JP2799191B2 - 細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法 - Google Patents
細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光試薬をプローブとした蛍光顕微鏡システ
ムを用い、細胞内におけるカルシウムイオン又は水素イ
オン等の２次元濃度分布像を形成する方法に関する。特
に、細胞輪郭に対応する画像を明確に表示し、該細胞輪
郭との間の正確な位置関係において前記イオンの２次元
濃度分布像を表示する方法に関する。
ムを用い、細胞内におけるカルシウムイオン又は水素イ
オン等の２次元濃度分布像を形成する方法に関する。特
に、細胞輪郭に対応する画像を明確に表示し、該細胞輪
郭との間の正確な位置関係において前記イオンの２次元
濃度分布像を表示する方法に関する。
神経科学および細胞生物学の分野において、細胞の代
謝機能を研究するために、生活細胞内部における遊離イ
オンの濃度を定量する方法が最近になって広く用いられ
るようになった。この方法では、被検定物質に対するプ
ローブとして作用し得る好適な蛍光試薬（以下、蛍光プ
ローブという）が生活細胞内に導入され、その蛍光強度
から目的とする化学種の濃度が測定される。この方法に
よって、細胞内のカルシウムイオン、ナトリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、塩素イオン等の種々のイオン
種や、蛋白質または核酸のような巨大分子の定量が行わ
れている。その定量原理は次の通りである。
謝機能を研究するために、生活細胞内部における遊離イ
オンの濃度を定量する方法が最近になって広く用いられ
るようになった。この方法では、被検定物質に対するプ
ローブとして作用し得る好適な蛍光試薬（以下、蛍光プ
ローブという）が生活細胞内に導入され、その蛍光強度
から目的とする化学種の濃度が測定される。この方法に
よって、細胞内のカルシウムイオン、ナトリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、塩素イオン等の種々のイオン
種や、蛋白質または核酸のような巨大分子の定量が行わ
れている。その定量原理は次の通りである。
前記蛍光プローブは、特定の被検定物質と結合するこ
とによって、その蛍光スペクトル又は励起スペクトルが
変化する。しかも、その変化量は被検定物質の濃度によ
って異なる。従って、分光蛍光光度計または蛍光顕微鏡
で蛍光強度を測定すれば、スペクトルの変化から被検定
物質の濃度を定量することができる。例えば、細胞内の
カルシウムイオンを定量する際には、蛍光プローブとし
てfura−２を投与し、カルシウムイオンとの特異的に結
合により生じる励起スペクトルの変化が測定される。な
お、蛍光顕微鏡による測定では、蛍光像の所定の円形微
小領域において、蛍光強度の変化が測定される。
とによって、その蛍光スペクトル又は励起スペクトルが
変化する。しかも、その変化量は被検定物質の濃度によ
って異なる。従って、分光蛍光光度計または蛍光顕微鏡
で蛍光強度を測定すれば、スペクトルの変化から被検定
物質の濃度を定量することができる。例えば、細胞内の
カルシウムイオンを定量する際には、蛍光プローブとし
てfura−２を投与し、カルシウムイオンとの特異的に結
合により生じる励起スペクトルの変化が測定される。な
お、蛍光顕微鏡による測定では、蛍光像の所定の円形微
小領域において、蛍光強度の変化が測定される。
ところで、上記の定量方法では細胞内の特定の微小領
域におけるカルシウム濃度の定量は容易であるが、比較
的広い平面領域におけるカルシウム濃度分布を得るのは
極めて困難である。そのような濃度分布を得ようとすれ
ば、多くの測定点においてサンプルを採取し、その夫々
のサンプルについて測定を行わなければならず、多大の
労力と時間とを必要とする。一方、神経科学および細胞
生物学の分野における研究では、例えば幾つかの細胞を
含む比較的広い領域におけるカルシウムイオンの濃度分
布を得ることが極めて重要である。従って、上記の定量
方法を発展させるためには、好適な蛍光プローブを開発
するための研究だけでなく、比較的広い平面領域におけ
る被検定物質の濃度を同時に測定することにより、容易
にその平面的濃度分布を得る方法が必要とされる。
域におけるカルシウム濃度の定量は容易であるが、比較
的広い平面領域におけるカルシウム濃度分布を得るのは
極めて困難である。そのような濃度分布を得ようとすれ
ば、多くの測定点においてサンプルを採取し、その夫々
のサンプルについて測定を行わなければならず、多大の
労力と時間とを必要とする。一方、神経科学および細胞
生物学の分野における研究では、例えば幾つかの細胞を
含む比較的広い領域におけるカルシウムイオンの濃度分
布を得ることが極めて重要である。従って、上記の定量
方法を発展させるためには、好適な蛍光プローブを開発
するための研究だけでなく、比較的広い平面領域におけ
る被検定物質の濃度を同時に測定することにより、容易
にその平面的濃度分布を得る方法が必要とされる。
このような要求を満たすために、出願人は特願昭63−
189453号において、画像処理を組み合わせた蛍光顕微鏡
システムを提案した。この蛍光顕微鏡システムを用いる
ことによって、比較的広い平面領域での細胞内イオン濃
度分布を容易に得ることが可能となった。本発明の好ま
しい実施例においてもこの蛍光顕微鏡をもちいるから、
その詳細な構成については後述の実施例で説明する。
189453号において、画像処理を組み合わせた蛍光顕微鏡
システムを提案した。この蛍光顕微鏡システムを用いる
ことによって、比較的広い平面領域での細胞内イオン濃
度分布を容易に得ることが可能となった。本発明の好ま
しい実施例においてもこの蛍光顕微鏡をもちいるから、
その詳細な構成については後述の実施例で説明する。
出願人の提案になる上記蛍光顕微鏡システムを用いた
場合でも、従来の細胞内イオン濃度分布を測定する方法
にも次のような問題がある。
場合でも、従来の細胞内イオン濃度分布を測定する方法
にも次のような問題がある。
細胞生理機能を研究する場合、遊離イオン濃度の増減
が細胞内のどの部位で生じるかに関する情報を得ること
が極めて重要である。しかし、測定された蛍光強度像は
一般にイオン濃度に関する情報しか含んでおらず、該イ
オン濃度と細胞内位置との関係に関する情報は含んでい
ない。このため、従来の方法では、測定された蛍光強度
像を画像処理しても、イオン濃度分布と細胞の輪郭とを
関連付けた画像を形成することができない。
が細胞内のどの部位で生じるかに関する情報を得ること
が極めて重要である。しかし、測定された蛍光強度像は
一般にイオン濃度に関する情報しか含んでおらず、該イ
オン濃度と細胞内位置との関係に関する情報は含んでい
ない。このため、従来の方法では、測定された蛍光強度
像を画像処理しても、イオン濃度分布と細胞の輪郭とを
関連付けた画像を形成することができない。
また、測定された蛍光強度像には細胞外のバックグラ
ウンド蛍光が含まれているから、測定対象であるイオン
の２次元濃度分布を得るためには、蛍光強度像からこの
バックグラウンド蛍光を差し引かなければならない。し
かし、バックグラウンドの値を客観的に決定するのは困
難であるため、従来の方法では、実験者が蛍光強度像の
プロファイル像から経験的に判断してバックグラウンド
レベルの値を決定している。このため、従来の方法では
バックグラウンド値の判定根拠が曖昧で、実験者の間で
のバラツキが大きく、正確なイオン濃度を求めるのが困
難である。
ウンド蛍光が含まれているから、測定対象であるイオン
の２次元濃度分布を得るためには、蛍光強度像からこの
バックグラウンド蛍光を差し引かなければならない。し
かし、バックグラウンドの値を客観的に決定するのは困
難であるため、従来の方法では、実験者が蛍光強度像の
プロファイル像から経験的に判断してバックグラウンド
レベルの値を決定している。このため、従来の方法では
バックグラウンド値の判定根拠が曖昧で、実験者の間で
のバラツキが大きく、正確なイオン濃度を求めるのが困
難である。
上記事情に鑑み、本発明の課題は、蛍光プローブを用
いた蛍光顕微鏡システムにより、細胞内の２次元濃度分
布を細胞の輪郭と関連付けて表示した画像を得ることが
でき、且つバックグラウンド蛍光のレベルを客観的に決
定して正確なイオン濃度を測定できる方法を提供するこ
とである。
いた蛍光顕微鏡システムにより、細胞内の２次元濃度分
布を細胞の輪郭と関連付けて表示した画像を得ることが
でき、且つバックグラウンド蛍光のレベルを客観的に決
定して正確なイオン濃度を測定できる方法を提供するこ
とである。
本発明は、蛍光プローブの蛍光スペクトル変化または
励起スペクトル変化に基づいて、生活細胞内における所
定の測定対象イオンの２次元濃度分布像を形成する方法
であって、 細胞内に蛍光プローブを投与する工程と、 該細胞を含む領域において、前記蛍光プローブからの
蛍光を測定することにより蛍光強度分布像を求める工程
と、 前記細胞を光学的に測定することにより、前記細胞の
明視野像、位相差像、ノマルスキー像および偏光像から
なる群から選択される細胞像を得る工程と、 前記蛍光強度分布像のプロファイルおよび前記細胞像
のプロファイルから、バックグラウンド蛍光値を決定す
る工程と、 前記蛍光強度分布像から前記バックグラウンド蛍光値
を差し引くことを含む画像処理により、前記測定対象イ
