JP2829397B2 - フィブリン結合活性ポリペプチド - Google Patents
フィブリン結合活性ポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチン酸のフィブリン結合活性
ポリペプチドに関し、更に詳しくはヒトフィブロネクチ
ンのＣ末端側フィブリン結合ドメインポリペプチドを含
有するフィブリン結合活性ポリペプチド、並びにそれら
をコードする核酸、及びそのDNAを用いた遺伝子工学的
な製造方法に関する。
ポリペプチドに関し、更に詳しくはヒトフィブロネクチ
ンのＣ末端側フィブリン結合ドメインポリペプチドを含
有するフィブリン結合活性ポリペプチド、並びにそれら
をコードする核酸、及びそのDNAを用いた遺伝子工学的
な製造方法に関する。
フィブロネクチン（以下FNと表示する）は血漿や細胞
外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機能
を持つことが知られている〔アニュアル レビュー オ
ブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochemis
try）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFNを
創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試みが
なされているが、血液から採取するために供給に制限が
あること、コスト高であること、また、病原性の細菌や
ウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機能
を持つことが知られている〔アニュアル レビュー オ
ブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochemis
try）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFNを
創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試みが
なされているが、血液から採取するために供給に制限が
あること、コスト高であること、また、病原性の細菌や
ウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
FNにはフィブリンに結合する領域（フィブリン結合ド
メイン）が２か所存在し、一方の領域はアミノ（Ｎ）末
端にあり、もう一方の領域はカルボキシ（Ｃ）末端にあ
る。フィブリン結合ドメインポリペプチドは、血小板と
フィブリンの結合を阻止することによる血液凝固阻止剤
としての用途が考えられる。また、最近の知見から、FN
のＣ末端側フィブリン結合ドメインがインシュリン結合
活性を有することが明らかにされ（第46回日本癌学会総
会記事、第181頁）、ドラッグデリバリーシステムとし
ての用途も考えられる。
メイン）が２か所存在し、一方の領域はアミノ（Ｎ）末
端にあり、もう一方の領域はカルボキシ（Ｃ）末端にあ
る。フィブリン結合ドメインポリペプチドは、血小板と
フィブリンの結合を阻止することによる血液凝固阻止剤
としての用途が考えられる。また、最近の知見から、FN
のＣ末端側フィブリン結合ドメインがインシュリン結合
活性を有することが明らかにされ（第46回日本癌学会総
会記事、第181頁）、ドラッグデリバリーシステムとし
ての用途も考えられる。
本発明の目的は、FNのフィブリン結合活性を有するフ
ィブリン結合活性ポリペプチド、及びその有利な製造方
法を提供することにある。
ィブリン結合活性ポリペプチド、及びその有利な製造方
法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はフィブリ
ン結合活性ポリペプチドに関する発明であって、下記一
般式I: （Ｗ）ｌ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ ‥‥〔Ｉ〕 〔式中、Ｗはメチオニン残基（Met）を示し、またＸは
アラニン残基（Ala）を示し、Ｙはヒトフィブロネクチ
ンのポリペプチド残基で、Asn2133−Ser2143に相当する
11アミノ酸ポリペプチド残基を示し、下記式II: で表される配列を有し、ＺはヒトフィブロネクチンのＣ
末端側フィブリン結合ドメインのCys2144−Gly2275に相
当する132アミノ酸ポリペプチド残基を表し、下記式II
I: で表される配列を有し、ｌ、ｍ及びｎはそれぞれ１又は
零の数を示す〕で表されることを特徴とする。
ン結合活性ポリペプチドに関する発明であって、下記一
般式I: （Ｗ）ｌ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ ‥‥〔Ｉ〕 〔式中、Ｗはメチオニン残基（Met）を示し、またＸは
アラニン残基（Ala）を示し、Ｙはヒトフィブロネクチ
ンのポリペプチド残基で、Asn2133−Ser2143に相当する
11アミノ酸ポリペプチド残基を示し、下記式II: で表される配列を有し、ＺはヒトフィブロネクチンのＣ
末端側フィブリン結合ドメインのCys2144−Gly2275に相
当する132アミノ酸ポリペプチド残基を表し、下記式II
I: で表される配列を有し、ｌ、ｍ及びｎはそれぞれ１又は
零の数を示す〕で表されることを特徴とする。
本発明の第２の発明は、第１の発明のフィブリン結合
活性ポリペプチドをコードする核酸に関する。
活性ポリペプチドをコードする核酸に関する。
また、本発明の第３の発明は前記一般式Ｉで表される
フィブリン結合活性ポリペプチドをコードするDNAを含
有せしめた組換え体プラスミドに関し、第４の発明は前
記組換え体プラスミドを導入せしめた形質転換体に関
し、第５の発明は、前記形質転換体を培養し、該培養物
より前記一般式Ｉで表されるフィブリン結合活性ポリペ
プチドを採取することを特徴とするこれらポリペプチド
の製造方法に関する。
フィブリン結合活性ポリペプチドをコードするDNAを含
有せしめた組換え体プラスミドに関し、第４の発明は前
記組換え体プラスミドを導入せしめた形質転換体に関
し、第５の発明は、前記形質転換体を培養し、該培養物
より前記一般式Ｉで表されるフィブリン結合活性ポリペ
プチドを採取することを特徴とするこれらポリペプチド
の製造方法に関する。
Ｃ末端側フィブリン結合ドメインについてはトリプシ
ン、サーモライシン、プラスミン等によって分解されて
得られた断片が報告されており〔フィブロネクチン、D.
F.モシャー（D.F.Mosher）編、アカデミック プレス
インク社刊、第73頁（1988）〕、その大きさは20kDから
34kDに及んでいる。このドメインの詳しい特定はなされ
ていないが、一般的には約44アミノ酸からなるＩ型類似
配列を３個と、その前後にそれらとは相同性の無い隣接
配列とを含む断片が知られている。本発明者らは、ヒト
FNのフィブリン結合活性を有するポリペプチドの構築及
びその製造法について研究し、フィブリン結合活性及び
インシュリン結合活性はＣ末端側フィブリン結合ドメイ
ンに存在するＩ型類似配列部分（Cys2144−Gly2275、13
2アミノ酸残基）があれば十分であり、また、そのＩ型
類似配列部分の前後に隣接してそれぞれ存在しているペ
プチド配列の有無は、大腸菌菌体内での発現量に著しく
影響を及ぼすことを見出した。本発明は以上の知見に基
づいて達成された。なお、本明細書において、アミノ酸
に付された肩数字は、EMBLデータバンク（EMBL DATA BA
NK）中のFNのcDNA配列を翻訳して得られるアミノ酸配列
に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。以下、本
発明を具体的に説明する。
ン、サーモライシン、プラスミン等によって分解されて
得られた断片が報告されており〔フィブロネクチン、D.
