JP2628336B2 - ブラジキニン誘導体およびその定量 - Google Patents
ブラジキニン誘導体およびその定量Info
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- JP2628336B2 JP2628336B2 JP63084486A JP8448688A JP2628336B2 JP 2628336 B2 JP2628336 B2 JP 2628336B2 JP 63084486 A JP63084486 A JP 63084486A JP 8448688 A JP8448688 A JP 8448688A JP 2628336 B2 JP2628336 B2 JP 2628336B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は主として、下記一般式（Ｉ）で表されるペプ
チド（Ｉ）の免疫学的定量に関するものであり、特に臨
床診断の分野において有用である。
チド（Ｉ）の免疫学的定量に関するものであり、特に臨
床診断の分野において有用である。
（式中、Ｘは水素原子またはLysを意味する。） 本明細書においてLysはリジン、Argはアルギニン、Pr
oはプロリン、Hypはヒドロキシプロリン、Glyはグリシ
ン、Pheはフェニルアラニン、Serはセリンの残基をそれ
ぞれ意味する。
oはプロリン、Hypはヒドロキシプロリン、Glyはグリシ
ン、Pheはフェニルアラニン、Serはセリンの残基をそれ
ぞれ意味する。
従来技術と解決課題 ブラジキニン（以下、BKという）およびカリジン（以
下、KKという）は小血管の拡張や透過性の亢進あるいは
平滑筋の収縮または弛緩などの生理作用を有するペプチ
ドである。一般式（Ｉ）におけるＣ末端から７番目のHy
pがProで置換されたペプチドであって、Ｘが水素原子で
ある場合がBKであり、ＸがLysである場合がKKであり、
いずれも代表的なキニン化合物である。ヒト体液中のBK
を酵素免疫定量法（EIA）による定量するキットか大日
本製薬（株）から市販されているが、このキットではBK
のみならずKKやペプチド（Ｉ）までもBKとして定量さ
れ、ペプチド（Ｉ）を分別定量することができなかっ
た。
下、KKという）は小血管の拡張や透過性の亢進あるいは
平滑筋の収縮または弛緩などの生理作用を有するペプチ
ドである。一般式（Ｉ）におけるＣ末端から７番目のHy
pがProで置換されたペプチドであって、Ｘが水素原子で
ある場合がBKであり、ＸがLysである場合がKKであり、
いずれも代表的なキニン化合物である。ヒト体液中のBK
を酵素免疫定量法（EIA）による定量するキットか大日
本製薬（株）から市販されているが、このキットではBK
のみならずKKやペプチド（Ｉ）までもBKとして定量さ
れ、ペプチド（Ｉ）を分別定量することができなかっ
た。
ペプチド（Ｉ）の極微量定量法に言及した報告はな
い。
い。
本発明者らは尿、血液、腹水などのヒト体液中にペプ
チド（Ｉ）が存在することおよびこれらのヒト体液中濃
度はガンの如き炎症を伴い血管透過性を亢進する疾患の
診断指標として可能性があるとの知見に基づいて、ペプ
チド（Ｉ）に対する特異性に優れた抗体の創製に成功
し、本発明を完成した。
チド（Ｉ）が存在することおよびこれらのヒト体液中濃
度はガンの如き炎症を伴い血管透過性を亢進する疾患の
診断指標として可能性があるとの知見に基づいて、ペプ
チド（Ｉ）に対する特異性に優れた抗体の創製に成功
し、本発明を完成した。
課題を解決するための手段 本発明はペプチド（Ｉ）を特異的に認識する抗体に関
する。更に詳細には、本発明は一般式（Ｉ） Ｘ−Arg−Pro−Hyp−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Arg
（Ｉ） （式中、Ｘは前掲と同じものを意味する。） で表されるペプチドのＣ末端と免疫原性タンパクとの結
合物を抗原として脊椎動物を免疫することにより作製さ
れた抗体であって、下記の（ａ）及び（ｂ）に記載する
交差特性、 （ａ）ＸがLysであるペプチド（Ｉ）に対する抗体は、