オンの２次元濃度分布像を形成する工程と、 前記細胞像と前記測定対象イオンの２次元濃度分布像
とを画像処理することにより、両画像をディスプレイ上
に重複表示する工程とを具備したことを特徴とするもの
である。
励起スペクトル変化に基づいて、生活細胞内における所
定の測定対象イオンの２次元濃度分布像を形成する方法
であって、 細胞内に蛍光プローブを投与する工程と、 該細胞を含む領域において、前記蛍光プローブからの
蛍光を測定することにより蛍光強度分布像を求める工程
と、 前記細胞を光学的に測定することにより、前記細胞の
明視野像、位相差像、ノマルスキー像および偏光像から
なる群から選択される細胞像を得る工程と、 前記蛍光強度分布像のプロファイルおよび前記細胞像
のプロファイルから、バックグラウンド蛍光値を決定す
る工程と、 前記蛍光強度分布像から前記バックグラウンド蛍光値
を差し引くことを含む画像処理により、前記測定対象イ
オンの２次元濃度分布像を形成する工程と、 前記細胞像と前記測定対象イオンの２次元濃度分布像
とを画像処理することにより、両画像をディスプレイ上
に重複表示する工程とを具備したことを特徴とするもの
である。
本発明におけるバックグラウンド蛍光値の決定は、任
意の線に沿った蛍光強度分布像のプロファイルと、明視
野像の細胞像の任意の線に沿ったプロファイルとを、好
ましくはCRT等のディスプレイ上に表示して行なう。
意の線に沿った蛍光強度分布像のプロファイルと、明視
野像の細胞像の任意の線に沿ったプロファイルとを、好
ましくはCRT等のディスプレイ上に表示して行なう。
蛍光強度分布像の形成およびイオンの２次元濃度分布
像の形成は、後述の実施例で詳細に説明するように、特
願昭63−189453号に開示した方法と同様にして行なうこ
とができる。
像の形成は、後述の実施例で詳細に説明するように、特
願昭63−189453号に開示した方法と同様にして行なうこ
とができる。
本発明において、測定対象イオンの２次元濃度分布像
と細胞像とを重複表示するためには、例えば第１図のフ
ローチャートに示した方法を用いることができる。
と細胞像とを重複表示するためには、例えば第１図のフ
ローチャートに示した方法を用いることができる。
この方法では、まずステップ１において、細胞の光学
的測定により得られた明視野像、位相差像、ノマルスキ
ー像または偏光像からなる細胞像を、その輝度の大小に
基づいて白黒階調変換を行ない、得られた白黒階調画像
をCRTディスプレイ上に表示する。この白黒階調画像上
に、測定対象イオンの２次元濃度分布像（蛍光像）を重
複表示すればよい。
的測定により得られた明視野像、位相差像、ノマルスキ
ー像または偏光像からなる細胞像を、その輝度の大小に
基づいて白黒階調変換を行ない、得られた白黒階調画像
をCRTディスプレイ上に表示する。この白黒階調画像上
に、測定対象イオンの２次元濃度分布像（蛍光像）を重
複表示すればよい。
しかし、明視野像、位相差像、ノマルスキー像および
偏光像は一般に蛍光像とは正確に重なり合わない。そこ
で、両画像の座標系を一致させるために、ステップ２に
おいて、２次元イオン濃度分布像の画像データのアフィ
ン変換を行なう。入力画像の座標系を（I,J）とし、出
力画像の座標系を（x,y）とすると、アフィン変換にお
ける座標変換は（x,y）から（I,J）中の実数型画像座標
（u,v）へとなされる。次に、（u,v）点の内装が行わ
れ、内装濃度レベルＩ′が（x,y）に格納される。この
アフィン変換による座標変換式は、次式で定義される。
偏光像は一般に蛍光像とは正確に重なり合わない。そこ
で、両画像の座標系を一致させるために、ステップ２に
おいて、２次元イオン濃度分布像の画像データのアフィ
ン変換を行なう。入力画像の座標系を（I,J）とし、出
力画像の座標系を（x,y）とすると、アフィン変換にお
ける座標変換は（x,y）から（I,J）中の実数型画像座標
（u,v）へとなされる。次に、（u,v）点の内装が行わ
れ、内装濃度レベルＩ′が（x,y）に格納される。この
アフィン変換による座標変換式は、次式で定義される。
ｕ＝a1x＋a2y＋a3 ｖ＝b1x＋b2y＋b3 但し、a1,a2,a3,b1,b2,b3は任意係数である。
上記のように座標変換された２次元イオン濃度分布像
の画像データは、イオン濃度に応じて色分けされ、ステ
ップ１で形成された細胞像の白黒階調画像の上に重ね合
わせて表示する。このときステップ１で形成された白黒
階調画像の情報を維持するために、ステップ３に示した
ように、両画像の重ね合せに際しては各座標位置におい
てエクスクルーシブオア（XOR）演算を行なう。これに
よって、ステップ１で得た白黒階調の細胞像とイオン濃
度分布像とが重複表示される。なお、エクスクルーシブ
オア（XOR）演算の基本形は次表で示される。
の画像データは、イオン濃度に応じて色分けされ、ステ
ップ１で形成された細胞像の白黒階調画像の上に重ね合
わせて表示する。このときステップ１で形成された白黒
階調画像の情報を維持するために、ステップ３に示した
ように、両画像の重ね合せに際しては各座標位置におい
てエクスクルーシブオア（XOR）演算を行なう。これに
よって、ステップ１で得た白黒階調の細胞像とイオン濃
度分布像とが重複表示される。なお、エクスクルーシブ
オア（XOR）演算の基本形は次表で示される。
入力Ａ 入力Ｂ 出力 ０ ０ ０ １ ０ １ ０ １ １ １ １ ０ 上記の演算則により白黒階調の細胞像とイオン濃度分
布像とを重ね合せると、次のようにして両画像の合成画
像が形成される。
布像とを重ね合せると、次のようにして両画像の合成画
像が形成される。
細胞像： ○○○××○×○ 濃度分布像：××○○×○×× 合成像： ○○×○×××○ 但し、パターン○は画面にデータがセットされている
状態を示し、パターン×は画面にデータがセットされて
いない状態を示している。
状態を示し、パターン×は画面にデータがセットされて
いない状態を示している。
上記本発明の方法では、バックグラウンド蛍光値を決
定する際に蛍光強度像のプロファイルのみを用いるので
はなく、基準として明視野像、位相差像、ノマルスキー
像または偏光像の何れかの細胞像のプロファイルをも併
用している。このため、実験者の恣意正確な判断を排
し、より正確かつ客観的にバックグラウンド蛍光値を決
定でき、より正確なイオン濃度および濃度分布を求める
ことができる。
定する際に蛍光強度像のプロファイルのみを用いるので
はなく、基準として明視野像、位相差像、ノマルスキー
像または偏光像の何れかの細胞像のプロファイルをも併
用している。このため、実験者の恣意正確な判断を排
し、より正確かつ客観的にバックグラウンド蛍光値を決
定でき、より正確なイオン濃度および濃度分布を求める
ことができる。
また、測定対象イオンの２次元濃度分布像を細胞像に
重複して表示しているため、濃度分布と細胞構造との関
係が明瞭となる。従って、濃度分布像の各点でのイオン
濃度が、細胞内のどの位置に対応するかを明確に知るこ
とができる。
重複して表示しているため、濃度分布と細胞構造との関
係が明瞭となる。従って、濃度分布像の各点でのイオン
濃度が、細胞内のどの位置に対応するかを明確に知るこ
とができる。
以下、本発明の好ましい実施例を含め、本発明の詳細
を説明する。
を説明する。
まず、本発明を理解するために必要な範囲で、蛍光プ
ローブを用いて生活細胞内の物質濃度等を測定する方法
をより詳細に説明する。
ローブを用いて生活細胞内の物質濃度等を測定する方法
をより詳細に説明する。
既述したように、この方法では特定のイオンの濃度に
応じて励起スペクトル又は蛍光スペクトルに変化を生じ
る蛍光プローブが用いられる。例えば、カルシウムイオ
ンの濃度を測定する場合には、蛍光プローブとして、fu
ra−２、Quin−２及びIndo−１の商品名で市販されてい
るモレキュラープローブス社製の蛍光試薬を用いること
ができる。
応じて励起スペクトル又は蛍光スペクトルに変化を生じ
る蛍光プローブが用いられる。例えば、カルシウムイオ
ンの濃度を測定する場合には、蛍光プローブとして、fu
ra−２、Quin−２及びIndo−１の商品名で市販されてい
るモレキュラープローブス社製の蛍光試薬を用いること
ができる。
fura−２は下記構造式（Ｉ）で示される。しかし、こ
のような遊離のカルボキシ基を有する形では、神経系の
株化細胞（NG108,N115）又はグリア由来の株化細胞（C6
Bu−１）等の細胞膜を透過しない。このため、細胞膜を
透過できるように、アセトキシメチルエステル化した誘
導体fura−2/AMとしてサンプル細胞に投与される。しか
し、fura−2/AMは細胞内に取り込まれると直ちに代謝を
受けて遊離のカルボキシイオンであるfura−２に転化さ
れ、カルシウムイオンと特異的に結合する。
のような遊離のカルボキシ基を有する形では、神経系の
株化細胞（NG108,N115）又はグリア由来の株化細胞（C6
Bu−１）等の細胞膜を透過しない。このため、細胞膜を
透過できるように、アセトキシメチルエステル化した誘
導体fura−2/AMとしてサンプル細胞に投与される。しか
し、fura−2/AMは細胞内に取り込まれると直ちに代謝を
受けて遊離のカルボキシイオンであるfura−２に転化さ
れ、カルシウムイオンと特異的に結合する。
カルシウムイオンと結合すると、fura−２の励起スペ
クトルはカルシウム濃度に応じて変化する。fura−２の
蛍光は510nmにシングルピークをもち、バンドパスは10n
