JP2780572B2 - オリゴヌクレオチドの酵素的合成法及びオリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用 - Google Patents
オリゴヌクレオチドの酵素的合成法及びオリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドの
酵素的合成法、特に、テトラマーブロックを用いたオリ
ゴヌクレオチドの酵素的合成法に関する。更に本発明
は、鎖中にリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
のＤＮＡ合成用プライマーおよびＤＮＡ配列識別用プロ
ーブに関する。
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ーブに関する。
【０００２】
【従来の技術】今日では、遺伝子工学の発達にともな
い、多数の種類のオリゴマーを少量ずつ必要とする機会
は多くなってきている。たとえば、酵素的ＤＮＡ合成用
のプライマーとして、あるいは特定の配列の探索プロー
ブとして用いられる。そこで、必要に応じてその場で合
成するためにＤＮＡ合成機が開発されてきた。しかし、
合成機を用いるにしても、ヒト遺伝子（約３０億塩基
長）の全ＤＮＡ塩基配列決定のような巨大なプロジェク
トには能率性や経済性の観点から方法的改善が要求され
る。この場合には長い（約１万塩基長）ＤＮＡ断片を直
接扱えて、かつ簡便なプライマーリレー法のようなＤＮ
Ａ塩基配列決定法に関する能率的実験方法の開発が必要
である。さらにそこで必要とする多種のＤＮＡオリゴマ
ーの調製にあたってはＤＮＡ自動合成機を用いる場合で
も効率的な合成法や操作法が求められる。本来、高額な
機械に依存しない方法はそれ自体、重要でもある。
い、多数の種類のオリゴマーを少量ずつ必要とする機会
は多くなってきている。たとえば、酵素的ＤＮＡ合成用
のプライマーとして、あるいは特定の配列の探索プロー
ブとして用いられる。そこで、必要に応じてその場で合
成するためにＤＮＡ合成機が開発されてきた。しかし、
合成機を用いるにしても、ヒト遺伝子（約３０億塩基
長）の全ＤＮＡ塩基配列決定のような巨大なプロジェク
トには能率性や経済性の観点から方法的改善が要求され
る。この場合には長い（約１万塩基長）ＤＮＡ断片を直
接扱えて、かつ簡便なプライマーリレー法のようなＤＮ
Ａ塩基配列決定法に関する能率的実験方法の開発が必要
である。さらにそこで必要とする多種のＤＮＡオリゴマ
ーの調製にあたってはＤＮＡ自動合成機を用いる場合で
も効率的な合成法や操作法が求められる。本来、高額な
機械に依存しない方法はそれ自体、重要でもある。
【０００３】塩基数１万のＤＮＡに対する特異的なＤＮ
Ａ合成プライマーや識別用のプローブとしての長さは、
多くの場合オクタマー（以下、“８マー”の方式で略記
する。）以上の長さが必要であることが示されている。
そのような機能的ＤＮＡオリゴマーである８マーを能率
的に調製する方法として４マーを基本ブロックとした合
成法が報告されている（山本ら、日化誌１９８８（２）
ｐ１８９−１９３）。この方法は、予め保護基で保護し
た２つのテトラマーを有機化学に縮合するものである。
Ａ合成プライマーや識別用のプローブとしての長さは、
多くの場合オクタマー（以下、“８マー”の方式で略記
する。）以上の長さが必要であることが示されている。
そのような機能的ＤＮＡオリゴマーである８マーを能率
的に調製する方法として４マーを基本ブロックとした合
成法が報告されている（山本ら、日化誌１９８８（２）
ｐ１８９−１９３）。この方法は、予め保護基で保護し
た２つのテトラマーを有機化学に縮合するものである。
【０００４】しかし、この方法では８マーを効率良く合
成できるが、脱保護等の操作が必要であり、簡便さの点
で改良が望まれる。
成できるが、脱保護等の操作が必要であり、簡便さの点
で改良が望まれる。
【０００５】
【発明の目的】そこで本発明の目的は、ＤＮＡ合成用プ
ライマーおよびＤＮＡ配列識別用プローブとして使用可
能なオリゴヌクレオチドを、比較的容易に合成する方法
を提供することにある。
ライマーおよびＤＮＡ配列識別用プローブとして使用可
能なオリゴヌクレオチドを、比較的容易に合成する方法
を提供することにある。
【０００６】さらに、本発明の別の目的は、新規なオリ
ゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ合成用プライマーおよび
ＤＮＡ配列識別用プローブを提供することにある。
ゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ合成用プライマーおよび
ＤＮＡ配列識別用プローブを提供することにある。
【０００７】
【発明の構成】本発明は、ヌクレオチド数が２〜２０で
あり、かつ５' 末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオ
チドの一種又は二種以上と、少なくとも３’末端にリボ
ヌクレオチド基を有し、残りのヌクレオチドの一部また
は全部がデオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチ
ド数が２〜２０であるオリゴヌクレオチドの一種又は二
種以上とを、ＲＮＡリガーゼの存在下連結してオリゴヌ
クレオチドを合成する方法であって、上記連結をアデノ
シン三リン酸及び２価の金属イオンの存在下で行うこと
を含むオリゴヌクレオチドの合成法に関する。
あり、かつ５' 末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオ
チドの一種又は二種以上と、少なくとも３’末端にリボ
ヌクレオチド基を有し、残りのヌクレオチドの一部また
は全部がデオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチ
ド数が２〜２０であるオリゴヌクレオチドの一種又は二
種以上とを、ＲＮＡリガーゼの存在下連結してオリゴヌ
クレオチドを合成する方法であって、上記連結をアデノ
シン三リン酸及び２価の金属イオンの存在下で行うこと
を含むオリゴヌクレオチドの合成法に関する。
【０００８】さらに本発明は、３' 末端にリボヌクレオ
チド基を有する５マーｄＮ1 ｄＮ2ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5
（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 及びｄＮ4 は同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 はリボ
ヌクレオチドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４
マーｐｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 （式中、ｄＮ6 、ｄＮ
7 、ｄＮ8 及びｄＮ9 は同一又は異なるデオキシリボヌ
クレオチドを示し、ｐｄＮ6 は５' 末端をリン酸化した
デオキシリボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼ
の存在下連結して９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 を合成する方法であって、
上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオンの
存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法に
関する。
チド基を有する５マーｄＮ1 ｄＮ2ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5
（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 及びｄＮ4 は同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 はリボ
ヌクレオチドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４
マーｐｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 （式中、ｄＮ6 、ｄＮ
7 、ｄＮ8 及びｄＮ9 は同一又は異なるデオキシリボヌ
クレオチドを示し、ｐｄＮ6 は５' 末端をリン酸化した
デオキシリボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼ
の存在下連結して９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 を合成する方法であって、
上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオンの
存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法に
関する。
【０００９】さらに本発明は、３’末端にリボヌクレオ
チド基を有する１０マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10（式中、ｄＮ1 、ｄ
Ｎ2、ｄＮ3 ｄＮ6 ｒＮ7 ｄＮ8 及びｄＮ9 は同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 及びｒ
Ｎ10は同一又は異なるリボヌクレオチドを示す）と５’
末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄ
Ｎ14又は９マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ
16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄ
Ｎ13、ｄＮ14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18及びｄＮ19は同
一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ15
はリボクレオチドを示し、ｐｄＮ11は５’末端をリン酸
化したデオキシリボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリ
ガーゼの存在下連結して１４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ
12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4
ｒＮ5 ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12
ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17 ｄＮ18ｄＮ19を合成
する方法、又は３' 末端にリボヌクレオチド基を有する
１５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7
ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ
15（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ6 、ｄＮ7 、
ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄＮ13及びｄＮ14は
同一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ
5、ｒＮ10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチ
ドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ
16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18
及びｄＮ19は同一又は異なるデオキシリボヌクレオチド
を示し、ｐｄＮ16は５' 末端をリン酸化したデオキシリ
ボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼの存在下連
