JP2873236B2 - ヒドロキシ酸の製法 - Google Patents
ヒドロキシ酸の製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、非常に高い鏡像異性純度、例えば99％ee
（鏡像異性超過量）の範囲、好ましくは99.6％eeを上廻
るそれを有している、 次式（Ｉ）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＲ−
鏡像体（エナンチオマー）： 又は次式（II）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の
Ｓ−鏡像体： を調製するための方法に係り、また、この本発明方法
は、電子供与体、例えばニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD（Ｈ））、及び該電子供与体を再生させ
るための酵素／基質系、例えばホルマートデヒドロゲナ
ーゼ（FDH）／ホルマートの存在下において、それぞ
れ、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由
来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−LDH）又はウ
シ心臓由来の酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−LD
H）で２−オキソ−４−フェニル酪酸を還元することを
含んでなる。前記式（Ｉ）のＲ−２−ヒドロキシ−４−
フェニル酪酸の製法は、好ましくは、電子供与体、例え
ばNAD（Ｈ）、及び該電子供与体を再生させるための酵
素／基質系、例えばホルマートデヒドロゲナーゼ（FD
H）／ホルマートの存在下において、表皮ブドウ球菌（S
taphylococcus epidermidis）由来の酵素であるＤ−乳
酸脱水素酵素（Ｄ−LDH）を用いて行われる。本発明方
法は、好ましくは酵素膜反応器内で連続的な酵素変換を
行うのにとりわけ適している。
（鏡像異性超過量）の範囲、好ましくは99.6％eeを上廻
るそれを有している、 次式（Ｉ）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＲ−
鏡像体（エナンチオマー）： 又は次式（II）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の
Ｓ−鏡像体： を調製するための方法に係り、また、この本発明方法
は、電子供与体、例えばニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD（Ｈ））、及び該電子供与体を再生させ
るための酵素／基質系、例えばホルマートデヒドロゲナ
ーゼ（FDH）／ホルマートの存在下において、それぞ
れ、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由
来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−LDH）又はウ
シ心臓由来の酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−LD
H）で２−オキソ−４−フェニル酪酸を還元することを
含んでなる。前記式（Ｉ）のＲ−２−ヒドロキシ−４−
フェニル酪酸の製法は、好ましくは、電子供与体、例え
ばNAD（Ｈ）、及び該電子供与体を再生させるための酵
素／基質系、例えばホルマートデヒドロゲナーゼ（FD
H）／ホルマートの存在下において、表皮ブドウ球菌（S
taphylococcus epidermidis）由来の酵素であるＤ−乳
酸脱水素酵素（Ｄ−LDH）を用いて行われる。本発明方
法は、好ましくは酵素膜反応器内で連続的な酵素変換を
行うのにとりわけ適している。
前記式（Ｉ）のＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸は、ACE（アンギオテンシン変換酵素）抑制剤又はそ
の前駆体を調製する場合の貴重な中間体である。また、
前記式（II）のＳ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
は異性体化合物の調製に用いられる。
酸は、ACE（アンギオテンシン変換酵素）抑制剤又はそ
の前駆体を調製する場合の貴重な中間体である。また、
前記式（II）のＳ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
は異性体化合物の調製に用いられる。
〔従来の技術〕 立体特異性微生物還元によってカイラル化合物を製造
することは公知である（概論として、Simonet al,Ange
w.Chemie 97,541,1985を参照されたい）。生物触媒とし
て、微生物そのもの、例えば菌類（例えばムコール、ゲ
オトリクム、サッカロミセス、カンジダ）又はバクテリ
ア類（プロテウス、プソイドモナス）が屡々用いられて
いる。また、微生物摘出物を使用することも可能であ
る。電子供与体は、例えば、炭水化物（例えばグルコー
ス、ホルマート、エタノール、水素又は電気化学電池用
のカソードである。基質の還元は、いわゆるファイナル
レダクターゼ（還元酵素）によって、例えば基質−特異
的脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）によって行われる。
ファイナルレダクターゼによって要求される還元当量
は、一般に、補酵素（コエンチーム）によって、例えば
ピリジンヌクレオチド、例えばNADH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）及びNADPH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート）によって、あるい
はフラビンヌクレオチド、例えばFMNH（フラビンモノヌ
クレオチド）及びFADH（フラビンアデニンジヌクレオチ
ド）によって、もたらされる。さらに、還元されたヌク
レオチドは、通常、一連の酵素触媒工程（競争電子受容
体がこれらの工程において形成される）において製造さ
れるか、さもなければ、天然もしくは合成のメディエタ
（例えばフェレドキシン、ビオロゲン）による電子移動
によって製造される。さらにまた、メディエタから直接
に電子を受け取ることができるファイナルレダクターゼ
も知られている。 生物触媒として、精製した酵素類、
すなわち分離したレダクターゼもまた適当である。この
ような場合には、一般に、還元されたピリジンヌクレオ
チド又はフラビンヌクレオチドを添加することが必要で
ある。さらに必要なものとしては、補酵素の酵素再生に
有効な系、すなわち、第２の酵素とその基質がある。Ya
mazaki及びMaeda（Agricol.Biol.Chem.50,2621,1986）
は、ベンゾイルホルマートからＲ−（−）−マンデル酸
を合成するためのものであって、NADH及び糞便連鎖球菌
（Streptococcus faecalis）由来のベンゾイルホルマー
トデヒドロゲナーゼの助けによりこれを行うバッチ法を
記載している。この方法もまたバイオリアクタ内で連続
的に実施することができ、かつ、その際、ホルマートデ
ヒドロゲナーゼ及びホルマートを用いて補酵素の再生を
行うことができる（Yamazaki及びMaeda,Agricol.Biol.C
hem.50,3213,1986）。欧州特許第EP0024547号明細書に
は、酵素膜反応器内において水溶性α−ケトカルボン酸
を連続的に酵素変換して対応のα−ヒドロキジカルボン
酸に変えるための方法が記載されている。この変換は、
NAD（Ｈ）（ポリエチレングリコールに結合させること
によって分子量を増大させておく）の存在下において、
かつ乳酸脱水素酵素の存在下において、同時にホルマー
トデヒドロゲナーゼ及びホルマートによるNADH再生を行
うことによって、実施することができる。
することは公知である（概論として、Simonet al,Ange
w.Chemie 97,541,1985を参照されたい）。生物触媒とし
て、微生物そのもの、例えば菌類（例えばムコール、ゲ
オトリクム、サッカロミセス、カンジダ）又はバクテリ
ア類（プロテウス、プソイドモナス）が屡々用いられて
いる。また、微生物摘出物を使用することも可能であ
る。電子供与体は、例えば、炭水化物（例えばグルコー
ス、ホルマート、エタノール、水素又は電気化学電池用
のカソードである。基質の還元は、いわゆるファイナル
レダクターゼ（還元酵素）によって、例えば基質−特異
的脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）によって行われる。
ファイナルレダクターゼによって要求される還元当量
は、一般に、補酵素（コエンチーム）によって、例えば
