JP2839837B2 - 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ - Google Patents
顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａInfo
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Description
【０００１】本発明は顆粒球コロニー刺激因子受容体
（以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称）の細胞質外領域の
内、リガンド結合領域蛋白質、即ちＧ−ＣＳＦ結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有し、大腸菌
内で複製可能な発現ベクター、該ベクターを用いるＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質およびその誘導
体の製造方法、並びにそのようにして製造された蛋白質
に関するものである。
（以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称）の細胞質外領域の
内、リガンド結合領域蛋白質、即ちＧ−ＣＳＦ結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有し、大腸菌
内で複製可能な発現ベクター、該ベクターを用いるＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質およびその誘導
体の製造方法、並びにそのようにして製造された蛋白質
に関するものである。
【０００２】
【従来技術】顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)は血
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり、好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を
担っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、
並びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分
かっている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等
の受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、
その増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を
与える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子として
の作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄
移植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄
性白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合があ
ることも分かっている。Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好
中球の前駆体および成熟した好中球、および種々の骨髄
性白血病細胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ
受容体は非血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤に
も存在しており、これらのリガンド(つまりＧ−ＣＳＦ)
とＧ−ＣＳＦ受容体との複合体形成反応の機構を解明す
ることは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防
に有効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細
胞がＧ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されている
が、それをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止する
ことが可能である。既に、マウスおよびヒト由来のＧ−
ＣＳＦ受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、
配列が明らかにされている［福永ら、Ｃell，６１，３
４１−３５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad，Ｓc
i．ＵＳＡ，８７，８７０２−８７０６（１９９０）；
ＷＯ９１／１４７７６（１９９１年１０月３日公
開）］。福永らは、また、Ｇ−ＣＳＦ受容体の発現に成
功したことを報告しているが（Ｃell，前掲；Ｐroc. Ｎ
atl. Ａcad, Ｓci. ＵＳＡ，前掲；ＥＭＢＯ Ｊ．，１
０，２８５５−２８６５(１９９１)），いずれも相補Ｄ
ＮＡの全配列を動物細胞を用いて発現させたものであ
り、その発現量は極めて低く、需要を満たすだけのＧ−
ＣＳＦ受容体の製造には最適でなく、構造解析、反応機
構の研究も十分に行うことができなかった。
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり、好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を
担っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、
並びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分
かっている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等
の受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、
その増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を
与える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子として
の作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄
移植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄
性白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合があ
ることも分かっている。Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好
中球の前駆体および成熟した好中球、および種々の骨髄
性白血病細胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ
受容体は非血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤に
も存在しており、これらのリガンド(つまりＧ−ＣＳＦ)
とＧ−ＣＳＦ受容体との複合体形成反応の機構を解明す
ることは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防
に有効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細
胞がＧ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されている
が、それをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止する
ことが可能である。既に、マウスおよびヒト由来のＧ−
ＣＳＦ受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、
配列が明らかにされている［福永ら、Ｃell，６１，３
４１−３５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad，Ｓc
i．ＵＳＡ，８７，８７０２−８７０６（１９９０）；
ＷＯ９１／１４７７６（１９９１年１０月３日公
開）］。福永らは、また、Ｇ−ＣＳＦ受容体の発現に成
功したことを報告しているが（Ｃell，前掲；Ｐroc. Ｎ
atl. Ａcad, Ｓci. ＵＳＡ，前掲；ＥＭＢＯ Ｊ．，１
０，２８５５−２８６５(１９９１)），いずれも相補Ｄ
ＮＡの全配列を動物細胞を用いて発現させたものであ
り、その発現量は極めて低く、需要を満たすだけのＧ−
ＣＳＦ受容体の製造には最適でなく、構造解析、反応機
構の研究も十分に行うことができなかった。
【０００３】
【発明が解決すべき課題】本発明者らは、上記の様々な
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子を
用いる必要はなく、むしろ、Ｇ−ＣＳＦとの結合に最も
重要な役割を果す領域、即ちリガンド結合領域の蛋白質
が有用であることに着目し、そのような蛋白質の有効な
製造方法を確立するために研究を重ねてきた。本発明の
目的に有用なリガンド結合領域蛋白質のアミノ酸配列
は、上記文献により、ヒトおよびマウス等に関して既知
である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受容体をコードする
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）をクローニングし、この受容体
はイムノグロブリン様領域、サイトカイン受容体相補領
域（以下ＣＲＨ領域と略す）、フィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ領域からなることを示した（Ｃell，前掲；Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ，前掲）。
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子を
用いる必要はなく、むしろ、Ｇ−ＣＳＦとの結合に最も
重要な役割を果す領域、即ちリガンド結合領域の蛋白質
が有用であることに着目し、そのような蛋白質の有効な
製造方法を確立するために研究を重ねてきた。本発明の
目的に有用なリガンド結合領域蛋白質のアミノ酸配列
は、上記文献により、ヒトおよびマウス等に関して既知
である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受容体をコードする
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）をクローニングし、この受容体
はイムノグロブリン様領域、サイトカイン受容体相補領
域（以下ＣＲＨ領域と略す）、フィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ領域からなることを示した（Ｃell，前掲；Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ，前掲）。
【０００４】ＣＲＨ領域とは、インターロイキン２−
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている［バザン
（Ｂazan），Ｐroc．Ｎatl.Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，８
７，６９３４−６９３８（１９９０）］。事実Ｇ−ＣＳ
Ｆ受容体でもこのＣＲＨ領域が必須であり、現在のとこ
ろこのＣＲＨ領域がこのファミリーのリガンド結合、お
よびシグナル伝達のために必要な１つのユニットと考え
られている。このＣＲＨ領域はさらにアミノ末端側ドメ
イン(以下ＢＮドメインと略す)およびＣ末端側ドメイン
の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させると、
活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結合に
はＢＮドメインが最も重要な役割を果たしていることを
示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持される
か否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやインタ
ーロイキン６受容体の場合には、Ｃ末端側ドメインも必
要と考えられている。以上の結果は、本発明におけるリ
ガンド結合領域蛋白質として、ＢＮドメインまたは該Ｂ
Ｎドメインと同等の活性を有する類似体を含む蛋白質が
有用であることを示唆しているが、ＢＮドメインのみで
発現させた例はなく、また、ＢＮドメインのみで結合活
性を有するか否かも不明であった。これらの課題を解決
するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を大量
に製造する必要がある。
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている［バザン
（Ｂazan），Ｐroc．Ｎatl.Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，８
７，６９３４−６９３８（１９９０）］。事実Ｇ−ＣＳ
Ｆ受容体でもこのＣＲＨ領域が必須であり、現在のとこ
ろこのＣＲＨ領域がこのファミリーのリガンド結合、お
よびシグナル伝達のために必要な１つのユニットと考え
られている。このＣＲＨ領域はさらにアミノ末端側ドメ
イン(以下ＢＮドメインと略す)およびＣ末端側ドメイン
の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させると、
活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結合に
はＢＮドメインが最も重要な役割を果たしていることを
示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持される
か否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやインタ
ーロイキン６受容体の場合には、Ｃ末端側ドメインも必
要と考えられている。以上の結果は、本発明におけるリ
ガンド結合領域蛋白質として、ＢＮドメインまたは該Ｂ
Ｎドメインと同等の活性を有する類似体を含む蛋白質が
有用であることを示唆しているが、ＢＮドメインのみで
発現させた例はなく、また、ＢＮドメインのみで結合活
性を有するか否かも不明であった。これらの課題を解決
するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を大量
に製造する必要がある。
【０００５】そのような活性を有する蛋白質（例、リガ
ンド結合領域蛋白質）の産生に大腸菌を用いることが出
来れば、その産生量の高さ、取り扱いの容易さ、および
変異体作成の有利さなどから、極めて好都合であり、意
義深い。従来、サイトカイン受容体のリガンド結合部位
（ＣＲＨ）の大腸菌での発現は非常に困難と考えられて
いた。その理由として、この結合部位は、多くのシステ
イン残基やプロリン残基を含み、容易にフォールデイン
グをしないことが挙げられていた。例外的にヒト成長ホ
ルモン受容体の場合には発現に成功しているが、その成
功の理由の一つは、ヒト成長ホルモン受容体では、同様
の他の受容体に比較してシステイン残基の含量が低いこ
とにあると考えられる。例えば、同じサイトカイン受容
体ファミリーでもエリスロポイエチン［ハリスら(Ｈarr
is）,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６７，１５２０５−１５
２０９(１９９２)］やインターフェロンγ［フォントラ
キスら(Ｆountoulakis）,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６
５，１３２６８−１３２７５(１９９０)］の受容体の場
合、大腸菌で発現された産生物のほとんどが菌体内で不
溶化されている。これらの受容体の発現が困難である他
の理由として、これら受容体が、多くの複雑なドメイン
の複合によって成立していることがある。Ｇ−ＣＳＦ受
容体も、前述のように、ＣＲＨ領域、イムノグロブリン
様領域、フィブロネクチン様領域からなる複雑な構成を
示している。上記のヒト成長ホルモン受容体の場合は細
胞質外領域がＣＲＨ領域のみからなっており、これもヒ
ト成長ホルモン受容体の発現の成功のもう一つの原因と
して考えられる。しかしながら、この成長ホルモン受容
体のＣＲＨ領域もＢＮドメインとＣ末端領域からなって
おり、決して単純な構成を有するとは断言できない。現
に、前述のインターフェロンγ、エリスロポイエチンは
その細胞質外ドメインはほとんどＣＲＨ領域のみからな
っているが、発現させるとその大部分は不溶化される。
ンド結合領域蛋白質）の産生に大腸菌を用いることが出
来れば、その産生量の高さ、取り扱いの容易さ、および
変異体作成の有利さなどから、極めて好都合であり、意
義深い。従来、サイトカイン受容体のリガンド結合部位
（ＣＲＨ）の大腸菌での発現は非常に困難と考えられて
いた。その理由として、この結合部位は、多くのシステ
イン残基やプロリン残基を含み、容易にフォールデイン
グをしないことが挙げられていた。例外的にヒト成長ホ
ルモン受容体の場合には発現に成功しているが、その成
功の理由の一つは、ヒト成長ホルモン受容体では、同様
の他の受容体に比較してシステイン残基の含量が低いこ
とにあると考えられる。例えば、同じサイトカイン受容
体ファミリーでもエリスロポイエチン［ハリスら(Ｈarr
is）,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６７，１５２０５−１５
２０９(１９９２)］やインターフェロンγ［フォントラ
キスら(Ｆountoulakis）,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，２６
５，１３２６８−１３２７５(１９９０)］の受容体の場
合、大腸菌で発現された産生物のほとんどが菌体内で不
溶化されている。これらの受容体の発現が困難である他
の理由として、これら受容体が、多くの複雑なドメイン
の複合によって成立していることがある。Ｇ−ＣＳＦ受
容体も、前述のように、ＣＲＨ領域、イムノグロブリン
様領域、フィブロネクチン様領域からなる複雑な構成を
示している。上記のヒト成長ホルモン受容体の場合は細
胞質外領域がＣＲＨ領域のみからなっており、これもヒ
ト成長ホルモン受容体の発現の成功のもう一つの原因と
して考えられる。しかしながら、この成長ホルモン受容
体のＣＲＨ領域もＢＮドメインとＣ末端領域からなって
おり、決して単純な構成を有するとは断言できない。現
に、前述のインターフェロンγ、エリスロポイエチンは
その細胞質外ドメインはほとんどＣＲＨ領域のみからな
っているが、発現させるとその大部分は不溶化される。
【０００６】ところで、シグナル伝達にはＣ末端領域も
含めたＣＲＨ領域全体が必要である(前掲福永らＥＭＢ
Ｏ．Ｊ．，１０，２８５５−２８６５(１９９１)が、リ
ガンド結合に関する限り、ＢＮドメインのみでも活性で
あると考えられる。即ち約１００アミノ酸残基のＢＮド
メインのみでも、天然とほぼ同じ構造を維持してフォー
ルドさせ、発現させることが出来れば、従来、発現が困
難であったＧ−ＣＳＦ受容体を始め、様々なサイトカイ
ン受容体の機能ドメインを大量に取り出すことが可能と
なる。次いで、発現産物のリガンド結合活性を調べ、こ
の部分のリガンド結合への寄与の程度を明確にすること
ができる。このようにして、小分子量のリガンド結合活
性を有する蛋白質を大量に得ることが可能となる。その
ような小分子量のリガンド結合蛋白質は、Ｘ線やＮＭＲ
の高次構造解析において著しく有利である。上記の理由
から、本発明で開示する、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド
結合領域蛋白質のＤＮＡ組換え法による製造は、従来困
難であった他の受容体のリガンド結合領域蛋白質の製造
への途をも開くものである。
含めたＣＲＨ領域全体が必要である(前掲福永らＥＭＢ
Ｏ．Ｊ．，１０，２８５５−２８６５(１９９１)が、リ
ガンド結合に関する限り、ＢＮドメインのみでも活性で
あると考えられる。即ち約１００アミノ酸残基のＢＮド
メインのみでも、天然とほぼ同じ構造を維持してフォー
ルドさせ、発現させることが出来れば、従来、発現が困
難であったＧ−ＣＳＦ受容体を始め、様々なサイトカイ
ン受容体の機能ドメインを大量に取り出すことが可能と
なる。次いで、発現産物のリガンド結合活性を調べ、こ
の部分のリガンド結合への寄与の程度を明確にすること
ができる。このようにして、小分子量のリガンド結合活
性を有する蛋白質を大量に得ることが可能となる。その
ような小分子量のリガンド結合蛋白質は、Ｘ線やＮＭＲ
の高次構造解析において著しく有利である。上記の理由
から、本発明で開示する、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド
結合領域蛋白質のＤＮＡ組換え法による製造は、従来困
難であった他の受容体のリガンド結合領域蛋白質の製造
への途をも開くものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｇ−ＣＳＦ受
容体のリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に
有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発
現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞および該形
質転換体を用いてＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を製
造する方法を提供するものである。本発明方法により製
造されたＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質
は、後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同
様な、特異的なＧ−ＣＳＦ結合活性を示した。従って、
該蛋白質は、Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用
に関連する疾患の研究や治療に有用であり、臨床的に投
与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に対する拮
抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、例え
ば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療または
予防にも有用である。さらに、本発明のリガンド結合領
域蛋白質は、ＢＮドメインとして約１００アミノ酸から
なる小分子量蛋白質であるために、以下の利点を有す
る。即ち、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能
性が低く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と
結合させる等、応用範囲が広い。しかも、Ｘ線やＮＭＲ
による高次構造の解析にも有利である。
容体のリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に
有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発
現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞および該形
質転換体を用いてＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を製
造する方法を提供するものである。本発明方法により製
造されたＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質
は、後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同
様な、特異的なＧ−ＣＳＦ結合活性を示した。従って、