結して１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6
ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒ
Ｎ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19を合成する方法であっ
て、上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオ
ンの存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成
法に関する。
チド基を有する１０マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10（式中、ｄＮ1 、ｄ
Ｎ2、ｄＮ3 ｄＮ6 ｒＮ7 ｄＮ8 及びｄＮ9 は同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 及びｒ
Ｎ10は同一又は異なるリボヌクレオチドを示す）と５’
末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄ
Ｎ14又は９マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ
16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄ
Ｎ13、ｄＮ14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18及びｄＮ19は同
一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ15
はリボクレオチドを示し、ｐｄＮ11は５’末端をリン酸
化したデオキシリボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリ
ガーゼの存在下連結して１４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ
12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4
ｒＮ5 ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12
ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17 ｄＮ18ｄＮ19を合成
する方法、又は３' 末端にリボヌクレオチド基を有する
１５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7
ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ
15（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ6 、ｄＮ7 、
ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄＮ13及びｄＮ14は
同一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ
5、ｒＮ10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチ
ドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ
16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18
及びｄＮ19は同一又は異なるデオキシリボヌクレオチド
を示し、ｐｄＮ16は５' 末端をリン酸化したデオキシリ
ボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼの存在下連
結して１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6
ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒ
Ｎ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19を合成する方法であっ
て、上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオ
ンの存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成
法に関する。
【００１０】オリゴヌクレオチドの合成法の好ましい態
様は、上記の３' 末端にリボヌクレオチド基を有する５
マー、１０マー又は１５マーと上記の５' 末端にリン酸
基を有する４マー又は９マーとをＲＮＡリガーゼの存在
下連結して９マー、１４マー又は１９マーを合成する方
法であって、上記連結を緩衝液中、アデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコ
ール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存在下で
行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法である。
様は、上記の３' 末端にリボヌクレオチド基を有する５
マー、１０マー又は１５マーと上記の５' 末端にリン酸
基を有する４マー又は９マーとをＲＮＡリガーゼの存在
下連結して９マー、１４マー又は１９マーを合成する方
法であって、上記連結を緩衝液中、アデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコ
ール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存在下で
行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法である。
【００１１】さらに本発明は、前記本発明のオリゴヌク
レオチドの合成法であって、合成されるオリゴヌクレオ
チドが、ヌクレオチド数が９〜１９のオリゴヌクレオチ
ドであり、少なくとも１つのヌクレオチドはリボヌクレ
オチドであり、残りのヌクレオチドはデオキシヌクレオ
チドであるＤＮＡ合成用プライマーまたはＤＮＡ配列識
別用プローブである合成法に関する。
レオチドの合成法であって、合成されるオリゴヌクレオ
チドが、ヌクレオチド数が９〜１９のオリゴヌクレオチ
ドであり、少なくとも１つのヌクレオチドはリボヌクレ
オチドであり、残りのヌクレオチドはデオキシヌクレオ
チドであるＤＮＡ合成用プライマーまたはＤＮＡ配列識
別用プローブである合成法に関する。
【００１２】以下本発明について説明する。本発明の合
成法の原料は、ヌクレオチド数が２〜２０、好ましくは
４〜１０であり、かつ５' 末端にリン酸基を有するオリ
ゴヌクレオチド（以下、ドナーということがある）、及
び３' 末端にリボヌクレオチド基を有するヌクレオチド
数が２〜２０好ましくは４〜１５であるオリゴヌクレオ
チド（以下、アクセプターということがある）である。
特に、５' 末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオチド
は、ＤＮＡオリゴマー及びリボヌクレオチド基を１つ含
有するＤＮＡオリゴマーであることが好ましい。もう一
方のオリゴヌクレオチドは、３' 末端にリボヌクレオチ
ドを有するＤＮＡオリゴマー及び３' 末端にリボヌクレ
オチド基を有し、かつリボヌクレオチド基を１つ又は２
つ含有するＤＮＡオリゴマーであることが好ましい。
成法の原料は、ヌクレオチド数が２〜２０、好ましくは
４〜１０であり、かつ５' 末端にリン酸基を有するオリ
ゴヌクレオチド（以下、ドナーということがある）、及
び３' 末端にリボヌクレオチド基を有するヌクレオチド
数が２〜２０好ましくは４〜１５であるオリゴヌクレオ
チド（以下、アクセプターということがある）である。
特に、５' 末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオチド
は、ＤＮＡオリゴマー及びリボヌクレオチド基を１つ含
有するＤＮＡオリゴマーであることが好ましい。もう一
方のオリゴヌクレオチドは、３' 末端にリボヌクレオチ
ドを有するＤＮＡオリゴマー及び３' 末端にリボヌクレ
オチド基を有し、かつリボヌクレオチド基を１つ又は２
つ含有するＤＮＡオリゴマーであることが好ましい。
【００１３】さらに好ましくは、本発明の合成法の原料
は、３' 末端にリボヌクレオチドを有する５マー（ペン
タマー）、１０マー又は１５マー（以下アクセプターと
いうことがある）と５' 末端にリン酸基を有する４マー
（テトラマー）又は９マー（以下ドナーということがあ
る）である。
は、３' 末端にリボヌクレオチドを有する５マー（ペン
タマー）、１０マー又は１５マー（以下アクセプターと
いうことがある）と５' 末端にリン酸基を有する４マー
（テトラマー）又は９マー（以下ドナーということがあ
る）である。
【００１４】アクセプター及びドナーとなる原料のオリ
ゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチドを構成す
る塩基及びリボヌクレオチドを構成する塩基は、アデニ
ン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン
（Ｔ）のいずれかである。
ゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチドを構成す
る塩基及びリボヌクレオチドを構成する塩基は、アデニ
ン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン
（Ｔ）のいずれかである。
【００１５】本発明では、アクセプターであるオリゴヌ
クレオチド、例えばｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 と
ドナーであるオリゴヌクレオチド、例えばｐｄＮ6 ｄＮ
7 ｄＮ8 ｄＮ9 とのＲＮＡリガーゼによる連結を、少な
くともＡＴＰ及び２価金属イオンの存在下で行う。この
系中で上記連結を行うことにより、比較的短いオリゴマ
ーである上記アクセプターとドナーの連結反応を容易に
進行させることができる。
クレオチド、例えばｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 と
ドナーであるオリゴヌクレオチド、例えばｐｄＮ6 ｄＮ
7 ｄＮ8 ｄＮ9 とのＲＮＡリガーゼによる連結を、少な
くともＡＴＰ及び２価金属イオンの存在下で行う。この
系中で上記連結を行うことにより、比較的短いオリゴマ
ーである上記アクセプターとドナーの連結反応を容易に
進行させることができる。
【００１６】好ましくは、この連結は、緩衝液中、ＡＴ
Ｐ、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）及びヘキサアンミンコバルトクロライド（ＨＣ
Ｃ）の存在下で行う。この系中で上記連結を行うことに
より、アクセプターとドナーの使用量が化学量論比に近
くてもほぼ定量的に連結反応が進行する。このことは、
合成した９マー等のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成用
プライマーとして精製することなしに使用する際に、非
常に有利である。化学量論比に近い使用量で連結すれば
擬似プライマーとして機能する可能性がある未反応のア
クセプター又はドナーの含有量を激減させることができ
るからである。
Ｐ、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）及びヘキサアンミンコバルトクロライド（ＨＣ
Ｃ）の存在下で行う。この系中で上記連結を行うことに
より、アクセプターとドナーの使用量が化学量論比に近
くてもほぼ定量的に連結反応が進行する。このことは、
合成した９マー等のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成用
プライマーとして精製することなしに使用する際に、非
常に有利である。化学量論比に近い使用量で連結すれば
