JP2641875B2 - ハイブリッドタンパク質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハイブリッドプラスミノーゲンアクチベー
タ、その様なハイブリッドプラスミノーゲンアクチベー
タをコードするDNA、その様なDNAを含有するハイブリッ
ドベクター、その様なハイブリッドベクターにより形質
転換された宿主、その様なハイブリッドプラスミノーゲ
ンアクチベータ、DNA、ハイブリッドベクター及び宿主
の製造方法、及びその様なハイブリッドプラスミノーゲ
ンアクチベータを含有する医薬組成物に関する。

〔従来の技術〕

血餅は発展した世界におけるヒトの罹病及び死亡の主
たる原因である。血餅は酵素トロンビンの作用によりそ
の可溶性前駆体フィブリノーゲンから形成されるフィブ
リンにより構成される。一連の酵素及びその他の物質は
血餅はそれらが血液の損失を防止する時に必要とされる
際及び場においてのみ正常に形成されることを確実にし
ている。

哺乳動物の血漿は血餅を溶解することのできる酵素系
フィブリン分解系を含んでいる。フィブリン分解系の一
成分はプラスミノーゲン（プラスミンの不活性プロ酵素
形態）をタンパク質分解酵素プラスミンに転換するプラ
スミノーゲンアクチベータと称される一群の酵素であ
る。プラスミンは次いで血餅のフィブリンネットワーク
を劣化させて可溶性生成物を形成する。体の血栓溶解能
力が血管内血栓を除去するのに不十分である場合、例え
ば血栓塞栓症或いは手術後合併症に悩む患者において外
因的に投与された血栓溶解剤を用いることが不可欠なこ
とがある。

二つのタイプのプラスミノーゲンアクチベータ（以下
“PA"と称する）をヒト体液或いは細胞から単離するこ
とができる。即ち、例えばヒトの尿及び腎臓細胞に存在
するセリンプロテアーゼであるウロキナーゼ或いはウロ
キナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ（以下
“ｕ−PA"と称する）及び内皮細胞により産生され数多
くの内分泌組織に見られる組織タイププラスミノーゲン
アクチベータ（以下“ｔ−PA"と称する）である。

ｔ−PA及びｕ−PAは共に二つの分子形態即ち一本鎖形
態（しばしばそれぞれ“sc−ｔ−PA"及び“sc−ｕ−PA"
と命令される）及び二本鎖（tc）形態で存在する。一本
鎖即ちプロ酵素形態はポリペプチド配列の良く規定され
た位置におけるタンパク質分解酵素の作用により二本鎖
形態に転換される。加工されたPAタンパク質の得られた
二本の鎖はイオウ−イオウ架橋により相互に結合して残
る。カルボキシ末端断片即ちＢ−鎖はPAの酵素活性を媒
介するのに対し、アミノ末端Ａ−鎖はフィブリン結合部
位などの制御単位を含有する。不活性sc−PAのフィブリ
ンなどの血餅の成分に対する特異的結合に引続きその部
位に存在する触媒量のタンパク質分解酵素による活性tc
−PAへの転換の結果有効な部位−特異的物質が得られ
る。

二つの異った遺伝子によりコード化されるｔ−PA及び
ｕ−PAは免疫学的及び酵素的に区別され、阻害剤、刺戟
剤及び賦活剤に対し異ったプロフィールの応答を有す
る。この様に、ｔ−PAのみがエリトリナ・ラチシマ（Er
ytrina latissima）（DE−３）からのプロテアーゼ阻害
剤により強く阻害される。ｔ−PA活性はフィブリン及び
フィブリン断片により大きく刺戟されるのちに対し、ｕ
−PA活性はフィブリン及びその断片による刺戟に対して
感応しない。これらの二つのPA酵素を区別するもう一つ
の性質はtc−ｔ−PAがフィブリン及びフィブリン断片に
対して高い親和性を有するのに対し、tc−ｕ−PAは余り
フィブリン親和性を有しないことである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