F.モシャー（D.F.Mosher）編、アカデミック プレス
インク社刊、第73頁（1988）〕、その大きさは20kDから
34kDに及んでいる。このドメインの詳しい特定はなされ
ていないが、一般的には約44アミノ酸からなるＩ型類似
配列を３個と、その前後にそれらとは相同性の無い隣接
配列とを含む断片が知られている。本発明者らは、ヒト
FNのフィブリン結合活性を有するポリペプチドの構築及
びその製造法について研究し、フィブリン結合活性及び
インシュリン結合活性はＣ末端側フィブリン結合ドメイ
ンに存在するＩ型類似配列部分（Cys2144−Gly2275、13
2アミノ酸残基）があれば十分であり、また、そのＩ型
類似配列部分の前後に隣接してそれぞれ存在しているペ
プチド配列の有無は、大腸菌菌体内での発現量に著しく
影響を及ぼすことを見出した。本発明は以上の知見に基
づいて達成された。なお、本明細書において、アミノ酸
に付された肩数字は、EMBLデータバンク（EMBL DATA BA
NK）中のFNのcDNA配列を翻訳して得られるアミノ酸配列
に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。以下、本
発明を具体的に説明する。
ヒトFNのタンパク質の一次構造については、ジ エン
ボ ジャーナル（The ENBO Journal）、第４巻、第1755
〜1759頁（1985）に記載されている。また、Ｃ末端側フ
ィブリン結合ドメインをコードするDNA断片は、pLF5、p
LF3、pLF4及びpLF2のFNcDNA部分をつなぎ合せて構築さ
れたpLF2435〔バイオケミストリー（Biochemistry）、
第25巻、第4936〜4941頁（1986）〕から必要な断片を切
出すことによって調製することができる。pLF2435から
必要なcDNA断片を制限酵素で切出し、５′側に開始コド
ンを含む合成DNAを、また、３′側に終止コドンを含む
合成DNAをそれぞれDNAリガーゼで連結した後、適当な発
現ベクターに接続することにより、目的のポリペプチド
をコードするプラスミドを得ることができる（第１図及
び第２図参照）。すなわち、第１図は、前期式ＩのＷ−
Ｘ−Ｙ−ＺをコードするプラスミドpFD705を、第２図は
Ｗ−Ｘ−ＺをコードするプラスミドpFD905をそれぞれ構
築するための工程図である。
ボ ジャーナル（The ENBO Journal）、第４巻、第1755
〜1759頁（1985）に記載されている。また、Ｃ末端側フ
ィブリン結合ドメインをコードするDNA断片は、pLF5、p
LF3、pLF4及びpLF2のFNcDNA部分をつなぎ合せて構築さ
れたpLF2435〔バイオケミストリー（Biochemistry）、
第25巻、第4936〜4941頁（1986）〕から必要な断片を切
出すことによって調製することができる。pLF2435から
必要なcDNA断片を制限酵素で切出し、５′側に開始コド
ンを含む合成DNAを、また、３′側に終止コドンを含む
合成DNAをそれぞれDNAリガーゼで連結した後、適当な発
現ベクターに接続することにより、目的のポリペプチド
をコードするプラスミドを得ることができる（第１図及
び第２図参照）。すなわち、第１図は、前期式ＩのＷ−
Ｘ−Ｙ−ＺをコードするプラスミドpFD705を、第２図は
Ｗ−Ｘ−ＺをコードするプラスミドpFD905をそれぞれ構
築するための工程図である。
このようにして得られるプラスミドによって発現され
るポリペプチドのＮ末端には、cDNAの５′側とベクター
との連結部位に存在するNco Iリンカー又はNco Iサイト
を含む合成DNAに由来する、開始コドンのMet残基（前記
Ｉ式においてＷと表記）及びAla残基（前記Ｉ式におい
てＸは表記）が付加しているが、そのことは本発明の効
果を左右するものではない。しかし、必要に応じてこれ
らの付加配列を除去することができる。例えばMetにつ
いては、組換え体に含まれるメチオニンアミノペプチダ
ーゼ〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacter
iol.）第169巻、第751頁、（1987）〕が作用し易い条件
下に組換え体を培養することにより、あるいは部分精製
したポリペプチドに、メチオニンアミノペプチダーゼを
作用させることにより、Ｎ末端Metを除去することがで
きる。また、Alaは部位特異的変異の手法で除去するこ
とができる。
るポリペプチドのＮ末端には、cDNAの５′側とベクター
との連結部位に存在するNco Iリンカー又はNco Iサイト
を含む合成DNAに由来する、開始コドンのMet残基（前記
Ｉ式においてＷと表記）及びAla残基（前記Ｉ式におい
てＸは表記）が付加しているが、そのことは本発明の効
果を左右するものではない。しかし、必要に応じてこれ
らの付加配列を除去することができる。例えばMetにつ
いては、組換え体に含まれるメチオニンアミノペプチダ
ーゼ〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacter
iol.）第169巻、第751頁、（1987）〕が作用し易い条件
下に組換え体を培養することにより、あるいは部分精製
したポリペプチドに、メチオニンアミノペプチダーゼを
作用させることにより、Ｎ末端Metを除去することがで
きる。また、Alaは部位特異的変異の手法で除去するこ
とができる。
発現ベクターとしては、既存のものはすべて利用する
ことができるが、例えばpUC118N/pUC119N〔フェブス
レターズ（FEBS Letters）、第223巻、第174〜180頁（1
987）〕、及びその誘導体を用いることにより好結果を
得ることができる。これらのプラスミドを大腸菌に導入
し、適当な条件下に培養することにより、Ｃ末端側フィ
ブリン結合ドメインポリペプチドが大腸菌内に蓄積され
る。発現の確認にはイムノブロッティングが用いられ
る。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分離した後、
泳動パターンをニトロセルロース膜に移し取る。FNのＣ
末端側フィブリン結合ドメインを認識するモノクローナ
ル抗体（HFN−11F6、セロテック社）で検出されるバン
ドが目的のポリペプチドである。
ことができるが、例えばpUC118N/pUC119N〔フェブス
レターズ（FEBS Letters）、第223巻、第174〜180頁（1
987）〕、及びその誘導体を用いることにより好結果を
得ることができる。これらのプラスミドを大腸菌に導入
し、適当な条件下に培養することにより、Ｃ末端側フィ
ブリン結合ドメインポリペプチドが大腸菌内に蓄積され
る。発現の確認にはイムノブロッティングが用いられ
る。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分離した後、
泳動パターンをニトロセルロース膜に移し取る。FNのＣ
末端側フィブリン結合ドメインを認識するモノクローナ
ル抗体（HFN−11F6、セロテック社）で検出されるバン
ドが目的のポリペプチドである。
目的ポリペプチドは、大腸菌菌体内で不溶化し、いわ
ゆる封入体を形成する。このため、目的ポリペプチドの
精製は、例えば次のように行う。
ゆる封入体を形成する。このため、目的ポリペプチドの
精製は、例えば次のように行う。
組換え大腸菌をＬ−ブロスなどの培地に培養し、集菌
した後、超音波処理により菌体破砕液を得、これを遠心
分離して目的ポリペプチドを含む封入体の沈殿を減る。
この沈殿を種々の界面活性剤〔例えばトリトン（Trito
n）Ｘ−100等〕を含む緩衝液に懸濁、遠心分離を繰返す
ことにより、沈殿を洗浄する。この沈殿を尿素及びジチ
オスレイトールを含む緩衝液に溶解し、この溶解液につ
いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行う。次い
で、目的ポリペプチド画分を透析法等による方法でリフ
ォールディングする。以上の操作により、目的のポリペ
プチドを精製することができる。
した後、超音波処理により菌体破砕液を得、これを遠心
分離して目的ポリペプチドを含む封入体の沈殿を減る。
この沈殿を種々の界面活性剤〔例えばトリトン（Trito
n）Ｘ−100等〕を含む緩衝液に懸濁、遠心分離を繰返す
ことにより、沈殿を洗浄する。この沈殿を尿素及びジチ
オスレイトールを含む緩衝液に溶解し、この溶解液につ
いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行う。次い
で、目的ポリペプチド画分を透析法等による方法でリフ
ォールディングする。以上の操作により、目的のポリペ
プチドを精製することができる。
得られたポリペプチドは、フィブリン結合活性の測定
及びインシュリン結合活性の測定に用いられる。
及びインシュリン結合活性の測定に用いられる。
フィブリン結合活性については、ヒトフィブリンをAF
−トレシルトヨパール650（東ソー）などのアフィニテ
ィークロマトグラフィー用活性化担体に結合させること
により調製したフィブリン固定化カラムに、一定量の試
料を吸着させ、アルギニン溶液にて溶出し、本カラムを
素通りした試料量、及び本カラムから溶出された試料量
を比較することによりフィブリンへの結合能力を示すこ
とができる。
−トレシルトヨパール650（東ソー）などのアフィニテ
ィークロマトグラフィー用活性化担体に結合させること
により調製したフィブリン固定化カラムに、一定量の試
料を吸着させ、アルギニン溶液にて溶出し、本カラムを
素通りした試料量、及び本カラムから溶出された試料量
を比較することによりフィブリンへの結合能力を示すこ
とができる。
インシュリン結合活性は、イムノブロッティングの手
法に準拠して行うことができる。すなわち、試料をSDS
−PAGEで分離した後、ニトロセルロースフィルターに移
し取り、酵素標識したインシュリンを作用させる。フィ
ルター洗浄後、結合したインシュリンを酵素活性により
判定することができる。
法に準拠して行うことができる。すなわち、試料をSDS
−PAGEで分離した後、ニトロセルロースフィルターに移
し取り、酵素標識したインシュリンを作用させる。フィ
ルター洗浄後、結合したインシュリンを酵素活性により
判定することができる。
以上の測定により、得られたポリペプチドがフィブリ
ンやインシュリンに対しても強い親和性を示すことが証
明される。
ンやインシュリンに対しても強い親和性を示すことが証
明される。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ FNのＣ末端側フィブリン結合ドメインAsn2133−Gly
2275（143アミノ酸残基、以下Ｆ−143と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（第１図参照） （１−１）合成DNAアダプターの調製 Ｃ末端側フィブリン結合ドメインに存在するＩ型繰返
し配列及びその上流に隣接する11アミノ酸配列をベクタ
ーに接続するための３′側のアダプター（鎖長29mer及
び37mer、第１図参照）をアプライドバイオシステムズ
社のDNA合成機を用いて合成した。300pmolの鎖長29mer
のものの５′末端をリン酸化した後、鎖長37merのDNAを
等量加え、アニーリング操作により、２重鎖とした。
2275（143アミノ酸残基、以下Ｆ−143と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（第１図参照） （１−１）合成DNAアダプターの調製 Ｃ末端側フィブリン結合ドメインに存在するＩ型繰返
し配列及びその上流に隣接する11アミノ酸配列をベクタ
ーに接続するための３′側のアダプター（鎖長29mer及
び37mer、第１図参照）をアプライドバイオシステムズ
社のDNA合成機を用いて合成した。300pmolの鎖長29mer
のものの５′末端をリン酸化した後、鎖長37merのDNAを
等量加え、アニーリング操作により、２重鎖とした。
（１−２）Nco I〜Hind III断片の調製 FNのＦ−143をコードするcDNA断片を含む5.9kbのプラ
スミドpLF2435〔バイオケミストリー第25巻、第4936〜4
941頁（1986）〕100μｇをSau3A Iで分解し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、0.96kbの断片を回収した。この
断片を更にHinc IIとHae IIで切断し、アガロースゲル
電気泳動にかけることにより、405bの断片を回収した。
この断片２μｇと150pmolのNco Iリンカー〔宝酒造
（株）、ｄ（pA−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ）〕及び（１−１）で得た３′側のアダプター150pmo
lをT4 DNAリガーゼ用バッフアー、0.5mM ATP、10mM DT
T、300ユニットのT4 DNAリガーゼを含む125μの反応
液中、15℃、一夜インキュベートした。反応液を70℃、
10分インキュベートした後、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを添加し37℃、30分インキュベートして３′側アダプ
ターの鎖長37のものの５′末端をリン酸化した。この反
応液をフェノール・クロロホルム抽出した後、エタノー
ル沈殿してDNAを回収し、次いでこのDNAをNco I及びHin
d IIIで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.44k
bのNco I〜Hind III断片約１μｇを回収した。
スミドpLF2435〔バイオケミストリー第25巻、第4936〜4
941頁（1986）〕100μｇをSau3A Iで分解し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、0.96kbの断片を回収した。この
断片を更にHinc IIとHae IIで切断し、アガロースゲル
電気泳動にかけることにより、405bの断片を回収した。
この断片２μｇと150pmolのNco Iリンカー〔宝酒造
（株）、ｄ（pA−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｔ）〕及び（１−１）で得た３′側のアダプター150pmo
lをT4 DNAリガーゼ用バッフアー、0.5mM ATP、10mM DT
T、300ユニットのT4 DNAリガーゼを含む125μの反応
液中、15℃、一夜インキュベートした。反応液を70℃、
10分インキュベートした後、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを添加し37℃、30分インキュベートして３′側アダプ
ターの鎖長37のものの５′末端をリン酸化した。この反
応液をフェノール・クロロホルム抽出した後、エタノー
ル沈殿してDNAを回収し、次いでこのDNAをNco I及びHin
d IIIで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.44k
bのNco I〜Hind III断片約１μｇを回収した。
（１−３）pUC119NTの構築 分泌型発現ベクターpIN III−ompAl〔ジ エンボ ジ
ャーナル、第３巻、第2437〜2442頁（1984）〕12μｇを
Hind III及びSal Iで分解し、アガロースゲル電気泳動
