃度が1mMになるようにIPTGを
加え、タンパク質の発現を誘起させた。更に３時間培養
を継続し、増殖した菌体を遠沈して集め、秤量後、溶菌
操作に付した。ただし、DNA分解酵素処理を氷上で30分
間行った後,5,000×ｇで10分間遠沈して上清（可溶性タ
ンパク質の分画）を採取し、水を加えて最終容量を2mL
とし、−80℃で凍結保存した。菌体ペレット（不溶性タ
ンパク質又は取り込まれた細胞の分画）は0.5％トリト
ンＸ−100及び1mM EDTAを含む溶液5mLで２回洗浄し、水
2mLに再懸濁して−80℃で凍結保存した。
タンパク質分布の分析はSDS−PAGE及びウェスタンブ
ロット法によった。使用した抗体はウサギヒトヘモグロ
ビンIgGウェスタンブロット法は製造元（Proto Blot We
stern Blot AP System,Promega Corp.,Madison,WI）推
奨の方法に従った。Fx−α及びFx−β発現クローンから
可溶性並びに不溶性タンパク質を含む湿菌体試料60μｇ
をとり、Fx−ヘモグロビンのクローンについては、発現
レベルが大きいので試料量を15μｇとした。
表11に示したように、タンパク質分布はかなり変動し
ており、Fx−αグロビンが可溶性分画のみから検出され
た。一方、Fx−βグロビンは菌体の可溶性分画及び不溶
性分画の両方に認められた。又、それぞれのサブユニッ
トを安定化しているFx−ヘモグロビンは可溶性分画のみ
から検出され、その濃度はそれぞれの発現サブユニット
の2.6倍以上であった。この結果はFx−βグロビンがFx
−αグロビンと共存した場合に限り、可溶性になること
を示唆する。
実施例4:変異Fx−α/Fx−β四量体ヘモグロビン発現ベ
クターの構築及び発現 ヘモグロビン ベス イスラエル:pDL II−10aを制限
酵素Sac IとSpe Iで処理した後、電気泳動溶離法によっ
て単離した。ヘモグロビン ベス イスラエル（β102,
asn→ser）のコドンの変化を適宜含んだオリゴヌクレオ
チドを前記の方法に従って合成し、Sac IとSpe Iとの間
の制限部位を架橋するのに用いた。それぞれのオリゴヌ
クレオチドの精製法及び定量法は前述のとおりである。
得られた相補オリゴヌクレオチドは95℃に10分間加熱し
た後、２時間かけてゆっくりと室温に冷却してアニーリ
ングを行った。アニーリング混合物の一部をとって試料
とし、Sac I/Spe I分解後ゲル精製したプラスミドpDL I
I−10aと当初のFx−α及びFx−βクローニングに用いた
モル比と同じ比率で結合させた。これにT4DNAリガーゼ
（２単位）を加え、室温で１時間培養した後、前述の方
法に従い、大腸菌JM109株と形質転換させた。それぞれ
のクローンを単離し、得られたプラスミドをプライマー
β−１（前記参照）を用いて塩基配列の決定を実施し
た。当該プラスミドの塩基配列決定には、シーケンナー
ゼ キット（United States Biochemical Corp.,Clevel
and,OH）を使用し、メーカー提供の操作法に従った。適
宜突然変異を起こしたβグロビンの塩基配列部分を前述
の方法に準じ、Hind III及びPst Iを用いて切り出し、
ゲル精製した後、pDL II−62へのクローニングを行っ
た。
他のヘモグロビン変異株：ヘモグロビン シェバリー
（β45,phe→ser），ヘモグロビンプロビデンス/MSR
（β82,lys→asp），ヘモグロビンβ67バリン→イソロ
イシン及びヘモグロビン カンサス（β102,asn→thr）
をコード化する合成遺伝子は前述の方法に準じて調節し
た。ただし、Sac II→Bg1 II,Sa II→Spe I,Nco I→Kpn
I及びSac I→Spe I間の制限部位の橋かけを行うオリゴ
ヌクレオチドを使用した（図７）。これらの変異オリゴ
ヌクレオチドの合成、制限酵素分解、ゲル精製及びリゲ
ーションの条件はヘモグロビン ベス イスラエルの場
合と同じである。変異成分を先ずクローン化してプラス
ミドpDL II−10aとし、次いで得られたクローンの塩基
配列決定を行い、変異βグロビン遺伝子をPst I及びHin
d IIIで酵素分解したpDL II−66aとのサブクローン化を
行った。当該プラスミドの塩基配列は前述の方法で決定
し、大腸菌細胞を形質転換させた後、培養、誘導した、
又、変異Fx−ヘモグロビンは実施例３の方法に準じて精
製した。精製後の変異ヘモグロビンの酸素結合力は表９
に示したとおりである。
実施例5:合成メチオニル−α／メチオニル−βヘモグロ
ビンの生成 Des−Fx−α及びdes−Fx−βグロビン遺伝子の構築 我々は既に大腸菌を用いてヘモグロビンの融合四量体
を生成する方法を確立した。ペプチドのＮ−末端を認識
部位とする基質Xa因子DNA塩基配列のコーディングが消
失すればメチオニンを唯一の残基とするＮ−末端を含む
（Fxフリー，“des−Fx"）合成ヘモグロビンが生成す
る。pDL II−62mにEcoR I及びPst Iを作用させてFx−α
グロビン遺伝子を含む塩基配列を切り出し、ゲル精製に
付した。同様にしてpGEM−１（Promega Corp.）をEcoR
I及びPst Iによって直鎖状に変え、前記の方法に従って
Fx−αグロビン遺伝子をプラスミドとリゲーションさせ
た。pGEM−１に含まれるFx−αグロビン遺伝子のクロー
ン（Fx−α pGEM）は精製プラスミドにEcoR I及びPst I
を作用させ、次いでアガーローズ電気泳動分析に付して
確認した。Fx−α pGEM−１はEagIで処理してXa因子を
コーディングする塩基配列を除去した（図５）。天然α
グロビンをコードするDNA塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドはNde I及びEag I（図８）制限酵素に適合する末
端基を使用して合成し、前記の方法に従って精製、アニ
ーリング及びリゲーションを行った。pGEM−des−Fx−
αの塩基配列（pDL II−83a）をT7プロモータープライ
マー（Promega Corp.,Madison,WI）を用いるジデオキシ
塩基配列決定法を用いて確認し、正しい塩基配列含むク
ローンをEcoR I及びPst Iで処理して得られたdes−Fx−
グロビン遺伝子をゲル精製後EcoR I/Pst I分解してゲル
精製を行ったpKK−233−３とクローン化してpDL II−86
cを生成させた後、大腸菌JM109株をリゲーション混液と
形質転換させ、誘導培養液細胞（前記参照）の全タンパ
ク質抽出物を分析して各クローンによるdes−Fx−α発
現を決定した。Fx−αグロビンとは対照的にdes−Fx−
αグロビンはSDS−PAGE上、αグロビンの標品と同じ泳
動挙動を示した。
Des−Fx−βグロビン配列は同様の方法により、pDL I
I−10aからPat I及びHind IIを用いて切り出したFx−β
グロビン遺伝子を使用して調整しゲル精製後、同じ制限
酵素で処理したpGEM−１とリゲーションさせた。次いで
Fx−βグロビン遺伝子を含むpGEM−１プラスミドをNde
I及びSac IIで処理し、ゲル精製に付した後、des−Fx−
βグロビン遺伝子の構築に用いた。目的とする塩基配列
（図20）に対応するオリゴヌクレオチドは上記の方法に
準じて合成し、精製、アニーリングした後、Nde I Sac
IIで切断したpGEM−Fx−βとリゲーションしてpGEM−de
s−Fx−β（pDL III−6f）を生成させた。塩基配列が正
しいことを確認した後、Pst I及びHind IIIで処理してd
es−Fx−β遺伝子を取り出し、ゲル精製後、des−Fx−
αを含むプラスミドpDL III−86cとPst I/Hind III部位
でリゲーションさせた。des−Fx−α並びにdes−Fx−β
グロビン遺伝子の両者を含むクローン（pDL III−13e）
（図９）は精製したプラスミドのEcoR I分解（上記参
照）後、IPTGで誘導させた培養液並びにIPTGを加えてい
ない対照の培養液につきスクリーニングを行ってその発
現を確認した。このようにして得られたdes−Fx−ヘモ
グロビンはSDS−PAGE上、天然のヘモグロビンと同一の
泳動挙動を示した。
メチオニル−ヘモグロビン［Met−Hgb］（des−Fx−ヘ
モグロビン）の特性 組換えメチオニル−ヘモグロビンは天然のヘモグロビ
ンと比較して塩素イオンリン酸塩イオンの存在下（表1
0）若くは水素イオン濃度の変動（図10）の際の反応性
が異なるがこれは両グロビンのＮ−末端に余分のアミノ
酸、メチオニンが存在するためと考えられる。α鎖のＮ
−末端アミノ基は特にリン酸塩イオンによるP50の変化
が大きく、メチオニンの付加によってＮ−末端アミノ基
の空間における立体構あるいは電気状態が変化してこの
ような効果が生じるものと思われる。
イノシトールヘキサホスフェートイオンの存在下のみ
でみられるP50の変化は溶液中のヘモグロビンとは、無
関係である。これは血漿中のモノホスフェート イオン
の濃度がP50を有意に増加させる程高くないからであ
り、しかも血漿中にはイノシトールヘキサホスフェート
は存在しない。P50の増加には血液中のヘモグロビンの
効率的なオフローディングを必要とし、これはヘモグロ
ビンに突然変異を起こさせて酸素への親和性を低下させ
るのが最も効果的である。
塩素イオンの影響によるP50の変化の程度は生理学的
には重要ではないが生化学反応機構の見地から興味がも
たれるもので、溶液中のヘモグロビンの酸素のオフロー
ディング能力とは余り関連性がない。ある種の動物のヘ
モグロビンは特に塩素イオン影響が著しく小さく、この
効果はＮ−末端のアミノ基を介して伝達されるものと考
えられている。メチオニンヘモグロビンでは立体化学的
変化又はメチオニンのpKaがバリンのそれと異なるので
この効果も変化したものであろう。
ヘモグロビンのP50は通常、水素イオン濃度による変
動が最も顕著であり、いわゆる“ボアー効果”の寄与が
一部考えられ、当該αグロビンのＮ−末端基が関与す
る。ヒトの変異グロビンでは多くの場合、ボアー効果が
変動することがみられるが、これは特に生理学的障害を
生じるものではない。このようにボアー効果並びにリン
酸塩及び塩化物効果が小さいことは溶液中におけるヘモ
グロビンの医学的又は生化学的応用の際に利点となる。
ボアー効果については、メチオニルヘモグロビンがより
アルカリ側のpH領域で適用可能なので例えば、組織培養
や臓器潅流等の多くの用途があると考えられる。図10に
予備試験の結果を示したがpH7.8以上の領域においてメ
チオニルヘモグロビンの方がヘモグロビンAoよりもP50
が大きいことが認められ、pHに対してプロットしたP50
の直線の傾きが対応するヘモグロビンのそれよりも小さ
いこと即ち、ボアー効果が小さいことを示唆する。しか
し、その後の研究においてメチオニル ヘモグロビンと
ヘモグロビンAoとの間のボアー効果の差は図10に示した
ものよりは少ない結果が得られた。
P50のpH,塩素イオン及びリン酸塩イオンによる変動が
一定であるヘモグロビン製品を使用する最大の利点は臨
床医にとって酸素オフ ローディング能力に関し投薬条
件を考慮しなくてもよいことが指摘される。
実施例6:天然サイズの合成ヘモグロビン（des−Val−ヘ
モグロビン）の合成 Des−Val−α（pDL II−91f）及びdes−Val−β（pDL
III−1a）の構築 遺伝子中のＮ−末端バリン コドンをATG（メチオニ
ン）コドンで置換したグロビン遺伝子エンコーディング
DNA塩基配列の構築はdes−Fx−クローンの場合と同様、
α及びβ遺伝子に対応してアミノ酸配列“met−leu・・
・”及び“met−his・・・”をエンコードするオリゴヌ
クレオチド（図８）を挿入する方法によった。pGEM−１
中に含まれるdes−Val−α（pDL II−9lf）及びdes−Va
l−βグロビン（pDL II−95a）の遺伝子の塩基配列が正
しいことを確認した後、当該des−Val−α遺伝子をEcoR
I/Pst Iで切断したpkk−233とクローン化してpDL III
−1aを生成させた。次いでpDL II−95a由来のdes−Val
−βグロビン遺伝子をPst I/Hind IIIの制限部位でpDL
III−1aとクローン化した。
Des−Val−αトランスファーベクターは下記のように
して、より特異的にプラスミドpDL II−62mから調製し
た。プラスミドpDL II−62mを制限酵素EcoR I及びPst I
で処理してFx−α−グロビン遺伝子を切り出し、ゲル精
製に付した。同様にプラスミドpGEM−１（Promega Cor
p.）をEcoR I及びPst Iで処理して直鎖化し，ゲル精製
後得られたFx−αグロビン遺伝子を前記の方法に従い，
対応するプラスミドとリゲーションさせた。
その際,pkk−233−３中の余分な制限部位がFx−コー
ディング配列の直接除去を妨害するのでpGEM−１のサブ
クローニングを行う必要がある。pGEM−１中にFx−αグ
ロビン遺伝子を含むクローンは精製プラスミドをEcoR I
及びPst Iで処理した後，アガローズ電気泳動分析を実
施して確認した。Fx−α pGEM−１をNde I及びEag Iで
処理してFx−αコーディングを除き,N−末端バリンをメ
チオニンで置換した天然αグロビンのDNA配列コーデイ
ングをオリゴヌクレオチドをNde I及びEag I制限部位と
適合する末端から合成した。得られたオリゴヌクレオチ
ドは前記の方法に準じ、精製した後、アニーリング及び
リゲーショを行った。pGEM des−Val−α（プラスミドp
DL II−9lf）の配列はT7プライマー（Promega Corp.,Mo
dison,Wisconsin）を用い，ジデオキシ配列決定法によ
って確認した。des−Val−α（pDL II−9lf）の正しい
配列を含むクローンをEcoR I及びPst I処理し，得られ
たdes−Val αグロビン遺伝子をゲル精製後,EcoR I/Pst
I処理，ゲル精製を行ったpkk−233−３とリゲーション
させてプラスミドpDL III−1aを得た。
Des−Val−βグロビン トランスファー ベクターは
同様の方法に従い，プラスミドpDL II−10aのFx−βグ
ロビン遺伝子を用いて調製した。pDL II−10aをPst I及
びHind Iで処理してFx−ベクターを切り出し，得られた
βグロビン配列をゲル精製後，同じ制限酵素で処理した
pGEM−１とリゲーションさせた。Fx−βグロビン遺伝子
を含むpGEMクローンにNde I及びSac IIを作用させた後
ゲル精製に付し,des−Valβグロビン遺伝子の構築に供
した。目的とするdes−Valβ配列をコードするオリゴヌ
クレオチドを合成し精製した後、アニーリングを行って
Nde I及びSac IIで切断したpGEM Fx−βとリゲーション
させてpGEM des−Val−β（プラスミドpDL II−95a）を
調製した。このdes−Val−βグロビンの塩基が正しいこ
とを確認した後,Pst I及びHind IIIで処理して遺伝子を
取り出し，ゲル精製に付した。
pDL III−14c及びpDL III−38b（des−Val−α/des−Va
l−βポリシストロン遺伝子クローン）の調製 Des−Val−αグロビン遺伝子を含むプラスミドpDL II
I1aをPst I及びHind IIIで処理した後精製し，同様な方
法を用いてpDL II−95aからdes−Val−βグロビン遺伝
子を取り出した．リゲーション及び形質転換反応に付し
た後,des−Val−α/des−Val−βグロビン同時発現プラ
スミドpDL III−14cを含むクローンと反応させ,IPTG誘
導法によってdes−Valヘモグロビンを生成させた．得ら
れた生成物はSDS−PAGEを用いて分析を行った。
次いでdes−Val−αグロビン遺伝子とは５′の位置に
あるdes−Val−βグロビン遺伝子を含むプラスミドpDL
III−38bを構築し、分析して確認した。
Des−Val−αグロビン遺伝子を含むプラスミドpDL II
I−1aに制限酵素Sma Iを作用させて直鎖化し，バクテリ
ア由来アルカリホスファターゼで処理して５′−ホスフ
ェート基を除き，フェノール抽出，エタノール沈殿した
後,TE緩衝液に再懸濁させた。des−Val−β遺伝子を含
むpGEM−１クローンをHInd IIIで処理し，フェノール抽
出，エタノール沈殿した後，プラスミドに対して,Hind
III−Sma Iリンカーのモル比が50:1のリゲーション混液
に懸濁させ、Sma Iで処理して５′−及び３′−位の末
端上においてSma I制限部位を含みβグロビン断片をゲ
ル精製した後，直鎖化したプラスミドpDL III−1aを含
有するリゲーション混液に加えてプラスミドpDL III−3
8bを得た。pDL III−14c及びpDL III−38bへのα及びβ
グロビン遺伝子の配向は制限酵素分析によって確認し
た。
大腸菌JM109株の細胞をpDL III−14c又はpDL III−38
bと形質転換させた後，アンピシリン含有2xYT培地中で
生育させ,IPTGを用いてコロニーの誘導を行い，得られ
たクローンにつき,SDS−PAGE及びウェスタンブロット法
を適用し,des−Val−α及びdes−Val−βグロビンポリ
ペプチド生成能を調べた。α→β配向（pDL III−14c）
又はβ→α配向（pDL III−38b）に伴うdes−Val−α又
はdes−Val−βグロブリンの免疫応答性には大差がみら
れなかった。
実施例7:組換えdes−Fx及びdes−Valヘモグロビンの分
析及び機能特性の比較 Des−Fx−ヘモグロビン（dFx−hab）又はdes−Valヘ
モグロビン（dV−hgb）を発現する大腸菌細胞を10の
ファーメンター中,OD600:15を示すまで培養して生育さ
せ，これにIPTG 300μｍを加え,6時間にわたり誘導を行
った。増殖した菌体を遠心分離して集め、次の工程に供
するまで−80℃に保存した。
ヘモグロビンの精製を行うため，菌体約200gをアプロ
チニン200単位/mL及びDNA分解酵素−1 20μg/mLを含む5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（NaPi）,pH 7.0（350mL）
に懸濁させ，リゾチーム1mg/mLを加えて溶菌させた後，
ダイノミルに４回通して粉砕した。次いでベックマンJA
14型ローター式遠心分離機を使用し,10,000rpm,4℃で4
0分間遠心分離して細胞破片を除き，上清分画を10mM Na
Pi,pH 7.0で平衡化したヘモグロビン−結合樹脂に加え1
0M NaOH又は濃リン酸でpH7.0に調整した後,5×30cmクロ
マトカラムに充填した。アプロチニン100単位/mLを含む
10mM NaPi,pH 7.0をカラムベッド容積の2.5倍量流して
カラムを洗浄した後,100単位/mLのアプロチニンを含む2
0mMトリス−塩酸緩衝液でヘモグロビンを溶出させる。
溶出したヘモグロビンを0.2μｍ膜濾過後,20mMトリス−
塩酸緩衝液,pH8.0で平衡化した1.6×10cmモノ−Ｑアニ
オン交換樹脂のカラムに通し,20mMトリス−塩酸緩衝液
中,0〜0.4M NaClの組成のリニア−グラジェント溶離液,
pH 8.0を用いてヘモグロビンを溶出させた。更にもう１
回,1.6×10cmのモノ−Ｓカチオン交換樹脂のカラムに通
し,10mMNaPi,pH7.0〜10mM NaPi,pH8.5,160mM NaCl組成
のリニア−グラジェント溶離液でヘモグロビンを溶出さ
