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JP2617712B2 - Assay method for human prostate specific antigen - Google Patents

Assay method for human prostate specific antigen

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Publication number
JP2617712B2
JP2617712B2 JP62050566A JP5056687A JP2617712B2 JP 2617712 B2 JP2617712 B2 JP 2617712B2 JP 62050566 A JP62050566 A JP 62050566A JP 5056687 A JP5056687 A JP 5056687A JP 2617712 B2 JP2617712 B2 JP 2617712B2
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JP
Japan
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antibody
labeled
mca
solution
present
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JP62050566A
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脩治 松浦
則文 小林
伸三 小畠
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和光純薬工業 株式会社
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  • Peptides Or Proteins (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サンドイッチ型免疫学的測定法によるヒト
前立腺特異抗原の新規な定量法に関する。
Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel method for quantifying human prostate-specific antigen by a sandwich immunoassay.

〔発明の背景〕[Background of the Invention]

ヒト前立腺特異抗原(以下、PAと略称する。)は、T.
M.Cheuらによりヒト前立腺組織或は精漿中から発見され
た蛋白質で(M.C.Wang et al;Invest Urology,17,159,1
980;Oncology,39,1,1982)、同じCheuらが報告している
前立腺性酸性ホスファターゼ(T.M.Cheu et al;Invest
Urology,15,319,1978)とは異なる前立腺性抗原蛋白で
ある。PAは他の臓器及び組織には含まれず、ヒト前立腺
にのみ存在するといわれている。従って、前立腺疾患、
特に前立腺癌のマーカーとして利用できる可能性が高い
ことから近年特に注目されてきている。
Human prostate-specific antigen (hereinafter abbreviated as PA) is T.
A protein found in human prostate tissue or seminal plasma by M. Cheu et al. (MCWang et al; Invest Urology, 17 , 159, 1).
980; Oncology, 39 , 1, 1982), a prostate acid phosphatase reported by Cheu et al. (TMCheu et al; Invest
Urology, 15 , 319, 1978). PA is not found in other organs and tissues, and is said to be present only in the human prostate. Therefore, prostate disease,
In particular, it has been particularly noted in recent years because it has a high possibility of being used as a marker for prostate cancer.

現在のところ前立腺癌の診断や治療経過の観察には前
立腺性酸性ホスファターゼを測定する方法が主に行われ
ているが、臨床学的には病状を十分に反映しているとは
言い難く、更に確実な診断指標の確立とその測定方法の
確立が望まれている。
At present, the method of measuring prostatic acid phosphatase is mainly used for diagnosis of prostate cancer and observation of the course of treatment, but it cannot be said that the clinical condition sufficiently reflects the disease state. It is desired to establish a reliable diagnostic index and a measurement method thereof.

PAを診断指標として診断や治療経過の観察を行った報
告としては、例えばKuriyama et al;Cancer Research,4
0,4658,1980、特表昭57−500169号公報、Pontes et al;
J.Urology,128,1216,1982、小川ら;Radioisotopes,33,2
73,1984等があり、血中PAの変動を測定することは、前
立腺癌の診断や治療経過の観察に有効であると報告され
ている。しかしながら、これらの報告に於て用いられて
いる測定方法は感度的にも特異性の面でも今一息であ
り、且つ再現性にも問題があり、しかも非常に時間のか
かる(通常24時間以上を要す。)ものであって且つその
操作も非常に繁雑であるところからその有効性は理解で
きてもそれを実際に応用するのには種々の問題が残され
ていた。
Reports of diagnosis and observation of the course of treatment using PA as a diagnostic index include, for example, Kuriyama et al; Cancer Research, 4
0, 4658,1980, Kohyo Sho 57-500169 JP, Pontes et al;
J. Urology, 128 , 1216, 1982; Ogawa et al .; Radioisotopes, 33 , 2
73, 1984, etc., and it has been reported that measuring the fluctuation of blood PA is effective for diagnosing prostate cancer and observing the course of treatment. However, the measurement methods used in these reports are at once short in terms of both sensitivity and specificity, and have problems in reproducibility, and are very time-consuming (usually more than 24 hours). ) And its operation is very complicated, but various problems remain in its practical application even though its effectiveness can be understood.

〔発明の目的〕[Object of the invention]

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、高
感度で、且つ特異性、再現性に優れ、しかも操作が簡便
で測定時間も極めて短い、サンドイッチ型免疫学的測定
法によるPAの新規定量法を提供することにある。
The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and has a high sensitivity, excellent specificity, excellent reproducibility, simple operation and extremely short measurement time, novel quantification of PA by a sandwich-type immunological assay. Is to provide a law.

〔発明の構成〕[Configuration of the invention]

本発明の目的を達成する為に、本発明は次の構成より
なる。
In order to achieve the object of the present invention, the present invention has the following configuration.

「サンドイッチ型免疫学的測定法によるPAの定量法に
於いて、マウスの腫瘍ラインからの細胞及びPAで予め免
疫されたマウスからの脾細胞との融合により形成された
ハイブリドーマにより産生される、PAに特異性を有し且
つ免疫グロブリンクラスがIgAである単クローン性抗PA
抗体と、PAで免疫された動物から得られるポリクローナ
ル抗PA抗体とを組み合わせて用いることを特徴とするPA
の定量法。」 即ち、本発明者らは、Cheuらの方法(Oncology,39,1,
1982)に従ってヒト精漿より精製したPAで予め免疫され
たマウスからの脾細胞とマウスの腫瘍ラインからの細胞
との融合により形成されたハイブリドーマにより産生さ
れる、PAに高い特異性を有する単クローン性抗PA抗体を
用いて、高感度で且つ特異性、再現性に優れ、しかも極
めて実用的で操作が簡便なサンドイッチ型免疫学的測定
法によるPAの測定法を組み立てるべく、鋭意研究の結
果、PAに特異性を有し且つ免疫グロブリンクラスがIgA
である単クローン性抗PA抗体と、PAで免疫された動物か
ら得られるポリクローナル抗PA抗体とを組み合わせて用
いることにより本発明の目的を達成し得ることを見出し
本発明を完成するに到った。
"In the quantification of PA by sandwich immunoassay, PA produced by hybridomas formed by fusion with cells from the tumor line of mice and splenocytes from mice previously immunized with PA, Monoclonal Anti-PA with Specificity for Antibodies and Immunoglobulin Class of IgA
A combination of an antibody and a polyclonal anti-PA antibody obtained from an animal immunized with PA.
Quantitation method. That is, the present inventors have proposed the method of Cheu et al. (Oncology, 39 , 1, 1).
1982) Monoclones with high specificity for PA produced by hybridomas formed by fusion of splenocytes from mice previously immunized with PA purified from human seminal plasma and cells from a mouse tumor line As a result of intensive research, to assemble a PA measurement method using a sandwich-type immunoassay method that is highly sensitive, specific, and reproducible, and that is extremely practical and easy to use, using an anti-PA antibody, PA specific and immunoglobulin class IgA
The present inventors have found that the object of the present invention can be achieved by using a monoclonal anti-PA antibody that is a polyclonal anti-PA antibody obtained from an animal immunized with PA in combination with the monoclonal antibody, and have completed the present invention. .