Ｘが水素原子であるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。
する。更に詳細には、本発明は一般式（Ｉ） Ｘ−Arg−Pro−Hyp−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Arg
（Ｉ） （式中、Ｘは前掲と同じものを意味する。） で表されるペプチドのＣ末端と免疫原性タンパクとの結
合物を抗原として脊椎動物を免疫することにより作製さ
れた抗体であって、下記の（ａ）及び（ｂ）に記載する
交差特性、 （ａ）ＸがLysであるペプチド（Ｉ）に対する抗体は、
Ｘが水素原子であるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。
（ｂ）Ｘが水素原子であるペプチド（Ｉ）に対する抗体
は、ＸがLysであるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。
は、ＸがLysであるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。
を有する抗体に関する。
ここにおけるペプチド（Ｉ）は、アミノ酸を１個ずつ
縮合せしめる方法、複数のアミノ酸からなる縮合物同士
を縮合せしめる方法またはこれらを組み合わせた方法に
より製造できる。この様な縮合は、例えばアジド法、混
合酸無水物法、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、活
性エステル法などの常法により、液相や固相において、
好ましくは固相において行える。
縮合せしめる方法、複数のアミノ酸からなる縮合物同士
を縮合せしめる方法またはこれらを組み合わせた方法に
より製造できる。この様な縮合は、例えばアジド法、混
合酸無水物法、ジシクロヘキシルカルボジイミド法、活
性エステル法などの常法により、液相や固相において、
好ましくは固相において行える。
固相法は、反応に関与せしめる必要のない官能基を保
護したアミノ酸とパム（pam）樹脂の如き不溶性担体と
を、アミノ酸のカルボキシル基を通して結合させ、保護
基を脱離し、これに反応に関与せしめる必要のない官能
基を保護したアミノ酸をカップルさせ、所望のペプチド
鎖になるまでこの操作を繰り返し、次いでフッ化水素処
理などにより不溶性担体との結合を切断し、保護基が残
存するときはこれを脱離して目的とするペプチドを得る
方法である。通常、フッ化水素処理により大部分の保護
基が脱離されるので、大抵は保護基脱離操作を独立して
行う必要がない。
護したアミノ酸とパム（pam）樹脂の如き不溶性担体と
を、アミノ酸のカルボキシル基を通して結合させ、保護
基を脱離し、これに反応に関与せしめる必要のない官能
基を保護したアミノ酸をカップルさせ、所望のペプチド
鎖になるまでこの操作を繰り返し、次いでフッ化水素処
理などにより不溶性担体との結合を切断し、保護基が残
存するときはこれを脱離して目的とするペプチドを得る
方法である。通常、フッ化水素処理により大部分の保護
基が脱離されるので、大抵は保護基脱離操作を独立して
行う必要がない。
ペプチド（Ｉ）と免疫原性タンパクとの結合物は抗体
を調製するためのハプテン抗原として有用である。ペプ
チド（Ｉ）と結合すべき免疫原性タンパクとしてはアル
ブミン、グロブリン、サイログロブリン、貝ヘモシアニ
ン、エデスチンなどのタンパクが挙げられる。
を調製するためのハプテン抗原として有用である。ペプ
チド（Ｉ）と結合すべき免疫原性タンパクとしてはアル
ブミン、グロブリン、サイログロブリン、貝ヘモシアニ
ン、エデスチンなどのタンパクが挙げられる。
ペプリド（Ｉ）と免疫原性タンパクとの結合は、ペプ
チド（Ｉ）のＣ末端において行う。このような結合は、
ペプチド（Ｉ）のＣ末端に更にシステイン（Cys）やCys
を含むペプチドを結合させたペプチドを合成し、そのCy
s中のSH基と免疫原性タンパクのアミノ基とを結合剤を
用いて結合させることにより実施できる。ここにおける
結合剤としては、例えば、特公昭58−8395に記載のｍ−