ピリジンヌクレオチド、例えばNADH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）及びNADPH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート）によって、あるい
はフラビンヌクレオチド、例えばFMNH（フラビンモノヌ
クレオチド）及びFADH（フラビンアデニンジヌクレオチ
ド）によって、もたらされる。さらに、還元されたヌク
レオチドは、通常、一連の酵素触媒工程（競争電子受容
体がこれらの工程において形成される）において製造さ
れるか、さもなければ、天然もしくは合成のメディエタ
（例えばフェレドキシン、ビオロゲン）による電子移動
によって製造される。さらにまた、メディエタから直接
に電子を受け取ることができるファイナルレダクターゼ
も知られている。 生物触媒として、精製した酵素類、
すなわち分離したレダクターゼもまた適当である。この
ような場合には、一般に、還元されたピリジンヌクレオ
チド又はフラビンヌクレオチドを添加することが必要で
ある。さらに必要なものとしては、補酵素の酵素再生に
有効な系、すなわち、第２の酵素とその基質がある。Ya
mazaki及びMaeda（Agricol.Biol.Chem.50,2621,1986）
は、ベンゾイルホルマートからＲ−（−）−マンデル酸
を合成するためのものであって、NADH及び糞便連鎖球菌
（Streptococcus faecalis）由来のベンゾイルホルマー
トデヒドロゲナーゼの助けによりこれを行うバッチ法を
記載している。この方法もまたバイオリアクタ内で連続
的に実施することができ、かつ、その際、ホルマートデ
ヒドロゲナーゼ及びホルマートを用いて補酵素の再生を
行うことができる（Yamazaki及びMaeda,Agricol.Biol.C
hem.50,3213,1986）。欧州特許第EP0024547号明細書に
は、酵素膜反応器内において水溶性α−ケトカルボン酸
を連続的に酵素変換して対応のα−ヒドロキジカルボン
酸に変えるための方法が記載されている。この変換は、
NAD（Ｈ）（ポリエチレングリコールに結合させること
によって分子量を増大させておく）の存在下において、
かつ乳酸脱水素酵素の存在下において、同時にホルマー
トデヒドロゲナーゼ及びホルマートによるNADH再生を行
うことによって、実施することができる。
酵素反応において決定的に重要なこととして、用いら
れる酵素の性質及び由来、すなわち、この場合にはファ
イナルレダクターゼあるいは基質−特異な脱水素酵素が
ある。ここで注意しなければならないこととして、同じ
タイプの酵素であったとしても、それらの酵素が異なる
生成源、例えば異なる微生物から分離されたものである
とすると、それらの酵素の生理学的挙動はいろいろに変
化可能である。差違が存在するのは、例えば反応の特異
性、基質の特異性と立体特異性、そして運動ファクタ、
例えばMichaelis-Menten定数及び抑制定数のような生物
変換のための決定的ファクタに関してである（先に引用
のSimon et al）。例えば、すでに知られている文献か
らのデータを比較すると、乳酸肝菌（Lactobacillus co
nfusus）由来のＤ−乳酸脱水素酵素はピルバート、２−
ケトブチラート及びフェニルピルバートを変換するけれ
ども、この酵素は、しかし、２−ケトバレレート、２−
ケトカプロエート及び２−ケト−３−メチルバレレート
を還元しないということが明らかとなるであろう。個々
の酵素／基質系の挙動は、そのために、それぞれのケー
スごとに試験しなければならずかつ、前記BP0024547は
この結論を指摘しているというものの、一般化によって
予測することはできない。
れる酵素の性質及び由来、すなわち、この場合にはファ
イナルレダクターゼあるいは基質−特異な脱水素酵素が
ある。ここで注意しなければならないこととして、同じ
タイプの酵素であったとしても、それらの酵素が異なる
生成源、例えば異なる微生物から分離されたものである
とすると、それらの酵素の生理学的挙動はいろいろに変
化可能である。差違が存在するのは、例えば反応の特異
性、基質の特異性と立体特異性、そして運動ファクタ、
例えばMichaelis-Menten定数及び抑制定数のような生物
変換のための決定的ファクタに関してである（先に引用
のSimon et al）。例えば、すでに知られている文献か
らのデータを比較すると、乳酸肝菌（Lactobacillus co
nfusus）由来のＤ−乳酸脱水素酵素はピルバート、２−
ケトブチラート及びフェニルピルバートを変換するけれ
ども、この酵素は、しかし、２−ケトバレレート、２−
ケトカプロエート及び２−ケト−３−メチルバレレート
を還元しないということが明らかとなるであろう。個々
の酵素／基質系の挙動は、そのために、それぞれのケー
スごとに試験しなければならずかつ、前記BP0024547は
この結論を指摘しているというものの、一般化によって
予測することはできない。
本発明の目的は、２−オキソ−４−フェニル酪酸の鏡
像選択的酵素還元によって、高度の鏡像異性純度を有し
ている２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＲ−及びＳ
−鏡像体を調製するための有効な方法を見い出すことに
ある。この物質は、α−ケトカルボン酸の酵素還元に係
る従来技術のなかにおいて基質として記載されておらず
かつ、したがって、酵素還元におけるその適応性及び挙
動が研究されていない。
像選択的酵素還元によって、高度の鏡像異性純度を有し
ている２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＲ−及びＳ
−鏡像体を調製するための有効な方法を見い出すことに
ある。この物質は、α−ケトカルボン酸の酵素還元に係
る従来技術のなかにおいて基質として記載されておらず
かつ、したがって、酵素還元におけるその適応性及び挙
動が研究されていない。
Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の調製に関し
て、上記した目的を達成するのに特に適当であることが
判明した方法は、電子供与件及び該電子供与体を再生さ
せるための酵素／基質系の存在下において表皮ブドウ球
菌（Staphylococcus epidermidis）由来の酵素、Ｄ−乳
酸脱水素酵素で基質を還元する方法である。なぜなら、
その他の微生物由来の乳酸脱水素酵素と比較して、前記
表皮ブドウ球菌由来のＤ−LDHは、用いられる基質に関
しての高い比活性（変換された基質1mg当りの単位数あ
るいは蛋白質のmg数Ｘ分当りの変換量μモル）によって
特に区別され（第１表を参照）、そして高い鏡像選択性
を有するからである。同じ理由から、基質をウシ心臓由
来の酵素、Ｌ−乳酸脱水素酵素で還元するタイプの同様
な方法は、Ｓ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を調
製するのにとりわけ適当である。これらの両方の方法に
ついて、特に酵素膜反応器内における連続的な反応プロ
セスが有利である。
て、上記した目的を達成するのに特に適当であることが
判明した方法は、電子供与件及び該電子供与体を再生さ
せるための酵素／基質系の存在下において表皮ブドウ球
菌（Staphylococcus epidermidis）由来の酵素、Ｄ−乳
酸脱水素酵素で基質を還元する方法である。なぜなら、
その他の微生物由来の乳酸脱水素酵素と比較して、前記
表皮ブドウ球菌由来のＤ−LDHは、用いられる基質に関
しての高い比活性（変換された基質1mg当りの単位数あ
るいは蛋白質のmg数Ｘ分当りの変換量μモル）によって
特に区別され（第１表を参照）、そして高い鏡像選択性
を有するからである。同じ理由から、基質をウシ心臓由
来の酵素、Ｌ−乳酸脱水素酵素で還元するタイプの同様
な方法は、Ｓ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を調
製するのにとりわけ適当である。これらの両方の方法に
ついて、特に酵素膜反応器内における連続的な反応プロ
セスが有利である。
高い鏡像選択性を有している基質−特異的脱水素酵素
としての表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidi
s）由来のＤ−LDHを基質としての２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸と組み合わせると、高い生産性値、良好な空時
収量、そしてその結果として、大規模で実施される酵素
変換において非常に重要でありかつかなり経済的の利点
となる安価の保証が得られる。
としての表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidi
s）由来のＤ−LDHを基質としての２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸と組み合わせると、高い生産性値、良好な空時
収量、そしてその結果として、大規模で実施される酵素
変換において非常に重要でありかつかなり経済的の利点
となる安価の保証が得られる。
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由来
のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水
素酵素のために用いられる電子供与体は、好ましくは、
その還元された形にある補酵素、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH）であり、また、この補酵素
は、Ｄ−又はＬ−LDHによってNADに酸化せしめられる。
この補酵素の再生のため、NADH−リサイクル酵素とその
基質、例えばホルマート、エタノール、イソプロパノー
ル、シクロヘキサノール、その他からなる酵素／基質系
が用いられる。ホルマートデヒドロゲナーゼ（FDH）／
ホルマート系であってそのホルマートとして蟻酸の塩、
例えばアルカリ金属ホルマート、例えばカリウム又はナ
トリウムホルマートを使用したもの、あるいはアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ADH）／エタノール系が有利であ
る。これらの系を使用すると、副産物として、それぞれ
CO2/HCO3 -及びアセトアルデヒドが生成せしめられる。
のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水
素酵素のために用いられる電子供与体は、好ましくは、
その還元された形にある補酵素、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH）であり、また、この補酵素
は、Ｄ−又はＬ−LDHによってNADに酸化せしめられる。
この補酵素の再生のため、NADH−リサイクル酵素とその
基質、例えばホルマート、エタノール、イソプロパノー
ル、シクロヘキサノール、その他からなる酵素／基質系
が用いられる。ホルマートデヒドロゲナーゼ（FDH）／
ホルマート系であってそのホルマートとして蟻酸の塩、
例えばアルカリ金属ホルマート、例えばカリウム又はナ
トリウムホルマートを使用したもの、あるいはアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ADH）／エタノール系が有利であ
る。これらの系を使用すると、副産物として、それぞれ
CO2/HCO3 -及びアセトアルデヒドが生成せしめられる。
本発明方法によると、生成物であるＲ−又はＳ−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が高度の鏡像異性純度で
もって得られる。ここで、“高度の鏡像異性純度”なる
記載は、それを本願明細書において用いた場合、問題と
している鏡像体がその他の鏡像体との混合物中で最低98
％ee、好ましくは99％eeを上廻って存在していることを
意味する。
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が高度の鏡像異性純度で
もって得られる。ここで、“高度の鏡像異性純度”なる
記載は、それを本願明細書において用いた場合、問題と
している鏡像体がその他の鏡像体との混合物中で最低98
％ee、好ましくは99％eeを上廻って存在していることを
意味する。
バッチ法では、基質である２−オキソ−４−フェニル
酪酸の例えばそのカリウム又はナトリウム塩の形をした
ものの500mMまでの濃度の、例えば20〜200mMの、好まし
くは50mMの濃度の水溶液を、変換が完結するまでの間、
0.01〜10mM、好ましくは約0.1mMの濃度の補酵素であるN
AD（Ｈ）、100−1200mM、好ましくは約300mMの濃度のNA
DH−リサイクル酵素、例えばアルコールデヒドロゲナー
ゼ又はホルマートデヒドロゲナーゼ、及びそれぞれエタ
ノール又はホルマート、そして表皮ブドウ球菌（Staphy
lococcus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又は
ウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素と攪拌しながらイン
キュベーションする。酵素は、有利には、NADH−リサイ
クル酵素の活性と基質−特異の脱水素酵素の活性の比が
1:0.1〜1:5であるような量でもって用いられる。反応混
合物は、酵素反応に通常用いられているように、pH6〜
９の範囲のpH値、例えばpH8.4を有している。反応温度
は20〜40℃、好ましくは室温のあたりである。生成物
は、反応混合物から、酸、例えば鉱酸、例えば塩酸など
を添加することによって結晶化させる。
酪酸の例えばそのカリウム又はナトリウム塩の形をした
ものの500mMまでの濃度の、例えば20〜200mMの、好まし
くは50mMの濃度の水溶液を、変換が完結するまでの間、
0.01〜10mM、好ましくは約0.1mMの濃度の補酵素であるN
AD（Ｈ）、100−1200mM、好ましくは約300mMの濃度のNA
DH−リサイクル酵素、例えばアルコールデヒドロゲナー
ゼ又はホルマートデヒドロゲナーゼ、及びそれぞれエタ
ノール又はホルマート、そして表皮ブドウ球菌（Staphy
lococcus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又は
ウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素と攪拌しながらイン
キュベーションする。酵素は、有利には、NADH−リサイ
クル酵素の活性と基質−特異の脱水素酵素の活性の比が
1:0.1〜1:5であるような量でもって用いられる。反応混
合物は、酵素反応に通常用いられているように、pH6〜
９の範囲のpH値、例えばpH8.4を有している。反応温度
は20〜40℃、好ましくは室温のあたりである。生成物
は、反応混合物から、酸、例えば鉱酸、例えば塩酸など
を添加することによって結晶化させる。
連続反応法の場合には、用いられる酵素を固定化する
のが一般的である。酵素は、例えば、重合体マトリック
ス中に包括したり、半透膜からなるカプセル又は繊維内
に包括したりあるいは限外濾過膜によって包括したりす
ることができ、さもなければ、２官能性又は多官能性の
試薬で架橋化したりすることができ、さもなければ、吸
着によって、あるいは無機物質からなるかもしくは天然
又は合成の重合体からなる担体に対するイオン結合又は
共有結合によって固定したりすることができる。この連
続方法のため、いろいろなタイプのバイオリアクタ、例
えば撹拌式反応器、固定床式反応器、流動床式反応器又
は膜反応器を使用することができる（概論として、Hart
meier,“Immobilisierte Biokatalysatoren",Berlin 19
86を参照されたい）。
のが一般的である。酵素は、例えば、重合体マトリック
ス中に包括したり、半透膜からなるカプセル又は繊維内
に包括したりあるいは限外濾過膜によって包括したりす
ることができ、さもなければ、２官能性又は多官能性の
試薬で架橋化したりすることができ、さもなければ、吸
着によって、あるいは無機物質からなるかもしくは天然
又は合成の重合体からなる担体に対するイオン結合又は
共有結合によって固定したりすることができる。この連
続方法のため、いろいろなタイプのバイオリアクタ、例
えば撹拌式反応器、固定床式反応器、流動床式反応器又
は膜反応器を使用することができる（概論として、Hart
meier,“Immobilisierte Biokatalysatoren",Berlin 19
86を参照されたい）。
本発明のEMRプロセス（酵素膜反応器内の連続法）に
おいて、用いられる反応容器は、好ましくは、用いられ
る酵素と変換に必要な補酵素を保持するけれども低分子
量の生成物及び未変換の基質を通過せしめる限外濾過膜
を装備した膜反応器である。膜反応器の大きな利点とし
ては、生物触媒を自然な形で、すなわち、未変性の形で
使用することができ、かつ別法で必要であった固定化の
ための定着工程（この工程は通常不活性化作用を有し
た）を実施することが不必要であるということがある。
酵素膜反応器は、例えば、フラット膜（チャンバ膜）反
応器あるいは中空繊維膜反応器であることができる。基
質を、例えば計量ポンプによって反応室に供給し、反応
混合物を撹拌するかもしくはポンプ１で循環させ、そし
て膜を通過した生成物含有の濾液の流れを引き抜く。本
発明の目的に用いられる膜は、好ましくは、5000〜1000
00ダルトン、例えば10000〜100000ダルトンの公称排斥