本発明で用いられる単クローン性抗PA抗体(以下、PA
−MCAと略称する。)としては、常法、即ちケラー、ミ
ルスタイン(G.Khler and C.Milstein;Nature,256,49
5,1975)により確立された細胞融合法に従い、マウスの
腫瘍ラインからの細胞と、PAで予め免疫されたマウスの
脾細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイ
ブリドーマから産生される単クローン性抗PA抗体を常法
により採取して得たものの中から特に本発明の目的に適
うものとして選択されたもの、即ち免疫グロブリンクラ
スがIgAである単クローン性抗PA抗体が用いられる。
The monoclonal anti-PA antibody used in the present invention (hereinafter referred to as PA
-Abbreviated as MCA. ) Is a conventional method, that is, G. Khler and C. Milstein; Nature, 256 , 49
According to the cell fusion method established according to US Pat. No. 5,1975), a hybridoma is produced by fusing cells from a tumor line of a mouse with splenocytes of a mouse previously immunized with PA, and a monoclonal clone produced from the hybridoma is produced. A monoclonal anti-PA antibody which is selected from those obtained by collecting an anti-PA antibody by a conventional method and which is particularly suitable for the purpose of the present invention, that is, a monoclonal anti-PA antibody whose immunoglobulin class is IgA is used.

また、本発明で用いられるポリクローナル抗PA抗体
(以下、PA−PCAと略称する。)としては常法、例えば
免疫実験学入門、第2刷、松橋直ら、(株)学会出版セ
ンター、1981等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、
兎、山羊、ラット、マウスなどの動物にPAで免疫して作
製したものがいずれも例外なく用いられる。
In addition, the polyclonal anti-PA antibody (hereinafter, abbreviated as PA-PCA) used in the present invention can be obtained by a conventional method, for example, “Introduction to Immune Experiments, 2nd Printing, Nao Matsuhashi, Gakkai Shuppan Center, 1981, etc. Horses, cows, sheep,
Any of animals prepared by immunizing animals such as rabbits, goats, rats and mice with PA can be used without exception.

本発明のPAの定量法は、抗体として本発明に係るPA−
MCAとPAで免疫された動物から得られるPA−PCAとを組み
合わせて用いる以外は例えば自体公知のサンドイッチ型
酵素免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、螢
光免疫測定法(FIA)等の方法に準じてこれを行えば良
く、用いる試薬もこれらの方法に於て用いられる試薬に
準じて、適宜選択して用いれば良い。
The method for quantifying PA of the present invention uses the PA-
Except for using a combination of MCA and PA-PCA obtained from an animal immunized with PA, for example, sandwich-type enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence immunoassay (FIA) known per se. This may be performed according to the method described in (1) and the like, and the reagent to be used may be appropriately selected and used according to the reagent used in these methods.

また、本発明のサンドイッチ型免疫学的測定法は、例
えば、先ず固定化抗体とPAを含む試料とを反応させ、然
る後これに標識抗体を反応させる方法でも、或は、先ず
PAを含む試料と標識抗体とを反応させ、次いでこれに固
定化抗体を反応させる方法でも、更にはPAを含む試料、
固定化抗体、標識抗体の三者を同時に反応させる方法で
も、いずれの方法によっても実用的な方法を組み立てる
ことが可能である。しかしながら、本発明のより好まし
い実施態様としては、PAを含む試料、固定化抗体、標識
抗体の三者を同時に反応させる、所謂1ステップ法が挙
げられる。即ち、反応を1ステップで行うことにより、
作業性が向上し、且つ測定時間の短縮が企れる。本発明
の方法はこのような1ステップ法による測定法の組み立
てを可能としたものである。
Further, the sandwich immunoassay of the present invention may be, for example, a method in which an immobilized antibody is first reacted with a sample containing PA and then a labeled antibody is reacted therewith, or
In a method in which a sample containing PA is reacted with a labeled antibody and then reacted with an immobilized antibody, a sample further containing PA,
A practical method can be assembled by any of the methods of simultaneously reacting an immobilized antibody and a labeled antibody. However, a more preferred embodiment of the present invention includes a so-called one-step method in which a sample containing PA, an immobilized antibody, and a labeled antibody are simultaneously reacted. That is, by performing the reaction in one step,
Workability is improved, and measurement time can be shortened. The method of the present invention makes it possible to assemble such a one-step measuring method.

本発明に於て、PA−MCA又はPA−PCAを水不溶性担体表
面に固定化する固定化の方法としては自体公知のEIA、R
IA又はFIAに於て一般に行われている自体公知の固定化
方法が何れも例外なく挙げられる。即ち、固体表面に物
理的吸着によりこれを行ってもよいし、化学的にアミノ
基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、
アミド基等の官能基を利用し架橋剤を用いてカップリン
グさせることによりこれを行うこともできる。
In the present invention, as a method for immobilizing PA-MCA or PA-PCA on the surface of a water-insoluble carrier, EIA, R
All immobilization methods known per se generally used in IA or FIA can be mentioned without exception. That is, this may be done by physical adsorption on the solid surface, or chemically, amino, carboxyl, hydroxyl, mercapto,
This can also be performed by utilizing a functional group such as an amide group and coupling with a crosslinking agent.

本発明で用いられる水不溶性担体としては例えば、ポ
リスチレン,ポリ塩化ビニル,ポリエチレン,ポリプロ
ピレン,変性セルロース,ポリアクリルアミド等の高分
子化合物やガラス,シリカゲル,金属酸化物等の無機物
質等、EIA、RIA又はFIAに於て通常用いられる自体公知
の担体が何れも使用可能である。また、これらは通常ビ
ーズ,チューブ,ディスク片,微粒子(ラテックス粒
子),マイクロプレート等の形態にして用いられること
も周知の如くである。
Examples of the water-insoluble carrier used in the present invention include polymer compounds such as polystyrene, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, modified cellulose, and polyacrylamide; and inorganic substances such as glass, silica gel, and metal oxides; Any known carrier usually used in FIA can be used. It is also well known that these are usually used in the form of beads, tubes, disk pieces, fine particles (latex particles), microplates and the like.

