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JP2918688B2 - プロトロンビン活性化ペプチド及びその分解産物に関するイムノアッセイ及びそれらに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

プロトロンビン活性化ペプチド及びその分解産物に関するイムノアッセイ及びそれらに対するモノクローナル抗体

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JP2918688B2
JP2918688B2 JP3501459A JP50145991A JP2918688B2 JP 2918688 B2 JP2918688 B2 JP 2918688B2 JP 3501459 A JP3501459 A JP 3501459A JP 50145991 A JP50145991 A JP 50145991A JP 2918688 B2 JP2918688 B2 JP 2918688B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は凝血分野に関するものであり、とりわけプロ
トロンビン活性化ペプチドF1.2及びF1.2.3並びにそれら
の分解産物であるdes-RF1.2,F2,及びdes-RF2（「抗
原」）のエピトープに対して作成されたモノクローナル
抗体、及び、抗原検出のためのイムノアッセイにおけ
る、又、診断用キットの成分としてのそれらの利用法、
及びそのようなモノクローナル抗体のフラグメントの利
用法に関するものである。
血栓症は、血液塊（血栓）が血管あるいは心臓におけ
る血液の正常な流れを阻止する重篤な、しばしば致命的
でもある疾患である。フィブリンは、フィブリノーゲン
に対する血液凝固蛋白質トロンビンの作用から産生され
る蛋白質である。血栓は血液成分の沈着物であり、それ
は主として赤血球細胞を伴うフィブリン、あるいは、血
管又は心内腔の内膜又は表面における凝固した血小板で
ある。血栓は線維素溶解反応を経て後に分解する不溶性
のフィブリンポリマーを含有する。血栓は正常な血液流
を妨げ、重篤な、そしてしばしば致命的な結果を引き起
こす。
6,400万人を越すアメリカ人が心臓血管疾患（CVD）、
つまり血栓病の危険率増大に関与する病気に冒されてい
る。CVDは、心臓発作、脳卒中、高血圧、動脈硬化症、
リューマチ性心臓、及び先天性心臓奇形症を含み、アメ
リカ合衆国における総死亡人口の50％以上を占める。48
0万人を越すアメリカ人が心臓発作、狭心症、あるいは
双方の病歴を有する。1989年には、150万の新たな心臓
発作が起こり、その45％は65歳以下の人に対して起こ
り、75％以上には入院の必要があり、1/3以上が死亡す
るであろうということが予想されている。約200万人も
の脳卒中の犠牲者が現在生存しており、毎年約500,000
人が脳卒中に見舞われている。CVDによる死亡者総数の1
/5は65才以下である。CVDに関する年間の健康管理費
は、1988年においては83億ドルを越えると予測された。
他の病気も血栓症の増加傾向を示す。それらには、
癌、妊娠、老化、外傷、経口避妊薬の使用、糖尿病、肝
臓及び腎臓疾患、及び肥満症があるが、これらに限られ
ない。
抗凝固剤療法を受けている患者に対して血栓症の危険
率を低減することはこの分野における患者治療のもう一
つの領域である。抗凝固剤の投与に際し、効果的な治療
を持続させるためには望ましい薬剤レベルを決定する必
要がある。最近では経口凝固剤療法に対する適切な用量
が、患者のプロトロンビン時間（「PT」）をモニターす
ることにより決定されており、これは正常血漿を使用し
て得られるものの約1.5倍から2.5倍に維持される。ヘパ
リン療法のおおまかな用量は、しばしば患者の活性化部
分的トロンボプラスチン時間（「APTT」）をモニターす
ることにより決定されるが、これはコントロールの1.5
倍以上に維持されるものである。
血液凝固は非常に複雑な過程であり、現在でさえも全
てが理解されている訳ではない。凝固回路の最終段階で
は、フィブリン、つまり血栓形成に必要な成分の形成が
結果として生じる。プロトロンビンの活性化及びトロン
ビンのそれに伴う生成がフィブリン形成には必要であ
る。凝血カスケードにおけるプロトロンビンの活性化は
図1Aに示されており、プロトロンビン活性化産物及び分
解型は図1Bに示される。因子Xaは凝血因子Va、カルシウ
ム及び刺激化された血小板の存在下においてプロトロン
ビンの活性化を触媒化し、２箇所の部位、つまりArg271
-Thr272及びArg320-Ile321においてプロトロンビンを切
断し、プロトロンビン活性化ペプチドフラグメントF1.2
及びトロンビンを産生する。最初の切断により、F1.2に
対して特異的なエピトープを所有するプロトロンビン上
には存在していないカルボキシ末端がF1.2上に露出す
る。トロンビンは一箇所の切断（Arg155-Ser156）によ
り、F1.2を分解することが可能であり、プロトロンビン
フラグメントF1及びプロトロンビンフラグメントF2を産
生する。Rabiet,M.J.,J.Biol,Chem.,261巻,13210-13215
（1986年）では、プロトロンビン活性化ペプチドフラグ
メント1.2.3,つまりF1.2より13アミノ酸残基長いペプチ
ドが、凝固している血漿中でArg284-Thr285での切断に
より形成されることが示唆されている。F1.2.3は非常に
不安定であり、プロテアーゼインヒビターが存在する場
合のみ検出可能である。
循環において血漿のカルボキシペプチダーゼは、カル
ボキシ末端から最後のアミノ酸であるアルギニン
（「Ｒ」）を除去することによりF1.2あるいはF2を更に
分解し、分解産物であるdes-RF1.2あるいはdes-RF2を生
成し得る。このことは、Chenoweth及びTeger Nilssonら
の業績（Chenoweth,D.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75
巻,3943-3947（1968年）;Teger-Nilsson,A.C.,Acta Che
m.Scand.,22巻,3171（1968年））に基づき仮定されたこ
とであり、彼らは循環性カルボキシペプチダーゼに対す
る概知の基質である補体成分C5aのdes-R型及びフィブリ
ノペプチドＢについて説明している。カルボキシペプチ
ダーゼは、グリシンあるいはアラニンが末端アルギニン
のすぐ手前に生じている場合には、この末端アルギニン
を好んで切断する。（Mckay,T.JJ.,Archives Biochem.
