JP2781749B2 - マイコバクテリアの溶菌方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は分子生物学の分野の
発明である。特に、本発明は細胞溶解の領域の発明であ
る。最も特定的には、本発明はマイコバクテリアの溶菌
方法の発明である。

【０００２】

【従来の技術】マイコバクテリアは、大きくて多様で広
く分布している、高い細胞壁脂質含量と遅い増殖速度と
を有する好気性で非胞子形成性の非運動型桿菌のファミ
リーである。マイコバクテリウム属のメンバーでは、病
原力が実に様々である。幾つかのマイコバクテリアは無
害であるが、他のヒト型結核菌のようなものはかなり病
原性である。マイコバクテリウム属の種は、それらの増
殖速度、色素生産性、動物病原性、及び生化学反応性に
より区別される。

【０００３】マイコバクテリウム科の微生物の如き病原
性微生物の存在を確認する多くの検出方法は、それら微
生物の溶解に依拠している。しかしながら、商業的な及
び公表されたマイコバクテリウム科の溶菌操作は、高価
であり、労力を要し、時間がかかり、そして腐蝕性の試
薬、特殊な装置、又はそれらの両方を必要とし得る。こ
れは、一般に溶菌に厳しい条件を要求しない他の型の細
胞についての溶解手順と対照的である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】最近のマイコバクテリ
アの遺伝学の進歩及び後天性免疫不全症候群を患ってい
る人々の如き患者における日和見病原菌への興味の高ま
りで、マイコバクテリウム科の菌を迅速に溶菌するため
の操作が必要であるという事実に注意が集まっている。
簡単、迅速かつ溶菌からの望まれる物質に対し分解性で
ないマイコバクテリアの溶菌方法を有することは有益で
あろう。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、簡単、迅速か
つ溶菌からの望まれる物質に対し分解性でないマイコバ
クテリアの溶菌方法を提供する。１つの態様において
は、マイコバクテリアを溶菌有効量の熱に曝すことから
本質的になる方法が提供される。

【０００６】更なる態様は、本発明のこの方法を用いて
マイコバクテリアの溶菌から遊離する特定の細胞成分を
単離することを含む。

【０００７】特有の態様は、マイコバクテリアから核酸
を単離して、本発明の方法の実施から得られるその核酸
を増幅する追加段階も含む。

【０００８】他の態様は、溶菌されたマイコバクテリア
にマイコバクテリア同定剤を添加してマイコバクテリア
の存在を同定することを含む。

【０００９】本発明の方法には１つの段階が含まれるだ
けであり、先行方法と比較して好都合であり、器具が殆
ど必要でないので、特に有益である。本発明の方法を実
施することによって、最小限の労力でマイコバクテリア
を溶菌することが可能になる。加えて、本発明を実施す
れば、マイコバクテリアからデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）が遊離される。ＤＮＡが遊離されるだけでなく、こ
の遊離したＤＮＡは、プローブハイブリダイゼーショ
ン、制限酵素分析、増幅等によるその後の分析にも適し
ている。

【００１０】本明細書で用いる場合“溶菌有効量の熱”
とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の如き細胞内成分を遊離する高
温の量のことであるが、望ましい細胞内成分を破壊した
りそれを後で使用するのに適さないものにしたりしない
量のことをいう。本発明の特に効果的な１つの態様にお
いては、この溶菌有効量の熱は強制熱風として与えられ
る。

【００１１】本発明は、マイコバクテリアの溶菌及びそ
れによるマイコバクテリアからのＤＮＡ及び細胞性物質
の遊離を可能にする。

【００１２】溶菌のためにマイコバクテリアを加熱する
ことは、腐蝕性の化学物質の使用、時間のかかる培養、
及び French プレス、 Hughes プレス、プローブの音波
処理、バス音波処理装置、凍結−解凍、ガラスビーズ、
Ribi 加圧細胞 (the Ribi pressure cell) 等の機械的
方法を包含する公知のマイコバクテリア溶菌方法（表Ｉ
を参照）よりも有益である。

【００１３】種々の微生物を溶菌するのに非常に多くの
酵素及び操作が存在するが、マイコバクテリアを溶菌す
るために熱をかけることはユニークである。マイコバク
テリアは容易に溶菌しないことで有名である。一般に、
マイコバクテリアの溶菌に帰着する操作は、所望の細胞
内容物も破壊してしまう。溶菌操作で細胞の内容物が破
壊されなかったとしても、それは、一般に、タイミング
が適切でありかつ骨の折れる手順を用いた結果に過ぎな
い。マイコバクテリアは、物理的ストレスに極めて抵抗
性なので、普通の細菌を死滅させる濃度及び消化操作に
曝すことができる（表ＩとIIを比較のこと）。従って、
この途方もなく溶菌抵抗性のマイコバクテリアを、あま
り猛烈でない細菌を溶菌できるに過ぎない熱だけで溶菌
できることは意外である。また、加熱よりも厳しい他の
条件が作用しないので、加熱がマイコバクテリアの溶菌
にそれほどよく作用することも意外である。しかしなが
ら、本発明を実施すると、マイコバクテリアが溶菌さ
れ、その後に、検出方法及び増幅の如き種々の目的に用
いるのに適する使用可能なＤＮＡ片、並びに遊離ＲＮＡ
及び他の細胞成分が生成する。本発明の方法は、溶菌し
た微生物からＤＮＡ及びＲＮＡを一本鎖の形で提供する
ことができる。