しかしながら、本発明の最も好ましい実施態様は、水
不溶性担体としてガラスビーズを用いる方法である。即
ち、水不溶性担体としてガラスビーズを用いることによ
り、相分離や洗浄等の操作が極めて簡便になり且つ測定
時間の短縮が企れる。
However, the most preferred embodiment of the present invention is a method using glass beads as a water-insoluble carrier. That is, by using glass beads as the water-insoluble carrier, operations such as phase separation and washing are extremely simplified and the measurement time can be shortened.

また、本発明に於てPA−MCA或はPA−PCAを標識物質に
より標識する方法としては、自体公知のEIA、RIA或いは
FIAに於て一般に行われている自体公知の標識方法(例
えば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1
版、中山書店、1971;図説 螢光抗体、川生明著、第1
版、(株)ソフトサイエンス社、1983;酵素免疫測定
法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第2版、医学書院、
1982等)がいずれも例外なく挙げられる。
Further, in the present invention, as a method of labeling PA-MCA or PA-PCA with a labeling substance, EIA, RIA or
Labeling methods known per se generally used in FIA (eg, Medical Chemistry Laboratory Course, Vol. 8, supervised by Yuichi Yamamura,
Edition, Nakayama Shoten, 1971; Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawao, First
Edition, Soft Science Co., Ltd., 1983; Enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 2nd edition, Medical Shoin,
1982 etc.) without exception.

本発明で用いられる標識物質としてはEIAでは酵素で
あり、RIAでは放射性同位元素であり、FIAでは螢光性物
質であることは云うを俟たない。
The labeling substance used in the present invention is an enzyme in EIA, a radioisotope in RIA, and a fluorescent substance in FIA.

本発明に係るEIAに於て、標識物質として用いられる
酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられるが、
これらに限定されるものではない。
In the EIA according to the present invention, examples of the enzyme used as the labeling substance include β-galactosidase, alkaline phosphatase, and peroxidase.
It is not limited to these.

本発明に於て、単クローン性抗体、ポリクローナル抗
体のいずれを固定化抗体とし、いずれを標識抗体とする
かは任意であるが、特異性、再現性により優れた測定を
行うことができるという点で単クローン性抗体を固定化
抗体とし、ポリクローナル抗体を標識抗体とする方法が
より好ましい。
In the present invention, any one of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody is used as an immobilized antibody, and which is used as a labeled antibody is optional. However, it is possible to perform a measurement excellent in specificity and reproducibility. It is more preferable to use a monoclonal antibody as an immobilized antibody and a polyclonal antibody as a labeled antibody.

本発明で用いられる標識抗体の最も好ましい実施態様
としては、家兎抗PA抗体(クラス;IgG)をFab′にした
後マレイミドでこれに酵素を標識した抗体が挙げられ
る。即ち、該標識抗体を用いることにより、より高感度
で、且つより特異性、再現性に優れた測定を行うことが
可能となる。
The most preferred embodiment of the labeled antibody used in the present invention is an antibody in which a rabbit anti-PA antibody (class; IgG) is converted to Fab 'and then an enzyme is labeled with maleimide. That is, by using the labeled antibody, it is possible to perform a measurement with higher sensitivity and more excellent specificity and reproducibility.

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例により何ら限定されるもので
はない。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

〔実施例〕〔Example〕

参考例1.単クローン性抗ヒト前立腺特異抗原抗体(PA
−MCA)及びこれを産生するハイブリドーマの作製 (1)免 疫 ヒト前立腺特異抗原(PA)50μgを溶解した10mMトリ
ス緩衝液(pH7.2)0.1mlとフロイントコンプリートアジ
ュバント0.1mlのエマルジョンをBalb/cマウス(雄、4
週齢)の腹腔内に投与した。その4週後、10mMトリス緩
衝液(pH7.2)0.1mlに溶解したヒトPA50μgを腹腔内に
投与した。
Reference Example 1. Monoclonal anti-human prostate specific antigen antibody (PA
-MCA) and preparation of hybridoma producing the same (1) Immunization An emulsion of 0.1 ml of 10 mM Tris buffer (pH 7.2) in which 50 μg of human prostate specific antigen (PA) was dissolved and 0.1 ml of Freund's complete adjuvant were prepared by Balb / c Mouse (male, 4
Weekly). Four weeks later, 50 μg of human PA dissolved in 0.1 ml of 10 mM Tris buffer (pH 7.2) was administered intraperitoneally.

(2)細胞融合 最終免疫より3日後、マウスの脾臓を摘出した。脾細
胞108個とNS−1細胞107個をポリエチレングリコール0.
5g、MEM培地0.5ml、DMSO 0.15mlの溶液中で室温1分間
インキュベートして融合させた。細胞を15%FCS添加RPM
I−1640培地に懸濁させた後、96穴プレート5枚に分注
し、CO2インキュベーターで培養を開始した。翌日1穴
当り2滴のHAT培地を加えた。それから3日毎に半量の
培地をHAT培地と交換した。融合後2週間目の培養上清
を抗体産生の検出の為に供した。
(2) Cell fusion Three days after the final immunization, the spleen of the mouse was removed. Splenocytes 8 and NS-1 10 7 cells polyethylene glycol 0.
5 g, 0.5 ml of MEM medium, and 0.15 ml of DMSO were incubated at room temperature for 1 minute for fusion. Cells were RPMIed with 15% FCS
After suspending in I-1640 medium, the suspension was dispensed into five 96-well plates, and culture was started in a CO 2 incubator. The next day, 2 drops of HAT medium per well were added. Then, every three days, half of the medium was replaced with HAT medium. The culture supernatant two weeks after the fusion was used for detection of antibody production.

(3)ハイブリドーマの選択 抗ヒトPA抗体産生ハイブリドーマの選択の為に、上記
の96穴の各細胞培養上清をELISA法にて分析した。
(3) Selection of hybridoma In order to select an anti-human PA antibody-producing hybridoma, each of the above 96-well cell culture supernatants was analyzed by ELISA.