せて精製し，主分画を集めて約100mg/mLの濃度になるま
で濃縮し，試験に供した。
試料溶液につき,0.1M Cl−を含む50mM HEPES,pH7.4
中,25℃でヘモックスアナライザー［Hemox Analyzer］
を用いて試験を行い，組換えヘモグロビンの結合能を評
価した。得られた結果は次に示すとおりである。
試料 P50 Ｎ A0 4.63 2.7 dFX−hgb 3.43 2.6 dV−hgb 7.04 2.8 結果及び考察： １）α及びβグロビン分子のＮ−末端へのメチオニンの
付加により（dFX−hgb）P50値が若干減少するが，協同
性［Cooperativity N］にはあまり影響しない。
２）α及びβグロビンの末端のバリンをメチオニンで置
換すれば（dV−hgb）P50値が増加するが，協同性への影
響は小さい。
実施例8:Des−Val−α／α（diα）グロビン及びdes−V
al−βグロビンの同時発現 di−αグロビン及びβグロビンの同時発現に係るプラ
スミド（pDL III−47a）調製の総括的合成案を下記に述
べる。出発原料として市販のトランスファー ベクタ
ー,M13mp19−RF,pKK223−３及びpGEM−１並びに実施例
中に記載した合成オリゴヌクレオチドを使用する。
先ずプラスミドpDL II−62m及びpDL II−10aの操作工
程について述べる。プラスミドpDL II−62mは“Fx−α
グロビン”遺伝子をTacプロモーターのpKK 223−３下流
へクローニングすることによって得た。又、プラスミド
pDL II−10aは同様な方法で“Fx−βグロビン”を挿入
して調製した。
図14に詳記したように“Fx−αグロビン”オペロンは
２つのシストロンをコードする最初のシストロンはオク
タペプチド“ローダー”を発現するもので第２のシスト
ロンはMet−Ile−Glu−Gly−Argに先行されるαグロビ
ンを発現する。後者の４個のアミノ酸はＸ因子開裂活性
に係る認識部位を構成するものである。なお，同様な方
法を用いて“Fx−βグロビン”を調製した。
ここではＸ因子認識部位を必要としないので，当該遺
伝子材料を操作し，“Fx"コドンを切り出して除去し
た。（この場合,pDL II−62m及びpDL III−10aのFx−α
及びFx−β遺伝子を使用するよりも直接目的とするdi−
αグロビン及びdes−Val−βグロビン遺伝子を合成する
方がより簡便と思われる）。Fx−αグロビン遺伝子カセ
ットを切り出し,pGEM−１にクローン化してpGEM Fx−α
を得，同様にしてpDL II−10aのFx−β遺伝子をpGEM−
１に移してpGEM Fx−βを得た。
認識部位（Fx）−コーテイング配列をpGEM Fx−α及
びpGEM Fx−βから除去すればそれぞれpDL II−91f及び
pDL II−95aが得られる。pDL II−91fのdes−Val−αグ
ロビン遺伝子をpKK−223−３へ再クローン化してpDL II
I−1aを得，本遺伝子をpKK−223−３のTacプロモーター
と連結することができた。pDL II−95aのdes−Val−β
グロビン遺伝子を精製した後,pDL III−1aのdes−Valα
グロビン遺伝子の下流に挿入してポリシストロンαグロ
ビン／βグロビンmRNAをコード化する単一の転写ユニッ
トが得られる（pDL−III−14c参照）。最後に目的とす
るdi−αリンカーコーデイング配列よりなる合成オリゴ
ヌクレオチド及びαグロビン遺伝子の別のコピーをpDL
III−14cに挿入してpDL III−47aを生成させ，そのTac
プロモターによってdi−αグロビン遺伝子及びdes−Val
グロビン遺伝子の転写を制御させる。
pDL III−47a（di−α／βグロビン クローン）の調製 プラスミドpDL II−91fのαグロビン遺伝子の大部分
を含むEag I及びPst I制限酵素切断断片をゲル精製に付
した後，当該αグロビン遺伝子のBstB I部位からそのカ
ルボキシル末端にわたる配列を含む合成DNAリンカー及
び当該αグロビン遺伝子のEag I部位からそのアミノ末
端を含むグリシンリンカーにリゲーションさせる（図1
2）。リゲーション反応液をPst Iで処理した後，生じた
断片をBstB I/Pst I−切断pDL III−14cにクローン化し
てプラスミドpDL III−47a（図13）を生成させた。
Di−α／βヘモグロビンの発現 大腸菌のクローンをウェスタンブロット法を用いて分
析し，βグロビンモノマーと結合させて合成するαグロ
ビンタンパク質四量体の生成に使用した。プラスミドの
構築が至適であることをEcoR Iで処理し，次いで0.8％
アガローズゲル電気泳動に付して確認した．なお,di−
α構成部分に存在するEcoR I切断断片は約1450bpであっ
た。
遺伝子操作でクロスリンクしたヘモグロビンの発現は
IPTG誘導法で行い，生じた組換えヘモグロビンをＳ−セ
ファローズを用いて精製した。大腸菌の細胞（400mL）
をOD600:3.0を示すまで培養した後,1mM IPTGを加えて誘
導し，更に４時間培養を続け，増殖した菌体を遠心分離
して集めた．得られた菌株ペレットを1mMベンズアミジ
ン,1mM EDTA及び0.1％トリトンＸ−100を含む10mMリン
酸ナトリウム溶液に懸濁させ，超音波処した後、15,000
×ｇで15分間遠心分離して得られた上清分画を10mMリン
酸ナトリウム溶液pH 6.0で平衡化したＳ−セファローズ
カラムに通した。10倍量の10mMリン酸ナトリウム溶液pH
6.8でカラムを洗浄した後,di−αヘモグロビンを10mMリ
ン酸ナトリウムpH7.4,30mM NaClで溶出させて精製し
た。得られた試料溶液につき，可視吸光スペクトル分光
法,SDS−PAGE及びウェスタンブロット法によって試験を
行い，ヘモグロビンの生成を確認した。
実施例9:低親和性変異di−αヘモグロビンの調製 組換えdi−αヘモグロビンの酸素に対する親和性を低
下させるため，合成オリゴヌクレオチドを用いてβグロ
ビン ポリペプチドに数回の突然変異を起させる方法を
採用した。これらの変異部分を導入するのに用いた制限
酵素の作用部位を表３に示す。Nagai（βバリン 67→I
1e）及びArg−Nagai（同じく，βバリン67→Arg）変異
部分の挿入に供するため,des−Val−βプラスミドpDL I
I−95aを制限酵素Nco I及びKpn Iで処理した後，ゲル精
製に付した。これらの制限酵素作用部位間の架橋を行う
のに適当なコドンを変化させたオリゴヌクレオチドを合
成し，精製後，アニーリングしてゲル精製プラスミドと
リゲーションさせた。塩基配列が正しいことを確認した
後，当該des−Val−βグロビンの変異遺伝子をPst I及
びHind IIIで切り取り，ゲル精製後プラスミドpDL III
−47aにクローン化した。カンサス変異部分（β Asn10
2→Thr）を含むβグロビン遺伝子をSac I及びSpe I制御
部位を用い，同様な方法で構築した。これらの変異βグ
ロビンに用いる変異コドンを表３の下欄に示す。
実施例10:di−αヘモグロビンの同定酸素結合力 酸素結合力の測定はヘモックスアナライザー（サウザ
ントン，ペンシルバニア）を用い,37℃で行った。測定
に使用したのは50mMビス−トリス緩衝液pH7.4中,0.1m N
aCl及び60μｍヘム当量のdi−αヘモグロビンを含む試
料溶液で120から酸素分圧0.5トルで測定を行った．得ら
れた結果のP50値を表４に示す。
in vivo半減期 α１〜α２間のgly−glyリンカーを含むdi−αヘモグ
ロビン（野生型）を記述の方法に従って調製し,20mM Na
Po4,pH7.4に溶かして濃度95mg/mlの溶液とし，体重388
〜426gの雄性Sprague−Dawleyラットに20〜30秒にわた
り，中央静脈カテーテルを介して点滴注入した。2,30,8
0,90,150,180,210及び240分後採血してヘパリン含有バ
イアル中に入れ，遠心分離して赤血球を除き，得られた
血漿試料につき,540nmにおける吸光度を測定してヘモグ
ロビンの定量を行った。試験結果の評価には均一混合試
料と考えられる２分時点のヘモグロビン濃度との比較か
らヘモグロビン残存率（％）を求めて点滴時間に対して
プロットし，残存率−点滴時間曲線から生物学的半減期
を算出した。クロスリンクしていないdes−Valヘモグロ
ビンについても100mg/mlの濃度の試料溶液につき，血漿
中ヘモグロビンの定量を行い，同じ方法で半減期を求め
た。得られた半減期はdi−αヘモグロビンが205分,des
−Valヘモグロビンは104分であった。
実施例11:野生型des−Valαグロビン及びdi−αグロビ
ンとプレスビテリアン変異を含むdes−Valβグロビンと
の同時発現 図14に示すプラスミドpSGE0.0−E4はプラスミドpKK23
3−３から導かれる他の発現ベクターと比較して下記の
点で異なる。
１）本プラスミドには機能的にテトラサイクリン抵抗
性遺伝子が含まれる。
２）lacリプレッサー タンパク質をコードするlac I
遺伝子がプラスミドに組込まれている．リプレッサータ
ンパク質がIPTGによる誘導が起こるまでTacプロモータ
ーが作動するのを抑制する機能を持つ。このリプレッサ
ー遺伝子がプラスミドに挿入されることによっ内因性la
c遺伝子を持たない大腸菌の細胞配列の形質転換を可能
にする。以上 プレスビテリアン変異を含むdes−Valβグロビン遺伝
子は合成オリゴヌクレオチドの相補塩基対をpSGE0.0−E
4のSac IとSpeとの間の制限部位に挿入して構築した。
Des−vAl−βグロビンのプレスビテリアン変異の組立
てには下記に示したオリゴヌクレオチド（Pres−Ａ及び
Pres−Ｂ）を用いた。
２種の制限酵素を作用させた後、プラスミドをゲル精
製に付して野生型コーデイングDNA断片を除きアニーリ
ングを行ったオリゴヌクレオチドをプラスミドとリゲー
ションさせた。大腸菌JM109株の菌体細胞を形質転換し
た後，クローンを選別してIPTG誘導及びSDS−PAGEによ
ってα及びβグロビン生成能力を調べた。又,di−デオ
キシヌクレオチド塩基決定法を用いてプレスビテリアン
（Presと略記する）変異の存在を確認した。
変異ヘモグロビンの生成，精製及び分析方法について
は前記実施例７に記載したとおりであり，次の結果が得
られた。
試料 P50 Ｎ A0 4.03 2.7 dV−hgb 7.04 2.8 dV−hgb Pres 33.0 2.5 βアスパラギン108をリジンに変換させて生じるプレ
スビタリアン変異により酸素への親和性が10倍程度減少
するが協同性には影響しない。
このプレスビタリアン変異はプラスミドpSGE1.1−E4
（図15）を用いて単一グリシンリンカーを含むdi−αグ
ロビンとも同時発現させることができた。得られた結果
は下記に示すとおりであり，α１のカルボキシル末端と
α２のアミノ末端を連結しても酸素結合力及び協同性に
は影響がみられない。
試料 P50 Ｎ dV−hgb Pres 33.0 2.5 di−α/Pres 33.0 2.4 実施例12:di−αグロビン及びβグロビンの同時発現に
供するプロモーター系の構築 本実施例ではdi−αグロビン遺伝子を１つのプロモー
ターにリンケージさせ，βグロビン遺伝子を別のプロモ
ーターにリンケージさせたが遺伝子の両方とも同じベク
ターに共存するものを用いた。（実施例16及び17参照） TACプロモーターの相補繊維（Syn pTAC）の配列をコ
ードするオリゴヌクレオチド（下記参照）及びその適当
な制限酵素作用部位を含む部分を合成してゲル精製後，
アニーリングを行った。Xbal制限酵素作用部位に相補的
なXba1部位の標品とリゲーションさせる際当該作用部位
を消失させることを意図し，将来SynpTACの操作が容易
になるように期待して実施した。
Syn pTACの塩基配列 プラスミドpDL III−47a（図13）を制限酵素BamHl及びX
balで処理し,Xbal/Hind III間の挿入部分のみを含むβ
グロビン遺伝子（図13a）をゲル精製に付した。
次いでpTacを上記プラスミドにリゲーションさせてプ
ラスミドpDL IV−64aを生成させた後，大腸菌JM 109株
との形質転換反応を行なわせた。形質転換生成物を単離
し,IPTG誘導及びSDS−PAGEによって機能性Tacプロモー
ターの存在を検索した。
プラスミドpDL III−47aを制限酵素Pst I及びHind II
Iで処理した後，ゲル精製に付してβグロビンのコーデ
ィング配列を取り出し、プラスミドpDL IV−64aは同じ
制限酵素で処理してSyn pTAC/βをコードする断片を切
り出してゲル精製に付した。Syn pTAC/β断片をPst I/H
ind III処理したpDL III−47aとのリゲーションによっ
てプラスミドpDL IV−67a（図16）が生じる。得られた
形質転換生成物をIPTG誘導及びSDS−PAGEによってdi−
α及びβの生成能力のスクリーニングを実施した。
Syn pTACのコントロール下にあるdes−Val−βグロビ
ン遺伝子をpDL III−47aの別の部位とリゲーションさせ
る試みがなされた。pDL IV−62aをHind III及びPst Iで
処理してSyn pTAC/βから切り出し，突出した制限部位
にT4ポリメラーゼをつめ，その鈍い末端をpDL III−47a
のPvu II部位にリゲーションさせてプラスミドpJR VI−
54a（図17）を調製し，前述の方法に従い,IGTG誘導及び
SDS−PAGE分析を行った。
本実験結果をSDS−PAGEにより評価したところ，別の
プロモーターでdi−α及びβの発現を制御してもタンパ
ク質の発現を増加させる効果は少なく，同様に別のプロ
モーターのコントロール下にある第２のβグロビン遺伝
子に挿入を行なってもタンパク質の生成能力には余り影
響しないことが判明した。
実施例13:di−α／β発現プラスミドの第２の翻訳カッ
プルβグロビン遺伝子挿入の試み（仮説的方法） プラスミドpDL III−47a（図13）をHind III及びPst
Iで処理し,Hind III/Pst I断片をゲル精製に付する。制
限部位の周囲にT4ポリメラーゼをつめ,Hind III処理
後，再びT4ポリメラーゼをつめ，その鈍い突端にβグロ
ビン遺伝子を連結する（図18）。形質転換反応後，生じ
たクローンを制限酵素で処理し，挿入されたβグロビン
遺伝子の存在と配向を確認した後,IPTG誘導及びSDS−PA
GE分析を行ってdi−α及びβグロビンのタンパク質生成
能力を評価する。
実施例14:di−βグロビン発現の試み（仮説的方法） 上記のdi−αグロビン遺伝子に類似するdi−βグロビ
ン遺伝子は下記の方法で構築することができる。pGem−
１ベクター（プロメガ社製，マジソン，ウイスコンシ
ン）中にdes−Valβグロビン遺伝子を含むプラスミドpD
L II−95aを制限酵素Pst I及びBspM IIで処理し，生じ
る大きな直鎖状のDNA塩基配列を単離してゲル精製に付
する。別にプラスミドpDL II−95aを同様に制限酵素Pst
I及びNhe Iで処理し、小さなPst II、Nhe II間の断片
を切り出してゲル精製する。前記の方法に準じ，β１の
Ｃ末端アミノ酸とβ２のＮ末端アミノ酸を異なる長さの
リンカーペプチド（実施例15参照）で連結した部分を含
むdi−βリンカーをエンコーデイングするオリゴヌクレ
オチドを合成し，ゲル精製後アニーリングを行う。β１
のＣ−末端ヒスチジンとβ２のＮ末端バリンを結んだオ
リゴヌクレオチドが得られるがその塩基配列は次の一般
式で表わされる： 式中“XXX"は２つのβグロビンペプチドを結ぶアミノ酸
を表わす。βグロビンの２つの末端間の間隔はデオキシ
状態で約18なので，“n"は５〜９の範囲にあると考えら
れる。上記の例ではオリゴヌクレオチドの塩基配列がβ
１のヒスチジンのカルボキシル基末端を介してNhe1制限
部位とアミノ酸リンカーを含む異なる長さのコーデイン
グ配列で生じるdi−β即ちβ２のバリンのアミノ末端基
並びにβ２遺伝子中のBspM II制限部位とを架橋する。
Di−βポリペプチドをエンコーデイングするプラスミ
ドの製法は下記のとおりである。未リン酸化di−βリン
カーDNAをNhe I及びBspM IIで処理した制限部位の末端
をPst I/NHe I断片にリゲーションさせ,Pst I部位のリ
ゲーションで生じる二量体に更にPst Iを作用させてPst
I及びBstM II末端のみを含む断片を得る。次いでこれ
らの断片をPst I/BspM II切断プラスミドとサブクロー
ン化を行い，形質転換反応後,di−β構築部分を含むク
ローンをPst I及びHind III制限酵素断片分析で確認す
る。リンカー領域の配列決定後，至適構成部分をdi−α
グロビン遺伝子又はmono−αグロビン遺伝子のいずれか
を含む発現プラスミドとサブクローン化させる。最後に
前述の方法に従い，大腸菌を形質転換させて生成するヘ
モグロビンの定量を行う。
実施例15:突然変異及び選別によるリンカー開発の試み
（仮説的方法） 本実施例ではリンカーエンコーデイングDNA塩基配列
の突然変異と選別により機能性リンカーを得る方法の可
能性について述べる。α１のBstB I部位とα２のEag I
部位との間を架橋するオリゴヌクレオチドを好適とされ
るランダム化Gly−Glyリンカーよりなる６個のヌクレオ
チドを与えるようにして合成する。このようなヌクレオ
チドのランダム化によってオリゴヌクレオチドの混合物
にはすべてのアミノ酸の組合わせよりなるコドンが存在
することになる。生成するオリゴヌクレオチドを精製，
アニーリングした後，前述の方法に従い,di−α／β同
時発現遺伝子の構築に供する。
次に我々が開発した方法により，組換えヘモグロビン
の生成能力の増加を指標としてdi−α／βプラスミドを
含むクローンのスクリーニングを行う。得られた大腸菌
のクローンをニトロセルロース膜フィルターを装着した
1mM IPTG含有2xYT−アンピシリン平板培地を用い,37℃
で１晩培養した後，一酸化炭素を封入したプラスチック
バッグに入れる。大腸菌細胞内に蓄積する組換えヘモグ
ロビンとCOとの化学結合による赤色の着色度を指標にし
て大腸菌コロニーを検索する。
Di−αリンカー中のアミノ酸の組合わせを変えること
によって連結したαグロビン鎖の折りたたみが安定化さ
れるので細胞内の組換えヘモグロビンの生成量が増加す
るのが期待され，大腸菌のクローンの着色度に反映され
る筈である。
ヘモグロビン生成量の高いコロニーを選別した後，ヘ
モグロビンの定量，酸素親和性及び構成タンパク質の安
定性等を検索して至適di−アミノ酸リンカーを決定し、
最後に最も高い収率及び品質のヘモグロビンを与えるリ
ンカーDNAの塩基配列決定を行う。
実施例16:同じプラスミド上の２個の分離したプロモー
ターの調節下にあるα及びβグロビン遺伝子を含むプラ
スミドの合成に関する仮説的のプロトコル 組換えヘモグロビンは、異なるグロビン遺伝子が別個
のプロモーターの調節下にあるような構造から発現され
得ると期待される。この状態から、２種の別個のメッセ
ンジャーRNAを生成できるだろう。１つはα−グロビン
遺伝子を暗号化したジシストロン配列をもつもの、他は
β−グロビン遺伝子を暗号化したジシストロン配列をも
つものである。α及びβの両グロビン遺伝子が同じプラ
スミド上で別個のプロモーターに調節されるような発現
系を構成するために次のプロトコルが最初に用いられる
べきである。des−Val−αグロビン遺伝子を含むプラス