擬似プライマーとして機能する可能性がある未反応のア
クセプター又はドナーの含有量を激減させることができ
るからである。
【００１７】原料となるアクセプター及びドナーは公知
の方法で合成することができる。例えば、アクセプター
として、ｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 のような３'
末端にリボヌクレオチドを有するＤＮＡオリゴマーは、
４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 のようなＤＮＡオリゴ
マーに、リボヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）
の存在下で連結させることにより合成できる。又、ドナ
ーは、４マーｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等のオリゴヌク
レオチドをポリヌクレオチドキナーゼの存在下でリン酸
化することにより合成することができる。
の方法で合成することができる。例えば、アクセプター
として、ｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 のような３'
末端にリボヌクレオチドを有するＤＮＡオリゴマーは、
４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 のようなＤＮＡオリゴ
マーに、リボヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）
の存在下で連結させることにより合成できる。又、ドナ
ーは、４マーｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等のオリゴヌク
レオチドをポリヌクレオチドキナーゼの存在下でリン酸
化することにより合成することができる。
【００１８】本発明では、アクセプター及びドナーの合
成を連結反応と同様の条件で行うこと、即ち、同一の緩
衝液中に、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコー
ル及びヘキサアンミンコバルトクロライドを含有するも
のを用いることが、連結反応を簡便にできるという観点
から好ましい。
成を連結反応と同様の条件で行うこと、即ち、同一の緩
衝液中に、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコー
ル及びヘキサアンミンコバルトクロライドを含有するも
のを用いることが、連結反応を簡便にできるという観点
から好ましい。
【００１９】即ち、例えば、アクセプターであるｄＮ1
ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 の合成を、４マーｄＮ1 ｄＮ
2 ｄＮ3 ｄＮ4 とリボヌクレオチド三リン酸ｒＮ5 ＴＰ
とを、緩衝液中、ＴｄＴ、マグネシウムイオン、ポリエ
チレングリコール及びヘキサアンミンコバルトクロライ
ドの存在下で連結することにより行うことが好ましい。
ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 の合成を、４マーｄＮ1 ｄＮ
2 ｄＮ3 ｄＮ4 とリボヌクレオチド三リン酸ｒＮ5 ＴＰ
とを、緩衝液中、ＴｄＴ、マグネシウムイオン、ポリエ
チレングリコール及びヘキサアンミンコバルトクロライ
ドの存在下で連結することにより行うことが好ましい。
【００２０】さらに、例えば、１０マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄ
Ｎ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10及び
１５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7
ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ
15が、それぞれ、９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 とリボヌクレオチド三リン
酸ｒＮ10ＴＰとを、及び１４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ
12ｄＮ13ｄＮ14とリボヌクレオチド三リン酸ｒＮ15ＴＰ
とを、緩衝液中、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、マグネシウムイオン、ポリエチレン
グリコール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存
在下で連結することにより得られることが好ましい。
Ｎ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10及び
１５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7
ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ
15が、それぞれ、９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ
5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 とリボヌクレオチド三リン
酸ｒＮ10ＴＰとを、及び１４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ
12ｄＮ13ｄＮ14とリボヌクレオチド三リン酸ｒＮ15ＴＰ
とを、緩衝液中、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、マグネシウムイオン、ポリエチレン
グリコール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存
在下で連結することにより得られることが好ましい。
【００２１】また、例えば、ドナーであるｐｄＮ6 ｄＮ
7 ｄＮ8 ｄＮ9 の合成を、緩衝液中、ポリヌクレオチド
キナーゼ、アデノシン三リン酸、マグネシウムイオン、
ポリエチレングリコール及びヘキサアンミンコバルトク
ロライドの存在下で、ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 をリン
酸化することにより行うことが好ましい。
7 ｄＮ8 ｄＮ9 の合成を、緩衝液中、ポリヌクレオチド
キナーゼ、アデノシン三リン酸、マグネシウムイオン、
ポリエチレングリコール及びヘキサアンミンコバルトク
ロライドの存在下で、ｄＮ6ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 をリン
酸化することにより行うことが好ましい。
【００２２】さらに、例えば、４マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄ
Ｎ13ｄＮ14、９マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15
ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19及び４マーｐｄＮ16ｄＮ17ｄ
Ｎ18ｄＮ19が、それぞれ４マーｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ
14、９マーｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ
17ｄＮ18ｄＮ19及び４マーｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ
19を、緩衝液中、ポリヌクレオチドキナーゼ、アデノシ
ン三リン酸、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコ
ール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存在下で
リン酸化することにより得られることが好ましい。
Ｎ13ｄＮ14、９マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15
ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19及び４マーｐｄＮ16ｄＮ17ｄ
Ｎ18ｄＮ19が、それぞれ４マーｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ
14、９マーｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ
17ｄＮ18ｄＮ19及び４マーｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ
19を、緩衝液中、ポリヌクレオチドキナーゼ、アデノシ
ン三リン酸、マグネシウムイオン、ポリエチレングリコ
ール及びヘキサアンミンコバルトクロライドの存在下で
リン酸化することにより得られることが好ましい。
【００２３】アクセプターであるｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 等の合成反応条件は、ＴｄＴの種類によって
も異なるが、例えば３５〜４０℃で１０分間〜２時間と
することができる。ドナーであるｐｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8
ｄＮ9 等の合成反応条件は、ポリヌクレオチドリガーゼ
の種類によっても異なるが、例えば３５〜４０℃で１０
分間〜２時間とすることができる。
Ｎ4 ｒＮ5 等の合成反応条件は、ＴｄＴの種類によって
も異なるが、例えば３５〜４０℃で１０分間〜２時間と
することができる。ドナーであるｐｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8
ｄＮ9 等の合成反応条件は、ポリヌクレオチドリガーゼ
の種類によっても異なるが、例えば３５〜４０℃で１０
分間〜２時間とすることができる。
【００２４】アクセプターであるｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄ
Ｎ4 ｒＮ5 等を含む反応混合物、及びドナーであるｐｄ
Ｎ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等を含む反応混合物は、そのま
ま混合し、さらにＲＮＡリガーゼ等を添加して連結反応
に用いることができる。但し、ＲＮＡリガーゼの添加前
に、それぞれの反応混合物中に含まれる酵素ＴｄＴ及び
キナーゼを失活させるために、例えば１００℃、２分間
熱処理を行う。この熱処理は、各反応混合物についてそ
れぞれ行う。
Ｎ4 ｒＮ5 等を含む反応混合物、及びドナーであるｐｄ
Ｎ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等を含む反応混合物は、そのま
ま混合し、さらにＲＮＡリガーゼ等を添加して連結反応
に用いることができる。但し、ＲＮＡリガーゼの添加前
に、それぞれの反応混合物中に含まれる酵素ＴｄＴ及び
キナーゼを失活させるために、例えば１００℃、２分間
熱処理を行う。この熱処理は、各反応混合物についてそ
れぞれ行う。
【００２５】上記４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 及び
ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等のＤＡＮオリゴマー及びＲ
ＮＡオリゴマーは、いずれも市販品又はＤＮＡ合成機
（例えばアプライドバイオシステムズ社製３８１Ａ）を
用いて合成することにより容易に入手できる。又、ドナ
ーである９マーは本発明の方法により合成できる。さら
にアクセプターである１０マーは、該９マーにＴｄＴを
用いてリボヌクレオチドを連結させることにより合成で
きる。また、アクセプターである１５マーも、本発明の
方法により合成した１４マーにＴｄＴを用いてリボヌク
レオチドを連結させることにより合成できる。
ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 等のＤＡＮオリゴマー及びＲ
