JP2884098B2 - Kujin-derived cell activator - Google Patents
Kujin-derived cell activatorInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明は、新規な細胞賦活物質（因子）の開発に関す
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Object of the Invention] The present invention relates to the development of a novel cell activator (factor).
具体的には、マメ科植物（Leguminosase）のクジン
（Sophora angusutifolia Sieb.et Zucc.）から抽出さ
れた特定の物性を示す水溶性成分を有効成分とする繊維
芽細胞又は上皮細胞賦活剤。Specifically, a fibroblast or epithelial cell activator containing, as an active ingredient, a water-soluble component having specific physical properties extracted from kujin (Sophora angusutifolia Sieb. Et Zucc.) Of leguminous plants (Leguminosase).
「産業上の利用分野」 本発明によるクジン由来の標記細胞賦活剤は、例え
ば、組織培養、医薬品、医薬部外品、化粧品（人及びそ
の他の動物用）、加工食品（健康食品、食品添加物）分
野に用いることができる。又、動物用飼料等にも添加し
て利用することも出来る。"Industrial application fields" The cell activator derived from kujin according to the present invention includes, for example, tissue culture, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics (for humans and other animals), processed foods (health foods, food additives) ) Can be used in the field. It can also be used by adding it to animal feeds.
「従来の技術」 クジン（苦参）は、古い書物「風土記」の中に多く記
され、薬用として正倉院に保存されている一つであり、
又、「延喜式」典薬寮によると、諸国より多量の苦参
が、日本に貢進されたと記載されている。“Conventional technology” Kujin (bitan) is one that is often written in the old book “Fudoki” and is preserved as medicinal in Shosoin.
In addition, according to the “Yenki Shiki” dormitory, it is stated that Japan contributed more torment than Japan.
更に、広川薬用植物大辞典には、クララとも称して、
漢方で健胃、利尿、解熱、鎮痛及び駆除薬とすると開示
されており、古くから、解熱、利尿、温補の薬物として
用いられている。Furthermore, in the Hirokawa Medicinal Plant Dictionary, it is also called Clara,
It is disclosed in Kampo as a stomach, diuresis, antipyretic, analgesic, and an exterminating drug, and has been used as a drug for antipyretic, diuretic, and hot supplement since ancient times.
苦参の薬理作用に関しては、例えば、山原らによれ
ば、クジン中に含まれるアルカロイド成分が、ストレス
潰瘍ラットに対して、潰瘍の発生を予防する効果を報告
している［文献所在：生薬の抗潰瘍作用に関する研究
（第一報），生薬の抗潰瘍作用，生薬,28,33〜37,197
4］。With regard to the pharmacological action of Bitter ginseng, for example, according to Yamahara et al., An alkaloid component contained in kujin has been reported to have an effect of preventing the development of ulcers in rats with stress ulcer [Reference location: Study on anti-ulcer effect (first report), anti-ulcer effect of crude drug, crude drug, 28,33-37,197
Four].
しかし、未だ、その他の作用については、十分研究さ
れていないのが現状であり、特に、クジンから得られた
抽出物については、細胞賦活作用に関する研究は、他に
見当たらない。However, at present, other effects have not been sufficiently studied. In particular, there is no other study on the cell activating effect of an extract obtained from kujin.
「発明が解決しようとする課題」 動物細胞（細胞賦活物質）の増殖能についてみると、
血清培地を用いた場合において、細胞を低密度で培養す
ると、細胞が死滅することが多く、更に、無血清培地で
行なうと、より顕著に細胞の死滅減少を起こす為、細胞
が非常に少ない状態からでも増殖してくるような物質が
望ましい。"Problems to be solved by the invention" Looking at the proliferation ability of animal cells (cell activators),
In the case of using a serum medium, when cells are cultured at a low density, the cells often die, and when the medium is used in a serum-free medium, the cell death is more significantly reduced. It is desirable to use a substance that can be propagated from the ground.