mである。そこで、種々の濃度のカルシウムイオンの存
在下において、励起光の波長を変化させながら波長510n
mの蛍光強度を蛍光分光光度計を用いて測定すると、第
２図のスペクトルが得られる。第２図から明らかなよう
に、カルシウム濃度に依存した蛍光強度の変化は、励起
光の波長が340nmのときに最も大きい。これに対して、
励起光の波長が360nmのとき、蛍光強度はカルシウム濃
度に依存した変化を示さない。また、励起光の波長が38
0nmのとき、蛍光強度は340nmの励起光のときとは逆の変
化を示す。
クトルはカルシウム濃度に応じて変化する。fura−２の
蛍光は510nmにシングルピークをもち、バンドパスは10n
mである。そこで、種々の濃度のカルシウムイオンの存
在下において、励起光の波長を変化させながら波長510n
mの蛍光強度を蛍光分光光度計を用いて測定すると、第
２図のスペクトルが得られる。第２図から明らかなよう
に、カルシウム濃度に依存した蛍光強度の変化は、励起
光の波長が340nmのときに最も大きい。これに対して、
励起光の波長が360nmのとき、蛍光強度はカルシウム濃
度に依存した変化を示さない。また、励起光の波長が38
0nmのとき、蛍光強度は340nmの励起光のときとは逆の変
化を示す。
このように、カルシウム濃度に依存した蛍光強度の変
化が励起光の波長によって異なる場合には、二波長測定
が効果的である。即ち、異なった二つの波長で励起し、
夫々の励起波長における蛍光強度の比からカルシウム濃
度を定量する。その場合、二つの励起波長のうちの一つ
は蛍光強度が最も大きく変化する波長を選択し、他の一
つは蛍光強度が変化しない波長または逆向きの変化を生
じる波長を選択する。この二波長測定を用いることによ
って、蛍光プローブの濃度および減衰、或いは励起光強
度のばらつきを標準化することができる。第２図に基づ
いて、励起波長として340nmおよび360nm（340nmは測定
光、360nmはレファレンス光）を選択したときの二波長
測定について更に説明れば次の通りである。
化が励起光の波長によって異なる場合には、二波長測定
が効果的である。即ち、異なった二つの波長で励起し、
夫々の励起波長における蛍光強度の比からカルシウム濃
度を定量する。その場合、二つの励起波長のうちの一つ
は蛍光強度が最も大きく変化する波長を選択し、他の一
つは蛍光強度が変化しない波長または逆向きの変化を生
じる波長を選択する。この二波長測定を用いることによ
って、蛍光プローブの濃度および減衰、或いは励起光強
度のばらつきを標準化することができる。第２図に基づ
いて、励起波長として340nmおよび360nm（340nmは測定
光、360nmはレファレンス光）を選択したときの二波長
測定について更に説明れば次の通りである。
励起波長340nmのときの蛍光強度をI340とし、励起波
長360nmのときの蛍光強度をI360とする。第１図のデー
タに基づいてI340/I360の値を計算すると、その値はカ
ルシウム濃度に依存して0.64〜1.89の範囲で変化する。
長360nmのときの蛍光強度をI360とする。第１図のデー
タに基づいてI340/I360の値を計算すると、その値はカ
ルシウム濃度に依存して0.64〜1.89の範囲で変化する。
測定にテレビカメラを用いる場合、高精度の二波長測
定を行うためには、使用するカメラのダイナミックレン
ジを考慮しなければならない。即ち、所定のダイナミッ
クレンジにおいてのみ、入力変化と出力変化の間に良好
な線形性が存在するから、高精度の出力を得るために
は、I340/I360の値（カメラの入力）がダイナミックレ
ンジ内で変化することが必要である。このような条件を
達成するためには、濃淡フィルタ（以下、NDフィルタと
記す）を用いて励起光強度を調節することによって、I3
40/I360の中央値が１になるように正規化すれば良い。
第３図中には、正規化されたI340/I360値とカルシウム
濃度との関係が示されている。このデータは、蛍光顕微
鏡システムでカルシウム濃度を定量する際の検量線とし
て用いることができる。
定を行うためには、使用するカメラのダイナミックレン
ジを考慮しなければならない。即ち、所定のダイナミッ
クレンジにおいてのみ、入力変化と出力変化の間に良好
な線形性が存在するから、高精度の出力を得るために
は、I340/I360の値（カメラの入力）がダイナミックレ
ンジ内で変化することが必要である。このような条件を
達成するためには、濃淡フィルタ（以下、NDフィルタと
記す）を用いて励起光強度を調節することによって、I3
40/I360の中央値が１になるように正規化すれば良い。
第３図中には、正規化されたI340/I360値とカルシウム
濃度との関係が示されている。このデータは、蛍光顕微
鏡システムでカルシウム濃度を定量する際の検量線とし
て用いることができる。
Indo−１は、カルシウム濃度測定に用いられるもう一
つの蛍光プローブで、下記構造式（II）で示される。In
do−１も、遊離のカルボキシ基を有する形では生活細胞
の細胞膜を透過しないため、アセトキシメチルエステル
化した誘導体Indo−1/AMとしてサンプル細胞に投与され
る。しかし、カルシウムイオンと特異的に結合するのは
Indo−1/AMはではなく、細胞内での代謝により生成した
Indo−１である。
つの蛍光プローブで、下記構造式（II）で示される。In
do−１も、遊離のカルボキシ基を有する形では生活細胞
の細胞膜を透過しないため、アセトキシメチルエステル
化した誘導体Indo−1/AMとしてサンプル細胞に投与され
る。しかし、カルシウムイオンと特異的に結合するのは
Indo−1/AMはではなく、細胞内での代謝により生成した
Indo−１である。
上記Indo−１を用いた場合には、fura−２の場合と異
なり、励起スペクトルではなく蛍光スペクトルがカルシ
ウム濃度に応じて変化する。第４図は、種々の濃度のカ
ルシウムの存在下において、Indo−１に波長340nmの励
起光を照射したときのIndo−１の蛍光スペクトルを示し
ている。このスペクトルから明らかなように、Indo−１
の蛍光のうち、カルシウム濃度に応じて蛍光強度が最も
大きく変化するのは、410nm付近の波長を有する蛍光で
ある。一方、波長460nmの蛍光はカルシウム濃度に依存
した強度変化を示さない。また、460nm〜480nmの範囲の
波長を有する蛍光はカルシウム濃度に依存した強度変化
を示すが、その変化は波長410nmの蛍光とは逆である、
その結果、励起光の波長を固定しておき、選択された二
つの波長で蛍光強度を測定することによって、fura−２
の場合と同様の二波長測定が可能である。測定波長の組
み合わせとしては、通常410nm及び460nm、或いは410nm
及び480nmが選択される。TVカメラを用いて観測すると
きには、fura−２の場合と同様の理由によって、I410/I
460又はI410/I480の値を正規化する。即ち、NDフィルタ
を用いることにより、I410/I460又はI410/I480の中央値
が１になるように調節する。第５図に、カルシウム濃度
と正規化されたI410/I460値との関係を示す。このデー
タは、蛍光顕微鏡システムでカルシウム濃度を定量する
際の検量線として用いることができる。
なり、励起スペクトルではなく蛍光スペクトルがカルシ
ウム濃度に応じて変化する。第４図は、種々の濃度のカ
ルシウムの存在下において、Indo−１に波長340nmの励
起光を照射したときのIndo−１の蛍光スペクトルを示し
ている。このスペクトルから明らかなように、Indo−１
の蛍光のうち、カルシウム濃度に応じて蛍光強度が最も
大きく変化するのは、410nm付近の波長を有する蛍光で
ある。一方、波長460nmの蛍光はカルシウム濃度に依存
した強度変化を示さない。また、460nm〜480nmの範囲の
波長を有する蛍光はカルシウム濃度に依存した強度変化
を示すが、その変化は波長410nmの蛍光とは逆である、
その結果、励起光の波長を固定しておき、選択された二
つの波長で蛍光強度を測定することによって、fura−２
の場合と同様の二波長測定が可能である。測定波長の組
み合わせとしては、通常410nm及び460nm、或いは410nm
及び480nmが選択される。TVカメラを用いて観測すると
きには、fura−２の場合と同様の理由によって、I410/I
460又はI410/I480の値を正規化する。即ち、NDフィルタ
を用いることにより、I410/I460又はI410/I480の中央値
が１になるように調節する。第５図に、カルシウム濃度
と正規化されたI410/I460値との関係を示す。このデー
タは、蛍光顕微鏡システムでカルシウム濃度を定量する
際の検量線として用いることができる。
次に、第６図および第７図を参照し、本発明において
好適に使用することができる蛍光顕微鏡システムの一例
を説明する。第６図は蛍光顕微鏡システムの概略図であ
り、第７図はそのブロック図である。このシステムは特
願昭63−189453号に開示したもので、倒立型落射蛍光顕
微鏡（オリンパス光学工業株式会社製、IMT−２）と、T
Vカメラと、画像処理装置とを組合せたものである。こ
の構成によって、所定の平面領域における上記蛍光分析
を同時に行い、容易にカルシウム濃度の分布等を得るこ
とを可能としたものである。なお、この蛍光顕微鏡シス
テムは、例えばfura−２を蛍光プローブに用いたカルシ
ウムイオンの定量のように、励起スペクトル変化に基づ
く分析を行うための構成を有している。