該蛋白質は、Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用
に関連する疾患の研究や治療に有用であり、臨床的に投
与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に対する拮
抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、例え
ば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療または
予防にも有用である。さらに、本発明のリガンド結合領
域蛋白質は、ＢＮドメインとして約１００アミノ酸から
なる小分子量蛋白質であるために、以下の利点を有す
る。即ち、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能
性が低く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と
結合させる等、応用範囲が広い。しかも、Ｘ線やＮＭＲ
による高次構造の解析にも有利である。
【０００８】また、本発明のＧ−ＣＳＦ受容体結合領域
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にし、
Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究（その立体
構造の解析など）を飛躍的に発展させ、ひいてはＧ−Ｃ
ＳＦのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にする
ものである。現在、Ｇ−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細
胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基き、放射
線治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減少
を回復するための治療剤として有用性が期待されている
が、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニスト
は、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦ
と同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にし、
Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究（その立体
構造の解析など）を飛躍的に発展させ、ひいてはＧ−Ｃ
ＳＦのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にする
ものである。現在、Ｇ−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細
胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基き、放射
線治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減少
を回復するための治療剤として有用性が期待されている
が、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニスト
は、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦ
と同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
【０００９】本発明の目的に従い、本明細書で用いる語
句を以下に定義する。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ受容
体という語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源
のＧ−ＣＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によ
って作られるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も
含むものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結
合に関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質
は、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢＮドメイ
ンを構成するアミノ酸配列を有する。発明の目的にとっ
ては、天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領域蛋
白質のみならず、当業者既知の方法で１またはそれ以上
のアミノ酸の変化によって得られる同様の活性を有する
誘導体も有用である。従って、本明細書中、単に、リガ
ンド結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミノ酸配列
を有する蛋白質のみならず、その誘導体（上記の意味で
の変異体）をも包含するものとする。
句を以下に定義する。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ受容
体という語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源
のＧ−ＣＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によ
って作られるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も
含むものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結
合に関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質
は、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢＮドメイ
ンを構成するアミノ酸配列を有する。発明の目的にとっ
ては、天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領域蛋
白質のみならず、当業者既知の方法で１またはそれ以上
のアミノ酸の変化によって得られる同様の活性を有する
誘導体も有用である。従って、本明細書中、単に、リガ
ンド結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミノ酸配列
を有する蛋白質のみならず、その誘導体（上記の意味で
の変異体）をも包含するものとする。
【００１０】ＢＮ、ｍＢＮ（マウス由来ＢＮ）、ｈＢＮ
（ヒト由来ＢＮ）とは、上記の定義に従うＧ−ＣＳＦ受
容体のリガンド結合領域を意味し、ｍＢＮおよびｈＢＮ
は、それぞれマウスおよびヒト由来の該領域を指す。ま
た、本明細書では特記しない限り、該領域のタンパク
質、その誘導体をも表すものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体
のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡとは、Ｇ
−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に関与する領
域を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。
該ＤＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢ
Ｎドメインを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を含有するものである。上記の蛋白質に関する定義と同
様に、該ＤＮＡは天然のリガンド結合領域蛋白質をコー
ドするもののみならず、当業者既知の方法で得られた該
蛋白質の誘導体をコードするＤＮＡをも包含する。ＤＮ
Ａは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
（ヒト由来ＢＮ）とは、上記の定義に従うＧ−ＣＳＦ受
容体のリガンド結合領域を意味し、ｍＢＮおよびｈＢＮ
は、それぞれマウスおよびヒト由来の該領域を指す。ま
た、本明細書では特記しない限り、該領域のタンパク
質、その誘導体をも表すものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体
のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤＮＡとは、Ｇ
−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に関与する領
域を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。
該ＤＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢ
Ｎドメインを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を含有するものである。上記の蛋白質に関する定義と同
様に、該ＤＮＡは天然のリガンド結合領域蛋白質をコー
ドするもののみならず、当業者既知の方法で得られた該
蛋白質の誘導体をコードするＤＮＡをも包含する。ＤＮ
Ａは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００１１】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域とは、サイ
トカイン受容体相補領域を指し、該領域のアミノ酸配列
はマウス［配列表の配列番号１；福永ら、Ｃell，６１,
３４１−３５０(１９９０)］およびヒト［配列表の配列
番号２；福永ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．ＵＳＡ，
８７，８７０２−８７０６(１９９０)］について既知で
ある。本明細書では、マウスまたはヒトＧ−ＣＳＦ受容
体のＢＮ部分に対応する領域の相補ＤＮＡを用いてリガ
ンド結合領域蛋白質の発現を示したが、合成ＤＮＡでも
よい。当業者ならば容易に理解するように、コドンの異
なるＤＮＡであっても、本発明の蛋白質のアミノ酸配列
をコードする限り、本発明の範囲に含まれ、実施例の記
載に限定されない。
トカイン受容体相補領域を指し、該領域のアミノ酸配列
はマウス［配列表の配列番号１；福永ら、Ｃell，６１,
３４１−３５０(１９９０)］およびヒト［配列表の配列
番号２；福永ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．ＵＳＡ，
８７，８７０２−８７０６(１９９０)］について既知で
ある。本明細書では、マウスまたはヒトＧ−ＣＳＦ受容
体のＢＮ部分に対応する領域の相補ＤＮＡを用いてリガ
ンド結合領域蛋白質の発現を示したが、合成ＤＮＡでも
よい。当業者ならば容易に理解するように、コドンの異
なるＤＮＡであっても、本発明の蛋白質のアミノ酸配列
をコードする限り、本発明の範囲に含まれ、実施例の記
載に限定されない。
【００１２】配列番号１に記載のアミノ酸配列をコード
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７［福永
ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)］に組み
込まれており、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３１２（寄託日平成
２年３月９日）の下で通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている、Escherichia coli K12
から入手可能である。また配列番号２に記載のアミノ酸
配列をコードしている相補ＤＮＡは、プラスミッドpＨ
Ｑ３［福永ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
８７，８７０２−８７０６(１９９０)］に組み込まれて
おり、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３１４（寄託日平成２年６月
２８日）の下で通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている、Escherichia coli ｐＨＱ３
から入手可能である。
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７［福永
ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)］に組み
込まれており、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３１２（寄託日平成
２年３月９日）の下で通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている、Escherichia coli K12
から入手可能である。また配列番号２に記載のアミノ酸
配列をコードしている相補ＤＮＡは、プラスミッドpＨ
Ｑ３［福永ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
８７，８７０２−８７０６(１９９０)］に組み込まれて
おり、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３１４（寄託日平成２年６月
２８日）の下で通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている、Escherichia coli ｐＨＱ３
から入手可能である。
【００１３】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメインとは、既
述のごとく、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域を２分した
場合、アミノ末端側領域であり、Ｇ−ＣＳＦ受容体のジ
ェノミックＤＮＡ（genomic ＤＮＡ）のエクソン５と６
［セタら(Ｓeta),Ｊ．Ｉmmunol．，１４８，２５９−２
６６(１９９２)］に対応する領域である。これは、具体
的には上記の福永らの開示した配列において、マウスＧ
−ＣＳＦ受容体では、９７番目のチロシンから２０１番
目のバリンに至る部分を指す（配列番号１においては、
それぞれ１番目のチロシンと１０５番目のバリンに相当
する)。同様に、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体では、９８番目
のチロシンから２０２番目のバリン（配列番号２ではそ
れぞれ１番目のチロシンと１０５番目のバリンに相当す
る）に至る領域とされている。
述のごとく、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域を２分した
場合、アミノ末端側領域であり、Ｇ−ＣＳＦ受容体のジ
ェノミックＤＮＡ（genomic ＤＮＡ）のエクソン５と６
［セタら(Ｓeta),Ｊ．Ｉmmunol．，１４８，２５９−２
６６(１９９２)］に対応する領域である。これは、具体
的には上記の福永らの開示した配列において、マウスＧ
−ＣＳＦ受容体では、９７番目のチロシンから２０１番
目のバリンに至る部分を指す（配列番号１においては、
それぞれ１番目のチロシンと１０５番目のバリンに相当
する)。同様に、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体では、９８番目
のチロシンから２０２番目のバリン（配列番号２ではそ
れぞれ１番目のチロシンと１０５番目のバリンに相当す
る）に至る領域とされている。
【００１４】しかしながら、ＢＮドメインの開始部位お
よび終了部位は必ずしも、本発明にとって厳密でなく、
該ＢＮドメイン全体の立体構造に大きな影響を与えるこ
とはない。その機能が保持されることを条件として、Ｎ
末端および／またはＣ末端が、数残基いずれかの方向に
ずれたもの、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端に
数残基のアミノ酸が付加したものも包含される。通常、
このような一次構造上の僅かな差異は該ＢＮドメイン全
体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると
考えられる。後述の実施例では、マウスの場合、マウス
Ｇ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメインをコードするＤＮＡ断
片を用いた。このＤＮＡ断片はグリシン−セリンから始
まり、元の配列（配列番号１）における９７番目のチロ
シンを経てＣ末端では、２０１番目のバリンに２０２番
目のリジンが付加したアミノ酸配列をコードしている
（配列番号３）。また、ヒトの場合、ヒトＧーＣＳＦ受
容体のＢＮドメインをコードするＤＮＡ断片を用いた。
このＤＮＡ断片も、そのＮ末端はグリシンーセリンから
始まり、元の配列（配列番号２）の９８番目のチロシン
を経て、Ｃ末端では２０２番目のバリンにリジンを付加
したアミノ酸配列をコードしている（配列番号１１）。
よび終了部位は必ずしも、本発明にとって厳密でなく、
該ＢＮドメイン全体の立体構造に大きな影響を与えるこ
とはない。その機能が保持されることを条件として、Ｎ
末端および／またはＣ末端が、数残基いずれかの方向に
ずれたもの、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端に
数残基のアミノ酸が付加したものも包含される。通常、
このような一次構造上の僅かな差異は該ＢＮドメイン全
体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると
考えられる。後述の実施例では、マウスの場合、マウス
Ｇ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメインをコードするＤＮＡ断
片を用いた。このＤＮＡ断片はグリシン−セリンから始
まり、元の配列（配列番号１）における９７番目のチロ
シンを経てＣ末端では、２０１番目のバリンに２０２番
目のリジンが付加したアミノ酸配列をコードしている
（配列番号３）。また、ヒトの場合、ヒトＧーＣＳＦ受
容体のＢＮドメインをコードするＤＮＡ断片を用いた。
このＤＮＡ断片も、そのＮ末端はグリシンーセリンから
始まり、元の配列（配列番号２）の９８番目のチロシン
を経て、Ｃ末端では２０２番目のバリンにリジンを付加
したアミノ酸配列をコードしている（配列番号１１）。
【００１５】さらに、本発明のリガンド結合領域蛋白質
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。本発明はまた、Ｇ
−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質の製造方法を提供するも
のである。そのような蛋白質の製造は、本発明のＤＮＡ
を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより行
うことができる。
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。本発明はまた、Ｇ
−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質の製造方法を提供するも
のである。そのような蛋白質の製造は、本発明のＤＮＡ
を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより行
うことができる。
【００１６】本発明のＧ−ＣＳＦレセプターの発現に
は、例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビ
シエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用い
られる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例
えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な
宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等
は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤ
ＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
しかしながら、本発明の目的には、上記の理由から、大
腸菌が好ましい。mＢＮまたはｈＢＮをコードするＤＮ
Ａを大腸菌宿主中で発現させるためには、あらかじめ、
このＤＮＡを大腸菌の遺伝子発現系に連結しておく必要
がある。大腸菌の発現系についてはすでに多くの成書が
あり、それらに従って操作すればよい。即ち、大腸菌を
用いる遺伝子操作法は、当該技術分野で既知の文献［マ
ニアティスら（Ｍaniatis），(１９８２),Ｍoleular
Ｃloning:Ａ ＬaboratoryＭanual,Ｃold Ｓpring Ｈ
arbor Ｌaboratory］を初めとして、近年出版された多
くの実験書に詳述されている。また蛋白質の精製などの
基本的な方法も生化学実験講座(日本生化学編,東京化学
同人)などの多くの成書に詳述されている。本発明方法
はこれら文献既知の方法を用いて行うことができるが、
以下に、簡単に説明する。
は、例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビ
シエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用い
られる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例
えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な
宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等
は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤ
ＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
しかしながら、本発明の目的には、上記の理由から、大
腸菌が好ましい。mＢＮまたはｈＢＮをコードするＤＮ
Ａを大腸菌宿主中で発現させるためには、あらかじめ、
このＤＮＡを大腸菌の遺伝子発現系に連結しておく必要
がある。大腸菌の発現系についてはすでに多くの成書が
あり、それらに従って操作すればよい。即ち、大腸菌を
用いる遺伝子操作法は、当該技術分野で既知の文献［マ
ニアティスら（Ｍaniatis），(１９８２),Ｍoleular
Ｃloning:Ａ ＬaboratoryＭanual,Ｃold Ｓpring Ｈ
arbor Ｌaboratory］を初めとして、近年出版された多
くの実験書に詳述されている。また蛋白質の精製などの
基本的な方法も生化学実験講座(日本生化学編,東京化学
同人)などの多くの成書に詳述されている。本発明方法
はこれら文献既知の方法を用いて行うことができるが、
以下に、簡単に説明する。
【００１７】ｍＢＮドメインまたはｈＢＮドメインは、
ポリメラーゼチェインリアクション法(以下ＰＣＲ法と
略す)によって取り出すことができる。次いで、これら
のＢＮドメイン遺伝子を大腸菌由来の発現プラスミッド
に挿入する。大腸菌由来の遺伝子発現系としては、それ
自身の菌体内で機能している遺伝子のプロモーター活性
と翻訳能とを持つＤＮＡ断片由来のものが多い。このよ
うなものとしては、トリプトファン遺伝子、ラクトース
遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、
トリプトファン遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッ
ドであるtac遺伝子などがある［中原，松原(１９８
６)，日本生化学会編,“遺伝子工学研究法ＩＩ",１〜１
７２,東京化学同人］。通常は、これらのＤＮＡ断片を
目的物の遺伝子の前に連結させることによって、該遺伝