そこで、本発明者らは、動物細胞を低密度から増殖を
可能とする因子を得る目的で、又、広く自然界を検索
（スクリーニング）する中で、生薬であるクジンの抽出
物から、強い細胞賦活作用を有することを見い出すに至
った。Therefore, the inventors of the present invention have conducted strong cell activation from extracts of crude drugs, kujin, while searching (screening) the natural world for the purpose of obtaining factors that enable animal cells to grow from low density. It has been found to have an effect.
本発明による繊維芽細胞又は上皮細胞賦活剤は、マメ
科の植物クジンから得られた下記（ａ）〜（ｄ）の物性
を示す水溶性成分を有効成分とする。The fibroblast or epithelial cell activator according to the present invention comprises, as an active ingredient, a water-soluble component having the following physical properties (a) to (d) obtained from leguminous plant kudin.
（ａ）分子量700〜1,100 （ｂ）80％以上のエタノール水溶液に難溶乃至不溶 無水エタノール,n−ブタノール，酢酸エチル，クロロ
ホルム，石油エーテル，エーテルには不溶 （ｃ）モーリッシュ（Molisch）反応：陽性 （ｄ）ニンヒドリン（Ninhydrin）反応：陽性 「課題を解決するための手段」 斯かる実状において、本発明者らは、更に鋭意研究を
行った結果、以下に詳記する如く、細胞生着率と、その
コロニー形成能促進作用に関する試験をもとに、クジン
から新規細胞賦活物質を、簡易な手段で得ることに成功
したわけである。(A) 700-1100 molecular weight (b) Poorly soluble or insoluble in 80% or more aqueous ethanol solution Insoluble in anhydrous ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether and ether (c) Molsch reaction: Positive (d) Ninhydrin reaction: Positive "Means for solving the problem" In such a situation, the present inventors have conducted further intensive studies, and as a result, as described in detail below, the cell engraftment rate Thus, based on a test on its ability to promote colony forming ability, a new cell activator was successfully obtained from kudin by simple means.
すなわち、クジン（乾燥物）１部に対して、５〜10部
の水を加えて、４℃にて、時々撹拌しながら数日間浸漬
を行った後、ろ過してろ液を取り、このろ液を減圧下に
おいて、10分の１〜20分の１になるまで濃縮を行い、濃
縮液に対して、有機溶媒（エタノール又はメタノール
等、ポリオール系の溶媒）の濃度が約60％になるように
添加後、遠心分離し、沈殿物を分取する。That is, 5 parts to 10 parts of water is added to 1 part of kujin (dry matter), and the resultant is immersed at 4 ° C. for several days with occasional stirring, and then filtered to obtain a filtrate. Is concentrated under reduced pressure until the concentration becomes 1/10 to 1/20, and the concentration of the organic solvent (polyol-based solvent such as ethanol or methanol) is about 60% with respect to the concentrated liquid. After the addition, the mixture is centrifuged to separate the precipitate.
次に、この沈殿物を水に溶解して、ゲルろ過を行な
い、特定するKav値に流出するフラクションを得る。更
に、これを凍結乾燥して、本発明によるクジン由来細胞
賦活物質を得る。Next, the precipitate is dissolved in water and subjected to gel filtration to obtain a fraction flowing out to a specified Kav value. Further, this is freeze-dried to obtain a kudin-derived cell activator according to the present invention.
尚、本発明によるクジン由来細胞賦活剤は、マメ科植
物のクジン（生薬名：苦参、別名をクララとも言う）を
出発原料となし、抽出、精製することによって製造でき
るが、精製前の抽出液（粗液、又は濃縮液、エキス）の
状態で用いることも出来る。更に、その際の出発原料
は、組織培養法によって得られた、クジンを用いること
もでき、又、上記原料を排出する際には、水の単独抽出
もで十分行なえるが、抽出液の腐敗を防止する為に、粗
液、又は濃縮液、エキスの状態で用いる際には、例え
ば、水性低級有機溶媒を用いることが良い。The stimulus-derived cell activator according to the present invention can be produced by extracting and purifying a leguminous plant kudin (herbal medicine name: bittersweet, also known as Clara) as a starting material. It can also be used in the state of a liquid (crude liquid, concentrated liquid, extract). Further, as a starting material at that time, kujin obtained by a tissue culture method can be used, and when the above-mentioned raw material is discharged, water alone can be sufficiently extracted. When used in the form of a crude liquid, a concentrated liquid, or an extract in order to prevent the occurrence of an organic solvent, for example, an aqueous lower organic solvent is preferably used.