好適に使用することができる蛍光顕微鏡システムの一例
を説明する。第６図は蛍光顕微鏡システムの概略図であ
り、第７図はそのブロック図である。このシステムは特
願昭63−189453号に開示したもので、倒立型落射蛍光顕
微鏡（オリンパス光学工業株式会社製、IMT−２）と、T
Vカメラと、画像処理装置とを組合せたものである。こ
の構成によって、所定の平面領域における上記蛍光分析
を同時に行い、容易にカルシウム濃度の分布等を得るこ
とを可能としたものである。なお、この蛍光顕微鏡シス
テムは、例えばfura−２を蛍光プローブに用いたカルシ
ウムイオンの定量のように、励起スペクトル変化に基づ
く分析を行うための構成を有している。
第６図において、１は励起光を発生するための照明装
置であり、その内部には光源としてHgランプ２が内蔵さ
れている。Hgランプ２の代わりにXeランプを用いてもよ
い。また、必要な波長の光を放射するものであれば、そ
れ以外のどのようなランプでも光源に用いることができ
る。照明装置１には投光管３が設けられ、該投光管３は
顕微鏡本体に連結されている。投光管３の内部には、濃
淡フィルタ４および干渉フィルタ５からなるフィルタユ
ニット６が、Hgランプ２の光軸上に設けられている。干
渉フィルタ５は、所定の波長を有する光のみを選択的に
透過させるためのものである。また、NDフィルタ４は、
各波における光の透過光量を調整するために用いられ
る。場合によっては、NDフィルタ４を省略しても良い。
置であり、その内部には光源としてHgランプ２が内蔵さ
れている。Hgランプ２の代わりにXeランプを用いてもよ
い。また、必要な波長の光を放射するものであれば、そ
れ以外のどのようなランプでも光源に用いることができ
る。照明装置１には投光管３が設けられ、該投光管３は
顕微鏡本体に連結されている。投光管３の内部には、濃
淡フィルタ４および干渉フィルタ５からなるフィルタユ
ニット６が、Hgランプ２の光軸上に設けられている。干
渉フィルタ５は、所定の波長を有する光のみを選択的に
透過させるためのものである。また、NDフィルタ４は、
各波における光の透過光量を調整するために用いられ
る。場合によっては、NDフィルタ４を省略しても良い。
フィルタユニット６を透過した励起光は、顕微鏡本体
内部に設けられた光学系（図示せず）を介して対物レン
ズ８に入射され、集光された状態で、ステージ９に載置
された試料細胞10に照射される。試料細胞10には予めfu
ra−２が投与されており、励起光の照射によって蛍光を
生じる。この蛍光は落射型光路を辿り、図示しない光学
系を介して接眼レンズ12から観察され、同時にTVカメラ
13（SIT）に入射される。TVカメラ13にはイメージプロ
セッサ14,コンピュータ15,モニタ16及びプリンタ17が接
続されている。
内部に設けられた光学系（図示せず）を介して対物レン
ズ８に入射され、集光された状態で、ステージ９に載置
された試料細胞10に照射される。試料細胞10には予めfu
ra−２が投与されており、励起光の照射によって蛍光を
生じる。この蛍光は落射型光路を辿り、図示しない光学
系を介して接眼レンズ12から観察され、同時にTVカメラ
13（SIT）に入射される。TVカメラ13にはイメージプロ
セッサ14,コンピュータ15,モニタ16及びプリンタ17が接
続されている。
上記の蛍光顕微鏡システムでは、蛍光によるカルシウ
ム濃度の測定だけでなく、通常の顕微鏡観察を行うため
の構成が採用されている。第６図における20aは、試料
細胞10を顕微鏡観察するためのための可視光源である。
光源20aからの可視光線は、コンデンサレンズ20bで集光
されて試料細胞10に照射される。こうして照射された可
視光線は試料細胞10を透過し、対物レンズ８の光学系を
介して接眼レンズ12から観察される。即ち、通常の顕微
鏡観察において、可視光線は透過型光路を辿る。この構
成によって細胞の明視野像を得ることができる。上記の
蛍光顕微鏡にノマルスキーコンデンサIM2−LWDNC（オリ
ンパス光学工業株式会社製）と、ノマルキースライダIM
2−NA（オリンパス光学工業株式会社製）と、ノマルス
キー用対物レンズLWDCD Plan 40x（オリンパス光学工業
株式会社製）とを装着することによって、ノマルスキー
像を得ることができる。また、位相差コンデンサIMT−
２−LWCD（オリンパス光学工業株式会社製）と、位相差
用対物レンズLWDCD Plan 40x−PL（オリンパス光学工業
株式会社製）とを装着することによって、位相差像を得
ることができる。更に、ノマルスキーコンデンサIM2−L
WDNC（オリンパス光学工業株式会社製）と、ノマルスキ
ー用対物レンズLWDCD Plan 40x（オリンパス光学工業株
式会社製）とを装着することによって、偏光像を得るこ
とができる。
ム濃度の測定だけでなく、通常の顕微鏡観察を行うため
の構成が採用されている。第６図における20aは、試料
細胞10を顕微鏡観察するためのための可視光源である。
光源20aからの可視光線は、コンデンサレンズ20bで集光
されて試料細胞10に照射される。こうして照射された可
視光線は試料細胞10を透過し、対物レンズ８の光学系を
介して接眼レンズ12から観察される。即ち、通常の顕微
鏡観察において、可視光線は透過型光路を辿る。この構
成によって細胞の明視野像を得ることができる。上記の
蛍光顕微鏡にノマルスキーコンデンサIM2−LWDNC（オリ
ンパス光学工業株式会社製）と、ノマルキースライダIM
2−NA（オリンパス光学工業株式会社製）と、ノマルス
キー用対物レンズLWDCD Plan 40x（オリンパス光学工業
株式会社製）とを装着することによって、ノマルスキー
像を得ることができる。また、位相差コンデンサIMT−
２−LWCD（オリンパス光学工業株式会社製）と、位相差
用対物レンズLWDCD Plan 40x−PL（オリンパス光学工業
株式会社製）とを装着することによって、位相差像を得
ることができる。更に、ノマルスキーコンデンサIM2−L
WDNC（オリンパス光学工業株式会社製）と、ノマルスキ
ー用対物レンズLWDCD Plan 40x（オリンパス光学工業株
式会社製）とを装着することによって、偏光像を得るこ
とができる。
第７図を参照して、上記の蛍光顕微鏡システムをより
詳細に説明する。図示のように、前記フィルタユニット
６は340nm,360nm又は380nmのうちの何れか一つの波長を
有する励起光のみを選択的に透過させる三つの干渉フィ
ルタ５を有している。この三つの干渉フィルタ５のどれ
かを光軸上に配置することによって、Hgランプ２で発生
された光から、fura−２を用いた二波長測定に必要な励
起光を取り出すことができる。また、フィルタユニット
６は複数のNDフィルタ４を有している。ここにNDフィル
タ４を用いる理由は、測定に使用される、波長の異なっ
た励起光の強度を調節するためである。即ち、二波長測
定に使用される波長の異なった二つの光は、略同じ強度
を有することが必要とされるがある。しかし、Hgランプ
２から発生する光は各波長によって強度が異なるため、
NDフィルタ４を通すことによって強度を調整するのであ
る。NDフィルタ４および干渉フィルタ５は、夫々ステッ
ピングモータ18,18によって光路を横切る方向に制御移
動可能になっている。これによって、所望のフィルタを
光路上に挿入できるようになっている。
詳細に説明する。図示のように、前記フィルタユニット
６は340nm,360nm又は380nmのうちの何れか一つの波長を
有する励起光のみを選択的に透過させる三つの干渉フィ
ルタ５を有している。この三つの干渉フィルタ５のどれ
かを光軸上に配置することによって、Hgランプ２で発生
された光から、fura−２を用いた二波長測定に必要な励
起光を取り出すことができる。また、フィルタユニット
６は複数のNDフィルタ４を有している。ここにNDフィル
タ４を用いる理由は、測定に使用される、波長の異なっ
た励起光の強度を調節するためである。即ち、二波長測
定に使用される波長の異なった二つの光は、略同じ強度
を有することが必要とされるがある。しかし、Hgランプ
２から発生する光は各波長によって強度が異なるため、
NDフィルタ４を通すことによって強度を調整するのであ
る。NDフィルタ４および干渉フィルタ５は、夫々ステッ
ピングモータ18,18によって光路を横切る方向に制御移
動可能になっている。これによって、所望のフィルタを
光路上に挿入できるようになっている。
また、図示してはいないが、対物レンズ８を変更した
ときの補正を目的として、第二のNDフィルタが設けられ
ている。この目的を達成するために、透過率の異なる複
数のNDフィルタ、例えば透過率０％,25％,40％,100％の
ものが用いられ、その何れかを光路中に任意に挿入でき
るようになっている。
ときの補正を目的として、第二のNDフィルタが設けられ
ている。この目的を達成するために、透過率の異なる複
数のNDフィルタ、例えば透過率０％,25％,40％,100％の
ものが用いられ、その何れかを光路中に任意に挿入でき
るようになっている。
図示のように、ダイクロミックミラー７が前記Hgラン
プ２の光軸上に配置されている。このダイクロミックミ
ラー７は、第６図中の対物レンズ８の真下に設けられて
いる。フィルターユニット６を透過した励起光はダイク
ロミックミラー７で反射されることにより、対物レンズ
８を通って試料細胞10に照射される。試料細胞で生じた
蛍光は、対物レンズ８を通してダイクロミックミラー７