【００１４】表Ｉ及びIIには、相当数のマイコバクテリ
ア溶菌手順が記載されている。これら全ての手順は、本
発明よりも多くの関わりを必要としている。

【００１５】

【表１】 表 Ｉ 商業的な及び公表されたマイコバクテリアの溶菌方法 著者／出典 方法 参照文献 GenProbe 溶菌緩衝液及びガラスビーズと共に15 Gen-Probe package 分間の音波処理 insert Pierreら 0.1N NaOH, 2M NaCl, 0.5% SDSと共に J. Clin. Micro. 29(1991) 95℃で15分間 (4):712-717 Hurleyら 蒸留フェノール及び 0.1mmジルコニウ Int. J. Systematic (1988) ムビーズと共にミニビーズビーター Bacteriology 38(2): (Biospec Prod. Bartlesville,オクラ 143-146 ホマ州）中で３分間 Labidi マイコバクテリアを 1.4% グリシン, Archs. Inst. Pasteur 60μg/ml D−シクロセリン, 1mg/ml Tunis. 655(3-4):261- 塩化リチウム, 200 μg/mlリゾチーム, 270 2mg/ml EDTA 中での増殖によりスフェ ロプラストに転化；次いで遠心分離に より沈殿させて 1% SDS 中で65℃で15 分間加熱 Butcher ら 10mg/ml サブチリシンと共に37℃で３ Gut 29:1222-1228 (1988) 時間；次いで 50mg/mlリゾチームと共 に37℃で３時間；次いで 3mg/ml プロ ナーゼ及び 1% SDS と共に37℃で12時 間 Wayne と 37℃で72時間激しくエアレーション； J. Bacteriol. 95(4): Gross 次いで10μM EDTA, 1mg/mlプロナーゼ 1481-1482 (1968) と共に嫌気的に37℃で24時間；次いで 5% DOCと共に56℃で90分間 Brisson-Noel 培養：0.1M NaOH, 2M NaCl, 0.5% SDS Lancet, 11/4:1069- ら(1989) と共に95℃で15分間 1071 血液：10mg/ml リゾチームと共に37℃ で４時間；次いで 5mg/ml pro K 及び 0.1% Triton X-100 と共に55℃で16時 間 De Witら 10mM Tris-HCl, pH8.5, 1mM EDTA,150 J. Clin. Micro. 28 mM EDTA と共に70℃で30分間；次いで (11):(1990) 緩衝フェノール：1.5% SDS（1:1 容量） 2437-2441 と共にオービタル震盪をしながら37℃ で３時間 Roberts ら 0.85% NaClで３回洗浄；次いで 70% J. Clin. Micro. 25 (1987) エタノールと共に20℃で15分間；次い (7):1239-1243 で−70℃ Pickenら 100mg/0.8ml リゾチームと共に37℃で Mol. Cell. Probes (1988) 16時間；次いで 1mg/ml pro K と共に 2:289-304 〜37℃で１時間；次いで 2% SDS と共 に50℃で６時間 Sjobringら SDS;次いでpro K によりタンパク質を J. Clin. Micro. 28 除去；次いで CTAB で沈殿 (10) 2200-2204 Whipple ら 8000U/0.5ml リパーゼと共に37℃で２ J. Clin. Micro. 25 (1987) 時間；次いで 5mg/ml リゾチームと共 (8):1511-1515 に37℃で２時間；次いで 2mg/ml pro K 及び 1% SDS と共に50℃で16時間； 次いで 0.4倍容量の 5M 酢酸カリウム と共に０℃で10分間 Varyら 10mg/ml サブチリシンと共に37℃で３ J. Clin. Micro. 28 (1990) 時間；次いで 5mg/ml リゾチームと共 (5):933-937 に50℃で３時間；次いで 3mg/ml プロ ナーゼ及び 1% SDS と共に18時間；次 いで新しい 3mg/ml プロナーゼと共に ６時間 Eisenachら D-シクロセリンと共に24〜72時間；15% Am. Rev. Resp. Dis.( 1986) スクロース中の 1mg/ml リゾチーム, 133 1065-1068 50mM Tris-HCl, 50mM EDTAと共に37℃ で30分間；次いで 0.1mg/ml pro K と 共に25℃で10分間；次いで 1% SDS と 共に37℃で２時間 Patel ら 軽質石油：クロロホルム：緩衝液 (3: J. Gen. Micro. 132:( 1986) 1:1)中でボルテックスをかけて混合し 541-551 ながら15分間；次いで遠心分離；次い で 10mg/mlナガーゼと共に37℃で 2-4 時間；次いで50mg/ml リゾチームと共 に50℃で2-4 時間；次いで 1% SDS 及 び 3mg/ml プロナーゼを間隔を開けて 12時間で添加しながら37℃で 12-36時間 Pao ら 25% スクロース, 0.1M EDTA, 50mM Tubercle 69:27-36 Tris-HCl中の 2 mg/mlリゾチームと共 に37℃で30分間；次いで0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl 中の 0.1% SDS Visuvanathan 70℃で１時間；次いで約12.5 mg/mlの J. Micro. Methods ら (1989) サブチリシンと共に37℃で18時間；次 10:59-64 いで約31mg/ml のリゾチームと共に50 ℃で５時間；次いで約2%のSDS 及び 3mg/mlプロナーゼと共に12時間；次い で新たな 3mg/ml プロナーゼと共に８ 時間 Sritharin NALC沈殿物を 10mM Tris-HCl,pH8.0, Mol. Cell. Probes と Barker 1mM EDTA及び 1% Triton X-100中に懸 5:385-395(1991) 濁させて30分間煮沸 Kolkら NALC沈殿物を 5% Tween 20と10mg/ml J. Clin. Micro. (1992) pro K の消化緩衝液に曝して15分間煮 30:2567-2575 沸 Victorら NALC沈殿物を遠心分離して渦を巻かせ J. Clin. Micro.(1992) る 30:1514-1517 Shawarら NALC沈殿物を 10mM Tris-HCl, 1mM ED J. Clin. Micro. (1993) TA及び 1% Triton X-100の溶菌緩衝液 31:61-65 に曝して30分間煮沸 Plikaytis ら NALC沈殿物を 20mg/mlリゾチームを含 Am. Rev. Respir.Dis. (1991) 有する緩衝液中に懸濁し；0.5M NaOH 144:1160-1163 と 1% SDS を添加して５分間煮沸 Cousins ら NALC沈殿物を75℃で45分間加熱して 2 J. Clin. Micro. (1992) mg/ml リゾチーム, 1% SDS及び 100μ 30:255-258 g/ml pro Kで溶菌 Del Portillo 痰を H₂Oで希釈して10分間煮沸し、次 J. Clin. Micro. ら(1991) いで 2mg/ml リゾチーム中で37℃でイ 29:2163-2168 ンキュベートし、1% SDS及び 250μg/ ml pro Kを添加してから65℃で20分間 インキュベート Buckら 臨床サンプルのNALC沈殿物を16,000× J. Clin. Micro. (1992) g で10分間遠心分離し、次いで30分間 30:1331-1334 音波処理して10分間煮沸 Savic ら サンプルをスプトリシン (sputolysin) J. Inf. Dis. (1992) 操作により液化及び沈殿し；沈殿物を 166:1177-1180 10分間煮沸し、ガラスビーズと混合し、 40μg pro K 及び 0.5% Tween 20と共 に37℃で30分間インキュベートして60 ℃で20分間音波処理 Shankar ら サンプルを遠心分離して沈殿物を0.1N Lancet NaOH, 1M NaCl 及び 0.5% SDS に曝し； 33:5-7 次いで95℃で15分間加熱 Pierreら サンプルを SDS操作により液化及び沈 J. Clin. Micro. (1991) 殿し；次いで沈殿物を0.1N NaOH, 2M 29:712-717 NaCl及び 0.5% SDS と共に95℃で15分 間インキュベート Thierry ら 上の Pierre ら (1991) と同じ Mol. Cell. Probes(1992) 6:181-191 Brisson-Noel 上の Pierre ら (1989) と同じ Lancet, Nov.4(1989) 1069-1071 DeWit ら 胸膜液をポリエチレングリコール (PE J. Clin. Micro. (1990) G)と混合し、遠心分離して沈殿物をフ 28:2437-2441 ェノールで緩衝した 10% SDSで37℃で ３時間抽出 Sjoborg ら サンプルをスプトリシン操作により液 J. Clin. Micro. (1990) 化及び沈殿し；沈殿物を 50mM Tris中 28:2200-2204 に懸濁し；５分間煮沸し；そしてガラ スビーズと共に50℃で15分間音波処理 凡例： SDS,ドデシル硫酸ナトリウム；CTAB, セチルトリメチルアンモニウム・ ブロミド；pro K,プロテナーゼＫ；Tris-HCl，トリス（ヒドロキシメ チル）アミノメタン塩酸；EDTA，エチレンジアミン四酢酸。

【００１６】

【表２】 表 II 公表された非マイコバクテリア細胞の溶解手順の例 著者／サンプル 方法 参照文献 deKloet ／酵母 20U/mlリチカーゼと共に32℃で１ J. Micro Meth. 2:189 分間 -196 Monsenら／ 5mM EDTA, 0.5% Triron X-100 中 FEMS Micro. letters 連鎖球菌 の 0.1mg/ml ムタノリシン (muta 16:19-24(1983) nolysin)と共に37℃で5-60分間 Chassy／グラム 1.0mg 細菌細胞当たり1.2mg リゾ Appl.Env.Microbiol. 陽性グルフリダ チームと共に37℃で60分間 39(1):153-158 (Gluffrida)菌(1980) Gross-Bellard ら 50mg/ml pro K と共に37℃で12時 Eur. J:Biochem.／哺乳動物 間 36:32-38 Grimbergら／ 10mg/ml Tris-HCl, 10mM NaCl, Nucleic Acids Res. 血液細胞核 10mM EDTA 中の 1mg/ml pro K と 17(20):8390(1989) 共に37℃で２時間 Morenoら／血液 0.4M Tris-HCl, 0.1M EDTA, 1% Nucleic Acids Res. (1989) SDS 中の 200μg pro K と共に50 17(20):8393 ℃で１時間 Birnboim & Doly 2mg/mlリゾチームと共に０℃で30 Nucleic Acids Res. ／大腸菌 (1979) 分間；次いで 0.2N NaOH, 1% SDS 7(6):1513-1523 と共に０℃で５分間 Klein ら／大腸 10mM Tris-HCl 中の1mg/mlリゾチ Plasmid 3:88-91菌 (1980) ームと共に20℃で15分間 溶菌から遊離した細胞成分の後の使用には、マイコバク
テリアの同定及び、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増殖
（Strand Displacement Amplification,ＳＤＡ）、リガ
ーゼ連鎖反応等の如き手段による核酸の増殖が含まれ
る。同定は、マイコバクテリア同定剤によって行うこと
ができる。同定剤とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸
等を含む核酸プローブを含む、マイコバクテリアを同定
するのに適する物質のことをいう。

【００１７】例えば、特定のマイコバクテリアの存在を
同定するためのプローブの使用は、一段階同定法におい
て用いることができる。例えば、サンプルを得たら、こ
のサンプルに熱をかけてから同定剤を添加する。そのサ
ンプルが痰サンプルであるときは、まず、このサンプル
をＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）及び水酸
化ナトリウムのような液化剤で消化する。次いで、その
同定剤に用いるために選んだマーカー（例えば、検出さ
れる信号）に依存して、マイコバクテリアの存在を種々
の手段により検出することができる。マイコバクテリア
の存在の同定手段は、通常、用いられる同定剤により決
まる。例えば、核酸プローブ（例えば、マイコバクテリ
アの種に対して特異性であるプローブ）は、典型的には
¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、蛍光色素、化学発光性又は比色測定用酵
素等で標識される。次いで、そのマーカーを検出する。
この検出は、その特定のマイコバクテリアが存在すると
いう指標になる。他の検出手段には、サザーンブロット
分析、電気泳動ゲル可視化等が含まれる。検出は、サン
プル及び状況に依存して、先立って増殖させてから行っ
ても増殖させないで行ってもよい。