限度（nominal exclusion limit）を有するものであ
る。これらの膜に適当な材料は、例えば、アセチルセル
ロース、ポリアミド、ポリスルホン又は変性ポリビニル
アルコールである。反応に含まれる酵素が膜上に吸着せ
しめられるのを防止するため、その膜に非特異性蛋白
質、例えばウシ血清アルブミンを予備被覆することがで
きる。
おいて、用いられる反応容器は、好ましくは、用いられ
る酵素と変換に必要な補酵素を保持するけれども低分子
量の生成物及び未変換の基質を通過せしめる限外濾過膜
を装備した膜反応器である。膜反応器の大きな利点とし
ては、生物触媒を自然な形で、すなわち、未変性の形で
使用することができ、かつ別法で必要であった固定化の
ための定着工程（この工程は通常不活性化作用を有し
た）を実施することが不必要であるということがある。
酵素膜反応器は、例えば、フラット膜（チャンバ膜）反
応器あるいは中空繊維膜反応器であることができる。基
質を、例えば計量ポンプによって反応室に供給し、反応
混合物を撹拌するかもしくはポンプ１で循環させ、そし
て膜を通過した生成物含有の濾液の流れを引き抜く。本
発明の目的に用いられる膜は、好ましくは、5000〜1000
00ダルトン、例えば10000〜100000ダルトンの公称排斥
限度（nominal exclusion limit）を有するものであ
る。これらの膜に適当な材料は、例えば、アセチルセル
ロース、ポリアミド、ポリスルホン又は変性ポリビニル
アルコールである。反応に含まれる酵素が膜上に吸着せ
しめられるのを防止するため、その膜に非特異性蛋白
質、例えばウシ血清アルブミンを予備被覆することがで
きる。
膜反応器内の反応混合物は、NADH−リサイクル酵素、
例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又は好ましくはホル
マートデヒドロゲナーゼ、表皮ブトウ球菌（Staphyloco
ccus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ
心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素、そしてNAD（Ｈ）を含
有する。NADH−リサイクル酵素は、有利には、NADH−リ
サイクル酵素の活性と基質−特異的脱水素酵素の比が1:
0.1〜1:5となるような量でもって用いられる。必要な補
酵素は、その分子量が増大せしめられていないNAD
（Ｈ）、すなわち、自然のNAD（Ｈ）の形で用いられ、
また、その使用濃度は0.01〜10mM、好ましくは約0.1mM
である。本発明方法では酵素膜反応器内において自然の
NAD（Ｈ）を使用することもまた可能であるということ
は、前記EP0024547に記載される従来技術に較べて明り
ょうな利点である。ちなみに、前記EP0024547では分子
量の増大のためにポリエチレングリコールに結合せしめ
られたNAD（Ｈ）を使用することが特定されている。こ
の結合は、しかし、酵素活性のロスを生じることが可能
である。例えば、補酵素として、自然のNAD（Ｈ）では
なくてそれに対照的なPEG−NAD（Ｈ）を使用した場合、
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由来の
Ｄ−乳酸脱水素酵素の活性がきびしく制限され、そのた
めに、Ｖmax値、すなわち、最高反応速度はほんの2.6単
位/mgであり、これとは対照的に、自然のNAD（Ｈ）のそ
れは26単位/mgである。もしもPEG−NAD（Ｈ）を使用し
た連続プロセスにおいて適当な基質変換速度が達成され
るべきであるならば、そのために、EMR内においてほば1
0倍量の酵素を使用することが必要であり、結果として
製造コストの急激な増大がある。限外濾過膜は、例え
ば、分子量20000のポリエチレングリコールに結合せし
めることによってその分子量の増大をはかったNAD
（Ｈ）を限外濾過膜の背後で有効に保持するため、1000
0ダルトンの最大排斥限度を有してもよい。他方におい
て、触媒量の自然のNAD（Ｈ）を基質の流れの中で使用
する場合、膜の排斥限度は酵素のサイズによってのみ定
められる。そのために、反応器の運転時間を制限する反
応器内の高圧力を避けることができるようにするため、
5000〜100000ダルトンの排斥限度を有する膜を使用する
ことが可能である。また、自然のNAD（Ｈ）使用時の低
圧力に由来して、より小サイズの、かつしたがってより
安価な膜を使用することが、また、より高い処理量を達
成することが、可能である。自然のNAD（Ｈ）を使用し
た場合には、また、500〜2000の範囲内の高サイクル値
も達成される。すなわち、NAD（Ｈ）１分子についてみ
た場合、500〜2000分子のヒドロキシ酸が形成せしめら
れる。本発明方法は、したがって、前記EP0024547に記
載の方法と較べてみた場合、かなりの経済的利点を奏す
ることができる。
例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又は好ましくはホル
マートデヒドロゲナーゼ、表皮ブトウ球菌（Staphyloco
ccus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ
心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素、そしてNAD（Ｈ）を含
有する。NADH−リサイクル酵素は、有利には、NADH−リ
サイクル酵素の活性と基質−特異的脱水素酵素の比が1:
0.1〜1:5となるような量でもって用いられる。必要な補
酵素は、その分子量が増大せしめられていないNAD
（Ｈ）、すなわち、自然のNAD（Ｈ）の形で用いられ、
また、その使用濃度は0.01〜10mM、好ましくは約0.1mM
である。本発明方法では酵素膜反応器内において自然の
NAD（Ｈ）を使用することもまた可能であるということ
は、前記EP0024547に記載される従来技術に較べて明り
ょうな利点である。ちなみに、前記EP0024547では分子
量の増大のためにポリエチレングリコールに結合せしめ
られたNAD（Ｈ）を使用することが特定されている。こ
の結合は、しかし、酵素活性のロスを生じることが可能
である。例えば、補酵素として、自然のNAD（Ｈ）では
なくてそれに対照的なPEG−NAD（Ｈ）を使用した場合、
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由来の
Ｄ−乳酸脱水素酵素の活性がきびしく制限され、そのた
めに、Ｖmax値、すなわち、最高反応速度はほんの2.6単
位/mgであり、これとは対照的に、自然のNAD（Ｈ）のそ
れは26単位/mgである。もしもPEG−NAD（Ｈ）を使用し
た連続プロセスにおいて適当な基質変換速度が達成され
るべきであるならば、そのために、EMR内においてほば1
0倍量の酵素を使用することが必要であり、結果として
製造コストの急激な増大がある。限外濾過膜は、例え
ば、分子量20000のポリエチレングリコールに結合せし
めることによってその分子量の増大をはかったNAD
（Ｈ）を限外濾過膜の背後で有効に保持するため、1000
0ダルトンの最大排斥限度を有してもよい。他方におい
て、触媒量の自然のNAD（Ｈ）を基質の流れの中で使用
する場合、膜の排斥限度は酵素のサイズによってのみ定
められる。そのために、反応器の運転時間を制限する反
応器内の高圧力を避けることができるようにするため、
5000〜100000ダルトンの排斥限度を有する膜を使用する
ことが可能である。また、自然のNAD（Ｈ）使用時の低
圧力に由来して、より小サイズの、かつしたがってより
安価な膜を使用することが、また、より高い処理量を達
成することが、可能である。自然のNAD（Ｈ）を使用し
た場合には、また、500〜2000の範囲内の高サイクル値
も達成される。すなわち、NAD（Ｈ）１分子についてみ
た場合、500〜2000分子のヒドロキシ酸が形成せしめら
れる。本発明方法は、したがって、前記EP0024547に記
載の方法と較べてみた場合、かなりの経済的利点を奏す
ることができる。
さらに加えて、例えばそのカリウム又はナトリウム塩
の形をした２−オキソ−４−フェニル酪酸の水溶液は、
基質として、反応器に連続的に供給せしめられる。基質
は500mMを上廻らない濃度で存在させるべきであり、20
〜200mMの範囲内、特に約50mMの濃度が有利である。同
じく、ホルマート又はエタノールも100〜1200mMの濃度
で連続的に計量供給せしめられ、また、ホルマートの場
合、約300mMの濃度が好ましい。
の形をした２−オキソ−４−フェニル酪酸の水溶液は、
基質として、反応器に連続的に供給せしめられる。基質
は500mMを上廻らない濃度で存在させるべきであり、20
〜200mMの範囲内、特に約50mMの濃度が有利である。同