に入射される。ダイクロミックミラー７は、この蛍光を
透過させる機能を有している。ダイクロミックミラー７
の直下には、エミッションフィルタ19が配置されてい
る。このエミッションフィルタ19は、fura−２を用いた
蛍光測定に使用される波長510nmの蛍光のみを透過させ
る。エミッションフィルタ19を透過した波長510nmの蛍
光は図示しないビームスプリッタに入射される。該入射
光の20％はそのままビームプリッタを通過し、図示しな
い光学系を介して第６図の接眼レンズ12に到達する。一
方、ビームスプリッタに入射した蛍光の80％は、別の光
学系を介してTVカメラ13に入射される。
プ２の光軸上に配置されている。このダイクロミックミ
ラー７は、第６図中の対物レンズ８の真下に設けられて
いる。フィルターユニット６を透過した励起光はダイク
ロミックミラー７で反射されることにより、対物レンズ
８を通って試料細胞10に照射される。試料細胞で生じた
蛍光は、対物レンズ８を通してダイクロミックミラー７
に入射される。ダイクロミックミラー７は、この蛍光を
透過させる機能を有している。ダイクロミックミラー７
の直下には、エミッションフィルタ19が配置されてい
る。このエミッションフィルタ19は、fura−２を用いた
蛍光測定に使用される波長510nmの蛍光のみを透過させ
る。エミッションフィルタ19を透過した波長510nmの蛍
光は図示しないビームスプリッタに入射される。該入射
光の20％はそのままビームプリッタを通過し、図示しな
い光学系を介して第６図の接眼レンズ12に到達する。一
方、ビームスプリッタに入射した蛍光の80％は、別の光
学系を介してTVカメラ13に入射される。
TVカメラ13にはイメージプロセッサ14が連結されてい
る。該イメージプロセッサ14はカメラ13をコントロール
する機能と、カメラ13から送られてくる画像データを積
算する機能を有する。更に、イメージプロセッサ14には
RAMディスクを内臓したコンピュータ15と、モニタ16
と、プリンタ17とが順次接続されている。コンピュータ
15はイメージプロセッサ14から送られてくる積算画像を
データ処理することによって、所期のカルシウム濃度お
よびカルシウム濃度分布を得る。また、コンピュータ15
は既述のステッピングモータ18に接続されており、その
動作を制御する。
る。該イメージプロセッサ14はカメラ13をコントロール
する機能と、カメラ13から送られてくる画像データを積
算する機能を有する。更に、イメージプロセッサ14には
RAMディスクを内臓したコンピュータ15と、モニタ16
と、プリンタ17とが順次接続されている。コンピュータ
15はイメージプロセッサ14から送られてくる積算画像を
データ処理することによって、所期のカルシウム濃度お
よびカルシウム濃度分布を得る。また、コンピュータ15
は既述のステッピングモータ18に接続されており、その
動作を制御する。
なお、上記の蛍光顕微鏡では蛍光波長を固定し、励起
波長を変化させる構成になっているが、これとは逆に励
起光の波長を固定し、蛍光波長を変化させ得る構成にす
ることも可能である。このような蛍光顕微鏡を用いれ
ば、Indo−１のように蛍光スペクトルに変化を生じるよ
うな蛍光プローブを用いることが可能である。
波長を変化させる構成になっているが、これとは逆に励
起光の波長を固定し、蛍光波長を変化させ得る構成にす
ることも可能である。このような蛍光顕微鏡を用いれ
ば、Indo−１のように蛍光スペクトルに変化を生じるよ
うな蛍光プローブを用いることが可能である。
次に、上記蛍光顕微鏡システムを使用し、fura−２を
蛍光プローブとして細胞内カルシウムイオンの濃度分布
像を形成する方法を説明する。
蛍光プローブとして細胞内カルシウムイオンの濃度分布
像を形成する方法を説明する。
サンプル細胞10で発生した蛍光がTVカメラ13に入射さ
れると、TVカメラ13は各画素ごとに、入射された蛍光を
その強度に比例した電気信号に変換する。こうして得ら
れた画像情報は、イメージプロセッサ14に入力される。
TVカメラ13は、所定の露光時間（一般には1/30秒）毎に
画像情報をイメージプロセッサ14に入力する。イメージ
プロセッサ14は、TVカメラ13から送られてくる画像情報
を所定の回数だけ積算する。この積算により形成された
画像は、コンピュータ15に送られる。
れると、TVカメラ13は各画素ごとに、入射された蛍光を
その強度に比例した電気信号に変換する。こうして得ら
れた画像情報は、イメージプロセッサ14に入力される。
TVカメラ13は、所定の露光時間（一般には1/30秒）毎に
画像情報をイメージプロセッサ14に入力する。イメージ
プロセッサ14は、TVカメラ13から送られてくる画像情報
を所定の回数だけ積算する。この積算により形成された
画像は、コンピュータ15に送られる。
イメージプロセッサ14から送られてきた画像情報は、
コンピュータ15のフレームメモリに書き込まれる。ま
た、フレームメモリーに書き込まれた画像情報は、内臓
RAMディスクに保存される。二波長測定の場合は、第一
の波長での測定画像（第一画像）と、第二の波長での測
定画像（第二画像）の夫々が保存される。例えば、fura
−２を用いた測定では、第一画像は励起波長340nmで測
定した画像であり、第二画像は励起波長360nmで測定し
た画像である。
コンピュータ15のフレームメモリに書き込まれる。ま
た、フレームメモリーに書き込まれた画像情報は、内臓
RAMディスクに保存される。二波長測定の場合は、第一
の波長での測定画像（第一画像）と、第二の波長での測
定画像（第二画像）の夫々が保存される。例えば、fura
−２を用いた測定では、第一画像は励起波長340nmで測
定した画像であり、第二画像は励起波長360nmで測定し
た画像である。
コンピュータ15は、画像処理プログラムに従って、各
画素ごとに第一画像および第二画像を比較し、蛍光強度
の比（例えばI340/I360）を計算する。また、第３図に
示したような検量線に基づいて、この蛍光強度の比をカ
ルシウム濃度に変換する。こうして得られたカルシウム
濃度に対応して、夫々の画素には疑似カラーが付与され
る。即ち、カルシウム濃度が同一の画素に対しては同一
の疑似カラーが付与され、カルシウム濃度の異なる画素
に対しては異なった疑似カラーが付与される。その結
果、細胞内の各部におけるカルシウム濃度は、個々の具
体的な濃度に対応した色彩として与えられる。また、各
色彩の分布として、細胞内におけるカルシウムの濃度分
布を容易に知ることができる。
画素ごとに第一画像および第二画像を比較し、蛍光強度
の比（例えばI340/I360）を計算する。また、第３図に
示したような検量線に基づいて、この蛍光強度の比をカ
ルシウム濃度に変換する。こうして得られたカルシウム
濃度に対応して、夫々の画素には疑似カラーが付与され
る。即ち、カルシウム濃度が同一の画素に対しては同一
の疑似カラーが付与され、カルシウム濃度の異なる画素
に対しては異なった疑似カラーが付与される。その結
果、細胞内の各部におけるカルシウム濃度は、個々の具
体的な濃度に対応した色彩として与えられる。また、各
色彩の分布として、細胞内におけるカルシウムの濃度分
布を容易に知ることができる。
なお、コンピュータ15のRAMディスクに書き込まれた
各段階の画像データは、何れも必要に応じてフロッピー
ディスクに保存することができる。また、コンピュータ
15のRAMディスク又はフロッピーディスクに保存された
画像データは、モニター16の画面に疑似カラーを付した
状態で出力することができる。これによって、細胞内の
カルシウム濃度をカラー画像として観察することができ
る。また、必要に応じて、このカラー画像をプリンタ17
からハードコピーとしてプリントアウトすることができ
る。
各段階の画像データは、何れも必要に応じてフロッピー
ディスクに保存することができる。また、コンピュータ
15のRAMディスク又はフロッピーディスクに保存された
画像データは、モニター16の画面に疑似カラーを付した
状態で出力することができる。これによって、細胞内の
カルシウム濃度をカラー画像として観察することができ
る。また、必要に応じて、このカラー画像をプリンタ17
からハードコピーとしてプリントアウトすることができ
る。
以上の説明から明らかなように、上記の蛍光顕微鏡シ
ステムによれば、蛍光顕微鏡で得られた情報を画像処理
することにより、細胞内のカルシウム濃度を平面的な濃
度分布として観察することができる。しかし、既述した
ように、この方法ではバックグラウンド蛍光値を客観的
に決定できず、また細胞構造と関連付けた画像表示がで
きない欠点がある。
ステムによれば、蛍光顕微鏡で得られた情報を画像処理
することにより、細胞内のカルシウム濃度を平面的な濃
度分布として観察することができる。しかし、既述した
ように、この方法ではバックグラウンド蛍光値を客観的
に決定できず、また細胞構造と関連付けた画像表示がで
きない欠点がある。
そこで、次に本発明の方法を適用して上記欠点を解決
した実施例について説明する。
した実施例について説明する。
第８図は、この実施例のフローチャートを示してい
る。このフローチャートに沿って説明すると、まずステ
ップ１において上記で説明した蛍光顕微鏡システムを用
い、試料細胞10として神経系株化細胞NG108,N115をステ
ージ９にセットする。続くステップ２おいて、試料細胞
10の明視野像を撮影する。第９図は、この白黒階調の明
視野像を示す写真である。図から明らかなように、この