【００１８】マイコバクテリアが痰の如きサンプルの形
で又は単離された形で得られたなら本発明の方法を用い
ることができる。マイコバクテリアは、便、痰、尿、血
清、組織、他の体液を含む種々の供給源から単離される
か、又は公営若しくは私営の培養物収集所等から得られ
る。典型的には、種々の供給源から得られたマイコバク
テリアを培養する。これには非常に時間がかかり、培養
期間は３〜６週間に達する。しかしながら、本発明の方
法を実施することにより、培養の必要性を排除すること
ができる。培養を望まない場合には、一般には、まず細
胞を慣用的なサンプル処理方法により供給源から単離
し、次いで通常は遠心分離によって沈殿させて細胞懸濁
液にする。次いで、この細胞懸濁液中のマイコバクテリ
アを熱に曝す。

【００１９】臨床サンプルで本発明の方法を用いれるこ
とは特に有益である。その細胞内成分が望まれる微生物
を典型的には約６０℃〜約１００℃の範囲の熱に曝す。
個々の微生物についての熱の範囲は、この範囲内で熱を
変動させながらその微生物からの所望の標的分子の放出
を定量することによって容易に得ることができる。熱が
微生物を溶解させ、その後に細胞内成分が放出される。
熱を使用する上での唯一の制限は、興味の対象である特
定の細胞内成分がその熱による破壊に感受性でないとい
うことである。従って、細胞内成分を放出させるために
用いる熱により破壊されないそれら成分は、本発明の方
法を用いることにより得ることができる。本発明の方法
では種々の加熱手段を利用できる。加熱手段には、水
浴、マイクロ波、対流オーブン、強制熱風オーブン等が
含まれる。

【００２０】本発明の方法は、微生物からＤＮＡ又はＲ
ＮＡを得るのに特に有益である。本発明の方法は、ＤＮ
Ａ及びＲＮＡが一本鎖の形で微生物から遊離できるよう
にする。一般に、ＤＮＡを得るための溶菌操作では、Ｄ
ＮＡは二本鎖の形で得られ、次いでこの二本鎖型を特別
な段階に付して、後の使用のために一本鎖ＤＮＡを得
る。かくして、本発明の方法は、後の使用に容易に用い
ることができる形でＤＮＡ及びＲＮＡを提供するので、
一本鎖の核酸を得るために水酸化ナトリウムの如き腐蝕
性の化学薬品を用いる必要がない。殆どの検出及び増幅
操作は、ＤＮＡ及びＲＮＡが一本鎖型であることを要す
る。種々の増幅方法が利用可能であり、例えば、鎖置換
増殖（ＳＤＡ）(Walker G.T.ら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89,392 (1992))、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）(PCR Technology, H.A. Erlich編 (Stockton Pres
s, New York, NY 1989)）、転写基礎増幅システム（tra
nscription-based amplification system，ＴＡＳ）(Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)）、連結増
幅反応（ligation amplification reaction,ＬＡＲ）(G
enomics 4:560 (1989)）、リガーゼ基礎増幅システム
（ligase based amplification system,ＬＡＳ）(Gene
89:117 (1990))、及びＱＢレプリカーゼ (Infect.Dis.
162:13 (1990)）がある。いずれのサンプル調製法も標
的分子に接触し易くして感度を向上させるのが目的であ
る。そのような目的は、サンプルを調製する方法、標的
プローブの比活性、及びサンプルを調製する培地又は物
質の選択を考慮に入れることによって達成される。

【００２１】細胞内成分を得るのに要する加熱時間は、
約２分から約２０分の範囲である。加熱の量及び加熱時
間は、細胞内成分が得られる供給源に依存して、溶菌さ
れるマイコバクテリアの一部をサンプリングして溶菌の
兆候を検査する（例えば、細胞内成分を検出する）こと
によって容易に見出せる。

【００２２】本発明の最も基本的な態様においては、所
望の細胞内成分を含有するサンプル（臨床サンプル又は
培養サンプル）を加熱すれば使用可能な成分が簡単に得
られる。微生物をＨ₂ Ｏ中で溶菌してもよいが、Ｔｒｉ
ｓ緩衝生理食塩水（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、リン酸緩衝生理食塩水
（５０ｍＭリン酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，
ｐＨ８．０）、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８，５０ｍＭＫＣｌ，
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂)、Ｒｅａｃｔ６（緩衝液名Ｒｅ
ａｃｔ６は、Bethesda Research Labs により登録され
ている）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１，
５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂)、リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０〜１２．０）、
Ｔｒｉｚｍａ９．０（Sigma ：トリスヒドロキシアミノ
メチルアミン）、及び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５
％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０の如き界面活性剤、の如き
好適な緩衝液中で溶菌してもよい。所望によりこの加熱
したサンプルを遠心分離して上澄み液と沈殿物とを後で
使用できるようにする。

【００２３】サンプルを加熱した後の細胞内成分の使用
には、増幅、検出等が含まれる。放出された細胞内成分
に関連する更なる段階には、所望の成分のその後の精製
が含まれる。例えば、溶菌したサンプルからＤＮＡを得
るための典型的な精製段階には、フェノール／クロロホ
ルム抽出の如き有機抽出又はガラス若しくは珪藻の如き
シリカ表面上への固相吸着が含まれる。

【００２４】本発明の方法は、先立って培養することな
く実施することができる。痰、便、組織、血液、血清等
からの未精製の生物学的サンプルを本発明を実施するこ
とにより溶菌し、そして同じサンプル中で、マイコバク
テリア同定剤で同定することができる。従って、本法
は、臨床、生物学的、食品又は環境サンプル中のマイコ
バクテリアを検出するための簡略化された手段を含む。

【００２５】熱でマイコバクテリアを溶菌する典型的な
手順には、マイコバクテリアのサンプルの短時間（例え
ば、約５分）遠心分離及び得られる上澄み液の排棄が含
まれる。次いで、マイコバクテリアの沈殿物を緩衝混合
液中にもどしてもよい。必要に応じて、あらゆる好適な
緩衝液が作用するであろう。溶菌有効量の熱で短時間イ
ンキュベーションした後、所望の細胞内成分を単離して
もよい。ＤＮＡを単離する慣用的な方法には、フェノー
ル：クロロホルム抽出、ガラスに結合させてから溶離す
る方法等が含まれる。ＤＮＡを単離する慣用的な手順の
例は、T. Maniatis ら, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual (Cold Spring Harbor Lab )(1982) 及び Bo
om ら, J. Clin. Micro. 28:495 (1990) の如き文献中
に見られる。

【００２６】上述のように、溶菌有効量の熱は、水浴、
マイクロ波、対流オーブン及び強制熱風オーブンを含む
種々の供給源から供給することができる。しかしなが
ら、強制熱風オーブンを用いることに伴う幾つかの利点
が存在し、それらには、サンプル管の外部を清浄で乾燥
した状態に維持できること、対流オーブンや加熱ブロッ
クよりも熱伝達が効率的で速いこと、及び優れた再現性
が含まれる。

【００２７】熱水浴とは対照的に、強制熱風オーブン
は、サンプル管の外部表面を濡らさない。かかる濡れた
外部表面は、その後にサンプルを処理する間にサンプル
間の交差コンタミネーションが起こる原因となる。ま
た、表面が濡れていると技術者又は科学者がサンプル管
を手際よく扱ったり操作したりするのが難しくなる。濡
れた外部表面についてのこれら同じような望ましくない
特徴は、液体境界面を有する加熱ブロック中でサンプル
管を加熱する場合にも存在する。

【００２８】対照的に、加熱ブロックが乾式である（即
ち、液体境界面がない）場合は、サンプルへの熱交換が
強制熱風オーブンよりも遅くなり、そして加熱ブロック
の上部の冷却域がサンプルの温度をバラツキなく保つの
を妨げるために再現性が乏しくなる。同じく、対流オー
ブンは外部サンプル管表面を清浄で乾燥した状態に維持
するが、熱伝達が遅いのでサンプルが所望の温度に達す
るのに長時間の遅れが生ずる。