ＮＡオリゴマーは、いずれも市販品又はＤＮＡ合成機
（例えばアプライドバイオシステムズ社製３８１Ａ）を
用いて合成することにより容易に入手できる。又、ドナ
ーである９マーは本発明の方法により合成できる。さら
にアクセプターである１０マーは、該９マーにＴｄＴを
用いてリボヌクレオチドを連結させることにより合成で
きる。また、アクセプターである１５マーも、本発明の
方法により合成した１４マーにＴｄＴを用いてリボヌク
レオチドを連結させることにより合成できる。
【００２６】連結においてアクセプターとドナーはほぼ
化学量論比で使用することが好ましい。但し、どちらか
一方を過剰に用いることもできる。しかし、一方を大過
剰に使用することは前述のように未反応のアクセプター
又はドナーの含有量を増加させ好ましくない。通常はモ
ル比でドナー１に対してアクセプター１〜５の範囲とす
ることが好ましい。
化学量論比で使用することが好ましい。但し、どちらか
一方を過剰に用いることもできる。しかし、一方を大過
剰に使用することは前述のように未反応のアクセプター
又はドナーの含有量を増加させ好ましくない。通常はモ
ル比でドナー１に対してアクセプター１〜５の範囲とす
ることが好ましい。
【００２７】ＲＮＡリガーゼとしてはＴ４ＲＮＡリガー
ゼを用いることが入手が容易であり、好ましい。Ｔ４Ｒ
ＮＡリガーゼの使用量は、１〜５０ユニットとすること
が適当である。
ゼを用いることが入手が容易であり、好ましい。Ｔ４Ｒ
ＮＡリガーゼの使用量は、１〜５０ユニットとすること
が適当である。
【００２８】本発明において緩衝液には、特に制限はな
く、ｐＨを中性付近（ｐＨ：約７〜８）に維持できるも
のであれば良い。例えば、トリス緩衝液、ヘペス緩衝
液、リン酸緩衝液等を挙げることができる。トリス緩衝
液としては、トリス−塩酸緩衝液であり、濃度は、例え
ば１０〜１００ｍＭの範囲とし、ｐＨは７〜８に調整す
ることが適当である。
く、ｐＨを中性付近（ｐＨ：約７〜８）に維持できるも
のであれば良い。例えば、トリス緩衝液、ヘペス緩衝
液、リン酸緩衝液等を挙げることができる。トリス緩衝
液としては、トリス−塩酸緩衝液であり、濃度は、例え
ば１０〜１００ｍＭの範囲とし、ｐＨは７〜８に調整す
ることが適当である。
【００２９】ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の濃度は１
０〜１０００μＭ、好ましくは５０〜５００μＭとする
ことが適当である。
０〜１０００μＭ、好ましくは５０〜５００μＭとする
ことが適当である。
【００３０】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、例
えば分子量２０００〜１００００、好ましくは６０００
〜８０００であり、緩衝液全量に対して１〜４０ｗｔ
％、好ましくは１５〜３０ｗｔ％とすることが適当であ
る。
えば分子量２０００〜１００００、好ましくは６０００
〜８０００であり、緩衝液全量に対して１〜４０ｗｔ
％、好ましくは１５〜３０ｗｔ％とすることが適当であ
る。
【００３１】２価の金属イオンとしては、マグネシウム
イオン、マンガンイオンとを例示できる。なかでも、マ
グネシウムイオンを用いることが好ましい。マグネシウ
ムイオン源としては、例えば塩化マグネシウムを用いる
ことができる。濃度は、１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜
２０ｍＭとすることが適当である。
イオン、マンガンイオンとを例示できる。なかでも、マ
グネシウムイオンを用いることが好ましい。マグネシウ
ムイオン源としては、例えば塩化マグネシウムを用いる
ことができる。濃度は、１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜
２０ｍＭとすることが適当である。
【００３２】ヘキサアンミンコバルトクロライド（ＨＣ
Ｃ）は、０．５〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭが
適当である。
Ｃ）は、０．５〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭが
適当である。
【００３３】上記緩衝液には、さらにジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等を添加す
ることもできる。ジチオスレイトールは、１〜５０ｍＭ
の濃度とすることが適当である。また、ＢＳＡは、１〜
５０μｇ／ｍｌとすることが適当である。
ル（ＤＴＴ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等を添加す
ることもできる。ジチオスレイトールは、１〜５０ｍＭ
の濃度とすることが適当である。また、ＢＳＡは、１〜
５０μｇ／ｍｌとすることが適当である。
【００３４】連結反応温度は、ＲＮＡリガーゼの種類に
よっても異なるが、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いる場合に
は、常温付近、例えば２０〜３０℃とすることが適当で
ある。また、反応時間は、反応温度によっても異なる
が、例えば１〜１０時間とすることができる。
よっても異なるが、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いる場合に
は、常温付近、例えば２０〜３０℃とすることが適当で
ある。また、反応時間は、反応温度によっても異なる
が、例えば１〜１０時間とすることができる。
【００３５】上記本発明の方法により合成される９マー
〜１９マー等のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成用プ
ライマー及びＤＮＡ配列識別用プローブとして用いるこ
とができる。
〜１９マー等のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成用プ
ライマー及びＤＮＡ配列識別用プローブとして用いるこ
とができる。
【００３６】本発明の合成用プライマーは、例えば、オ
リゴヌクレオチドが、９マーｄＮ1ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4
ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 、１４マーｄＮ1 ｄＮ
2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10
ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄ
Ｎ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ
11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19
（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ4 、ｄＮ6 、ｄ
Ｎ7 、ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄＮ13、ｄＮ
14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18、及びｄＮ19は、同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 、ｒＮ
10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチドを示
す）である。
リゴヌクレオチドが、９マーｄＮ1ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4
ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 、１４マーｄＮ1 ｄＮ
2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10
ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄ
Ｎ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ
11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19
（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ4 、ｄＮ6 、ｄ
Ｎ7 、ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄＮ13、ｄＮ
14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18、及びｄＮ19は、同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 、ｒＮ
10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチドを示
す）である。
【００３７】本発明のＤＮＡ配列識別用プローブは、例
えば、オリゴヌクレオチドが、９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ
3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 、１４マーｄ
Ｎ1ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ
9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1
ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9ｒ
Ｎ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ
18ｄＮ19（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ4 、ｄ
Ｎ6 、ｄＮ7 、ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ 12、ｄＮ
13、ｄＮ14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18、及びｄＮ19は、
同一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ
5 、ｒＮ10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチ
ドを示す）である。
えば、オリゴヌクレオチドが、９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ
3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 、１４マーｄ
Ｎ1ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ
9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1
ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9ｒ
Ｎ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ
18ｄＮ19（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ4 、ｄ
Ｎ6 、ｄＮ7 、ｄＮ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ 12、ｄＮ
13、ｄＮ14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18、及びｄＮ19は、
同一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ
5 、ｒＮ10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオチ
ドを示す）である。
【００３８】本発明のＤＮＡ合成用プライマーを用いた
ＤＮＡの合成は、例えば、カレント・プロトコルズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols
in Molecular Biology）（John Wiley & Sons, Inc.)の
７．４．１〜９に記載の方法に基づいて行うことができ
る。具体的には、テンプレートとなるＤＮＡとテンプレ
ートＤＮＡの所定の位置の塩基配列と相補関係にある塩
基配列を有する本発明のＤＮＡ合成用プライマーとを混
合し、熱変性（例えば、６０〜８０℃で５〜３０分間）
し、次いでアニーリング（例えば、４０〜５０℃で１０
〜６０分間）することによりプライマーをテンプレート
ＤＮＡの所定の位置に結合させる。次に４種のｄＮＴ
Ｐ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
を加えて、クレノーフラグメントの存在下、例えば４０
〜６０℃で１０〜６０分間反応させることで、プライマ
ーを開始位置にテンプレートＤＮＡと相補関係にある塩
基配列を有するＤＮＡを合成することができる。
ＤＮＡの合成は、例えば、カレント・プロトコルズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols
in Molecular Biology）（John Wiley & Sons, Inc.)の
７．４．１〜９に記載の方法に基づいて行うことができ
る。具体的には、テンプレートとなるＤＮＡとテンプレ
ートＤＮＡの所定の位置の塩基配列と相補関係にある塩
基配列を有する本発明のＤＮＡ合成用プライマーとを混
合し、熱変性（例えば、６０〜８０℃で５〜３０分間）
し、次いでアニーリング（例えば、４０〜５０℃で１０
〜６０分間）することによりプライマーをテンプレート
ＤＮＡの所定の位置に結合させる。次に４種のｄＮＴ
Ｐ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
を加えて、クレノーフラグメントの存在下、例えば４０
〜６０℃で１０〜６０分間反応させることで、プライマ
ーを開始位置にテンプレートＤＮＡと相補関係にある塩
基配列を有するＤＮＡを合成することができる。
【００３９】又、本発明のＤＮＡ配列識別用プローブの
使用は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molec
ularBiology）（John Wiley & Sons, Inc.)の２．９．
１０〜１３に記載の方法に基づいて行うことができる。
本発明のＤＮＡ配列識別用プローブの使用は、例えば、
一部の塩基配列が分かっているが、全体は塩基配列は未
知のＤＮＡの識別に有用である。例えばｃＤＮＡのライ
ブラリーのスクリーニングに際して有用である。例え
ば、本発明のＤＮＡ配列識別用プローブに蛍光発色団を
付加したものを、ｃＤＮＡのライブラリーを含むベクタ
ーで形質転換した宿主のコロニーに接触させることで、
ＤＮＡ配列識別用プローブと相補関係にある塩基配列を
有するｃＤＮＡを他のｃＤＮＡと識別することが可能で
ある。或いは、プラスミドの制限酵素による開裂部位の
前後のＤＮＡと相補関係にある塩基配列を有するＤＮＡ
配列識別用プローブを用いることで、外来遺伝子をこの
開裂部位に組み込んだプラスミドとそれ以外のプラスミ
ドとを区別することも可能である。
使用は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molec
ularBiology）（John Wiley & Sons, Inc.)の２．９．
１０〜１３に記載の方法に基づいて行うことができる。
本発明のＤＮＡ配列識別用プローブの使用は、例えば、
一部の塩基配列が分かっているが、全体は塩基配列は未
知のＤＮＡの識別に有用である。例えばｃＤＮＡのライ
ブラリーのスクリーニングに際して有用である。例え
ば、本発明のＤＮＡ配列識別用プローブに蛍光発色団を
付加したものを、ｃＤＮＡのライブラリーを含むベクタ
ーで形質転換した宿主のコロニーに接触させることで、
ＤＮＡ配列識別用プローブと相補関係にある塩基配列を
有するｃＤＮＡを他のｃＤＮＡと識別することが可能で
ある。或いは、プラスミドの制限酵素による開裂部位の
前後のＤＮＡと相補関係にある塩基配列を有するＤＮＡ
配列識別用プローブを用いることで、外来遺伝子をこの
開裂部位に組み込んだプラスミドとそれ以外のプラスミ
ドとを区別することも可能である。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。
【００４１】尚、以下の実施例において用いた酵素は以
下の通りである。 Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（タカラ製）：Ｔ４ａｍＮ８２に感
染した大腸菌Ｂ株由来 Ｔ４ポリヌクレオチド（タカラ製）：Ｔ４ｐｓｅＴ遺伝
子を持つ大腸菌５９４（λＣＭ２１）ＮＭ５７５由来又
はＴ４ａｍＮ８２に感染した大腸菌Ａ１９株由来 ＮＥＢ：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを過剰生産する
組換え体大腸菌Ｗ３１１０株（λＲＣ４）由来 ＴｄＴ（タカラ製）：子牛胸腺由来
下の通りである。 Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（タカラ製）：Ｔ４ａｍＮ８２に感
染した大腸菌Ｂ株由来 Ｔ４ポリヌクレオチド（タカラ製）：Ｔ４ｐｓｅＴ遺伝
子を持つ大腸菌５９４（λＣＭ２１）ＮＭ５７５由来又
はＴ４ａｍＮ８２に感染した大腸菌Ａ１９株由来 ＮＥＢ：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを過剰生産する
組換え体大腸菌Ｗ３１１０株（λＲＣ４）由来 ＴｄＴ（タカラ製）：子牛胸腺由来
【００４２】実施例１（ＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧの調製） （ＧＴＴＧｒＡの調製）市販のＧＴＴＧ５００ｐモル、
ｒＡＴＰ１ｎモル及びＴｄＴ１０ユニットを含む下記の
組成を有する標準溶液１０μｌを調製した。この溶液を
３７℃で１時間放置し、次いでＧＴＴＧｒＡの生成を電
気泳動法により確認した。
ｒＡＴＰ１ｎモル及びＴｄＴ１０ユニットを含む下記の
組成を有する標準溶液１０μｌを調製した。この溶液を
３７℃で１時間放置し、次いでＧＴＴＧｒＡの生成を電
気泳動法により確認した。
【００４３】（ＧＴＴＧリン酸化（ｐＧＴＴＧの調
製））市販のＧＴＴＧ５００ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモル
及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを下記標
準溶液に溶解して全量を１０μｌにした。この溶液を３
７℃で１時間放置し、次いでｐＧＴＴＧの生成を電気泳
動法により確認した。
製））市販のＧＴＴＧ５００ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモル
及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを下記標
準溶液に溶解して全量を１０μｌにした。この溶液を３
７℃で１時間放置し、次いでｐＧＴＴＧの生成を電気泳
動法により確認した。
【００４４】（ＧＴＴＧｒＡとｐＧＴＴＧの連結）前記
で得られたＧＴＴＧｒＡ５００ｐモル、ｐＧＴＴＧ１０
０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡリガー
ゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む下記に示す標準溶
液１０μｌを２５℃で４時間反応させた。
で得られたＧＴＴＧｒＡ５００ｐモル、ｐＧＴＴＧ１０
０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡリガー
ゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む下記に示す標準溶
液１０μｌを２５℃で４時間反応させた。
【００４５】その結果、ＧＴＴＧｒＡとｒＧＴＴＧが連
結してＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
結してＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
【００４６】標準溶液 ５０ｍＭ トリスーＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール） ２５％ ＰＥＧ６０００ １ｍＭ ＨＣＣ（ヘキサアンミンコバルトクロライド） １０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
【００４７】実施例２（ＴＧＡＧｒＣＣＡＴＴの調製） （ＴＧＡＧ＋ｒＣ→ＴＧＡＧｒＣ）市販のＤＮＡ合成機
により合成したＴＧＡＧ５００ｐモル、ｒＣＴＰ１ｎモ
ルおよびＴｄＴ１３ユニットを実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を５つ用
意し、１つは調製直後に、又、残りの４つは、３７℃で
それぞれ３０分、１、２又は４時間反応させた後に電気
泳動法によりＴＧＡＧｒＣの生成を確認した。その結
果、試料調製後３０分間にＴＧＡＧの全量が反応してＴ
ＧＡＧｒＣが生成されていた。
により合成したＴＧＡＧ５００ｐモル、ｒＣＴＰ１ｎモ
ルおよびＴｄＴ１３ユニットを実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を５つ用
意し、１つは調製直後に、又、残りの４つは、３７℃で
それぞれ３０分、１、２又は４時間反応させた後に電気
泳動法によりＴＧＡＧｒＣの生成を確認した。その結
果、試料調製後３０分間にＴＧＡＧの全量が反応してＴ
ＧＡＧｒＣが生成されていた。
【００４８】（ＣＡＴＴのリン酸化）市販のＤＮＡ合成
機により合成したＣＡＴＴ５００ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を５つ用
意し、１つは調製直後に、又残りの４つは３７℃でそれ
ぞれ３０分、１、２又は４時間反応させた後に電気泳動
法によりｐＣＡＴＴの生成を確認した。その結果、試料
調製後３０分以内にＣＡＴＴの全量がリン酸化されてｐ
ＣＡＴＴに変換されていた。
機により合成したＣＡＴＴ５００ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を５つ用
意し、１つは調製直後に、又残りの４つは３７℃でそれ
ぞれ３０分、１、２又は４時間反応させた後に電気泳動
法によりｐＣＡＴＴの生成を確認した。その結果、試料
調製後３０分以内にＣＡＴＴの全量がリン酸化されてｐ
ＣＡＴＴに変換されていた。
【００４９】（ＴＧＡＧｒＣ＋ｐＣＡＴＴ→ＴＧＡＧｒ
ＣＣＡＴＴ）先に合成したＴＧＡＧｒＣ２５０ｐモル相
当の反応液５μｌと先に合成したｐＣＡＴＴ２５０ｐモ
ル相当の反応液５μｌとｒＡＴＰ５００ｐモルを含有す
る溶液１μｌ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含
む溶液１μｌを実施例１に示した標準溶液５μｌと混合
して全量を１２μｌとした。
ＣＣＡＴＴ）先に合成したＴＧＡＧｒＣ２５０ｐモル相
当の反応液５μｌと先に合成したｐＣＡＴＴ２５０ｐモ
ル相当の反応液５μｌとｒＡＴＰ５００ｐモルを含有す
る溶液１μｌ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含
む溶液１μｌを実施例１に示した標準溶液５μｌと混合
して全量を１２μｌとした。
【００５０】この試料を５つ用意して、１つは調製直後
に、又残りの４つは２５℃でそれぞれ３０分、１、２又
は４時間反応させた後に電気泳動法によりＴＧＡＧｒＣ
ＣＡＴＴの生成を確認した。その結果、試料調製後３０
分以内に連結反応は完了していた。
に、又残りの４つは２５℃でそれぞれ３０分、１、２又
は４時間反応させた後に電気泳動法によりＴＧＡＧｒＣ
ＣＡＴＴの生成を確認した。その結果、試料調製後３０
分以内に連結反応は完了していた。