先ず96穴プレートに、精製されたヒトPAを10μg/mlの
濃度で0.05mlずつ分注し、37℃で2時間静置して抗原を
プレートに固定化した。Tween20(ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート、花王石鹸(株)商品名)を
0.05%含む10mMリン酸緩衝液pH7.4(以下、洗浄液と略
す。)で3回洗浄した後、培養上清中の蛋白質の非特異
的吸着を避ける為、1%BSA(牛血清アルブミン)溶液
を0.2mlずつ分注し37℃で2時間静置した。洗浄液で3
回洗浄した後、上記の細胞培養上清を0.05ml分注し37℃
で2時間静置した。陰性対照としてはHAT培地を用い
た。次に洗浄液で3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗
マウス免疫グロブリン溶液(DAKO社製)0.05mlを分注し
37℃で2時間静置した。洗浄液で3回洗浄後、過酸化水
素0.02%を含む0.4%オルトフェニレンジアミン溶液0.0
5mlを分注し室温で30分反応後、6N硫酸0.05mlを加えて
反応を停止し、O.D.490nmを測定した。陰性対照の2倍
以上のO.D.を示す培養上清で増殖しているハイブリドー
マを抗ヒトPA抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
First, 0.05 ml of the purified human PA was dispensed at a concentration of 10 μg / ml into a 96-well plate, and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours to immobilize the antigen on the plate. Tween20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate, trade name of Kao Soap Co., Ltd.)
After washing three times with 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.05% (hereinafter abbreviated as washing solution), a 1% BSA (bovine serum albumin) solution to avoid non-specific adsorption of proteins in the culture supernatant Was dispensed in 0.2 ml portions and left at 37 ° C. for 2 hours. 3 with cleaning solution
After washing twice, 0.05 ml of the above cell culture supernatant was dispensed at 37 ° C.
For 2 hours. HAT medium was used as a negative control. Next, after washing three times with a washing solution, 0.05 ml of a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin solution (manufactured by DAKO) was dispensed.
It was left at 37 ° C. for 2 hours. After washing three times with a washing solution, a 0.4% orthophenylenediamine solution containing 0.02% of hydrogen peroxide 0.0
After dispensing 5 ml and reacting at room temperature for 30 minutes, 0.05 ml of 6N sulfuric acid was added to stop the reaction, and OD 490 nm was measured. Hybridomas proliferating in the culture supernatant showing OD more than twice that of the negative control were selected as hybridomas producing anti-human PA antibody.

(4)単クローン化 クローニングは限界希釈法で行った。96穴プレートの
1穴当りハイブリドーマが0.5個入るように分注した。
この操作を2回繰返し単クローン化を完全なものとし
た。ELISA法で検討し10種のクローンを選択して、次の
抗体作製に使用した。
(4) Monocloning Cloning was performed by the limiting dilution method. A 96-well plate was dispensed so that 0.5 hybridomas were contained in each well.
This operation was repeated twice to complete the monocloning. After examining by ELISA, 10 clones were selected and used for the next antibody production.

(5)単クローン性抗体の作製 上記10種のハイブリドーマの5×106個を夫々10日前
にプリスタン処理したBalb/cマウス(雄、8週齢)の腹
腔内に投与し、約2週間後に腹水を回収した。
(5) Preparation of monoclonal antibody 5 × 10 6 of the above 10 hybridomas were administered intraperitoneally to Balb / c mice (male, 8 weeks old) which had been treated with pristane 10 days before, and about 2 weeks later Ascites was collected.

腹水を40%飽和の硫安分画を行い、更にDEAEセルロー
スを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、PA−MCA
No.106、120、201−1、202−2、204−1、207−2、2
09−2、213−1、214−2、及び303−1の10種類を得
た。
The ascites was subjected to a 40% saturated ammonium sulfate fractionation, and further column chromatography using DEAE cellulose was performed to obtain PA-MCA.
No.106,120,201-1,202-2,204-1,207-2,2
09-2, 213-1, 214-2, and 303-1 were obtained.

参考例2. PA−MCAの免疫グロブリンクラス又はサブク
ラスの同定 参考例1で得られた10種の単クローン性抗体について
免疫グロブリンクラス又はサブクラスの同定をELISA法
により次の様に行った。
Reference Example 2. Identification of immunoglobulin class or subclass of PA-MCA The immunoglobulin class or subclass of the 10 monoclonal antibodies obtained in Reference Example 1 was identified by ELISA as follows.

(操作法) 参考例1−(3)と同様の操作により、96穴プレート
に、精製されたPAを固定化してBSAによるブロッキング
を行い、次に、参考例1で得られたPA−MCAの2μg/ml
溶液0.05mlを分注して反応させ、更にマウスの免疫グロ
ブリンクラス又はサブクラスに対する抗体溶液(MILES
社製)0.05mlを分注して反応させ、次いでペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン溶液(DAKO社製)0.05
mlを分注して反応させた。洗浄液で3回洗浄後過酸化水
素0.02%を含む0.4%オルトフェニレンジアミン溶液0.0
5mlを分注し室温で30分反応後、6N硫酸0.05mlを加えて
反応を停止し、O.D.490nmを測定した。陰性対照として
洗浄液を用いて同様の操作を行った。
(Operation method) Purified PA was immobilized on a 96-well plate by the same operation as in Reference Example 1- (3), blocking was performed with BSA, and then the PA-MCA obtained in Reference Example 1 was purified. 2μg / ml
A 0.05 ml solution was dispensed and allowed to react, and an antibody solution (MILES) for the mouse immunoglobulin class or subclass was further added.
The reaction was carried out by dispensing 0.05 ml of a peroxidase-labeled anti-rabbit immunoglobulin solution (manufactured by DAKO).
ml was dispensed and reacted. After washing three times with a washing solution, a 0.4% orthophenylenediamine solution containing 0.02% of hydrogen peroxide 0.0
After dispensing 5 ml and reacting at room temperature for 30 minutes, 0.05 ml of 6N sulfuric acid was added to stop the reaction, and OD 490 nm was measured. The same operation was performed using a washing solution as a negative control.

(結果) 得られた結果を表1に示す。(Results) The obtained results are shown in Table 1.

参考例3. PA−MCAの特異性の検討 参考例1で得られたPA−MCAの特異性を検討する為、
腫瘍マーカーとして比較的良く測定されるα−フェトプ
ロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)及びヒト絨毛性
ゴナドトロピン(hCG)との交差性の検討を行った。
Reference Example 3. Examination of specificity of PA-MCA To examine the specificity of PA-MCA obtained in Reference Example 1,
Cross-reactivity with α-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA) and human chorionic gonadotropin (hCG), which are relatively well measured as tumor markers, was examined.