MBSと略称されるマレイミド誘導体が挙げられる。
チド（Ｉ）のＣ末端において行う。このような結合は、
ペプチド（Ｉ）のＣ末端に更にシステイン（Cys）やCys
を含むペプチドを結合させたペプチドを合成し、そのCy
s中のSH基と免疫原性タンパクのアミノ基とを結合剤を
用いて結合させることにより実施できる。ここにおける
結合剤としては、例えば、特公昭58−8395に記載のｍ−
MBSと略称されるマレイミド誘導体が挙げられる。
本発明の抗体は、このようにして作製された一般式
（Ｉ）で表されるペプチドと免疫原性タンパクとの結合
物（ハプテン抗原）を適当なアジュバントとともにウサ
ギやモルモット、山羊、羊などの脊椎動物に非経口投与
（免疫）し、その血清を採取し、公知の処理をなすこと
によって容易に得られる。モノクローナル抗体は、この
ように免疫された動物の抗体産生細胞を脾臓より採取
し、以下常法に従って、ミエローマ細胞との融合、クロ
ーン性細胞のスクリーニングなどの操作を経て創製でき
る。
（Ｉ）で表されるペプチドと免疫原性タンパクとの結合
物（ハプテン抗原）を適当なアジュバントとともにウサ
ギやモルモット、山羊、羊などの脊椎動物に非経口投与
（免疫）し、その血清を採取し、公知の処理をなすこと
によって容易に得られる。モノクローナル抗体は、この
ように免疫された動物の抗体産生細胞を脾臓より採取
し、以下常法に従って、ミエローマ細胞との融合、クロ
ーン性細胞のスクリーニングなどの操作を経て創製でき
る。
かくして得られる本発明の抗体は、抗原に対する特異
性が極めて高く、BKやKKの如きペプチド（Ｉ）の類縁体
とは実質的に交差しない。
性が極めて高く、BKやKKの如きペプチド（Ｉ）の類縁体
とは実質的に交差しない。
本発明は、また、上記の抗体を用いるペプチド（Ｉ）
の免疫学的定量用キットに関する。すなわち、本発明の
キットは、 （ａ）Ｃ末端側が標識物で標識されたペプチド（Ｉ）、 （ｂ）先に説明した抗体そのものまたはその不溶化物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬、 から構成される。
の免疫学的定量用キットに関する。すなわち、本発明の
キットは、 （ａ）Ｃ末端側が標識物で標識されたペプチド（Ｉ）、 （ｂ）先に説明した抗体そのものまたはその不溶化物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬、 から構成される。
試薬（ａ）は、標識物と一般式（Ｉ）で表されるペプ
チド（Ｉ）とを、ペプチド（Ｉ）のＣ末端で結合させた
結合物（標識抗原）である。標識物としては酵素、放射
性物質、蛍光物質、スピン化合物などが挙げられ、特に
酵素が好ましい。酵素としてはβ−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、リパーゼ、パーオキシダー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼな
どが用いられる。酵素とペプチド（Ｉ）との結合は、す
でに説明した免疫原生タンパクとペプチド（Ｉ）との結
合方法と同様の方法により行える。
チド（Ｉ）とを、ペプチド（Ｉ）のＣ末端で結合させた
結合物（標識抗原）である。標識物としては酵素、放射
性物質、蛍光物質、スピン化合物などが挙げられ、特に
酵素が好ましい。酵素としてはβ−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、リパーゼ、パーオキシダー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼな
どが用いられる。酵素とペプチド（Ｉ）との結合は、す
でに説明した免疫原生タンパクとペプチド（Ｉ）との結
合方法と同様の方法により行える。
試薬（ｂ）は本発明の抗体そのものか、または本発明
の抗体と不溶性担体とを結合させた不溶化抗体である。
不溶性担体としては本分野で用いられるものであればい
ずれでもよいが、米国特許4,166,767に開示の細菌細胞
壁片が特に好ましく用いられる。不溶性担体と抗体との