【００５１】実施例３（ＴＧＡＧｒＣＣＡＴＴの調製） ＴＧＡＧ１．５ｎモル、ｒＣＴＰ２ｎモル及び１３ユニ
ットのＴｄＴを用いて３７℃で１時間、実施例２と同様
の条件でＴＧＡＧｒＣを得た。これとは別にＣＡＴＴ１
ｎモル、ｒＡＴＰ２ｎモル、１０ユニットのポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて３７℃で１時間、実施例２と同
様の条件でｐＣＡＴＴを得た。
ットのＴｄＴを用いて３７℃で１時間、実施例２と同様
の条件でＴＧＡＧｒＣを得た。これとは別にＣＡＴＴ１
ｎモル、ｒＡＴＰ２ｎモル、１０ユニットのポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて３７℃で１時間、実施例２と同
様の条件でｐＣＡＴＴを得た。
【００５２】ＴＧＡＧｒＣとｐＣＡＴＴとのモル比を
１：１、３：１又は５；１にして連結反応を行った。即
ち、１００ｐモルに相当するｐＣＡＴＴの反応液１μ
ｌ、２ｍＭのｒＡＴＰ溶液１μｌおよびＴ４ＲＮＡリガ
ーゼ５０ユニットを１００ｐモル、３００ｐモル又は５
００ｐモルに相当するＴＧＡＧｒＣの反応液に混合し、
実施例１と同様の条件で１時間反応させてＴＧＡＧｒＣ
ＣＡＴＴを得た。いずれの条件でもほぼ定量的に連結反
応が進行したことが、電気泳動法により確認された。
１：１、３：１又は５；１にして連結反応を行った。即
ち、１００ｐモルに相当するｐＣＡＴＴの反応液１μ
ｌ、２ｍＭのｒＡＴＰ溶液１μｌおよびＴ４ＲＮＡリガ
ーゼ５０ユニットを１００ｐモル、３００ｐモル又は５
００ｐモルに相当するＴＧＡＧｒＣの反応液に混合し、
実施例１と同様の条件で１時間反応させてＴＧＡＧｒＣ
ＣＡＴＴを得た。いずれの条件でもほぼ定量的に連結反
応が進行したことが、電気泳動法により確認された。
【００５３】実施例４（プライマー活性の確認） 実施例３で得られたＴＧＡＧｒＣＣＡＴＴを含む、反応
条件の異なる３種類の反応物のプライマー活性を確認し
た。大腸菌のバクテリオファージＭ１３の一本鎖ＤＮＡ
（Ｍ１３ｓｓＤＮＡ）をテンプレートとして使用した。
条件の異なる３種類の反応物のプライマー活性を確認し
た。大腸菌のバクテリオファージＭ１３の一本鎖ＤＮＡ
（Ｍ１３ｓｓＤＮＡ）をテンプレートとして使用した。
【００５４】上記ＴＧＡＧｒＣＣＡＴＴ生成物はこのＤ
ＮＡの♯２６０７−♯２６１５に完全相補で、ここから
プライマーの下流にあるもっとも近い制限酵素ＨａｅII
I （タカラ酒造社）の認識切断部位（♯２５５６）まで
の切断フラグメントがプライミングインジケーター（６
０塩基長）となる。
ＮＡの♯２６０７−♯２６１５に完全相補で、ここから
プライマーの下流にあるもっとも近い制限酵素ＨａｅII
I （タカラ酒造社）の認識切断部位（♯２５５６）まで
の切断フラグメントがプライミングインジケーター（６
０塩基長）となる。
【００５５】テンプレートとして、Ｍ１３ｓｓＤＮＡ１
ｐモル及びプライマーとしてｐＣＡＴＴとＴＧＡＧｒＣ
のモル比の異なる各反応液（（Ａ）１：１、（Ｂ）３；
１（Ｃ）５：１）をｐＣＡＴＴ１ｐモル相当または２ｐ
モル相当用いた。または参照としてＴＧＡＧｒＣ５ｐモ
ルとｐＣＡＴＴ１ｐモルの混合物またはＴＧＡＧｒＣ１
０ｐモルとｐＣＡＴＴ２ｐモルの混合物もプライマーと
して用いた。伸長反応バッファとして７ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 を用い、上記テンプレ
ートとプライマを含めて全量を１８μｌとし、７０℃、
１０分変性し、次いで４５℃、３０分アニーリングし
た。
ｐモル及びプライマーとしてｐＣＡＴＴとＴＧＡＧｒＣ
のモル比の異なる各反応液（（Ａ）１：１、（Ｂ）３；
１（Ｃ）５：１）をｐＣＡＴＴ１ｐモル相当または２ｐ
モル相当用いた。または参照としてＴＧＡＧｒＣ５ｐモ
ルとｐＣＡＴＴ１ｐモルの混合物またはＴＧＡＧｒＣ１
０ｐモルとｐＣＡＴＴ２ｐモルの混合物もプライマーと
して用いた。伸長反応バッファとして７ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 を用い、上記テンプレ
ートとプライマを含めて全量を１８μｌとし、７０℃、
１０分変性し、次いで４５℃、３０分アニーリングし
た。
【００５６】この反応混合物にｄＮＴＰ（各４ｍＭ）１
μｌとクレノーフラグメント４ユニット（（タカラ酒造
社）１μｌ）を加えて全量を２０μｌとして４５℃３０
分反応させた。次いで８０℃、５分処理して酵素を失活
させた。次に反応液に制限酵素ＨａｅIII 、１２ユニッ
ト（タカラ酒造社、１μｌ）を加えて３７℃、１時間反
応させた。反応液の半分を電気泳動（８％ポリアクリル
アミド／８Ｍ尿素ゲル、３００Ｖ、１時間）させ銀染色
で検出した。
μｌとクレノーフラグメント４ユニット（（タカラ酒造
社）１μｌ）を加えて全量を２０μｌとして４５℃３０
分反応させた。次いで８０℃、５分処理して酵素を失活
させた。次に反応液に制限酵素ＨａｅIII 、１２ユニッ
ト（タカラ酒造社、１μｌ）を加えて３７℃、１時間反
応させた。反応液の半分を電気泳動（８％ポリアクリル
アミド／８Ｍ尿素ゲル、３００Ｖ、１時間）させ銀染色
で検出した。
【００５７】その結果を、参考写真１に示す。レーン１
から９までの条件と６０塩基長にプライミングインジケ
ーター（ＰＩ）が出現したか否かを以下の表１にまとめ
る。
から９までの条件と６０塩基長にプライミングインジケ
ーター（ＰＩ）が出現したか否かを以下の表１にまとめ
る。
【００５８】 表 １ ─────────────────────────────────── レーン 条件 ＰＩの出現 ─────────────────────────────────── １ Ｍ１３ｓｓＤＮＡのＨａｅIII 処理 なし ２ プライマー（Ａ）１ｐモル使用 あり ３ プライマー（Ｂ）１ｐモル使用 あり ４ プライマー（Ｃ）１ｐモル使用 あり ５ ＴＧＡＧｒＣ５ｐモル、ｐＣＡＴＴ１ｐモル使用 なし ６ プライマー（Ａ）２ｐモル使用 あり ７ プライマー（Ｂ）２ｐモル使用 あり ８ プライマー（Ｃ）２ｐモル使用 あり ９ ＴＧＡＧｒＣ５ｐモル、ｐＣＡＴＴ１ｐモル使用 なし ───────────────────────────────────
【００５９】実施例５（ＧＴＴＧｒＣＧＴＴＧの調製） （ＧＴＴＧｒＣの調製）市販のＧＴＴＧ２５０ｐモル、
ｒＣＴＰ５００ｐモル、ＴｄＴ１３ユニットを実施例１
に示す標準溶液で全量を１０μｌとした。この試料を４
つ用意し、１つは調製直後、又残りの３つはそれぞれ３
７℃で１０分、２０分又は３０分後にＧＴＴＧｒＣの生
成を電気泳動により確認した。その結果、３０分でＧＴ
ＴＧｒＣの生成はほぼ完了したことを確認した。
ｒＣＴＰ５００ｐモル、ＴｄＴ１３ユニットを実施例１
に示す標準溶液で全量を１０μｌとした。この試料を４
つ用意し、１つは調製直後、又残りの３つはそれぞれ３
７℃で１０分、２０分又は３０分後にＧＴＴＧｒＣの生
成を電気泳動により確認した。その結果、３０分でＧＴ
ＴＧｒＣの生成はほぼ完了したことを確認した。
【００６０】（ＧＴＴＧのリン酸化）市販のＧＴＴＧ２
５０ｐモル、ｒＡＴＰ５００ｐモル、キナーゼ１０ユニ
ットを実施例１に示す標準溶液で全量を１０μｌとし
た。この試料を４つ用意し、１つは調製直後、又、残り
の３つはそれぞれ調製後１０分、２０分又は３０分後に
ｐＧＴＴＧの生成を電気泳動法により確認した。その結
果、ＧＴＴＧのリン酸化は調製後１０分でほぼ完了して
いた。
５０ｐモル、ｒＡＴＰ５００ｐモル、キナーゼ１０ユニ
ットを実施例１に示す標準溶液で全量を１０μｌとし
た。この試料を４つ用意し、１つは調製直後、又、残り
の３つはそれぞれ調製後１０分、２０分又は３０分後に
ｐＧＴＴＧの生成を電気泳動法により確認した。その結
果、ＧＴＴＧのリン酸化は調製後１０分でほぼ完了して
いた。
【００６１】（ＧＴＴＧｒＣとｐＧＴＴＧとの連結）Ｇ
ＴＴＧｒＣ７５ｐモルとｐＧＴＴＧ２５ｐモルに相当す
る各反応液又はＧＴＴＧｒＣ２５ｐモルとｐＧＴＴＧ２
５ｐモルに相当する各反応液とｒＡＴＰ５００ｐモルＴ
４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを標準溶液で全量を１０
μｌとした。この試料を２本又は４本用意して調製直後
又は２５℃で１０分、２０分又は３０分後にＧＴＴＧｒ
ＣＧＴＴＧの生成を確認した。その結果、ＧＴＴＧｒＣ
／ｐＧＴＴＧ＝３で３０分後に生成物のバンドが出現し
ているのが確認できた。
ＴＴＧｒＣ７５ｐモルとｐＧＴＴＧ２５ｐモルに相当す
る各反応液又はＧＴＴＧｒＣ２５ｐモルとｐＧＴＴＧ２
５ｐモルに相当する各反応液とｒＡＴＰ５００ｐモルＴ
４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを標準溶液で全量を１０
μｌとした。この試料を２本又は４本用意して調製直後
又は２５℃で１０分、２０分又は３０分後にＧＴＴＧｒ
ＣＧＴＴＧの生成を確認した。その結果、ＧＴＴＧｒＣ
／ｐＧＴＴＧ＝３で３０分後に生成物のバンドが出現し
ているのが確認できた。
【００６２】実施例６（ＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧの調製） 実施例１と同様の方法により得られたＧＴＴＧｒＡ５０
０ｐモル、実施例１と同様の方法により得られたｐＧＴ
ＴＧ１０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡ
リガーゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む５０ｍＭヘ
ペス−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）（１０ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５
０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン））１０μｌ
を１７℃で５時間反応させた。
０ｐモル、実施例１と同様の方法により得られたｐＧＴ
ＴＧ１０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡ
リガーゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む５０ｍＭヘ
ペス−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）（１０ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５
０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン））１０μｌ
を１７℃で５時間反応させた。
【００６３】その結果、ＧＴＴＧｒＡとｒＧＴＴＧが連
結してＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
結してＧＴＴＧｒＡＧＴＴＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
【００６４】実施例７（ＴＧＡＧｒＣＴＧＡＧの調製） 実施例２と同様の方法により得られたＴＧＡＧｒＣ５０
０ｐモル、実施例１と同様の方法により得られたｐＴＧ
ＡＧ１０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡ
リガーゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む５０ｍＭヘ
ペス−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）（１０ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５
０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン））１０μｌ
を１７℃で５時間反応させた。
０ｐモル、実施例１と同様の方法により得られたｐＴＧ
ＡＧ１０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎモルおよび、Ｔ４ＲＮＡ
リガーゼ（タカラ社製）５０ユニットを含む５０ｍＭヘ