ミドPDL III−1aは、制限酵素Bam HIによって消化さ
れ、細菌のアルカリホスファターゼと反応し、フェノー
ルで抽出、エタノールで沈殿し、TE緩衝液に再懸濁され
るだろう。des−Valβ構造を含むPKK発現プラスミドで
あるpJR IIII 50−ａはそれから制限酵素BamH I及びPvu
Iによって消化され、Ptacプロモーター、des−Valβ配
列、転写終結配列及びアンピシリン耐性遺伝子の一部を
含むプラスミドからのフラグメントが切り出されるだろ
う。このフラグメントのゲル精製につづいてPvu I−Bam
HIリンカーが合成され、挿入片は次に挿入片の５′−
及び３′末端の両方にBamH Iの適合部位を生ずるように
Bam HIによりバックカットされるだろう。この挿入片は
次にBam HIの線状プラスミドpDL III−1aの内にクロー
ン化され、その結果一つのPtacプロモーターに調節され
る翻訳的に連結したdes−Val−βグロビン遺伝子が、分
離したPtacプロモーターに調節される翻訳的に連結した
des−αグロビン遺伝子の３′側に位置づけられるプラ
スミドになる。挿入片を含むβ−グロビンの方向を確認
するために制限酵素マッピングが用いられるだろう。大
腸菌JM−109は、分離Ptac−グロビン構造を含むプラス
ミドにより形質転換され、アンピシリンを含む培地で増
殖してプラスミドを含むクローンは次にIPTGによって誘
導され、des−Val−αグロビン、des−Val−βグロビン
及びdes−Valヘモグロビンの発現がSDS−PAGE分析、抗
ヘモグロビン抗体によるウエスタンブロティング法及び
標準ガスクロマトグラフ法によるdes−Valヘモグロビン
の分離により分析されるだろう。
あるいは、分離プロモーターに調節される分離ベクタ
ー上のDNA配列から両グロビン遺伝子の同時発現を達成
することができる。
実施例17:分離プロモーターの調節の下で異なるベクタ
ー上にα及びβグロビン遺伝子を含むベクターの構成に
関する仮説的のプロトコル Ptacプロモーターの調節下にあるジシストロンローダ
ー遺伝子/des−Valα構造を含むPKK233−３プラスミド
であるpDL III−Iaを含んだ大腸菌クローンは、同じプ
ロモーターの調節下にあり、テトラサイクリンに対する
余分な抗生物質耐性の遺伝子を伴ったジシストロンロー
ダー遺伝子/des−Val−β構造を含むプラスミドにより
形質転換される。これは次の方法で組み立てることがで
きる：プラスミドPJRIV−50aはPtacプロモーターで調節
されるdes−Val−βグロビン遺伝子を含んでいる。この
プラスミドはPvu IIによって切断され、二本鎖末端をも
つ直線状プラスミドを生成する。これはリン酸化リンカ
ーNot Iにより連結されよう（New England BioLabs）。
連結混合物は大腸菌の形質転換に用いられる。プラスミ
ドDNAが作られ、Not I部位を含んだプラスミドは、Not
Iアガロースゲル電気泳動による消化で同定される。こ
のプラスミドは、Ptac:des−Val−βグロビン配列を含
む。抗生物質カナマイシンへの耐性遺伝子は商業的に利
用可能であり（Pharmacia）、両端にEcoR I制限部位を
もっている。末端は、Maniatisらの方法によるT4 DNAポ
リメラーゼの処理で二本鎖末端に変換される。その結果
生じたフラグメントは50倍過剰のリン酸化Not Iリンカ
ーにより連結される（25℃,60分）。連結反応は、EDTA
中0.01Mで、70℃,20分加熱し、エタノールで沈澱させ
る。沈澱したDNAを100μｌのNot I緩衝液に取り、100単
位のNot Iで２時間（37℃）処理する。フラグメントは
アガロースゲル電気泳動で精製される。カナマイシン耐
性遺伝子に適合しNot Iは次にNot I直線状PJRIV−50aに
連結され、カナマイシン耐性をもつPtacに調節されるde
s−Val−βグロビン遺伝子を伴うプラスミドが生成され
る。プラスミドPdl III−1aを含む大腸菌JM−109クロー
ン、アンピシリン耐性をもつPtacの調節下のdes−Valα
グロビンを含むプラスミドは、次に、des−Valβ用の遺
伝子を含むカナマイシン耐性プラスミドにより形質転換
される。そして、クローンは、アンピシリン及びカナマ
イシン両方への耐性用として選別される。他の抗生物質
耐性遺伝子も同様に用いることができる。分離プロモー
ターの調節の下でα及びβのグロビンポリペプチドの発
現は、IPTG誘導、SDS Page及びウエスタンブロッティン
グにより分析される。
若し、プラスミド排除による問題に遭遇した場合は、
大腸菌で分離プラスミドからポリペプチドを発現するの
に用いたPINプラスミドによる同じ計画を用いることが
できる（McNally,et al.,PNAS 85,7270,1988）。
α及びβグロビン遺伝子が、分離した、しかし同じプ
ロモーターの調節下にあるプラスミドを作る際に直面す
るかも知れない一つの潜在的ない問題は、プラスミド上
の同じ配列内、例えばプロモーター領域での相同組換え
の可能性である。これは、重要なDNA配列のセグメント
の欠失をもたらすことになる。従って、例えばPtac及び
Ptrcのようなそれぞれ異なるグロビン遺伝子をもつ異な
った、非相同性のプロモーターあるいは適当な宿主（C
1857を含む）におけるλPLプロモーターを用いることが
望ましい。
実施例18:aPL調節ベクター系におけるdi−αβグロビン
構造の合成と構成 前例で、グロビン遺伝子は、Tacプロモーターの調節
下にあり、α（di−αの）及びβグロビン遺伝子はそれ
ぞれSchonerらにより示されたようにリボソームのロー
ダーシストロンに翻訳的に連結されていた。この例で
は、λPLプロモーター及び異なった翻訳カプラー（下記
参照）が用いられている。
pL発現系は、pTAC系に比較して異なったカプラーをも
っている。翻訳カプラーとして作用するように、２つの
SDと翻訳終止のための暗号配列がＮ蛋白質の暗号配列の
３′末端に加えられた。それにつづくグロビンの暗号配
列はPTAC系で用いられたものと同じである。
Pharmaciaから利用できるPPL−λベクターを用い、大
腸菌菌株N99ci＋及びN4830−１（C 1857）中に遺伝子的
に架橋した四量体のヒトヘモグロビン（野生型）が生成
されるようにプラスミド構造を構成した。これらの細菌
株は、Pharmaciaから得られ、野生型Ci＋リプレッサー
の存在下でのナラジキシン酸（40μg/ml）またはマイト
マイシンＣ（10μg/ml）の添加により、あるいはC1857
リプレッサー遺伝子を含む菌株の熱処理により誘導され
る（Mott,et.ai.,PNAS 82,88,1985及びGottemann,M.E.,
et al.,J.Mol.Biol.140,57,1980）。クローニング計画
のダイヤグラムは図19に示す。
pPL−λベクターからのEag I部位の除去 di−α遺伝子配列のクローニングを可能にするために
は、pPL−λからのEag Iの除去が必要であった。何故な
らば、両方のα構造遺伝子が、暗号配列の中の6bpの位
置にEag I部位をもっているためである。PPL−λベクタ
ーは、Eag I部位によって消化されその末端はT4 DNAポ
リメラーゼを用いて満たされた。BamH Iリンカー（５′
−CCCGATCCGGG−３′）（Pharmacia）は標準法により、
pPL−λプラスミドを消化したEag Iに二本鎖末端が連結
された。これにより、望んだ構造の中でEag I部位が除
かれた。この結果得られた混合物は、Eag I部位をまだ
もっているすべてのプラスミドを除くため、Eag Iによ
り消化された。大腸菌N99CiH細胞は、結果的に生じたプ
ラスミド、pPL−λ−Ｅにより形質転換された。所望の
プラスミドを含むクローンは、制限消化分析法で同定さ
れた。
pPL−λ−Ｅに対する合成共翻訳カプラーの結合 グロビン遺伝子をベクターに挿入する前に、合成した
翻訳カプラー配列をpPL−λ−ＥのHpa I部位に結合させ
ることが必要であった。これは、Hpa IによるPpl−λ−
Ｅの消化と、それに続く、ベクターのHpa I部位に対す
る共翻訳カプラーの二本鎖末端結合により行われた。カ
プラーの二本鎖末端への結合の結果Hpa I部位が破壊さ
れた。結合混合物は、Hpa I部位を含む残りのプラスミ
ドを消化するためHpa Iで処理された。この結果生じた
反応性混合物により大腸菌N99Ci＋細胞が形質転換され
た。正しい方向に共翻訳カプラーを含むクローンである
ことを確認するためEcoR I及びHind III制限消化により
スクリーンニングが行われた。522bp及び4762bpのDNAフ
ラグメントは、所望の方向性をもったプラスミドである
ことが認められた。カプラーの方向を確認するため、結
果として生じたプラスミドはプライマー（５′CAATGGAA
AGCAGCAACC−３′）を用いて、翻訳カプラー配列から上
流の30塩基対配列へ相補的に配列された。所望のプラス
ミドはpPL−λ−Ｅ＋TCと名づけられた。
pPL−λの調節下でのdes−Valα及びβ遺伝子を含む発
現プラスミドの構築 Des−Valα及びβグロビン遺伝子は、PDL III−14cの
Eag I及びHind IIIによる消化とそれに続く、所望の942
bpセグメントのアガロースゲル精製により得られた。
精製したα及びβグロビン遺伝子フラグメントは、Eat
I及びpPL−Lamda−Ｅ＋TCを消化したHind IIIにクロー
ン化された。連結混合物は、大腸菌N99Ci＋の転換に用
いられた。そしてクローンは、EcoR I（4758及び1468 b
p）により、所望のプラスミド、pPL−α／βの存在確認
のためスクリーニングされた。そして、Pst I及びHind
III（4005,1775,520 bp）により所望の制限部位の存在
が確認された。さらに、共翻訳カプラーとdes−Valαグ
ロビン遺伝子間の配列は20 bpプライマーによる配列を
通し、またdes−ValβとpPLベクター間の配列は、第２
プライマー（５′ACCCGGAAAACTTCCGTC−３′）により確
認された。
pPL−λの調節下のdi−α及びβグロビン遺伝子を含む
発現プラスミドの構築 第２αグロビン鎖のアミノ部分の自然配列に単一のグ
リシン残基経由で結合したαグロビンのカルボキシ末端
部分を暗号化するRGVクロスリンカーは、５′CGAAATAAC
GTGGTGTTCTGTCTGC−３′及び３′TTTATGGCACCACAAGACAG
ACGCCGG−５′の５′末端を別々にT4キナーゼでリン酸
化した後アニーリングすることによって作られた。この
二重らせんオリゴヌクレオチドは、前述のように、Eag
IとHind IIIにより消化されたpDL III−14cから作られ
たdes−Valαとβグロビンの精製フラグメントのEag I
末端にクローン化された。この連結で生じた直線状DNA
配列は、BstB IとHind III制限部位配列として粘着性の
末端暗号を含みアガロースゲル電気泳動により精製さ
れ、pPL−α／βを消化したBstB IとHind IIIにクロー
ン化された。pPL−di−α／βと名づけられた新しいプ
ラスミドは、グリシン残基経由で結合したdi−αグロビ
ンを含む配列の上流に共翻訳カプラーのある配列を含
み、すべて単一PLプロモーターの調節下で、βグロビン
遺伝子配列に隣接した共翻訳カプラーがつづいている。
これらのクローンは、Eag I制限消化による小標本のス
クリーニングで同定された。第２αグロンビン遺伝子の
ないクローンは単に消化物を直線状に配置したが、一方
第２遺伝子を含むクローンは、431bpと6222bp DNAフラ
グメントを遊離した。
複製突然変異のROP−起源を含む発現プラスミドpSGEO.1
−L0の構築 pPL−di−α／βは、Pvu IIにより消化され次に粘着
性末端を満たすためにT4 DNAポリメラーゼで処理され
た。直線状のプラスミドは次にNot Iリンカー（Promega
Corp.,Madison,WI）（５′TTGCGGCCAA−３′）でブラ
ント末端が連結された。連結混合物は次いで、Pvu III
部位を含む残りのプラスミドを除去するためPvu IIによ
り処理された。大腸菌は、pSGEO.1−L0によって形質転
換され、ユニークNot I制限部位の存在により正のクロ
ーンが同定された。
λPLプロモーター調節下での大腸菌におけるヘモグロビ
ンSGEO.1の発現 大腸菌N99Ci＋及び大腸菌N4830−１は、pSGEO.1−L0
によって形質転換され、前述のように、アンピシリンを
含む寒天板上で増殖した。これらの大腸菌菌種は、cI＋
リプレッサー遺伝子とc1857熱感受性リプレッサー遺伝
子とをそれぞれ含んでいる。
N99Ci＋の接種は、TB倍地中30℃で、1.0のCD600に増
殖し、ナラデキシン酸（40μg/ml）で誘発された。培養
物を37℃で４〜６時間培養後、細胞を収穫した。ヘモグ
ロビン生成は、全細胞タンパク失のSDS−PAGE分析とウ
エスタンブロット分析で推定された。これらの技術で、
SGE0.1がこの細胞ラインで全細胞タンパク質の、0.02％
生成されることが推定された。ヘモグロビン（57μｇ）
は、モノＱクロマトグラフィで分離され、正常ヘモグロ
ビンの代表的な光学スペクトルをもつことが示された。
N4730−１の接種は、TB倍地中30℃で1.0のOD600に培
養された。そして予め十分に加熱した倍地（65℃）を添
加して接種温度を42℃にあげることにより誘発された。
培養菌は、そこで42℃で４〜６時間培養された。全細胞
タンパク質のSDS−PAGEによる分析でSGE0.1が、ウエッ
ト細胞ペーストのｇ当り0.18mgのタンパク質に相当す
る、全細胞蛋白質の0.4％が合成されることが明らかに
された。2Lのプレパラートから作られたSGE0.1は、他で
述べたように精製された結果7.6mgの精製物質、SGE0.1
（7.6mg）が分離され、P507.08（ヘモックスアナライザ
ーpH7.4、0.1M Nacl,37℃）で、天然ヘモグロビンの代
表的な光学スペクトルを示した。
実施例19:酵母中でのヘモグロビンの生成 精製酵素とDNA修飾酵素はすべて、BRL,New England B
iolabs,IBI,PharmaciaまたはBoerhringer−Mannheimか
ら購入した。使用した酵素の濃度は30分で完全に反応が
生ずると供給者から示唆された濃度で行った。これらの
酵素を用いる際の緩衝液と条件は、特に述べない限り、
酵素により定められていた。プラスミドDNAは、Birnboi
m及びDolyによって述べられたように（Nucleic Acids R
esearch 1979,7:1513−1520），大腸菌DH5αから精製さ
れた。酢酸トリス電気泳動緩衝液を用いてDNAの電気泳
動分析がアガロースゲル中で行われた（Mamiatis et a
l.Molecular Cloning,Cold Spring,Harbor,NY,1982）。
DNAは、0.5μg/mlの臭化エチジウムによりゲルを染色
し、紫外光線にゲルをさらすことによって目に見ること
ができた。DNAフラグメントは、BIO−101から購入した
キットを用いてアガロースゲルから精製した。DNAフラ
グメントは、アクリルアミドゲルからは、目的のDNAを
含んだゲルフラグメントを切り出して、3.25Mの酢酸ア
ンモニウム中に粉砕し、37℃で一晩培養することによっ
て精製した。ゲルフラグメントを遠心分離（12,000×g,
15分）で除き、DNAを95％エタノール２容と５％ウソプ
ロパノールで沈澱させた。沈澱物を真空で乾燥し、0.1
×TE（１×TEは10mMトリス．塩酸pH7.8,1mM Na3 EDTA）
中に溶解した。DNAのアクリルアミドゲル電気泳動を、M
aniatisらが述べたよに（Molelucar Cloning,Cold Spri
ng Harbor,NY,1982）酢酸トリス電気泳動緩衝液中で行
った。細菌増殖培地とDNA転換法については、R.W.Davis
らによって述べられている（Advanced Bacterial Genet
ics,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980,P1
40−141）。直線状または環状DNAによるS.cerevisiaeの
形質転換は、H.Itoら（J.Bacteriology 153:163−168
（1983））が述べたように行った。形質転換細胞はウラ
シルあるいはプラスミド上の選択マーカーに依存するト
リプトファン（SD−ura,SD−Trp）を欠いたSD培地で選
択された（F.Sherman et al.,Methods in Yeast Geneti
cs:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratr
y,1979）。用いられた他のすべての酵母培地はSherman
ら（同書）により述べられている。
ガラクトース調節プロモーターの合成とアッセンブリ この合成プロモーターは、２つの機能部分、調節配列
とメッセンジャーRNAの合成を効率的に開始させる配列
から成る。我々が選んだ調節域の一つは、ガラクトース
の存在下で転写の正の調節を与えるヌクレオチド配列を
含む（M.Johnston and R.Davis,1984.Molecular and Ce
llular Biology 4:1440−1448:L.Guarente et al.,198
2,Proc Nat Acad Sci（USA）79:7410−7414:）。転写開
始部位は、S.cerevisiaeグリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（GAP491）（L.McAlis
ter and M.J.Holland,Biol Chem 260:15019−1527,198
3:J.P.Holland et al.,J.Biol Chem 258:5291−5299,19
83）のコンセンサス配列から引き出せる。
図１に示す合成オリゴヌクレオチドは、Biosearch860
0 DNAシンセサイザーで合成された。それぞれのオリゴ
ヌクレオチドは、28％水酸化アンモニウムによりその支
持カラムから切断された。阻止群は、切断されたオリゴ
ヌクレオチドを28％水酸化アンモニウム中で16時間以上
65℃で培養することにより除去された。すべてのオリゴ
ヌクレオチドは、7Mの尿素を含む10％アクリルアミド
（19:1 アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）の平
板による分離用ポリアクリルアミド電気泳動により精製
された。オリゴヌクレオチドは、50mMの酢酸アンモニウ
ム（PH7.4）2.5mMの酢酸マグネシウム、0.25mMのEDTA及
び0.25％SDS中で37℃、16時間培養することによりアク
リルアミド薄片から溶離した。アクリルアミドフラグメ
ントは、遠心分離により（14,000×g,10分）除去され、
オリゴヌクレオチドは、水溶液層に食塩0.25M及び３容
量の100％エタノールを添加することにより沈澱した。
沈殿したオリゴヌクレオチドを遠心分離（14,000×g,30
分）で集め、80％エタノールで２回,100％エタノールで
１回洗浄し、全ペレットを乾燥した。ペレットを0.1×T
Eに溶解した。２×10-10モル（各々）のオリゴヌクレオ
チド１−５（表５）は、C.066M、トリス塩酸（pH 7.