(操作法) 参考例1−(3)と同様の操作により、96穴プレート
に、精製されたPA,AFP,CEA又はhCGの2μg/ml溶液を用
いてこれらを固定化しBSAによるブロッキングを行い、
次に参考例1で得られたPA−MCAの2μg/ml溶液0.05ml
を分注して反応させ、更に、ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス免疫グロブリン溶液(DAKO社製)0.05mlを分注して
反応させた。洗浄液で3回洗浄後過酸化水素0.02%を含
む0.4%オルトフェニレンジアミン溶液0.05mlを分注し
室温で30分反応後、6N硫酸0.05mlを加えて反応を停止
し、O.D.490nmを測定した。陰性対照として洗浄液を用
いて同様の操作を行った。
(Operation method) In the same manner as in Reference Example 1- (3), these were immobilized on a 96-well plate using a 2 μg / ml solution of purified PA, AFP, CEA or hCG, and blocking with BSA was performed.
Next, 0.05 ml of a 2 μg / ml solution of PA-MCA obtained in Reference Example 1
Was dispensed, and 0.05 ml of a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin solution (manufactured by DAKO) was dispensed and reacted. After washing three times with a washing solution, 0.05 ml of a 0.4% orthophenylenediamine solution containing 0.02% of hydrogen peroxide was dispensed and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 0.05 ml of 6N sulfuric acid, and OD 490 nm was measured. The same operation was performed using a washing solution as a negative control.

(結果) 上記操作に従って測定を行ったところ参考例1で得ら
れたPA−MCAはAFP,CEA又はhCGとは反応しないことが判
った。
(Results) The measurement was performed according to the above operation, and it was found that PA-MCA obtained in Reference Example 1 did not react with AFP, CEA or hCG.

参考例4. Western Blottingによる特異性の検討 参考例1で得られたPA−MCAの特異性を検討する為
に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とWester
n Blottingを用いる酵素免疫染色法とを組み合わせて、
検体中のPAの検出を行った。
Reference Example 4. Examination of specificity by Western Blotting In order to examine the specificity of PA-MCA obtained in Reference Example 1, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Wester
In combination with the enzyme immunostaining method using n Blotting,
PA in the specimen was detected.

(操作法) PAを含む試料を公知の方法(Nature,227,680,1970)
に従って、5%〜10%のゲル濃度のスラブゲルを用いて
PAGEを行った。泳動の終わったゲルはTowbinらの方法
(Proc.Natl.Acad.Sci.,76,4350,1979)に準じてニトロ
セルロースメンブランに転写を行った。ニトロセルロー
ス上に転写された蛋白バンドは、PA−MCAと反応させた
後、更に2次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウス
免疫グロブリン溶液(DAKO社製)を反応させ洗浄した
後、ジアミノベンチジン反応を行ってPA−MCAの結合部
位を検出した。
(Operation method) A sample containing PA is prepared by a known method (Nature, 227 , 680, 1970)
Using a slab gel with a gel concentration of 5% to 10% according to
PAGE was performed. The gel after electrophoresis was transferred to a nitrocellulose membrane according to the method of Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 76 , 4350, 1979). The protein band transferred onto the nitrocellulose was reacted with PA-MCA, further reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin solution (manufactured by DAKO) as a secondary antibody, washed, and then subjected to a diaminobenzidine reaction. Thus, the binding site of PA-MCA was detected.

(結果) 上記操作の結果、参考例1で得られたPA−MCAはいず
れも分子量33000のCheuらのバンドと反応した。
(Results) As a result of the above operation, each of the PA-MCAs obtained in Reference Example 1 reacted with the band of Cheu et al. Having a molecular weight of 33,000.

実験例1 EIAに適用可能な抗PA抗体の組み合わせの選
択 ELISA法によりEIAに適用可能な抗PA抗体の組み合わせ
の選択を行った。
Experimental Example 1 Selection of Combination of Anti-PA Antibodies Applicable to EIA A combination of anti-PA antibodies applicable to EIA was selected by ELISA.

(試薬) ・ペルオキシダーゼ標識PA−PCA 公知の方法(酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮
井潔編、第2版、医学書院、1982)に従って、Fab′と
した家兎抗PA抗体をマレイミド法によりペルオキシダー
ゼと結合させてペルオキシダーゼ標識PA−PCA(以下、P
OD標識PA−PCAと略称する。)を調製した。
(Reagent)-Peroxidase-labeled PA-PCA According to a well-known method (enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, second edition, Kikakushoin, 1982), rabbit anti-PA antibody as Fab 'was maleimide. Peroxidase-labeled PA-PCA (hereinafter referred to as P
Abbreviated as OD-labeled PA-PCA. ) Was prepared.

(操作法) 96穴マイクロプレートに、PA−MCAの10μg/ml溶液0.0
5mlを分注し、37℃、1時間静置して抗体をプレートに
固定化した。洗浄液で3回洗浄した後、非特異的吸着を
避ける為、1%BSA溶液を0.2mlずつ分注して、37℃、1
時間静置した。洗浄液で3回洗浄後、PA溶液(100ng/m
l)を0.05mlずつ分注して、37℃、1時間静置して免疫
反応を行った。洗浄液で3回洗浄後、POD標識PA−PCA溶
液を0.05mlずつ分注して、37℃、1時間静置して反応さ
せた。洗浄液で十分洗浄後、マイクロプレートに残存す
るペルオキシダーゼ活性の測定を以下の様に行った。即
ち、過酸化水素0.02%を含む0.4%オルトフェニレンジ
アミン溶液0.05mlを分注し室温で30分反応後、6N硫酸0.
05mlを加えて反応を停止し、O.D.490nmを測定した。(P
A;0ng/mlの溶液により得られた値をBlとし、PA;100ng/m
lの溶液によりえられた値をESとした。) (結果) 結果を表2に示す。但し、ここで×、△、○、◎は各
々以下の範囲を示す。
(Operation method) PA-MCA 10 μg / ml solution 0.0
5 ml was dispensed and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to immobilize the antibody on the plate. After washing three times with a washing solution, 0.2 ml of a 1% BSA solution is dispensed at 37 ° C. to avoid non-specific adsorption.
Let stand for hours. After washing three times with washing solution, PA solution (100ng / m
l) was dispensed in 0.05 ml portions and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour to carry out an immune reaction. After washing three times with the washing solution, 0.05 ml of the POD-labeled PA-PCA solution was dispensed, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to react. After sufficient washing with a washing solution, the peroxidase activity remaining on the microplate was measured as follows. That is, 0.05 ml of a 0.4% orthophenylenediamine solution containing 0.02% of hydrogen peroxide was dispensed and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
The reaction was stopped by adding 05 ml, and OD490nm was measured. (P
A; the value obtained from the solution of 0 ng / ml was Bl, PA; 100 ng / m
a value that has been example with a solution of l was E S. (Results) The results are shown in Table 2. Here, ×, Δ, 、, and ◎ indicate the following ranges, respectively.