子を発現させる。通常、発現には菌体内発現と分泌発現
の２種類があり、各々について適当な発現系が存在す
る。
ポリメラーゼチェインリアクション法(以下ＰＣＲ法と
略す)によって取り出すことができる。次いで、これら
のＢＮドメイン遺伝子を大腸菌由来の発現プラスミッド
に挿入する。大腸菌由来の遺伝子発現系としては、それ
自身の菌体内で機能している遺伝子のプロモーター活性
と翻訳能とを持つＤＮＡ断片由来のものが多い。このよ
うなものとしては、トリプトファン遺伝子、ラクトース
遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、
トリプトファン遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッ
ドであるtac遺伝子などがある［中原，松原(１９８
６)，日本生化学会編,“遺伝子工学研究法ＩＩ",１〜１
７２,東京化学同人］。通常は、これらのＤＮＡ断片を
目的物の遺伝子の前に連結させることによって、該遺伝
子を発現させる。通常、発現には菌体内発現と分泌発現
の２種類があり、各々について適当な発現系が存在す
る。
【００１８】目的物が本来、細胞外に分泌される蛋白質
である場合には、目的物の遺伝子のＮ末端に大腸菌由来
の分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発
現生成物がペリプラスムに分泌されるように発現系を構
築することが多い。また、目的物質を他の蛋白質との融
合蛋白質として発現させるために、後者をコードする遺
伝子の直後に、目的物質の遺伝子を連結させる方法が一
般的に用いられる。融合させる蛋白質としては大腸菌内
でよく発現するものなどから選択される。本発明のリガ
ンド結合領域蛋白質と融合させ得る蛋白質としては、β
−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼやマルトース結
合蛋白質（ＭＢＰ）などを挙げることができる。これら
の蛋白質は、大腸菌の発現制御下では非常によく発現す
るので、融合蛋白質としての発現も極めて良好である場
合が多い。融合蛋白質から目的蛋白質を分離する方法も
既知である。例えば目的物にメチオニンが含まれていな
い場合には、臭化シアン処理を行う。それ以外の場合に
は、例えば融合蛋白質の各々の遺伝子の連結部分に制限
プロテアーゼファクターＸaの認識配列を入れておき、
制限プロテアーゼファクターＸaによる切り出しを可能
にするなどの手法が用いられる。
である場合には、目的物の遺伝子のＮ末端に大腸菌由来
の分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発
現生成物がペリプラスムに分泌されるように発現系を構
築することが多い。また、目的物質を他の蛋白質との融
合蛋白質として発現させるために、後者をコードする遺
伝子の直後に、目的物質の遺伝子を連結させる方法が一
般的に用いられる。融合させる蛋白質としては大腸菌内
でよく発現するものなどから選択される。本発明のリガ
ンド結合領域蛋白質と融合させ得る蛋白質としては、β
−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼやマルトース結
合蛋白質（ＭＢＰ）などを挙げることができる。これら
の蛋白質は、大腸菌の発現制御下では非常によく発現す
るので、融合蛋白質としての発現も極めて良好である場
合が多い。融合蛋白質から目的蛋白質を分離する方法も
既知である。例えば目的物にメチオニンが含まれていな
い場合には、臭化シアン処理を行う。それ以外の場合に
は、例えば融合蛋白質の各々の遺伝子の連結部分に制限
プロテアーゼファクターＸaの認識配列を入れておき、
制限プロテアーゼファクターＸaによる切り出しを可能
にするなどの手法が用いられる。
【００１９】以下に、本発明について具体的に説明す
る。マウス由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡを得るために、後述の実施例
１に記載のごとく、リガンド結合領域蛋白質としてマウ
スＧ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメイン（以下、ｍＢＮと称
する）蛋白質コードするＤＮＡを用いた。該ｍＢＮドメ
インのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、既知のプラ
スミッドpＢＬＪ１７からＰＣＲ法によって得ることが
できる。また、ＤＮＡ合成法によっても得ることができ
る。後述の実施例では、mＢＮドメインを、大腸菌内で
よく発現するＭＢＰとの融合蛋白質として発現させた。
この態様では、発現プロモーターとして、ＩＰＴＧの添
加によって誘導がかかるtacプロモーターを用いた。Ｍ
ＢＰのＮ末端にはそのシグナル配列が付加されているの
で、発現生成物はペリプラスムに蓄積される。融合蛋白
質以外の方法で発現させる目的で、ＢＮドメインの遺伝
子をアルカリンホスファターゼのプロモーターなど様々
なプロモーターと結合させたが、組換え体は得られなか
った。これは、発現量がごく微量であっても、組換え蛋
白質が大腸菌宿主に対して致死作用を及ぼしたためであ
ると考えられる。
る。マウス由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡを得るために、後述の実施例
１に記載のごとく、リガンド結合領域蛋白質としてマウ
スＧ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメイン（以下、ｍＢＮと称
する）蛋白質コードするＤＮＡを用いた。該ｍＢＮドメ
インのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、既知のプラ
スミッドpＢＬＪ１７からＰＣＲ法によって得ることが
できる。また、ＤＮＡ合成法によっても得ることができ
る。後述の実施例では、mＢＮドメインを、大腸菌内で
よく発現するＭＢＰとの融合蛋白質として発現させた。
この態様では、発現プロモーターとして、ＩＰＴＧの添
加によって誘導がかかるtacプロモーターを用いた。Ｍ
ＢＰのＮ末端にはそのシグナル配列が付加されているの
で、発現生成物はペリプラスムに蓄積される。融合蛋白
質以外の方法で発現させる目的で、ＢＮドメインの遺伝
子をアルカリンホスファターゼのプロモーターなど様々
なプロモーターと結合させたが、組換え体は得られなか
った。これは、発現量がごく微量であっても、組換え蛋
白質が大腸菌宿主に対して致死作用を及ぼしたためであ
ると考えられる。
【００２０】細胞のペリプラスムに蓄積した融合蛋白質
を抽出し、Ｑ−セファロース、ファクターＸaによる目
的ペプチドの切り出し、さらにＳ−セファロース、ゲル
ろ過ＨＰＬＣからなる一連の操作によって、目的とする
ＢＮドメインを精製することができる。これらの一連の
方法は単なる例示にすぎず、当業者既知の他の精製系を
用いても、目的物質は得ることができる。具体的には、
ＭＢＰをコードするＤＮＡの下流にＢＮドメイン遺伝子
を挿入した。ＭＢＰ遺伝子の上流には、そのためのシグ
ナル配列に対応する部分が含まれており、産生された融
合蛋白質は、細胞質からペリプラスム画分に分泌発現さ
れる。従って、上記発現プラスミッドで大腸菌宿主を形
質転換し、得られた形質転換体を培養すると、目的の蛋
白質を含む融合蛋白質が宿主菌体のペリプラスムに蓄積
された。次いで、融合蛋白質をオスモティックショック
により抽出・精製し、マルトース結合蛋白質から切り離
すことにより、目的の蛋白質を得た。上記の方法では、
天然のアミノ酸配列を有するｍＢＮ蛋白質が得られる
が、１またはそれ以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入ま
たは置換）を有する該ｍＢＮの変異体も同様にして大腸
菌に発現させることができる。そのような変異は、リガ
ンド結合活性の改善、インビボの安定性等を改善するこ
とを目的とする。
を抽出し、Ｑ−セファロース、ファクターＸaによる目
的ペプチドの切り出し、さらにＳ−セファロース、ゲル
ろ過ＨＰＬＣからなる一連の操作によって、目的とする
ＢＮドメインを精製することができる。これらの一連の
方法は単なる例示にすぎず、当業者既知の他の精製系を
用いても、目的物質は得ることができる。具体的には、
ＭＢＰをコードするＤＮＡの下流にＢＮドメイン遺伝子
を挿入した。ＭＢＰ遺伝子の上流には、そのためのシグ
ナル配列に対応する部分が含まれており、産生された融
合蛋白質は、細胞質からペリプラスム画分に分泌発現さ
れる。従って、上記発現プラスミッドで大腸菌宿主を形
質転換し、得られた形質転換体を培養すると、目的の蛋
白質を含む融合蛋白質が宿主菌体のペリプラスムに蓄積
された。次いで、融合蛋白質をオスモティックショック
により抽出・精製し、マルトース結合蛋白質から切り離
すことにより、目的の蛋白質を得た。上記の方法では、
天然のアミノ酸配列を有するｍＢＮ蛋白質が得られる
が、１またはそれ以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入ま
たは置換）を有する該ｍＢＮの変異体も同様にして大腸
菌に発現させることができる。そのような変異は、リガ
ンド結合活性の改善、インビボの安定性等を改善するこ
とを目的とする。
【００２１】例えば、天然の配列を有するmＢＮドメイ
ンの発現を試みた場合、ペリプラスム中の産生物には、
目的とするモノマー状態の融合蛋白質の他に、それらが
会合した巨大分子量の産生物も存在する。これらを、フ
ァクターＸaで切断した場合には、会合した状態のmＢＮ
が得られ、しかもこれらには結合活性は見られない。こ
れの多くは還元剤を含まないＳＤＳを含むポリアクリル
アミドゲルで展開するとモノマー状態と同じ分子量を示
すことから、ＢＮドメイン中に存在するシステイン残基
がフォールディングの過程で分子間に架橋してしまって
生ずる会合体ではなく、疎水性基が会合して生ずる会合
体であると考えられる。そこで、mＢＮドメイン中の７
７番目のロイシン、７８番目のチロシンのそれぞれをア
ラニンに変異させることで、より会合の生じにくい変異
mＢＮの製造を試みた。mＢＮ−Ｌ７７Ａに関しては、こ
れをコードするＤＮＡ断片を配列番号９で示すように設
計した。これは配列番号３の７７番目のアミノ酸ロイシ
ンをコードするコドンＣＴＧをアラニンをコドンするコ
ドンＧＣＧに変えたものである。またmＢＮ−Ｙ７８Ａ
に関しては、これをコードするＤＮＡ断片を配列番号１
０で示すように設計した。これは配列３の７８番目のア
ミノ酸チロシンをコードするコドンＴＡＣをＧＣＣに変
えたものである。
ンの発現を試みた場合、ペリプラスム中の産生物には、
目的とするモノマー状態の融合蛋白質の他に、それらが
会合した巨大分子量の産生物も存在する。これらを、フ
ァクターＸaで切断した場合には、会合した状態のmＢＮ
が得られ、しかもこれらには結合活性は見られない。こ
れの多くは還元剤を含まないＳＤＳを含むポリアクリル
アミドゲルで展開するとモノマー状態と同じ分子量を示
すことから、ＢＮドメイン中に存在するシステイン残基
がフォールディングの過程で分子間に架橋してしまって
生ずる会合体ではなく、疎水性基が会合して生ずる会合
体であると考えられる。そこで、mＢＮドメイン中の７
７番目のロイシン、７８番目のチロシンのそれぞれをア
ラニンに変異させることで、より会合の生じにくい変異
mＢＮの製造を試みた。mＢＮ−Ｌ７７Ａに関しては、こ
れをコードするＤＮＡ断片を配列番号９で示すように設
計した。これは配列番号３の７７番目のアミノ酸ロイシ
ンをコードするコドンＣＴＧをアラニンをコドンするコ
ドンＧＣＧに変えたものである。またmＢＮ−Ｙ７８Ａ
に関しては、これをコードするＤＮＡ断片を配列番号１
０で示すように設計した。これは配列３の７８番目のア
ミノ酸チロシンをコードするコドンＴＡＣをＧＣＣに変
えたものである。
【００２２】上記ＤＮＡ断片の実際の調製はＰＣＲによ
り行った。具体的には、Ｎ末端プライマーとして、配列
番号６の塩基配列を有するＤＮＡプライマーをＤＮＡ合
成機で合成する。これは、pＭＡＬp−mＢＮプラスミッ
ド中のＭＢＰ蛋白質中のＣ末端に近い部分をコードする
プライマーである。Ｃ末端プライマーとしては配列番号
７および配列番号８の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用
いた。配列番号７のプライマーは、元の配列番号３のア
ミノ酸配列における７７番目のロイシンがアラニンに変
るよう、該プライマー中の１８−２０番目にＣＧＣを有
する。また、配列番号８のプライマーは、同様に、７８
番目のチロシンをアラニンに変化させるために、１５−
１７番目にＧＧＣを有する。さらにこれら変異させる部
分のすぐ外側に、制限酵素ＰfＩＭＩの認識部位を有す
るよう、構築されている。従って、これらプライマーを
用い、pＭＡＬp−mＢＮをテンペレートとしてＰＣＲ反
応を行えば、融合蛋白質のＭＢＰのＣ末端を含む領域か
ら、mＢＮのＮ末端から変異部分を含めて、そのすぐ下
流に位置する制限酵素ＰfＩＭＩの認識部位に至る部分
をコードする領域が合成される。次いで、ＰＣＲ反応の
生成物を、mＢＮ部分上流の制限酵素部位ＢamＨＩと、
ＰfＩＭＩで切断し、pＭＡＬp−mＢＮのＢamＨＩ−Ｎde
Ｉ切断物とＮdeＩ−ＰfＩＭＩ切断物とをライゲーショ
ンして連結すれば（図５参照）、目的とする変異体の発
現プラスミッドpＭＡＬp-mＢＮ-Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬ
p−mＢＮ−Ｙ７８Ａが構築出来る（図５）。
り行った。具体的には、Ｎ末端プライマーとして、配列
番号６の塩基配列を有するＤＮＡプライマーをＤＮＡ合
成機で合成する。これは、pＭＡＬp−mＢＮプラスミッ
ド中のＭＢＰ蛋白質中のＣ末端に近い部分をコードする
プライマーである。Ｃ末端プライマーとしては配列番号
７および配列番号８の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用
いた。配列番号７のプライマーは、元の配列番号３のア
ミノ酸配列における７７番目のロイシンがアラニンに変
るよう、該プライマー中の１８−２０番目にＣＧＣを有
する。また、配列番号８のプライマーは、同様に、７８
番目のチロシンをアラニンに変化させるために、１５−
１７番目にＧＧＣを有する。さらにこれら変異させる部
分のすぐ外側に、制限酵素ＰfＩＭＩの認識部位を有す
るよう、構築されている。従って、これらプライマーを
用い、pＭＡＬp−mＢＮをテンペレートとしてＰＣＲ反
応を行えば、融合蛋白質のＭＢＰのＣ末端を含む領域か
ら、mＢＮのＮ末端から変異部分を含めて、そのすぐ下
流に位置する制限酵素ＰfＩＭＩの認識部位に至る部分
をコードする領域が合成される。次いで、ＰＣＲ反応の
生成物を、mＢＮ部分上流の制限酵素部位ＢamＨＩと、
ＰfＩＭＩで切断し、pＭＡＬp−mＢＮのＢamＨＩ−Ｎde
Ｉ切断物とＮdeＩ−ＰfＩＭＩ切断物とをライゲーショ
ンして連結すれば（図５参照）、目的とする変異体の発
現プラスミッドpＭＡＬp-mＢＮ-Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬ
p−mＢＮ−Ｙ７８Ａが構築出来る（図５）。
【００２３】他方、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結
合部位をコードするＤＮＡを宿主内で発現させるため
に、該ＤＮＡを配列番号１１に示すように設計した。し
かし、この天然型ＢＮドメインを大量に取り出すことは
出来ない。これは、ｍＢＮドメインの場合には６個のシ
ステイン残基が存在し、そのそれぞれが３組のジスルフ
ィド結合を形成することで安定に保たれるのに対して、
ｈＢＮドメインではもうひとつ余分のシステイン（配列
番号２では６７番目のシステイン、配列番号１１では６
９番目のシステインに対応）が存在することに起因する
と考えられる。つまりその余分のシステイン残基がｈＢ
Ｎドメインの発現、精製過程で、ジスルフィド結合の形
成においてかけちがいが起こり、その結果として本来の
ジスルフィド結合を破壊して別のジスルフィド結合を形
成し、ｈＢＮドメインの立体構造が破壊されてしまうた
めと考えられる。マウスの場合にはこれに対応する残基
はセリン（配列番号１における６７番目のセリンに対
応）である。そこでｈＢＮドメインの余分のシステイン
をセリンに改変することで発現を試みた。ｈＢＮーＣ６
９Ｓは、配列番号２に示したｈＢＮドメインをコードす
るＤＮＡ断片の６７番目のアミノ酸システイン（配列番
号１１では６９番目のシステインに対応）をコードする
ＴＧＣをセリンをコードするＴＣＣに変えたものである
（配列番号１２）。Ｎ末端、Ｃ末端には前記のように、
ｈＢＮとしてエクソン５と６に対応する領域に天然型の
hＢＮの場合と同様に、それぞれグリシンーセリンとリ
ジンが付加されている。
合部位をコードするＤＮＡを宿主内で発現させるため
に、該ＤＮＡを配列番号１１に示すように設計した。し
かし、この天然型ＢＮドメインを大量に取り出すことは
出来ない。これは、ｍＢＮドメインの場合には６個のシ
ステイン残基が存在し、そのそれぞれが３組のジスルフ
ィド結合を形成することで安定に保たれるのに対して、
ｈＢＮドメインではもうひとつ余分のシステイン（配列
番号２では６７番目のシステイン、配列番号１１では６
９番目のシステインに対応）が存在することに起因する
と考えられる。つまりその余分のシステイン残基がｈＢ
Ｎドメインの発現、精製過程で、ジスルフィド結合の形
成においてかけちがいが起こり、その結果として本来の
ジスルフィド結合を破壊して別のジスルフィド結合を形
成し、ｈＢＮドメインの立体構造が破壊されてしまうた
めと考えられる。マウスの場合にはこれに対応する残基
はセリン（配列番号１における６７番目のセリンに対
応）である。そこでｈＢＮドメインの余分のシステイン
をセリンに改変することで発現を試みた。ｈＢＮーＣ６
９Ｓは、配列番号２に示したｈＢＮドメインをコードす
るＤＮＡ断片の６７番目のアミノ酸システイン（配列番
号１１では６９番目のシステインに対応）をコードする
ＴＧＣをセリンをコードするＴＣＣに変えたものである
（配列番号１２）。Ｎ末端、Ｃ末端には前記のように、
ｈＢＮとしてエクソン５と６に対応する領域に天然型の
hＢＮの場合と同様に、それぞれグリシンーセリンとリ
ジンが付加されている。
【００２４】天然型のｈＢＮドメインは既知のプラスミ
ッドｐＨＱ３よりＰＣＲ法によって取り出すことが出来
る。具体的には、Ｎ末端プライマーとして配列番号１３
の塩基配列を有するＤＮＡをＤＮＡ合成機で合成する。
これは、ｈＢＮ蛋白質中のＮ末端部分をコードするプラ
イマーである。Ｃ末端プライマーとしては配列番号１４
の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これらをプラ
イマーに、ｐＨＱ３をテンペレートに用いてＰＣＲを行
うことによりｈＢＮのＤＮＡを得ることが出来る。
ッドｐＨＱ３よりＰＣＲ法によって取り出すことが出来
る。具体的には、Ｎ末端プライマーとして配列番号１３
の塩基配列を有するＤＮＡをＤＮＡ合成機で合成する。
これは、ｈＢＮ蛋白質中のＮ末端部分をコードするプラ
イマーである。Ｃ末端プライマーとしては配列番号１４
の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これらをプラ
イマーに、ｐＨＱ３をテンペレートに用いてＰＣＲを行
うことによりｈＢＮのＤＮＡを得ることが出来る。
【００２５】なお、後述の実施例では、ｈＢＮ−Ｃ６９
Ｓを、天然型のｈＢＮを大腸菌由来の発現プラスミッド
に挿入したもの（pＭＡＬp−ｈＢＮ、図７）からさらに
ＰＣＲ法によって変異を入れることで変異プラスミッド
を取得しているが、ｐＨＱ３より直接に変異を入れなが
らのＰＣＲを行うことで、またはＤＮＡ合成法によって
も変異プラスミッドは得ることが出来る。この場合、Ｎ
末端プライマーとして上記の配列番号６の塩基配列を有
するＤＮＡプライマーを用いる。これは、pＭＡＬp−ｈ
ＢＮプラスミッド中のＭＢＰ蛋白質中のＣ末端に近い部
分をコードしている。Ｃ末端プライマーとしては配列番
号１５の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これ
は、６９番目のシステインをセリンに変えるため、１１
ー１３番目にＧＧＡを有する。これらをプライマーと
し、pＭＡＬp−ｈＢＮをテンペレートとしてＰＣＲを行
う。これによりｈＢＮーＣ６９ＳのＮ末端側半分つまり
Ｎ末端側から変異のはいった部分までのＤＮＡを得るこ
とが出来る。ｈＢＮのＣ末端側半分については配列番号
１６と配列番号１７の塩基配列をそれぞれＮ末端側とＣ
末端側のプライマーとしてＰＣＲを行う。この場合、前
者は、６９番目のシステインがセリンに変わるよう、３
−５番目の塩基がＴＣＣとなっている。後者はｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮプラスミッド中のｈＢＮをコードするＤＮＡ
のすぐ下流の発現ベクター中のＤＮＡ配列をコードして
いる。その結果、ｈＢＮーＣ６９ＳのＣ末端側半分、つ
まり変異の入った部分からＣ末端までのＤＮＡを得るこ
とが出来る。最後にそれぞれＰＣＲ産物を合わせ、さら
に配列番号６のＤＮＡプライマーと配列番号１７のＤＮ
Ａプライマーを加えてＰＣＲを行うことにより、全ｈＢ
Ｎ−Ｃ６９ＳのＤＮＡを得ることが出来る。
Ｓを、天然型のｈＢＮを大腸菌由来の発現プラスミッド
に挿入したもの（pＭＡＬp−ｈＢＮ、図７）からさらに
ＰＣＲ法によって変異を入れることで変異プラスミッド
を取得しているが、ｐＨＱ３より直接に変異を入れなが
らのＰＣＲを行うことで、またはＤＮＡ合成法によって
も変異プラスミッドは得ることが出来る。この場合、Ｎ
末端プライマーとして上記の配列番号６の塩基配列を有
するＤＮＡプライマーを用いる。これは、pＭＡＬp−ｈ
ＢＮプラスミッド中のＭＢＰ蛋白質中のＣ末端に近い部
分をコードしている。Ｃ末端プライマーとしては配列番
号１５の塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これ
は、６９番目のシステインをセリンに変えるため、１１
ー１３番目にＧＧＡを有する。これらをプライマーと
し、pＭＡＬp−ｈＢＮをテンペレートとしてＰＣＲを行
う。これによりｈＢＮーＣ６９ＳのＮ末端側半分つまり
Ｎ末端側から変異のはいった部分までのＤＮＡを得るこ
とが出来る。ｈＢＮのＣ末端側半分については配列番号
１６と配列番号１７の塩基配列をそれぞれＮ末端側とＣ
末端側のプライマーとしてＰＣＲを行う。この場合、前
者は、６９番目のシステインがセリンに変わるよう、３
−５番目の塩基がＴＣＣとなっている。後者はｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮプラスミッド中のｈＢＮをコードするＤＮＡ
のすぐ下流の発現ベクター中のＤＮＡ配列をコードして
いる。その結果、ｈＢＮーＣ６９ＳのＣ末端側半分、つ
まり変異の入った部分からＣ末端までのＤＮＡを得るこ
とが出来る。最後にそれぞれＰＣＲ産物を合わせ、さら
に配列番号６のＤＮＡプライマーと配列番号１７のＤＮ
Ａプライマーを加えてＰＣＲを行うことにより、全ｈＢ
Ｎ−Ｃ６９ＳのＤＮＡを得ることが出来る。
【００２６】次いで、このＤＮＡ斷片を、ｐＭＡＬTMｐ
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）のＢ
ａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間に挿入することにより、発
現プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓ（図９）
を得た。プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７Ａお
よびｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７８Ａで形質転換された大
腸菌細胞からは、元のpＭＡＬp−mＢＮで形質転換され
た大腸菌からのｈＢＮに比べて、約２〜３倍量の精製m
ＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−Ｙ７８Ａが生産され得
る。さらに元のｐＭＡＬｐ−ｈＢＮを形質転換した大腸
菌細胞からは、極少量しかｈＢＮを抽出できないが、ｐ
ＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを形質転換した大腸菌細胞
からは、大量のｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを精製することができ