6）、0.01Mの塩化マグネシウム、0.002Mのジチオトレイ
トール（DTT）、0.001Mスペルミジン及び10単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼの0.02M1中でリン酸化された。
リン酸化反応は、37℃で30分、96℃で５分加熱して終了
した。２×10-10モルのオリゴヌクレオチド１及び６
（表５）は、0.07Mのトリス塩酸（pH7.6）,0.01Mの塩化
マグネシウムの最終容量0.04ml中のリン酸化オリゴヌク
レオチドに添加した。オリゴヌクレオチド１−６（表
５）の混合物は、96℃で５分、75℃で20分、55℃で30
分、37℃で60分、そして25℃で15分加熱された。T4 DNA
リガーゼ（10単位）、DTT（最終濃度0.002M）及びATP
（0.001M）を添加し、混合物を４℃で16時間培養した。
その結果の210bpオリゴヌクレオチドは、Sal I制限エン
ドヌクレアーゼ部位と適合する５′末端と、XbaI部位と
適合する３′末端を含んでいる。何故ならば、完全なオ
リゴヌクレオチドの２つの末端を含むオリゴヌクレオチ
ドはリン酸化されていないので、お互いに連結すること
が出来ない。このオリゴヌクレオチドは、Xba IとSal I
により消化されたベクターpSK＋（Stratagene,Inc.）
（図21（ａ））中にクローン化された。連結化合物は、
pSK（＋）を消化したXba I,Sal Iの50ngを含み、0.01ml
の容量中に5pモルの連結したオリゴヌクレオチドを含ん
でいる。大腸菌DH5αは、連結反応の一部分によって形
質転換され、挿入物を含むクローンは、XGAL（４μg/m
l）を補充したLB−アンピシリン（0.15mg/ml）寒天板上
の白色コロニーのスクリーニングで同定された。これら
の分離物からプラスミドDNAを作り、またXba IとSal I
により消化されることで正の確認がなされた。制限消化
はアガロースゲル電気泳動によって分析され、期待した
大きさ（約250bp）のフラグメントを含むクローンが確
認された。３つのすべてのクローンのDNA配列が決定さ
れ、その内一つをさらに利用するために選んでpGS2488
と名づけた（図21（ａ））。
合成ガラクトース上流活性化因子（GALUAS）配列の組
合せ図６に示すオリゴヌクレオチドは、前述のように合
成され精製された。オリゴヌクレオチド２−５はリン酸
化され、オリゴヌクレオチド１及び６によってアニーリ
ングされてGAPの組合せで述べたように連結された。こ
のプロトコルで生成した全体長さのオリゴヌクレオチド
は、Sph IとSal Iにより生じた制限エンコードヌクレア
ーゼ部位に適合しうる非リン酸化末端を持っている。し
かしながら、オリゴヌクレオチドがSal Iに連結する
際、２つのフラグメント間に結果的に生じた接合部は、
もはや切断しうるSal I部位は含まないだろう。
GALUASはSPHI−Sal Iフラグメント上に含まれる。こ
のフラグメントをpGS2488にクローン化するために、我
々はこのプラスミドのKpn I部位をSph I部位に変える必
要があった。プラスミドpGS2488は、KpnIによる切断で
修飾された。Kpn I消化プラスミドは、50μＭの各デオ
キシリボヌクレオチドトリホスファート（A,G,C,T）、
0.033Mの酢酸トリス（pH7.9）、0.066Mの酢酸カリウ
ム、0.01Mの酢酸マグネシウム、0.5mMのDTT及び100μg/
mlのウシ血清アルブミン（BSA）を含む0.05mlの緩衝液
中で、２単位のT4ポリメラーゼと共に培養された。Na3
EDTAの0.015Mを加え、混合物はフェノールクロロホルム
により1Xが抽出された。DNAがエタノールにより沈澱し
た。乾燥ペレットを、T4 DNAリガーゼ緩衝液0.008ml,50
ngリン酸化SphIリンカー（New England Biolabs）及び1
0単位のT4 DNAリガーゼ中に溶解した。混合物を25℃で
１時間培養し、大腸菌DH5αを形質転換するのに使用し
た、プラスミドDNAは、12の形質転換物質から作られ、
制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動によりSph I部
位の存在とKpn Iの欠損について試験された。これらの
特性をもったプラスミドを含むクローンが同定され、プ
ラスミドはPGS2888と名づけられた（図21（ｂ））。
このハイブリッドプロモーターの組合せにおける次の
行程は、GALUASを含んだSph I−Sal IフラグメントをPG
S2888中にクローン化することであった。PGS2888をSph
IとSal Iによって消化し、フェノールクロロホルムで抽
出し、エタノールで沈澱した。PGS2888を消化したSph
I,Sal Iの50ngが、T4 DNAリガーゼの10単位を含む0.005
ml 1×リガーゼ緩衝液中でアニーリングし、連結したGA
LUAS混合物25ngと共に培養した。連結混合物を一晩４℃
で培養し、一部を大腸菌DH5αの形質転換に用いた。ア
ンピシリン耐性クローンを分離し、プラスミドDNAが作
られた。プラスミドDNA（Xba IとSp Iで消化された）
を、アガロースゲル電気泳動により分析し、期待した大
きさ（約500bp）のフラグメントを含むプラスミドを同
定し、このプラスミドの推定のGALUAS部分の配列が決定
され、プラスミドはPGS4788（図21（ｂ））と名づけら
れた。合成したGALGAPプロモーター（pGGAP）の完全な
配列が図20に示されている。
pGGAP−β−グロビン発現カセットの構築 プラスミドpLC II FX−β−グロビン（K.Nagai,M.Per
utz and C.Payart,Proc Nat Sci（USA）82:7252−725
5）が、ヒトβ−グロビンcDNAの供給源として用いられ
た。β−グロビンcDNAの暗号域は、β−グロビン暗号
（翻訳された）配列の最初の４つのヌクレオチドだけを
失っているApaL1からHind3のフラグメントとして切り出
すことができる。pLcFX βグロビン（５μｇ）は、ApaL
1とHind3によって消化され、cDNAを含む550bpフラグメ
ントがアクリルアミドゲル電気泳動法で精製された。β
−グロビンcDNAを含むApaL1−Hind3フラグメントは次の
ようなアダプター（上に述べたように合成され精製され
た）を用いて、pUC19を消化したXba1,Hind3中にクロー
ン化された。
２つのオリゴヌクレオチドを混合し（各々12.6μ
ｇ）、食塩を0.25M添加し、エタノール（無水）の３容
量を加えた。沈澱したオリゴヌクレオチドを遠心分離
（14,000×g,15分）で集め、ペレットを80％エタノール
で２回、無水エタノールで１回洗い、真空乾燥した。ア
ダプターを0.1×TEの1mlに溶解した。β−グロビンcDNA
を含むXbal−Hind3フラグメントの50ngとエタノール12.
5ngはT4 DNAリガーゼの10単位を含んだT4 DNAリガーゼ
緩衝液0.010ml中に、（非リン酸化の）YH1a,bオリゴヌ
クレオチドを沈澱させた。連結混合物を４℃で16時間培
養し、一部を大腸菌DH5αの形質転換に使用した。形質
転換細胞は、４μg/mlのXGALを含むLB−アンピシリン板
上で選別された。プラスミドDNAは12の白色コロニーか
ら作られた。DNAを、NcolまたはApaL1で消化し、アガロ
ースゲル電気泳動で分析した。これらのコロニーの内の
４つは、期待した制限フラグメントを含み。１つをpUC1
9β−グロビンと名づけた。（図21（ａ））。プラスミ
ドpSUC2−６Σ（G.Stetler et al.Biotechnology 7:55
−60（1989）（図21（ａ））を、Hind3とXbalで消化
し、大きなフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精
製した。β−グロビンcDNAを含むXbal−Hind3のフラグ
メントもまたpUC19β−グロビンから精製された（アガ
ロースゲル電気泳動法）。pSUC2−６Σを消化し、ゲル
で精製されたXbal,Hind3の10ngを、pUC19β−グロビン
からのXbal,Hind3フラグメントの16ngと共に、T4 DNAリ
ガーゼの10単位を含むリガーゼ緩衝液0.01ml中で混合し
た。連結化合物を25℃で１時間培養し、一部を大腸菌DH
5α形質転換に使用した。形質転換細胞を、LB−アンピ
シリン培地上で選別し、３つをプラスミドDNAの製造に
用いた。これらは、EcoR Iによる消化で分析され、また
アガロースゲル電気泳動により分析された。これらの中
２つは、期待した制限フラグメントをもつプラスミドを
含み、１つをpGS1188と名づけた（図21（ｂ））。この
プラスミドは、σプロモーターの転写調節下でのβ−グ
ロビンを含み、また、３′転写終結シグナルとMFα１遺
伝子ポリアデニレーションシグナルを含んでいる。
pGGAPによるσプロモーターの置換 プラスミドpGS1188はSph IとNco Iによって消化さ
れ、ベクタープラスβ−グロビンcDNAがアガロースゲル
電気泳動によりσプロモーターから分離されて前述のよ
うに精製された。プラスミドpgs4788（10μｇ）もまたS
ph IとNco Iによって消化され、この消化で生じた〜500
bpフラグメント（pGGAPを含む）がアガロースゲル電気
泳動で精製された。ベクターを含みゲル精製されたβ−
グロビンの50ngを、pGGAPプロモーターを含むNco I−Sp
h Iフラグメントの50ngと共に、T4 DNAリガーゼの10単
位を含む１×リガーゼ緩衝液の0.01ml中で培養した。混
合物を25℃で１時間培養し、連結混合物の一部を大腸菌
DH5αの形質転換に使用した。アンピシリン耐性のクロ
ーンが選別された。これらのクローンの12から分離した
プラスミドDNAは、〜500bp GGAPプロモーターを含んだ
プラスミドの確認のためSph IとNco Iによる消化で分析
された。β−グロビンcDNAの存在はXbaIとSalIによる消
化で確認され、ついでアガロースゲル電気泳動分析を行
った。期待のフラグメントを含むプラスミドが確認され
てpGS3588と名づけられた（図21（ｂ））。このフラグ
メントの酵母ベクター中へのサブクローン化を促進する
ため、pS3588のSma I部位を次のようにXho Iに変換し
た:pGS3588の１μｇをSma Iによって消化した。消化物
をフェノール−クロロホルムで１回抽出し、次にエタノ
ールで沈澱させた。沈澱したDNAは、リン酸化Xho Iリン
カー100ngとT4 DNAリガーゼ10単位と共にT4 DNAリガー
ゼ緩衝液中に溶解した（最終容量0.01ml）。連結物を室
温で２時間培養し、連結混合物の一部大腸菌DH5α（過
剰のリンカーは形質転換前に除かなかった）の形質転換
に用いた。アンシピリン耐性クローンを分離してプラス
ミドDNAを製造した。余剰のXno I部位を含んだプラスミ
ドは、Xno Iによる消化とアガロースゲル電気泳動分析
で確認された。pGGAP−β−グロビン発現カセットを含
むプラスミドが同定され、pGS3888と名づけられた（図2
1（ｂ））。
α−グロビン発現カセットの構築 我々はK.Nagai（MRC,Cambridge）から全体長さの一部
のcDNA（ｐα−MRC）クローンを得た。pGGAPプロモータ
ーからの発現にcDNA暗号化α−グロビンを仲介させるた
め２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した（オ
リゴヌクレオチドの合成と精製は前記の通りである）。
これら２つのオリゴヌクレオチドを、パーキン エル
マーセタスPCRキットと鋳型としてのｐα−MRCを用い
て、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（R.K.Sakai et al.,
1985.Science 230:1350−1354）のプライマーとして用
いた。α−グロビンcDNA（8.3μg/ml）は、0.018mlの水
中で0.005mlの10M苛性ソーダの添加により変性した。混
合物を25℃で５分間培養した。変性したDNAは3Mの酢酸
ソーダ0.003ml（pH5.2）と無水エタノール0.075mlの添
加により沈澱した。沈澱したDNAを80％エタノールで２
回、100％エタノールで１回洗って乾燥した。乾燥ペレ
ットを次の液に溶解した:20μＭのα−1 0.005ml、20μ
Ｍのα−2 0.005ml,10×Taq Iポリメラーゼ緩衝液0.010
ml（パーキンエルマーセタス）,Tal Iポリメラーゼ0.00
05ml（パーキンエルマーセタス），水0.663ml,4つのデ
オキシリボヌクレオチドトリホスフェート（各々1.25m
M）0.016ml。溶液を94℃で１分加熱した後にTaq Iポリ
メラーゼを添加した。酵素を加えた後水溶液を0.100ml
のパラフィン油で覆った。反応混合液を手で25回次の温
度で循環させた:37℃で２分、68.5℃で３分そして94℃
で１分。25回循環した後、反応混合液を37℃で２分、及
び68.5℃で10分間培養した。反応混合液の一部（0.005m
l）をアガロースゲル電気泳動で分析し、期待の大きさ
のバンド（〜430bp）が明らかにされた。PCR増幅DNAフ
ラグメントは、翻訳開始のため最適の配列状態にATGコ
ドンがはめこまれる５′の延長を含めるべきである（M.
Kozack.1986,Cell 44:283−292）。３′末端は、翻訳タ
ーミネーターとSal I制限エンドヌクレアーゼ部位を含
む延長を持つべきである。PCR−増幅反応物はフェノー
ル−クロロホルムで抽出し、エタノールにより沈澱させ
た。乾燥ぺレットを1mMトリス塩酸（pH7.8）0.05mlに溶
かした。この物質の一部（0.025ml,1.25μｇ）をNcolと
Sal Iによって消化し、アクリルアミドゲル（５％）電
気泳動により精製した。フラグメントを含むゲル薄片を
2.5M酢酸アンモニウム（pH7.4）0.3ml中で粉砕し、37℃
で16時間培養して溶離した。アクリルアミドフラグメン
トを遠心分離で除き、DNAは0.75mlのエタノールの添加
で沈澱した。ペレットを集め、1mMトリス塩酸（pH7.