にかけ、1ppターミネーター配列を含む0.95kbのHind II
I−Sal I断片を回収した。この断片0.75μｇをあらかじ
めHind III及びSal Iで分解して脱リン酸したプラスミ
ドpUC119N0.5μｇと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、
0.5mM ATP、10mM DTT及び2.8ユニットのT4 DNAリガーゼ
を含む20μの反応液中、16℃、一夜インキュベートし
た。反応液２μを用いて大腸菌JM109を形質転換し、1
ppターミネーター配列を持つプラスミドを得、pUC119NT
と命名した。
ャーナル、第３巻、第2437〜2442頁（1984）〕12μｇを
Hind III及びSal Iで分解し、アガロースゲル電気泳動
にかけ、1ppターミネーター配列を含む0.95kbのHind II
I−Sal I断片を回収した。この断片0.75μｇをあらかじ
めHind III及びSal Iで分解して脱リン酸したプラスミ
ドpUC119N0.5μｇと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、
0.5mM ATP、10mM DTT及び2.8ユニットのT4 DNAリガーゼ
を含む20μの反応液中、16℃、一夜インキュベートし
た。反応液２μを用いて大腸菌JM109を形質転換し、1
ppターミネーター配列を持つプラスミドを得、pUC119NT
と命名した。
なお、pUC119Nは、市販のpUC119ベクター〔宝酒造
（株）販売〕の翻訳開始コドン部位にNco Iサイトを導
入し、更にリボソーム結合部位と開始コドンの距離を８
塩基したものである。
（株）販売〕の翻訳開始コドン部位にNco Iサイトを導
入し、更にリボソーム結合部位と開始コドンの距離を８
塩基したものである。
（１−４）Nco I〜Hind III断片のpUC119NTへのクロー
ニング （１−３）で得たプラスミドpUC119NT 1μｇをNco I
及びHind IIIで分解後、脱リン酸した。このプラスミド
0.5μｇを（１−２）で得たNco I〜Hind III断片0.2μ
ｇと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP、10m
M DTT、及び５ユニットのT4 DNAリガーゼを含む50μ
の反応液中、16℃、５時間インキュベートした。この反
応液２μを大腸菌JM109の形質転換に使用した。
ニング （１−３）で得たプラスミドpUC119NT 1μｇをNco I
及びHind IIIで分解後、脱リン酸した。このプラスミド
0.5μｇを（１−２）で得たNco I〜Hind III断片0.2μ
ｇと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP、10m
M DTT、及び５ユニットのT4 DNAリガーゼを含む50μ
の反応液中、16℃、５時間インキュベートした。この反
応液２μを大腸菌JM109の形質転換に使用した。
（１−５）大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 （１−４）で得た反応液２μを用いて、大腸菌JM10
9を形質転換した。得られた形質転換体中６クローンに
ついてプラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド
法で調製したプラスミドをNco I及びHind IIIで分解
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I
〜Hind III断片（0.44kb）のバンドの生成を調べた。そ
の結果、１クローンに目的のバンドの生成が認められ
た。また、ダイデオキシ法により、組込まれたcDNA断片
領域の塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認
した。この組換え体プラスミドをpFD705と命名した。
9を形質転換した。得られた形質転換体中６クローンに
ついてプラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド
法で調製したプラスミドをNco I及びHind IIIで分解
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I
〜Hind III断片（0.44kb）のバンドの生成を調べた。そ
の結果、１クローンに目的のバンドの生成が認められ
た。また、ダイデオキシ法により、組込まれたcDNA断片
領域の塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認
した。この組換え体プラスミドをpFD705と命名した。
また、このプラスミドを保持する大腸菌JM109をEsche
richia coli JM109/pFD705と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第11037号（FER
M P−11037）〕。
richia coli JM109/pFD705と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第11037号（FER
M P−11037）〕。
（１−６）組換え体からのポリペプチドの精製 （１−５）で得たEscherichia coli JM109/pFD705を5
0μg/mlのアンピシリンを添加した5mlのＬ−ブロスを含
む試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを500mlの
同培地を含む２の三角フラスコ２本に接種し、100rpm
で培養を続けた。660nmの吸光度が0.3の時点でIPTG（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を2mMになる
よう添加し、16時間後に集菌した。菌体の一部を用いて
イムノブロッティングを行った。すなわち、全菌体タン
パク質をSDS−PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）で分離し、泳動パターンをニトロセルロースメンブ
ランに転写した後、FNのフィブリン結合ドメインを特異
的に認識するモノクローナル抗体〔HFN−11F6、セロテ
ック（Serotec）社販売〕を作用させ、次いでパーオキ
シダーゼ標識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体
のパーオキシダーゼ活性を４−クロロ−１−ナフトール
と過酸化水素の存在下で発色させ、16.5kD付近に目的の
ポリペプチドが生産されていることを確認した。次に、
全菌体ペルット（湿重量4.4g）を緩衝液〔50mMトリス
（Tris）−HCl,pH8.0、25％ショ糖、1mM EDTA〕21mlに
懸濁し、2mg/mlリゾチーム溶液を1ml添加した。０℃、3
0分放置後、超音波処理することにより菌体を破砕し
た。この菌体破砕液に、1M MgCl2を66μ、1M MnCl2を
22μ及び60,000ユニット/mlデオキシリボヌークレア
ーゼＩ（DNase I）を55μをそれぞれ添加し、37℃、3
0分インキュベートした。次いで、0.2M NaCl、１％デオ
キシコール酸、１％ノニデット（Nonidet）Ｐ−40を含
む20mMトリス−HCl,pH7.5緩衝液4.4mlを添加し、12,000
rpmで10分間遠心分離し、上澄みを捨てた。沈殿緩衝液
（50mMトリス−HCl,pH8.0、10mM EDTA、100mM NaCl、0.