結合は、結合剤を用いる常法に従って行える。結合剤と
しては、抗体のアミノ基と不溶性担体のアミノ基との間
を化学的に結合するグルタルアルデヒドやトルエンジイ
ソシアネート、ジハロゲン化ジニトロベンゼンなどが挙
げられる。また、抗体のSH基と不溶性担体のアミノ基ま
たは逆に不溶性担体のSH基と抗体のアミノ基とを架橋す
る前記の如きマレイミド誘導体（ｍ−MBS）が結合剤と
して好適に用いられる。SH基が存在しない場合は、特開
昭57−142967に開示されている例えばＮ−（アセチルメ
ルカプトアセトキシン）サクシンイミドを用いてSH基を
導入してから結合に供することもできる。
の抗体と不溶性担体とを結合させた不溶化抗体である。
不溶性担体としては本分野で用いられるものであればい
ずれでもよいが、米国特許4,166,767に開示の細菌細胞
壁片が特に好ましく用いられる。不溶性担体と抗体との
結合は、結合剤を用いる常法に従って行える。結合剤と
しては、抗体のアミノ基と不溶性担体のアミノ基との間
を化学的に結合するグルタルアルデヒドやトルエンジイ
ソシアネート、ジハロゲン化ジニトロベンゼンなどが挙
げられる。また、抗体のSH基と不溶性担体のアミノ基ま
たは逆に不溶性担体のSH基と抗体のアミノ基とを架橋す
る前記の如きマレイミド誘導体（ｍ−MBS）が結合剤と
して好適に用いられる。SH基が存在しない場合は、特開
昭57−142967に開示されている例えばＮ−（アセチルメ
ルカプトアセトキシン）サクシンイミドを用いてSH基を
導入してから結合に供することもできる。
試薬（ｃ）として通常用いられるのは、試薬（ｂ）た
る抗体に対する抗体（第２抗体）であって、不溶化され
たもの（不溶化第２抗体）である。第２抗体は、例えば
ウサギ血清から得られたIgG分画を抗原として、他の動
物、例えばモルモットを免疫することにより調製でき
る。細菌細胞壁片を担体とする不溶化第２抗体は、マー
セラなる名称で大日本製薬（株）から市販されている。
る抗体に対する抗体（第２抗体）であって、不溶化され
たもの（不溶化第２抗体）である。第２抗体は、例えば
ウサギ血清から得られたIgG分画を抗原として、他の動
物、例えばモルモットを免疫することにより調製でき
る。細菌細胞壁片を担体とする不溶化第２抗体は、マー
セラなる名称で大日本製薬（株）から市販されている。
このほか緩衝化剤、標識活性測定用試薬、検量線作成
用標準抗原溶液などの試薬が用いられる。
用標準抗原溶液などの試薬が用いられる。
これらの試薬を用いるペプチド（Ｉ）の定量は、 検体と試薬（ａ）および試薬（ｂ）とを反応させ、 試薬（ｂ）として不溶化抗体を用いたときは、反応
混液を遠心して、遊離の試薬（ａ）（上清）とその他の
もの（沈殿）とを分離（B/F分離）し、 試薬（ｂ）として本発明の抗体そのものを用いたと
きは、更に試薬（ｃ）を反応させてからB/F分離を行
い、 またはで分離した上清または沈殿中の標識物の
活性を測定する、 ことにより容易に実施できる。このような工程ないし
の実施条件は、通常のEIA法と変わりはない。検体が
ヒト体液の如きキニナーゼを含むときは、通常、あらか
じめトリクロル酢酸などによって除タンパクしておく方
がよい。
混液を遠心して、遊離の試薬（ａ）（上清）とその他の
もの（沈殿）とを分離（B/F分離）し、 試薬（ｂ）として本発明の抗体そのものを用いたと
きは、更に試薬（ｃ）を反応させてからB/F分離を行
い、 またはで分離した上清または沈殿中の標識物の
活性を測定する、 ことにより容易に実施できる。このような工程ないし
の実施条件は、通常のEIA法と変わりはない。検体が
ヒト体液の如きキニナーゼを含むときは、通常、あらか
じめトリクロル酢酸などによって除タンパクしておく方
がよい。
具体例 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。な
お以下において、一般式（Ｉ）におけるＸが水素原子で
あるペプチドをHYP−BKと略称し、ＸがLysであるペプチ
ドをHYP−KKと略称する。
お以下において、一般式（Ｉ）におけるＸが水素原子で