じく、ホルマート又はエタノールも100〜1200mMの濃度
で連続的に計量供給せしめられ、また、ホルマートの場
合、約300mMの濃度が好ましい。
反応混合物は、酵素反応の場合に通常行われているよ
うに、pH6〜９の範囲のpH値、例えばpH8.4程度を保有す
る。反応温度は20〜40℃、好ましくは室温付近である。
うに、pH6〜９の範囲のpH値、例えばpH8.4程度を保有す
る。反応温度は20〜40℃、好ましくは室温付近である。
本発明の好ましい１方法は、上記したようなものであ
って、しかも酵素変換が次のような酵素膜反応器内で実
施されるものである： （ａ） 公称排斥限度が例えば5000〜100000ダルトン、
好ましくは10000〜100000ダルトンであって、任意に非
特異性蛋白質、例えばウシ血清アルブミンが予備被覆さ
れている限外濾過膜を装備する。
って、しかも酵素変換が次のような酵素膜反応器内で実
施されるものである： （ａ） 公称排斥限度が例えば5000〜100000ダルトン、
好ましくは10000〜100000ダルトンであって、任意に非
特異性蛋白質、例えばウシ血清アルブミンが予備被覆さ
れている限外濾過膜を装備する。
（ｂ） ホルマートデヒドロゲナーゼ又はアルコールデ
ヒドロゲナーゼ、好ましくはホルマートデヒドロゲナー
ゼ、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由
来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱
水酵素、そして例えば0.01〜1mM、好ましくは約1mMの濃
度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD
（Ｈ））の溶液からなる反応混合物を含有する。
ヒドロゲナーゼ、好ましくはホルマートデヒドロゲナー
ゼ、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由
来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱
水酵素、そして例えば0.01〜1mM、好ましくは約1mMの濃
度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD
（Ｈ））の溶液からなる反応混合物を含有する。
（ｃ） 500mMまでの濃度の、例えば20〜200mM、好まし
くは約50mMの濃度の、例えばそのカリウム又はナトリウ
ム塩の形をした、基質である２−オキソ−４−フェニル
酪酸、そしてそれぞれ例えば100〜1200mM、好ましくは
約300mMの濃度の、ホルマート、例えばカリウム又はナ
トリウムホルマート、又はエタノールの水溶液がこれに
連続的に供給される。
くは約50mMの濃度の、例えばそのカリウム又はナトリウ
ム塩の形をした、基質である２−オキソ−４−フェニル
酪酸、そしてそれぞれ例えば100〜1200mM、好ましくは
約300mMの濃度の、ホルマート、例えばカリウム又はナ
トリウムホルマート、又はエタノールの水溶液がこれに
連続的に供給される。
（ｄ） 形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き
抜かれる。
抜かれる。
Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は、ACE抑制
剤又はその前駆体を調製する場合の貴重な中間体であ
る。近年、このクラスに属する活性物質がますます注目
をあびている。かかる物質は、入手可能な抗高血圧症の
可能性を拡張しかつそれとともに、高血圧のコントロー
ルのための可能な治療法を拡大する。多数の有効なACE
抑制剤において顕著な構造を示すと、次のような部分式
のものである： 上式において、Ｒ2は、水素であるかもしくはすなわ
ちＳ−形状を有する低級アルキル基である。Ｒ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸は公知な手法に従ってACE
抑制剤の調製に用いることができ、また、高度の鏡像異
性純度が達成される（これに関しては、例えば、欧州特
許出願第206993号を参照されたい）。本発明の特に評価
されるべき点は、なかんずく、多数の工程を含むACE抑
制剤の合成時に、その合成の比較的に早い段階において
鏡像異性的に純粋な化合物を使用することが可能である
ことである。このことに関連して特に興味のあるもの
は、ACE抑制剤である１−カルボキシメチル−3S−〔（1
S−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル）アミ
ノ〕−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−
２−オンの調製である。Ｓ−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸は、上記と同様に、ACE抑制剤の鏡像体を調製
するためや毒物学の研究に適している。
剤又はその前駆体を調製する場合の貴重な中間体であ
る。近年、このクラスに属する活性物質がますます注目
をあびている。かかる物質は、入手可能な抗高血圧症の
可能性を拡張しかつそれとともに、高血圧のコントロー
ルのための可能な治療法を拡大する。多数の有効なACE
抑制剤において顕著な構造を示すと、次のような部分式
のものである： 上式において、Ｒ2は、水素であるかもしくはすなわ
ちＳ−形状を有する低級アルキル基である。Ｒ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸は公知な手法に従ってACE
抑制剤の調製に用いることができ、また、高度の鏡像異
性純度が達成される（これに関しては、例えば、欧州特
許出願第206993号を参照されたい）。本発明の特に評価
されるべき点は、なかんずく、多数の工程を含むACE抑
制剤の合成時に、その合成の比較的に早い段階において
鏡像異性的に純粋な化合物を使用することが可能である
ことである。このことに関連して特に興味のあるもの
は、ACE抑制剤である１−カルボキシメチル−3S−〔（1
S−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル）アミ
ノ〕−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−
２−オンの調製である。Ｓ−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸は、上記と同様に、ACE抑制剤の鏡像体を調製
するためや毒物学の研究に適している。
以下に記載する実施例は本発明を説明するためのもの
である。なお、本発明はこれらの実施例の範囲に限定さ
れるものではないことを理解されたい。
である。なお、本発明はこれらの実施例の範囲に限定さ
れるものではないことを理解されたい。
略語の説明 ee……鏡像異性超過量（enantiomeric excess） FDH……ホルマートデヒドロゲナーゼ HPLC……高圧液体クロマトグラフィ ＫI……抑制定数 ＫM……Michaelis−Menten定数 LDH……乳酸脱水素酵素 NADH……ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド rpm……回転／分 Ｕ……酵素活性の単位（規定の反応条件下、1Uでもって
１μモル／分の基質変換が行われる） Ｖmax……最高反応速度 例１ 微生物粗抽出物による２−オキソ−４−フェニル酪酸の
酵素還元 試験菌株を3g/lのＤ−又はＬ−乳酸塩とともに28℃で
３日間、撹拌（250rpm）しながら、200mlの栄養液148
（22g/lのグルコース、5g/lのLab-Lemco牛肉エキス〔Ox
oid〕、5g/lのペプトンＣ、5g/lのイーストエキス、3g/
lのBacto-Casein〔Difco〕、1.5g/lのNaCl、pH6.5）又
は栄養液MV7（2g/lのNH4NO3,1.4g/lのNa2HPO4、0.6g/l
のＫ2HPO4,0.2g/lのMgSO4・7H2O,0.01g/lのCaCl2・2H
2O,0.001g/lのFeSO4・7H2O,1mlの微量元素溶液〔20mg/l
のNa2MoO4,20mg/lのNa2Ｂ4Ｏ7・10H2O,20mg/lのZnSO4・
7H2O,20mg/lのMnSO4・Ｈ2O,20mg/lのCuSO4・5H2Ｏ〕,pH
6.5）中で培養した。細胞を燐酸塩緩衝液（pH7.0）で洗
浄し、Sorvall社の遠心分離機、Rotor SS34中で遠心分
離（20分間、20000rpm）することによって収穫した。次
いで、これらの細胞をUltrasonics社製のCelldistruper
W−375中で375Wで45分間にわたって超音波処理するこ
とによって、４℃で分裂させた。もう１度遠心分離を行
った後、酵素の粗抽出物を28℃の次のような試験混合物