以下、本発明を更に具体的に示す為に、実施例等をも
って詳記する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and the like in order to more specifically show the present invention.
〔実施例１〕 クジン（乾燥物）１部に対して、５〜10部の水を加え
て、４℃にて、時々撹拌しながら３日間浸漬を行う。浸
漬後、ろ過してろ液をとり、ろ液を減圧下において、10
分の１〜20分の１になるまで濃縮を行い、この濃縮液に
対してエタノールの濃度が60％になるように添加した
後、遠心分離し、沈殿物を分取する。[Example 1] 5 parts to 10 parts of water is added to 1 part of kudin (dry matter), and immersion is performed at 4 ° C for 3 days with occasional stirring. After immersion, filter and collect the filtrate.
Concentration is performed until the concentration becomes 1/20, and ethanol is added to the concentrated solution so that the concentration becomes 60%. Then, centrifugation is performed to separate a precipitate.
次に、この沈殿物を水で溶解した後、セファデックス
Ｇ−25メディウムを充填したカラム（25×60cm）によっ
て、ゲルろ過を行い（第１図）、Kav値で0.65〜0.85に
流出するフラクションを得る。Next, after dissolving this precipitate with water, gel filtration is performed by a column (25 × 60 cm) packed with Sephadex G-25 medium (FIG. 1), and the fraction flowing out to 0.65 to 0.85 in Kav value. Get.
更に、これを凍結乾燥して、クジン由来細胞賦活物質
を得る。尚、その収量は、約5gである。Further, this is freeze-dried to obtain a kudin-derived cell activator. Incidentally, the yield is about 5 g.
尚、ここで得られたクジン由来細胞賦活物質をもと
に、以下に開示する如く、理化学的データ及び生物学的
データをもって確認した。In addition, based on the kudin-derived cell activator obtained here, it was confirmed with physicochemical data and biological data as disclosed below.
〔１〕理化学的特性に関するデータ （ａ）分子量測定 クジン由来細胞賦活物質の分子量は、以下の試験法を
もって推定するとき、700〜1100にあることが確認され
た（第２図）。[1] Data on physicochemical properties (a) Measurement of molecular weight It was confirmed that the molecular weight of the cell activation substance derived from kudin was 700 to 1100 when estimated by the following test method (FIG. 2).
（測定法の概要） ポリエチレングリコール1000及び4000を標準品とし
て、セファデックスＧ−25ファイン（ファルマシア社
製）で分画して、分子量を推定する。(Summary of Measurement Method) Using polyethylene glycol 1000 and 4000 as standard products, fractionation is performed using Sephadex G-25 Fine (manufactured by Pharmacia), and the molecular weight is estimated.
（ｂ）ペーパークロマトグラム（東洋ろ紙No.50使用）
による測定 展開溶媒として、エタノール：水＝（2:3）を使用し
た場合、クロマトグラム上のRf値は、0.50〜0.60にある
ことが確認された。(B) Paper chromatogram (using Oriental filter paper No.50)
When ethanol: water = (2: 3) was used as the developing solvent, it was confirmed that the Rf value on the chromatogram was in the range of 0.50 to 0.60.
尚、ｎ−ブタノールに溶解したニンヒドリンを噴霧
し、100℃に加熱すると紫色に呈色する。In addition, when ninhydrin dissolved in n-butanol is sprayed and heated to 100 ° C., it turns purple.
又、展開溶媒を変えて、エタノール：水＝（4:1）を
使用した場合は、原点にとどまり、Rf値は確認されなか
った。In addition, when ethanol: water = (4: 1) was used while changing the developing solvent, the Rf value was not confirmed, because it remained at the origin.