あるペプチドをHYP−BKと略称し、ＸがLysであるペプチ
ドをHYP−KKと略称する。
実施例 １ ペプチド（Ｉ）の合成 （Ａ） HYP−BKは、固相ペプチド合成装置モデル990E
（ベックマン インストルメント社）を用いてJ.Am.Che
m.Soc.,86,304−305（1964）に開示の方法に準じて合成
した。即ち、手順に従って、Ｐ−メチルベンツヒドリル
アミン樹脂に各Boc−Ｌ−アミノ酸を順次カップルさせ
ることによりHYP−BKを合成した。縮合剤としては、Boc
−アルギニンの場合はジシクロヘキシルカルボジイミド
および１−ヒドロキシベンツトリアゾールを用い、その
ほかの場合は前者のみを用いた。なお、得られたHYP−B
Kのアミノ酸配列は470Aプロテイン シークエンサー
（アプライド バイオシステム社）により確認した。
（ベックマン インストルメント社）を用いてJ.Am.Che
m.Soc.,86,304−305（1964）に開示の方法に準じて合成
した。即ち、手順に従って、Ｐ−メチルベンツヒドリル
アミン樹脂に各Boc−Ｌ−アミノ酸を順次カップルさせ
ることによりHYP−BKを合成した。縮合剤としては、Boc
−アルギニンの場合はジシクロヘキシルカルボジイミド
および１−ヒドロキシベンツトリアゾールを用い、その
ほかの場合は前者のみを用いた。なお、得られたHYP−B
Kのアミノ酸配列は470Aプロテイン シークエンサー
（アプライド バイオシステム社）により確認した。
（Ｂ） （Ａ）と同様にして次のペプチドを得る。
HYP−KK HYP−BK−Cys（HYP−BKのＣ末端にCysを縮合させたペプ
チド） HYP−KK−Cys（HYP−KKのＣ末端にCysを縮合させたペプ
チド） 実施例 ２ ペプチドとタンパクとの結合 ウシ血清アルブミン（BSA）50mgを含む0.05Mリン酸緩
衝液（pH7）50mlにｍ−MBSの2.5mgを含むジオキサン5ml
を加え室温で１時間攪拌し、同緩衝液で２倍に希釈し、
PM30（アミコン社）膜で濾過洗浄する。膜上物を同緩衝
液5mlに溶解し、HYP−BK−Cysの5mgを含む同緩衝液1ml
を加え、さらに２時間室温で攪拌する。本混液を0.9％N
aClの５で２回透析し、HYP−BK−Cys−BSA結合物（ハ
プテン抗原溶液）を得る。
チド） HYP−KK−Cys（HYP−KKのＣ末端にCysを縮合させたペプ
チド） 実施例 ２ ペプチドとタンパクとの結合 ウシ血清アルブミン（BSA）50mgを含む0.05Mリン酸緩
衝液（pH7）50mlにｍ−MBSの2.5mgを含むジオキサン5ml
を加え室温で１時間攪拌し、同緩衝液で２倍に希釈し、
PM30（アミコン社）膜で濾過洗浄する。膜上物を同緩衝
液5mlに溶解し、HYP−BK−Cysの5mgを含む同緩衝液1ml
を加え、さらに２時間室温で攪拌する。本混液を0.9％N
aClの５で２回透析し、HYP−BK−Cys−BSA結合物（ハ
プテン抗原溶液）を得る。
同様にしてHYP−KK−Cys−BSA結合物（ハプテン抗原
溶液）を得る。
溶液）を得る。
実施例 ３ 抗体の調製 （Ａ） ポリクローナル抗体 実施例２で得た２種のハプテン抗原溶液を、それぞれ
280nmにおける吸光度が約２となるように0.9％NaClで希
釈し、等量のフロインド完全アジュバントと混合し、乳
濁したものを、ウサギ１羽あたり後足蹠に0.2mlずつを
２カ所、背部皮下に0.2mlずつを８カ所注射（免疫）
し、次回からは、２時間毎に、背部皮下に0.2mlずつを1
0カ所注射する。５回免疫し、１週間後ウレタン麻酔下
に頚動脈より全血を採取し、それぞれの抗血清を得る。
280nmにおける吸光度が約２となるように0.9％NaClで希
釈し、等量のフロインド完全アジュバントと混合し、乳
濁したものを、ウサギ１羽あたり後足蹠に0.2mlずつを
２カ所、背部皮下に0.2mlずつを８カ所注射（免疫）
し、次回からは、２時間毎に、背部皮下に0.2mlずつを1
0カ所注射する。５回免疫し、１週間後ウレタン麻酔下
に頚動脈より全血を採取し、それぞれの抗血清を得る。
（Ｂ） モノクローナル抗体 BALB/cマウス１匹あたり、（Ａ）で調製した乳濁液0.