ペス−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）（１０ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５
０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン））１０μｌ
を１７℃で５時間反応させた。
【００６５】その結果、ＴＧＡＧｒＣとｒＴＧＡＧが連
結してＴＧＡＧｒＣＴＧＡＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
結してＴＧＡＧｒＣＴＧＡＧが生成していることを電気
泳動法により確認した。
【００６６】 実施例８（ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧの調製） （ＣＧＧＡ＋ｒＧ→ＣＧＧＡｒＧ）市販のＤＮＡ合成機
により合成したＣＧＧＡ２５０ｐモル、ｒＧＴＰ１ｎモ
ルおよびＴｄＴ１０ユニットを実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、１時間反応させた。ＣＧＧＡｒＧの生成は電気泳動
法により確認した。
により合成したＣＧＧＡ２５０ｐモル、ｒＧＴＰ１ｎモ
ルおよびＴｄＴ１０ユニットを実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、１時間反応させた。ＣＧＧＡｒＧの生成は電気泳動
法により確認した。
【００６７】（ＴＧＡＧのリン酸化）市販のＤＮＡ合成
機により合成したＴＧＡＧ２５０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、４時間反応させた。ｐＴＧＡＧの生成は電気泳動法
により確認した。
機により合成したＴＧＡＧ２５０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、４時間反応させた。ｐＴＧＡＧの生成は電気泳動法
により確認した。
【００６８】（ＣＧＧＡｒＧ＋ｐＴＧＡＧ→ＣＧＧＡｒ
ＧＴＧＡＧ）先に合成したＣＧＧＡｒＧ２５０ｐモル相
当の反応液８μｌと先に合成したｐＴＧＡＧ２５０ｐモ
ル相当の反応液４μｌとｒＡＴＰ１ｎモルを含有する溶
液１μｌ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含む溶
液１μｌを実施例１に示した標準溶液５μｌと混合して
全量を１７μｌとした。
ＧＴＧＡＧ）先に合成したＣＧＧＡｒＧ２５０ｐモル相
当の反応液８μｌと先に合成したｐＴＧＡＧ２５０ｐモ
ル相当の反応液４μｌとｒＡＴＰ１ｎモルを含有する溶
液１μｌ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含む溶
液１μｌを実施例１に示した標準溶液５μｌと混合して
全量を１７μｌとした。
【００６９】この試料を２５℃で１時間反応させた。Ｃ
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧは電気泳動法により確認した。
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧは電気泳動法により確認した。
【００７０】（ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧ＋ｒＡ→ＣＧＧＡ
ｒＧＴＧＡＧｒＡ）先に合成したＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧ
の反応液１４μｌ並びにｒＡＴＰ１ｎモル及び１０ユニ
ットのＴｄＴを実施例１の標準溶液各１μｌに溶解した
溶液を混合して全量を１６μｌとした。この試料を３７
℃で１時間反応させた。ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡの生
成は電気泳動法により確認した。
ｒＧＴＧＡＧｒＡ）先に合成したＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧ
の反応液１４μｌ並びにｒＡＴＰ１ｎモル及び１０ユニ
ットのＴｄＴを実施例１の標準溶液各１μｌに溶解した
溶液を混合して全量を１６μｌとした。この試料を３７
℃で１時間反応させた。ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡの生
成は電気泳動法により確認した。
【００７１】（ＡＴＡＧのリン酸化）市販のＤＮＡ合成
機により合成したＡＴＡＧ２５０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、１時間反応させた。ｐＡＴＡＧの生成は電気泳動法
により確認した。
機により合成したＡＴＡＧ２５０ｐモル、ｒＡＴＰ１ｎ
モル及び１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ（ニ
ューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）を実施例１に示した標準溶
液に溶解して全量を１０μｌにした。この試料を３７
℃、１時間反応させた。ｐＡＴＡＧの生成は電気泳動法
により確認した。
【００７２】（ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡ＋ｐＡＴＡＧ
→ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ）先に合成したＣ
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡ２５０ｐモル相当の反応液１０
μｌと先に合成したｐＡＴＡＧ２５０ｐモル相当の反応
液２μｌとｒＡＴＰ１ｎモルを含有する溶液１μｌ及び
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含む溶液１μｌを実
施例１に示した標準溶液５μｌと混合して全量を１６μ
ｌとした。
→ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ）先に合成したＣ
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡ２５０ｐモル相当の反応液１０
μｌと先に合成したｐＡＴＡＧ２５０ｐモル相当の反応
液２μｌとｒＡＴＰ１ｎモルを含有する溶液１μｌ及び
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニットを含む溶液１μｌを実
施例１に示した標準溶液５μｌと混合して全量を１６μ
ｌとした。
【００７３】この試料を２５℃で１時間反応させた。Ｃ
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧの生成は電気泳動法に
より確認した。
ＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧの生成は電気泳動法に
より確認した。
【００７４】実施例９（プライマー活性の確認） 実施例８で得られたＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ
を含む反応物のプライマー活性を確認した。大腸菌のバ
クテリオファージＭ１３の一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｓｓＤ
ＮＡ）をテンプレートとして使用した。
を含む反応物のプライマー活性を確認した。大腸菌のバ
クテリオファージＭ１３の一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｓｓＤ
ＮＡ）をテンプレートとして使用した。
【００７５】上記ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ生
成物はこのＤＮＡの♯１６１９−♯１６３３に完全相補
で、ここからプライマーの下流にあるもっとも近い制限
酵素ＨａｅIII （タカラ酒造社）の認識部位（♯１３９
８）までの切断フラグメントがプライミングインジゲー
ター（２３６塩基長）となる。
成物はこのＤＮＡの♯１６１９−♯１６３３に完全相補
で、ここからプライマーの下流にあるもっとも近い制限
酵素ＨａｅIII （タカラ酒造社）の認識部位（♯１３９
８）までの切断フラグメントがプライミングインジゲー
ター（２３６塩基長）となる。
【００７６】テンプレートとして、Ｍ１３ｓｓＤＮＡ１
ｐモル及びプライマーとしてＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡ
ＡＴＡＧ以外に以下の表に示すものを参照として用い
た。伸長反応バッファとして７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 を用い、上記テンプレートとプ
ライマを含めて全量を１８μｌとし、７０℃、１０分変
性し、次いで４５℃、３０分アニーリングした。
ｐモル及びプライマーとしてＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡ
ＡＴＡＧ以外に以下の表に示すものを参照として用い
た。伸長反応バッファとして７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 を用い、上記テンプレートとプ
ライマを含めて全量を１８μｌとし、７０℃、１０分変
性し、次いで４５℃、３０分アニーリングした。
【００７７】この反応混合物にｄＮＴＰ（各４ｍＭ）１
μｌとクレノーフラグメント４ユニット（（タカラ酒造
社）１μｌ）を加えて４５℃３０分反応させた。次いで
８０℃、５分処理して酵素を失活させた。次に反応液に
制限酵素ＨａｅIII 、１２ユニット（タカラ酒造社、１
μｌ）を加えて３７℃、１時間反応させた。反応液の半
分を電気泳動（４％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲ
ル、３００Ｖ、１時間）させ銀染色で検出した。
μｌとクレノーフラグメント４ユニット（（タカラ酒造
社）１μｌ）を加えて４５℃３０分反応させた。次いで
８０℃、５分処理して酵素を失活させた。次に反応液に
制限酵素ＨａｅIII 、１２ユニット（タカラ酒造社、１
μｌ）を加えて３７℃、１時間反応させた。反応液の半
分を電気泳動（４％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲ
ル、３００Ｖ、１時間）させ銀染色で検出した。
【００７８】その結果を、参考写真２に示す。レーン１
から１０までの条件と２３６塩基長にプライミングイン
ジケーター（ＰＩ）が出現したか否かを以下の表２にま
とめる。
から１０までの条件と２３６塩基長にプライミングイン
ジケーター（ＰＩ）が出現したか否かを以下の表２にま
とめる。
【００７９】 表 ２ ──────────────────────────────────── レーン 条件 ＰＩの出現 ──────────────────────────────────── １ ＣＧＧＡｒＧ（６ｐモル）＋ｐＴＧＡＧ（３ｐモル） なし ２ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧ反応物（３ｐモル相当） あり（弱） ３ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡ反応物（９ｐモル相当） あり（弱） ４ ＣＧＧＡｒＧ（６ｐモル）＋ｐＴＧＡＧ（３ｐモル） ＋ｐＡＴＡＧ（３モル） なし ５ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ反応物（３ｐモル相当）あり（強） ６ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ反応物（９ｐモル相当）あり（強） ７ ＧＧＡＧＴＧＡＧ（既知ＤＮＡオリゴマー）（１ｐモル） あり（強） ８ なし（テンプレート） なし ９ ＣＧＧＡｒＧ（１８ｐモル）＋ｐＴＧＡＧ（９ｐモル） なし １０ ＣＧＧＡｒＧ（１８ｐモル）＋ｐＴＧＡＧ（９ｐモル） ＋ｐＡＴＡＧ（９ｐモル） なし ────────────────────────────────────
【００８０】実施例１０ （ＰＣＲへの応用） 実施例８で得られたオリゴヌクレオチドＣＧＧＡｒＧＴ
ＧＡＧｒＡＡＴＡＧのＰＣＲのプライマーとしての応用