×:1≦ES/Bl≦2 △:2<ES/Bl≦3 ○:3<ES/Bl≦5 ◎:5<ES/Bl この結果から明らかな如く、参考例1で得られた10種
のPA−MCAの内、POD標識PA−PCAと組み合わせた場合に
比較的反応性が良いのは、No.106、201−1、202−2、
207−2、209−2、213−1、303−1の7種であり、中
でも免疫グロブリンクラスがIgAであるNo.303−1が特
に良いことが判った。
×: 1 ≦ E S / Bl ≦ 2 △: 2 <E S / Bl ≦ 3 ○: 3 <E S / Bl ≦ 5 ◎: 5 <E S / Bl As is clear from these results, of the 10 types of PA-MCA obtained in Reference Example 1, the combination with POD-labeled PA-PCA has relatively good reactivity when No. 106, 201-1, 202-2,
207-2, 209-2, 213-1 and 303-1. Among them, No. 303-1 whose immunoglobulin class is IgA was found to be particularly good.

実験例2 EIAに適用可能なPA−MCAの組み合わせの選択 実験例1の結果から比較的反応性の良かったPA−MCA7
種(No.106、201−1、202−2、207−2、209−2、21
3−1、303−1)を用いて、EIAに適用可能なPA−MCAの
組み合わせの選択を行った。
Experimental Example 2 Selection of PA-MCA Combination Applicable to EIA From the results of Experimental Example 1, PA-MCA7 with relatively good reactivity
Species (Nos. 106, 201-1, 202-2, 207-2, 209-2, 21
Using 3-1 and 303-1), a combination of PA-MCA applicable to EIA was selected.

(試薬) ・ペルオキシダーゼ標識PA−MCA 公知の方法(酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮
井潔編、第2版、医学書院、1982)に従って、Fab′と
したPA−MCA(但し、No.303−1を除く。)をマレイミ
ド法によりペルオキシダーゼと結合させてペルオキシダ
ーゼ標識PA−MCA(以下、POD標識PA−MCAと略称す
る。)を調製した。
(Reagent)-Peroxidase-labeled PA-MCA According to a known method (enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 2nd edition, Medical Shoin, 1982), PA-MCA with Fab '(however, No. .303-1) was combined with peroxidase by the maleimide method to prepare peroxidase-labeled PA-MCA (hereinafter abbreviated as POD-labeled PA-MCA).

(操作法) POD標識PA−PCAをPOD標識PA−MCAに代えた以外は、実
験例1の操作法と同様の操作法により行った。
(Operation method) The same operation method as that of Experimental example 1 was used, except that POD-labeled PA-PCA was replaced with POD-labeled PA-MCA.

(結果) 結果を表3に示す。(ここで、×、△、○、◎は前記
と同じ。) この結果から、PA−MCA同士の組み合わせとしては、N
o.106と303−1及びNo.213−1と303−1の組み合わせ
がよく、特にNo.213−1と303−1の組み合わせがEIAに
適用可能と考えられた。
(Results) The results are shown in Table 3. (Here, ×, Δ, ○, ◎ are the same as above.) From this result, the combination of PA-MCAs is N
Combinations of Nos. 106 and 303-1 and Nos. 213-1 and 303-1 were good, and in particular, combinations of Nos. 213-1 and 303-1 were considered to be applicable to EIA.

実験例3 実験例1及び2の結果から得られたEIA適用可能な本
発明に係わる抗体の組み合わせと、従来から用いられて
いるPA−PCAとPOD標識PA−PCAとの組み合わせによるPA
測定法による検量線の作成を行い、その実用性の検討を
行った。
EXPERIMENTAL EXAMPLE 3 A combination of the antibody according to the present invention applicable to EIA obtained from the results of Experimental Examples 1 and 2, and PA using a combination of conventionally used PA-PCA and POD-labeled PA-PCA
A calibration curve was created by the measurement method, and its practicality was examined.

(試薬) ・抗PA抗体固定化ガラスビーズの調製 ガラスビーズを2%の3−アミノプロピルトリエトキ
シシラン−アセトン溶液に室温で24時間浸しアミノアル
キルシラン化した。次に、ビーズを25%グルタルアルデ
ヒド溶液に浸し、室温で4時間活性化した後、本発明に
係るPA−MCA No.303−1又は家兎より得られたPA−PCA
の100μg/ml溶液に4℃で一晩浸した。洗浄後、5%シ
ョ糖及び1%BSAを含む20mMリン酸緩衝液に4℃で一晩
浸した後、乾燥し抗PA抗体固定化ガラスビーズ(以下、
A−PA−Gと略称する。)とした。
(Reagent)-Preparation of anti-PA antibody-immobilized glass beads Glass beads were immersed in a 2% 3-aminopropyltriethoxysilane-acetone solution at room temperature for 24 hours to carry out aminoalkylsilane conversion. Next, the beads were immersed in a 25% glutaraldehyde solution and activated at room temperature for 4 hours, and then PA-MCA No. 303-1 according to the present invention or PA-PCA obtained from a rabbit.
In a 100 μg / ml solution at 4 ° C. overnight. After washing, the plate was immersed in a 20 mM phosphate buffer containing 5% sucrose and 1% BSA at 4 ° C. overnight, dried, and dried with anti-PA antibody-immobilized glass beads (hereinafter, referred to as “beads”).
Abbreviated as A-PA-G. ).

・ペルオキシダーゼ標識抗PA抗体の調製 公知の方法(酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮
井潔編、第2版、医学書院、1982)に従って、Fab′と
したPA−MCA No.213−1又は家兎より得られたPA−PCA
をマレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させてペ
ルオキシダーゼ標識抗PA抗体Fab′(以下、POD−PA−Fa
b′と略称する。)を調製した。
Preparation of Peroxidase-Labeled Anti-PA Antibody PA-MCA No. 213-1 as Fab 'according to a known method (enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 2nd ed., Medical School, 1982). Or PA-PCA obtained from rabbits
Is bound to peroxidase by a maleimide method to give a peroxidase-labeled anti-PA antibody Fab '(hereinafter, POD-PA-Fa
Abbreviated as b '. ) Was prepared.