る。
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）のＢ
ａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間に挿入することにより、発
現プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓ（図９）
を得た。プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７Ａお
よびｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７８Ａで形質転換された大
腸菌細胞からは、元のpＭＡＬp−mＢＮで形質転換され
た大腸菌からのｈＢＮに比べて、約２〜３倍量の精製m
ＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−Ｙ７８Ａが生産され得
る。さらに元のｐＭＡＬｐ−ｈＢＮを形質転換した大腸
菌細胞からは、極少量しかｈＢＮを抽出できないが、ｐ
ＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを形質転換した大腸菌細胞
からは、大量のｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを精製することができ
る。
【００２７】発現した変異体蛋白質、mＢＮ−Ｌ７７Ａ
およびmＢＮ−Ｙ７８Ａ、またはｈＢＮ−Ｃ６９Ｓは、
リガンドとの結合試験において、mＢＮまたはｈＢＮと
変らない解離定数を示した。これは、これらの変異体
が、元のmＢＮまたはｈＢＮと同じ、リガンドへの結合
活性を保持していることを示すものである。以上の結果
は、mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−Ｙ７８Ａが、疎水的
残基における変異によって、会合を起こしにくい形にな
り、そのために大腸菌内での分解を受けにくくなったこ
とを示唆している。また、ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓに関して
は、余分のシステイン残基がセリンに置換された結果、
立体構造形式に悪影響を及ぼし得るジスルフィド結合の
かけちがいが解消された結果、安定性が増大したことを
示唆している。このように、変異の結果、生成物の安定
性が増大したことは、収量の向上のみならず、生体内で
の投与を含めて、他のキャリアーへの結合の際の安定性
の維持が可能であり、ＢＮ領域蛋白質の取り扱いが容易
になり、その応用範囲を広くする等、有意義である。
およびmＢＮ−Ｙ７８Ａ、またはｈＢＮ−Ｃ６９Ｓは、
リガンドとの結合試験において、mＢＮまたはｈＢＮと
変らない解離定数を示した。これは、これらの変異体
が、元のmＢＮまたはｈＢＮと同じ、リガンドへの結合
活性を保持していることを示すものである。以上の結果
は、mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−Ｙ７８Ａが、疎水的
残基における変異によって、会合を起こしにくい形にな
り、そのために大腸菌内での分解を受けにくくなったこ
とを示唆している。また、ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓに関して
は、余分のシステイン残基がセリンに置換された結果、
立体構造形式に悪影響を及ぼし得るジスルフィド結合の
かけちがいが解消された結果、安定性が増大したことを
示唆している。このように、変異の結果、生成物の安定
性が増大したことは、収量の向上のみならず、生体内で
の投与を含めて、他のキャリアーへの結合の際の安定性
の維持が可能であり、ＢＮ領域蛋白質の取り扱いが容易
になり、その応用範囲を広くする等、有意義である。
【００２８】即ち、本発明は、大腸菌遺伝子発現系の制
御下にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合部位蛋白質をコ
ードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミッド、および
該発現プラスミッドによって形質転換された形質転換体
を提供する。さらに本発明は、該形質転換体を用いるリ
ガンド結合部位蛋白質の製造方法、並びに該製造方法に
よって得られるリガンド結合部位蛋白質を提供する。リ
ガンド結合部位蛋白質は好ましくはｍＢＮドメイン蛋白
質またはｈＢＮドメイン蛋白質である。本発明法により
大腸菌を宿主として生産されたmＢＮドメインまたはｈ
ＢＮドメインの生理活性を、リガンドへの結合能を指標
として測定したところ、これら両ドメインのリガンドへ
の結合能が認められた。この結果は、本発明方法で得ら
れた組換えリガンド結合領域（mＢＮドメインまたはｈ
ＢＮドメイン）蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド
結合活性を保持しており、臨床面での有用性を有すると
同時に、立体構造解析などのＧ−ＣＳＦ受容体の研究の
飛躍的な発展をもたらし得ることを示すものである。
御下にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合部位蛋白質をコ
ードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミッド、および
該発現プラスミッドによって形質転換された形質転換体
を提供する。さらに本発明は、該形質転換体を用いるリ
ガンド結合部位蛋白質の製造方法、並びに該製造方法に
よって得られるリガンド結合部位蛋白質を提供する。リ
ガンド結合部位蛋白質は好ましくはｍＢＮドメイン蛋白
質またはｈＢＮドメイン蛋白質である。本発明法により
大腸菌を宿主として生産されたmＢＮドメインまたはｈ
ＢＮドメインの生理活性を、リガンドへの結合能を指標
として測定したところ、これら両ドメインのリガンドへ
の結合能が認められた。この結果は、本発明方法で得ら
れた組換えリガンド結合領域（mＢＮドメインまたはｈ
ＢＮドメイン）蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド
結合活性を保持しており、臨床面での有用性を有すると
同時に、立体構造解析などのＧ−ＣＳＦ受容体の研究の
飛躍的な発展をもたらし得ることを示すものである。
【００２９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメイン蛋白
質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクター
pＭＡＬp−mＢＮの構築 公知のマウスＧ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸配列［福永
ら,Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)］を基に、
そのＢＮ−ドメイン（ｍＢＮドメイン）蛋白質をコード
するＤＮＡを配列番号３で示すように設計した。このＤ
ＮＡ断片は、マウスのＧ−ＣＳＦ受容体の９７番チロシ
ンから２０２番リジンをコードすると共に、その部分を
ＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、発現された融合
蛋白質から所望のｍＢＮドメイン蛋白質を単離、精製す
ることができるようにＭＢＰをコードするベクターに挿
入可能な形に設計されている。即ち、ＭＢＰとmＢＮの
間にはファクターＸaの認識部位であるＩle−Ｇlu−Ｇl
y−Ａrgをコードする配列が挿入されるよう設計されて
いる。従って、ＭＢＰと融合した形で発現したmＢＮ
は、制御プロテアーゼファクターＸaによる切断によっ
てＭＢＰから切り離される。配列番号３に示すＤＮＡ断
片では、ファクターＸaの作用をより効率的にするため
に、９７番チロシンのＮ末端側にグリシン−セリンをコ
ードする配列であるＧＧＴＴＣＴが付加されている。ま
たＣ末端には終結コドンＴＡＡが付加されている。さら
に、調製したＤＮＡ断片をpＭＡＬTMpのＸbaＩ部位に連
結すべく、該ＤＮＡのＣ末端側をさらに延長して、その
延長部にＸbaＩ認識部位が形成されている。
説明する。実施例１ マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＮドメイン蛋白
質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクター
pＭＡＬp−mＢＮの構築 公知のマウスＧ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸配列［福永
ら,Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)］を基に、
そのＢＮ−ドメイン（ｍＢＮドメイン）蛋白質をコード
するＤＮＡを配列番号３で示すように設計した。このＤ
ＮＡ断片は、マウスのＧ−ＣＳＦ受容体の９７番チロシ
ンから２０２番リジンをコードすると共に、その部分を
ＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、発現された融合
蛋白質から所望のｍＢＮドメイン蛋白質を単離、精製す
ることができるようにＭＢＰをコードするベクターに挿
入可能な形に設計されている。即ち、ＭＢＰとmＢＮの
間にはファクターＸaの認識部位であるＩle−Ｇlu−Ｇl
y−Ａrgをコードする配列が挿入されるよう設計されて
いる。従って、ＭＢＰと融合した形で発現したmＢＮ
は、制御プロテアーゼファクターＸaによる切断によっ
てＭＢＰから切り離される。配列番号３に示すＤＮＡ断
片では、ファクターＸaの作用をより効率的にするため
に、９７番チロシンのＮ末端側にグリシン−セリンをコ
ードする配列であるＧＧＴＴＣＴが付加されている。ま
たＣ末端には終結コドンＴＡＡが付加されている。さら
に、調製したＤＮＡ断片をpＭＡＬTMpのＸbaＩ部位に連
結すべく、該ＤＮＡのＣ末端側をさらに延長して、その
延長部にＸbaＩ認識部位が形成されている。
【００３０】上記ＤＮＡ断片の実際の調製はＰＣＲを用
いた。具体的には、まず、それぞれ配列番号４及び配列
番号５に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー及
びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム社
の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次いで、
２μＭのＮ−末端プライマー(５末端がリン酸化されて
いるもの)、２μＭのＣ−末端プライマーpＪ１７ＤＮＡ
（１ng）、１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのd
ＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlと
する。ここで１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、d
ＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造の
ＧeneＡmpのキットのものを使用した。この反応液をＤ
ＮＡサーマルサイクラー(型式ＰＪ２０００,宝酒造)に
セットし、９４℃，１分間熱処理；３７℃２分間アニー
リング；７２℃，３分間反応のサイクルプログラムで２
５回反応を繰り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成
する。さらに、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理する
ことにより精製する。その精製ＤＮＡのうち約１μg
を、０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５
０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素
ＸbaＩ(宝酒造)５単位と共に３７℃で１時間インキュベ
ートしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処
理及びエタノール沈澱した後、１％アガロースゲルの電
気泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出し、スプレ
ック０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した
後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。これ
を５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収す
る。フェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液か
ら目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
いた。具体的には、まず、それぞれ配列番号４及び配列
番号５に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー及
びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム社
の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次いで、
２μＭのＮ−末端プライマー(５末端がリン酸化されて
いるもの)、２μＭのＣ−末端プライマーpＪ１７ＤＮＡ
（１ng）、１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのd
ＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlと
する。ここで１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、d
ＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造の
ＧeneＡmpのキットのものを使用した。この反応液をＤ
ＮＡサーマルサイクラー(型式ＰＪ２０００,宝酒造)に
セットし、９４℃，１分間熱処理；３７℃２分間アニー
リング；７２℃，３分間反応のサイクルプログラムで２
５回反応を繰り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成
する。さらに、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理する
ことにより精製する。その精製ＤＮＡのうち約１μg
を、０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５
０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素
ＸbaＩ(宝酒造)５単位と共に３７℃で１時間インキュベ
ートしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処
理及びエタノール沈澱した後、１％アガロースゲルの電
気泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出し、スプレ
ック０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した
後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。これ
を５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収す
る。フェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液か
ら目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
【００３１】続いて、上記ＤＮＡ断片を、pＭＡＬTMp
(ニューイングランドバイオラボ社から購入可能)のＭＢ
Ｐの下流に存在する制限プロテアーゼファクターＸaの
認識配列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−Ａrg末端に存在するＳtuＩ
部位と、ＸbaＩ部位の間に挿入する(図１)。具体的に
は、約１μgのpＭＡＬTMp ＤＮＡを５０mＭ食塩及び１
０mＭ塩化マグネシウムを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さらにそれぞれ５単位の
制限酵素ＳtuＩとＸbaＩを加えて、３７℃で１時間イン
キュベートすることにより、加えたＤＮＡを消化する。
次に、１％アガロースゲルの電気泳動にかけて大きい方
のＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、スプレック
０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、
３７℃で５分間インキュベートして融解する。これを５
０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収する。
フェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液から目
的とするＤＮＡ断片を取り出す。続いてこれを上で調製
したＤＮＡ断片と混合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０m
Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)を加えて４μlとする。
これを１６μlのＡ液(ＤＮＡライゲーションキット;宝
酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮＡライゲーションキット;宝
酒造)と混合し、１６℃で３０分間反応させる。さら
に、これを１００μlの大腸菌Ｋ１２株コンピテントセ
ルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間イ
ンキュベートすることで大腸菌へ移入し、発現プラスミ
ッドpＭＡＬp−mＢＮを構築した。このプラスミッドを
導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＮは通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（受
託日：平成５年 １２月 ７日；受託番号:ＦＥＲＭ−Ｐ
１４００２)。
(ニューイングランドバイオラボ社から購入可能)のＭＢ
Ｐの下流に存在する制限プロテアーゼファクターＸaの
認識配列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−Ａrg末端に存在するＳtuＩ
部位と、ＸbaＩ部位の間に挿入する(図１)。具体的に
は、約１μgのpＭＡＬTMp ＤＮＡを５０mＭ食塩及び１
０mＭ塩化マグネシウムを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さらにそれぞれ５単位の
制限酵素ＳtuＩとＸbaＩを加えて、３７℃で１時間イン
キュベートすることにより、加えたＤＮＡを消化する。
次に、１％アガロースゲルの電気泳動にかけて大きい方
のＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、スプレック
０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、
３７℃で５分間インキュベートして融解する。これを５
０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収する。
フェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液から目
的とするＤＮＡ断片を取り出す。続いてこれを上で調製
したＤＮＡ断片と混合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０m
Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)を加えて４μlとする。
これを１６μlのＡ液(ＤＮＡライゲーションキット;宝
酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮＡライゲーションキット;宝
酒造)と混合し、１６℃で３０分間反応させる。さら
に、これを１００μlの大腸菌Ｋ１２株コンピテントセ
ルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間イ
ンキュベートすることで大腸菌へ移入し、発現プラスミ
ッドpＭＡＬp−mＢＮを構築した。このプラスミッドを
導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＮは通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（受
託日：平成５年 １２月 ７日；受託番号:ＦＥＲＭ−Ｐ
１４００２)。
【００３２】実施例２ プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｍＢ
Ｎで形質転換された大腸菌によるｍＢＮの製造 ごく少量の消泡剤を添加した、バクトトリプトン(ディ
フコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５
ｇ、１００μg／mlアンピシリンおよび０.２％グルコー
スを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、２
３℃でミッドログフェーズ（Ａ６００＝約０.９)まで増
殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が０.
２mＭになるように添加する。続いて、約２時間培養
後、菌体を集める。集めた菌体は１００mlの２０％ショ
糖２μg／mlアプロチニン、１μg／mlペプスタチンＡ、
５μg／mlロイペプチンを含む３０mＭトリス緩衝液（p
Ｈ７.５）に懸濁して室温で１０分間保温する。続いて
再び集菌し、今度は５０mlの２μg／mlアプロチニン、
１μg／mlペプスタチンＡ、５μg／mlロイペプチンを含
む５mＭ硫酸マグネシウムに懸濁して０℃で１０分間保
温する。これを８,０００回転の遠心で除いた後、上清
を集めてペリプラスム画分とする。
Ｎで形質転換された大腸菌によるｍＢＮの製造 ごく少量の消泡剤を添加した、バクトトリプトン(ディ
フコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５
ｇ、１００μg／mlアンピシリンおよび０.２％グルコー
スを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、２
３℃でミッドログフェーズ（Ａ６００＝約０.９)まで増
殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が０.
２mＭになるように添加する。続いて、約２時間培養
後、菌体を集める。集めた菌体は１００mlの２０％ショ
糖２μg／mlアプロチニン、１μg／mlペプスタチンＡ、
５μg／mlロイペプチンを含む３０mＭトリス緩衝液（p
Ｈ７.５）に懸濁して室温で１０分間保温する。続いて
再び集菌し、今度は５０mlの２μg／mlアプロチニン、
１μg／mlペプスタチンＡ、５μg／mlロイペプチンを含
む５mＭ硫酸マグネシウムに懸濁して０℃で１０分間保
温する。これを８,０００回転の遠心で除いた後、上清
を集めてペリプラスム画分とする。
【００３３】ペリプラスム画分は２０mＭになるように
リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.０)を加えた後、１mＭ
ＥＤＴＡを含む２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
０)(以後Ａ緩衝液と略す)で平衡化したＱ−セファロー
ス(２.２cm直径×１０cm;ファルマシア)に添加して全体
で５００mlのＡ緩衝液で０−０.４Ｍ食塩の濃度勾配で
溶出する(図２)。ＭＢＰとmＢＮとが融合した形態の目
的とする蛋白質は、２８０nmの吸光度で追跡すると０.