Biophysics,197巻,487-492（1979年））。F1.2及びF2の
カルボキシ末端配列の末端アルギニンのすぐ手前にはグ
リシンが存在しており、両者共にカルボキシペプチダー
ゼの良い基質であり、そのために切断されるものと予測
される。
F1.2は271のアミノ酸で構成されており、約90分の半
減期で循環する。（Bauer,K.A,.J.Clin.Invest.,76巻,8
26-836（1985年））。F1.2は、F1及びF2という２種類の
領域を有するとして定義され得る。そのF1領域は特別な
カルシウム結合性アミノ酸であるガンマーカルボキシグ
ルタミン酸を有し、これはF1、F1.2及びプロトロンビン
が正常なリン脂質結合活性に必要な正常なカルシウム依
存的コンホメーションをとるのに必要なものである。
抗原の生成は、トロンビン形成及び凝血因子Xaの活性
化を示す。最近では、血栓症の危険率増大に関与する臨
床症状においてはF1.2レベルが上昇し、抗凝固剤療法中
には減少することが知られている。（Bauer,K.A.,Bloo
d,70巻,343-350（1987年））。このようなレベルの測定
は、患者の健康管理にとって重要なことである。
トロンビンには数々の天然の基質や阻害物が存在する
ため、トロンビン及び抗原の形成はフィブリン形成と同
時である必要はない。しかし、多くのプロトロンビンの
活性化が起こる場合にはトロンビンの量もやはり増加
し、フィブリン形成及びおそらくは血栓形成が起こる可
能性も増大する。それと反対に、わずかなプロトロンビ
ンの活性化が起こる場合には、フィブリノーゲンを切断
可能なトロンビンの量及び血栓形成の可能性も減少す
る。
最近では、活性血栓症診断に関するテスト、並びに、
凝固に関する出血問題を予測かつ診断するための数多く
のテストが存在する。例えば、PTは凝血因子VII、Ｘ、
及びＶ、プロトロンビン及びフィブリノーゲンを含む凝
血システムの部分の総括的な統合性をテストする一段階
の凝固アッセイであり、経口抗凝固剤が患者に投与され
ている場合に有効である。先に記述したように、APTTは
ヘパリン性抗凝固剤療法をモニターするのに有効であ
る。ラジオイムノアッセイもまた、本来の及び異常なプ
ロトロンビンレベルの測定に有効である。
フィブリノペプチドＡ及び可溶性フィブリンを含むト
ロンビン活性の結果を測定する幾つかの免疫学的テスト
が存在する。フィブリノペプチドＡのレベルは明らかな
血栓症と伴に上昇するが、フィブリノペプチドＡの濃度
と血栓症の危険率との間にはほとんど相関性が見られな
い。トロンビン−アンチトロンビンIII複合体に対する
ポリクローナル抗体に基づくイムノアッセイは、主たる
生理学的インヒビターであるアンチトロンビンIIIに結
合している不活性なトロンビンの循環濃度の測定に有効
である。
凝血過程の後半においては、プラスミンによる形成血
栓の線維素溶解が起こり、これはD-Dimer、総分解産物
及びフィブリン分解産物のような数々の免疫学的テスト
により測定可能である。
先に述べたアッセイのいずれに関しても、血栓症を予
測することが証明されているものはない。
高感度のモノクローナル抗体を基にしたテストが、最
近ではプロトロンビン活性化の程度の測定に利用可能で
ある。このようなテストは、血栓症の危険率が増大して
いる患者の同定、抗凝固剤療法を行っている患者の管理
法の改善、２次合併症診断技術の改良、血栓症に帰因す
る罹患率の低減、及び、血栓症により社会に課せられる
経済的負担の低減に有効であると思われる。
F1.2の測定を通してプロトロンビンの活性化の測定を
試みるある種のアッセイが文献に記載されている。H.La
u（J.Biol.Chem.,254巻,8751-8761（1979年））は、F2
に対するポリクローナル抗体を使用するプロトロンビン
フラグメントF2/F1.2の定量に関するラジオイムノアッ
セイについて記載している。これらのポリクローナル抗
体は、数々の免疫学的精製段階を通さない限り、プロト
ロンビンと切断により遊離するそのフラグメントを完全
に区別しはしない。
欧州特許出願0 303 983（′983）は、F2/F1.2のカル
ボキシ末端に相当する合成ペプチドを動物を免疫するた
めに用いてF2/F1.2に対するポリクローナルな抗血清を
取得するという、類似したアッセイについて記載してい
る。これらの抗体がF1.2の検出のためのイムノアッセイ
において機能するためには、やはり免疫学的精製が必要
である。
′983により述べられているイムノアッセイでは、F1.
2のカルボキシ末端上のエピトープに結合する精製ポリ
クローナル抗体で固相をコートし、次いで検出抗体とし
てラベル化ポリクローナル抗プロトロンビンを導入す
る。このアッセイはF1.2を検出することが可能ではある
ものの、このアッセイには、特異性が低い及び試薬ロッ
トの標準化が困難であるといった問題を含むポリクロー
ナル抗体の使用における固有の問題が存在する。Pelze
r,H.,Supp.2 Haemostasis Abst.18巻,No 102（1988年）
も参照。
Shi,Q.,Thromb.Hemost.62巻,165,Abst.No.493（1989
年）による「フラグメントF1.2に対する２サイト酵素イ
ムノアッセイを用いるプロトロンビンの活性化検出」と
いうアブストラクト中では、′983に類似したイムノゲ
イン及びテスト用アッセイが記載されている。F1.2のカ
ルボキシ末端に匹敵する合成ペプチドに対するポリクロ
ーナル抗体が固相の捕獲抗体として用いられ、更に、ラ
ベル化モノクローナル抗F1.2が検出用に用いられている
が、これはおそらくF1領域におけるものであると思われ
る。Shi他は、ポリクローナルな捕獲抗体のイムノアフ
ィニティー精製法は必要ないと述べている。このアブス
トラクトからは果して他の精製法が使用されているかど
うかは不明である。試薬がポリクローナル抗体であると
いうことから、その特異的有効性は共給動物の寿命によ
り制限され、かつ再現的ではなくなる。
プロトロンビンの活性化測定、血栓症症状の形成診断
及び抗凝固剤療法の効果のモニターのための抗原検出の
問題に対する解決策が、F1.2を検出するラジオ及び酵素
イムノアッセイの利用によって得られてはいるものの、
現時点で有効なテスト法は、使用法が頻雑であるか、臨
床医が必要とする程感度が良くないか、特異性が低いか
のいずれかである。引用したアッセイ全てにおいて存在
する一つの固有な障害とは捕獲抗体としてのポリクロー
ナル抗体の使用である。F1.2に加え、プロトロンビン、
F1そしておそらくは他のフラグメントもこれらのポリク
ローナル抗体により捕獲され得るであろうと考えられ、
そのためにテストの特異性が低減している。抗原に対す
るモノクローナル抗体及びこれらの高度に特異的であり
かつ感度の良いモノクローナル抗体あるいはそれらのフ
ラグメントを使用する新しいイムノアッセイが必要とさ
れる。
発明の概要 本発明は、サンプル中のプロトロンビン活性化ペプチ
ドF1.2及びF1.2.3並びにそれらの変性型des-RF1.2,F2及
びdes-RF2に対するアッセイに関する改良法を提供す
る。特に、各々の抗原上のカルボキシ末端上のエピトー
プに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体及び
それらのフラグメントを特許請求する。又、これらのモ
ノクローナル抗体を含む、サンプル中の抗原に対するア
ッセイ用の診断キットについても特許請求する。
発明の詳細な説明 本発明の抗体とは、抗原のカルボキシ末端に対して特
異的なモノクローナル抗体である。とりわけ、適切な抗
原のアミノ酸配列に基づいた合成ペプチドをこれらのモ
ノクローナル抗体を産生するためのハプテンとして用い
た。
合成ペプチドは、ペプチド結合により結合されている
既知の配列を有するアミノ酸鎖であり、例えば化学的あ
るいはレコンビナント的手法によって調製可能なもので