(操作法) 所定濃度のPA溶液100μl、POD−PA−Fab′400μl及
びA−PA−G 1個を試験管にとり37℃で2時間反応さ
せた。洗浄液で充分に洗浄した後、ビーズに結合したペ
ルオキシダーゼ活性を次のようにして測定した。即ち、
ビーズを新しい試験管にとり、過酸化水素0.02%を含む
0.4%オルトフェニレンジアミン溶液500μlを分注して
37℃で30分間反応させた後、15N硫酸2.5mlで反応を停止
させ、直ちに492nmの吸光度を測定した。
(Operation method) 100 μl of a PA solution having a predetermined concentration, 400 μl of POD-PA-Fab ′ and one A-PA-G were placed in a test tube and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After washing thoroughly with a washing solution, the activity of peroxidase bound to the beads was measured as follows. That is,
Transfer beads to new test tube and contain 0.02% hydrogen peroxide
Dispense 500 μl of 0.4% orthophenylenediamine solution
After reacting at 37 ° C. for 30 minutes, the reaction was stopped with 2.5 ml of 15N sulfuric acid, and the absorbance at 492 nm was measured immediately.

(結果) 得られた結果を第1図に示す。但し、ここで実線 はPA−MCA No.303−1固定化A−PA−Gと家兎PA−PCA
より調製したPOD−PA−Fab′とを組み合わせて用いた場
合を、点線 はPA−MCA No.303−1固定化A−PA−GとPA−MCA No.2
13−1より調製したPOD−PA−Fab′とを組み合わせて用
いた場合を、また、一点鎖線 は家兎PA−PCA固定化A−PA−Gと家兎PA−PCAより調製
したPOD−PA−Fab′とを組み合わせて用いた場合を夫々
示す。
(Results) The results obtained are shown in FIG. However, here is the solid line Is PA-MCA No.303-1 immobilized A-PA-G and rabbit PA-PCA
In the case of using POD-PA-Fab ′ prepared in combination, the dotted line Are PA-MCA No. 303-1 immobilized A-PA-G and PA-MCA No. 2
In the case where POD-PA-Fab ′ prepared from 13-1 was used in combination, Shows the case where rabbit PA-PCA-immobilized A-PA-G was used in combination with POD-PA-Fab 'prepared from rabbit PA-PCA.

この結果から明らかな如く、本発明に係わる特定のPA
−MCA No.303−1と家兎PA−PCAを組み合わせて用いた
測定法が最も高感度であることがわかった。
As is clear from this result, the specific PA according to the present invention
-The measurement method using the combination of MCA No. 303-1 and rabbit PA-PCA was found to have the highest sensitivity.

実施例1. 血中PAの定量 実験例3で得られた結果をもとに組み立てた本発明の
高感度PA定量法を用いて、血中PAの定量を行った。
Example 1. Quantification of PA in Blood Blood PA was quantified using the highly sensitive PA quantification method of the present invention assembled based on the results obtained in Experimental Example 3.

(試料) 前立腺疾患、尿路結石、膀胱腫瘍、尿道腫瘍、子宮癌
の各患者血清、正常血清及び所定濃度PA溶液を試料とし
た。
(Sample) Serum, normal serum, and a PA solution of a predetermined concentration of each patient of prostate disease, urolithiasis, bladder tumor, urethral tumor, and uterine cancer were used as samples.

(試薬) 実験例3で用いたPA−MCA No.303−1を固定化したA
−PA−Gと家兎PA−PCAから調製したPOD−PA−Fab′と
を用い、他の試薬は実験例3と同様の試薬を用いた。
(Reagent) PA-MCA No. 303-1 used in Experimental Example 3 was immobilized on A
-PA-G and POD-PA-Fab 'prepared from rabbit PA-PCA were used, and the other reagents were the same as in Experimental Example 3.

(操作法) 実験例3と同様に行い、血清中のPA濃度は所定濃度の
PA溶液から得られた検量線から求めた。
(Operation method) Performed in the same manner as in Experimental Example 3, and the serum PA concentration was
It was determined from a calibration curve obtained from the PA solution.

(結果) 得られた血清中PA濃度と疾患との関係を第2図に示
す。
(Results) FIG. 2 shows the relationship between the obtained serum PA concentration and the disease.

この結果から明らかな如く、本発明に係わるPA測定法
により測定された血清中のPA濃度は前立腺癌に於て特異
的に上昇し他の疾患とは明らかに区別できることが判っ
た。
As is clear from these results, it was found that the serum PA concentration measured by the PA measuring method according to the present invention was specifically increased in prostate cancer and could be clearly distinguished from other diseases.

尚、夫々の試料についての本実施例に於ける、反応か
ら測定終了までの総測定時間はいずれも3〜3.5時間で
あった。
In this example, the total measurement time from the reaction to the end of the measurement was 3 to 3.5 hours for each sample.

実施例2. 血清中PA濃度と前立腺癌の病勢との関連性 本発明に係わるPA測定法を用いて、血清中PA濃度と前
立腺癌の病勢との関連性を検討した。
Example 2. Relationship between serum PA concentration and disease state of prostate cancer Using the PA measurement method according to the present invention, the relationship between serum PA concentration and disease state of prostate cancer was examined.

(試料) 前立腺癌患者(再燃、ステージA及びステージD)血
清及び正常血清を試料とした。
(Sample) Serum of a prostate cancer patient (relapse, stage A and stage D) and normal serum were used as samples.

(試薬及び操作法) 実施例1と同様に行った。(Reagent and operation method) The same procedure as in Example 1 was performed.

(結果) 結果を第3図に示す。(Results) The results are shown in FIG.

この結果から明らかな如く、本発明に係わるPA測定法
により測定された血清中のPA濃度は前立腺癌の病勢をよ
く反映することが判った。
As is clear from these results, it was found that the serum PA concentration measured by the PA measurement method according to the present invention well reflects the pathology of prostate cancer.