２Ｍ食塩濃度付近にピークとして溶出され、ＳＤＳを含
む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約５４キロダ
ルトンの分子量を示すことで確認することができる。目
的物の画分をＰＭ−１０(アミコン)で約５ml位にまで濃
縮するとともに、濃縮液を０.１Ｍのトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）におきかえる。これにさらに４０μlのプロテ
アーゼファクターＸa(ニューイングランドパイオラボ
社)を添加して１６℃で２０時間反応させる。これによ
りmＢＮがＭＢＰから切り放される。
リン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.０)を加えた後、１mＭ
ＥＤＴＡを含む２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
０)(以後Ａ緩衝液と略す)で平衡化したＱ−セファロー
ス(２.２cm直径×１０cm;ファルマシア)に添加して全体
で５００mlのＡ緩衝液で０−０.４Ｍ食塩の濃度勾配で
溶出する(図２)。ＭＢＰとmＢＮとが融合した形態の目
的とする蛋白質は、２８０nmの吸光度で追跡すると０.
２Ｍ食塩濃度付近にピークとして溶出され、ＳＤＳを含
む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約５４キロダ
ルトンの分子量を示すことで確認することができる。目
的物の画分をＰＭ−１０(アミコン)で約５ml位にまで濃
縮するとともに、濃縮液を０.１Ｍのトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）におきかえる。これにさらに４０μlのプロテ
アーゼファクターＸa(ニューイングランドパイオラボ
社)を添加して１６℃で２０時間反応させる。これによ
りmＢＮがＭＢＰから切り放される。
【００３４】反応液をＡ緩衝液で１０倍希釈する。これ
をＡ緩衝液で平衡化したＳ−セェファロース(１.２cm直
径×５cm;ファルマシア)に添加し、全体２００mlのＡ緩
衝液で０−０.４Ｍの食塩の濃度勾配で溶出する。２８
０nmの吸光度で追跡すると、０.１３Ｍ食塩濃度付近
に、ＭＢＰから切り離された目的物質、mＢＮが溶出さ
れる。これをＳＤＳを含む１５％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、約１３キロダルトンのバンドを検
出することによって、目的物であることを確認すること
ができる。なおＭＢＰの分子量は約４２キロダルトンで
あり、Ｓ−セェファロースには吸着しないために、ｍＢ
Ｎとは明確に区別される。上記の目的物を含む画分を濃
縮した後、０.２Ｍ 食塩を含むＡ緩衝液で平衡化したゲ
ル濾過ＨＰＬＣであるＴＳＫgel Ｇ２０００ＳＷ Ｈ
ＰＬＣ(７.６mm直径×６００cm;トソー)に添加すると、
mＢＮドメインが溶出した(図３)。このようにして、１
リットルの培養液で培養した菌体から、単一の標品にま
で精製された約０.１mgのｍＢＮを得た。この蛋白質の
Ｎ末端のアミノ酸配列はＧly−Ｓer−Ｔyr−Ｐro−Ｐro
−Ａla−Ｓerであり、発現が予想される蛋白質のＮ末端
の配列と一致している。これは、精製物が目的のmＢＮ
であることを示すものである。
をＡ緩衝液で平衡化したＳ−セェファロース(１.２cm直
径×５cm;ファルマシア)に添加し、全体２００mlのＡ緩
衝液で０−０.４Ｍの食塩の濃度勾配で溶出する。２８
０nmの吸光度で追跡すると、０.１３Ｍ食塩濃度付近
に、ＭＢＰから切り離された目的物質、mＢＮが溶出さ
れる。これをＳＤＳを含む１５％のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、約１３キロダルトンのバンドを検
出することによって、目的物であることを確認すること
ができる。なおＭＢＰの分子量は約４２キロダルトンで
あり、Ｓ−セェファロースには吸着しないために、ｍＢ
Ｎとは明確に区別される。上記の目的物を含む画分を濃
縮した後、０.２Ｍ 食塩を含むＡ緩衝液で平衡化したゲ
ル濾過ＨＰＬＣであるＴＳＫgel Ｇ２０００ＳＷ Ｈ
ＰＬＣ(７.６mm直径×６００cm;トソー)に添加すると、
mＢＮドメインが溶出した(図３)。このようにして、１
リットルの培養液で培養した菌体から、単一の標品にま
で精製された約０.１mgのｍＢＮを得た。この蛋白質の
Ｎ末端のアミノ酸配列はＧly−Ｓer−Ｔyr−Ｐro−Ｐro
−Ａla−Ｓerであり、発現が予想される蛋白質のＮ末端
の配列と一致している。これは、精製物が目的のmＢＮ
であることを示すものである。
【００３５】実施例３ 組換えｍＢＮのリガンドとの結
合活性 実施例２で単一にまで精製したmＢＮの生理活性を下記
の方法により、リガンドであるＧ−ＣＳＦとの結合能を
指標として測定した。mＢＮと125Ｉで放射能標識したＧ
−ＣＳＦとを混合してmＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体を形
成させる。形成された複合体に架橋剤を添加して固定し
た後、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
展開し、ゲル上のバンドとして分離する。バンドの観察
は、ゲルをイメージングプレートで顕出することにより
行う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識のＧ
−ＣＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそ
れと競争させることにより、ｍＢＮとＧ−ＣＳＦの複合
体の解離定数を測定することができる。
合活性 実施例２で単一にまで精製したmＢＮの生理活性を下記
の方法により、リガンドであるＧ−ＣＳＦとの結合能を
指標として測定した。mＢＮと125Ｉで放射能標識したＧ
−ＣＳＦとを混合してmＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体を形
成させる。形成された複合体に架橋剤を添加して固定し
た後、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
展開し、ゲル上のバンドとして分離する。バンドの観察
は、ゲルをイメージングプレートで顕出することにより
行う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識のＧ
−ＣＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそ
れと競争させることにより、ｍＢＮとＧ−ＣＳＦの複合
体の解離定数を測定することができる。
【００３６】実施例２で調製した０.５μＭのmＢＮドメ
イン、１.２mＭ125Ｉ−ヒトＧ−ＣＳＦ(１００,０００c
pm、アムシャム社)および様々な濃度の非標識ヒトＧ−
ＣＳＦ(１０-5−１０-10Ｍ;キリン株式会社より供与）
の混合物を、０.００５％ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢
酸緩衝液（pＨ７.０）中、最終容量５０μlとして室温
で９０分間保温する。次いで、０.５μlのジメチルスル
ホキシドに溶解した０.１Ｍジチオビスサクシニミジル
プロピオーネ(ピアスケミカル社)を加え、０℃で３０分
間保温する。５μlの２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.
５）を加えて反応を止める。続いて、反応混合物をＳＤ
Ｓを含む１５％のポリアクリルアミド電気泳動にかけ
る。泳動後、ゲルをフジイメージィングプレート(アナ
ライズ用、タイプＢＡ;(株)富士写真フィルム)に感光さ
せ、イメージアナライザー(バイオ・イメージアナライ
ザーＢＡ１００;富士写真フィルム)で解析すると、生成
したmＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体は、ゲル上の３０キロ
ダルトンのバンドとして顕出された。この複合体の解離
定数は、非標識Ｇ−ＣＳＦを加えて行った実験における
値との比較より、３０−８０nＭと測定された(図４)。
この結果は福永ら(ＥＭＢＯ Ｊ.１０,２８５５−２８
６５(１９９１))が、相補ＤＮＡのＣ末端ドメインのみ
を欠失させた変異体を用いて行った実験の結果とよく対
応しており、本発明方法で得た蛋白質が目的とするｍＢ
Ｎ蛋白質であることを示している。
イン、１.２mＭ125Ｉ−ヒトＧ−ＣＳＦ(１００,０００c
pm、アムシャム社)および様々な濃度の非標識ヒトＧ−
ＣＳＦ(１０-5−１０-10Ｍ;キリン株式会社より供与）
の混合物を、０.００５％ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢
酸緩衝液（pＨ７.０）中、最終容量５０μlとして室温
で９０分間保温する。次いで、０.５μlのジメチルスル
ホキシドに溶解した０.１Ｍジチオビスサクシニミジル
プロピオーネ(ピアスケミカル社)を加え、０℃で３０分
間保温する。５μlの２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.
５）を加えて反応を止める。続いて、反応混合物をＳＤ
Ｓを含む１５％のポリアクリルアミド電気泳動にかけ
る。泳動後、ゲルをフジイメージィングプレート(アナ
ライズ用、タイプＢＡ;(株)富士写真フィルム)に感光さ
せ、イメージアナライザー(バイオ・イメージアナライ
ザーＢＡ１００;富士写真フィルム)で解析すると、生成
したmＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体は、ゲル上の３０キロ
ダルトンのバンドとして顕出された。この複合体の解離
定数は、非標識Ｇ−ＣＳＦを加えて行った実験における
値との比較より、３０−８０nＭと測定された(図４)。
この結果は福永ら(ＥＭＢＯ Ｊ.１０,２８５５−２８
６５(１９９１))が、相補ＤＮＡのＣ末端ドメインのみ
を欠失させた変異体を用いて行った実験の結果とよく対
応しており、本発明方法で得た蛋白質が目的とするｍＢ
Ｎ蛋白質であることを示している。
【００３７】即ち、福永らは上記変異体に関して、解離
定数約１０ｎＭを報告している。Ｃ末端ドメイン−欠失
変異体はイムノグロブリン様ドメインを含んでいるが、
このイムノグロブリン様ドメインのみを欠失させた場
合、結合活性は天然のものの約１／１０〜１／２０に低
下することが知られている（解離定数は増大）。従っ
て、ＢＮドメインのみの場合には、さらに上記Ｃ末端ド
メイン−欠失変異体の解離定数の約１０ｎＭから増大す
ると予測される。従って本実施例で得た値（３０〜８０
ｎＭ）は、この予測とよく対応していることが分かる。
即ち、実施例２で得た、単一に精製されたmＢＮは天然
のＧ−ＣＳＦ受容体におけるｍＢＮ（リガンド結合領域
蛋白質）と同様のフォールディングをしていることが強
く示唆されるものである。
定数約１０ｎＭを報告している。Ｃ末端ドメイン−欠失
変異体はイムノグロブリン様ドメインを含んでいるが、
このイムノグロブリン様ドメインのみを欠失させた場
合、結合活性は天然のものの約１／１０〜１／２０に低
下することが知られている（解離定数は増大）。従っ
て、ＢＮドメインのみの場合には、さらに上記Ｃ末端ド
メイン−欠失変異体の解離定数の約１０ｎＭから増大す
ると予測される。従って本実施例で得た値（３０〜８０
ｎＭ）は、この予測とよく対応していることが分かる。
即ち、実施例２で得た、単一に精製されたmＢＮは天然
のＧ−ＣＳＦ受容体におけるｍＢＮ（リガンド結合領域
蛋白質）と同様のフォールディングをしていることが強
く示唆されるものである。
【００３８】実施例４ 変異ｍＢＮドメインＬ７７Ａお
よびＹ７８ＡをコードするＤＮＡの調製および大腸菌発
現ベクターpＭＡＬp−mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬp
−mＢＮ−Ｙ７８Ａの構築 （１） pＭＡＬp mＢＮ−Ｌ７７Ａの構築 変異ｍＢＮドメインＬ７７ＡをコードするＤＮＡを製造
するために、配列番号６の塩基配列を有するＮ末端プラ
イマー、配列番号７の塩基配列を有するＣ末端プライマ
ーをアプライド・バイオシステム社の３８０Ｂ型ＤＮＡ
合成機を用いて調製した。これらプライマーと、テンペ
レートとしてｐＭＡＬTMp−ｍＢＮを用い、実質上、実
施例１と同様にＰＣＲ反応に付し、変異ＤＮＡを調製し
た。即ち、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−
末端プライマー、pＭＡＬpTM−mＢＮ ＤＮＡ（１ng）、
１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、d
ＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラー
ゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlとする。ここ
で１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣ
ＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpの
キットのものを使用した。この反応液をＤＮＡサーマル
サイクラー(型式ＰＪ２０００,宝酒造)にセットし、９
４℃，１分間熱処理；３７℃２分間アニーリング；７２
℃，３分間反応のサイクルプログラムで２５回反応を繰
り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成する。さら
に、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理することにより
精製する。その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食
塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス塩
酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素ＢamＨI(宝酒
造)５単位およびＰｆＩＭＩ（ニューイングランドバイ
オラボ）５単位と共に３７℃で１時間インキュベートし
てＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処理及び
エタノール沈澱した後、１％アガロースゲルの電気泳動
にかけ、約０.２kbpのバンドを切り出し、スプレック０
１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、３
７℃で５分間インキュベートして融解する。これを５０
００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収する。フ
ェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液から目的
とするＤＮＡ断片を取り出す。
よびＹ７８ＡをコードするＤＮＡの調製および大腸菌発
現ベクターpＭＡＬp−mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬp
−mＢＮ−Ｙ７８Ａの構築 （１） pＭＡＬp mＢＮ−Ｌ７７Ａの構築 変異ｍＢＮドメインＬ７７ＡをコードするＤＮＡを製造
するために、配列番号６の塩基配列を有するＮ末端プラ
イマー、配列番号７の塩基配列を有するＣ末端プライマ
ーをアプライド・バイオシステム社の３８０Ｂ型ＤＮＡ
合成機を用いて調製した。これらプライマーと、テンペ
レートとしてｐＭＡＬTMp−ｍＢＮを用い、実質上、実
施例１と同様にＰＣＲ反応に付し、変異ＤＮＡを調製し
た。即ち、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−
末端プライマー、pＭＡＬpTM−mＢＮ ＤＮＡ（１ng）、
１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、d
ＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラー
ゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlとする。ここ
で１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣ
ＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpの
キットのものを使用した。この反応液をＤＮＡサーマル
サイクラー(型式ＰＪ２０００,宝酒造)にセットし、９
４℃，１分間熱処理；３７℃２分間アニーリング；７２
℃，３分間反応のサイクルプログラムで２５回反応を繰
り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成する。さら
に、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理することにより
精製する。その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食
塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス塩
酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素ＢamＨI(宝酒
造)５単位およびＰｆＩＭＩ（ニューイングランドバイ
オラボ）５単位と共に３７℃で１時間インキュベートし
てＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処理及び
エタノール沈澱した後、１％アガロースゲルの電気泳動
にかけ、約０.２kbpのバンドを切り出し、スプレック０
１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、３
７℃で５分間インキュベートして融解する。これを５０
００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収する。フ
ェノール処理及びエタノール沈澱によって濾液から目的
とするＤＮＡ断片を取り出す。
【００３９】他方、pＭＡＬTMp−ｍＢＮ約１μｇを５０
mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１０mＭト
リス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さらにそ
れぞれ５単位の制限酵素ＢamＨIとＰｆＩＭＩを加え
て、３７℃で１時間インキュベートすることにより、加
えたＤＮＡを消化する。次に、１％アガロースゲルの電
気泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバンド
を切り出し、スプレック０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノー
ル沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出
す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合し、１
mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.
４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液（ＤＮ
Ａライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮ
Ａライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６℃で３
０分間反応させる。さらに、これを１００μlの大腸菌
Ｋ１２株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分間、
さらに４２℃で２分間インキュベートすることにより大
腸菌へ移入し、発現プラスミッドpＭＡＬp−mＢＮ−Ｌ
７７Ａを構築した。プラスミッド中の変異ＢＮドメイン
に対応するＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号９に示す。
このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp
−mＢＮ−Ｌ７７Ａは通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている(受託日：平成５年 １２月
７日;受託番号:ＦＥＲＭ−Ｐ １４００３)。
mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１０mＭト
リス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さらにそ
れぞれ５単位の制限酵素ＢamＨIとＰｆＩＭＩを加え
て、３７℃で１時間インキュベートすることにより、加
えたＤＮＡを消化する。次に、１％アガロースゲルの電
気泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバンド
を切り出し、スプレック０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノー
ル沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出
す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合し、１
mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.