5％トリトンＸ−100）22mlに懸濁し、14,000rpmで10分
間遠心分離し上澄みを捨てた。この沈殿を次いで20％エ
チレングリコール水溶液22mlに懸濁し、14,000で10分間
遠心分離した。得られた沈殿を更に２％ノニデットＰ−
40水溶液22mlに懸濁し、14,000rpmで10分間遠心分離し
上澄みを捨てることにより精製された封入体0.5g（湿重
量）のペレットを得た。この封入体を20mMトリス−HCl,
pH8.3、50mM DTT、7M尿素液10mlに溶解した。不溶物を
遠心分離により除去した後、可溶化液を1mM EDTA、5M尿
素、5mM DTTを含む20mMトリス−HCl,pH8.3緩衝液で平衡
化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ−100HR（ファルマ
シア社製）750mlを含むカラムを用いてゲルろ過クロマ
トグラフィーを行った。同一緩衝液で溶出、分画し、各
分画液の一部をSDS−PAGEにかけ、目的画分を90ml集め
た。この画分を1mM酸化型グルタチオンを含む20mMトリ
ス−HCl,pH9.0緩衝液中で４℃、二昼夜透析することに
より、タンパクのリフォールディングを行った。この透
析内液を引続き蒸留水中で透析することにより脱塩し、
凍結乾燥して、電気泳動的に単一なポリペプチドを21.5
mg得た。アプライドバイオシステムズ社のペプチドシー
ケンサー477A/120Aを用いて、本ポリペプチドのＮ末端
からのアミノ酸配列を調べたところ、Ala−Asn−Glu−G
ly−Leu−Asnの配列が認められ、Ｆ−143のＮ末端にAla
が付加したＮ末配列と一致した（以下、本ポリペプチド
をAla−Ｆ−143と略称する）。
0μg/mlのアンピシリンを添加した5mlのＬ−ブロスを含
む試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを500mlの
同培地を含む２の三角フラスコ２本に接種し、100rpm
で培養を続けた。660nmの吸光度が0.3の時点でIPTG（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を2mMになる
よう添加し、16時間後に集菌した。菌体の一部を用いて
イムノブロッティングを行った。すなわち、全菌体タン
パク質をSDS−PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）で分離し、泳動パターンをニトロセルロースメンブ
ランに転写した後、FNのフィブリン結合ドメインを特異
的に認識するモノクローナル抗体〔HFN−11F6、セロテ
ック（Serotec）社販売〕を作用させ、次いでパーオキ
シダーゼ標識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体
のパーオキシダーゼ活性を４−クロロ−１−ナフトール
と過酸化水素の存在下で発色させ、16.5kD付近に目的の
ポリペプチドが生産されていることを確認した。次に、
全菌体ペルット（湿重量4.4g）を緩衝液〔50mMトリス
（Tris）−HCl,pH8.0、25％ショ糖、1mM EDTA〕21mlに
懸濁し、2mg/mlリゾチーム溶液を1ml添加した。０℃、3
0分放置後、超音波処理することにより菌体を破砕し
た。この菌体破砕液に、1M MgCl2を66μ、1M MnCl2を
22μ及び60,000ユニット/mlデオキシリボヌークレア
ーゼＩ（DNase I）を55μをそれぞれ添加し、37℃、3
0分インキュベートした。次いで、0.2M NaCl、１％デオ
キシコール酸、１％ノニデット（Nonidet）Ｐ−40を含
む20mMトリス−HCl,pH7.5緩衝液4.4mlを添加し、12,000
rpmで10分間遠心分離し、上澄みを捨てた。沈殿緩衝液
（50mMトリス−HCl,pH8.0、10mM EDTA、100mM NaCl、0.