ある。この配列を特定の天然物のものと同一にすること
が可能である。小さな合成ペプチドは、それらをイムノ
ゲン性にするために適切な担体蛋白質と複合体を形成さ
せてもさしつかえない。これらの複合化蛋白質を、合成
ペプチドによって表現される抗原のカルボキシ末端のエ
ピトープに結合するモノクローナル抗体を動物内に産生
させるためのイムノゲンとして使用した。
本発明において合成ペプチド用に使用された配列は、
プロトロンビン及びトロンビンの既知の切断点のcDNA配
列に由来するものであった。とりわけ、新たに切断によ
って露出する末端カルボキシ基の配列を用いた。これら
の配列を用いることにより、我々は、プロトロンビンと
たとえあるとしても低い交差反応性を有するモノクロー
ナル抗体を発生させ、選択した。
F1.2、従ってF2もであるが、それらのカルボキシ末端
に対するモノクローナル抗体を産生させるイムノゲン性
複合体のうち一種類の合成ペプチドのアミノ酸配列は、
少なくともIle-Glu-Gly-Arg-OHを含有する。最も望まし
い合成ペプチドはSer-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH
という配列を含有する。カルボキシル酸としてのカルボ
キシ末端のアルギニンはこの特異的なイムノゲンにおけ
る必須成分である。
F1.2.3のカルボキシ末端に対するモノクローナル抗体
を産生するためのイムノゲンとして用いられる合成ペプ
チドに関するアミノ酸配列は、少なくとも配列Phe-Asn-
Pro-Arg-OHを有する。最も好ましい配列はTyr-Gln-Thr-
Phe-Phe-Asn-Pro-Arg-OHである。分解フラグメントdes-
RF1.2及びdes-RF2に対するモノクローナル抗体を産生す
るために好ましい配列はSer-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-
OHである。
これらのペプチドは、専門技術に熟練した者には良く
知られている方法を用いて産生可能である。ペプチド合
成に関する有機化合法は、均一化相あるいは固相のいず
れかを使用する縮合反応を用いるアミノ酸のカップリン
グを含む。縮合反応に対して一般的に良く知られている
方法としては、「ペプチド、分析、合成、生物学」第１
〜第３巻（E.Gross編集,1979年,1980年,1981年）により
記載されるように、カルボジイミド法、アジド法、混合
無水化物法及び活性化エステル類を用いる方法が含まれ
る。固相法は、Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.,85巻,214
9（1963年）により記載されている。適切なペプチドはC
ambridge Research Biochemicals社、Cambridge,UKある
いはMultiple Peptide Systems社、San Diego,Californ
ia等の供給会社から購入することも可能である。
我々は選択した合成ペプチドを担体分子に複合化さ
せ、イムノゲンを産生させた。有効な担体分子であれば
どんなものでも使用可能である。適切な担体分子には、
例えばオバルブミン、ポリサッカライド、海洋性鍵穴型
カサ貝（marine keyholelimpet）のヘモシアニン及びト
ランスフェリンが含まれる。本発明における使用に関し
て最も好ましい担体とはオバルブミンである。
複合化法は専門技術に熟練したものには良く知られる
ところのものであり、例えばPeter,K.,Ann.Rev.Bioche
m.,46巻,523-551（1977年）に示されるように、化学架
橋試薬あるいは酸化反応の使用を含み得る。我々は、合
成ペプチド及び担体蛋白質の複合体を、架橋試薬Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオ
ネート（SPDP）及びCarlsson,J.,Biochem J.,173巻,723
-737（1978巻）の基本的方法を用いて調製した。
M.Cianfriglia他、Hybridoma2巻４号、451-457,（198
3年）により記載されているマウスにおける免疫法の改
良法により適切な抗−抗原モノクローナル抗体が産生さ
れた。これ以前に行った他種の免疫法を用いた５回の細
胞融合の試験では、イムノゲンに対して特異的である適
切なIgGモノクローナル抗体が産生されなかったため、
この改良法が必要であった。しかしながら、適切なモノ
クローナル抗体を産生しなかった免疫化マウスからの血
清は、抗原に対して非常に反応性及び特異性の高いポリ
クローナル抗体を含有していた。
完全フロインドアジュバント中の複合化合成ペプチド
の腹腔内注射（I.P.）によりマウスを免疫した。初回抗
原刺激後、マウスを21日間そのままにしておき、次いで
不完全フロインドアジュバント中の同一のイムノゲンで
追加抗原刺激を行った。最終追加抗原刺激は、静脈注射
（I.V.）及び腹腔内注射（I.P.）の両ルートにより、PB
S中の同一のイムノゲンを用いて、25日、26日及び27日
目に行った。マウスは好ましい媒体ではあるが、ラット
やモルモットのような他の動物も使用可能である。
免疫したマウスを28日目に屠殺し、脾細胞を摘出し
た。Kohler及びMilstein,Nature,256巻,495（1975年）
の改良法（B.Butman,他、Appl.Env.Micro.,54巻,1564-1
569（1983年））に従い、細胞を非分泌型の血漿細胞系
（P3×63Ag8.653,ATCC Number CRL 1580,Rockville,M
d.）と融合させてハイブリドーマを作成し、Iscove′s
Modified Dulbecco′ｓ培地にヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミジン（HAT）を加え、更に20％ウマ血
清又は５％のウシ胎児血清、１％のNutridoma（Boehrin
ger Mannheim）及び腹膜単核フィーダー細胞を加えたマ
イクロタイタープレート中に撤いた。上清を、間接酵素
結合イムノアッセイ（「ELISA」）により抗−抗原抗体
についてスクリーニングし、選択されてきた陽性のハイ
ブリドーマカルチャーをクローン化した。
適切な抗体の産生に関するハイブリドーマのスクリー
ニングは本発明においては絶対必要な段階である。例え
ばF1.2に対するモノクローナル抗体のスクリーニングに
おいては、モノクローナル抗体はプロトロンビンあるい
はF1とは非反応性であるべきで、さもなくば、少なくと
も最小限度の交差反応にとどまるべきである。又、その
抗体は、単に免疫化に用いた合成的に産生されたペプチ
ドのみではなく、天然のF1.2及びF2上のエピトープを認
識しなくてはならない。
スクリーニングアッセイにより、選択された陽性のハ
イブリドーマに由来する44種のモノクローナル抗体が前
述の要求を満たす特異性を示すことが明らかにされた。
８種類のハイブリドーマをクローン化し、選択された
６種類のクローンを標準的な方法を用いてマウス中の腹
水腫瘍として増殖させた。モノクローナル抗体の増殖に
関する他の方法は専門技術に熟練した者には良く知られ
ており、中空線維カートリッジあるいは発酵装置のよう
なバイオリアクターにおける増殖を含む。これらの方法
を用いて増殖させる抗体のうちのいずれのものについて
も、その特性決定をしてゆくことが必要である。腹水中
のモノクローナル抗体のELISAによる特性決定を行い、
６種類のクローン化ハイブリドーマにつきカルチャー中
に示される特異性を確認した。Protein Aアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いて、抗体をこれらの腹水液
から精製した。専門技術に熟練した者には良く知られて
いる他の免疫精製法も有効であると思われる。