４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液（ＤＮ
Ａライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮ
Ａライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６℃で３
０分間反応させる。さらに、これを１００μlの大腸菌
Ｋ１２株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分間、
さらに４２℃で２分間インキュベートすることにより大
腸菌へ移入し、発現プラスミッドpＭＡＬp−mＢＮ−Ｌ
７７Ａを構築した。プラスミッド中の変異ＢＮドメイン
に対応するＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号９に示す。
このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp
−mＢＮ−Ｌ７７Ａは通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている(受託日：平成５年 １２月
７日;受託番号:ＦＥＲＭ−Ｐ １４００３)。
【００４０】（２）pＭＡＬp−mＢＮ−Ｙ７８Ａの構築 配列番号８の塩基配列を有するＣ末端プライマーを用い
る外は、上記（１）と同様にして目的のＤＮＡ断片（配
列番号１０）を含有する発現プラスミッドpＭＡＬp m
ＢＮ−Ｙ７８Ａを構築した。このプラスミッドを導入し
た大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＮ−Ｙ７８Ａは通産
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている
（受託日：平成５年 １２月 ７日；受託番号:ＦＥＲＭ
−Ｐ １４００４)。
る外は、上記（１）と同様にして目的のＤＮＡ断片（配
列番号１０）を含有する発現プラスミッドpＭＡＬp m
ＢＮ−Ｙ７８Ａを構築した。このプラスミッドを導入し
た大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＮ−Ｙ７８Ａは通産
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている
（受託日：平成５年 １２月 ７日；受託番号:ＦＥＲＭ
−Ｐ １４００４)。
【００４１】実施例５ プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｍＢ
Ｎ−Ｌ７７ＡまたはｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７ＡＹ７
８Ａで形質転換された大腸菌による変異ｍＢＮの製造お
よびその活性 実施例２と同様にして形質転換体を培養し、そのペリプ
ラズム画分から、目的の変異ｍＢＮを得た。このように
して、１リットルの培養液で培養された各形質転換体体
の培養液から、それぞれ、単一の標品にまで精製された
ｍＢＮ−Ｌ７７ＡおよびｍＢＮ−Ｙ７８Ａを約０.２５m
gおよび約０.２５mgを得た。このように、pＭＡＬp−m
ＢＮ−Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬp−mＢＮ−Ｙ７８Ａで形
質転換された大腸菌の培養液からは、元のpＭＡＬp−m
ＢＮで形質転換された大腸菌の場合に比べて、同じ量の
培養液から約２〜３倍量の精製mＢＮ−Ｌ７７Ａおよびm
ＢＮ−Ｙ７８Ａ蛋白質を得ることができる。これらの蛋
白質はいずれも単一標品である。次いで、実施例３と同
様にして、単一にまで精製された変異体mＢＮの生理活
性を調べた。その結果、mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−
Ｙ７８Ａは、mＢＮと変らない解離定数を示した（図
６）。この結果は、本実施例で得た、単一に精製された
変異mＢＮが天然のＧ−ＣＳＦ受容体におけるｍＢＮ
（リガンド結合領域蛋白質）と同様のフォールディング
をし、かつリガンド結合能力を有することを強く示唆す
るものである。
Ｎ−Ｌ７７ＡまたはｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７ＡＹ７
８Ａで形質転換された大腸菌による変異ｍＢＮの製造お
よびその活性 実施例２と同様にして形質転換体を培養し、そのペリプ
ラズム画分から、目的の変異ｍＢＮを得た。このように
して、１リットルの培養液で培養された各形質転換体体
の培養液から、それぞれ、単一の標品にまで精製された
ｍＢＮ−Ｌ７７ＡおよびｍＢＮ−Ｙ７８Ａを約０.２５m
gおよび約０.２５mgを得た。このように、pＭＡＬp−m
ＢＮ−Ｌ７７ＡおよびpＭＡＬp−mＢＮ−Ｙ７８Ａで形
質転換された大腸菌の培養液からは、元のpＭＡＬp−m
ＢＮで形質転換された大腸菌の場合に比べて、同じ量の
培養液から約２〜３倍量の精製mＢＮ−Ｌ７７Ａおよびm
ＢＮ−Ｙ７８Ａ蛋白質を得ることができる。これらの蛋
白質はいずれも単一標品である。次いで、実施例３と同
様にして、単一にまで精製された変異体mＢＮの生理活
性を調べた。その結果、mＢＮ−Ｌ７７ＡおよびmＢＮ−
Ｙ７８Ａは、mＢＮと変らない解離定数を示した（図
６）。この結果は、本実施例で得た、単一に精製された
変異mＢＮが天然のＧ−ＣＳＦ受容体におけるｍＢＮ
（リガンド結合領域蛋白質）と同様のフォールディング
をし、かつリガンド結合能力を有することを強く示唆す
るものである。
【００４２】実施例６ ヒトＧ−ＣＳＦ受容体のＢＮド
メイン蛋白質をコードするＤＮＡの調製及び大腸菌発現
ベクターｐＭＡＬｐ−ｈＢＮの構築 公知のヒトＧーＣＳＦ受容体のアミノ酸配列（福永ら、
Ｐroc. Ｎatl. Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ， ８７, ８７０２
−８７０６ (１９９０)）を基に、そのＢＮドメイン
（ｈＢＮドメイン）蛋白質をコードするＤＮＡを配列番
号１１に示すように設計した。このＤＮＡ断片は、ヒト
のＧーＣＳＦ受容体の９８番チロシンから２０３番リジ
ン（福永ら、前掲）をコードするとともに、その部分を
ＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、発現させた融合
蛋白質から所望のｈＢＮドメイン蛋白質を単離、精製す
ることが出来るように、ＭＢＰをコードするベクターに
工夫がなされている。即ち、ＭＢＰとｈＢＮの間にファ
クターＸａの認識部位であるＩle−Ｇlu−Ｇly−Ａrgを
コードする配列が挿入されている。従って、ＭＢＰと融
合した形で発現したｈＢＮは、制限プロテアーゼファク
ターＸａによってＭＢＰから切り出される。ｈＢＮ配列
に示すＤＮＡ断片では、ファクターＸａの作用をより効
率的にするために、９８番チロシンのＮ末端側にグリシ
ンーセリンをコードする配列であるＧＧＴＴＣＴが付加
されている。またＣ末端側には終結コドンＴＡＡが付加
されている。さらに、調製したＤＮＡ断片をｐＭＡＬTM
ｐのＸｂａＩの部位に連結すべく、該ＤＮＡのＣ末端側
をさらに延長して、その延長部にＸｂａＩ認識部位が形
成されている。
メイン蛋白質をコードするＤＮＡの調製及び大腸菌発現
ベクターｐＭＡＬｐ−ｈＢＮの構築 公知のヒトＧーＣＳＦ受容体のアミノ酸配列（福永ら、
Ｐroc. Ｎatl. Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ， ８７, ８７０２
−８７０６ (１９９０)）を基に、そのＢＮドメイン
（ｈＢＮドメイン）蛋白質をコードするＤＮＡを配列番
号１１に示すように設計した。このＤＮＡ断片は、ヒト
のＧーＣＳＦ受容体の９８番チロシンから２０３番リジ
ン（福永ら、前掲）をコードするとともに、その部分を
ＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、発現させた融合
蛋白質から所望のｈＢＮドメイン蛋白質を単離、精製す
ることが出来るように、ＭＢＰをコードするベクターに
工夫がなされている。即ち、ＭＢＰとｈＢＮの間にファ
クターＸａの認識部位であるＩle−Ｇlu−Ｇly−Ａrgを
コードする配列が挿入されている。従って、ＭＢＰと融
合した形で発現したｈＢＮは、制限プロテアーゼファク
ターＸａによってＭＢＰから切り出される。ｈＢＮ配列
に示すＤＮＡ断片では、ファクターＸａの作用をより効
率的にするために、９８番チロシンのＮ末端側にグリシ
ンーセリンをコードする配列であるＧＧＴＴＣＴが付加
されている。またＣ末端側には終結コドンＴＡＡが付加
されている。さらに、調製したＤＮＡ断片をｐＭＡＬTM
ｐのＸｂａＩの部位に連結すべく、該ＤＮＡのＣ末端側
をさらに延長して、その延長部にＸｂａＩ認識部位が形
成されている。
【００４３】上記のＤＮＡを製造するためにＰＣＲを用
いた。具体的には配列番号１３および配列番号１４で示
されるＤＮＡ断片をそれぞれＮ末端およびＣ末端プライ
マーとしてアプライドバイオシステム社の３８０Ｂ型Ｄ
ＮＡ合成機を用いて調製した。即ち２μＭのＮ末端プラ
イマー、２μＭのＣ末端プライマー、ｐＨＱ３ＤＮＡ
（１ｎｇ）、１０Ｘ反応緩衝液１０μｌ、各０.２５ｍ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを加えて最終液量を１
００μlとする。ここで１０Ｘ反応緩衝液、ｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼは宝酒造のＧeneＡｍｐのキットものを使用し
た。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー（型式ＰＪ
２０００、宝酒造）にセットし、９４℃、１分間熱処
理；３７℃、２分間アニーリング；７２℃、３分間反応
のサイクルプログラムで２５回反応を繰り返すことによ
り合成する。さらに、上記ＰＣＲ産物をフェノール処理
することで精製する。この精製ＤＮＡのうち、約１０ｎ
ｇをそれぞれ５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造）お
よびＸｂａＩ（宝酒造）とともに０.１Ｍ食塩および１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）５０μl 中、３７℃で１時間インキュベ
ートしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処
理およびエタノール沈殿した後、１％アガロースゲルの
電気泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出しスプレ
ック０１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結し
た後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。こ
れを５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収
する。フェノール処理およびエタノール沈殿で目的とす
るＤＮＡを取り出す。
いた。具体的には配列番号１３および配列番号１４で示
されるＤＮＡ断片をそれぞれＮ末端およびＣ末端プライ
マーとしてアプライドバイオシステム社の３８０Ｂ型Ｄ
ＮＡ合成機を用いて調製した。即ち２μＭのＮ末端プラ
イマー、２μＭのＣ末端プライマー、ｐＨＱ３ＤＮＡ
（１ｎｇ）、１０Ｘ反応緩衝液１０μｌ、各０.２５ｍ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを加えて最終液量を１
００μlとする。ここで１０Ｘ反応緩衝液、ｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼは宝酒造のＧeneＡｍｐのキットものを使用し
た。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー（型式ＰＪ
２０００、宝酒造）にセットし、９４℃、１分間熱処
理；３７℃、２分間アニーリング；７２℃、３分間反応
のサイクルプログラムで２５回反応を繰り返すことによ
り合成する。さらに、上記ＰＣＲ産物をフェノール処理
することで精製する。この精製ＤＮＡのうち、約１０ｎ
ｇをそれぞれ５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造）お
よびＸｂａＩ（宝酒造）とともに０.１Ｍ食塩および１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）５０μl 中、３７℃で１時間インキュベ
ートしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処
理およびエタノール沈殿した後、１％アガロースゲルの
電気泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出しスプレ
ック０１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結し
た後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。こ
れを５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収
する。フェノール処理およびエタノール沈殿で目的とす
るＤＮＡを取り出す。
【００４４】続いて、上記ＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬTMｐ
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）の下
流に存在する制限プロテアーゼファクターＸａの認識配
列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−Ａrg末端に存在するＢａｍＨＩと
ＸｂａＩ部位の間に挿入する（図７）。具体的には、約
１μｇのpＭＡＬTMｐ ＤＮＡを５０ｍＭ食塩および１０
ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.５）５０μｌに溶解し、さらにそれぞれ５単位
の制限酵素ＢamＨＩとＸｂaIを加えて、３７℃で１時間
インキュベートしてＤＮＡを消化する。次にこれを１％
アガロースゲルの電気泳動にかけ、大きいほうのバンド
を切り出し、スプレック０１（宝酒造）に入れ、−８０
℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベー
トすることにより融解する。これを５０００回転で１０
分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処理お
よびエタノール沈殿で目的とするＤＮＡを取り出す。続
いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合し、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（pＨ７.４）を加
えて４μｌとする。これを１６μｌのＡ液（ＤＮＡライ
ゲーションキット；宝酒造）および４μｌのＢ液（ＤＮ
Ａライゲーションキット；宝酒造）と混合し、１６℃で
３０分間反応させる。さらに、これを１００μｌの大腸
菌Ｋ１２株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分
間、さらに４２℃で２分間インキュベーションすること
で大腸菌へ移入し、発現プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈＢ
Ｎを構築した。このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ１
２株／ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮは通産省工技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。（受託日：平成６年
５月 ２３日；寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ １４３２１）。
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）の下
流に存在する制限プロテアーゼファクターＸａの認識配
列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−Ａrg末端に存在するＢａｍＨＩと
ＸｂａＩ部位の間に挿入する（図７）。具体的には、約
１μｇのpＭＡＬTMｐ ＤＮＡを５０ｍＭ食塩および１０
ｍＭ塩化マグネシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.５）５０μｌに溶解し、さらにそれぞれ５単位
の制限酵素ＢamＨＩとＸｂaIを加えて、３７℃で１時間
インキュベートしてＤＮＡを消化する。次にこれを１％
アガロースゲルの電気泳動にかけ、大きいほうのバンド
を切り出し、スプレック０１（宝酒造）に入れ、−８０
℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベー
トすることにより融解する。これを５０００回転で１０
分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処理お
よびエタノール沈殿で目的とするＤＮＡを取り出す。続
いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合し、１ｍＭの
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（pＨ７.４）を加
えて４μｌとする。これを１６μｌのＡ液（ＤＮＡライ
ゲーションキット；宝酒造）および４μｌのＢ液（ＤＮ
Ａライゲーションキット；宝酒造）と混合し、１６℃で
３０分間反応させる。さらに、これを１００μｌの大腸
菌Ｋ１２株コンピテントセルと混合し、０℃で３０分
間、さらに４２℃で２分間インキュベーションすること
で大腸菌へ移入し、発現プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈＢ
Ｎを構築した。このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ１
２株／ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮは通産省工技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。（受託日：平成６年
５月 ２３日；寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ １４３２１）。
【００４５】実施例７ プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈＢ
Ｎで形質転換された大腸菌によるｈＢＮの製造 バクトトリプトン（ディフコ）１０ｇ、イーストエキス
（ディフコ）５ｇ、食塩５ｇ、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンおよび０.２％グルコースを含む培地１リットル
に上記形質転換体を接種し、２３℃でミッドログフェー
ズ（Ａ６００＝約０.９）まで増殖させる。それにＩＰ
ＴＧ（シグマ社）を最終濃度が０.２ｍＭになるように
添加する。続いて、約２時間培養後、菌体を集める。集
めた菌体は２００ｍｌの２０％ショ糖、２μg/mlアプロ
チニン、１μg/mlペプスタチンＡ、５μg/mlロイペプチ
ンをふくむ３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）に懸濁
して室温で１０分間インキュベートする。再び集菌し、
５０ｍｌの２μg/mlアプロチニン、１μg/mlペプスタチ
ンＡ、５μg/mlロイペプチンを含有する５ｍＭ硫酸マグ
ネシウムに懸濁して０℃で１０分間インキュベートす
る。これを８０００回転の遠心で除いた後、上清を集め
ペリプラスム画分とする。ペリプラスム画分は２０ｍＭ
になるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を
加えた後、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ２ーメルカプトエタ
ノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６.０）（以後Ａ緩衝液と略す）で平衡化したＱーセフ
ァロース（２.２ｃｍ直径Ｘ１０ｃｍ；ファルマシア）
に添加して全体で５００ｍｌのＡ緩衝液で０−０.４Ｍ
食塩の濃度勾配で溶出する。目的のＭＢＰとhＢＮとの
融合蛋白質は、０.２Ｍ食塩濃度付近に溶出され、ＳＤ
Ｓを含む１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約
５４キロダルトンの分子量を示すことで確認することが
出来る。
Ｎで形質転換された大腸菌によるｈＢＮの製造 バクトトリプトン（ディフコ）１０ｇ、イーストエキス
（ディフコ）５ｇ、食塩５ｇ、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンおよび０.２％グルコースを含む培地１リットル
に上記形質転換体を接種し、２３℃でミッドログフェー
ズ（Ａ６００＝約０.９）まで増殖させる。それにＩＰ
ＴＧ（シグマ社）を最終濃度が０.２ｍＭになるように
添加する。続いて、約２時間培養後、菌体を集める。集
めた菌体は２００ｍｌの２０％ショ糖、２μg/mlアプロ
チニン、１μg/mlペプスタチンＡ、５μg/mlロイペプチ
ンをふくむ３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）に懸濁
して室温で１０分間インキュベートする。再び集菌し、
５０ｍｌの２μg/mlアプロチニン、１μg/mlペプスタチ
ンＡ、５μg/mlロイペプチンを含有する５ｍＭ硫酸マグ
ネシウムに懸濁して０℃で１０分間インキュベートす
る。これを８０００回転の遠心で除いた後、上清を集め
ペリプラスム画分とする。ペリプラスム画分は２０ｍＭ
になるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を
加えた後、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ２ーメルカプトエタ
ノールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６.０）（以後Ａ緩衝液と略す）で平衡化したＱーセフ
ァロース（２.２ｃｍ直径Ｘ１０ｃｍ；ファルマシア）
に添加して全体で５００ｍｌのＡ緩衝液で０−０.４Ｍ
食塩の濃度勾配で溶出する。目的のＭＢＰとhＢＮとの
融合蛋白質は、０.２Ｍ食塩濃度付近に溶出され、ＳＤ
Ｓを含む１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約
５４キロダルトンの分子量を示すことで確認することが
出来る。
【００４６】目的物の画分をＰＭ−１０（アミコン）で
約５mlまで濃縮すると共に、濃縮液を０.１Ｍトリス緩
衝液に置き換える 。これにプロテアーゼファクターＸa
（ニューイングランドバイオラボ社）を添加し、１６℃
で２０時間反応させる。これによりｈＢＮがＭＢＰから
切り離される。次いで、反応液を１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ２ーメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５.５）（以後Ｂ緩衝液と略す）で
平衡化したＳーセファロース（１.２ｃｍ直径Ｘ５ｃ
ｍ；ファルマシア）に添加して全体で２００ｍｌのＢ緩
衝液で０−０.４Ｍ食塩の濃度勾配で溶出する。２８０
ｎｍの吸光度で追跡すると、０.２Ｍ食塩濃度付近に、
ＭＢＰから切り離された目的物ｈＢＮが溶出された。こ
れは、ＳＤＳ含有−１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で、約１２キロダルトンの分子量を示すバンドとし
て確認することが出来る。上記目的物は濃縮した後、
０.２Ｍ食塩を含むＡ緩衝液で平衡化したゲル濾過ＨＰ
ＬＣである、ＴＳＫ gel Ｇ２０００ＳＷ ＨＰＬＣ
（７.６ｍｍ直径Ｘ６００ｃｍ；トーソー）に添加し
て、ｈＢＮドメインを溶出する。
約５mlまで濃縮すると共に、濃縮液を０.１Ｍトリス緩
衝液に置き換える 。これにプロテアーゼファクターＸa
（ニューイングランドバイオラボ社）を添加し、１６℃
で２０時間反応させる。これによりｈＢＮがＭＢＰから
切り離される。次いで、反応液を１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ２ーメルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５.５）（以後Ｂ緩衝液と略す）で
平衡化したＳーセファロース（１.２ｃｍ直径Ｘ５ｃ
ｍ；ファルマシア）に添加して全体で２００ｍｌのＢ緩
衝液で０−０.４Ｍ食塩の濃度勾配で溶出する。２８０
ｎｍの吸光度で追跡すると、０.２Ｍ食塩濃度付近に、
ＭＢＰから切り離された目的物ｈＢＮが溶出された。こ
れは、ＳＤＳ含有−１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で、約１２キロダルトンの分子量を示すバンドとし
て確認することが出来る。上記目的物は濃縮した後、
０.２Ｍ食塩を含むＡ緩衝液で平衡化したゲル濾過ＨＰ
ＬＣである、ＴＳＫ gel Ｇ２０００ＳＷ ＨＰＬＣ
（７.６ｍｍ直径Ｘ６００ｃｍ；トーソー）に添加し
て、ｈＢＮドメインを溶出する。
【００４７】実施例８ 組み換えｈＢＮドメインのリガ
ンドとの結合活性 ｈＢＮの生理活性は実施例３と同様、リガンドであるＧ
−ＣＳＦとの結合能を指標として測定した。ｈＢＮと
125Ｉで放射能標識したＧ−ＣＳＦの複合体を形成させ
る。形成された複合体に架橋剤を添加して固定した後、
ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開
し、ゲル上でバンドとして分離する。バンドの観察は、
ゲルをイメージングプレートで顕出することにより行
う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識Ｇ−Ｃ
ＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそれと
競争させることにより、ｈＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体の
解離定数を測定することが出来る。実施例６で調製した
０.５ｍＭのｈＢＮドメイン、１.２ｎＭ125Ｉ−ヒトＧ
−ＣＳＦ（100,000 cpm, アムシャム社）およびさまざ
まの濃度に希釈した非標識ヒトＧ−ＣＳＦ（１０-5−１
０-10Ｍ；キリンビール株式会社より供与）の混合物を
０.００５％ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.０）中、最終容量５０mlとして室温で９０分間イ
ンキュベートする。次いで、０.５μlの０.１Ｍジチオ
ビスサクシニミジルプロピオーネ（ピアＳケミカル社）
を加え、０℃で３０分間インキュベートする。５μlの
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）を加えて反応を停
止する。続いて、反応混合物をＳＤＳを含む１５％ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動する。泳動後、ゲルをイ