を検討した。反応及び分析は以下に示す条件で行った。
ＧＡＧｒＡＡＴＡＧのＰＣＲのプライマーとしての応用
を検討した。反応及び分析は以下に示す条件で行った。
【００８１】ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ合成反
応物のＰＣＲへの応用 反応緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５μｇ／ｍｌ
ゼラチン、各５０μＭ ｄＮＴＰ テンプレート：Ｍ１３ｓｓＤＮＡ（１ｆモル） 合成酵素：ＡｍｐｌｉＴａｑ（タカラ、０．５ユニッ
ト） プライマー１：ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ合成
反応物（９ｐモル相当） プライマー２：ＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣ
ＧＣ（Ｐ１、２ｐモル） 反応条件：４０サイクル（変性：９２℃、７０秒、アニ
ール：４５℃、３００秒、合成：６０℃、１５０秒／サ
イクル） 分析：反応液１０μｌを８Ｍ尿素／４％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分析した。
応物のＰＣＲへの応用 反応緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５μｇ／ｍｌ
ゼラチン、各５０μＭ ｄＮＴＰ テンプレート：Ｍ１３ｓｓＤＮＡ（１ｆモル） 合成酵素：ＡｍｐｌｉＴａｑ（タカラ、０．５ユニッ
ト） プライマー１：ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ合成
反応物（９ｐモル相当） プライマー２：ＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣ
ＧＣ（Ｐ１、２ｐモル） 反応条件：４０サイクル（変性：９２℃、７０秒、アニ
ール：４５℃、３００秒、合成：６０℃、１５０秒／サ
イクル） 分析：反応液１０μｌを８Ｍ尿素／４％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分析した。
【００８２】電気泳動の結果を参考写真３に示す。尚、
各レーンに使用したプライマーを以下の表３に示す。Ｐ
ｌは、Ｍ１３ｓｓＤＮＡの♯１３６９−１３８９の配列
に相当し、テトラマー三個付加物（１４マー）は、♯１
６１９−１６３３に相補的であることから２６４塩基長
のバンドの生成が期待され、これが検出されたことから
発明のオリゴヌクレオチドのＰＣＲへの応用が可能であ
ることが示された（レーン２）。
各レーンに使用したプライマーを以下の表３に示す。Ｐ
ｌは、Ｍ１３ｓｓＤＮＡの♯１３６９−１３８９の配列
に相当し、テトラマー三個付加物（１４マー）は、♯１
６１９−１６３３に相補的であることから２６４塩基長
のバンドの生成が期待され、これが検出されたことから
発明のオリゴヌクレオチドのＰＣＲへの応用が可能であ
ることが示された（レーン２）。
【００８３】 表 ３ ──────────────────────────────────── レーン 使用したプライマー ──────────────────────────────────── １ ＣＧＡＧＴＧＡＧ（２ｐモル）＋Ｐｌ（２ｐモル） ２ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ反応物（９ｐモル相当） ＋Ｐｌ（２ｐモル） ３ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧ（９ｐモル相当）＋Ｐｌ（２ｐモル） ４ ＣＧＧＡｒＧ（１８ｐモル）＋ｐＴＧＡＧ（９ｐモル） ＋ｐＡＴＡＧ（９ｐモル） ５ Ｐｌ（２ｐモル） ６ ＧＧＡＧＴＧＡＧ（２ｐモル） ７ ＣＧＧＡｒＧＴＧＡＧｒＡＡＴＡＧ反応物（９ｐモル相当） ８ ナシ ────────────────────────────────────
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−190086（ＪＰ，Ａ) 欧州公開67597（ＥＰ，Ａ１) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８［17］（1980) Ｐ．3909−3916 Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏ ｌ．105（1980）Ｐ．481−487 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．23 （1986）Ｐ．320−327 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/10 - 15/11 C12Q 1/68 C07H 21/02 - 21/04 C12P 19/34 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ヌクレオチド数が２〜２０であり、かつ
５' 末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオチドの一種
又は二種以上と、少なくとも３’末端にリボヌクレオチ
ド基を有し、残りのヌクレオチドの一部または全部がデ
オキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド数が２〜
２０であるオリゴヌクレオチドの一種又は二種以上と
を、ＲＮＡリガーゼの存在下連結してオリゴヌクレオチ
ドを合成する方法であって、上記連結をアデノシン三リ
ン酸及び２価の金属イオンの存在下で行うことを含むオ
リゴヌクレオチドの合成法。 - 【請求項２】 ３' 末端にリボヌクレオチド基を有する
５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 （式中、ｄ
Ｎ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 及びｄＮ4 は同一又は異なるデオ
キシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 はリボヌクレオチ
ドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ
6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 （式中、ｄＮ6 、ｄＮ7 、ｄＮ8
及びｄＮ9 は同一又は異なるデオキシリボヌクレオチド
を示し、ｐｄＮ6 は５' 末端をリン酸化したデオキシリ
ボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼの存在下連
結して９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6ｄ
Ｎ7 ｄＮ8 ｄＮ9 を合成する方法であって、 上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオンの
存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法。 - 【請求項３】 ３' 末端にリボヌクレオチド基を有する
１０マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7
ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10（式中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、
ｄＮ4 、ｄＮ6 、ｄＮ7 、ｄＮ8 及びｄＮ9 は同一又は
異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ5 及びｒ
Ｎ10は同一又は異なるリボヌクレオチドを示す）と５'
末端にリン酸基を有する４マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄ
Ｎ14又は９マーｐｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ
16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄ
Ｎ13、ｄＮ14、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ18及びｄＮ19は同
一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒＮ15
はリボヌクレオチドを示し、ｐｄＮ11は５' 末端をリン
酸化したデオキシリボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡ
リガーゼの存在下連結して１４マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3
ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄ
Ｎ12ｄＮ13ｄＮ14又は１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ
4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12
ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19を合成す
る方法、又は３' 末端にリボヌクレオチド基を有する１
５マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ6 ｄＮ7 ｄ
Ｎ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14ｒＮ15（式
中、ｄＮ1 、ｄＮ2 、ｄＮ3 、ｄＮ6 、ｄＮ7 、ｄ
Ｎ8 、ｄＮ9 、ｄＮ11、ｄＮ12、ｄＮ13及びｄＮ14は同
一又は異なるデオキシリボヌクレオチドを示し、ｒ
Ｎ5 、ｒＮ10及びｒＮ15は同一又は異なるリボヌクレオ
チドを示す）と５' 末端にリン酸基を有する４マーｐｄ
Ｎ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19（式中、ｄＮ16、ｄＮ17、ｄＮ
18及びｄＮ19は同一又は異なるデオキシリボヌクレオチ
ドを示し、ｐｄＮ16は５' 末端をリン酸化したデオキシ
リボヌクレオチドを示す）とをＲＮＡリガーゼの存在下
連結して１９マーｄＮ1 ｄＮ2 ｄＮ3 ｄＮ4 ｒＮ5 ｄＮ
6 ｄＮ7 ｄＮ8 ｄＮ9 ｒＮ10ｄＮ11ｄＮ12ｄＮ13ｄＮ14
ｒＮ15ｄＮ16ｄＮ17ｄＮ18ｄＮ19を合成する方法であっ
て、 上記連結をアデノシン三リン酸及び２価の金属イオンの
存在下で行うことを含むオリゴヌクレオチドの合成法。 - 【請求項４】 ヌクレオチド数が９〜１９のオリゴヌク
レオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチドはリボ
ヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはデオキシヌ
クレオチドであるＤＮＡ合成用プライマーを合成する請
求項１〜３のいずれか１項に記載の合成法。 - 【請求項５】 ヌクレオチド数が９〜１９のオリゴヌク
レオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチドはリボ
ヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはデオキシヌ
クレオチドであるＤＮＡ配列識別用プローブを合成する
請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成法。
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| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８［１７］（１９８０）Ｐ．３９０９−３９１６ |
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