（ｃ）溶媒に対する溶解性試験 水及び60％エタノール水溶液には易溶であるが、80％
以上のエタノール水溶液では難溶である。又、無水エタ
ノール、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、
石油エーテル、エーテルには不溶である。(C) Solubility test in solvent Easily soluble in water and 60% ethanol aqueous solution, but 80%
The above aqueous ethanol solution is hardly soluble. Also, anhydrous ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform,
Insoluble in petroleum ether and ether.
（ｄ）その他の反応試験 モーリッシュ反応：水に溶解した液に、15％ α−ナ
フトールを滴下し、硫酸を加える時、赤紫色を呈する。(D) Other reaction tests Maurish reaction: 15% α-naphthol is added dropwise to a solution dissolved in water, and when sulfuric acid is added, it exhibits a reddish purple color.
ニンヒドリン反応：水に溶解した液に、ニンヒドリン
試液を加え、水浴中で３分間加熱する時紫色を呈する。Ninhydrin reaction: A ninhydrin TS is added to a solution dissolved in water, and the solution turns purple when heated in a water bath for 3 minutes.
〔２〕生物学的特性に関するデータ （ａ）細胞生着率の促進作用 モルモットの初代線維芽細胞、更にマウスの初代腹腔
マクロファージは、無血清のMEM中では、培養器に生着
せず死滅する。[2] Data on Biological Properties (a) Promoting Effect of Cell Engraftment Rate Primary fibroblasts of guinea pigs and primary peritoneal macrophages of mice do not survive in the incubator in serum-free MEM.
これに対して、クジン由来細胞賦活物質は、無血清の
培地において、細胞の生着性（率）を促進し、死滅する
ことを防止することが確認出来る。In contrast, it can be confirmed that the kudin-derived cell activator promotes cell engraftment (rate) in a serum-free medium and prevents death.
又、クジン由来細胞賦活物質を添加することにより、
細胞が生着し、１週間以上生存することが確認された。Also, by adding a kujin-derived cell activator,
It was confirmed that the cells survived and survived for at least one week.
（ｂ）コロニー形成からみた促進作用 第１表（次表）は、10〜1000個のモルモットの初代培
養線維芽細胞を、直径6.0cmのペトリ皿（培養液:MEM＋
５％FBS〈牛胎児血清〉）に播種し、２週間後のコロニ
ー数を測定した成績結果である。(B) Promoting action from the viewpoint of colony formation Table 1 (next table) shows that 10 to 1000 guinea pig primary cultured fibroblasts were placed in a 6.0 cm diameter Petri dish (culture medium: MEM +
5% FBS (fetal calf serum)), and the results of counting the number of colonies after 2 weeks.
モルモットの初代培養線維芽細胞を用いて、コロニー
形成数（能）を求めてみると、クジン由来細胞賦活物質
の添加は、有意にコロニー数が増加し、無添加に比べる
と、約５倍以上の増加が確認された。When the number of colonies forming (potency) was determined using guinea pig primary cultured fibroblasts, the number of colonies significantly increased when the cell activation substance was added, and it was about 5 times or more as compared with the case without addition. Increase was confirmed.
この促進作用は、線維芽細胞に限らず、上皮細胞等に
おいても、同等に確認された。This promoting effect was equally confirmed not only in fibroblasts but also in epithelial cells and the like.
「第１表」コロニー形成数（能）促進作用 「発明の効果」 本発明によるクジンから得られた繊維芽細胞又は上皮
細胞賦活剤は、下記（ａ）〜（ｄ）の物性を示す水溶性
成分を有効成分とする。"Table 1" Promoting effect on the number of colonies formed (ability) "Effect of the Invention" The fibroblast or epithelial cell activator obtained from kudin according to the present invention contains a water-soluble component having the following physical properties (a) to (d) as an active ingredient.