【００２９】サンプルを強制熱風で加熱すると、所望の
サンプル温度に素早く到達でき、結果の再現性が優れて
おり、そしてサンプル管の表面が清浄で乾燥しているた
めにサンプル間の交差コンタミネーションが抑えられる
ことにより、他の加熱方法の上述の望ましくない特徴が
取り除かれるか又は有意に抑えられる。強制熱風加熱で
の温度制御のこの長所は、サンプル管全体の周囲の空気
が急速に動いていることに依っている。

【００３０】強制熱風加熱は、周囲温度から約１５０℃
までの範囲の温度を達成でき、好ましくは周囲温度から
約１００〜１０５℃の所望の温度までに約２分間で到達
できる、あらゆる市販の強制熱風オーブンで行うことが
できる。オーブンを通り抜ける空気の速度は、約３ｍ／
秒〜約６ｍ／秒である。オーブン内での通気パターン
は、全てのサンプル管がバラツキなくかつ均一に所望の
温度に効率良く加熱されるようなパターンであるべきで
ある。市販の強制熱風オーブンでは、通気はサンプル管
又はサンプルを保持している容器に対して一般に水平又
は垂直であるが、サンプル管又は容器が熱風中に実質的
に完全に没してしまう如何なる通気パターン又は配置も
許容できる。

【００３１】加えて、強制熱風加熱での熱伝達はバラツ
キがないために、マイコバクテリアの生育能力の損失又
は死滅がよりバラツキなく起こることが分かった。マイ
コバクテリア微生物の死滅は、これら微生物が感染性で
あるのでその溶菌と同じほど重要であり得る。マイコバ
クテリアの死滅にバラツキがあると、マイコバクテリア
を溶菌して核酸を得ようとする研究者の安全が脅かされ
る。実施例で詳細に説明するが、対流オーブン及び加熱
ブロックは、マイコバクテリアを非感染性にするか又は
死滅させるのに十分な温度に達したサンプルをバラツキ
なく提供することはない。

【００３２】上記の加熱方法の全てにおいて、マイコバ
クテリアサンプルは、加熱している間、栓をした管又は
他の容器内に保持される。従って、その管又は容器内の
蒸気圧は、圧力、絶対温度及び体積間のシャルルの法則
の関係に従って、熱が上昇するにつれて上昇する。管又
は容器内の圧力の簡単な測定の仕方は、Chemical Rubbe
r Company (“CRC") により発刊された the Handbook o
f Chemistry and Physics に提示されている如き、容
易に入手できる表を参照すればよい。

【００３３】本発明を実施することにより溶菌できる重
要なマイコバクテリアには、トリ型結核菌、Ｍ．ゴルド
ナエ (M. gordonae)、ヒト型結核菌、カンサス・マイコ
バクテリウム、Ｍ．フォルチュイツム、Ｍ．ケロナエ
(M. chelonae)、ウシ型結核菌、Ｍ．スクロフラセウ
ム、パラ結核菌、Ｍ．マリヌム、Ｍ．シミアエ (M. sim
iae)、Ｍ．スズルガイ (M. szulgai) 、Ｍ．イントラセ
ルラーレ (M. intracellulare)、Ｍ．キセノピ (xenop
i) 、Ｍ．ウルセランス、らい菌、鼡らい菌、スメグマ
菌、Ｍ．フラベッセンス (M. flavescens)、Ｍ．テラエ
(M. terrae)、Ｍ．ノンクロモゲニクム (M. nonchromo
genicum)、Ｍ．マルモエンセ (M. malmoense)、Ｍ．ア
ジアチクム (M. asiaticum) 、Ｍ．バッカエ (M. vacca
e)、Ｍ．ガストリ (M. gastri)、Ｍ．トリビアレ (M. t
riviale)、Ｍ．ハエモヒルム (M. haemophilum) 、Ｍ．
アフリカヌム (M. africanum) 、Ｍ．サーモレジスタブ
ル (M. thermoresistable)、及びＭ．フレイが含まれ
る。幾つかのマイコバクテリアは病原性である。例え
ば、既に２０億人に感染し、毎年７〜９百万人に感染し
ているヒト型結核菌は、疫学的及び臨床的観点から重要
なマイコバクテリアである。加えて、トリ型結核菌、ウ
シ型結核菌、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．アフリカヌ
ム、らい菌、Ｍ．ケロナエ、パラ結核菌、及びＭ．マリ
ヌムも、疫学的及び臨床的観点から重要である。

【００３４】本発明を実施すれば、種々の検出操作に後
で使用するためのＤＮＡ、ＲＮＡ及び細胞成分を提供す
るマイコバクテリアの迅速で簡単な溶菌操作が提供され
る。

【００３５】以下の実施例は、この明細書に記載した本
発明の具体的態様を説明するものである。当業者には明
らかであろうが、種々の変更及び修飾が可能である。そ
してそれらは本発明の範囲内に属すると考えられる。

【００３６】

【実施例】

実施例１ 目的：ヒト型結核菌の溶菌についての熱単独での効果の
証明 操作：ヒト型結核菌培養物の３ｍｌ沈殿物をＢＡＣＴＥ
Ｃシステム（Becton Dickinson, Towson, メリーランド
州）で７Ｈ１０培地中で培養することにより調製した。
このサンプルを０．５ｍｌのＨ₂ Ｏ中でもどしてから沸
騰水浴中に１５分間浸けた。

【００３７】この溶菌サンプルをフェノール／クロロホ
ルムで２回抽出してからクロロホルム／イソアミルアル
コールで２回抽出した。次いで、これらを−２０℃で一
晩エタノール沈殿した。サンプルを１５０μｌのＨ₂ Ｏ
中でもどした。ＰＣＲミックスを作り、それぞれ５０μ
ｌの溶菌産物を用いてサイクルに付した。１０μｌのＰ
ＣＲ産物をアクリルアミドゲル（１０％）で展開した。
５０μｌの原サンプルも、GENE SCREEN Plusハイブリダ
イゼーション転写膜（DuPontカタログ番号 NEF-976）を
メーカーの使用説明書に従って用いて、スロット (Slo
t) ブロットハイブリダイゼーション分析に用いた。

【００３８】結果：このＰＣＲ産物のエチジウム染色ゲ
ルから、ＰＣＲによる増幅そして該ゲル上での検出が可
能になるのに十分な標的ＤＮＡが加熱で放出されたこと
が示された。このブロットのオートラジオグラムは、Ｄ
ＮＡがこのマイコバクテリアから遊離して放射性プロー
ブにハイブリダイズしていたことを示した。

【００３９】実施例２ 操作：ＢＡＣＴＥＣヒト型結核菌培養物の３ｍｌ沈殿物
を実質的に実施例１の方法に従って調製した。このサン
プルを０．５ｍｌのＨ₂ Ｏ中でもどしてから６０℃で１
５分間音波処理した。この溶菌サンプルをフェノール／
クロロホルムで２回抽出してからクロロホルム／イソア
ミルアルコールで２回抽出した。次いで、これらを−２
０℃で一晩エタノール沈殿した。サンプルを１５０μｌ
のＨ₂ Ｏ中でもどした。ＰＣＲミックスを作り、それぞ
れ５０μｌの溶菌産物を用いてサイクルに付した。１０
μｌのＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル（１０％）で展
開した。５０μｌの原サンプルもスロットブロットハイ
ブリダイゼーション分析に用いた。

【００４０】結果：このＰＣＲ産物のエチジウム染色ゲ
ルから、ＰＣＲによる増幅そして該ゲル上での検出が可
能になるだけの標的ＤＮＡが音波処理では放出されなか
ったことが示された。このブロットのオートラジオグラ
ムは、ＤＮＡが放射性プローブにハイブリダイズしなか
ったことを示した。従って、音波処理単独では、ヒト型
結核菌からＤＮＡは放出されなかった。

【００４１】実施例３ 操作 ：ＢＡＣＴＥＣヒト型結核菌培養物の３ｍｌ沈殿物
を実質的に実施例１の方法に従って調製した。

【００４２】このサンプルを０．５ｍｌのＨ₂ Ｏ＋２５
μｌ分のガラスビーズ中でもどした。次いで、このサン
プルをビーズと共に沸騰水浴中に１５分間浸けた。

【００４３】この溶菌サンプルをフェノール／クロロホ
ルムで２回抽出してからクロロホルム／イソアミルアル
コールで２回抽出した。これらを−２０℃で一晩エタノ
ール沈殿した。サンプルを１５０μｌのＨ₂ Ｏ中でもど
した。ＰＣＲミックスを作り、それぞれ５０μｌの溶菌
産物を用いてサイクルに付した。１０μｌのＰＣＲ産物
をアクリルアミドゲル（１０％）で展開した。５０μｌ
の原サンプルもスロットブロットハイブリダイゼーショ
ン分析に用いた。