5mlを４〜５カ所にわけて、２週間間隔で皮下に注射す
る。３回免疫した１週間後にその脾臓を採取し、常法に
より抗体生産性細胞を得る。この脾臓細胞（７×10
5個）とマウスミエローマ細胞（P3×63Ag−U1、2.1×10
6個）とをポリエチレングリコール法で融合してハイブ
リドーマを調製する。96穴タイタープレートに分配し、
常法により培養する。抗体生産細胞のスクリーニングは
実施例５の酵素標識抗原、不溶化抗ヤギIgGウサギ抗体
（マーセラ30）、酵素基質および酵素反応停止剤を用い
て実施する。最終的には３種のモノクローナル抗体（Ig
G型）生産性ハイブリドーマを得た。そのうちの２種がE
IAに適したモノクローナル抗体を生産するものであっ
た。
5mlを４〜５カ所にわけて、２週間間隔で皮下に注射す
る。３回免疫した１週間後にその脾臓を採取し、常法に
より抗体生産性細胞を得る。この脾臓細胞（７×10
5個）とマウスミエローマ細胞（P3×63Ag−U1、2.1×10
6個）とをポリエチレングリコール法で融合してハイブ
リドーマを調製する。96穴タイタープレートに分配し、
常法により培養する。抗体生産細胞のスクリーニングは
実施例５の酵素標識抗原、不溶化抗ヤギIgGウサギ抗体
（マーセラ30）、酵素基質および酵素反応停止剤を用い
て実施する。最終的には３種のモノクローナル抗体（Ig
G型）生産性ハイブリドーマを得た。そのうちの２種がE
IAに適したモノクローナル抗体を生産するものであっ
た。
実施例 ４ ペプチドと酵素の結合 大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（以下β−Ga1とい
う。ベーリンガーマンハイム社）の1mgを含む水2mlにマ
レイミド500μｇを含む水1mlを加え室温で１時間攪拌す
る。これを0.02Mリン酸緩衝液（pH7）の５で２回透析
し、SH基が保護されたβ−Ga1を得る。
う。ベーリンガーマンハイム社）の1mgを含む水2mlにマ
レイミド500μｇを含む水1mlを加え室温で１時間攪拌す
る。これを0.02Mリン酸緩衝液（pH7）の５で２回透析
し、SH基が保護されたβ−Ga1を得る。
透析内容液3mlにｍ−MBS60μｇを含有するジメチルホ
ルムアミド0.4mlを加え室温で2.5時間攪拌する。この溶
液1mlに実施例１（Ｂ）で得たHYP−BK−CysまたはHYP−
KK−Cysの500μｇを含む水200μｌを加え、室温で２時
間攪拌しバイオゲルP4カラム（バイオラッド社、2.5×3
2cm、100〜200メッシュ）にかけて5mlずつ分画し、酵素
活性部分を集め酵素標識抗原（HYP−BK−Cys−β−Ga1
またはHYP−KK−Cys−Ga1）溶液を得る。
ルムアミド0.4mlを加え室温で2.5時間攪拌する。この溶
液1mlに実施例１（Ｂ）で得たHYP−BK−CysまたはHYP−
KK−Cysの500μｇを含む水200μｌを加え、室温で２時
間攪拌しバイオゲルP4カラム（バイオラッド社、2.5×3
2cm、100〜200メッシュ）にかけて5mlずつ分画し、酵素
活性部分を集め酵素標識抗原（HYP−BK−Cys−β−Ga1
またはHYP−KK−Cys−Ga1）溶液を得る。
実施例 ５ EIAによるHYP−BKの定量 試薬 標準抗原 ０〜1000ng/mlとなるように実施例１（Ａ）で得たHYP
−BKを下記緩衝液Ａで溶解した溶液。
−BKを下記緩衝液Ａで溶解した溶液。
抗体 実施例３（Ａ）で得た血清（抗HYP−BKポリクローナ
ル抗体）を緩衝液Ａで5000倍希釈した溶液。
ル抗体）を緩衝液Ａで5000倍希釈した溶液。
酵素標識抗原 実施例４で得たHYP−BK−Cys−β−Ga1含有溶液を緩
衝液Ａで20倍希釈した溶液。
衝液Ａで20倍希釈した溶液。
不溶化第２抗体 マーセラ10（不溶化抗ウサギIgGヤギ抗体） （大日本製薬（株）） 0.9％NaCl 基質 27mM2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド−１mMM
gCl2−40％エチレングリコール−0.1％NaN3 酵素反応停止剤 0.1M K2HPO4−NaOH（pH11） 緩衝液Ａ 0.1％BSA−0.1％NaN3−0.9％NaCl−0.04Mリン酸緩衝液