5％トリトンＸ−100）22mlに懸濁し、14,000rpmで10分
間遠心分離し上澄みを捨てた。この沈殿を次いで20％エ
チレングリコール水溶液22mlに懸濁し、14,000で10分間
遠心分離した。得られた沈殿を更に２％ノニデットＰ−
40水溶液22mlに懸濁し、14,000rpmで10分間遠心分離し
上澄みを捨てることにより精製された封入体0.5g（湿重
量）のペレットを得た。この封入体を20mMトリス−HCl,
pH8.3、50mM DTT、7M尿素液10mlに溶解した。不溶物を
遠心分離により除去した後、可溶化液を1mM EDTA、5M尿
素、5mM DTTを含む20mMトリス−HCl,pH8.3緩衝液で平衡
化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ−100HR（ファルマ
シア社製）750mlを含むカラムを用いてゲルろ過クロマ
トグラフィーを行った。同一緩衝液で溶出、分画し、各
分画液の一部をSDS−PAGEにかけ、目的画分を90ml集め
た。この画分を1mM酸化型グルタチオンを含む20mMトリ
ス−HCl,pH9.0緩衝液中で４℃、二昼夜透析することに
より、タンパクのリフォールディングを行った。この透
析内液を引続き蒸留水中で透析することにより脱塩し、
凍結乾燥して、電気泳動的に単一なポリペプチドを21.5
mg得た。アプライドバイオシステムズ社のペプチドシー
ケンサー477A/120Aを用いて、本ポリペプチドのＮ末端
からのアミノ酸配列を調べたところ、Ala−Asn−Glu−G
ly−Leu−Asnの配列が認められ、Ｆ−143のＮ末端にAla
が付加したＮ末配列と一致した（以下、本ポリペプチド
をAla−Ｆ−143と略称する）。
（１−７）pFD705からの介在配列（GCT）の除去 （１−５）で得たプラスミドpFD705によって発現され
るポリペプチド（Ala−Ｆ−143）のＮ末端にはNco Iリ
ンカーに由来するAlaが付加されている。このAlaに対応
する配列（GCT）を部位特異的変異の手法により除去し
た。すなわち、オリゴヌクレオチドｄ〔AGCCTTCGTTCATG
GTCTGT〕を合成し、サイト−ダイレクティド ミュータ
ジェネシスシステム ミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販
売〕を用いて行った。その結果、末端のAlaが除去され
たＦ−143を発現するプラスミドを得、pFD708と命名し
た。
るポリペプチド（Ala−Ｆ−143）のＮ末端にはNco Iリ
ンカーに由来するAlaが付加されている。このAlaに対応
する配列（GCT）を部位特異的変異の手法により除去し
た。すなわち、オリゴヌクレオチドｄ〔AGCCTTCGTTCATG
GTCTGT〕を合成し、サイト−ダイレクティド ミュータ
ジェネシスシステム ミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販
売〕を用いて行った。その結果、末端のAlaが除去され
たＦ−143を発現するプラスミドを得、pFD708と命名し
た。
実施例２ FNのＣ末端側フィブリン結合ドメインCys2144−Gly
2275（132アミノ酸残基、以下Ｆ−132と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（第２図参照） （２−１）合成DNAアダプターの調製 Ｃ末端側フィブリン結合ドメインに存在するＩ型繰返
し配列をベクターに接続するための５′側のアダプター
（鎖長11mer＃１及び＃２、第２図参照）をアプライド
バイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合成した。300
pmolの11mer＃２の５′末端をリン酸化した後、鎖長11m
er＃１の合成DNA等量を加えてアニーリング操作によ
り、２重鎖とした。また、３′側には（１−１）で調製
したアダプター（29mer及び37mer）を用い、（１−１）
と同様の方法で２重鎖とした。
2275（132アミノ酸残基、以下Ｆ−132と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（第２図参照） （２−１）合成DNAアダプターの調製 Ｃ末端側フィブリン結合ドメインに存在するＩ型繰返
し配列をベクターに接続するための５′側のアダプター
（鎖長11mer＃１及び＃２、第２図参照）をアプライド
バイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合成した。300
pmolの11mer＃２の５′末端をリン酸化した後、鎖長11m
er＃１の合成DNA等量を加えてアニーリング操作によ
り、２重鎖とした。また、３′側には（１−１）で調製
したアダプター（29mer及び37mer）を用い、（１−１）
と同様の方法で２重鎖とした。
（２−２）Nco I〜Hind III断片の調製 （１−２）で得たpLF2435のSau3A I断片（0.96kb断
片）を更にFok IとHae IIで切断し、アガロースゲル電
気泳動にかけることにより、0.37kbの断片を回収した。
この断片２μｇと150pmolの５′側アダプター及び150pm
olの３′側アダプターとを300ユニットのT4 DNAリガー
ゼを含む125μの反応液中、15℃、一夜インキュベー
トした。反応液を70℃、10分インキュベートした後、
（１−２）と同様の方法でアダプターのもう一方の側の
５′末端をリン酸化し、次いで、Nco I及びHind IIIで
分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.40kbのNco
I〜Hind III断片約0.5μｇを回収した。
片）を更にFok IとHae IIで切断し、アガロースゲル電
気泳動にかけることにより、0.37kbの断片を回収した。
この断片２μｇと150pmolの５′側アダプター及び150pm
olの３′側アダプターとを300ユニットのT4 DNAリガー
ゼを含む125μの反応液中、15℃、一夜インキュベー
トした。反応液を70℃、10分インキュベートした後、
（１−２）と同様の方法でアダプターのもう一方の側の
５′末端をリン酸化し、次いで、Nco I及びHind IIIで
分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.40kbのNco
I〜Hind III断片約0.5μｇを回収した。
（２−３）Nco I〜Hind III断片のpUC119NTへのクロー
ニング （１−３）で得たプラスミドpUC119NT 1μｇをNco I
及びHind IIIで分解後、脱リン酸した。このプラスミド
0.8μｇと（２−２）で得たNco I〜Hind III断片0.2μ
ｇに対してライゲーションキット〔宝酒造（株）販売〕
Ａ液60μ及びＢ液7.5μを加えて16℃、30分インキ
ュベートした。この反応液４μを大腸菌JM109の形質
転換に使用した。
ニング （１−３）で得たプラスミドpUC119NT 1μｇをNco I
及びHind IIIで分解後、脱リン酸した。このプラスミド
0.8μｇと（２−２）で得たNco I〜Hind III断片0.2μ
ｇに対してライゲーションキット〔宝酒造（株）販売〕
Ａ液60μ及びＢ液7.5μを加えて16℃、30分インキ
ュベートした。この反応液４μを大腸菌JM109の形質
転換に使用した。
（２−４）大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 （２−３）で得た反応液４μを用いて、大腸菌JM10
9を形質転換した。得られた形質転換体中６クローンに
ついてプラスミドの分析を（１−５）と同様の方法で行
い、Nco I〜Hind III断片（0.41kb）のバンドの生成を
調べた。その結果、３クローンに目的のバンドの生成が
認められた。また、ダイデオキシ法により、組込まれた
cDNA断片領域の塩基配列を決定し、目的の配列を含むこ
とを確認した。この組換え体プラスミドをpFD905と命名