メージングプレート（アナライズ用、タイプＢＡ；
（株）富士写真フィルム）で解析すると、生成したｈＢ
ＮとＧ−ＣＳＦの複合体は、ゲル上で３０キロダルトン
のバンドとして顕出した。この複合体の解離定数は、非
標識Ｇ−ＣＳＦを加えた実験との比較より約１００ｎＭ
と測定された（図８）。この結果は福永ら（ＥＭＢＯ
Ｊ.，１０, ２８５５−２８６５ (１９９１) ）が、相
補ＤＮＡのＣＲＨ領域のＣ末端ドメインのみを欠失させ
た変異体を用いた結果とよく対応している。
ンドとの結合活性 ｈＢＮの生理活性は実施例３と同様、リガンドであるＧ
−ＣＳＦとの結合能を指標として測定した。ｈＢＮと
125Ｉで放射能標識したＧ−ＣＳＦの複合体を形成させ
る。形成された複合体に架橋剤を添加して固定した後、
ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開
し、ゲル上でバンドとして分離する。バンドの観察は、
ゲルをイメージングプレートで顕出することにより行
う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識Ｇ−Ｃ
ＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそれと
競争させることにより、ｈＢＮとＧ−ＣＳＦの複合体の
解離定数を測定することが出来る。実施例６で調製した
０.５ｍＭのｈＢＮドメイン、１.２ｎＭ125Ｉ−ヒトＧ
−ＣＳＦ（100,000 cpm, アムシャム社）およびさまざ
まの濃度に希釈した非標識ヒトＧ−ＣＳＦ（１０-5−１
０-10Ｍ；キリンビール株式会社より供与）の混合物を
０.００５％ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.０）中、最終容量５０mlとして室温で９０分間イ
ンキュベートする。次いで、０.５μlの０.１Ｍジチオ
ビスサクシニミジルプロピオーネ（ピアＳケミカル社）
を加え、０℃で３０分間インキュベートする。５μlの
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）を加えて反応を停
止する。続いて、反応混合物をＳＤＳを含む１５％ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動する。泳動後、ゲルをイ
メージングプレート（アナライズ用、タイプＢＡ；
（株）富士写真フィルム）で解析すると、生成したｈＢ
ＮとＧ−ＣＳＦの複合体は、ゲル上で３０キロダルトン
のバンドとして顕出した。この複合体の解離定数は、非
標識Ｇ−ＣＳＦを加えた実験との比較より約１００ｎＭ
と測定された（図８）。この結果は福永ら（ＥＭＢＯ
Ｊ.，１０, ２８５５−２８６５ (１９９１) ）が、相
補ＤＮＡのＣＲＨ領域のＣ末端ドメインのみを欠失させ
た変異体を用いた結果とよく対応している。
【００４８】即ち、福永らは上記相補ＤＮＡの変異体に
関して、解離定数約１０ｎＭを報告している。この変異
体は イムノグロブリン様ドメインを含んでいるが、こ
のイムノグロブリン様ドメインのみを欠失させた場合、
結合活性は天然のものの約１／１０−１／２０に低下す
ることが知られている（解離定数は増大）。従ってＢＮ
ドメインのみの場合には、さらに上記相補ＤＮＡの変異
体の解離定数１０ｎＭから増大すると予測される。従っ
て本実施例で得た１００ｎＭはこの予測とよく対応して
いる。即ち、本発明で得たｈＢＮドメインは天然と同様
なフォールディングをしていることが強く示唆される。
関して、解離定数約１０ｎＭを報告している。この変異
体は イムノグロブリン様ドメインを含んでいるが、こ
のイムノグロブリン様ドメインのみを欠失させた場合、
結合活性は天然のものの約１／１０−１／２０に低下す
ることが知られている（解離定数は増大）。従ってＢＮ
ドメインのみの場合には、さらに上記相補ＤＮＡの変異
体の解離定数１０ｎＭから増大すると予測される。従っ
て本実施例で得た１００ｎＭはこの予測とよく対応して
いる。即ち、本発明で得たｈＢＮドメインは天然と同様
なフォールディングをしていることが強く示唆される。
【００４９】実施例９ 変異ｈＢＮドメインＣ６９Ｓを
コードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクターｐＭ
ＡＬｐ−ｈＢＮ-Ｃ６９Ｓの構築 変異ｈＢＮドメインＣ６９ＳをコードするＤＮＡを製造
するためにＰＣＲを使った。具体的には配列番号６およ
び配列番号１５のＤＮＡ断片をそれぞれＮ末端およびＣ
末端プライマーとしてアプライドバイオシステム社の３
８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製した。これらをプラ
イマーとし、実施例６で調製したpＭＡＬｐ−ｈＢＮ Ｄ
ＮＡをテンペレートに用いて、ＰＣＲ法により、Ｎ末端
側部分をコードするＤＮＡを製造した。即ち２μＭのＮ
末端プライマー、２μＭのＣ末端プライマー、ｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮ ＤＮＡ（１ｎｇ）、１０Ｘ反応緩衝液１０
μｌ、各０.２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０.５μl
を加えて最終液量を１００μlとする。ここで１０Ｘ反
応緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶
液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡｍｐ
のキットのものを使用した。これをＤＮＡサーマルサイ
クラー（型式ＰＪ２０００、宝酒造）にセットし、９４
℃、３０秒間熱処理；５０℃、３０秒間アニーリング；
７２℃、１.５分間反応のサイクルプログラムで２０回
反応を繰り返すことにより合成する。またＣ末端側部分
をコードするＤＮＡを製造するために、配列番号１６お
よび配列番号１７で示されるＤＮＡ断片をプライマーと
して同様に合成した。合成したＰＣＲ産物はそれぞれ１
％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.１５kbpのバ
ンドを切り出し、スプレック０１（宝酒造）に入れ、−
８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュ
ベートすることにより融解する。これを５０００回転で
１０分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処
理およびエタノール沈殿で精製、回収する。続いて回収
したＤＮＡ断片（それぞれ１ｎｇ）を混合してテンペレ
ートとし、配列番号６と配列番号１７の合成ＤＮＡをＮ
末端Ｃ末端プライマー（それぞれ２μＭ）として加え、
１０Ｘ反応緩衝液１０μｌ、各０.２５ｍＭのｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５μlを加えて最終液量を１００μlと
してＰＣＲ反応を行い、ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓをコードする
ＤＮＡ全体を製造した。反応は９４℃、３０秒間熱処
理；３７℃、３０秒間アニーリング；７２℃、1分間反
応のサイクルプログラムで２０回を繰り返し行う。
コードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクターｐＭ
ＡＬｐ−ｈＢＮ-Ｃ６９Ｓの構築 変異ｈＢＮドメインＣ６９ＳをコードするＤＮＡを製造
するためにＰＣＲを使った。具体的には配列番号６およ
び配列番号１５のＤＮＡ断片をそれぞれＮ末端およびＣ
末端プライマーとしてアプライドバイオシステム社の３
８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製した。これらをプラ
イマーとし、実施例６で調製したpＭＡＬｐ−ｈＢＮ Ｄ
ＮＡをテンペレートに用いて、ＰＣＲ法により、Ｎ末端
側部分をコードするＤＮＡを製造した。即ち２μＭのＮ
末端プライマー、２μＭのＣ末端プライマー、ｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮ ＤＮＡ（１ｎｇ）、１０Ｘ反応緩衝液１０
μｌ、各０.２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０.５μl
を加えて最終液量を１００μlとする。ここで１０Ｘ反
応緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶
液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡｍｐ
のキットのものを使用した。これをＤＮＡサーマルサイ
クラー（型式ＰＪ２０００、宝酒造）にセットし、９４
℃、３０秒間熱処理；５０℃、３０秒間アニーリング；
７２℃、１.５分間反応のサイクルプログラムで２０回
反応を繰り返すことにより合成する。またＣ末端側部分
をコードするＤＮＡを製造するために、配列番号１６お
よび配列番号１７で示されるＤＮＡ断片をプライマーと
して同様に合成した。合成したＰＣＲ産物はそれぞれ１
％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.１５kbpのバ
ンドを切り出し、スプレック０１（宝酒造）に入れ、−
８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュ
ベートすることにより融解する。これを５０００回転で
１０分間遠心して、その濾液を回収する。フェノール処
理およびエタノール沈殿で精製、回収する。続いて回収
したＤＮＡ断片（それぞれ１ｎｇ）を混合してテンペレ
ートとし、配列番号６と配列番号１７の合成ＤＮＡをＮ
末端Ｃ末端プライマー（それぞれ２μＭ）として加え、
１０Ｘ反応緩衝液１０μｌ、各０.２５ｍＭのｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ溶液、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ０.５μlを加えて最終液量を１００μlと
してＰＣＲ反応を行い、ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓをコードする
ＤＮＡ全体を製造した。反応は９４℃、３０秒間熱処
理；３７℃、３０秒間アニーリング；７２℃、1分間反
応のサイクルプログラムで２０回を繰り返し行う。
【００５０】さらに、上記ＰＣＲ産物をフェノール処理
することで精製する。この精製ＤＮＡのうち、約１０ｎ
ｇをそれぞれ５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造）お
よびＸｂａＩ（宝酒造）とともに０.１ Ｍ食塩および１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）５０ml 中で３７℃で１時間インキュベー
トしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処理
およびエタノール沈殿した後、１％アガロースゲル電気
泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出し、スプレッ
ク０１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結した
後、３７℃で５分間インキュベートすることにより融解
する。これを５０００回転で１０分間遠心して、その濾
液を回収する。フェノール処理およびエタノール沈殿で
目的とするｈＢＮ−Ｃ６９ＳをコードするＤＮＡを取り
出す。続いて、上記ＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬTMｐ（ニュ
ーイングランドバイオラボ社から購入可能）の下流の制
限プロテアーゼファクターＸａの認識配列 Ile-Glu-Gly
-Arg末端に存在するＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間に実
施例６と同様に挿入する（図９）。
することで精製する。この精製ＤＮＡのうち、約１０ｎ
ｇをそれぞれ５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造）お
よびＸｂａＩ（宝酒造）とともに０.１ Ｍ食塩および１
０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）５０ml 中で３７℃で１時間インキュベー
トしてＤＮＡを消化する。この消化液をフェノール処理
およびエタノール沈殿した後、１％アガロースゲル電気
泳動にかけ、約０.３kbpのバンドを切り出し、スプレッ
ク０１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結した
後、３７℃で５分間インキュベートすることにより融解
する。これを５０００回転で１０分間遠心して、その濾
液を回収する。フェノール処理およびエタノール沈殿で
目的とするｈＢＮ−Ｃ６９ＳをコードするＤＮＡを取り
出す。続いて、上記ＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬTMｐ（ニュ
ーイングランドバイオラボ社から購入可能）の下流の制
限プロテアーゼファクターＸａの認識配列 Ile-Glu-Gly
-Arg末端に存在するＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間に実
施例６と同様に挿入する（図９）。
【００５１】具体的には、約１μｇのｐＭＡＬTMｐ Ｄ
ＮＡを５０ｍＭ食塩および１０ｍＭ塩化マグネシウムを
含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）５０μｌに
溶解し、さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩとＸ
baＩを加えて、３７℃で１時間インキュベートしてＤＮ
Ａを消化する。次にこれを１％アガロースゲルの電気泳
動にかけ、大きい方のバンドを切り出し、スプレック０
１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、
３７℃で５分間インキュベートし、融解する。これを５
０００回転で１０分間遠心し、その濾液を回収する。フ
ェノール処理およびエタノール沈殿で目的とするＤＮＡ
を取り出す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混
合し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.４）を加えて４μlとする。これを１６μｌの
Ａ液（ＤＮＡライゲーションキット；宝酒造）および４
μｌのＢ液（ＤＮＡライゲーションキット；宝酒造）と
混合し、１６℃で３０分間反応させる。さらに、これを
１００μｌの大腸菌Ｋ１２株コンピテントセルと混合
し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間インキュベ
ーションすることで大腸菌へ移入し、発現プラスミッド
ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを構築した。このプラス
ミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ
−Ｃ６９Ｓは通産省工技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。（受託日：平成６年 ５月 ２３日；寄
託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ １４３２０）。
ＮＡを５０ｍＭ食塩および１０ｍＭ塩化マグネシウムを
含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）５０μｌに
溶解し、さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩとＸ
baＩを加えて、３７℃で１時間インキュベートしてＤＮ
Ａを消化する。次にこれを１％アガロースゲルの電気泳
動にかけ、大きい方のバンドを切り出し、スプレック０
１（宝酒造）に入れ、−８０℃で１５分間凍結した後、
３７℃で５分間インキュベートし、融解する。これを５
０００回転で１０分間遠心し、その濾液を回収する。フ
ェノール処理およびエタノール沈殿で目的とするＤＮＡ
を取り出す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混
合し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.４）を加えて４μlとする。これを１６μｌの
Ａ液（ＤＮＡライゲーションキット；宝酒造）および４
μｌのＢ液（ＤＮＡライゲーションキット；宝酒造）と
混合し、１６℃で３０分間反応させる。さらに、これを
１００μｌの大腸菌Ｋ１２株コンピテントセルと混合
し、０℃で３０分間、さらに４２℃で２分間インキュベ
ーションすることで大腸菌へ移入し、発現プラスミッド
ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを構築した。このプラス
ミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／ｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ
−Ｃ６９Ｓは通産省工技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。（受託日：平成６年 ５月 ２３日；寄
託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ １４３２０）。
【００５２】実施例１０ プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｈ
ＢＮ−Ｃ６９Ｓで形質転換された大腸菌によるｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓの製造およびその活性 実施例７と同様に形質転換体を培養し、そのペリプラス
ム画分から、目的のｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを得た。これは天
然型のｈＢＮより発現量が高く、１リットルの培養でお
よそ０.８mg以上と考えられる。次いで実施例８と同様
に活性を測定すると上記の天然型のｈＢＮと変わらない
活性を示した（図１０）。この結果はｈＢＮ−Ｃ６９Ｓ
ドメインが天然のヒトＧ−ＣＳＦ受容体におけるｈＢＮ
と同様のフォールディングをし、かつリガンド結合能力
を有していることを強く示唆している。
ＢＮ−Ｃ６９Ｓで形質転換された大腸菌によるｐＭＡＬ
ｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓの製造およびその活性 実施例７と同様に形質転換体を培養し、そのペリプラス
ム画分から、目的のｈＢＮ−Ｃ６９Ｓを得た。これは天
然型のｈＢＮより発現量が高く、１リットルの培養でお
よそ０.８mg以上と考えられる。次いで実施例８と同様
に活性を測定すると上記の天然型のｈＢＮと変わらない
活性を示した（図１０）。この結果はｈＢＮ−Ｃ６９Ｓ
ドメインが天然のヒトＧ−ＣＳＦ受容体におけるｈＢＮ
と同様のフォールディングをし、かつリガンド結合能力
を有していることを強く示唆している。
【００５３】
【発明の効果】本発明は、大腸菌を宿主とする遺伝子組
換え法によって本発明のリガンド結合領域蛋白質、即
ち、mＢＮドメインまたはｈＢＮドメインを発現させ、
該宿主からmＢＮドメインまたはｈＢＮドメインを抽出
・精製する方法を確立したものである。こうして得たm
ＢＮドメインまたはｈＢＮドメインはリガンドであるＧ
−ＣＳＦへの結合能を保持しており、Ｇ−ＣＳＦ受容体
とリガンドとの相互作用に関連する疾患の研究や治療に
有用である。臨床面では、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に
対する拮抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異
常、例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治
療または予防に有用である。本発明のＢＮドメインは、
約１００アミノ酸からなる小分子量蛋白質であるため
に、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能性が低
く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と結合さ
せる等、応用範囲が広い上、Ｘ線やＮＭＲによる高次構
造の解析にも有利であるという特徴を有する。また、本
発明のＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質は、ペプチドラ
イブラリーなどを用いてのペプチド性のＧ−ＣＳＦのア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング、非ペ
プチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニングを可能にし、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳ
Ｆ受容体の結合の研究（その立体構造の解析など）を飛
躍的に発展させ、Ｇ−ＣＳＦのアゴニスト、アンタゴニ
スト等の医薬の開発研究、製造に有用である。現在、Ｇ
−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆
粒球の機能亢進作用に基き、放射線治療や抗ガン剤治療
を受けたガン患者での白血球減少を回復するための治療
剤として有用性が期待されているが、上記のＧ−ＣＳＦ
アゴニストまたはアンタゴニストは、それら白血球減少
患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦと同等またはそれ以上
の効果を発揮し得ると予想される。
換え法によって本発明のリガンド結合領域蛋白質、即
ち、mＢＮドメインまたはｈＢＮドメインを発現させ、
該宿主からmＢＮドメインまたはｈＢＮドメインを抽出
・精製する方法を確立したものである。こうして得たm
ＢＮドメインまたはｈＢＮドメインはリガンドであるＧ
−ＣＳＦへの結合能を保持しており、Ｇ−ＣＳＦ受容体
とリガンドとの相互作用に関連する疾患の研究や治療に
有用である。臨床面では、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に
対する拮抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異
常、例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治
療または予防に有用である。本発明のＢＮドメインは、
約１００アミノ酸からなる小分子量蛋白質であるため
に、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能性が低
く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と結合さ
せる等、応用範囲が広い上、Ｘ線やＮＭＲによる高次構
造の解析にも有利であるという特徴を有する。また、本
発明のＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質は、ペプチドラ
イブラリーなどを用いてのペプチド性のＧ−ＣＳＦのア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング、非ペ
プチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニングを可能にし、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳ
Ｆ受容体の結合の研究（その立体構造の解析など）を飛
躍的に発展させ、Ｇ−ＣＳＦのアゴニスト、アンタゴニ
スト等の医薬の開発研究、製造に有用である。現在、Ｇ
−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆
粒球の機能亢進作用に基き、放射線治療や抗ガン剤治療
を受けたガン患者での白血球減少を回復するための治療
剤として有用性が期待されているが、上記のＧ−ＣＳＦ
アゴニストまたはアンタゴニストは、それら白血球減少
患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦと同等またはそれ以上
の効果を発揮し得ると予想される。
【００５４】
【００５５】配列番号：１ 配列の長さ：６３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Mouse 細胞の種類：ＮＦＳ−６０ 配列 TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC CTC ACC 48 Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr 1 5 10 15 ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC CAC CTG 96 Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 20 25 30 CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC TGT CAG 144 Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln 35 40 45 TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG CAG AAC 192 Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn 50 55 60 AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA AAC TTG CTC CTG TAC CAG TAT ATG GCC 240 Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala 65 70 75 80 ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC CCA AAG 288 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys 85 90 95 CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT GTT GTG AAA TTG GAG CCT CCC ATG CTG 336 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 100 105 110 CAG GCC CTG GAC ATT GGC CCT GAT GTA GTC TCT CAC CAG CCT GGC TGC 384 Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys 115 120 125 CTG TGG CTG AGC TGG AAG CCA TGG AAG CCC AGT GAG TAC ATG GAA CAG 432 Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln 130 135 140 GAG TGT GAA CTT CGC TAC CAG CCA CAG CTC AAA GGA GCC AAC TGG ACT 480 Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr 145 150 155 160 CTG GTG TTC CAC CTG CCT TCC AGC AAG GAC CAG TTT GAG CTC TGC GGG 528 Leu Val Phe His Leu Pro Ser Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly 165 170 175 CTC CAT CAG GCC CCA GTC TAC ACC CTA CAG ATG CGA TGC ATT CGC TCA 576 Leu His Gln Ala Pro Val Tyr Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser 180 185 190 TCT CTG CCT GGA TTC TGG AGC CCC TGG AGC CCC GGC CTG CAG CTG AGG 624 Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg 195 200 205 CCT ACC ATG AAG GCC 639 Pro Thr Met Lys Ala 210 213