明視野像には細胞の輪郭および内部構造が明瞭に表示さ
れている。この明視野像の画像データは、コンピュータ
15に記憶される。
る。このフローチャートに沿って説明すると、まずステ
ップ１において上記で説明した蛍光顕微鏡システムを用
い、試料細胞10として神経系株化細胞NG108,N115をステ
ージ９にセットする。続くステップ２おいて、試料細胞
10の明視野像を撮影する。第９図は、この白黒階調の明
視野像を示す写真である。図から明らかなように、この
明視野像には細胞の輪郭および内部構造が明瞭に表示さ
れている。この明視野像の画像データは、コンピュータ
15に記憶される。
ステップ３においては、試料細胞10に蛍光プローブと
してfura−２を投与した後、波長340nm及び波長360nmの
二つの励起光を用いて波長510nmの蛍光強度を測定しす
ることにより、蛍光強度像を得る。得られた二つの蛍光
強度像は、コンピュータ15に記憶される。
してfura−２を投与した後、波長340nm及び波長360nmの
二つの励起光を用いて波長510nmの蛍光強度を測定しす
ることにより、蛍光強度像を得る。得られた二つの蛍光
強度像は、コンピュータ15に記憶される。
ステップ４においては、次のようにしてバックグラウ
ンド蛍光の値が決定される。即ち、コンピュータ15に保
存されている明視野像から、第９図のＩ−Ｉ線で示した
位置での輝度プロファイルをモニター16に表示する。ま
た、コンピュータ15に保存されている二つの蛍光強度像
から、同じ位置で蛍光強度プロファイルをモニター15に
重複表示させる。この重複表示は、特に座標変換を行う
ことなく可能である。この重複表示されたプロファイル
を第10図に示す。図中、曲線は明視野像の輝度プロフ
ァイル、曲線は励起波長340nmでの蛍光強度プロファ
イル、曲線は励起波長360nmでの蛍光強度プロファイ
ルである。明視野像の輝度プロファイルから、破線A,
Bで示す位置が細胞の輪郭に対応することが分かる。即
ち、蛍光強度プロファイルの破線A,Bの外側の部分は、
細胞外のバックグラウンド蛍光である。従って、バック
グラウンド蛍光値の決定に際しては、破線A,Bと蛍光強
度プロファイル曲線，との交点における蛍光強度
（この例では10）を採用すればよい。直線Ｃは、こうし
て決定されたバックグラウンドレベルを示している。こ
の方法により、バックグラウンド蛍光値を客観的かつ正
確に決定することができる。ここでもし不正確なバック
グラウンド値（例えば５または15）を決定すると、後の
ステップで得られるカルシウムの２次元濃度分布像が明
視野像の細胞領域に一致しなくなってしまう。
ンド蛍光の値が決定される。即ち、コンピュータ15に保
存されている明視野像から、第９図のＩ−Ｉ線で示した
位置での輝度プロファイルをモニター16に表示する。ま
た、コンピュータ15に保存されている二つの蛍光強度像
から、同じ位置で蛍光強度プロファイルをモニター15に
重複表示させる。この重複表示は、特に座標変換を行う
ことなく可能である。この重複表示されたプロファイル
を第10図に示す。図中、曲線は明視野像の輝度プロフ
ァイル、曲線は励起波長340nmでの蛍光強度プロファ
イル、曲線は励起波長360nmでの蛍光強度プロファイ
ルである。明視野像の輝度プロファイルから、破線A,
Bで示す位置が細胞の輪郭に対応することが分かる。即
ち、蛍光強度プロファイルの破線A,Bの外側の部分は、
細胞外のバックグラウンド蛍光である。従って、バック
グラウンド蛍光値の決定に際しては、破線A,Bと蛍光強
度プロファイル曲線，との交点における蛍光強度
（この例では10）を採用すればよい。直線Ｃは、こうし
て決定されたバックグラウンドレベルを示している。こ
の方法により、バックグラウンド蛍光値を客観的かつ正
確に決定することができる。ここでもし不正確なバック
グラウンド値（例えば５または15）を決定すると、後の
ステップで得られるカルシウムの２次元濃度分布像が明
視野像の細胞領域に一致しなくなってしまう。
ステップ５においては、まず上記で決定されたバック
グラウンド蛍光値によって、コンピュータ15に保存され
ている二つの蛍光強度像を補正する。この補正は、蛍光
強度像における各点の蛍光強度値から上記のバックグラ
ウンド蛍光値を差し引くことによって行われる。次に、
こうして補正された二つの蛍光強度像をコンピュータ15
により画像処理し、画像割り算を行なう。これによっ
て、各画素においてI340/I360の値を表示した画像が得
られる。
グラウンド蛍光値によって、コンピュータ15に保存され
ている二つの蛍光強度像を補正する。この補正は、蛍光
強度像における各点の蛍光強度値から上記のバックグラ
ウンド蛍光値を差し引くことによって行われる。次に、
こうして補正された二つの蛍光強度像をコンピュータ15
により画像処理し、画像割り算を行なう。これによっ
て、各画素においてI340/I360の値を表示した画像が得
られる。
ステップ６においては、第３図に示した検量線に基づ
き、ステップ５で得た蛍光強度比をカルシウム濃度に変
換する。更に、得られたカルシウム濃度に対応して、夫
々の画素には疑似カラーを付与する。これにより、カル
シウム濃度が同一の画素に対しては同一の疑似カラーが
付与された２次元濃度分布像が得られる。第11図は、得
られた２次元濃度分布像を示す写真である。この写真は
白黒写真であるが、実際に得られた写真は、カルシウム
濃度に応じた疑似カラーが付与されたカラー写真であ
る。なお、上記の２次元濃度分布像はコンピュータ15に
保存される。
き、ステップ５で得た蛍光強度比をカルシウム濃度に変
換する。更に、得られたカルシウム濃度に対応して、夫
々の画素には疑似カラーを付与する。これにより、カル
シウム濃度が同一の画素に対しては同一の疑似カラーが
付与された２次元濃度分布像が得られる。第11図は、得
られた２次元濃度分布像を示す写真である。この写真は
白黒写真であるが、実際に得られた写真は、カルシウム
濃度に応じた疑似カラーが付与されたカラー写真であ
る。なお、上記の２次元濃度分布像はコンピュータ15に
保存される。
最後のステップ７において、上記の２次元濃度分布像
はステップ２で得られた明視野像と重ね合わされる。こ
の重ね合わせには、第１図について既に説明したよう
に、アフィン変換およびエクスクルーシブオア（XOR）
演算による方法を用いる。これらの変換および演算はコ
ンピュータ15によって行なう。第12図は、こうして得ら
れた重ね合わせ像を示す写真である。この写真は白黒写
真であるが、実際に得られた写真は、白黒階調の細胞の
明視野像にカルシウム濃度分布を示す疑似カラー像が表
示されたカラー写真である。この合成画像には、細胞内
のカルシウム濃度分布が細胞構造との関連において明瞭
に示されている。
はステップ２で得られた明視野像と重ね合わされる。こ
の重ね合わせには、第１図について既に説明したよう
に、アフィン変換およびエクスクルーシブオア（XOR）
演算による方法を用いる。これらの変換および演算はコ
ンピュータ15によって行なう。第12図は、こうして得ら
れた重ね合わせ像を示す写真である。この写真は白黒写
真であるが、実際に得られた写真は、白黒階調の細胞の
明視野像にカルシウム濃度分布を示す疑似カラー像が表
示されたカラー写真である。この合成画像には、細胞内
のカルシウム濃度分布が細胞構造との関連において明瞭
に示されている。
なお、上記の実施例は細胞像として明視野像を用いた
が、細胞像には明視野像の外、位相差像、ノマルスキー
像および偏光像のなかから細胞の内と外とで輝度が明確
に異なるものを選択して用いればよい。
が、細胞像には明視野像の外、位相差像、ノマルスキー
像および偏光像のなかから細胞の内と外とで輝度が明確
に異なるものを選択して用いればよい。
また、上記実施例は細胞内のカルシウムイオン濃度の
定量に関するものであるが、カルシウムのみならず水素
イオン濃度、蛋白質等の巨大分子濃度等の測定にも同様
に適用でき、何れの場合にも上記と同様の効果を得るこ
とができる。
定量に関するものであるが、カルシウムのみならず水素
イオン濃度、蛋白質等の巨大分子濃度等の測定にも同様
に適用でき、何れの場合にも上記と同様の効果を得るこ
とができる。
以上詳述したように、本発明によれば細胞内の２次元
濃度分布を細胞の輪郭と関連付けて表示した画像を得る
ことができ、且つバックグラウンド蛍光のレベルを客観
的に決定して正確なイオン濃度を測定できる等、顕著な
効果を得ることができる。
濃度分布を細胞の輪郭と関連付けて表示した画像を得る
ことができ、且つバックグラウンド蛍光のレベルを客観
的に決定して正確なイオン濃度を測定できる等、顕著な
効果を得ることができる。
第１図は本発明において画像の重ね合わせを行なうため
の方法を示すフローチャート、第２図〜第５図は、蛍光
プローブを用いたイオン濃度測定法の原理を説明するた
めの図、第６図および第７図は本発明に用いる蛍光顕微
鏡システムの説明図、第８図は本発明の一実施例を示す
フローチャート、第９図は本発明の一実施例において得
られた細胞の明視野像を示す顕微鏡写真、第10図は本発
明の一実施例においてバックグラウンド蛍光値を決定し
た方法を示す図、第11図は本発明の一実施例において得
られたカルシウムの２次元濃度分布像を示す顕微鏡写
真、第12図は本発明の一実施例において得られた明視野
像およびカルシウム２次元濃度分布像の重ね合わせ像を
示す顕微鏡写真である。 １……照明装置、２……Hgランプ、３……投光管、４…