した。
9を形質転換した。得られた形質転換体中６クローンに
ついてプラスミドの分析を（１−５）と同様の方法で行
い、Nco I〜Hind III断片（0.41kb）のバンドの生成を
調べた。その結果、３クローンに目的のバンドの生成が
認められた。また、ダイデオキシ法により、組込まれた
cDNA断片領域の塩基配列を決定し、目的の配列を含むこ
とを確認した。この組換え体プラスミドをpFD905と命名
した。
また、このプラスミドを保持する大腸菌JM109をEsche
richia coli JM109/pFD905と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第11038号（FER
M P−11038）〕。
richia coli JM109/pFD905と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第11038号（FER
M P−11038）〕。
（２−５）組換え体からのポリペプチドの精製 （２−４）で得たEscherichia coli JM109/pFD905を
（１−６）と同様の方法で培養し、１の培養菌体から
精製封入体のペレット0.5g（湿重量）を得た。この封入
体から、（１−６）と同様の方法で目的タンパクの精製
を行い、電気泳動的に単一なポリペプチドを12mgを得
た。本ポリペプチドを還元カルボキシメチル化すること
により〔「生化学実験講座」Ｉタンパク質の化学II、東
京化学同人社刊、第228〜230頁（1976）記載の方法に従
った〕、あらかじめシステイン残基を保護したものにつ
いて、Ｎ末端のアミノ配列を調べた結果、Ala−Cys−Ph
e−Asp−Pro−Tyrの配列が認められ、Ｆ−132のＮ末端
にAlaが付加したＮ末配列と一致した（以下、本ポリペ
プチドをAla−Ｆ−132と略称する）。
（１−６）と同様の方法で培養し、１の培養菌体から
精製封入体のペレット0.5g（湿重量）を得た。この封入
体から、（１−６）と同様の方法で目的タンパクの精製
を行い、電気泳動的に単一なポリペプチドを12mgを得
た。本ポリペプチドを還元カルボキシメチル化すること
により〔「生化学実験講座」Ｉタンパク質の化学II、東
京化学同人社刊、第228〜230頁（1976）記載の方法に従
った〕、あらかじめシステイン残基を保護したものにつ
いて、Ｎ末端のアミノ配列を調べた結果、Ala−Cys−Ph
e−Asp−Pro−Tyrの配列が認められ、Ｆ−132のＮ末端
にAlaが付加したＮ末配列と一致した（以下、本ポリペ
プチドをAla−Ｆ−132と略称する）。
（２−６）pFD905からの介在配列（GCT）の除去 （２−５）で得たプラスミドpFD905によって発現され
るポリペプチド（Ala−Ｆ−132）のＮ末端にはNco Iサ
イトを有する５′側アダプター（第２図参照）に由来す
るAlaが付加されている。このAlaに対応する配列（GC
T）を部位特異的変異の手法により除去した。すなわ
ち、オリゴヌクレオチドｄ〔GGTCAAAGCACATGGTCTGT〕を
合成し、サイト−ダイレクティド ミュータジェネシス
システム ミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販売〕を用い
て行った。その結果、末端のAlaが除去されたＦ−132を
発現するプラスミドを得、pFD908と命名した。
るポリペプチド（Ala−Ｆ−132）のＮ末端にはNco Iサ
イトを有する５′側アダプター（第２図参照）に由来す
るAlaが付加されている。このAlaに対応する配列（GC
T）を部位特異的変異の手法により除去した。すなわ
ち、オリゴヌクレオチドｄ〔GGTCAAAGCACATGGTCTGT〕を
合成し、サイト−ダイレクティド ミュータジェネシス
システム ミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販売〕を用い
て行った。その結果、末端のAlaが除去されたＦ−132を
発現するプラスミドを得、pFD908と命名した。
参考例１ 生物活性の測定 前記実施例１及び２で得られる各ポリペプチドを用い
てフィブリン結合活性及びインシュリン結合活性を測定
した。
てフィブリン結合活性及びインシュリン結合活性を測定
した。
（３−１）フィブリン結合活性 関口らの方法〔ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）第2
56巻、第6452〜6462頁（1981）〕に従い、フィブリン固
定化カラムへの吸着によりフィブリン結合活性を調べ
た。なお、フィブリン固定化カラムの調製法はヘーン
（D.L.Heene）らの方法〔トロムボシス リサーチ（Thr
ombosis Research）第２巻、第137〜154頁（1973）〕に
より作製した。ただし、担体樹脂としてAF−トレシルト
ヨパール650（東ソー）を用いた。フィブリン−AFトヨ
パールカラム（1ml）に各種試料ポリペプチド過剰量（2
70pmol）を通した。5mlの洗浄バッファー（10mMトリス
−リン酸、pH7.5、50mM NaCl、1mM EDTA）で洗浄した
後、5mlの溶出バッファー１（0.5MアルギニンPBS溶液）
で吸着画分を溶出させた。次いで、5mlの溶出バッファ
ー２（6M尿素、25mMトリス−リン酸、pH7.5）で溶出さ
せた。各画分を0.5mlずつ分画し、試料ポリペプチドの
溶出位置でFNのＣ末端側フィブリン結合ドメインを認識
するモノクローナル抗体（HFN−11F6、セロテック社）
を用いたELISA法により調べた。その結果、Ala−Ｆ−14
3、Ｆ−143、Ala−Ｆ−132及びＦ−132の各フィブリン
結合活性ポリペプチドはいずれも本カラムの素通り画分
及び溶出バッファー１で溶出される吸着画分に認めら
れ、フィブリン結合活性を有することが認められた。ま
た、素通りした試料量と吸着した試料量との比から、各
試験のフィブリンへの結合能力を比較した結果、いずれ
の試料も大差はなかった（後記第１表参照）。
ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）第2
56巻、第6452〜6462頁（1981）〕に従い、フィブリン固
定化カラムへの吸着によりフィブリン結合活性を調べ
た。なお、フィブリン固定化カラムの調製法はヘーン
（D.L.Heene）らの方法〔トロムボシス リサーチ（Thr
ombosis Research）第２巻、第137〜154頁（1973）〕に
より作製した。ただし、担体樹脂としてAF−トレシルト
ヨパール650（東ソー）を用いた。フィブリン−AFトヨ
パールカラム（1ml）に各種試料ポリペプチド過剰量（2
70pmol）を通した。5mlの洗浄バッファー（10mMトリス
−リン酸、pH7.5、50mM NaCl、1mM EDTA）で洗浄した
後、5mlの溶出バッファー１（0.5MアルギニンPBS溶液）
で吸着画分を溶出させた。次いで、5mlの溶出バッファ
ー２（6M尿素、25mMトリス−リン酸、pH7.5）で溶出さ
せた。各画分を0.5mlずつ分画し、試料ポリペプチドの
溶出位置でFNのＣ末端側フィブリン結合ドメインを認識
するモノクローナル抗体（HFN−11F6、セロテック社）
を用いたELISA法により調べた。その結果、Ala−Ｆ−14
3、Ｆ−143、Ala−Ｆ−132及びＦ−132の各フィブリン
結合活性ポリペプチドはいずれも本カラムの素通り画分
及び溶出バッファー１で溶出される吸着画分に認めら
れ、フィブリン結合活性を有することが認められた。ま
た、素通りした試料量と吸着した試料量との比から、各
試験のフィブリンへの結合能力を比較した結果、いずれ
の試料も大差はなかった（後記第１表参照）。
（３−２）インシュリン結合活性 FNのフィブリン結合ドメインにはインシュリン結合活
性があることが知られている（第46回日本癌学会総会記
事、第181頁）。そこでAla−Ｆ−143、Ｆ−143、Ala−
Ｆ−132及びＦ−132の各フィブリン結合活性ポリペプチ