精製された抗−抗原モノクローナル抗体を、アイソタ
イプ及び等電点について調査した。ELISAを使用する免
疫化学的分析法を行いモノクローナル抗体の特異性を決
定した。６種類全ての抗体は以下のような抗原に対して
特異的に結合することが示された:F1.2、F2、及びPF2-O
VA。PF2-OVAはF1.2カルボキシ末端に匹敵する合成ペプ
チドとオバルブミンとの複合体を示す。以下に示す抗原
に対しては、いづれの抗体も特異的結合性を示さなかっ
た：プロトロンビン、トロンビン、F1、des-R-PF2-OV
A、オバルブミン。des-R-PF2-OVAは、オバルブミンとde
s-RF1.2のカルボキシ末端に匹敵する合成ペプチドとの
複合体を示す。
これらの抗−抗原モノクローナル抗体及びそのフラグ
メントは、抗原を検出するために種々のイムノアッセイ
において使用することが可能である。抗原に対するアッ
セイに対して好んで用いられる方法は、少なくとも１種
類の抗−抗原モノクローナル抗体及び少なくとも１種類
のラベル化分析物質を含み、以下のａ）〜ｇ）で構成さ
れるサンドウィッチイムノアッセイにおいては、ラベル
化分析物質はラベル化抗体あるいはラベル化ペプチドで
良く、好ましいのは抗−抗原抗体、更に最も好ましいの
はポリクローナル抗体である； ａ） 抗−抗原モノクローナル抗体での固相のコート、 ｂ） コートされた固相へのサンプルの添加及びインキ
ュベーション、 ｃ） 固相の洗浄、 ｄ） ラベル化抗−抗原抗体の添加及びインキューベー
ション、 ｅ） 固相の洗浄、 ｆ） ラベル活性の検出、及び ｇ） 反応の解析。
ラベル化抗体は固相上の抗体又は抗原に対して結合特
異性を有し得る。サンプルとしては血漿が好ましいが、
血清、全血液、尿、脳脊髄液及び滑液等の他種の体液も
使用可能である。洗浄液は一般的にはバッファー化溶液
であり、水でも良いし、あるいは他の成分を含有してい
てもさしつかえない。ラベルは、酵素系に関しては西洋
ワサビのパーオキシダーゼが好ましいが、専門技術に熟
練した者には知られているように、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ルシ
フェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼも使用可能であ
る。非酵素系における有効なラベルの例としては、フル
オロイソチオシアネート、ローダミン、フルオレセイン
等の螢光ラベル、ラジオイムノアッセイ用のラジオアイ
ソトープ及び粒子が含まれる。
例として提示するがこれらに制限するつもりのない抗
原のインビトロ検出に関する他の方法には、競合的阻害
アッセイ、一段階アッセイおよび凝集アッセイがある。
本発明は、サンプル中の抗原のアッセイに使用され、
実質的にプロトロンビンには非反応性である抗−抗原モ
ノクローナル抗体を少なくとも一種類含む診断テスト用
キットを含む。加えて、診断用キットは、バッファー
液、ラベル化されたポリクローナルあるいはモノクロー
ナル抗−抗原抗体、抗原又はペプチド、及びキットの使
用に必要ないかなる付属物をも含んでいてさしつかえな
い。
以下の実施例は、抗−F1.2モノクローナル抗体の産生
及び使用について記載する。これらの実施例は単に本発
明の例示のために提供するのであり、いかなる場合にお
いても明細書で述べきれなかった事柄に係わる制限であ
るとして解釈されるものではない。
実施例１ 合成ペプチドの調製 免疫複合体の調製に用いられ、更に抗−F1.2抗体のス
クリーニング並びに特性決定に関して用いられる合成ペ
プチドのアミノ酸配列を表１に示す。
＊全ての合成ペプチドは、アミド化カルボキシル末端
（−CONH2）を有するPF2.NH2を除き、Ｃ末端において未
修飾のカルボキシル基を有する。４種類のペプチドは、
単に複合体形成の目的のために、Ｎ末端にアミノ酸Ｃ及
びＧを有する。
**記号＝Ａ（アラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｄ（ア
スパラギン酸）、Ｃ（システイン）、Ｅ（グルタミン
酸）、Ｇ（グリシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイ
シン）、Ｋ（リシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニ
ン） RF2、desRPF2、XPF2、及びPF2.14と表示されるペプチ
ドはCambridge Research Biochemicals社、Cambridge,U
Kより購入し、残りのペプチドはMultiple Peptide Sy
stems社、San Diego,CAより購入した。ペプチドPF2の配
列、Cys-Gly-Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHは、
F1.2カルボキシ末端の最後の８つのアミノ酸、−Ser-As
p-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHに複合体形成に都合の良
い追加的な２つのアミノ酸、システイン及びグリシンを
加えたものを基にしている。ペプチドdesRPF2、XPF2及
びPF2.14もまた複合体形成の目的のためにそれらのＮ末
端に（CG）を含有する。
実施例２ 免疫複合体の調製 先の実施例１に記載されているPF2とオバルブミンと
を、ヘテロ二官能性架橋試薬、Ｎ−スクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）を用
いてカップリングした。
カップリング法については、SPDPのエタノール溶液を
調製し、Carlsson（上記参照）の方法を用いて活性エス
テルの濃度を決定した。オバルブミン（グレードV;Sigm
a Chemical Co.社）を100mMNaCl、100mMNaHPO4、0.02
％NaN3、pH7.5のカップリングバッファー中に溶解し、
次にカップリングバッファーで平衡化したSephadex G-2
5TM（Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.社）上でゲル
濾過した。オバルブミンを室温で30分間、17倍モル過剰
なSPDPと伴にインキュベートした。オバルブミンのチオ
ール化の程度については、ジチオスレイトールでチオー
ル化化合物を還元し、ピリジルチオンの遊離を343nmで
モニターすることにより、12.5モルピリジルジスルフィ
ド基／モルオバルブミンであると推定された。カップリ
ングバッファーに溶けている1mMのPF2を50mMのジチオス
レイトールと伴に室温で10分間インキュベートすること
によってPF2のＮ末端システィンスルフヒドリル基を還
元した。PF2を、即座にカップリングバッファーで平衡
化してあるSephadex G-10TM（Pharmacia LKB Biotechno
logy, Inc.社）でゲル濾過し、次いでオバルブミンのピ
リジルジスルフィド部位に比較して1.25モル余剰にして
チオール化オバルブミンと伴に室温下でインキュベート
した。カップリング反応は、343nmの最大吸光度及び既
知の消光率（8.08ml/μmol）を有するピリジルチオンの
遊離により分光光度計でモニターした。カップリングは
10分以内に完了し、平均結合量は8.9molPF2/molオバル
ブミンであった。イムノゲンとしての使用に先立ち、PF
2-OVAとして同定された複合体を−20℃下に保存した。
実施例３ 他のペプチド含有複合体の調製 オバルブミンとdesRPF2あるいはXPF2との複合体、及
び西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP;Sigma Chemical C
o.社）とPF2.14との複合体は、先の実施例２に架橋試薬
として記載したSPDPを用いて調製した。ピリジルジスル