【００４４】結果：このＰＣＲ産物のエチジウム染色ゲ
ルから、ＰＣＲによる増幅そして該ゲル上での検出が可
能になるのに十分な標的ＤＮＡがガラスビーズ存在下で
の加熱で放出されたことが示され、そして増幅のレベル
は、ガラスビーズの不存在下でなされたのと同じである
ように見えた。このブロットのオートラジオグラムは、
ＤＮＡが放射性プローブにハイブリダイズしなかったこ
とを示した。従って、加熱処理＋ガラスビーズでは、検
出されるだけの十分なＤＮＡが放出されなかったか又は
ＤＮＡがビーズに結合したままであったかのいずれかで
あった。ビーズの添加は、ＤＮＡ放出のプロセスには有
利でないと考えられる。

【００４５】実施例４ 操作 ：ＢＡＣＴＥＣヒト型結核菌培養物の３ｍｌ沈殿物
を実質的に実施例１の方法に従って調製した。

【００４６】このサンプルを０．５ｍｌのＨ₂ Ｏ＋〜２
５μｌ分のガラスビーズ中でもどした。サンプルをビー
ズと共に６０℃で１５分間音波処理した。

【００４７】この溶菌サンプルをフェノール／クロロホ
ルムで２回抽出してからクロロホルム／イソアミルアル
コールで２回抽出した。これらを−２０℃で一晩エタノ
ール沈殿した。サンプルを１５０μｌのＨ₂ Ｏ中でもど
した。ＰＣＲミックスを作り、それぞれ５０μｌの溶菌
産物を用いてサイクルに付した。１０μｌのＰＣＲ産物
をアクリルアミドゲル（１０％）で展開した。５０μｌ
の原サンプルもスロットブロットハイブリダイゼーショ
ン分析に用いた。

【００４８】結果：このＰＣＲ産物のエチジウム染色ゲ
ルから、ガラスビーズを伴う音波処理で標的ＤＮＡが放
出されたことが示された。このＤＮＡはＰＣＲにより増
幅されたもので該ゲル上で検出された。しかしながら、
認められた増幅標的のレベルは、先程の実施例１及び３
における好結果の処理についてのレベルよりも低かっ
た。このブロットのオートラジオグラムは、ＤＮＡが放
射性プローブにハイブリダイズしなかったことを示し
た。従って、音波処理＋ガラスビーズでは、検出される
だけの十分なＤＮＡが放出されなかったか又はＤＮＡが
ビーズに結合したままであったかのいずれかであった。

【００４９】実施例５ 操作 ：ＢＡＣＴＥＣヒト型結核菌培養物の３ｍｌ沈殿物
を実質的に実施例１の方法に従って調製した。

【００５０】このサンプルを２００μｌのＨ₂ Ｏで希釈
してから Gen-Prove溶菌管中に入れて、６０℃で１５分
間音波処理してからこの溶菌管に３００μｌのＨ₂ Ｏを
更に添加した。

【００５１】この溶菌サンプルをフェノール／クロロホ
ルムで４回抽出してからクロロホルム／イソアミルアル
コールで２回抽出した。次いで、これらを−２０℃で一
晩エタノール沈殿した。サンプルを１５０μｌのＨ₂ Ｏ
中でもどした。ＰＣＲミックスを作り、それぞれ５０μ
ｌの溶菌産物を用いてサイクルに付した。１０μｌのＰ
ＣＲ産物をアクリルアミドゲル（１０％）で展開した。
５０μｌの原サンプルもスロットブロットハイブリダイ
ゼーション分析に用いた。

【００５２】結果：このＰＣＲ産物のエチジウム染色ゲ
ルから、ＰＣＲによる増幅そして該ゲル上での検出が可
能になるのに十分な標的ＤＮＡがこの Gen-Prove溶菌方
法で放出されたことが示され、そしてその増幅のレベル
は、実施例１及び３で認められたレベルと同じであるよ
うに見えた。このブロットのオートラジオグラムは、Ｄ
ＮＡが放射性プローブにハイブリダイズしたことを示し
た。これは、検出されるのに十分なＤＮＡが放出された
ことを示している。Gen-Prove は好結果を与えるが、分
析に付する前にサンプルを清浄にする（即ち、溶菌溶液
から夾雑物を除去する）ために、追加のフェノール／ク
ロロホルム抽出が２回必要になった。

【００５３】実施例６ 操作 ：１０μｌの１０⁶ ／ｍｌ ＢＡＣＴＥＣ培養ヒト
型結核菌を１ｍｌの滅菌Ｈ₂Ｏ中に入れて、この溶液か
ら複数の１０μｌアリコートを複数の０．６ｍｌ管に入
れた（＝１００微生物／実験）。各管に１００μｌの１
×ＰＣＲ緩衝液を添加して、１００℃で０、１、５、１
０及び１５分間インキュベートした。加熱後に、ヒト型
結核菌を含有するこれら混合液をマイクロ遠心機（１
２,０００×ｇ）で５分間遠心分離し、その沈殿物と上
澄み液を、ＩＳ６１１０ヒト型結核菌挿入成分に対して
特異性のプライマーを用いて次の熱サイクル手順に従っ
てＰＣＲ増幅に付した：９４℃３分間変性、次いで９４
℃１分間変性、６２℃１分間アニーリング、７２℃１分
間伸長を３０サイクル、ついで７２℃７分間伸長、及び
４℃浸漬。この増幅産物をエチジウム染色ポリアクリル
アミドゲルで分析した。

【００５４】結果：増幅された標的の生成により示され
たところでは、０時間（即ち、未煮沸）コントロールを
含む全ての加熱時間で溶菌が起こったことが分かった。
これにはまず驚いたが、このことは、ＰＣＲ反応の初期
の温度サイクルが９４℃に３分間加熱することからなっ
ており、これは増幅された標的により証明されるように
ヒト型結核菌の溶菌には十分であると思われるので、矛
盾するものではない。加熱時間が１分間から１５分間に
増加するにつれて、沈殿物中の増幅された標的の信号が
減少した。これは、熱がこの微生物の溶菌をもたらすた
めに遠心分離によってはそれらが沈殿しなくなったと考
えると矛盾しない。

【００５５】熱サイクル反応の間に行われる９４℃加熱
はヒト型結核菌から増幅可能な標的ＤＮＡを放出させる
のに適していること、及びこの反応の前の１００℃での
インキュベーション時間を増やすとヒト型結核菌の溶菌
が向上することが結論として得られた。

【００５６】実施例７ 操作 ：更なる証拠により、熱サイクル反応の間に行われ
る９４℃加熱がヒト型結核菌から増幅可能な標的ＤＮＡ
を放出させるのに適していることが示唆された。１００
のヒト型結核菌微生物をＰＣＲ混合液に直接投入して上
記の通りにＰＣＲサイクルに付した。ＩＳ６１１０配列
を含有する１００コピーのプラスミドＳＫ４．３からな
る陽性コントロールをＨ₂ Ｏからなる陰性コントロール
と同時に流した。

【００５７】結果：これら増幅された標的をエチジウム
染色ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ＩＳ６１１
０配列を含有する陽性コントロールに増幅された標的が
見られ、無傷微生物にも増幅された標的が見られたが、
陽性コントロールよりも約１０倍大きな強度であった。
これは、各ヒト型結核菌微生物が約１０コピーのＩＳ６
１１０標的配列を含有するという公表された知見と一致
する。

【００５８】この実験は、熱サイクル反応の間に行われ
る９４℃加熱がヒト型結核菌から増幅可能な標的ＤＮＡ
を放出させるのに適しているという先の結論をより確か
なものにした。

【００５９】実施例８ 目的 マイコバクテリアを沸騰水浴中で加熱する際に存在
させる緩衝液であって：Ａ．溶菌してそれらのＤＮＡを
放出させＢ．このＤＮＡの増幅を可能にする適合性の緩
衝液を特定する。