ドのインシュリン結合活性を調べた。これら各ポリペプ
チドを20μｇより順次1/2希釈したものをバイオラッド
社製BIO−DOTを用いてニトロセルロース膜に吸着させ
た。このニトロセルロース膜を３％BSAを含むPBSバッフ
ァーでブロッキング操作を行った後、50μg/mlのパーオ
キシダーゼ標識したインシュリン（シグマ社）を含むPB
Sバッファー中室温、２時間放置した。次にこのニトロ
セルロース膜をPBSで５分間、２回洗浄した後、結合し
たパーオキシダーゼ−インシュリンを４−クロロ−１−
ナフトール及び過酸化水素を基質として検出した。その
結果、いずれも濃度に対応した発色がみられ、インシュ
リン結合活性があることが確認された（第１表参照）。
性があることが知られている（第46回日本癌学会総会記
事、第181頁）。そこでAla−Ｆ−143、Ｆ−143、Ala−
Ｆ−132及びＦ−132の各フィブリン結合活性ポリペプチ
ドのインシュリン結合活性を調べた。これら各ポリペプ
チドを20μｇより順次1/2希釈したものをバイオラッド
社製BIO−DOTを用いてニトロセルロース膜に吸着させ
た。このニトロセルロース膜を３％BSAを含むPBSバッフ
ァーでブロッキング操作を行った後、50μg/mlのパーオ
キシダーゼ標識したインシュリン（シグマ社）を含むPB
Sバッファー中室温、２時間放置した。次にこのニトロ
セルロース膜をPBSで５分間、２回洗浄した後、結合し
たパーオキシダーゼ−インシュリンを４−クロロ−１−
ナフトール及び過酸化水素を基質として検出した。その
結果、いずれも濃度に対応した発色がみられ、インシュ
リン結合活性があることが確認された（第１表参照）。
〔発明の効果〕 以上述べてきたごとく、本発明により、少なくともフ
ィブリン結合活性を有するフィブリン結合活性ポリペプ
チド、並びにそれらをコードする核酸、及びそのDNAを
用いた遺伝子工学的な製造方法が提供される。
ィブリン結合活性を有するフィブリン結合活性ポリペプ
チド、並びにそれらをコードする核酸、及びそのDNAを
用いた遺伝子工学的な製造方法が提供される。
上記ポリペプチドは、血液凝固阻止剤、ドラッグデリ
バリーシステムとしてなど各種の用途に有用である。
バリーシステムとしてなど各種の用途に有用である。
第１図は前記式ＩにおけるＷ−Ｘ−Ｙ−Ｚをコードする
プラスミドpFD705を構築するための工程図で、第２図は
前記式ＩにおけるＷ−Ｘ−ＺをコードするプラスミドpF
D905を構築するための工程図である。
プラスミドpFD705を構築するための工程図で、第２図は
前記式ＩにおけるＷ−Ｘ−ＺをコードするプラスミドpF
D905を構築するための工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ. Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．７，ｐ．1755−1759 （1985) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 25，ｐ．4936−4941（1986) 第46会日本癌学会総会記事、第181頁 709、ａｍＧ、1987 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/745 C12N 1/21 C12P 21/02 A61K 38/36 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】下記一般式I: （Ｗ）ｌ−（Ｘ）ｍ−（Ｙ）ｎ−Ｚ ‥‥〔Ｉ〕 〔式中、Ｗはメチオニン残基（Met）を示し、またＸは
アラニン残基（Ala）を示し、Ｙはヒトフィブロネクチ
ンのポリペプチド残基で、Asn2133−Ser2143に相当する
11アミノ酸ポリペプチド残基を示し、下記式II: で表される配列を有し、ＺはヒトフィブロネクチンのＣ
末端側フィブリン結合ドメインのCys2144−Gly2275に相
当する132アミノ酸ポリペプチド残基を表し、下記式II
I: で表される配列を有し、ｌ、ｍ及びｎはそれぞれ１又は
零の数を示す〕で表されることを特徴とするフィブリン
結合活性ポリペプチド。 - 【請求項２】請求項１記載のフィブリン結合活性ポリペ
プチドをコードする核酸。 - 【請求項３】請求項１記載のフィブリン結合活性ポリペ
プチドをコードするDNAを含有せしめた組換え体プラス
ミド。 - 【請求項４】請求項３記載の組換え体プラスミドを導入
せしめた形質転換体。 - 【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、該培
養物より請求項１記載のフィブリン結合活性ポリペプチ
ドを採取することを特徴とするフィブリン結合活性ポリ
ペプチドの製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP1262131A JP2829397B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | フィブリン結合活性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1262131A JP2829397B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | フィブリン結合活性ポリペプチド |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH03123799A JPH03123799A (ja) | 1991-05-27 |
| JP2829397B2 true JP2829397B2 (ja) | 1998-11-25 |
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| JP1262131A Expired - Fee Related JP2829397B2 (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | フィブリン結合活性ポリペプチド |
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Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| ATE168014T1 (de) * | 1991-11-08 | 1998-07-15 | Somatogen Inc | Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem |
| US5668104A (en) * | 1992-03-31 | 1997-09-16 | Toray Industries, Inc. | Hematopoietic stem cell growth-promoting compositions containing a fibroblast-derived fragment of fibronectin and a growth factor, and methods employing them in vitro or in vivo |
-
1989
- 1989-10-09 JP JP1262131A patent/JP2829397B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５，ｐ．４９３６−４９４１（１９８６） |
| Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．７，ｐ．１７５５−１７５９（１９８５） |
| 第４６会日本癌学会総会記事、第１８１頁７０９、ａｍＧ、１９８７ |
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| JPH03123799A (ja) | 1991-05-27 |
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