フィド化反応に関しては、SPDPを0.83:1のモル比のHRP
と伴に、あるいは、30:1のモル比のオバルブミンと伴
に、室温にて75分間インキュベートした。平均最終カッ
プリング量は、10.2モルdes-RPF2/モルオバルブミン、
7.4モルXPF2/モルオバルブミン、及び1.6モルPF2.14/HR
Pであった。複合体は、抗体のスクリーニング及び特性
決定に使用するまでは−20℃下に保存した。
実施例４ 抗ペプチドモノクローナル抗体のスクリーニ
ング及び特性決定のための蛋白質の調製 F1.2、F2、及びプロトロンビンは、カルチャー液中の
抗ペプチド抗体に関するスクリーニング中の過ちを除去
する目的で、均一になるまで慎重に精製する必要があ
る。プロトロンビンは、抗−ペプチド抗体のスクリーニ
ング及びその抗体価測定を妨げる可能性のあるF1及びF2
のような混入物質をしばしば含有する。希望どうりの抗
体はプロトロンビンを認識しないはずであるので、プロ
トロンビンはF1.2及びF2を含有しないことが重要であ
る。
ヘパリン−SepharoseTM−カラム（Pharmacia LKB Bio
technology, Inc.社）を用いて、市販薬として入手可能
なプロトロンビン（Enzyme Research Inc.社）から低
レベルの混入物質を除去した。これは、20mMトリス、50
mMNaCl、pH7.5のバッファーに対して12mgのプロトロン
ビンを一晩、４℃下で透析し、後に、同じバッファーで
平衡化した2.6×29cmヘパリンSepharoseTMカラムにゆっ
くりと通して行った（上述のLauを参照のこと）。精製
プロトロンビンは、還元化及び非還元化条件での銀染色
ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（「SDS-PAGE」）上で一本のバンドを示した。
未精製F1.2は、触媒量の精製因子Xa（Boehringer Man
nheim社を、５μM ThromstopTM（American Diagnostic
a社）（NAPAP、Ｎ−アルファー−（２−ナフチルスルフ
ォノニルグリシル）−D,1−アミジノ−フェニルアラニ
ン−ピペリジド）及び100mMCaCl2の存在下で25mgの精製
プロトロンビンと反応させて生成した。反応の進度をSD
S-PAGEによってモニターし、最終量各々50μＭのGGACK
TM（Calbiochem Corp.社）（ダンシル−Ｌ−グルタミ
ル−グリシル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン）及
びPPACKTM（Calbiochem Corp.社）（Ｄ−フェニルアラ
ニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケト
ン）で、因子Xa及びトロンビンを不可逆的に阻害するこ
とにより反応を停止させた。ThromstopTM及び高レベル
のCaCl2が、プロトロンビンの不活性化、あるいはF1.2
の破壊からF1.2産生中に生産されるトロンビンを停止す
るためには必要である。PPACKTMはThromstopTMと置き換
えて使用することは不可能であり、これは希望するトロ
ンビンに加えて因子Xaを阻害してしまうためである。
先のように産生されるF1.2は、最初に20mMトリス、50
mM NaCl、pH7.4のバッファー液に対して４℃で一晩それ
を透析し、先にプロトロンビンの精製に関して記載した
条件を用いて2.6×29cmのヘパリンSepharoseTMカラムに
かけて精製した。F1.2を含むピークをSDS-PAGEにより同
定し、続けて、バッファー溶液で平衡化したMono-QTM、
Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.社、HR5/5高速蛋白
質液体クロマトグラフィー（FPLC）カラムにかけた。精
製F1.2は、50分のNaCl濃度勾配（20mMトリスpH7.4に溶
解している50mM NaClから500mM NaCl）における最後の
ピークとして溶出された。このF1.2は、クーマシーブル
ー染色SDS-PAGEに基づくと、純度95％以上であり、43,0
00ダルトンという見かけ上の分子量を有した。微量混入
物はF1、及びしばしばプロトロンビンを含有した。
未精製のF1及びF2は、Oxyuraneousの毒液由来のプロ
テアーゼ（約0.1mg;Sigma Chemical Co.社）でプロトロ
ンビン（85mg）をF1,F2,及びトロンビンへと切断するこ
とにより生成した。反応の進度はトロンビン感受性の色
素原性基質でトロンビン活性の増加を観察することによ
りモニターした。インキュベーションは、最終の濃度が
各々50μＭになるようにPPACKTM及びGGACKTMを添加する
ことにより、60分後に停止させた。F1及びF2の両物質共
先にF1.2の精製に関して記載したようにMono-QTMカラム
で精製した。
実施例５ 免疫法 BALB/cマウスをCianfriglia法の改良法を用い、先の
実施例２において記載したPF2‐OVA免疫複合体で免疫し
た。１日目に完全フロインドアジュバント中の50μｇの
イムノゲンをI.P.（腹腔内注射）によりマウスに初回免
疫投与し、21日間そのままにした。22日目にマウスを不
完全フロイドアジュバント中の50μｇの免疫複合体を追
加免疫投与し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶かし
た５μｇの免疫複合体を用いて25日、26日及び27日目に
腹腔内注射（I.P.）及び静脈注射（I.V.）の両方を通し
て最終追加免疫投与した。28日目に脾蔵を摘出し、脾細
胞をハイブリドーマの融合のために単離した。
実施例６ ハイブリドーマの調製 免疫脾細胞をKohler及びMilsteinにより記載された技
術の先のButmanにおいて記載されている改良法によりP3
×63Ag8.653マウスミエローマ細胞に融合させた。「Fus
ion97」細胞を20％ウマ血清及びHATを含むIscove′s Mo
dified Dulvecco′s Mediumに撒き、また、「Fusion9
8」細胞をマウス腹膜侵出細胞のフィーダー層にかぶせ
る様にして１％NutridomaTM（Boehringer-Mannheim
社）、５％ウシ胎児血清及びHATを含有するIscove′s M
odified Culbecco′s Mediumに撒いた。2,3日ごとに各
カルチャー穴内の50％の培養液を交換することでカルチ
ャーの栄養補給を行った。
実施例７ 抗体のスクリーニング HAT培地中でハイブリドーマの増殖を示すカルチャー
を、F1.2と反応するモノクローナル抗体の産生に関して
ELISAによりスクリーニングした。この目的のために100
μl/穴の精製F1.2（５μg/ml）をpH7.5のPBSに溶かし、
一晩Immulon IITMマイクロタイタープレート（Dynatech
社、Va.）上にコートし、その後３％ウオゼラチンを含
むPBS溶液でブロックした。その後ハイブリドーマの培
養上清（100μl/穴）を添加して37℃下で60分間インキ
ュベートし、0.5％グリセロール及び0.05％Tween20
TM（Rohm and Haas社）を含む脱イオン水で５回洗浄し
て未結合抗体を除去した。特異的な抗体結合は、100μl
/穴のマウスイムノグロブリン（IgG＋IgM）に対するHRP
複合化ヤギ抗体を60分間反応させ、後に100μl/穴のテ
トラメチルベンジジン色素原性基質と共に30分間発色さ
せて検出した。反応は100μl/穴の2N H2SO4を用いて停
止させ、450nmで自動マイクロプレート測定器を用いて
測定した。その後、陽性の穴を増殖させ、ELISAを用い
てF1.2、PF2-OVA、OVA及びプロトロンビンに対する特異
性につき再テストした。Fusion97は、213のうち13のF1.