8）、0.1mM EDTAの0.020ml中に溶解した。このフラグメ
ントは、消化されたNco I,SI中にクローン化され、アガ
ロースゲルでpGS3888が精製された。pGS3888を消化した
Nco I,Sal Iの50ngを、α−グロビンcDNAを含み、ゲル
精製されたPCR−増幅Ncol−Sal1フラグメントの50ngと
共に、T4 DNAリガーゼ10単位を含むリガーゼ緩衝液0.01
ml中で、25℃で２時間培養した。この反応混合物の一部
を大腸菌DH5α−の形質転換に用い、また、アンピシリ
ン耐性クローンを、LB−アンピシリン培地上で選別し
た。プラスミドDNAは、12の別個の分離物から作られ、N
colとSal1によって消化された。制限消化物をアクリル
アミドゲル電気泳動（５％）によって分析し、12個すべ
てが期待した大きさのフラグメントを含んでいた。これ
らの中の一つをpGS4088と名づけた（図22）。pGS4088に
挿入されたα−グロビンは、PCR−増幅により突然変異
が決して生じないよう完全に配列された。
一本鎖プラスミドからα−及びβ−グロビン遺伝子を同
時発現する酵母発現プラスミドの構築 プラスミドpGS3888とpGS4088からのα−グロビン及び
β−グロビン発現カセットは、それらが一本鎖Not1上に
切り出されるような方法で一本鎖プラスミド中にクロー
ン化された。このNot Iフラグメントは、そこで、別々
の（しかし同じ）プロモーターの調節下でα−及びβ−
グロビン鎖の両方を運び、発現するプラスミドを発生さ
せるように高次複写酵母プラスミドpClN中にクローン化
された。詳細を以下に記す。
Not I部位のpSK（＋）への導入 プラスミドpSK（＋）（Stratagene,Inc.）（図23
（ａ））は、100ngの精製プラスミドをKpn Iにより消化
することで修飾された。完全に消化された後、DNAをエ
タノールで沈澱させ、乾燥ペレットをT4 DNAポリメラー
ゼの10単位を含むT4 DNAポリメラーゼ緩衝液0.05ml中に
溶解した。反応混合物を37℃で20分培養し、Na3EDTAの
（10mM）を加えて70℃で10分加熱した。消化したDNAは
エタノールで沈澱し、乾燥ペレットを10mMトリス塩酸
（pH7.8）、1mM EDTAの0.01ml中に溶解した。この物質
（20μｇ）の一部を、T4DNAリガーゼ10単位と50ngのリ
ン酸かNot Iリンカーを含んだリガーゼ緩衝液0.005ml中
に溶解した。連結混合物を25℃で２時間培養し、その一
部を大腸菌DH5αの形質転換に使用した。アンピシリン
耐性コロニーは、LB−アンピシリン培地上で選別され
た。プラスミドDNAを分解し、Not Iで消化し、アクリル
アミドゲル（５％）電気泳動によって分析した。余剰の
Not I部位をもつプラスミドは、新しい〜90bpフラグメ
ントを発生することが期待される。このようなプラスミ
ドは同定されてpSN（＋）と名づけられた（図23
（ａ））。
pGGAP−α−グロビン発現カセットのpSN（＋）中へのク
ローニング pSN（＋）はSalIによって消化され、フェノール−ク
ロロホルムで抽出され、エタノールで沈澱した。沈澱し
たDNA（50μg/ml）を、1mMトリス−塩酸（pH7.8）、0.1
mM EDTAに溶解した。pGS4088をXholによって消化し、α
−グロビン発現カセットを含む〜1100bpフラグメントを
アガロースゲルから分離した。精製したフラグメントを
0.1×TEに溶解した（20μg/ml）。pSN（＋）を消化した
Sal1の25ngを、ゲル精製したα−グロビンフラグメント
の50ngと共に、T4 DNAリガーゼの10単位を含むリガーゼ
緩衝液0.01ml中に混合した。連結混合物を25℃で1.5時
間培養し、一部を大腸菌DH5αの形質転換に用いた。ア
ンピシリン耐性クローンが分離された。100の形質転換
細胞が格子状に新鮮なプレートに転移された。格子の複
製はニトロセルロースフィルター上で作られ、コロニー
ハイブリッド形成のために準備された（R.W.Davis et a
l.Adv Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor,,NY,19
80）。ハイブリッド形成されたプローブはオリゴヌクレ
オチド４（表６）であった。このオリゴヌクレオチド
（20pM）は、0.050Mのトリス−塩酸（PH7.6）,0.01Mの
塩化マグネシウム、0.005MのDTT,0.0001Mのスペルミジ
ン、0.0001MのEDTA,50PMの32P−ATP及び10単位のT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを含む0.02mlの反応混合液中で32
P−ATPにより標識された。反応混合液を37℃で２時間培
養し、結合しないATPはスピムカラムクロマトグラフィ
（BIORAD）を指針通り操作して除去した。フィルターは
ハイブリッド形成液（６×SSC,50％ホルムアミド,2％SD
S,20pM32P標識プローブ）中で37℃で16時間培養した。
フィルターは１×SSC,0.1％SDSにより55℃で４回（各15
分）;0.2×SSC,0.1％SDSを50℃で２回（各５分）そして
0.2×SSCで２回（各５分）洗浄を行った。フィルターの
オートラジオグラフがとられた。ハイブリッド形成シグ
ナルを発したコロニーは、プラスミドDNAを作るのに用
いられた。このDNAはEcoR Iで消化され、この消化で生
じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分析
した。正しい大きさのフラグメントを含むプラスミドが
同定されpGS4888と名づけられた（図23（ａ））。
PGGAP−β−グロビン発現カセットのpGS4888中へのクロ
ーニング pGS4888の構成にはXnolフラグメント（pGGAP−α−グ
ロビン）のSal1部位へのクローニングが必要であった。
Xno1部位とSal1部位の組み合わせは、シングルユニーク
Xho1部位をもったpGS4888を残して、Xho1とSal1制限エ
ンドヌクレアーゼの両方の認識部位を破壊する。pGS388
8からのXho1フラグメントを、アガロースゲル電気泳動
で精製し、pGS4888の構成で述べたように基本的にpGS48
88を消化したXhol中にクローン化を行った。コロニーフ
ィルターハイブリッド形成は、ハイブリッド形成のプロ
ーブとして、pGS3888からのNco I−Sal Iフラグメント
（β−グロビンcDNAを含む）を用いて行われた。このフ
ラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し、ア
マーシャムの無作意なオリゴヌクレオチド標識キットを
用いてα32P−dCTPによって標識した。フィルターは交
配、洗浄されpGS4888の構成に際し述べたようにオート
ラジオグラフィが作られた。プラスミドDNAはハイブリ
ッド形成シグナルを生成するコロニーから作られ、Ncol
またはNcol及びSph1のどちらかにより消化された。これ
らの消化物は、α−及びβ−グロビン発現カセットの両
方を含むプラスミドの同定を行い、α−及びβ−グロビ
ン転写ユニットの相対的方向性が明らかにされる。両方
の転写ユニットを含むプラスミドが同定されてpGS189と
名づけられた（図23（ｂ））。
プラスミドpClNの構築 プラスミドpC1Nは、Not1部位の導入のために修飾され
た。pC1N DNA（100μｇ）はSal1により消化され、フェ
ノール−クロロホルムで抽出、エタノールで沈澱した。
Sal1、末端は、“二本鎖”末端を作るためT4 DNAポリメ
ラーゼで修飾されリン酸化Not1リンカーが添加された。
これらの修飾に用いられた方法は本質的には、pSN
（＋）（前述）を作る時に用いられた方法と同じであ
る。これらの操作から得られたプラスミドは、pC1N（図
23（ｂ））と呼ばれる。このpC1NはNot1で消化され、フ
ェノール−クロロホルムで抽出、エタノールで沈澱し
た。〜2.4kb Not1フラグメント（α−、β−グロビン発
現カセットを運ぶ）は、pGS189 DNAを消化したNot1から
アガロースゲル電気泳動で精製された。pC1Nを消化した
Not1の50ngが、精製ゲル50ng,pGS189から分離した2.4Kb
フラグメントと共に、T4 DNAリガーゼ10単位を含むリガ
ーゼ緩衝液0.01ml中で混合された。反応混合物を25℃で
２時間培養し、一部を大腸菌DH5αの形質転換に用い
た。アンピシリン耐性クローンは、LB−アンピシリンプ
レートで選別され、プラスミドDNAが作られた。精製し
たDNAはEcoR Iによって消化され、アガロースゲル電気
泳動で分析し、α−及びβ−グロビン遺伝子を運ぶプラ
スミドを同定し、ベクターについて挿入物の方向を決定
した。２つのプラスミドが同定され、２つの可能性ある
方向を表示し、pGS289（図23（ｂ））とpGS389（図23
（ｂ））と名づけられた。
SACCHAROMYCES CEREVISIAEにおける組換え体ヒトヘモグ
ロビンの発現 S.cerevisiae菌株GSY112（MATαpep4::HIS3prb1 1.6R
his3200 ura3−52 leu2::his G can1 cir0）及びRSY33
4（MATα−reg1−50l pep4−3 prb1−1122 ura3−52 le
u2−3,leu2−112）はItoらの方法（J.Bacteriology 15
3:163−168（1983））によりプラスミドpGS289またはpG
S389により形質転換された。形質転換細胞は、酵母SD−
uraで選別された。シングルコロニー分離物はつみとら
れてウラシルとロイシンを欠いたSD培地で画像培養され
た。この選択培地（SD−ura,−leu）からのコロニーはS
D−ura,−leuの2mlの接種に用いられた。培養は30℃で2
4時間行われ、YP＋３％エタノールの20ml培養物の接種
に用いられた。これらはさらに24時間培養され、ガラク
トースが２％濃度で加えられた。誘導後4,8,24,28,32及
び48時間目に試料を採取した。細胞を遠心分離で集め、
10mMのトリス−塩酸（pH7.8）1mlと1mMEDTAで洗い、SDS
−PAGE試料緩衝液（２×108細胞/ml）中に再懸濁した。
試料を10分煮沸して不溶物を遠心分離で除き、0.005ml
の試料をSDS−PAGE（12.5％ゲル）で分析し、ついでニ
トロセルローズへ転移した。α−及びβ−グロビン鎖
は、商業上利用される兎の抗ヒトヘモグロビンと、Prom
egaから購入したイムノブロッティングキットを用いて
染色した。用いたプロトコルはPromegaから供給しても
らった。両鎖が合成され、pGS289はpGS389よりわずかに
生成の少ないことがイムノブロットにより示された。α
−鎖（低バンド）とβ−鎖の間の化学量論の明かな不足
は、両鎖に対する抗体の免疫反応性の相違に起因してい
る。これはコマシイ［Commassie］ブリリアントブルー
に染色された精製ヒト及び組換え体ヘモグロビンとイム
ノブロットの試料との比較によって示された。
実施例20:酵母中に合成されたヒト組換え体ヘモグロビ
ンの特性 RSY334［pGS389］は100mlのSD−ロイシン中で2.4のCD
600に増殖した。これはYPEの1Lを接種するのに用いられ
た。この培養は、30℃で24時間振とうし、24時間目に40
％のガラクトース50mlを添加した。培養が続けられて、
その24時間後に細胞を採取した（９のOD600）。細胞ペ
レットを0.01Mトリス−塩酸（pH7.18）,0.001M EDTAの1
00ml中に再懸濁し、細胞懸濁液中に一酸化酸素を３分間
通した。細胞を遠心分離で集め、一酸化酸素で処理後、
はっきり赤くなった。細胞ペレット（19g）を19mlの溶
菌緩衝液（0.01M NaPO4pH6.0,0.020M DTT,1％トリトン
×100,0.001M PMSF,0.005Mベンザミジン及び0.06mMロイ
ペプチン）に再懸濁し、一酸化炭素を２分間通した。0.
5インチの角片を備えたBranson250ソニケーターで、細
胞懸濁液を音波処理した。音波処理は最高出力で２分
（0.5秒パルス）行った。これは４回繰返し、２分間隔
で行った。細胞片を遠心分離（27.000×g,15分）で除
き、表面に浮かんだものは残した（０℃）。ペレットを
5mlの溶菌緩衝液に再懸濁した。再懸濁ペレットを上で
述べたようにミクロチップで音波処理した（最大量の70
％）。細胞片は同様に遠心分離で除き表面浮遊物は最初
のものと一緒にした。一緒にした溶液は遠心分離（38,0
00×g,20分）により透明にな赤色液になった。10mMのリ
ン酸でpH6.0に調整後、0.01Mリン酸ソーダで（PH6.0）
つり合った5mlのＳ−Sepharose高速カラムに液を通し
た。赤色物質はすべてカラムに残り、0.01Mリン酸ソー
ダ（pH6.0）20mlでカラムを洗浄した。カラムは0.05Mの
リン酸ソーダ（pH7.5）,0.1M食塩で溶出し、1mlのフラ
ンクションが集められた。赤色は２つのフラクションに
溶出した。この物質の純度はSDS−PAGEで分析され最初
のクロマノグラフィの段階後で50％以上と思われる。こ
の物質は10mMのリン酸ソーダ（PH6.0）,0.001M EDTAに
対して０℃で16時間透析され、モノ−S FPLCカラムで
（PH6.8−PH9.0,0.02Mリン酸ソーダグラジェント）で再
びクロマトグラフにかけた。これからのピーク層は85％
以上の純度であった。島津の分光光度計（図24上部）に
より400mMから650mMまで精製物質を走査し、吸収スペク
トルが得られた。スペクトルはヒトヘモグロビンと一致
し（図24下部）、タンパク質が折りたたまれ、ヘムと結
合していることを示していた。二つのピーク層から回収
されたヘモグロビンの量は消衰計数（1.23×104 A450/
M）から20mgと決定された。
実施例21:分離酵母プラスミドからのα−、β−グロビ
ン発現のベクターの構築 α−及びβ−グロビン発現カセットの両方を担うシン
グル酵母ベクターの開発に加えて、我々は、２つのグロ
ビンcDNAのそれぞれの分離したプラスミドを使用する系
を開発した。２つのプラスミドはそれぞれ酵母内のプラ
スミドを維持するために使われる２つの酵母遺伝子をも
っている。普通、両方ともLEU2遺伝子を共通に持ち、１
つ（pGS4688）はURA3遺伝子を、他（pGS4988）はTRP1遺
伝子を持っている。突然変異をURA3,LEU2,及びTRP1にも
たらす宿主菌を使用することによって、両プラスミド
（一つはα−グロビン、他はβ−グロビン発現カセッ
ト）は維持することができる。これらのベクターの構築
につき以下に記す。
pC1Tの構築 プラスミドpC1U（５μｇ）がBam HIとSal Iにより消
化され、最大フラグメントがアガロースゲル電気泳動に
より精製された。プラスミドYRp7（10μｇ）（J.Strath
ern,E.Jones,and J.Broach,The Molecular Biology of
the Yeast Saccharomyces,Cold Spring Harbor,NY,198
1）はBgl II及びSal Iにより消化された。そしてTRPI遺
伝子を含むフラグメントはアガロースゲル電気泳動によ
り精製された。ゲルで精製し、pClUを消化したBamH I及
びSal Iの25ngとBgl II−Sal−Ｉフラグメントの50ngを
T4 DNAリガーゼの10単位を含むリガーゼ緩衝液中で混合
した。反応混合物を25℃で1.5時間培養し、連結反応混
合物の一部を大腸菌DH5αの形質転換に用いた、テトラ
サイクリン耐性コロニーが、LB−テトラサイクリン培地
上で選別された。プラスミドDNAは15の形質転換細胞か
ら作られ、EcoR Iにより消化され、アガロースゲル電気
泳動により分析された。期待するEcoR I制限フラグメン
トをもった一個の分離物が選ばれてpC1Tと名づけられた
（図22（ａ））。
β−グロビン発現カセットのpC1T中のクローニング 100ngのpC1TがSalIによって消化され、フェノールで
抽出され、エタノールで沈澱し、10mMトリス−塩酸（PH
7.8）,1mM EDTAの0.01ml中に溶解させた。プラスミドpG
S3888はXho Iにより消化されてβグロビン発現カセット
を含む〜1.2Kb Xholフラグメントがアガロースゲル電気
泳動により精製された。pC1Tを消化したSal1の10ngとβ
−グロビン発現カセットを含むXho1フラグメントの60ng
を、T4 DNAリガーゼの10単位を含むリガーゼ緩衝液0.01
ml中で混合した。反応混合物を25℃で30分培養した。こ
の物質の一部は大腸菌DH5αの形質転換に使用された。1
00のアンピシリン耐性形質転換細胞が採取され、LB−ア
ンピシリン寒天上にうえつけられた。それらを37℃で５
時間培養し、ニトロセルロースフィルターで表面を覆っ
た。Xho Iフラグメントを含むプラスミドは前述のよう
にハイブリッド形成プローブXho Iフラグメントを用い
てコロニー交雑により同定された。オートラジオグラフ
のシグナルを発するコロニーはプラスミドDNAの製造に
用いられた。精製DNAはEcoR Iによって消化され、期待
する制限フラグメントの存在について、アガロースゲル
電気泳動により分析した。所望のXhol挿入物を含む２つ
のコロニーが同定され、挿入物の方向性は、プラスミド
DNAのEcoR I消化物またはSph1消化物のアガロースゲル
分析により定められた。分離物は両方共、同じ方向に所
望の挿入物を含み、一つをpGS4988と名づけた（図22
（ａ））。
α−グロビン発現カセットのpC1U内のクローニング α−グロビン発現カセットを含むpGS4088からXho1フ
ラグメントはアガロースゲル電気泳動により精製した。
そして回収したフラグメントを1mMトリス−塩酸PH7.8,
0.1mM EDTAに100ng/0.01mlで溶解した。ゲル精製のフラ
グメント25ngは、pC1Uを消化したSal1（フェノール−ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた）の10ng
と共に、T4 DNAリガーゼ10単位を含むリガーゼ緩衝液0.