中の基質ともども、撹拌しながら、３〜５日間にわたっ
て（変換が完結するまで）インキュベーションに供し
た： 5ml 遠心分離上澄み液（粗抽出物） 20ml 燐酸塩緩衝液、pH7（0.069M） 3g/l ２−オキソ−４−フェニル酪酸 18g/l エタノール 1g/l NAD（Ｈ） 100U イーストアルコールデヒドロゲナーゼ（Boeh
ringer） 反応の完結時、溶液に2N塩酸を加えてそのpH値をpH2
に調節した。晶出した生成物を酢酸エチルで抽出した。
溶媒を留去し、そして残渣を真空中で乾燥した。試験に
供した微生物抽出物に応じて鏡像異性純度を異にする結
晶の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が得られた。
１μモル／分の基質変換が行われる） Ｖmax……最高反応速度 例１ 微生物粗抽出物による２−オキソ−４−フェニル酪酸の
酵素還元 試験菌株を3g/lのＤ−又はＬ−乳酸塩とともに28℃で
３日間、撹拌（250rpm）しながら、200mlの栄養液148
（22g/lのグルコース、5g/lのLab-Lemco牛肉エキス〔Ox
oid〕、5g/lのペプトンＣ、5g/lのイーストエキス、3g/
lのBacto-Casein〔Difco〕、1.5g/lのNaCl、pH6.5）又
は栄養液MV7（2g/lのNH4NO3,1.4g/lのNa2HPO4、0.6g/l
のＫ2HPO4,0.2g/lのMgSO4・7H2O,0.01g/lのCaCl2・2H
2O,0.001g/lのFeSO4・7H2O,1mlの微量元素溶液〔20mg/l
のNa2MoO4,20mg/lのNa2Ｂ4Ｏ7・10H2O,20mg/lのZnSO4・
7H2O,20mg/lのMnSO4・Ｈ2O,20mg/lのCuSO4・5H2Ｏ〕,pH
6.5）中で培養した。細胞を燐酸塩緩衝液（pH7.0）で洗
浄し、Sorvall社の遠心分離機、Rotor SS34中で遠心分
離（20分間、20000rpm）することによって収穫した。次
いで、これらの細胞をUltrasonics社製のCelldistruper
W−375中で375Wで45分間にわたって超音波処理するこ
とによって、４℃で分裂させた。もう１度遠心分離を行
った後、酵素の粗抽出物を28℃の次のような試験混合物
中の基質ともども、撹拌しながら、３〜５日間にわたっ
て（変換が完結するまで）インキュベーションに供し
た： 5ml 遠心分離上澄み液（粗抽出物） 20ml 燐酸塩緩衝液、pH7（0.069M） 3g/l ２−オキソ−４−フェニル酪酸 18g/l エタノール 1g/l NAD（Ｈ） 100U イーストアルコールデヒドロゲナーゼ（Boeh
ringer） 反応の完結時、溶液に2N塩酸を加えてそのpH値をpH2
に調節した。晶出した生成物を酢酸エチルで抽出した。
溶媒を留去し、そして残渣を真空中で乾燥した。試験に
供した微生物抽出物に応じて鏡像異性純度を異にする結
晶の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が得られた。
結晶の形をした酸を無水エタノールに溶解し、そして
塩化水素ガスと室温で24時間にわたって反応させた。ア
ルコールを留去しかつ高度の真空下に手早く脱ガスを行
った後、淡黄色の油状物が残留した。次いでこの油状物
をカイラルカラム（250×4.6mm内径、処理量/1ml/分、
固定相Chiralcel OD〔Stehelin社、Basle在〕タイプOD
−５−15−20925、移動相90％ヘキサン−10％イソプロ
パノール−0.1％ジエチルアミン）上で25℃/32バールで
HPLCによって分析した。被分析物質を1mg/ml（注入量1m
g/ml）の濃度で溶離剤中に存在させた。走査を210nmの
波長で実施し、そして外部標準との表面積比較により評
価を行った。被検微生物抽出物について見出されたee値
を次の第２表に示す。
塩化水素ガスと室温で24時間にわたって反応させた。ア
ルコールを留去しかつ高度の真空下に手早く脱ガスを行
った後、淡黄色の油状物が残留した。次いでこの油状物
をカイラルカラム（250×4.6mm内径、処理量/1ml/分、
固定相Chiralcel OD〔Stehelin社、Basle在〕タイプOD
−５−15−20925、移動相90％ヘキサン−10％イソプロ
パノール−0.1％ジエチルアミン）上で25℃/32バールで
HPLCによって分析した。被分析物質を1mg/ml（注入量1m
g/ml）の濃度で溶離剤中に存在させた。走査を210nmの
波長で実施し、そして外部標準との表面積比較により評
価を行った。被検微生物抽出物について見出されたee値
を次の第２表に示す。
例２ 商業的に人手可能な脱水素酵素による２−オキソ−４−
フェニル酪酸の酵素還元 基質を28℃の次のような試験混合物中の商業的に入手
可能な脱水素酵素ともども、静かに撹拌しながら、３〜
７日間にわたって（変換が完結するまで）インキュベー
ションに供した： 50ml 燐酸塩緩衝液、pH7（0.069M） 3g/l ２−オキソ−４−フェニル酪酸 18g/l エタノール 200U イーストアルコールデヒドロゲナーゼ（Boeh
ringer） 200U 供試酵素（商業的に入手可能な脱水素酵素） 1g/l NAD（Ｈ） Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸又はＳ−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の鏡像異性活性を前記例
１に記載のようにして測定した。結果を次の第３表に示
す。
フェニル酪酸の酵素還元 基質を28℃の次のような試験混合物中の商業的に入手
可能な脱水素酵素ともども、静かに撹拌しながら、３〜
７日間にわたって（変換が完結するまで）インキュベー
ションに供した： 50ml 燐酸塩緩衝液、pH7（0.069M） 3g/l ２−オキソ−４−フェニル酪酸 18g/l エタノール 200U イーストアルコールデヒドロゲナーゼ（Boeh
ringer） 200U 供試酵素（商業的に入手可能な脱水素酵素） 1g/l NAD（Ｈ） Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸又はＳ−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の鏡像異性活性を前記例
１に記載のようにして測定した。結果を次の第３表に示
す。
上記したee値を比較するに、基質の立体特異的還元に
ついてみた場合、分離酵素のほうが微生物粗抽出物に較
べてより適当であること、そしてその理由として、分離
酵素の場合のＲ−又はＳ−２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸の鏡像異性超過量は顕著に大であることがあげら
れること、が判る。選択的酵素では、同じように高いee
値を得るために、精製工程のほかに、粗抽出物からの富
化を行わなければならないであろう。
ついてみた場合、分離酵素のほうが微生物粗抽出物に較
べてより適当であること、そしてその理由として、分離
酵素の場合のＲ−又はＳ−２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸の鏡像異性超過量は顕著に大であることがあげら
れること、が判る。選択的酵素では、同じように高いee
値を得るために、精製工程のほかに、粗抽出物からの富
化を行わなければならないであろう。
例３ 酵素膜反応器（EMR）内における商業的に入手可能な脱
水素酵素による２−オキソ−４−フェニル酪酸の酵素還
元 ２−オキソ−４−フェニル酪酸のＲ−又はＳ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸への連続変換を25℃に保持
しかつ反応器容量が10mlである平滑膜型酵素膜反応器
（EMR）内で実施した。直径62mmの酢酸セルロース限外
濾過膜は、公称排斥限度が10000ダルトンであり、ま
た、50mgのウシ血清アルブミンの予備被覆を保有した。
水素酵素による２−オキソ−４−フェニル酪酸の酵素還
元 ２−オキソ−４−フェニル酪酸のＲ−又はＳ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸への連続変換を25℃に保持
しかつ反応器容量が10mlである平滑膜型酵素膜反応器
（EMR）内で実施した。直径62mmの酢酸セルロース限外
濾過膜は、公称排斥限度が10000ダルトンであり、ま
た、50mgのウシ血清アルブミンの予備被覆を保有した。
最適な反応プロセスの決定は、実験的にもとめられた
酵素運動論の補助の下に分析を行うことによって、すな
わち、基質濃度50,100及び150mMについてのＤ−又はＬ
−乳酸脱水素酵素とホルマートデヒドロゲナーゼの運動
定数（ＫM,KI,Vmax）を測定することによって、そして