…濃淡フィルタ,5……干渉フィルタ、６……フィルタユ
ニット、８……対物レンズ、９……ステージ、10……試
料細胞、12……接眼レンズ,13……TVカメラ、13、14…
…イメージプロセッサ、15……コンピュータ、16……モ
ニタ、17……プリンタ、18……ステッピングモータ、19
……エミッションフィルタ
の方法を示すフローチャート、第２図〜第５図は、蛍光
プローブを用いたイオン濃度測定法の原理を説明するた
めの図、第６図および第７図は本発明に用いる蛍光顕微
鏡システムの説明図、第８図は本発明の一実施例を示す
フローチャート、第９図は本発明の一実施例において得
られた細胞の明視野像を示す顕微鏡写真、第10図は本発
明の一実施例においてバックグラウンド蛍光値を決定し
た方法を示す図、第11図は本発明の一実施例において得
られたカルシウムの２次元濃度分布像を示す顕微鏡写
真、第12図は本発明の一実施例において得られた明視野
像およびカルシウム２次元濃度分布像の重ね合わせ像を
示す顕微鏡写真である。 １……照明装置、２……Hgランプ、３……投光管、４…
…濃淡フィルタ,5……干渉フィルタ、６……フィルタユ
ニット、８……対物レンズ、９……ステージ、10……試
料細胞、12……接眼レンズ,13……TVカメラ、13、14…
…イメージプロセッサ、15……コンピュータ、16……モ
ニタ、17……プリンタ、18……ステッピングモータ、19
……エミッションフィルタ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−25536（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−28542（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−102342（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−192632（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−154638（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/62 - 21/74
Claims (2)
- 【請求項１】蛍光プローブの蛍光スペクトル変化または
励起スペクトル変化に基づいて、生活細胞内における所
定の測定対象イオンの２次元濃度分布像を形成する方法
であって、 細胞内に蛍光プローブを投与する工程と、 該細胞を含む領域において、前記蛍光プローブからの蛍
光を測定することにより蛍光強度分布像を求める工程
と、 前記細胞を光学的に測定することにより、前記細胞の明
視野像、位相差像、ノマルスキー像および偏光像からな
る群から選択される細胞像を得る工程と、 前記蛍光強度分布像のプロファイルおよび前記細胞像の
プロファイルから、バックグラウンド蛍光値を決定する
工程と、 前記蛍光強度分布像から前記バックグラウンド蛍光値を
差し引くことを含む画像処理により、前記測定対象イオ
ンの２次元濃度分布像を形成する工程と、 前記細胞像と前記測定対象イオンの２次元濃度分布像と
を画像処理することにより、両画像をディスプレイ上に
重複表示する工程とを具備したことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記細胞の明視野像、位相差像、ノマルス
キー像および偏光像からなる群から選択される細胞像を
得る工程を、前記蛍光測定により蛍光強度分布像を求め
る工程よりも前に行なう請求項１に記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1218366A JP2799191B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法 |
| US07/563,251 US5097135A (en) | 1989-08-24 | 1990-08-06 | Method of forming a two-dimensional distribution image of ion concentration in a cell |
| FR9010269A FR2651321B1 (fr) | 1989-08-24 | 1990-08-10 | Procede de formation d'une image de la distribution bidimensionnelle de la concentration ionique dans une cellule vivante. |
| DE4026564A DE4026564A1 (de) | 1989-08-24 | 1990-08-22 | Verfahren zum herstellen eines zweidimensionalen verteilungsbildes einer ionenkonzentration in einer zelle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1218366A JP2799191B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0381648A JPH0381648A (ja) | 1991-04-08 |
| JP2799191B2 true JP2799191B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=16718767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1218366A Expired - Fee Related JP2799191B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 細胞内イオンの２次元濃度分布像を形成する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5097135A (ja) |
| JP (1) | JP2799191B2 (ja) |
| DE (1) | DE4026564A1 (ja) |
| FR (1) | FR2651321B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4026821A1 (de) * | 1990-08-24 | 1992-03-05 | Philips Patentverwaltung | Verfahren zur erfassung von anomalien der haut, insbesondere von melanomen, sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| US5461236A (en) * | 1992-06-09 | 1995-10-24 | Herbert R. Gram | Oil spill detection system |
| US5949077A (en) * | 1992-08-10 | 1999-09-07 | Alfano; Robert R. | Technique for imaging an object in or behind a scattering medium |
| JPH07194393A (ja) * | 1992-08-24 | 1995-08-01 | Hamamatsu Photonics Kk | 生細胞内イオン濃度の３波長測光法のための定数最適化方法 |
| DE4228366C2 (de) * | 1992-08-26 | 1995-05-24 | Rainer Dr Uhl | Fluoreszenz-Meßvorrichtung |
| US5355215A (en) * | 1992-09-30 | 1994-10-11 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements |
| FI96638C (fi) * | 1992-11-17 | 1996-07-25 | Biohit Oy | "Inner-filter"-korjaus fluorometripohjaisella monitoimintoisella laitteella |
| US6800452B1 (en) | 1994-08-08 | 2004-10-05 | Science Applications International Corporation | Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays |
| DE69635391T2 (de) * | 1995-12-29 | 2006-08-03 | Basil Ian Shine | Verfahren zur Untersuchung einer Zellprobe |
| US5986271A (en) * | 1997-07-03 | 1999-11-16 | Lazarev; Victor | Fluorescence imaging system |
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| US6702453B2 (en) | 2001-10-26 | 2004-03-09 | Birchwood Lighting, Inc. | Flexible light fixture |