尚、夫々の試料についての、本実施例に於ける総測定
時間も実施例1の場合と同様全て3〜3.5時間であっ
た。
Incidentally, the total measurement time in each of the samples in this example was 3 to 3.5 hours as in the case of Example 1.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

以上述べた如く、本発明は前立腺癌及びその病勢を極
めて良く反映する、実用的で且つ簡便な高感度PA測定法
を提供するものであり、特異性、再現性に優れ、しかも
その測定所要時間は4時間以内と従来のそれが24時間以
上であるのに比べて極めて短時間である点に顕著な効果
を奏する発明であり、前立腺癌の診断、治療効果の判定
等、臨床上甚だ大なる貢献が期待できる発明である。
As described above, the present invention provides a practical and simple high-sensitivity PA measurement method that reflects prostate cancer and its disease very well, and has high specificity, excellent reproducibility, and the time required for the measurement. Is an invention which has a remarkable effect in that it is within 4 hours, which is a very short time as compared with the conventional one which is 24 hours or more, and it is extremely large clinically for diagnosis of prostate cancer, judgment of therapeutic effect, etc. It is an invention that can be expected to contribute.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第1図は、実験例3で得られた検量線を示し、夫々横軸
の各PA濃度(ng/ml)について得られた492nmに於ける吸
光度の値(O.D.)を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。但し、実線 は単クローン性抗ヒト前立腺特異抗原抗体(以下、PA−
MCAと略称する。)No.303−1固定化ガラスビーズと家
兎ポリクローナル抗ヒト前立腺特異抗原抗体(以下、家
兎PA−PCAと略称する。)より調製したペルオキシダー
ゼ標識家兎PA−PCA−Fab′とを組み合わせて用いた場合
を、点線 はPA−MCA No.303−1固定化ガラスビーズとPA−MCA N
o.213−1より調製したペルオキシダーゼ標識PA−MCA−
Fab′とを組み合わせて用いた場合を、また、一点鎖線 は家兎PA−PCA固定化ガラスビーズと家兎PA−PCAより調
製したペルオキシダーゼ標識家兎PA−PCA−Fab′とを組
み合わせて用いた場合を夫々示す。 第2図は、実施例1で得られた血中の前立腺特異抗原
(以下、PAと略称する。)濃度と病態の関係を示し、横
軸の各病態に於ける血中PA濃度を縦軸に示したものであ
る。 第3図は、実施例2で得られた血中PA濃度と前立腺癌の
病勢の関係を示し、横軸の各前立腺癌の病勢に於ける血
中PA濃度を縦軸に示したものである。
FIG. 1 shows a calibration curve obtained in Experimental Example 3, in which the absorbance value (OD) at 492 nm obtained for each PA concentration (ng / ml) on the horizontal axis is plotted along the vertical axis. It is the connection between the points. However, solid line Is a monoclonal anti-human prostate specific antigen antibody (hereinafter, PA-
Abbreviated as MCA. ) No. 303-1 immobilized glass beads and peroxidase-labeled rabbit PA-PCA-Fab 'prepared from rabbit polyclonal anti-human prostate specific antigen antibody (hereinafter abbreviated as rabbit PA-PCA). If used, the dotted line Is PA-MCA No.303-1 immobilized glass beads and PA-MCA N
o. Peroxidase-labeled PA-MCA- prepared from 213-1
In the case where Fab ′ is used in combination, Indicates the case where rabbit PA-PCA-immobilized glass beads and a peroxidase-labeled rabbit PA-PCA-Fab ′ prepared from rabbit PA-PCA were used in combination. FIG. 2 shows the relationship between the blood prostate specific antigen (hereinafter abbreviated as PA) concentration obtained in Example 1 and the disease state. The horizontal axis represents the blood PA concentration in each disease state. This is shown in FIG. FIG. 3 shows the relationship between the blood PA concentration obtained in Example 2 and the disease state of prostate cancer, and the horizontal axis shows the blood PA concentration in each disease state of prostate cancer on the vertical axis. .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/08 9162−4B C12N 15/00 C (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 小畠 伸三 赤穂市折方丸ヶ端1589番地の19 和光純 薬工業株式会社赤穂農園内 (56)参考文献 特開 昭59−163565(JP,A) 特表 昭57−500169(JP,A)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Agency reference number FI Technical display location C12P 21/08 9162-4B C12N 15/00 C (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Shinzo Kobatake 1589 Orika Marugabata, Ako-shi 19 Wako Junyaku Kogyo Co., Ltd. Ako Farm (56) References JP-A-59-163565 (JP, A) JP-A-57-500169 (JP, A) )

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】サンドイッチ型免疫学的測定法によるヒト
前立腺特異抗原(以下、PAと略称する。)の定量法に於
いて、マウスの腫瘍ラインからの細胞及びPAで予め免疫
されたマウスからの脾細胞との融合により形成されたハ
イブリドーマにより産生される、PAに特異性を有し且つ
免疫グロブリンクラスがIgAである単クローン性抗PA抗
体と、PAで免疫された動物から得られるポリクローナル
抗PA抗体とを組み合わせて用いることを特徴とするPAの
定量法。
The present invention relates to a method for quantifying human prostate-specific antigen (hereinafter abbreviated as PA) by a sandwich-type immunoassay, wherein cells from a tumor line of a mouse and mice from a mouse previously immunized with PA are used. A monoclonal anti-PA antibody having specificity for PA and having an immunoglobulin class of IgA, produced by a hybridoma formed by fusion with splenocytes, and a polyclonal anti-PA obtained from an animal immunized with PA A method for quantifying PA, which comprises using an antibody in combination.
【請求項2】水不溶性担体に固定化された単クローン性
抗PA抗体と、酵素、放射性物質、蛍光性物質等の標識物
質で標識されたポリクローナル抗PA抗体とを組み合わせ
て用いる特許請求の範囲第1項に記載の定量法。
2. A combination of a monoclonal anti-PA antibody immobilized on a water-insoluble carrier and a polyclonal anti-PA antibody labeled with a labeling substance such as an enzyme, a radioactive substance, or a fluorescent substance. Item 2. The method according to item 1.
【請求項3】標識物質で標識されたポリクローナル抗PA
抗体が家兎抗PA抗体(クラス:IgG)をFab′にした後、
マレイミド法でこれに酵素を標識したポリクローナル抗
PA抗体である特許請求の範囲第2項に記載の定量法。
3. A polyclonal anti-PA labeled with a labeling substance.
After making the rabbit anti-PA antibody (class: IgG) Fab ',
Polyclonal antibody labeled with enzyme by maleimide method
3. The method according to claim 2, which is a PA antibody.
【請求項4】水不溶性担体がガラスビーズである特許請
求の範囲第2項又は第3項に記載の定量法。
4. The method according to claim 2, wherein the water-insoluble carrier is glass beads.
JP62050566A 1987-03-05 1987-03-05 Assay method for human prostate specific antigen Expired - Lifetime JP2617712B2 (en)

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JP62050566A JP2617712B2 (en) 1987-03-05 1987-03-05 Assay method for human prostate specific antigen

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JP62050566A JP2617712B2 (en) 1987-03-05 1987-03-05 Assay method for human prostate specific antigen

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JPS63215967A JPS63215967A (en) 1988-09-08
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