2特異的ハイブリドーマを産生し、Fusion98は、635のう
ち35のF1.2特異的ハイブリドーマを産生した。アイソタ
イプの決定は、市販の二重拡散免疫法キットを培養上清
に用いて行った。Fusion97及びFusion98由来の合計８つ
のハイブリドーマが特異性のデーター及びIgGのアイソ
タイプに基づき、クローニング用に選択された。
実施例８ ハイブリドーマのクローニング及びスケール
拡大 ２回連続の限界稀釈クローニングにより、各々の50％
L929ならし培地を含むアミノプテリン抜きのハイブリド
ーマ培養液中にハイブリドーマをクローン化していっ
た。L929ならし培地とは、ATCCより取得された集密的単
層のL929マウス線維芽細胞を10％ウシ胎児血清を含むIs
cove′s Modified Dulbecco′s Medium中で3,4日増殖さ
せ、後にならし培地を遠心及び過滅菌して調製した。
２種類の融合細胞の各々から得られた３種類ずつの安定
なハイブリドーマクローンを、従来の方法に従いPrista
neR（Aldrich Chemical Co.社）を感作CD2F1マウス（BA
LB/c×DBA F1雑種）中の腹水腫瘍として増殖させた。
プロテインA SepharoseTMを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、６種類のIgGモノクローナル
抗体が腹水から精製された。
実施例９ 腹水液中のモノクローナル抗体の特性決定 腹水中のモノクローナル抗体は、Immulon IITMマイク
ロタイタープレートの穴にコートした以下の抗原;F1.
2、F1、F2、PF2-OVA、des-R-PF2-OVA及びプロトロンビ
ン、を用いて先の実施例７において記載したELISAによ
り特異性を確認した。結果を表２及び図２にまとめた。
６種類のモノクローナル抗体全てはテストした８種類の
抗原に対して類似したELISA反応性プロフィールを示し
た。陽性反応はF1.2,R2,及びPF2-OVAに対して観察され
た。陰性反応はF1、des-R-PF2-OVA、OVA、プロトロンビ
ン及びトロンビンに観察された。
実施例10 精製モノクローナル抗体の特性決定 精製した６種類のモノクローナル抗−F1.2抗体につ
き、物理学的性質及び特異性という見地からの特性決定
を行った。
ａ）物理学的性質 ｉ）表３は、アイソタイプ、等電点（pI）及びマイクロ
タイタープレートの穴を飽和する必要量、を含むモノク
ローナル抗体の物理学的性質を示している。抗体のアイ
ソタイプは先の実施例７で記載したようにして決定し
た。等電点はPharmacia LKBBiotechnology,Inc.社のPha
st-Gel SystemTMを用いる等電点電気泳動により決定し
た。バンドパターンは、ポリクローナルではなく、モノ
クローナルな抗体の存在に矛盾しないものであった。
ii）マイクロタイタープレートの穴を飽和するのに必要
な抗体量を決定するために、150mM NaCl、20mMトリス、
5mMCaCl2、pH7.4のバッファー中に溶かした5pg/mlと90
μg/mlとの間の抗体100μｌを、室温で18時間、Griener
TMマイクロタイタープレート（Organon Teknika,Inc.
社）の穴でインキュベートした。その穴を300μl/穴の1
50mM NaCl、0.05％Tween20TM溶液で３回洗浄し、次い
で、37℃下で１時間、200μｌの150mM NaCl、20mMトリ
ス、5mMCaCl2、５％無脂肪ドライミルク、pH8.2でブロ
ックし、その後に上述のように洗浄した。Boehringer M
annheim社のHRPでラベル化したヤギの抗マウスイムノグ
ロブリンを、37℃下で１時間、各穴でインキュベートし
た。穴を上述のように洗浄し、指示薬としてテトラメチ
ルベンジジン／過酸化水素を、反応停止溶液として硫酸
を、更に10分間の発色時間を用いて、450nmでHRP活性を
測定した。HRP活性がそれ以上増加しないモノクローナ
ル抗体濃度を穴飽和に必要な濃度とみなした。６種類の
モノクローナル抗体に関してはモノクローナル抗体につ
いて通常報告される価に矛盾しない抗体量で充分な穴飽
和が起った。
iii）特異性。表３は、F1.2、F1、F2、プロトロンビ
ン、トロンビン、オバルブミン−PF2免疫複合体、des R
PF2、XPF2及び無関係なペプチド（PCPr）とのオバルブ
ミン複合体、及びピリジル二硫化オバルブミンに関する
精製抗−F1.2抗体の特異的をまとめたものである。
これらの実験に使用するために、GrienerTMマイクロ
タイタープレートを150mM NaCl、20mMトリス、5mMCaC
l2、pH8.2に溶解している抗原（１μｇのトロンビン；
各100ngのF1.2、F1、F2、プロトロンビン、オバルブミ
ン−PCPr及びピリジル二硫化オバルブミン；各10ngのPF
2、des RPF2、及びXPF2とのオバルブミン複合体）で、
室温で18時間コートした。その後プレートを上述のよう
に洗浄及びブロックした。モノクローナル抗体（150mM
NaCl、20mMトリス、5mMCaCl2、0.02％Tween-20TM、pH7.
4のバッファー中に溶解した50pg/mlから70μg/μｌの間
の抗体100μｌ）を、コートしたプレートを用いて37℃
で１時間インキュベートした。各プレートを上述のよう
に洗浄し、上述のHRP−ラベル化ヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋
Ｌ）を用いて結合抗体を検出した。各抗体に対する力価
はプレートに結合したオバルブミン−PF2複合体を用い
ての結合曲線の中間点であった。（図３参照）反応性と
は、５μg/μｌの抗体を使用した場合の450nmにおける
バックグラウンドの吸光度の３倍以上の吸光度であると
して定義した。
６種類のモノクローナル抗体の各々は、5-10Hを除い
て、F1、プロトロンビン（II）、トロンビン（IIa）、
ピリジル二硫化オバルブミン（pyr-OVA）、あるいはdes
-R-PF2、XPF2、及びPCPrとオバルブミンとの複合体を認
識せず、F1.2及びF2を認識した。モノクローナル抗体5-
10Hは他の５種類のモノクローナル抗体より高いバック
グラウンド値を示すが、おそらくはこれは非特異的な相
互作用に起因するものと思われる。反応性をより厳密に
定義する試験を行ったところ（50μg/mlの抗体を使用し
た時でのバックグラウンドより大きいA450値）、抗体6-
9A、8-11H、9-1A、2-7C、及び5-3Bは依然としてF1、プ
ロトロンビン、トロンビン、あるいはテストに用いたオ
バルブミン複合体のうちのいずれのものをも認識しなか
った。
iv）サンドウイッチELISA法において溶液からのF1.2捕
獲能についても検査した。プレート飽和実験に関して先
に記載したように、つまり、プレートを飽和するとして
知られる抗体濃度を使用して、抗体コート化GrienerTM
プレートを調製及びブロックした。150mM NaCl、20mMト
リス、5mMCaCl2、pH7.5の溶液中のF1.2（0.023-23nM）
の種々の濃度サンプルをプレート穴内で37℃下１時間イ
ンキュベートし、未結合のF1.2を先のように洗浄した。
プロトロンビンのカルシウム依存的コンフォマー（実施
例11参照）に対するHRPラベル化ポリクローナル抗体を
プレートと供に、37℃下で１時間インキュベートし、そ
の後プレートを洗浄した。HRP活性は、先に記載したよ
うに測定した。
モノクローナル抗体に対するF1.2の結合曲線を図４に
示す。各抗体は溶液相のF1.2に結合可能であり、F1.2の
顕色用に使用することが可能であった。抗体5-10H及び5
-3Bはより低濃度のF1.2を検出するという意味で優れて
いた。非特異的結合性が5-10Hによって示されるため、5
-3BがF1.2のELISA法を顕色するための抗体として選択さ
れ、1989年11月２日に、12302 Parklawn Drive, Rockvi
lle, Md. 20852,USAに位置するAmerican Type Culture
Collectionに寄託し、ATCCHB 10291の受託番号を取得し