01ml中で混合した。反応混合物を25℃で1.5時間培養
し、一部を大腸菌DH5αの形質転換に使用した。アンピ
シリン耐性コロニーをLB−アンピシリン板上で選別し
た。プラスミドDNAは、12の形質転換細胞から作られ、H
ind IIIにより消化され、アガロースゲル電気泳動によ
り分析された。２つの可能な方向性をもった分離物は、
pGS4488（図22（ｂ））及びpGS4688（図22（ｂ））と名
づけられた。
分離プラスミドからα−及びβ−グロビン鎖を発現する
二倍体菌株の構築 S.cerevisiae RSY330（MAα pep4−3 prb1−112 hist
7 ura3−52 trp1−289 can1 gal1）はpGS4488またはpGS
4688により形質転換された（Ito et al.）Trp+形質転換
細胞はSD−trp培地上で選択され、単集落の画線培養が
行われた。S.cerevisiae BJY 1991（MATα prb1−112 p
ep4−3 leu2−3,112 trp1−101 ura3−52 gal2canl）は
pGS4988で形質転換された。URA＋形質転換細胞はSD−ur
a培地上で選別されて、単集落の画線培養が行われた。
これらの菌株はそれぞれ次のようにα−及びβ−グロビ
ンの生成について試験された。（１）単集落はSD−選択
培地から取り上げられ、SD−選択（液体）培地の2mlを
接種のために使用した。培養は30℃で24時間行い、新鮮
なSD−選択培地25ml中に希釈し、さらに24時間培養し
た。細胞を遠心分離によって集め、２％のYP−ガラクト
ース25ml中に再懸濁し、さらに24時間培養した。細胞を
収穫し（8,000×g,10分）ペレットを0.010Mのトリス塩
酸（PH7.8）、0.001MのEDTA50mlで洗った。ペレットを9
6℃で10分加熱してSDS−PAGE試料緩衝液に溶解し、破片
は遠心分離機（15,000×g,10分）で除いた。１×106細
胞から得たきれいな表面浮遊物をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法とウエスタンイムノブロッティング
（前述）により分析した。β−グロビンは、BJY3505［p
GS4988］からの抽出物中に容易に見つけられた。我々は
また、シグナル力はかなり弱いけれどもα−グロビン交
叉反応物質を見出すことができた。四量体ヘモグロビン
の生成は、α及びβ鎖の両方の存在が必要であり、理想
的にはこれらは同じ細胞内に発現するだろう。何故なら
ば、菌株BJY3505,BJY1991及びRSY330は半数体であるた
め、それぞれ反対の接合型の酵母菌とは交配することが
できるからである。菌株RSY330及びBJY1991は共に接合
型αであるのに対し、BJY3505は接合型ａである。BJY35
05［pGS4988］,RSY330［4688］またはBJY1991［4688］
またはRSY330［pGS4688］接合が行われた。そして余分
なアミノ酸や他の栄養剤をもたないSD最小培地での画線
培養により二倍体が選別される。プラスミドを生ずるど
んな親株もこの培地では増殖できないが、二倍体は増殖
できる。何故ならば二倍体はTRPIとURA3における突然変
異のため同型接合体であり、両プラスミドはこれらの栄
養剤の不足の中でも増殖する細胞のために存在しなけれ
ばならない。これらの二倍体菌株は前述したように、α
及びβ−グロビンの合成のために分析された。最も驚く
べき結果が得られた。α−グロビンとβ−グロビンは、
半数体菌株の中で小量合成されるが、二倍体菌株での同
時発現の結果、両鎖の量の実質的な増加がもたらされ
た。さらにガラクトースによる誘導後（24時間）、細胞
ペレットは顕著な紅赤の色を発現した。これらの結果は
次のことを示唆するものである。（ａ）α−及びβ−グ
ロビンの同時発現はおそらく彼等の相互作用の結果とし
て２つのタンパク質を安定化させる。そして（ｂ）その
タンパク質は明らかに折りたたまれ、ヘムと結合してい
る。
実施例22:酵母誘導ヘモグロビンの酸素結合性 酵母から誘導されたヘモグロビンのP50はHgb Aoのそ
れと殆ど同じである。どのように測定するかによるがP
50は無リン酸溶液中でおよそ５〜10トルの範囲である。
25℃では、50mMビストリス,pH7.4,食塩0.1Mでその値は
およそ４〜６トルである。同じ溶液でも37℃では、P50
は8.5〜11である。
実施例23:S.cerevisiaeにおけるdi−αヘモグロビンの
発現 方法 特に断らない限り、すべての酵素（制限エンドヌクレ
アーゼ、T4 DNAリガーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）はNew Engaland Bionabs,Pharm
acia,BRL,StratageneまたはBoerhinger Mannheimから購
入した。制限酵素とT4 DNAリガーゼは、メーカーから提
供された緩衝液を使用した。
核酸のエタノール沈澱は、7.5M酢酸アンモニウム0.5
容量と20:1のエタノール：イソプロパノールの２容量の
添加によって行われた。ペレットは遠心分離機で14,000
×ｇ、15分によって集められ、80％エタノールで２回、
95％エタノールで１回洗浄し、真空で乾燥した。フェノ
ール抽出は、50:49:1のフェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコールの混合液の添加によって行った。位
相は遠心分離機で14,000×ｇで分離し、水位相を集め
た。プラスミドDNAはBirnborn及びDolyにより述べられ
ているように（Nucleic Acids Research 1979,7:1513−
1520）大腸菌DH5αから精製された。DNAの電気泳動分析
は、酢酸トリス電気泳動緩衝液を用い、アガロースゲル
中で行われた（Maniatis,et al.Moleculer Cloning,Col
d Springs Harbor,NY,1982）。DNAはゲルを05μg/mlの
臭化エチジウムで染色し、ゲルを紫外光線にあてること
で目に見ることができた。DNAフラグメントはBIO−101
から購入したキットを用い、アガロースゲルから精製し
た。DNAフラグメントは、切り出したゲルフラグメント
を3.25Mの酢酸アンモニウム中に粉砕し一晩37℃で培養
する方法でアクリルアミドゲルから精製した。ゲルフラ
グメントは遠心分離（14,000×g,15分）によって除か
れ、またDNAはエタノールで沈澱する。沈澱物はTE（10m
Mトリス塩酸、pH7.8,1mMNa3EDTA）中に溶解させる。DNA
のアクリルアミドゲル電気泳動はManiatisらの方法で行
った（Moleculer Cloning,Cold Spring Harbor,Laborat
ory,NY,1982）．細菌の増殖培値とDNA形質転換法はR.W.
Davisらの述べた方法である（Advanced Bacterial Gene
tics,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1980）.S.cer
evisiaeの増殖のための方法はF.Stermanらにより述べら
れている（Methods in Yeast Genetics:A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1979）S.Cer
evisiaeの直鎖または環状DNAによる形質転換はH.Itoら
が述べた方法で行った（J.Bacteriology 153:163−168
（1983））。
pGS4888からのPst I及びSpe I部位の除去 ２個のα−グロビン鎖を結合するための合成リンカー
のデザインは、２個のα−グロビンのコード配列の結合
点を含む30bp配列の側面を攻撃するPst I及びSpe Iの部
位を含めることになる。何故ならば、我々はいくつかの
異なったリンカー配列のテストから、これらの部位は異
なるリンカー配列をエンコードしている比較的短い合成
オリゴヌクレオチドの方向性をもったクローニングを可
能にすると予想できるからである。それ故に、ベクター
配列からPst IとPst Iを除くことがコード領域の部位の
使用を可能にするため必要である。プラスミドpGS4888
の１μｇをPst Iにより消化し、エタノールで沈澱し
た。乾燥ペレットを33mM酢酸トリス、PH7.9,66mMの酢酸
カリウム,10mMの酢酸マグネシウム,0.5mMのDTT及び590
μＭの各dNTP（T4ポリメラーゼ緩衝液）の50μＭ中に再
び懸濁した。T4 DNAポリメラーゼの２単位を添加し、反
応混合物を37℃で15分インキュベートした。Na3EDTAを1
2.5mMまで加え、65℃で15分加熱しフェノール抽出を行
い、エタノールで沈澱させた。乾燥ペレットをT4 DNAリ
ガーゼ緩衝液（BRL）に溶解し、DNAリガーゼ１μｌ（10
単位）を添加した。連結混合物を４℃で16時間インキュ
ベートした。連結反応の一部を大腸菌DH5αの形質転換
に用い、形質転換した細胞をLB−アンピシリンプレート
上選別した。プラスミドDNAは12の形質転換細胞から作
られた。DNAはPst I消化物のアガロースゲル電気泳動に
より分析を行った。５つの形質転換した細胞がPst I部
位を失い、その中の１つをpGS1889と名づけた。このプ
ラスミドのSpe I部位は、pGS1889をSpe Iで消化した
後、前述のようにして除いた。プラスミドは、Pst IとS
pe Iの両部位が失われたことが確認され、pGS1989と名
づけられた。
α−グロビンcDNAの２個のコピーを結合する計画 αグロビンのコード領域の５′−363bpを含むフラグ
メントは、ApaL1フラグメントに対するNcoIのように、p
GS4888から切り出すことができる。３′非翻訳領域を通
りヌクレオチド109を含む第２フラグメントはSal Iフラ
グメントに対するFok Iのように、除くことができる。
これら２つのフラグメントを一緒に結びつけることによ
って、合成オリゴヌクレオチドアダプターを用い、α鎖
cDNAの２個の双頭コピーをコード化した単一の翻訳ユニ
ットを作ることができる。これらのフラグメントの精製
と構築は以下のようである。
プラスミドpGS4888はApaL I及びNco Iによって逐次消
化され〜365bpフラグメント（α−鎖１）はアクリルア
ミドゲル電気泳動により精製を行った。〜351bpの第２
フラグメント（α−鎖２）はFok I及びSal Iによる配列
消化とその後のアクリルアミドゲル電気泳動による精製
で作製した。４つのオリゴヌクレオチドが合成され（表
８）,ApaLlとFok I末端を含む〜173bpリンカー（RGGV）
に構築された。オリゴヌクレオチドの合成、精製、構築
は前述の通りである。このアダプターは、α−鎖１の
３′末端とα−鎖２の５′末端部分と同じ様に、α−鎖
２のアミノ終結部分とα−鎖１のカルボキシ終結部分を
連結するアミノ酸ブリッジをコード化している。この構
造ではα−鎖１のカルボキシ末端アルギニン残基は、２
グリシン残基により、α−鎖２のアミノ末端バリンから
分離している。“ジグリシンブリッジ”部分は、Hpa I,
Spe I及びPst I部位により側面攻撃をうける。これらの
部位は、２個のα−鎖を発現カセットに結合する〜30bp
アダプターの使用によって色々なブリッジの置換が可能
となり、以下に記載のように４つの部分連結で行われ
た。
プラスミドpGS1989はNco IとSal Iにより逐次消化さ
れ、プラスミドベクターとpGALGAPを含む大フラグメン
トはアガロースゲル電気泳動法で精製を行った（gp198
9）。gp1989の50ngと、ゲル精製を行ったApaL1−Nco1α
−鎖１フラグメント及びFok I−Sal Iα−鎖２のフラグ
メントの各々200ngを混合した。20倍モル過剰の合成Apa
L I−Fok Iアダプターが加れられた（アダプターセグメ
ントの５′末端はリン酸化されていない）。結合反応は
20μｌの容量で23℃で４時間行われた。この反応混合物
の一部は大腸菌DH5αの形質転換に用いられ、また、ア
ンピシリン耐性コロニーが選別された。形質転換した細
胞は、ニトロセルロースフィルターにパッチされ、32P
標識オリゴヌクレオチドAL2asを用いるハイブリッド形
成によりスクリーニングされた（表８）。オリゴAL2−a
sの5pMは、T4ポリヌクレオチドキナーゼの２単位,50mM
トリス−塩酸（PH7.6）,10mM塩化マグネシウム,6mM DT
T,0.1mMスペルミジン,0.1Mm EDTA,及び10pMのγ32P−AT
P（7000Ci/mM）を含む20μｌの溶液中で37℃,2時間イン
キュベートした。フィルターはManiatisらの方法で進め
られ、ハイブリッド形成は、５×SSC、50％ホルムアミ
ド,100μg/ml酵母tRNA及び２％SDS中で37℃,16時間行わ
れた。フィルターは、２×SSC及び１×SSC中55℃で15分
間連続洗浄した（各液２回、全洗浄液が１％SDSを含
む）。乾燥フィルターをＸ線フィルムに感光させ、ハイ
ブリッド形成シグナルを与えるコロニーはプラスミドDN
Aの作成に用いられた。プラスミドDNAは制限酵素消化物
により、２個のα−鎖（Nco I−Sal I消化剤）に一致し
た大きさの挿入物を含むか、またユニークPst I,Spe I
及びHpa I部位を含むか否かが分析された。この方法で
同定されたプラスミドをpGS2189と名づけた（図25）。
β−グロビン発現カセットを含むpGS3888からのXho I
フラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製し
た。pGS2189を消化したXho 1（50ng）と、ゲル精製を行
ったpGS3888からの挿入物150ngを、T4 DNAリガーゼ10単
位を含むリガーゼ緩衝液１μｌ中で混合した。この混合
物の一部を大腸菌DH5αの形質転換に用い、そしてアン
ピシリン耐性コロニーが選別された。プラスミドDNAが
分離され、Xho1,BamH IまたはNco Iを用いた消化により
分析された。いくつかのプラスミドは期待した大きさの
制限フラグメントを生成し、すべて図25に示すような方
向に挿入物を含むことが確認された。これらの中の一つ
をpGS2989と名づけた。このプラスミドは連結したα−
グロビン遺伝子と、分離したプロモーターの調節下にあ
るβ−グロビン遺伝子を含むけれども、S.Cerevisiae中
に複製する能力はない。２個の遺伝子（di−α−グロビ
ン、di−β−グロビン）を含む全発現カセットは、Not
Iフラグメントとして精製することができる。pGS2989の
10μgPvulとNot1によって消化され、Not Iフラグメント
はゲル精製された。Pvu Iによる消化物は、ベクター配
列の大きさが減少したが、若しそうでなければ、所望の
NotIフラグメントに相当した筈である。ゲル精製された
Not Iフラグメントの100ngと、pClNを消化したNot Iの5
0ngを、T4 DNAリガーゼの10単位を含む10μｌのリガー
ゼ緩衝液中で混合した。反応混合物を、４℃で一晩培養
し、１部を大腸菌DH5αの形質転換に使用した。アンピ
シリン耐性の形質転換した細胞が選別され、プラスミド
DNAが作られた。DNAはプラスミドがdi−α、β−グロビ
ン発現カセットを含むかどうかを確認し、また挿入した
フラグメントの方向を調べるためにNco I−Sal1,Pst I
またはNot Iによって消化された。いくつかのプラスミ
ドは正しい挿入物を含み、そのフラグメントはすべて正
しい方向であることが確認された。これらの中の１つを
pGS3089と名づけた（図25）。このプラスミドは、菌株G
SY112とRSY334の形質転換に使用した。
発現と精製 S.Cerevisiae菌株GSY112［pGS3089］とESY334［pGS30
89］を、SD−ウラシル倍地中で飽和状態まで増殖させ、
2LのYPD培地に希釈した（培養はすべて30℃で行っ
た）。接種後（YPD培養の）24時間目にガラクトーズを
１％添加し、さらに24時間培養した。一酸化炭素を培養
液中にバブルし、細胞を遠心分離により集めた。細胞と
切断緩衝液（10mMリン酸ソーダ（PH7.2）,1mMEDTA,1mM
EDTA及び5mM DTT）の1:1混合物（重量：容量）を“ビー
ド−ビータ”（Biospec Products,Bartlesville,OK）中
で粉砕した。砕片を遠心分離（10,000×g,30分）により
除いた。溶解層をリン酸でpH6.0に調整し、10mMのリン
酸ソーダでpH6.0に合わせたＳ−セファローズのカラム
（高速）でクロマトグラフにかけた。充填カラムを10mM
トリス−塩酸,pH6.7で洗浄し、ヘモグロビンは、20mMト
リス−塩酸,PH7.5による洗浄で溶出した。明るい赤色帯
を集め、苛性ソーダを加えてPH8.0に調整した。この物
質を今度は20mMトリス−塩酸でPH8.0に合わせたＱ−セ
ファローズカラム（高速）でクロマトグラフにかけた。
ヘモグロビンは食塩グラジェント（０〜0.4M）により溶
出した。最後のクロマトグラフは、5mMリン酸ソーダ、P
H7.4,0.1M食塩中で調整されたセファクリルＳ−200で行
った。精製プロトコルの各工程で、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による分析（Laemmli,U.K.,1970,
Nature 227:680−685）とコマシーブリリアントブルー
による染色を行った。精製したタンパク質は、モノマー
β−グロビンと共に動くバンドとα−グロビンダイマー
と予想される位置でのバンドをもっている。この物質は
サイズ排除クロマトグラフィ（Progel TSK G3000 SWXL
HPLC Column）による分析で、ヒト四量体ヘモグロビン
と同時移動する。このタンパク質は赤色で８〜10トルの
50％結合親和力（P50）で酸素と結合し、ヘムを組み入
れて、酸素と可能的な結合能力のあることを示してい
る。
精製されたタンパク質は逆相HPLCにより、α−とβ−
鎖に分離され、各々の鎖の10のアミノ末端残基の配列が
定められた。この配列は、真正ヒトヘモグロビンのそれ
に適合しており、開始メチオニンは、α−グロビンダイ
マーとβ−グロビンダイマーの両方から効率的に除かれ
たことを示している。
例24:低親和性で遺伝子的に架橋したヘモグロビン変異
体の構築と酵母における発現 部位を指定した突然変異生成ベクターの構築 β−グロビン遺伝子とそのGALGAPプロモーターを含む
Xho1フラグメントが、分離用アガロースゲル電気泳動に
よるpGS2989から分離され、ファージスクリプト（RF型,
Stratagene,Inc.から入手）を消化したXho Iと連結し
た。大腸菌XL1−BlueはDNA連結混合物により形質転換さ
れ、ファージ含有挿入物が同定された（XGALを含む倍地
上の白色の溶菌斑）。シングル溶菌斑を分離してDNAを
作り、Xho Iによる消化とアガロースゲル電気泳動によ
り分析した。この構造はMpβ−グロビンと名づけられ
た。
一本鎖鋳型の作成 大腸菌XL1−Blue（Stratagene,11099 North Torrey P
ines Road,LaJolla,CA 92037で市販）の飽和培養物（20
0μｌ）が、2XYT肉汁の4mlの接種に用いられた。培養は
37℃で２時間行われ、次いでシングルM13β−グロビン
ファージプラークを感染させて、６〜８時間培養を継続
した。細胞を遠心分離で除去し、廃棄した。1.6mlの透
明な倍地に冷却した30％のPEG8000を含む3.5M酢酸アン
モニウムの320μｌを添加し、30分氷上で培養すること
によりファージを沈澱させた。遠心分離によってファー
ジを集め、10mMのトリス−塩酸PH8.0,1mM EDTA（TE）の
0.1ml中に再懸濁した。DNAは、フェノール／クロロホル
ムによる２回の抽出で分離された。DNA（水位相に含ま
れる）は、食塩を添加して0.5Mとし、２倍容の95％エタ
ノールの添加で沈澱させた。DNAペレットは20μｌの水
に溶解する。
in vitroの突然変異生成反応 200ngの鋳型DNAと、20mMトリス−塩酸,PH7.4,2mM塩化
マグネシウム,50mM食塩の10μｌ中の適当なリン酸化突
然変異誘発のオリゴヌクレオチドを20倍の過剰モルで混
合し、70℃で５分加熱する。アニーリング反応は40℃ま
でゆっくり（40分）冷やし、さらに30℃（15分）になる
ようにする。最後のアニーリング反応後、混合物を５分
間氷冷する。この混合物に、１μｌの合成緩衝液（4mM
の各dNTP,7.5mM ATP,175mMトリス−塩酸 PH7.4,37.5mM
塩化マグネシウム,215mM DTT）,0.5μｌのT4遺伝子32タ
ンパク質（２μg/μｌ）、１μｌのT4 DNAリガーゼ（３
単位）及び1mlのT4 DNAポリメラーゼ（１単位）が添加
される。混合物を37℃で90分（その後室温で５分）イン
キュベートする。反応は、0.1Mトリス−塩酸（PH8.0）
及び0.1M EDTAの90mlの添加により停止する。反応混合
物のおよそ0.1μｌを大腸菌XL1−Blue細胞の形質転換に
使用した。（細胞はD.Hanahan,1983.J.Mol.Biol.166:55
7の方法で形質転換のために作られた）。
突然変異遺伝子を含むファージ用のスクリーニング およそ50〜100の容菌斑を、適当な宿主菌（XL1−Blu
e）を順序よく接種した新鮮なプレート上においた。37
℃で６〜８時間培養後、ニトロセルロースフィルターで
プレートを覆い、ハイブリッド形成の準備を、基本的に
Davis,R.W.らが述べるように行った（Advanced Bacteri
al Genetics:A Manual of Genetic Enginering.Cold Sp
ring Harbor Laboratory,New York 1980）．突然変異誘
発オリゴヌクレオチドによるハイブリッド形成温度の選
択は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド構成を基にし
てきめられた。オリゴヌクレオチドはγ32P−ATPとポリ
ヌクレオチドキナーゼで標識化された（T.Maniatis et
al.Molecular Cloning:A Labortory Manual.Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1982）．ハイブリッド形成は、6X
SSC,2％SDS,標識オリゴヌクレオチドの105cpm/mlを用い
た100μg/mlの酵母tRNAに正しく適合した計算温度以下
の２〜５℃で６時間以上行った。温度は公式を用いて計
算された。すなわち、1MのNa＋濃度と想定し、あらゆる
GCペア用４℃，各ATペア用＋２℃。フィルターは、CXSS
C,2％SDSで、ハイブリッド形成の時と同じ温度で洗浄
し、Ｘ線フィルムに感光させた。正のハイブリッド形成
シグナルを与える溶菌斑が、前述のように、一本鎖DNA
を作るのに用いられた。一本鎖DNAは、突然変異体配列
が実際に存在することを確かめる配列反応用の鋳型とし
て用いられた（Sanger,F.and Coulson,A.R.1975,J.Mol.