（ａ）分子量700〜1,100 （ｂ）80％以上のエタノール水溶液に難溶乃至不溶無水
エタノール,n−ブタノール，酢酸エチル，クロロホル
ム，石油エーテル，エーテルには不溶 （ｃ）モーリッシュ（Molisch）反応：陽性 （ｄ）ニンヒドリン（Ninhydrin）反応：陽性 更に、本発明のクジン由来細胞賦活物質に関する作
用、効果についてまとめてみると、次の如く述べること
ができる。(A) 700 to 1,100 molecular weight (b) Poorly soluble or insoluble in 80% or more aqueous ethanol solution Insoluble in anhydrous ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether, ether (c) Molsch reaction: Positive (d) Ninhydrin reaction: Positive Further, the actions and effects of the kudin-derived cell activator of the present invention can be summarized as follows.
細胞の生着率を促進し、細胞の死滅を防止することが
できる。It can promote cell engraftment and prevent cell death.
又、第１表に示した如く、細胞のコロニー形成率を促
進（増殖）することができる。In addition, as shown in Table 1, the cell colony formation rate can be promoted (proliferated).
よって、その利用分野は、例えば、組織培養促進剤と
しての利用、あるいは医薬品、化粧品等においては、潰
瘍部、又は外傷部の再生治癒の促進剤として、あるい
は、細胞賦活剤として用いるが出来る。Therefore, the field of application can be used, for example, as a tissue culture promoter, or in a pharmaceutical or cosmetic product, as a promoter of regeneration and healing of an ulcer or a wound, or as a cell activator.
第１図は、本発明による実施例１の製造工程中に得られ
たクジン由来細胞賦活物質のゲルろ過による溶出図であ
る。 第２図は、本発明の実施例１によって得られたクジン由
来細胞賦活物質の分子量測定に当って、標準物質を用い
て作成した、分子量とKav値による検量線である。 第２図中、Ａはポリエチレングリコール1000（平均分子
量1000）、Ｂはポリエチレングリコール4000（平均分子
量3000）。FIG. 1 is an elution diagram by gel filtration of a kudin-derived cell activator obtained during the production process of Example 1 according to the present invention. FIG. 2 is a calibration curve based on the molecular weight and the Kav value prepared using a standard substance in the measurement of the molecular weight of the kudin-derived cell activator obtained in Example 1 of the present invention. In FIG. 2, A is polyethylene glycol 1000 (average molecular weight 1000), and B is polyethylene glycol 4000 (average molecular weight 3000).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−9731（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−50877（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−303914（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−135409（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−178910（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−15809（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−5007（ＪＰ，Ａ) 特公 昭42−7279（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭38−20591（ＪＰ，Ｂ１) 赤松金芳著、「新訂 和漢薬」、医歯 薬出版株式会社、昭和55年10月15日、第 １版第５刷発行、ｐ．339−341 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 35/78 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-51-9731 (JP, A) JP-A-64-50877 (JP, A) JP-A-63-303914 (JP, A) JP-A-62 135409 (JP, A) JP-A-61-178910 (JP, A) JP-A-61-15809 (JP, A) JP-A-61-5007 (JP, A) JP-B-42-7279 (JP, B1) Japanese Patent Publication No. 38-20591 (JP, B1) by Kanayoshi Akamatsu, "New Edition Wakan Yaku", Ito Yakuhin Publishing Co., Ltd., October 15, 1980, 1st edition, 5th printing, p. 339-341 (58) Field surveyed (Int. Cl. 6 , DB name) A61K 35/78
Claims (1)
〜（ｄ）の物性を示す水溶性成分を有効成分とする繊維
芽細胞又は上皮細胞賦活剤 （ａ）分子量700〜1,100 （ｂ）80％以上のエタノール水溶液に難溶乃至不溶 無水エタノール,n−ブタノール，酢酸エチル，クロロホ
ルム，石油エーテル，エーテルには不溶 （ｃ）モーリッシュ（Molisch）反応：陽性 （ｄ）ニンヒドリン（Ninhydrin）反応：陽性(1) The following (a) obtained from leguminous plant kujin:
(D) a fibroblast or epithelial cell activator containing a water-soluble component having the physical properties of (d) as an active ingredient; (a) a molecular weight of 700 to 1,100 (b) a sparingly soluble or insoluble anhydrous ethanol, n- Insoluble in butanol, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether, ether (c) Molisch reaction: positive (d) Ninhydrin reaction: positive
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