た。
ｖ）モノクローナル抗体5-3Bのエピトープ要求性をより
厳密に定義するために追加的な特異性研究を行った。飽
和濃度の5-3Bで前述のようにコートしたマイクロタイタ
ープレートを用いる競合的ELISA法を使用した。HRPラベ
ル化PF2.14（10nM複合体を50μｌ使用）を150mM NaCl、
20mMトリス、5mMCaCl2、0.05％Tween-20TM、pH7.2のバ
ッファー溶液存在下で種々の濃度の同容量の精製F1.2あ
るいは合成ペプチドと共に37℃下で75分間インキュベー
トした。穴を300μｌの150mM NaCl、20mMトリス、0.05
％Tween-20TM、pH7.2のバッファー溶液で４回洗浄し
た。HRP活性は先に詳細を記載したようにして測定し、
それはHRP-PF2.14の結合度合を示すものであった
（Ｂ）。競合性抗原のない条件では至適結合（Bo）が観
察された。B/Bo比は、HRP-PF2.14に関する結合パーセン
ト率を示すものであった。
F1.2及びPF2.14の両方はHRP-PF2.14と効果的に競合し
（図５）、ラベル化ペプチドを用いる競合的アッセイが
実現可能なものであることが示され、更に、5-3Bが天然
の蛋白質及び合成ペプチドの両方を認識し得ることが確
認された。それと比較して、des-RPF2及びPF2.NH2のい
ずれのものもHRP-PF2.14とは競合せず、又、PF2.Kは高
濃度においてのみ競合した（図６）。これらの結果によ
り、5-3Bによって認識されるエピトープには、未修飾の
カルボキシル基を所有するＣ末端アミノ酸、あるいは、
未修飾のカルボキシル基を所有しないＣ末端アルギニン
のいずれの存在も不充分なものであり、未修飾のカルボ
キシル基を所有する陽性に荷電されているＣ末端アミノ
酸（例えばリシン）の存在が不充分ながらも重要である
ことが示された。至適認識は、未修飾のカルボキシル基
を有するＣ末端アルギニンが存在する時に起こる。
HRP-PF2.14と競合する種々な長さのペプチドの効力比
較により、5-3Bによって認識されるために重要なエピト
ープサイズは６から８アミノ酸の間であることが示され
た（図７）。
実施例11 プロトロンビンのカルシウム依存的コンフォ
マーに対する抗体の調製 イムノゲンが、ウシトロンビンではなくヒトトロンビ
ン及びヒトプロトロンビンのフラグメントF1であること
を除き、Tai, N. M., J. Biol. Chem., 255巻,2790（19
80年）により記載されるとうりに抗体を調製かつ精製し
た。これらの抗体はF1、プロトロンビン及びF1.2をそれ
ぞれの天然なカルシウム異存的コンホメーションにおい
て認識する。
実施例12 プロトロンビンのカルシウム依存的コンフォ
マーに対するHRPラベル化抗体の調製 プロトロンビンのカルシウム依存的コンフォーマーに
対する抗体を、架橋試薬としてSPDPを、そしてCarlsson
（上記参照のこと）の方法を用いて、HRPに対してカッ
プリングさせた。本実施例と実施例１のとの相違とは、
最初に抗体及びHRPの両方をSPDPを用いる反応によりチ
オール化したことである。HRP1モルあたりにおおよそ１
箇所のピリジル二硫化部位が導入された。チオール化HR
Pを、pH4.5のカップリングバッファーに溶解しているジ
チオスレイトールを使用して還元し、pH7.5のカップリ
ングバッファーで平衡化したSephadex G-25TMでゲル濾
過し、次いで、チオール化した抗体とpH7.5室温下で45
分〜60分間反応させた。インキュベーションのモル比は
平均結合量が２〜５モルHRP/モル抗体の間であるような
複合体を生成させるように選択した。7.5％の均一なゲ
ルにおけるSDS-PAGEにより、150,000ダルトン以上の分
子量を有する複合体の存在が確認された。
実施例13 F1.2サンドウィッチELISA F1.2ELISAは、F1.2のカルボキシ末端に特異的な5-3B
モノクローナル抗体を捕獲物質として使用するヒトF1.2
に関する２段階のサンドウィッチイムノアッセイであ
る。
このアッセイで用いられるマイクロタイタープレート
は、１穴あたり0.4μｇの5-3B（150mM NaCl、20mMトリ
ス、pH7.2のバッファー溶液に溶解）を室温で18時間イ
ンキュベートすることによって調製される。この量の抗
体は、この固定化条件において充分にプレート穴を飽和
した。各穴に関し、内容物を吸引し、次いで150μｌの
ブロック溶液（１％オバルブミン、2.5％ショ糖、150mM
NaCl、20mMトリス、0.05％Tween-20TM、pH7.2）を添加
した。室温下での１時間のインキュベーション後、穴の
内容物を再度吸引した。プレートを室温で一晩乾燥さ
せ、後に４℃下で、乾燥剤包を含むマイラーフォイルバ
ック内に保存した。
アッセイにおいて用いる標準液及びコントロールはF
1.2を除去したヒト血漿に精製F1.2を添加して調製し
た。除去の前にクエン酸塩添加した正常血漿をバッファ
ー化した血漿安定化溶液と9:1（v/v）の比率で混合し
た。除去は血漿をBaSO4で二度吸着させて行った（0.22g
BaSO4/ml血漿）。この過程により、プロトロンビン及
びF1.2を含む、ガンマーカルボキシグルタミン酸残基を
含有する蛋白質を除去した。精製F1.2を吸着させた血漿
に添加し、各々、０、0.25,1.0,3.0,6.0及び10nMのF1.2
を含む標準液、及び、0.5nM及び7.0nMのF1.2を含むコン
トロールを作成した。標準液及びコントロールは、1.0m
l分注に分けて凍結乾燥したため、使用する以前にバッ
ファー溶液で再構成する必要がある。アッセイで用いら
れるHRPラベル化抗−カルシウム依存性プロトロンビン
コンフォマー抗体の調製は、先の実施例12に記載してあ
る。この抗体はラビット血清をベースにした基質に溶解
して凍結乾燥したため、検出抗体としてアッセイに使用
する前には蛋白質をベースにするバッファー溶液で再構
成する必要がある。
このアッセイに関する適切なサンプルとは、少なくと
も30％の正常レベルのアンチトロンビンIIIを含有する
ヘパリン処理血漿であった。アッセイに先立ち、血漿
を、アッセイの感度を増加させる目的で用いるバッファ
ー化サンプル処理試薬と9:1（v:v）の比率で混合した。
F1.2を10nM以上含む血漿サンプルは、表４に見られるよ
うに、測定値を0-10nMF1.2というアッセイの有効範囲内
に入れるために0nMF1.2標準液で必要に応じて希釈する
こにより測定可能となる。
血漿サンプル、標準液（0-10nMのF1.2）、あるいはコ
ントロール（レベルＩ及びII）を、コートしてあるマイ
クロタイター用穴を用いて室温で60分間インキュベート
した。プロトロンビンを含む未結合の蛋白質を洗浄によ
り除去した。洗浄は穴の内容物を吸引して行い、その穴
を、300μｌのバッファー化洗浄液で充填し、その後内
容物を吸引し、充填と吸引とは４回繰り返した。第２段
階においては、室温における60分のインキュベーション
中に、結合したF1.2に、プロトロンビンのカルシウム依
存的コンフォマーに対するHRPラベル化抗体という表識
を付けた。二度目の洗浄では未結合のHRPラベル化抗体
を除去した。結合したHRP活性は、テトラメチルベンジ
ジン（TMB）／過酸化水素（1:1混合物）指示剤システム
（10分間のカラー発色）及び停止試薬としての2N硫酸を
使用して測定した。450nmで測定した吸光度はF1.2の濃
度に比例した（図８）。サンプル、標準液、コントロー
ル、検出抗体、TMB/過酸化水素混合物、及び硫酸の容量
はそれぞれ100μl/穴であった。
実施例14 F1.2 ELISAの分析能 アッセイの感度（すなわち、0 nMF1.2標準液から識別
可能な最小F1.2レベル）は、0.05nMのF1.2であった。こ
の価を決定するためには、0 nMF1.2標準液を複数アッセ
イし、450nmにおける平均吸光度に２倍の標準偏差を加
えた価に対応するF1.2濃度を標準曲線からの外挿によっ
て推定した。
このアッセイは、1.5μＭのプロトロンビン存在下に
おいては少なくとも0.23nMのF1.2に関して特異的であ
る。1.5μＭの精製プロトロンビンを含有するバッファ