【００６０】原料 ＢＡＣＴＥＣヒト型結核菌培養瓶 (〜１０⁶ 微生物／ｍ
ｌ) ＢＡＣＴＥＣ Ｍ．フォルチュイツム培養物 (〜１０⁸
微生物／ｍｌ) ＮａＣｌ (Fisher #5271-500 Lot#896394) Ｎａリン酸塩 (Fisher #5381 Lot#742308) Ｎａ₃ リン酸塩 (Fisher #5377 Lot#78758) １０×ＴＢＳ ｐＨ８．１（＋２％アジド） アセトン (Fisher A18-000 Lot#902245) １０％ＳＤＳ溶液 (BRL #5553JA Lot#ARU602) ＮＰ−４０ (Sigma #N-6507 Lot#36F-0198) Ｔｗｅｅｎ２０ (BioRadカタログ#170-0531 コントロー
ル#M1419) アクロモペプチダーゼ (Sigma #A-7550 Lot#127F-6839
1) Ｔｒｉｚｍａ９．０ (１００ｍＭ Ｔｒｉｓ９．０＋１
０ｍＭ ＮａＣｌ） １０×ＰＣＲ緩衝液 (１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．
８，５００ｍＭＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ） １０×ＲＥＡＣＴ６ (１×５０ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｒｉ
ｓ，ＫＣｌ＋６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）操作 １４本の１．５ｍｌネジ蓋付き試験管を一列に並べた。
各試験管に２ｍｌのヒト型結核菌培養物からの沈殿物を
添加した。これを、Ｍ．フォルチュイツムの培養物につ
いても行った。

【００６１】滅菌Ｈ₂ Ｏで次の溶液を調製した： １．滅菌Ｈ₂ Ｏ ２．１００ｍＭ ＮａＣｌ ３．１×ＴＢＳ (５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０
ｍＭ ＮａＣｌｐＨ８） ４．１×ＰＢＳ (５０ｍＭ Ｎａ₂ リン酸塩，１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８） ５．１×ＰＣＲ緩衝液 ６．１×Ｒｅａｃｔ６ (５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ１２，ＮａＣｌ，ＫＣｌ＋６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ） ７．Ｔｒｉｚｍａ９．０ ８．Ｔｒｉｚｍａ９．０＋アクロモペプチダーゼ ９．１０％アセトン 10．０．５％Ｔｗｅｅｎ２０ 11．０．５％ＮＰ−４０ 12．０．５％ＳＤＳ 13．リン酸ナトリウム（５０ｍＭ ｐＨ１２） 14．リン酸ナトリウム（５０ｍＭ ｐＨ５） ＃８を除いて、３００μｌの溶液をその適切なマイコバ
クテリア沈殿物に添加し（それぞれ１本のヒト型結核
菌、１本の Ｍ．フォルチュイツム）、３０分間ボルテ
ックスした後で１００℃でインキュベートした。＃８に
は３００μｌのＴｒｉｚｍａ９．０＋３６μｌのアクロ
モペプチダーゼの５ｍｇ／ｍｌ溶液（５０ユニット）を
添加した。これを５０℃で３０分間インキュベートして
から１００℃で３０分間インキュベートした。全サンプ
ルをフェノール／クロロホルム抽出してから、クロロホ
ルム抽出し、次いで一晩エタノール沈殿した。

【００６２】サンプルを３０μｌの滅菌水中にもどして
から、１５μｌのサンプル＋５μｌのII型追跡色素 (tr
acking dye) を１×ＴＡＥ中の１％アガロースゲルで電
気泳動し、臭化エチジウム染色で可視化した。

【００６３】各サンプル５μｌ（ヒト型結核菌のみ）を
０．２５μＭのヒト型結核菌２１及び２２プライマー並
びに２．５ユニットの増幅Ｔａｑ (amplitaq) ポリメラ
ーゼを含有するＰＣＲミックス中に入れた。サンプルを
次のサイクルに付した： ９４℃ ３分間 変性 ９４℃ １分間 変性 ） ６２℃ １分間 アニーリング ）３０サイクル ７２℃ １分間 伸長 ） ７２℃ ７分間 伸長 ４℃ 浸漬 各ＰＣＲ産物の１０％を１０％アクリルアミドゲルで電
気泳動して臭化エチジウムで染色した。

【００６４】結果 アガロースゲルの結果は、１００倍多い微生物を有する
Ｍ．フォルチュイツムサンプルが、ヒト型結核菌よりも
多いＤＮＡを放出することを示している（パーセンテー
ジで比較したものでなく量で比較したもの）。ヒト型結
核菌については、アクロモペプチダーゼ／煮沸、Ｔｗｅ
ｅｎ２０／煮沸サンプル、及び０．５％ＳＤＳにおいて
ＤＮＡが見られる。

【００６５】これらＰＣＲの結果は、ＰＣＲを阻害する
ことが分かっているＳＤＳを除いては、全ての溶液が煮
沸で（ヒト型結核菌）ＤＮＡを放出することを示してい
る。結論 このデータは、試験した１４の溶液のうち１３が、ＰＣ
Ｒで検出できるような量で煮沸した場合にヒト型結核菌
ＤＮＡを遊離するであろうことを示している。アガロー
スゲルは、それら緩衝液がＭ．フォルチュイツムから小
さなサイズのＤＮＡを遊離させるが、該ゲル上で多くの
ＤＮＡが認められるだけ十分なヒト型結核菌微生物が存
在しなかったことを示している。

【００６６】実施例９ １００℃の強制熱風加熱によるマイコバクテリアの溶菌 Ａ．原料及び方法 この実施例では次のマイコバクテリアを用いた： 微生物 供給源／株 トリ型結核菌 ATCC 25291 Ｍ．ケロナエ Trudeau Society 1542 Ｍ．フォルチュイツム Trudeau Society 1529 Ｍ．ゴルドナエ Trudeau Society 1318 Ｍ．イントラセルラーレ ATCC 13950 カンサス・マイコバクテリウム Trudeau Society 1201 Ｍ．サーモレジスタブル CAP Survey⁺ ヒト型結核菌 Trudeau Society 201 Ｍ．キセノピ Trudeau Society 1482 ⁺CAP ＝ College of American Pathologists 全ての微生物を Lowenstein-Jensen（ＬＪ）斜面上及び
Ｂａｃｔｅｃ１２Ｂバイアル (Becton Dickinson Diagn
ostic Instrument Systems, Towson,メリーランド州）
中で増殖させた。ガラス製組織グラインダーで微生物塊
を分散して２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
６）で希釈することによって微生物の濃度を種々の McF
arlandスタンダードに調節した。

【００６７】この実施例の死滅段階における微生物の生
育能力は、０．２ｍｌのこの懸濁液をＢａｃｔｅｃ１２
Ｂバイアル中でＰＡＮＴＡ溶液（Becton Dickinson）と
一緒に３７℃で少なくとも６週間培養することによって
確認した。全ての陽性Ｂａｃｔｅｃ信号を抗酸性染色
（キニオウンズ(Kinyoun's) 及びオーラミンＯ）及びグ
ラム染色により確認した。疑問のある結果を出したバイ
アルを血液寒天及びＬＪ斜面上で副次培養した。ＣＯ₂
中で３７℃でインキュベートしたＬＪ斜面上での増殖物
も一定の実験のためのＢａｃｔｅｃシステムへの補助と
して用いた。微生物濃度は、混釈平版法により Middleb
rook７Ｈ１０寒天 (Difco,デトロイト, ミシガン州) で
測定した。

【００６８】臨床サンプルをｎ−アセチルシステイン−
ＮａＯＨ法 (Remel, Lenexa,カンサス州) により処理し
て、１ｍｌの０．２％ウシアルブミン(Remel) 中に再懸
濁させた。得られた懸濁液を以下“ＮＡＬＣ沈殿物”と
いう。

【００６９】１．マイコバクテリアの加熱 まず、ウシ型結核菌を除く表１に掲げた全ての微生物の
１．５及び４．５ｍｌ容量の McFarland２懸濁液を沸騰
水浴中で１００℃に加熱して、０、５、１０、１５及び
３０分でサンプルを採取した。独立した３実験では、１
００℃で少なくとも５分間加熱した後ではマイコバクテ
リアは増殖しなかった。

【００７０】しかしながら、沸騰水浴に伴う固有の安全
性の問題のために、これら１００℃加熱実験を強制熱風
オーブンを用いて繰り返した。強制熱風オーブンでの結
果は沸騰水浴の結果と同じであった。また、臨床サンプ
ルからの７つの陽性及び７つの陰性ＮＡＬＣ沈殿物も強
制熱風オーブン中で１００℃で３０分間加熱した。６週
間インキュベートした後、これら加熱ＮＡＬＣ沈殿物の
いずれも陽性ではなかった。