反応体の質量バランスの計算によって反応器の挙動のシ
ミュレーションを得ることによって、行った。“Runge
−Kutta−Program"を適用するとともに、パラメータ：
滞留時間、抽出物濃度及び助因子の濃度ならびに酵素の
半減期を変更した（Hoffmann及びHoffmann,“Einfuhrun
g in die Optimierung mit Anwendung−sbeispielen au
s dem Chemie−Ingenieurwesen",Weinheim 1971を参照
されたい）。
酵素運動論の補助の下に分析を行うことによって、すな
わち、基質濃度50,100及び150mMについてのＤ−又はＬ
−乳酸脱水素酵素とホルマートデヒドロゲナーゼの運動
定数（ＫM,KI,Vmax）を測定することによって、そして
反応体の質量バランスの計算によって反応器の挙動のシ
ミュレーションを得ることによって、行った。“Runge
−Kutta−Program"を適用するとともに、パラメータ：
滞留時間、抽出物濃度及び助因子の濃度ならびに酵素の
半減期を変更した（Hoffmann及びHoffmann,“Einfuhrun
g in die Optimierung mit Anwendung−sbeispielen au
s dem Chemie−Ingenieurwesen",Weinheim 1971を参照
されたい）。
基質溶液は、50mMの２−オキソ−４−フェニル酪酸、
300mMの蟻酸カリウム、そして0.1mMのNAD（Ｈ）を含有
した。2.6U/mlのＤ−LDH及び4.8U/mlのFDH又は1.4U/ml
のＬ−LDH及び2.5U/mlのFDHを導入した。この反応溶液
を10ml/hの速度で連続的に反応器にポンプ送入し、そし
てその生成物を膜を介して引き抜いた。反応器内の滞留
時間は、Ｄ−LDHを用いた変換の場合が60分間、そして
Ｌ−LDHを用いた変換の場合が120分間であった。酵素活
性を連続的にモニタリングし、そして必要に応じて、さ
らに添加を行って一定に保持した。
300mMの蟻酸カリウム、そして0.1mMのNAD（Ｈ）を含有
した。2.6U/mlのＤ−LDH及び4.8U/mlのFDH又は1.4U/ml
のＬ−LDH及び2.5U/mlのFDHを導入した。この反応溶液
を10ml/hの速度で連続的に反応器にポンプ送入し、そし
てその生成物を膜を介して引き抜いた。反応器内の滞留
時間は、Ｄ−LDHを用いた変換の場合が60分間、そして
Ｌ−LDHを用いた変換の場合が120分間であった。酵素活
性を連続的にモニタリングし、そして必要に応じて、さ
らに添加を行って一定に保持した。
生成物のデータを次の第４表に示す。
例４ １−カルボキシメチル−3S−〔（1S−エトキシカルボニ
ル−３−フェニルプロピル）アミノ〕−2,3,4,5−テト
ラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オン（ACE抑制
剤）の合成 4.1 Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエ
ステルの合成 5.0gのＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を50ml
の無水エタノールに溶解し、そして室温で24時間にわた
って塩化水素ガスと反応させた。アルコールを留去し、
高真空下に手早く脱ガスを済ませた後、淡黄色の油状物
（5.7g）が残留した。この油状物をカイラルカラム（前
記例１を参照）上でHPLCに従って分析したところ、9
9.8％がＲ−形のエステルであった。0.2％未満がＳ−形
のエステルであった。この油状物を100〜105℃及び6.5
パスカルで蒸留したところ、5.2gの（−）−Ｒ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステル、旋光度▲
〔α〕20 D▼＝−20.8°（クロロホルム中１％）、が得
られた。
ル−３−フェニルプロピル）アミノ〕−2,3,4,5−テト
ラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オン（ACE抑制
剤）の合成 4.1 Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエ
ステルの合成 5.0gのＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を50ml
の無水エタノールに溶解し、そして室温で24時間にわた
って塩化水素ガスと反応させた。アルコールを留去し、
高真空下に手早く脱ガスを済ませた後、淡黄色の油状物
（5.7g）が残留した。この油状物をカイラルカラム（前
記例１を参照）上でHPLCに従って分析したところ、9
9.8％がＲ−形のエステルであった。0.2％未満がＳ−形
のエステルであった。この油状物を100〜105℃及び6.5
パスカルで蒸留したところ、5.2gの（−）−Ｒ−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステル、旋光度▲
〔α〕20 D▼＝−20.8°（クロロホルム中１％）、が得
られた。
4.2 （＋）−Ｒ−２−（４−ニトロベンゼンスルホニ
ルオキシ）−４−フェニル酪酸エチルエステルの合成 9.75g（46.8ミリモル）の（−）−Ｒ−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸エチルエステル（99.6％ee）を
50mlのトルエンに溶解し、11.4gの４−ニトロベンゼン
スルホニルクロリドをこれに添加し、そして次に反応混
合物を０℃まで冷却した。6.25gのトリエチルアミンを
添加した後、反応混合物を30分間をかけて室温まで加温
し、そして混合した。（＋）−Ｒ−２−（４−ニトロベ
ンゼンスルホニルオキシ）−４−フェニル酪酸エチルエ
ステル、旋光度▲〔α〕20 D▼＝＋13.2°（無水エタノ
ール中３％）、が定量的収率で得られた。
ルオキシ）−４−フェニル酪酸エチルエステルの合成 9.75g（46.8ミリモル）の（−）−Ｒ−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸エチルエステル（99.6％ee）を
50mlのトルエンに溶解し、11.4gの４−ニトロベンゼン
スルホニルクロリドをこれに添加し、そして次に反応混
合物を０℃まで冷却した。6.25gのトリエチルアミンを
添加した後、反応混合物を30分間をかけて室温まで加温
し、そして混合した。（＋）−Ｒ−２−（４−ニトロベ
ンゼンスルホニルオキシ）−４−フェニル酪酸エチルエ
ステル、旋光度▲〔α〕20 D▼＝＋13.2°（無水エタノ
ール中３％）、が定量的収率で得られた。
4.3 １−カルボキシメチル−3S−〔（1S−エトキシカ
ルボニル−３−フェニルプロピル）−アミノ〕−2,3,4,
5−テトラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンの合
成 46.1gの３−（Ｓ）−アミノベンズアゼピン−２−オ
ン−１−Ｎ−酢酸tert.−ブチルエステル、84.3gの光学
的に純粋な（99.6％ee）（＋）−Ｒ−２−（４−ニト
ロベンゼンスルホニルオキシ）−４−フェニル酪酸エチ
ルエステル及び19.53gのＮ−メチルモルホリンを溶媒を
使用しないで75〜80℃で９時間にわたって反応させた。
沈殿した４−ニトロベンゼンスルホン酸のＮ−メチルモ
ルホリン塩を250mlの酢酸エチル及び150mlの水を添加す
ることによって溶解し、約150mlの2Nソーダ溶液を加え
ることによってpH8.8に調整し、そして酢酸エチル相を
分離し、水で、さらに２回洗浄した。酢酸エチルを留去
したところ、ジアステレオ異性体の比が最低SS:SR＝99.
8:0.2であることがHPLCから明らかである油状物（98g）
が得られた。
ルボニル−３−フェニルプロピル）−アミノ〕−2,3,4,
5−テトラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンの合
成 46.1gの３−（Ｓ）−アミノベンズアゼピン−２−オ
ン−１−Ｎ−酢酸tert.−ブチルエステル、84.3gの光学
的に純粋な（99.6％ee）（＋）−Ｒ−２−（４−ニト
ロベンゼンスルホニルオキシ）−４−フェニル酪酸エチ
ルエステル及び19.53gのＮ−メチルモルホリンを溶媒を
使用しないで75〜80℃で９時間にわたって反応させた。
沈殿した４−ニトロベンゼンスルホン酸のＮ−メチルモ
ルホリン塩を250mlの酢酸エチル及び150mlの水を添加す
ることによって溶解し、約150mlの2Nソーダ溶液を加え
ることによってpH8.8に調整し、そして酢酸エチル相を
分離し、水で、さらに２回洗浄した。酢酸エチルを留去
したところ、ジアステレオ異性体の比が最低SS:SR＝99.