（pH7） 緩衝液Ｂ 0.5Mトリス塩酸−0.2％ゼラチン−0.9％NaCl（pH8） 20％トリクロル酢酸（除タンパク剤） 操作 （１） 前処理（除タンパク） プラスチンクチューブに500μの検体（血清など）
を入れ、20％トリクロル酢酸100μを混和し、生じる
沈殿を遠心分離（15000×ｇ、10分間）し、上清250μ
に同量の緩衝液Ｂを加えたものを検体とする。
gCl2−40％エチレングリコール−0.1％NaN3 酵素反応停止剤 0.1M K2HPO4−NaOH（pH11） 緩衝液Ａ 0.1％BSA−0.1％NaN3−0.9％NaCl−0.04Mリン酸緩衝液
（pH7） 緩衝液Ｂ 0.5Mトリス塩酸−0.2％ゼラチン−0.9％NaCl（pH8） 20％トリクロル酢酸（除タンパク剤） 操作 （１） 前処理（除タンパク） プラスチンクチューブに500μの検体（血清など）
を入れ、20％トリクロル酢酸100μを混和し、生じる
沈殿を遠心分離（15000×ｇ、10分間）し、上清250μ
に同量の緩衝液Ｂを加えたものを検体とする。
（２） 定量方法 試験管（１×10cm）に標準抗原または前処理検体100
μを入れ、次に抗体200μを加え、37℃で温置す
る。30分後、酵素標識抗原200μを混和し、37℃で温
置する。30分後マーセラ10の200μを加え同温度で15
分間温置する。次に2mlの0.9％NaClを加え、遠心（1500
×10分間）し、上清を除去する。この洗浄操作をもう１
度くりかえす。沈殿に500μの緩衝液Ａを加え攪拌し
て均一にする。これに基質100μを加え攪拌し、37℃
で30分間温置し、酵素反応停止剤1.5mlを加える。これ
を遠心（1500×ｇ、10分間）し、410nmにおける上清の
吸光度を測定する。別に作成した検量線（第１図）から
検体中のHYP−BK量を求める。
μを入れ、次に抗体200μを加え、37℃で温置す
る。30分後、酵素標識抗原200μを混和し、37℃で温
置する。30分後マーセラ10の200μを加え同温度で15
分間温置する。次に2mlの0.9％NaClを加え、遠心（1500
×10分間）し、上清を除去する。この洗浄操作をもう１
度くりかえす。沈殿に500μの緩衝液Ａを加え攪拌し
て均一にする。これに基質100μを加え攪拌し、37℃
で30分間温置し、酵素反応停止剤1.5mlを加える。これ
を遠心（1500×ｇ、10分間）し、410nmにおける上清の
吸光度を測定する。別に作成した検量線（第１図）から
検体中のHYP−BK量を求める。
実施例 ６ 交差性 検体としてBK、Des9BK（Ｃ末端から９番目のアミノ酸
が欠如したBK、以下同様）、Des8、9BKおよびHYP−KKを
用いるほかは実施例５と同様の操作を行った。その結
果、500ng/ml以下では交差性は認められず、1000ng/ml
においては、BKおよびDes8、9BKの場合は0.39％の、Des
9BKおよびKKの場合は0.39％以下の、またHYP−KKの場合
は0.72％の交差が認められるにすぎなかった。
が欠如したBK、以下同様）、Des8、9BKおよびHYP−KKを
用いるほかは実施例５と同様の操作を行った。その結
果、500ng/ml以下では交差性は認められず、1000ng/ml
においては、BKおよびDes8、9BKの場合は0.39％の、Des
9BKおよびKKの場合は0.39％以下の、またHYP−KKの場合
は0.72％の交差が認められるにすぎなかった。
実施例 ７ モノクローナル抗体を用いるEIA 実施例３（Ｂ）で得たモノクローナル抗体およびマー
セラ30を用いるほかは実施例５と同様にしてHYP−BKの
定量を行った。
セラ30を用いるほかは実施例５と同様にしてHYP−BKの
定量を行った。
実施例 ８ HYP−KKのEIA 標準抗原として実施例１（Ｂ）で得たHYP−KKを含む
緩衝液Ａを、抗体として実施例３（Ａ）で調製した抗HY
P−KK抗体を含む緩衝液Ａを、また酵素標識抗原として
実施例４で調製したHYP−KK−Cys−β−Ga1を含む緩衝
液Ａを用いるほかは、実施例５と同様にしてHYP−KKのE
IAを実施した。