【００７１】２．ＰＣＲ増幅 加熱死滅後のヒト型結核菌標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を標
準的手順（Saiki, R.K. ら, Science 230, 1350 (198
5)）に従い、Thierry, D.C. ら, Mol. Cell. Probes 6,
181 (1992) に記載されたＩＳ６１１０ヒト型結核菌複
合体挿入成分のヌクレオチド９５６と１０２９の間の領
域に対して特異性のプライマーを用いて行った。マイコ
バクテリア属ＤＮＡのＰＣＲ増幅には、Shinnick, T.M.
ら, Infec.Immun., 56, 446 (1988) に記載された６５
Ｋ遺伝子内の配列に対して特異性のプライマーを用い
た。簡単に説明すると、各反応液は、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ, ｐＨ８．８，１００ｍＭ ＫＣｌ，４．５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１．０ｍＭデオキシヌクレオチド三
リン酸，２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールから構成
される５０μｌのＰＣＲ緩衝液ミックスを含有し、これ
に新たにプライマー（５０ｐＭ）とＴａｑポリメラーゼ
（２．５ユニット；Cetus Perkin-Elmer, Branchburg,
ニュージャージー州）を添加した。これを前もって混合
して置いたストック溶液から５０μｌのサンプルを含有
する０．５ｍｌ微小分離管に添加して約５０μｌの鉱油
（Sigma,セントルイス, ミズーリ州）でその上を覆っ
た。

【００７２】ａ．温度サイクル手順 ＩＳ６１１０の増幅のために、このＰＣＲ混合液を、９
４℃３分間変性１サイクル、及び９４℃１分間変性、６
２℃１分間アニーリング、７２℃１分間伸長からなる３
０サイクルにセットしたモデル４８０温度サイクル装置
（Cetus Perkin-Elmer) でインキュベートした。続い
て、これを７２℃での７分間伸長段階に付した。

【００７３】６５Ｋ標的の増幅は、９５℃３分間変性１
サイクル、及び９５℃１．５分間変性、５０℃１分間ア
ニーリング、７２℃２分間伸長からなる２７サイクルに
セットしたモデル４８０温度サイクル装置（Cetus Perk
in-Elmer) で行った。続いて、これを７２℃での７分間
伸長段階に付した。

【００７４】ｂ．ＰＣＲ増幅ＤＮＡの検出 １０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動及び臭化
エチジウムでの染色にによりＰＣＲ産物を可視化した。
化学発光固相サンドイッチアッセイにより又はSciScan
5000 走査デンシトメーター（U.S. Biochemical，クリ
ーブランド，オハイオ州）での臭化エチジウム染色ゲル
のポラロイド写真（５７型フィルム）の濃度測定により
産物を定量した。

【００７５】３．ＳＤＡ増幅 加熱死滅後のマイコバクテリアＤＮＡのＳＤＡによる等
温増幅を、Walkerら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
392 (1992) 及び Nucleic Acids Res. 20, 1695 (1992)
の方法により、ヒト型結核菌についてはＩＳ６１１０
ＤＮＡ標的を用い、マイコバクテリウム種については１
６ｓｒＤＮＡを用いて行った。２５μｌのサンプルを
０．５ｍｌ微小分離管中で２０μｌの溶液１（以下に記
載）と混合してから、沸騰水浴中で２．５分間変性し
た。加熱ブロック（USA/Scientific Thermolok Dry Bat
h, Ocala, フロリダ州）中で４１℃に冷却した後、５μ
ｌの溶液２（以下に記載）を添加した。これら分離管を
４１℃で２時間インキュベートした後、９５℃加熱浴中
で２分間インキュベートすることによってこのＳＤＡ反
応を停止させた。ＳＤＡ産物を化学発光固相サンドイッ
チアッセイにより検出した。阻害物質の効果を照査する
ために、合成標的配列を各反応バイエルに添加した。

【００７６】ａ．ＩＳ６１１０増幅 溶液１．１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，０．２５ｍｇ／ｍ
ｌウシ血清アルブミン，２２．５グリセロール，９０．
７５ｍＭ ＫＰＯ₄ ，０．５ｍＭデオキシヌクレオチド
三リン酸（ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ），０．５ｍ
Ｍデオキシアデノシン５’−〔α−チオ〕三リン酸及び
Walker, G.T. ら (1994) A Chemiluminescent DNA pro
be test based upon strand displacement amplificati
on. ViralDetection Methods. Academic Press で公表
された４つのプライマーＢ１，Ｂ２，Ｓ１及びＳ２をそ
れぞれ１２５０ｎＭ，及びＨ₂ Ｏ中の超純粋ヒト胎盤Ｄ
ＮＡ(Sigma) を２５０ｎｇ。ＭｇＣｌ₂ は、ＭｇＰＯ₄
の析出を避けるために最後に注意して添加し、同じ Wal
ker らの刊行物の合成コントロール配列２５０００コピ
ーを各反応に含めた。

【００７７】溶液２．ＨｉｎｃII制限エンドヌクレアー
ゼ及びポリメラーゼＩのエキソクレノウフラグメントを
Ｈ₂ Ｏで５μｌ当たりそれぞれ１５０及び３ユニットの
比活性に希釈した。

【００７８】ｂ．１６Ｓ増幅 溶液１．＝０．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，３
０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），８１．２５ｍ
Ｍ ＫＰＯ₄ ，１．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リ
ン酸（ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ），０．５ｍＭデ
オキシアデノシン５’−〔α−チオ〕三リン酸及び４つ
のプライマーＢ１，Ｂ２，Ｓ１，Ｓ２をそれぞれ１２５
０ｎＭ，及びＨ₂ Ｏ中の超純粋ヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma)
を２５０ｎｇ。合成コントロール配列５００コピーを各
反応に含めた。上で説明したＩＳ６１１０増幅でのよう
に、この１６Ｓ増幅に用いたプライマーとコントロール
配列は、Walkerらの参考文献に公表されている。

【００７９】溶液２．＝ＩＳ６１１０増幅についてはＨ
ｉｎｃII制限エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼＩの
エキソクレノウフラグメントをＨ₂ Ｏで５μｌ当たりそ
れぞれ１５０及び３ユニットの比活性に希釈し、酢酸マ
グネシウムを６５ｍＭの濃度になるように添加した。

【００８０】Ｂ．増幅ＤＮＡのアッセイ検出 １．ＩＳ６１１０ ＰＣＲ及びＳＤＡ増幅ヒト型結核菌ＩＳ６１１０ＤＮＡ
を、これら増幅産物の内部配列に特異的な Walker らの
刊行物に開示されたビオチニル化ＤＮＡプローブ及び W
alker らの刊行物に開示されたアルカリ性ホスファター
ゼ結合デテクタープローブの溶液相ハイブリダイゼーシ
ョンにより検出した。

【００８１】２．１６ＳｒＤＮＡ ＳＤＡ増幅マイコバクテリア１６Ｓ ＤＮＡをビオチニ
ル化捕捉プローブ及び２種のアルカリ性ホスファターゼ
結合ディテクタープローブで検出し、増幅内部コントロ
ールを異なる一組の捕捉プローブとディテクタープロー
ブにより捕捉した。これら捕捉プローブとディテクター
プローブは全て Walker らの刊行物に開示されている。

【００８２】ハイブリダイゼーションは、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，１．８Ｍ ＮａＣｌ，
０．２％アセチル化ウシ血清アルブミン，０．１ｍＭ
ＺｎＣｌ₂ ，０．１％ＮａＮ₃ を含有するストレプトア
ビジン被覆マイクロタイタープレート（Microlite 1, D
ynatech, Chantilly, バージニア州）中で３７℃で４５
分間行った。次いで、それらプレートを１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，
０．１％ウシ血清アルブミン及び０．１％ＮａＮ₃ で３
回洗浄（３００μｌ／洗浄）して、未結合ビオチニル化
プローブを除去した。化学発光性アルカリ性ホスファタ
ーゼ基質、つまり Lumi-Phos 530（Lumigen, Southfiel
d,ミシガン州）をウェルに添加して３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで、それらの反応をルミノメー
ター（Labsystems Luminoscan,フィンランド）で読み取
った。

【００８３】Ｃ．結果 加熱で死滅させた微生物のサンプルからのゲノミックＤ
ＮＡを上記の通りＰＣＲ及びＳＤＡを用いる増幅に付し
た。以下の表III 及びIVに示したゲノミックＤＮＡの増
幅は、強制熱風オーブン中で３０分間１００℃の温度に
曝すことによりこれらマイコバクテリア種が溶菌された
ことを明らかにしている。