ーをベースとする系、及び、約1.5μＭのプロトロンビ
ンを含有するヘパリン処理血漿からのF1.2の回収率は、
表５に見られるように、各々92％及び98％という平均値
であった。
プロトロンビン、あるいは、血漿をベースとする他の
蛋白質との交差反応性のため、100％を越す回収率が得
られる結果となったものと思われる。更に、このアッセ
イにおいては、トリグリセリド、ヘモグロビンあるいは
ビリルビンによる主だった妨害作用は検出されなかった
（表６）。
測定のばらつきは他のサンドウィッチELISA法と同程
度である（Hoek, J. A., Clin. Chem., 34巻,2058-2062
（1988年））。２ヶ所のプレート部位で測定した変位係
数は、表７に見られるコントロールレベルＩ及びIIの両
方において、アッセイ内のばらつきによると９％以下で
あり、アッセイ間のばらつきでは11％以下となった。
実施例15 F1.2ELISAの臨床成果 健康人、血栓症あるいは血栓症的な危険性に関係する
症状の患者、及び抗凝固剤療法中の患者において、先の
実施例13のELISAアッセイを使用してF1.2レベルを測定
した。年齢45才以下の健康人に対する平均F1.2濃度は1.
5±0.6nM（±SD;n＝30）であり、ラジオイムノアッセイ
（Bauer, K., Blood, 70巻,343-350（1987年））により
測定された価に一致した。表８に見られるような上昇F
1.2（＞2.7nM）の頻度は、確定的な血栓症の症状におい
ては100％（16/16患者）であったのに対し、血栓症の素
因を作る症状においては38％（15/39患者）であった。
鎌状赤血球性貧血症の２つのケース及び静脈血栓症の１
つのケースにおいては、F1.2レベルは20nM以上であっ
た。
長期クマジン療法中の５人の患者においては、F1.2レ
ベルが抑制された（表９）。
正常F1.2レベルを示す一人の患者はこの療法をわずか
５日間続けただけであった。突然性心臓死／心筋梗塞
（４患者）あるいは不安定性アンギナ（３患者）の治療
のために継続的にヘパリン注射（表10）を受けている患
者においては、突然の心臓死を患い、臨床経過が開花性
播種性血管内凝血により複雑化した患者を除いては、全
ての患者につきF1.2レベルは減少した。
記載されるF1.2 ELISAにより測定されたF1.2レベルを
示すこれらのデーターは、個人個人の血栓症の危険率の
査定及び抗凝固剤療法の有効性のモニターに有用である
と思われる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バツトマン，ブライアン・テイー アメリカ合衆国、メリーランド・21793、 ウオーカーズビル、ハイランダー・ブー ルバード・9366 (72)発明者 ステイナー，ジエラルド・ピー アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27503、バハマ、スタリオン・ウエイ・ 10006 (72)発明者 ムーア，ブライアント・エム アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27503、バハマ、ポニー・コート・19 (72)発明者 ドンブローズ，フレデリツク・エイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 93003、ベンチユラ、ヒルウエイ・サー クル・151 (56)参考文献 特開 昭64−70498（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 261［28］（1986）ｐ．13210−13215 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/12 - 5/28 C12P 21/08 C12N 15/02 - 15/08 G01N 33/53 - 33/577 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】−Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHの
    アミノ酸配列を有するオクタペプチドを用いた、プロト
    ロンビン活性化ペプチドF1.2のカルボキシル末端上のエ
    ピトープに特異的に結合し、プロトロンビンとは反応し
    ない抗体を産生する方法。
  2. 【請求項２】−Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHの
    アミノ酸配列を有するオクタペプチドに特異的に結合す
    るモノクローナル抗体およびそのフラグメントであり、
    該抗体がプロトロンビン活性化ペプチドF1.2のカルボキ
    シル末端上のエピトープに特異的に結合し、プロトロン
    ビンには、結合しないことを特徴とするモノクローナル
    抗体およびそのフラグメント。
  3. 【請求項３】ATCC No.HB10291として同定されるハイブ
    リドーマに由来するモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】ATCC No.HB10291として同定されるハイブ
    リドーマ。
  5. 【請求項５】サンプル中のプロトロンビン活性化ペプチ
    ドF1.2をアッセイする方法であり、 ａ）請求項２あるいは３に係るモノクローナル抗体で固
    相をコートする、 ｂ）固相にサンプルを添加し、インキュベートする、 ｃ）固相を洗浄する、 ｄ）ラベル化抗体を添加し、インキュベートする、 ｅ）固相を洗浄する、 ｆ）ラベルを検出する、 ｇ）反応を解析する、 事から成り、該ラベル化抗体が固相上の抗体あるいは抗
    原に対して結合特異性を有することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】前記ラベル化抗体がポリクローナル抗体で
    ある請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記サンプルが血清、血漿、全血、尿、脳
    脊髄液あるいは滑液から成る群より選択される請求項５
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ラベルが、西洋ワサビパーオキシダー
    ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカ
    リホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、フルオロイ
    ソチオシアネート、ローダミン、フルオレセイン、ルシ
    フェラーゼおよびラジオアイソトープから成る群より選
    択された物質であることを特徴とする請求項５に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】サンプル中のプロトロンビン活性化ペプチ
    ドF1.2をアッセイする方法であり、請求項２あるいは３
    に記載のモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、
    イムノアッセイが、競合阻害イムノアッセイ、単一ステ
    ップイムノアッセイおよび凝集イムノアッセイから成る
    群から選択されることを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】前記イムノアッセイがラベル化分析物を
    含み、該ラベル化分析物がラベル化抗体あるいはラベル
    化ペプチドである請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】請求項２あるいは３に係る少なくとも一
    つのモノクローナル抗体を含む、サンプル中のプロトロ
    ンビン活性化ペプチドF1.2をアッセイするための診断用
    キット。
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