緩衝液Ａを、抗体として実施例３（Ａ）で調製した抗HY
P−KK抗体を含む緩衝液Ａを、また酵素標識抗原として
実施例４で調製したHYP−KK−Cys−β−Ga1を含む緩衝
液Ａを用いるほかは、実施例５と同様にしてHYP−KKのE
IAを実施した。
第１図はHYP−BK類の検量線である。なお、第１図にお
いてBx/Boは標準抗原濃度が０の場合の吸光度（Bo）と
標準抗原濃度がｘの場合の吸光度（Bx）の比（％）を示
す。
いてBx/Boは標準抗原濃度が０の場合の吸光度（Bo）と
標準抗原濃度がｘの場合の吸光度（Bx）の比（％）を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, 150（１），511−516，（1988年１月15 日)
Claims (2)
- 【請求項１】一般式（Ｉ） Ｘ−Arg−Pro−Hyp−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Arg
（Ｉ） （式中、Ｘは水素原子またはLysを意味する。） で表されるペプチドのＣ末端と免疫原性タンパクとの結
合物を抗原として脊椎動物を免疫することにより作製さ
れた抗体であって、次の（ａ）及び（ｂ）に記載する交
差特性を有する抗体。 （ａ）ＸがLysであるペプチド（Ｉ）に対する抗体は、
Ｘが水素原子であるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。 （ｂ）Ｘが水素原子であるペプチド（Ｉ）に対する抗体
は、ＸがLysであるペプチド（Ｉ）、ブラジキニン及び
カリジンと実質的に交差しない。 - 【請求項２】少なくとも下記の試薬から構成されてなる
ペプチド（Ｉ）の免疫学的定量用キット： （ａ）Ｃ末端側が標識物で標識されたペプチド（Ｉ）、 （ｂ）請求項１に記載の抗体そのものまたはその不溶化
物、 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
するための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63084486A JP2628336B2 (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | ブラジキニン誘導体およびその定量 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63084486A JP2628336B2 (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | ブラジキニン誘導体およびその定量 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01258699A JPH01258699A (ja) | 1989-10-16 |
| JP2628336B2 true JP2628336B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
ID=13831980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63084486A Expired - Lifetime JP2628336B2 (ja) | 1988-04-05 | 1988-04-05 | ブラジキニン誘導体およびその定量 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2628336B2 (ja) |
-
1988
- 1988-04-05 JP JP63084486A patent/JP2628336B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５０（１），５１１−５１６，（１９８８年１月１５日） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01258699A (ja) | 1989-10-16 |
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