【００８４】

【表３】表 III加熱溶菌マイコバクテリア種からのＤＮＡのＰＣＲ 種 ＲＤＵ＊ ヒト型結核菌 239.7 Ｍ．イントラセルラーレ 161.7 トリ型結核菌 177.0 Ｍ．ケロナエ 78.1 Ｍ．サーモレジスタブル 92.5 Ｍ．フォルチュイツム 192.7 カンサス・マイコバクテリウム 149.5 Ｍ．ゴルドナエ 40.4 Ｍ．キセノピ 203.9 陰性コントロール 4.7 ＊ＲＤＵ＝相対密度単位

【表４】 表 IV 加熱溶菌マイコバクテリア種からのＤＮＡのＳＤＡ 種 属ＲＬＵ＊ 内部コントロールＲＬＵ ヒト型結核菌 13058 1601 Ｍ．イントラセルラーレ 14027 1439 トリ型結核菌 8724 1028 Ｍ．ケロナエ 1306 1544 Ｍ．サーモレジスタブル 1706 2247 Ｍ．フォルチュイツム 3033 1083 カンサス・マイコバクテリウム 13947 942 Ｍ．ゴルドナエ 6992 3150 Ｍ．キセノピ 689 1413 陰性コントロール 27 3275 ＊ＲＬＵ＝相対光度単位 ＰＣＲ及びＳＤＡによる７つの陽性臨床サンプルからの
ゲノミックＤＮＡの増幅も認められた。しかしながら、
７つの陰性臨床サンプルの増幅の結果は、陰性コントロ
ールと矛盾するものではなかった。

【００８５】強制熱風オーブン中でのマイコバクテリア
の加熱は、マイコバクテリアの溶菌をもたらすだけでな
く、無生育能力又は死滅をももたらした。

【００８６】実施例１０ ９５℃及び１０５℃の強制熱風加熱によるマイコバクテ
リアの溶菌 ４種のマイコバクテリア、つまりヒト型結核菌、トリ型
結核菌、Ｍ．ケロナエ及びＭ．イントラセルラーレをマ
イコバクテリア用のＢａｃｔｅｃ（商標）培地７Ｈ９中
で培養した。ＧＩ（増殖指数）により示される対数増殖
期に入った直後に細胞を採取した。従って、それら細胞
は生育能力があると考えられ、死んだ後の細胞破壊のた
めに自発的に細胞から放出されるマイコバクテリアＤＮ
Ａからの錯雑の可能性はあまりなかった。

【００８７】４種のマイコバクテリア全てのサンプルを
強制熱風オーブン中で：(1) ９５℃で５、１０、１５及
び３０分間隔；及び (2)１０５℃で５、１０、１５及び
３０分間隔の加熱に曝した。

【００８８】次いで、溶解したマイコバクテリアから放
出されたＩＳ６１１０又は属検出物のいずれかについて
の標的ＤＮＡを実施例１０に記載したＳＤＡ法を用いて
増幅した。以下の表２に示すように、ＩＳ６１１０及び
属検出物についての増幅可能な標的ＤＮＡが、曝した時
間に関係なく両方の温度で全てのサンプルから放出され
た。サンプル番号２０の増幅は低いように見えるが、こ
の結果は、抑制されたコントロール配列（シグナチャー
(signature)）により示されるように、細胞溶解中では
なくて増幅中のサンプルの錯雑のためであった。

【００８９】

【表５】 表 ２ ９５℃及び１０５℃での溶菌後のマイコバクテリアＤＮＡの増幅 サンプル＃ 種 温度 時間 ＧＩ IS6110 属 シグナチャー １ ヒト型結核菌 95℃ 5分 70 77966 75105 7754 ２ 同上 95℃ 10分 74200 58006 10701 ３ 同上 95℃ 15分 77380 80744 9001 ４ 同上 95℃ 30分 77005 92741 13695 ５ 同上 100℃ 5分 145 75987 69625 7518 ６ 同上 100℃ 10分 73237 78294 11218 ７ 同上 100℃ 15分 73023 75464 10455 ８ 同上 100℃ 30分 69722 74620 7993 ９ トリ型結核菌 95℃ 5分 70 13 89191 4073 10 同上 95℃ 10分 10 88090 2598 11 同上 95℃ 15分 111 85086 1849 12 同上 95℃ 30分 11 90384 1603 13 同上 100℃ 5分 133 96 91375 1350 14 同上 100℃ 10分 29 88899 2008 15 同上 100℃ 15分 19 85065 2194 16 同上 100℃ 30分 62 81745 1375 17 ケロナエ 95℃ 5分 201 9 41447 3598 18 同上 95℃ 10分 10 19953 4279 19 同上 95℃ 15分 98 46995 3309 20 同上 95℃ 30分 12 1144 108 21 同上 100℃ 5分 473 15 21246 3483 22 同上 100℃ 10分 13 15795 3157 23 同上 100℃ 15分 16 16562 5124 24 同上 100℃ 30分 124 17235 2737 25 イントラセルラーレ 95℃ 5分 85 8 57191 5967 26 同上 95℃ 10分 13 79016 8331 27 同上 95℃ 15分 15 72134 8023 28 同上 95℃ 30分 21 80282 7436 29 同上 100℃ 5分 127 20 86008 9670 30 同上 100℃ 10分 35 59088 3478 31 同上 100℃ 15分 335 78192 6858 32 同上 100℃ 30分 35 67761 4163 コントロール ＳＤＡゲノミック標的 IS6110 属 シグナチャー 0 14 77 7002 10 2982 761 11939 20 6800 368 9902 40 17514 1503 13128 アッセイ標的の原子モル数のレベル IS6110 属 シグナチャー 0 19 262 43 低 1198 1841 2613 中 3979 7335 11273 高 13779 20475 30486 ＊低＝ＩＳ６１１０について５００でシグナチャーについて２０００ 中＝ＩＳ６１１０について２０００でシグナチャーについて８０００ 高＝ＩＳ６１１０について８０００でシグナチャーについて３２０００ 具体的な態様に関して本発明を説明してきたが、これら
詳細な記載を限定と解釈するべきではない。本発明の思
想及び範囲から逸脱することなく、種々の均等法、変法
及び修飾法が可能であるが、かかる均等な態様は本発明
に包含されると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ウィリアム・イー・キーティング アメリカ合衆国メリーランド州21234, ボルチモア，ノース・ブランチ・レーン 3002 (72)発明者 アドリアン・ジェイ・ウォルターズ アメリカ合衆国メリーランド州21212, ボルチモア，コーディング・アベニュー 508 (72)発明者 ジュリアン・エイ・ロブソン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27312，ピッツボロ，フェアリントン・ ポスト 46 (72)発明者 アレン・レイチラー アメリカ合衆国メリーランド州21117, オーウィングス・ミルス，コーチハウ ス・ドライブ １ (56)参考文献 欧州特許出願公開547789（ＥＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12Q 1/06 C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マイコバクテリアを溶菌剤の不存在下で
   溶菌有効量の熱および所望により他の物理的溶菌条件に
   曝すことを含むマイコバクテリウム科の細菌の溶菌方法
   であって、前記溶菌有効量の熱が強制熱風として与えら
   れる方法。
2. 【請求項２】 マイコバクテリアを非感染性にする、請
   求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 マイコバクテリウム科の細菌が、トリ型
   結核菌、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．ゴルドナエ、ヒ
   ト型結核菌、カンサス・マイコバクテリウム、Ｍ．フォ
   ルチュイツム、Ｍ．ケロナエ、ウシ型結核菌、Ｍ．スク
   ロフラセウム、パラ結核菌、Ｍ．フレイ、Ｍ．マリヌ
   ム、Ｍ．シミアエ、Ｍ．スズルガイ、らい菌、Ｍ．キセ
   ノピ、Ｍ．ウルセランス、鼡らい菌、Ｍ．フラベセン
   ス、Ｍ．テラエ、Ｍ．ノンクロモゲニクム、Ｍ．マルモ
   エンセ、Ｍ．アジアチクム、Ｍ．バッカエ、Ｍ．ガスト
   リ、Ｍ．トリビアエ、Ｍ．ハエモヒルム、Ｍ．アフリカ
   ヌム、Ｍ．サーモレジスタブル、及びスメグマ菌からな
   る群から選ばれる、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 マイコバクテリアがヒト型結核菌であ
   る、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 細胞成分の単離を更に含む、請求項１記
   載の方法。
6. 【請求項６】 単離された細胞成分がＤＮＡである、請
   求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 単離された細胞成分がＲＮＡである、請
   求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 マイコバクテリア核酸の増幅を更に含
   む、請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 マイコバクテリア同定剤の添加を更に含
   む、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 マイコバクテリア同定剤が核酸プロー
    ブである、請求項９記載の方法。