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：６３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：Homo sapiens (ヒト) 組織の種類：胎盤またはＵ９３７ 配列 TAC CCT CCA GCC ATA CCC CAC AAC CTC TCC TGC CTC ATG AAC CTC ACA 48 Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr 1 5 10 15 ACC AGC AGC CTC ATC TGC CAG TGG GAG CCA GGA CCT GAG ACC CAC CTA 96 Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 20 25 30 CCC ACC AGC TTC ACT CTG AAG AGT TTC AAG AGC CGG GGC AAC TGT CAG 144 Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln 35 40 45 ACC CAA GGG GAC TCC ATC CTG GAC TGC GTG CCC AAG GAC GGG CAG AGC 192 Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser 50 55 60 CAC TGC TGC ATC CCA CGC AAA CAC CTG CTG TTG TAC CAG AAT ATG GGC 240 His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly 65 70 75 80 ATC TGG GTG CAG GCA GAG AAT GCG CTG GGG ACC AGC ATG TCC CCA CAA 288 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln 85 90 95 CTG TGT CTT GAT CCC ATG GAT GTT GTG AAA CTG GAG CCC CCC ATG CTG 336 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 100 105 110 CGG ACC ATG GAC CCC AGC CCT GAA GCG GCC CCT CCC CAG GCA GGC TGC 384 Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys 115 120 125 CTA CAG CTG TGC TGG GAG CCA TGG CAG CCA GGC CTG CAC ATA AAT CAG 432 Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln 130 135 140 AAG TGT GAG CTG CGC CAC AAG CCG CAG CGT GGA GAA GCC AGC TGG GCA 480 Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala 145 150 155 160 CTG GTG GGC CCC CTC CCC TTG GAG GCC CTT CAG TAT GAG CTC TGC GGG 528 Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly 165 170 175 CTC CTC CCA GCC ACG GCC TAC ACC CTG CAG ATA CGC TGC ATC CGC TGG 576 Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp 180 185 190 CCC CTG CCT GGC CAC TGG AGC GAC TGG AGC CCC AGC CTG GAG CTG AGA 624 Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg 195 200 205 ACT ACC GAA CGG GCC 639 Thr Thr Glu Arg Ala 210 213
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ GGT TCT TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC 48 Gly Ser Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His 1 5 10 15 CTC ACC ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC 96 Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr 20 25 30 CAC CTG CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC 144 His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp 35 40 45 TGT CAG TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG 192 Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg 50 55 60 CAG AAC AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA AAC TTG CTC CTG TAC CAG TAT 240 Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr 65 70 75 80 ATG GCC ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC 288 Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser 85 90 95 CCA AAG CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT GTT GTG AAA TAA 327 Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys 100 105 108
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＴＴＣＴＴＡＴＣ ＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＣＣＣＣＴＣＡ
２７
２７
【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴ ＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣ ＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧ ＴＣＧ
ＡＧ ３５
ＡＧ ３５
【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGCCGCCAGC GGTCGTCAGA CTGTCG 26
【００６１】配列番号：７ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGGCCATAT ACTGGTACGC GAGCAAGTTT TTTCGGGGGA T 41
【００６２】配列番号：８ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGGCCATAT ACTGGGCCAG GAGCAAGTTT TTTCGGGG 38
【００６３】配列番号：９ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 配列の特徴：２２９−２３１：mutation 配列 GGT TCT TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC 48 Gly Ser Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His 1 5 10 15 CTC ACC ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC 96 Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr 20 25 30 CAC CTG CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC 144 His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp 35 40 45 TGT CAG TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG 192 Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg 50 55 60 CAG AAC AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA AAC TTG CTC GCG TAC CAG TAT 240 Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Ala Tyr Gln Tyr 65 70 75 80 ATG GCC ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC 288 Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser 85 90 95 CCA AAG CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT GTT GTG AAA TAA 327 Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys 100 105 108
【００６４】配列番号：１０ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 配列の特徴：２３２−２３４：mutation 配列 GGT TCT TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC 48 Gly Ser Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His 1 5 10 15 CTC ACC ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC 96 Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr 20 25 30 CAC CTG CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC 144 His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp 35 40 45 TGT CAG TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG 192 Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg 50 55 60 CAG AAC AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA AAC TTG CTC CTG GCC CAG TAT 240 Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Leu Ala Gln Tyr 65 70 75 80 ATG GCC ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC 288 Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser 85 90 95 CCA AAG CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT GTT GTG AAA TAA 327 Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys 100 105 108
【００６５】配列番号：１１ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 配列 GGT TCT TAC CCT CCA GCC ATA CCC CAC AAC CTC TCC TGC CTC ATG AAC 48 Gly Ser Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn 1 5 10 15 CTC ACA ACC AGC AGC CTC ATC TGC CAG TGG GAG CCA GGA CCT GAG ACC 96 Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr 20 25 30 CAC CTA CCC ACC AGC TTC ACT CTG AAG AGT TTC AAG AGC CGG GGC AAC 144 His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn 35 40 45 TGT CAG ACC CAA GGG GAC TCC ATC CTG GAC TGC GTG CCC AAG GAC GGG 192 Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly 50 55 60 CAG AGC CAC TGC TGC ATC CCA CGC AAA CAC CTG CTG TTG TAC CAG AAT 240 Gln Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn 65 70 75 80 ATG GGC ATC TGG GTG CAG GCA GAG AAT GCG CTG GGG ACC AGC ATG TCC 288 Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser 85 90 95 CCA CAA CTG TGT CTT GAT CCC ATG GAT GTT GTG AAA TAA 327 Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys 100 105 108
【００６６】配列番号：１２ 配列の長さ：３２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 配列の特徴：２０５−２０７：mutation 配列 GGT TCT TAC CCT CCA GCC ATA CCC CAC AAC CTC TCC TGC CTC ATG AAC 48 Gly Ser Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn 1 5 10 15 CTC ACA ACC AGC AGC CTC ATC TGC CAG TGG GAG CCA GGA CCT GAG ACC 96 Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr 20 25 30 CAC CTA CCC ACC AGC TTC ACT CTG AAG AGT TTC AAG AGC CGG GGC AAC 144 His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn 35 40 45 TGT CAG ACC CAA GGG GAC TCC ATC CTG GAC TGC GTG CCC AAG GAC GGG 192 Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly 50 55 60 CAG AGC CAC TGC TCC ATC CCA CGC AAA CAC CTG CTG TTG TAC CAG AAT 240 Gln Ser His Cys Ser Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn 65 70 75 80 ATG GGC ATC TGG GTG CAG GCA GAG AAT GCG CTG GGG ACC AGC ATG TCC 288 Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser 85 90 95 CCA CAA CTG TGT CTT GAT CCC ATG GAT GTT GTG AAA TAA 327 Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys 100 105 108
【００６７】配列番号：１３ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGGATCCAT CGAGGGTAGG GGTTCTTACC CTCCAGCCAT ACCCCACA 48
【００６８】配列番号：１４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴ ＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡ ＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧ ＡＴＣ
ＡＡＧ ３６
ＡＡＧ ３６
【００６９】配列番号：１５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＣＧＴＧＧＧＡＴ ＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧ ＣＴＣＴＧＣＣＣＧＴ
３０
３０
【００７０】配列番号：１６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTCCATCCC ACGCAAACAC CT 22
【００７１】配列番号：１７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＣＣＧＡＧＧＴＴ ＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡ ＣＧＡＣ
２４
２４
【図１】 マウス由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結
合領域蛋白質の大腸菌での発現のための発現ベクターｐ
ＭＡＬｐ−ｍＢＮの構築模式図である。
合領域蛋白質の大腸菌での発現のための発現ベクターｐ
ＭＡＬｐ−ｍＢＮの構築模式図である。
【図２】 培養した形質転換体、大腸菌Ｋ１２株／ｐＭ
ＡＬｐ−ｍＢＮのペリプラズムに発現されたｍＢＮ−Ｍ
ＢＰ融合蛋白質のＱ−セファロースによる溶出パターン
の模写図である。
ＡＬｐ−ｍＢＮのペリプラズムに発現されたｍＢＮ−Ｍ
ＢＰ融合蛋白質のＱ−セファロースによる溶出パターン
の模写図である。
【図３】 形質転換体により発現されたｍＢＮドメイン
蛋白質のＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷ ＨＰＬＣによる
溶出パターンの模写図である。
蛋白質のＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷ ＨＰＬＣによる
溶出パターンの模写図である。
【図４】 組換え法で製造したｍＢＮとＧ−ＣＳＦとの
解離定数の測定のためのグラフである。
解離定数の測定のためのグラフである。
【図５】 マウス由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結
合領域蛋白質の誘導体の大腸菌での発現のための発現ベ
クターｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７ＡおよびｐＭＡＬｐ
−ｍＢＮ−Ｙ７８Ａの構築模式図である。
合領域蛋白質の誘導体の大腸菌での発現のための発現ベ
クターｐＭＡＬｐ−ｍＢＮ−Ｌ７７ＡおよびｐＭＡＬｐ
−ｍＢＮ−Ｙ７８Ａの構築模式図である。
【図６】 組換え法で製造したｍＢＮ−Ｌ７７Ａおよび
ｍＢＮ−Ｙ７８ＡとＧ−ＣＳＦとの解離定数の測定のた
めのグラフである。
ｍＢＮ−Ｙ７８ＡとＧ−ＣＳＦとの解離定数の測定のた
めのグラフである。
【図７】 ヒト由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合
領域蛋白質の大腸菌での発現のための発現ベクターｐＭ
ＡＬｐ−ｈＢＮの構築模式図である。
領域蛋白質の大腸菌での発現のための発現ベクターｐＭ
ＡＬｐ−ｈＢＮの構築模式図である。
【図８】 組換え法で製造したｈＢＮとＧ−ＣＳＦとの
解離定数の測定のためのグラフである。
解離定数の測定のためのグラフである。
【図９】 ヒト由来のＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合
領域蛋白質の誘導体の大腸菌での発現のための発現ベク
ターｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓの構築模式図であ
る。
領域蛋白質の誘導体の大腸菌での発現のための発現ベク
ターｐＭＡＬｐ−ｈＢＮ−Ｃ６９Ｓの構築模式図であ
る。
【図１０】組換え法で製造したｈＢＮ−Ｃ６９ＳとＧ−
ＣＳＦとの解離定数の測定のためのグラフである。
ＣＳＦとの解離定数の測定のためのグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号３または１１で示されるアミノ
酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、または配列
番号３または１１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ
酸の欠失、置換若しくは付加による変異体蛋白質であっ
て顆粒球コロニー刺激因子との結合活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 変異体蛋白質が、配列番号９、１０また
は１２で示されるアミノ酸配列を有するものである請求
項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡを大腸菌
遺伝子発現系の制御下に含有している組換え体プラスミ
ッド。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のＤＮＡを大腸菌
マルトース結合蛋白質をコードするＤＮＡの下流に含有
し、大腸菌に顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド
結合領域蛋白質と大腸菌マルトース結合蛋白質との融合
蛋白質を発現させ得る請求項３記載の組換え体プラスミ
ッド。 - 【請求項５】 請求項３または４記載のプラスミッドで
形質転換された大腸菌。 - 【請求項６】 請求項５記載の大腸菌を培養し、該大腸
菌内に蓄積された組換え生成物を回収することからなる
顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白
質の製造方法。 - 【請求項７】 請求項６記載の方法で製造された、顆粒
球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6116252A JP2839837B2 (ja) | 1993-12-21 | 1994-05-30 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-321862 | 1993-12-21 | ||
| JP32186293 | 1993-12-21 | ||
| JP6116252A JP2839837B2 (ja) | 1993-12-21 | 1994-05-30 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227288A JPH07227288A (ja) | 1995-08-29 |
| JP2839837B2 true JP2839837B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=26454626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6116252A Expired - Fee Related JP2839837B2 (ja) | 1993-12-21 | 1994-05-30 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2839837B2 (ja) |
-
1994
- 1994-05-30 JP JP6116252A patent/JP2839837B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07227288A (ja) | 1995-08-29 |
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