| DE10327382A1 (de) * | 2003-06-16 | 2005-01-05 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie |
| US7396650B2 (en) * | 2003-06-27 | 2008-07-08 | Commissariat A L'energie Atomique | Method for dosing a biological or chemical sample |
| FR2856792B1 (fr) * | 2003-06-27 | 2006-09-15 | Commissariat Energie Atomique | Procede et dispositif de dosage d'un echantillon biologique ou chimique |
| US7491943B2 (en) * | 2005-01-13 | 2009-02-17 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Method and apparatus for UV imaging |
| US20090092319A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Olympus Corporation | Phase-information extraction method |
| DE102008057115B4 (de) * | 2008-11-13 | 2013-11-28 | Lre Medical Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe und Vorrichtung zu seiner Durchführung |
| FR2942899B1 (fr) * | 2009-03-03 | 2011-09-23 | Jose Balbuena | Dispositif et procede d'analyse optique de documents |
| JP5387328B2 (ja) * | 2009-08-31 | 2014-01-15 | ソニー株式会社 | 蛍光像取得装置、蛍光像取得方法及び蛍光像取得プログラム |
| WO2011097508A2 (en) * | 2010-02-04 | 2011-08-11 | University Of Southern California | Combined spectral and polarimetry imaging and diagnostics |
| DE102011111315A1 (de) * | 2011-08-26 | 2013-02-28 | Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt | Verfahren zur Fluoreszenzmessung |
| JP6253225B2 (ja) * | 2012-09-18 | 2017-12-27 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法 |
| JP5822054B1 (ja) * | 2013-12-18 | 2015-11-24 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 |
| WO2016140199A1 (ja) * | 2015-03-02 | 2016-09-09 | シチズンホールディングス株式会社 | 光測定装置及びこれを備えた歯ブラシ |
| CN105548097B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-06-29 | 贵州大学 | 一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法 |
| JP6742724B2 (ja) * | 2015-12-28 | 2020-08-19 | シスメックス株式会社 | 細胞領域決定方法、細胞撮像システム、細胞画像の処理装置及びコンピュータプログラム |
| WO2019012771A1 (ja) * | 2017-07-11 | 2019-01-17 | 浜松ホトニクス株式会社 | 試料観察装置及び試料観察方法 |
| JP6656210B2 (ja) * | 2017-07-21 | 2020-03-04 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | 分光蛍光光度計 |
| JP6919890B2 (ja) * | 2017-07-21 | 2021-08-18 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | 光分析装置用の表示装置 |
| DE102021001955B4 (de) | 2021-04-14 | 2023-03-23 | Baumer Inspection Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur fluoreszenzbasierten Inspektion sowie Prüfanordung mit einer solchen Vorrichtung |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4631750A (en) * | 1980-04-11 | 1986-12-23 | Ampex Corporation | Method and system for spacially transforming images |
| US4492752A (en) * | 1982-09-03 | 1985-01-08 | Ortho Diagnostics Systems Inc. | Method for discriminating between unstained and absorbing dye stained cells |
| EP0112401B1 (en) * | 1982-12-27 | 1987-04-22 | International Business Machines Corporation | Optical near-field scanning microscope |
| US4495293A (en) * | 1983-02-24 | 1985-01-22 | Abbott Laboratories | Fluorometric assay |
| US4668868A (en) * | 1986-02-20 | 1987-05-26 | Noller Hans T | Apparatus for performing fluoroimmunoassays of biological specimens |
| US5049673A (en) * | 1987-10-30 | 1991-09-17 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent indicator dyes for calcium working at long wavelengths |
| JP2749069B2 (ja) * | 1988-04-26 | 1998-05-13 | オリンパス光学工業株式会社 | 蛍光顕微鏡装置 |
| JPH0212060A (ja) * | 1988-06-30 | 1990-01-17 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 細胞の状態のモニター方法及びその装置 |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP1218366A patent/JP2799191B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-08-06 US US07/563,251 patent/US5097135A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-10 FR FR9010269A patent/FR2651321B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-22 DE DE4026564A patent/DE4026564A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0381648A (ja) | 1991-04-08 |
| FR2651321B1 (fr) | 1994-04-29 |
| FR2651321A1 (fr) | 1991-03-01 |
| DE4026564C2 (ja) | 1993-05-19 |
| DE4026564A1 (de) | 1991-02-28 |
| US5097135A (en) | 1992-03-17 |
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