Biol.94:441）。
酵母発現ベクターへのクローニング ファージRF DNAは、突然変異体配列をもつことが確認
されたファージ感染細胞から作られ、作り変えられたβ
−グロビン遺伝子を含むXho Iフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で精製した。このフラグメントは、di−
gly配座から、di−α−クロスリンクをシングルグリシ
ンブリッジに変えるように改造されたpGS3089の誘導体
にクローン化された。そしてそれからβ−グロビン遺伝
子が欠失し、pGS3889 desβと名づけられた（図26）。
これは、ユニークXno I部位を創り出して、改質したβ
−グロビン発現カセットが挿入され、α−グロビン２量
体による同時発現を可能にした。このようにして発生し
た発現プラスミド（“Presbyterian"のpGS3889,“Ageno
gi"のpGS5189,“Kansas"のpGS5689そして“βV671"のpG
S4989,特定のコドンで突然変異があることを除き、他は
すべてpGS3089と同じである）が、S.Cerevisiae菌株GSY
112及びRSY334を形質転換するために用いられた。
酵母に発現した遺伝子的に架橋した低親和性突然変異タ
ンパク質の特性 プラスミドpGS3889（single gly bridge,βN108K ali
as“Presbyterian"）をもつ細胞を増殖させてヘモグロ
ビンを、前述のように精製した。この物質は、機能性に
つての分析では、野生型β−鎖（突然変異体としてP50
＝23〜25,N＝2.5）をもつ架橋型タンパク質に比較し
て、実質的には“右寄り”であった。
実施例25:大腸菌内のdi−αヘモグロビンの発現におけ
る菌株の選択と誘導温度の影響 表100には、di−α／β発酵の比較が示されている。
また、誘導温度の比較も示されている。欄の見出しの
“mg di−Ａ＋B"は発酵当りdi−α及びβポリペプチド
の全mgである。隣接の欄“mg/OD−L"は単に細胞密度基
準の最初の欄の数を表す。見出しがPHGBとされている２
欄は、機能的な組換え体ヘモグロビンの総計とその細胞
密度で修正した生成量を示す。最後の欄は、最終的な機
能性ヘモグロビンの収穫の点から、菌株JM109が好まし
いことを示している。如何なる理論にもとらわれなけれ
ば、我々はこうした相違が異なる菌株に発現されるプロ
テアーゼに関係すると信じる。２つの最良のJM109の実
験結果のうち、誘導温度が１つは30℃で、もう１つは37
℃で生成した最終の機能性ヘモグロビンの量がほぼ同じ
であることがみられたのは興味深い。
実施例26:シングルグリシンまたはプロリン残基の結合
した、遺伝子的にクロスリンクされているα−グロビン
２量体の構築 Di−α−グロビン架橋を変える以下のような合成アダ
プターが合成され、前述と同様に精製された。
RPVとRGVオリゴヌクレオチドの相補的なペアは水0.05
ml中で結合した（各オリゴヌクレオチドの2.4μｇ）。
アダプターの２つのペアは、4M食塩の２μｌと100％エ
タノールの0.158mLの添加により（別々に）沈澱し、続
いて遠心分離にかけた。ペレットは、80％と100％のエ
タノールで洗い乾燥した。アダプターは24μｌのTE中で
溶解した。
REGVとRPVアダプターのクローニング pGS2989のプラスミドは、酵素Hpa IとPst Iにより配
列的に消化され、ベクターをアガロースゲル電気泳動で
精製した。消化したプラスミドは次に、10倍モル過剰の
RGVまたはRPVアダプター（これらのアダプターはリン酸
化されていない）により、前述したように連結された。
連結混合物の一部を大腸菌DH5の形質転換に用いた。形
質転換した細胞が、アンピシリンを含むLBプレート上で
選別された新しいアダプターを含むクローンは、コロニ
ーフィルターハイブリッド形成によって同定された。ハ
イブリッド形成のプローブには、RPVまたはRGVの上流鎖
（前出）を用いた。これらのプローブは、32P−ATPとT4
ポリオヌクレオトドキナーゼで標識された。フィルター
は、６×SSC,50％ホルムアミド、２％SDS及び150μg/ml
の酵母tRNAを含む溶液中37℃で適当なプローブ（105cpm
/ml）によってハイブリッド形成が行われた。フィルタ
ーを12時間以上インキュベート後、２×SSC,2％SDS（25
0ml,各20分間）で４回洗浄し、Ｘ線フィルムに感光させ
た。オートラジオグラフのシグナルを生じたコロニー
は、次のプライマー:5′AAGCTTCAGCACCGTATTCA−３′
（α2segl）を用いて配列されたプラスミドDNAを作るの
に用いられた。このプライマーは、ダイマーのα１サブ
ユニット中の相当する配列による相同性を最小にし、di
−αダイマーのα２サブユニットの５′末端に近い配列
による相同性を最大にするように特別なデザインを行っ
た。
これは、α１−ドメインの５′末端の近くの同じよう
な配列から読まれるバックグランドの配列なしに、２つ
のα−ドメインをつなぐ配列を通して、その領域から読
まれる配列を決めることを可能にする。この方法で構成
されるプラスミドは、pGS2989RPV（シングルプロリン架
橋）またはpGS2989RGV（シングルグリシン架橋）と命名
された。
酵母発現プラスミドへのクローニング ヘモグロビン発現カセットを含むpGS2989RPVまたはpG
S2989RGVからのNot Iフラグメントは、アガロースゲル
電気泳動で精製され、Not Iにより消化されたpC1N中に
サブクローン化された。アンピシリン耐性の形質転換し
た細胞からプラスミドDNAが分離され、Not Iによる消化
とアガロースゲル電気泳動により分析が行われた。これ
らのプラスミドはpGS3089RPVまたはpGS3089RGVと名づけ
られた。異なるβ−鎖突然変異体の置換を容易にするた
め、プラスミドの第２のセットを、これらから作った。
これらのプラスミドは、XhoIによる消化と１μg/ml以下
の希釈条件下での再連結［religation］によって作られ
た。これはβ−鎖発現カセットの欠失をもたらす。プラ
スミドDNAはアンピシリン耐性の形質転換した細胞から
分離され、Not IとXho Iによる消化でその構造を確認し
た（これらのプラスミドを、pGS3089 RGV−desβ、図26
参照、及びpGS3089 RPV−desβと名づけた）。
参考例：ヘムによる組換え体α−グロビン及び組換え体
β−グロビンの再構築と、人工ヘモグロビンを作るため
の化学還元 人工ヘモグロビンを作る一般的な方法を、以下に例示
する。
凍結乾燥した組換えα及びβ−グロビン（各100mg）
を、それぞれ、8M尿素/50mMトリス−塩酸、PH8.01/1mM
EDTA/1mM DTTに溶解し、希釈し、室温で３−４時間イン
キュベートした。次に、α−グロビンを、冷却した2mM
K2HPO4,PH5.7/1mM EDTA/1mM DTTに希釈した。ヘミン（2
5mg）を2.4mg 0.1M KOHに溶解し1M KCNの等容量で希釈
した；この溶液は次に、保存リン酸緩衝液20mM K2HPO4,
PH6.7でヘミンの0.1mg/mlとした。この溶液からのヘミ
ンを冷却したα−グロビンに2.8モル過剰に添加した。
そして等モル量のβ−グロビンが加えられ、この溶液は
0.1M K2HPO4,PH7.6/1mM EDTA /1mM KCNに対して、４℃
で一晩、透析が行われた。人工ヘモグロビン溶液は、PM
−10膜（Amicon）を用いて限外濾過により濃縮された
後、ゴム隔膜により、200mlのねじぶた付き試験管に移
された。ヘモグロビン溶液は、排気して酸素を除き、窒
素を大量に流し、次に一酸化炭素で溶液を飽和させた。
100mMの次亜硫酸ソーダ溶液がゴム隔膜により20mlのね
じぶた付き試験管に、嫌気的に準備された。4.5等量の
次亜硫酸ソーダをシリンジを通してヘモグロビン溶液に
加え、この混合液を氷上で15分間インキュベートした。
ヘモグロビン溶液は４×40cmセファデックスＧ−25（微
細）カラムの10mMリン酸ソーダ緩衝液PH6.0に対してゲ
ル濾過が行われた。着色溶液は次に、同じ緩衝液で平衡
状態にある２×10cm−52（Whatman）カラムに通し、500
mlの10mMリン酸緩衝液PH6.0及び500mlの70mMリン酸緩衝
液PH6.9の直線勾配でクロマトグラフにかけた。酸素気
流中の光分解により、一酸化炭素がヘモグロビンから除
かれた。この方法で作られた人工ヘモグロビンは、融合
ペプチドから分離された収量はわずか25％であったが、
天然の酸素結合性を示している。
表200 細菌ベクターと酵母ベクター 定義 ROP:プラスミドのコピー数を制御する遺伝子 ROP＋＝低いコピー数 ROP−＝高いコピー数 AR:プラスミド選択に使用されるアンピシリン耐性 TR:プラスミド選択に使用されるテトラサイクリン耐性 TS:テトラサイクリン感応性、TR遺伝子は機能的でない FX−A:FX−α遺伝子 FX−B:FX−β遺伝子 DFX−Ａ Des−FX αグロビン遺伝子 DFX−Ｂ Des−FX βグロビン遺伝子 DV−A:Des−Valαグロビン遺伝子 DV−B:Des−Valβグロビン遺伝子 RV−Di−α：アミノ酸スペーサを持たないDi−α遺伝子
（Ｒ＝アルギニン;V＝バリン） RGV−Di−α：バリンが続く単一グリセリン（Ｇ）リン
カーを持つDi−α遺伝子 RGM−Di−α：メチオニン（Ｍ）が続く単一のグリセリ
ンリンカーを持つDi−α遺伝子 RGGV−Di−α:2つのグリセリンリンカーを持つDi−α遺
伝子 RGGGV−Di−α:3つのグリセリンリンカーを持つDi−α
遺伝子 LASI:TACプロモーターを制御するリプレッサータンパク
質をコードする遺伝子 LAC＋＝プラスミド上のリプレッサー遺伝子 LAC−＝プラスミド上にリプレッサーがない遺伝
子 α、di−α及び／又はβ遺伝子を有する下記の細菌プラ
スミドは全て、翻訳カプラーも有する。pPL発現系は翻
訳的にλＮタンパク質遺伝子をグロビン遺伝子にカップ
ルする。
pKK223−３ Pharmacia LKB,800 Centennial Ave.,P.O.Box 1327 P
iscataway,N.J.08855−1327で購入した親プラスミド。
その他全てのプラスミドはこの親プラスミド起源であ
る。遺伝子挿入を可能にするためのポリ制限部位部分が
続くTACプロモーターを持つ。
AR,TS,ROP＋,LAC− 1.pDL II−62m FX−Ａを持つpKK223−３ AR,TS,ROP＋,LAC− 2.pDL II−10a FX−Ｂを持つpKK233−２ AR,TS,ROP＋,LAC− 3.PDL II−66A 親プラスミドは１および2;単一オペロン中にFX−Ａと
FX−Ｂ両方を持つ。
AR,TS,ROP＋,LAC− 4.pGEM FX−Ａ 親プラスミドは１およびPromega Corporation,2800 W
oods Hollow Rd.,Madison,WI 53711から購入できるpGem
l。
pGemlはFX−Ａを有する。
AR 5.pGEM FX−Ｂ 親プラスミドは２とpGeml。
pGemlはFX−Ｂを持つ。
AR 6.pDL II−83a 親は4;DFX−Ａを含む。
7.pDL III−6f 親は5;DFX−Ｂを持つ。
AR 8.pDL II−86c 親プラスミドはpKK233−３と６。
DFX−Ａを持つ。
AR,TS,ROP＋,LAC− 9.pDL III−13e 親は７と８。
DFX−ＡとDFX−Ｂ双方を有するpKK223−３ AR,TS,ROP＋,LAC− 10.pDL II−9lf 親は４、DV−Ａを有する。
AR 11.pDL II−95a 親は７、DV−Ｂを有する。
AR 12.pDL III−1a 親はpKK223−２と10 DV−Ａを有す AR,TS,ROP＋,LAC− 13.pDL III−14c 親は11と12 DV−ＡとDV−Ｂ有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 14.pDL III−47a 親は13 RGM−DI−αとDV−Ｂを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 15.pDL III−82A 親は13 RGGV−DI−αとDV−Ｂを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 16.pDL IV−8a 親は13 RGV−DI−αとDV−Ｂを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 17.pDL IV−47b 親は13 RV−DI−αとDV−Ｂを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 18.pDL IV−66a 親は13 RGGGV−DI−αとDV−Ｂを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 19.pDL IV−3a 親は15 ROP遺伝子はNot IリンカーをROP遺伝子内のPvu II
部位に挿入することによって不活性化される。
AR,TS,ROP−,LAC− 20.pDL IV−38a 親は15 DV−Ｂ中にNagai突然変異を有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 21.pDL IV−58f 親は20 ROP遺伝子は19の場合同様に不活性化。
AR,TS,ROP−,LAC− 22.pDL IV−59a 親は21と、多数供給者から購入可能なpBR322 次のようにして調整された機能的TR遺伝子を有す。
即ち、pBR322のEco R1部位は、Bam H1リンカーを挿入
することによってBam H1に変えられている。これはpBR3
22からTR遺伝子の５′末端をBam H1フラグメントとして
除去することを可能にした。このフラグメントは次にTA
CプロモーターとpKK223−３の不活性TR遺伝子との結合
部に位置するBam H1部位に挿入される。このフラグメン
トの挿入は、もしそのフラグメントが正しい方向に挿入
されたのなら、TR遺伝子を再活性化する。テトラサイク
リンプレート上でのコロニー選択は、フラグメントが正
しい方向にあることを保証する。
AR,TS,ROP−,LAC− 23.pJR Ｖ−83a 親は11 Presbyterian突然変異（asn108〜lys）のあるDV−Ｂ
を有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 24.pJR VI−29a 親は15と23 Presbyterian突然変異のあるRGGV−DIαとDV−Ｂを有
す。
AR,TS,ROP−,LAC− 25.pJR VI−53b 親は24 BAM H1フラグメントの挿入により作られたTR AR,TS,ROP＋,LAC− 26.pJR VI−61a 親は25 Not IリンカーをPvu II部位に挿入して作られたROP AR,TS,ROP−,LAC− 27.pDL Ｖ−4a 親は16と26 Presbyterian突然変異のあるRGV−DIαとDV−Ｂを有
す。
AR,TS,ROP−,LAC− 28.pDL Ｖ−10a 親は27 TRに変換するためBam H1フラグメントを挿入 AR,TS,ROP−,LAC− 29.pDL Ｖ−16d 親は28 Not I部位に挿入したLAC I遺伝子を有す。
LAC I遺伝子は次のプロコルを用いて得る。
即ち、５′末端にNot II部位を有するポリメラーゼ
鎖反応（PCR）プライマーがlac 1遺伝子を増殖するのに
用いられた。ゲル精製に続いて、その遺伝子がpDLV−1a
のNot I部位に挿入された。
第２βグロビン遺伝子自身のTACプロモーターの制御
下に第２βグロビンを組み込ませようとして以上のほか
のプラスミドもいくつか構築しようとしてみた。
30.pDL IV−64a 親は14 合成TACプロモーターの制御下のβグロビンを有す。
AR,TS,ROP＋,LAC− 31.pDL IV−67a 親は14と30 1pTACの制御下のDI−αと第2pTACの制御下のDV−Ｂを
有す。DV−ＢはDI−αに隣接。
AR,TS,ROP−,LAC− 32.pJR VI−54a 親プラスミドは14と30 1pTAC制御下のDI−αとDV−Ｂ、及び別のpTACの制御
下に第２のDV−Ｂを有す。その第2DV−Ｂはそのプラス
ミドのPvu II部位に挿入される。
AR,TS,ROP−,LAC− 33.pPL λ， Pharmaciaから購入できるプラスミド LKB（上記）はpLプロモーター及び融合の発現または
翻訳的にカップルされる組換え体タンパク質に使用する
ことができるλのＮタンパク質のコード領域を有す。
34.pPL−α／β 親プラスミドは13と33 DV−ＡとDV−Ｂを有す。
AR,ROP＋ 35.pPL−diα／β 親プラスミドは34 RGV−DIαとDV−Ｂを有す。
AR,ROP＋ 36.pSGE0.1−L0 親プラスミドは35 ROP遺伝子はNot IリンカーをROP遺伝子のPvu II部位
に挿入することによって不活性化させられる。
AR,ROP− 37.pSK＋ Stragene,LaJolla,CAから購入できる。
38.pGS2488 合成GAP491翻訳開始部位の挿入によって上記37から入
手。
39.pGS2888 Kpn I部位をSph I部位に変換することによって上記38
から入手。
40.pGS4788 GALGAPハイブリッドプロモーターを形成するため合成
GALUASを上記39へ挿入することによって39から入手。
41.pLC II FX−β−グロビン Kiyoshi Nagai,Medical Research Council,London,En
glandから購入できるプラスミド。βグロビン遺伝子が
ある。
42.pUC19 Bethesda Research Laboratories,Gaithesburg,Maryl
andから購入できるプラスミド。
43.pSUC2−６Σ Stetler,et al.,Biotechnology,7:55−60（1989）記
述のプラスミド。
44.pUC19β−グロビン 上記41と42から入手。
45.プラスミド pGS1188 （上記44からの）βグロビン遺伝子はσプロモーター
とMFXターミネーター（両者とも上記43からのもの）の
制御下にある。
46.プラスミド pGS3588 上記45と40から入手。σプロモーターは40のGALGAPプ
ロモーターと交換されている。
47.プラスミド pGS3888 Sma I部位をXho I部位に変換することによって46から
入手。
47a.プラスミド ｐα−MRC K.Nagai,MRCで購入できるプラスミド。αグロビン遺
伝子がある。
48.プラスミド pGS4088 βグロビン遺伝子を交換を取り去り、αグロビン遺伝
子を挿入することによって47から入手。
49.プラスミド pSN（＋） Kpm I部位をNot I部位に変えることによって37から入
手。
50.プラスミド pGS4888 48からのpGGAP−α−グロビン発現カセットを挿入す
ることによって49から入手。
51.プラスミド pGS189 47からのpGGAP−−β−グロビン発現カセットを挿入
することによって50から入手。プラスミドはしたがって
GALGAPαグロビンとGALGAPβグロビンオペロンの双方を
持つ。
52.プラスミド pC1U Stetler,et al.,Biotechnology,7:55−60（1989）に
記述されているプラスミド。
53.プラスミド pC1N Not I部位を付加することによって52から入手。
54.プラスミド pGS289 αグロビンとβグロビンの発現カセットを挿入するこ
とによって53から入手。
55.プラスミド pGS389 同上。ただし方向を逆にして挿入。
56.プラスミド pYRp7 Strathern,et al.The Molecular Biology of the Yea
st Saccharomyces（Cold Spring harbon 1981）に記述
されているプラスミド。TRPI遺伝子の源。
57.pC1T 52と56から入手。Ura3遺伝子（52）をTrp1遺伝子（5
6）と交換することによって入手。
58.pGS4988 47からのβグロビン発現カセットを挿入することによ
って57から入手。
59.プラスミド pGS4488 48からのαグロビン発現カセットを挿入することによ
って52から入手。
60.プラスミド pGS4688 同上。ただし方向を逆に挿入。
61.プラスミド pGS4888 48からのGGAP−αグロビン発現カセットを挿入するこ
とによって49から入手。
62.プラスミド pGS1889 Pst I部位を除去することによって61から入手。
63.プラスミド pGS1989 SpeI部位を除去することによって62から入手。
64.プラスミド pGS2189 61と63から入手。di−αグロビンをRGGVリンカーでエ
ンコードする。
65.プラスミド pGS2989 64と47から入手。di−αグロビン遺伝子とβグロビン
遺伝子を有す。
66.プラスミド pGS3089 65の発現カセットを挿入することによって53から入
手。
66a.ファージスクリプト Stratageneから購入できるファージ。
67.ファージ Mpβ−グロビン GALGAPプロモーターと65からのβグロビン遺伝子を挿
入することによって上記ファージスクリプトから入手。
67a.プラスミド pGS3089 RGV desβ βグロビン発現カセットを有するXho Iフラグメント
を欠失するとによって66から入手。
68.プラスミド pGS3889 「Presbyterian」（βN108K）突然変異のある66。
69.プラスミド pGS5189 「Agenogi」（βE90K）突然変異のある66。
70.プラスミド pGS5689 「kansas」（βN102K）突然変異のある66。
71.プラスミド pGS4989 「βV67I」突然変異のある66。
72.プラスミド pGS2989 PRV RPVdi−αリンカーのある64。
73.プラスミド pGS2989 RGV RPVdi−αリンカーのある64。
74.プラスミド pGS3089 RGV 73からのHgb発現カセットがある53。
75.プラスミド pGS3089 RPV 72からのHgb発現カセットがある53。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (31)優先権主張番号 ３７９，１１６ (32)優先日 平成１年７月13日(1989．7．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ２０９９２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８３２３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８３２４ (72)発明者 ローゼンダール、メアリー エス. アメリカ合衆国、コロラド州、ブルーム フィールド、シィティ．、イレブンス アベニュー 3246 ダブリュ (72)発明者 ステットラー、ゲイリー エル. アメリカ合衆国、コロラド州、デンバ ー、サウス ヒューストン 36 (72)発明者 ワーゲンバッハ、ミッチェル アメリカ合衆国、コロラド州、ボウルダ ー、パイン ４番 1645 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１及び第２のヒトαグロビン様ポリペプ
    チド配列を含み、それらのポリペプチド配列はシングル
    ポリペプチド鎖を形成するように１個または２個以上の
    ペプチド結合により連結されたヒトジα−グロビン様ポ
    リペプチドであって、前記シングルポリペプチド鎖はβ
    −グロビンと結合する能力があり、ヘムを組み入れて可
    逆的な酸素結合活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク
    質を形成することを特徴とするヒトジα−グロビン様ポ
    リペプチド。
  2. 【請求項２】第１及び第２のヒトβグロビン様ポリペプ
    チド配列を含み、それらのポリペプチド配列はシングル
    ポリペプチド鎖を形成するように１個または２個以上の
    ペプチド結合により連結されたヒトジβ−グロビン様ポ
    リペプチドであって、前記シングルポリペプチド鎖はα
    −グロビンと結合する能力があり、ヘムを組み入れて可
    逆的な酸素結合活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク
    質を形成することを特徴とするヒトジβ−グロビン様ポ
    リペプチド。
  3. 【請求項３】前記第１及び第２のヒトαグロビン様ポリ
    ペプチド配列が、第１ポリペプチドの正常なＣ末端と第
    ２ポリペプチドの正常なＮ末端との間で、単一のポリペ
    プチド結合によりまたは１〜３個のアミノ酸のペプチド
    リンカーにより連結されている請求項１のポリペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】前記第１及び第２のヒトβグロビン様ポリ
    ペプチド配列が、第１ポリペプチドの正常なＣ末端と第
    ２ポリペプチドの正常なＮ末端との間で、単一のポリペ
    プチド結合によりまたは１〜３個のアミノ酸のペプチド
    リンカーにより連結されている請求項２のポリペプチ
    ド。
  5. 【請求項５】（ａ）請求項１に記載のヒトジα−グロビ
    ン様ポリペプチド及び２個のヒトβグロビン様ポリペプ
    チドから構成される多量体タンパク質、 （ｂ）請求項２に記載のヒトジβ−グロビン様ポリペプ
    チド及び２個のヒトαグロビン様ポリペプチドから構成
    される多量体タンパク質、及び、 （ｃ）請求項１に記載のヒトジα−グロビン様ポリペプ
    チド及び請求項２に記載のヒトジβ−グロビン様ポリペ
    プチドから構成される多量体タンパク質 からなる群から選ばれ、補欠分子族ヘムを有し、可逆的
    酸素結合活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク質。
  6. 【請求項６】第１及び第２のヒトαグロビン様ポリペプ
    チド配列をコードする第１及び第２のDNA配列と、任意
    にリンカーアミノ酸配列をコードするリンカーDNA配列
    とを含む組換え体DNA分子であって、該第１及び第２のD
    NA配列と含まれる場合には該リンカー配列は、シングル
    ポリペプチド鎖として発現され、前記シングルポリペプ
    チド鎖はヒトβグロビンと結合する能力があるととも
    に、ヘムを組み入れて可逆的な酸素結合活性をもつヒト
    ヘモグロビン様タンパク質を形成することを特徴とする
    組換え体DNA。
  7. 【請求項７】第１及び第２のヒトβグロビン様ポリペプ
    チド配列をコードする第１及び第２のDNA配列と、任意
    にリンカーアミノ酸配列をコードするリンカーDNA配列
    とを含み、シングルポリペプチド鎖として発現される組
    換え体DNA分子であって、前記シングルポリペプチド鎖
    はヒトαグロビンと結合する能力があるとともに、ヘム
    を組み入れて可逆的な酸素結合活性をもつヒトヘモグロ
    ビン様タンパク質を形成することを特徴とする組換え体
    DNA。
  8. 【請求項８】請求項６に記載の組換え体DNA分子により
    形質転換された宿主を準備し、前記宿主をヒトジα−グ
    ロビン様ポリペプチドを発現する条件下で培養し、前記
    ポリペプチドをヘム及びヒトβグロビン様ポリペプチド
    と結合させてヒトヘモグロビン様タンパク質を得ること
    を含み、前記結合は前記宿主中で生じてもよく、２個の
    天然ヘモグロビンαサブユニットが単一のヒトジα−グ
    ロビン様ポリペプチドに置換されている可逆的酸素結合
    活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク質の製造方法。
  9. 【請求項９】請求項７に記載の組換え体DNA分子により
    形質転換された宿主を準備し、前記宿主をヒトジβ−グ
    ロビン様ポリペプチドを発現する条件下で培養し、前記
    ポリペプチドをヘム及びヒトαグロビン様ポリペプチド
    と結合させてヒトヘモグロビン様タンパク質を得ること
    を含み、前記結合は前記宿主中で生じてもよく、２個の
    天然ヘモグロビンβサブユニットが単一のヒトジβ−グ
    ロビン様ポリペプチドに置換されている可逆的酸素結合
    活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク質の製造方法。
  10. 【請求項１０】請求項６に記載の組換え体DNA分子と請
    求項７に記載の組換え体DNA分子により形質転換された
    宿主を準備し、前記宿主をヒトジα−グロビン様ポリペ
    プチドと前記ヒトジβ−グロビン様ポリペプチドを発現
    する条件下で培養し、前記ヒトジα−グロビン様ポリペ
    プチドと前記ヒトジβ−グロビン様ポリペプチドのそれ
    ぞれとヘムと結合させてヒトヘモグロビン様タンパク質
    を得ることを含み、前記結合は前記宿主中で生じてもよ
    く、２個の天然ヘモグロビンβサブユニットが単一のヒ
    トジβ−グロビン様ポリペプチドに置換され、且つ２個
    の天然ヘモグロビンαサブユニットが単一のヒトジα−
    グロビン様ポリペプチドに置換されている、可逆的酸素
    結合活性をもつヒトヘモグロビン様タンパク質の製造方
    法。
  11. 【請求項１１】α−グロビン様ポリペプチドを含むポリ
    ペプチド及びβ−グロビン様ポリペプチドを含むポリペ
    プチドが、形質転換した非赤血球細胞でそれぞれ発現さ
    れる、ヘモグロビン様タンパク質の製造方法において、
    α及びβグロビン様ポリペプチドは集められヘムと結合
    されて細胞内に生物学的に機能的なヘモグロビン様タン
    パク質を生成するような様式で、同じ細胞内にαグロビ
    ン及びβグロビン様ポリペプチドを含むポリペプチドを
    発現させることを含む改良方法。
  12. 【請求項１２】（ａ）（ｉ）ヒトαグロビン様ポリペプ
    チドを含むポリペプチドをコードし、細胞内で機能的な
    プロモーターに連結されているDNA配列、及び （ii）ヒトβグロビン様ポリペプチを含むポリペプチド
    をコードし、細胞内で機能的なプロモーターに操作可能
    に連結されているDNA配列を有する非ヒト細胞を準備
    し、 （ｂ）前記αグロビン及びβグロビン様ポリペプチドを
    含むポリペプチドを同時発現させ、前記細胞はこのよう
    なポリペプチドを一緒に折り畳みヘムを組み入れてヒト
    ヘモグロビン様タンパク質を可溶性で回収可能な形態で
    生成することを含む請求項11の方法。
  13. 【請求項１３】（ａ）α−グロビン様ドメインを含むサ
    ブユニットタンパク質をコードする第１シストロン、及
    び、前記第１シストロンに先行しまたは後に続く、βグ
    ロビン様ドメインを含む第２のサブユニットタンパク質
    をコードする第２シストロンを含むポリシストロン遺伝
    子単位と、前記ポリシストロン遺伝子単位の転写を制御
    する単一のプロモーターとを有する、形質変換された非
    ヒト細胞であって、ヘムを合成する能力があるととも
    に、ヘムを前記サブユニットタンパク質に組み入れヒト
    ヘモグロビン様タンパク質を形成する能力がある細胞を
    準備し、 （ｂ）前記ヒトヘモグロビン様タンパク質の発現に適し
    た条件下で細胞を培養することを含む請求項12の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101584540B1 (ko) * 2014-04-16 2016-01-14 박병용 대형 식품용기 자동 세척장치

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022849A (en) * 1987-05-16 2000-02-08 Baxter Biotech Technology Saarl Mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US6204009B1 (en) 1988-05-16 2001-03-20 BAXTER BIOTECH TECHNOLOGY SàRL Nucleic acids encoding mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US5545727A (en) * 1989-05-10 1996-08-13 Somatogen, Inc. DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
US5599907A (en) * 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
US5844090A (en) * 1994-05-09 1998-12-01 Somatogen, Inc. Modified hemoglobin-like compounds
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
WO1991013158A1 (en) * 1990-02-28 1991-09-05 Delta Biotechnology Limited Protein production in yeast
US6172039B1 (en) 1990-04-16 2001-01-09 Apex Bioscience, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
WO1991016349A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-31 Strohtech, Inc. Expression of recombinant hemoglobin in yeast
US5610137A (en) * 1990-12-20 1997-03-11 The Uab Research Foundation Transgenic, cross-linked hemoglobin
ATE206760T1 (de) * 1990-12-20 2001-10-15 Univ Alabama Res Found Transgenes, vernetztes hämoglobin
GB9028062D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Agricultural & Food Res Production of transgenic animals
US5714345A (en) * 1990-12-24 1998-02-03 Pharmaceutical Proteins Limited Increased expression of a gene by a second transferred mammary gland specific sequence transgenic
WO1993008831A1 (en) * 1991-10-30 1993-05-13 Strohtech, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
AU665599B2 (en) * 1991-11-08 1996-01-11 Hemosol Inc. Hemoglobins as drug delivery agents
FR2688784B1 (fr) * 1992-03-18 1995-06-30 Pasteur Merieux Serums Vacc Transporteur d'oxygene.
US6610654B2 (en) 1993-03-31 2003-08-26 Wellstat Therapeutics Corporation Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
ES2185649T3 (es) * 1993-03-31 2003-05-01 Wellstat Therapeutics Corp Inhibidores de la proliferacion de las celulas germinales y sus utilizaciones.
US5939391A (en) * 1993-03-31 1999-08-17 Pro-Neuron, Inc. Hemoglobin alpha chain peptide fragments useful for inhibiting stem cell proliferation
US5612310A (en) * 1993-05-24 1997-03-18 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5554638A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5840851A (en) * 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
US5665869A (en) * 1993-11-15 1997-09-09 Somatogen, Inc. Method for the rapid removal of protoporphyrin from protoporphyrin IX-containing solutions of hemoglobin
US6140071A (en) * 1994-01-27 2000-10-31 Somatogen, Inc. Proteins with mutations to decrease N-terminal methylation
US5631219A (en) * 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
AU6489996A (en) * 1995-07-14 1997-02-18 Somatogen, Inc. Methods for increasing protein expression
US5824511A (en) * 1995-08-01 1998-10-20 University Technology Corporation Method for enhancing the production of hemoproteins
US6812207B1 (en) 1995-10-23 2004-11-02 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
US6114505A (en) * 1995-10-23 2000-09-05 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
CA2236794A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Bruce A. Kerwin Method for control of functionality during cross-linking of hemoglobins
WO1997023631A2 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Somatogen, Inc. Globins containing binding domains
US6218513B1 (en) 1995-12-22 2001-04-17 Baxter Biotech Technology Sarl Globins containing binding domains
US5861483A (en) 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
JP2001502543A (ja) * 1996-10-18 2001-02-27 バクスター バイオテック テクノロジー エス．エイ．アール．エル． 組換えヘモグロビン調製物においてプロトポルフィリンｉｘのレベルを減少させる方法
EP1950298A3 (en) 1997-05-02 2008-12-24 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Hemoglobin mutants with increased soluble expression and/or reduced nitric oxide scavenging
DE10036491A1 (de) * 2000-07-25 2002-02-07 Roche Diagnostics Gmbh Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe
EP1368483B1 (en) 2001-03-09 2012-10-24 Genentech, Inc. Process for production of polypeptides
US7494974B2 (en) 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
US7504377B2 (en) 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
WO2009014450A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Sanare As Novel peptides with anti-tumor activity
EP2058398A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-13 Nipro Corporation Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast
US10752672B1 (en) * 2019-02-01 2020-08-25 Cheer Global Limited Recombinant hemoglobins and methods of preparation and use thereof
KR20220137895A (ko) * 2020-01-10 2022-10-12 주식회사 인트론바이오테크놀로지 대장균을 사용한 돼지 미오글로빈의 제조 방법
US20230073947A1 (en) * 2020-01-10 2023-03-09 Intron Biotechnology, Inc. A method for preparing bovine myoglobin using escherichia coli
CN116203144B (zh) * 2022-05-11 2023-10-27 重庆医科大学附属儿童医院 测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用
CN118108834A (zh) * 2022-11-30 2024-05-31 康码（上海）生物科技有限公司 重组血红蛋白

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3924943A (en) 1974-06-11 1975-12-09 Xerox Corp Segmented biased transfer member
US4769326A (en) 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
US4620948A (en) 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4599197A (en) 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8412517D0 (en) 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
US4598064A (en) 1984-06-27 1986-07-01 University Of Iowa Research Foundation Alpha-alpha cross-linked hemoglobins
US4600531A (en) 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
US4774180A (en) 1986-02-26 1988-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Construction and application of polyproteins
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
GB8701001D0 (en) 1987-01-19 1987-02-18 Gordon D G Ceiling tiles
WO1988006601A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Gene repressors
EP0561245A1 (en) * 1987-05-16 1993-09-22 Somatogenetics International, Inc. Blood substitutes comprising recombinant hemoglobin
GB8711614D0 (en) * 1987-05-16 1987-06-24 Medical Res Council Proteins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101584540B1 (ko) * 2014-04-16 2016-01-14 박병용 대형 식품용기 자동 세척장치

Also Published As

Publication number Publication date
ATE142692T1 (de) 1996-09-15
ES2204926T3 (es) 2004-05-01
KR920701434A (ko) 1992-08-11
IL94361A0 (en) 1991-03-10
NO304027B1 (no) 1998-10-12
DE69028448T2 (de) 1997-02-06
NO914387L (no) 1991-11-08
AU635744B2 (en) 1993-04-01
FI105104B (fi) 2000-06-15
IE970086A1 (en) 2000-02-23
AU5675690A (en) 1990-11-29
EP0402300A2 (en) 1990-12-12
IL94361A (en) 1995-07-31
NO973848L (no) 1997-08-21
GR3021106T3 (en) 1996-12-31
DE69028448D1 (de) 1996-10-17
HUT61591A (en) 1993-01-28
EP0700997B1 (en) 2003-07-30
DE69034091D1 (de) 2003-09-04
NO315568B1 (no) 2003-09-22
FI20000025A (fi) 2000-01-05
NZ233642A (en) 1992-12-23
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