8:0.2であることがHPLCから明らかである油状物（98g）
が得られた。
粗製の活性物質を調製するため、96gの上記油状物を2
00mlの酢酸エチルに溶解して得た０〜10℃の溶液に54g
の塩化水素ガスを吹き込んだ。tert.−ブチルエステル
のソルボリシスが完了した時、微結晶懸濁液の形をした
活性物質が得られた。酢酸エチルを真空中で繰り返し留
去することによって過剰量の塩化水素を完全に除去し
た。次いで、この高度に濃縮された結晶懸濁液を200ml
のアセトンを加えて希釈し、15℃で濾取し、そしてその
都度50mlの酢酸エチルで２回洗浄した。一定の重量が得
られるまで真空中で60℃で乾燥した後、ジアステレオ異
性体比がSS:SR＝99.9:0.1である実質的に白色である活
性物質62.5g（85.4％）が分離された；▲〔α〕20 D▼＝
−138°（無水エタノール中１％）、融点181℃。
00mlの酢酸エチルに溶解して得た０〜10℃の溶液に54g
の塩化水素ガスを吹き込んだ。tert.−ブチルエステル
のソルボリシスが完了した時、微結晶懸濁液の形をした
活性物質が得られた。酢酸エチルを真空中で繰り返し留
去することによって過剰量の塩化水素を完全に除去し
た。次いで、この高度に濃縮された結晶懸濁液を200ml
のアセトンを加えて希釈し、15℃で濾取し、そしてその
都度50mlの酢酸エチルで２回洗浄した。一定の重量が得
られるまで真空中で60℃で乾燥した後、ジアステレオ異
性体比がSS:SR＝99.9:0.1である実質的に白色である活
性物質62.5g（85.4％）が分離された；▲〔α〕20 D▼＝
−138°（無水エタノール中１％）、融点181℃。
例５ １−カルボキシメチル−3S−〔（1R−エトキシカルボニ
ル−３−フェニルプロピル）−アミノ〕−2,3,4,5−テ
トラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンの合成 前記例４に記載のものと同様な手法に従って、１−カ
ルボキシメチル−3S−〔（1R−エトキシカルボニル−３
−フェニルプロピル）−アミノ〕2,3,4,5−テトラヒド
ロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンをＳ−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸から調製した。
ル−３−フェニルプロピル）−アミノ〕−2,3,4,5−テ
トラヒドロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンの合成 前記例４に記載のものと同様な手法に従って、１−カ
ルボキシメチル−3S−〔（1R−エトキシカルボニル−３
−フェニルプロピル）−アミノ〕2,3,4,5−テトラヒド
ロ−1H−ベンズアゼピン−２−オンをＳ−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸から調製した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス―ペーター シェール スイス国，4147 アエシュ，エグフルベ ーク 11 (72)発明者 エルケ シュミット ドイツ連邦共和国，7800 フライブル ク，コンビクト‐シュトラーセ 10アー (72)発明者 ゴットフリート ゼデルマイアー ドイツ連邦共和国，7801 シャルシュタ ット，エルレンベーク 11 (56)参考文献 国際公開89／7147（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 3/00 - 17/18 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】次式（Ｉ）の２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸のＲ−鏡像体： 又は次式（II）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の
Ｓ−鏡像体： から選ばれるヒドロキシ酸を調製するためのものであっ
て、それぞれ、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epide
rmidis）由来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−LD
H）又はウシ心臓由来の酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素
（Ｌ−LDH）で２−オキソ−４−フェニル酪酸を還元す
ることを含んでなるヒドロキシ酸の製法において、 前記還元を、 （ｉ） 電子供与体としての、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD（Ｈ））、及び （ii） （ａ）ホルマートデヒドロゲナーゼ（FDH）／
ホルマート及び（ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼ（AD
H）／エタノールからなる群から選ばれた、前記電子供
与体を再生させるための酵素／基質系 の存在において実施することを特徴とするヒドロキシ酸
の製法。 - 【請求項２】99.6％ee（鏡像異性超過量）を上廻る鏡像
異性純度で２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を調製す
ることを含んでなる、請求項１に記載の製法。 - 【請求項３】酵素変換を連続的に実施することを含んで
なる、請求項１又は２に記載の製法。 - 【請求項４】酵素変換を酵素膜反応器内で実施すること
を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製
法。 - 【請求項５】酵素変換を、酵素膜反応器であって、 （ａ） 限外濾過膜を有しており、 （ｂ） ホルマートデヒドロゲナーゼ（FDH）又はアル
コールデヒドロゲナーゼ（ADH）、表皮ブドウ球菌（Sta
phylococcus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素
（Ｄ−LDH）又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素
（Ｌ−LDH）、そしてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（NAD（Ｈ））の溶液からなる反応混合物を含有
し、 （ｃ） 基質である２−オキソ−４−フェニル酪酸及び
それぞれホルマート又はエタノールの水溶液がこれに連
続的に供給され、そして （ｄ） 形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き
抜かれる、タイプの反応器内で実施することを含んでな
る、請求項４に記載の製法。 - 【請求項６】酵素変換を、酵素膜反応器であって、 （ａ） 公称排斥限度が5000〜100000ダルトンである限
外濾過膜を有し、 （ｂ） ホルマートデヒドロゲナーゼ（FDH）又はアル
コールデヒドロゲナーゼ（ADH）、表皮ブドウ球菌（Sta
phylococcus epidermidis）由来のＤ−乳酸脱水素酵素
（Ｄ−LDH）又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素
（Ｌ−LDH）、そして0.01〜1mMのニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NAD（Ｈ））の溶液からなる反応混
合物を含有し、 （ｃ） 500mMまでの基質である２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸及びそれぞれ100〜1200mMのホルマート又はエ
タノールの水溶液がこれに連続的に供給され、そして （ｄ） 形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き
抜かれる、タイプの反応器内で実施することを含んでな
る、請求項４又は５に記載の製法。 - 【請求項７】限外濾過膜に非特異性蛋白質が予備被覆さ
れている酵素膜反応器内において酵素変換を実施するこ
とを含んでなる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の
製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH213888 | 1988-06-06 | ||
| CH2138/88-1 | 1988-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0239893A JPH0239893A (ja) | 1990-02-08 |
| JP2873236B2 true JP2873236B2 (ja) | 1999-03-24 |
Family
ID=4226761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1141276A Expired - Lifetime JP2873236B2 (ja) | 1988-06-06 | 1989-06-05 | ヒドロキシ酸の製法 |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0347374B1 (ja) |
| JP (1) | JP2873236B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1336081C (ja) |
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| ES (1) | ES2059817T3 (ja) |
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| PT (1) | PT90747B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE68926389T2 (de) * | 1988-02-08 | 1996-08-14 | Daicel Chem | Verfahren zur herstellung optisch aktiver 2-hydroxy-4-phenylbutansäure |
| US5256552A (en) * | 1988-02-08 | 1993-10-26 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acid |
| US5371014A (en) * | 1988-02-12 | 1994-12-06 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy acid esters using microbes to reduce the 2-oxo precursor |
| US5686275A (en) * | 1991-12-23 | 1997-11-11 | Genzyme Ltd. | Synthesis of homochiral 2-hydroxy acids |
| US5770410A (en) * | 1992-01-30 | 1998-06-23 | Genzyme Corporation | Chiral synthesis with modified enzymes |
| GB9413710D0 (en) * | 1994-07-07 | 1994-08-24 | Genzyme Ltd | Chiral synthesis |
| RU2278612C2 (ru) * | 2000-07-14 | 2006-06-27 | Лайфскен, Инк. | Иммуносенсор |
| CA2426594A1 (en) * | 2000-10-17 | 2002-04-25 | Pcbu Services, Inc. | Production of .alpha.-hydroxy-carboxylic acids using a coupled enzyme system |
| US8067398B2 (en) * | 2005-06-01 | 2011-11-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Biodegradable polymers having a pre-determined chirality |
| JP5312332B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2013-10-09 | カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ | 有機−無機ハイブリッドキラル吸着剤の製造方法およびラセミ混合物の分離方法 |
| CN101302503B (zh) * | 2007-05-08 | 2011-04-06 | 上海医药工业研究院 | 突变的植物乳杆菌d-乳酸脱氢酶及其基因、重组酶和应用 |
| WO2011009849A2 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | Basf Se | Method for preparing optically active hydroxy acid esters |
| KR102485620B1 (ko) * | 2017-03-03 | 2023-01-09 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | Acc 억제제 및 그의 고체 형태를 제조하는 방법 |
| CN109234325A (zh) * | 2017-07-11 | 2019-01-18 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶在不对称合成手性羟基化合物中的应用 |
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| DE2930087A1 (de) * | 1979-07-25 | 1981-02-26 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen umwandlung von wasserloeslichen alpha -ketocarbonsaeuren in die entsprechenden alpha -hydroxycarbonsaeuren |
| US4785089A (en) * | 1985-06-13 | 1988-11-15 | Ciba-Geigy Corporation | Novel sulfonic acid esters and their preparation |
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- 1989-06-02 CA CA000601534A patent/CA1336081C/en not_active Expired - Lifetime
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