注射されたｔ−PAの不満足な血清安定性、tc−ｕ−PA
のフィブリンに対する低い親和性、及びsc−ｕ−PAのフ
ィブリン親和性が間接的であること、即ち、追加の血液
因子を必要とすると考えられている（D.J.Binnema et a
l.8th Int.Congress of Fibrinolysis,ウイーン,1986）
を考慮すると、フィブリンに対する高い親和性、刺戟剤
に対するより好ましい応答、阻害剤による減少された不
活性化、及び血液循環におけるより長い有効な半減期を
有する改良されたプラスミノーゲンアクチベータの必要
性が継続している。

従って、本発明の目的は親酵素の望ましくない特性を
欠きながらｔ−PA及びｕ−PAの好ましい性質を保持する
新規ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを提供
することである。

驚くべきことに、血栓症その他の状態の治療のため
に、プラスミノーゲン活性化を介してフィブリン分解を
もたらしたい場合には一本鎖ハイブリッドPAタンパク質
が一本鎖ｔ−PA及びｕ−PAと対比した場合により優れた
生物学的特性を示すことが発見された。具体的には、生
来のPA類に対比して本発明による新規PA分子の血餅をin
vivoで溶解するのに必要とされる量がより少ないこと
である。本発明による一本鎖バイブリッドPA分子は組換
えDNA技術により多量に製造することができ、患者に注
射時に溶解されるべき血餅の部位においてのみフィブリ
ンの影響の下にそれらの二本鎖形態に転換される。二本
鎖ハイブリッドPA分子は文献に記載されているが（ヨー
ロッパ特許出願155,387号明細書、K.C.Robbins,8th Int
ernational Congress of Fibrinolysis,ウイーン、198
6）、しかし、ハイブリッドPA分子のより好ましい一本
鎖形態は引用した文献に開示されるようにタンパク質レ
ベルでは製造されず、組換えDNA技術によってのみ多量
に且つ工業規模で製造することができる。

〔問題点を解決するための手段〕

従って、本発明の更なる目的は該一本鎖ｕ−PA/t−PA
ハイブリッドタンパク質の製造手段及び方法を提供する
ことである。その様な手段は該ｕ−PA/t−PAハイブリッ
ドタンパク質をコードするDNA、該DNAを含有するハイブ
リッドベクター及び該ハイブリッドベクターで形質転換
された宿主を包含する。又、一本鎖ｕ−PA/t−PAハイブ
リッドタンパク質、該DNA、該ハイブリッドベクター及
び該宿主を製造するための方法も提供される。本発明は
又、組換えDNAの一本鎖生成物がin vitroで適当なタン
パク質分解酵素例えばプラスミンにより切断することが
できるので二本鎖ハイブリッドPA分子のよりコスト有効
的製造方法も提供する。

〔発明の具体的説明〕

本発明は特にアミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ
−PA及びヒトｕ−PAの部分配列に対応する少なくと２個
の部分配列により構成されるアミノ酸配列を有する一本
鎖ハイブリッドPAに関する。

血液のフィブリン分解及び凝固系に含まれるその他の
セリンプロテアーゼ類と同様にｕ−PA及びｔ−PAは触媒
作用ドメイン（鎖Ｂ）に結合して鎖Ａ内に大きな非触媒
作用セグメントを有する。このｔ−PAの非−触媒作用Ａ
−鎖は個々のフィンガー即ち「フィンガー」ドメイン、
「成長因子」ドメイン及び二つの「クリングル」構造に
部分分割することができるのに対し、ｕ−PAのＡ−鎖は
「成長因子」ドメイン及び１個の「クリングル」構造に
より構成される。〔例えば、L.Patthy,Cell41,657−663
（1985）参照〕。Ｂ−鎖の触媒作用部位はそれぞれ32
2、371及び478（ｔ−PA）及び204、255及び356（ｕ−P
A）におけるHis、Asp、Ser残基により形成されており、
フィブリン分解活性に必須である。

タンパク質ドメインは全タンパク質の全体構造内にお
ける構造的及び／又は機能的存在である。例えばｔ−PA
のＡ−鎖では四つのドメイン（フィンガー、成長因子−
及び二つのクリングルドメイン）が一続きに配列されて
いる。これらのドメインの境界は対応するDNA配列にお
けるエキソン−イントロン結合の位置により最も良く規
定される（上記、L.Patthy）。しかしながら、実用的理
由のために各ドメインの最小の大きさはＳ−Ｓ架橋形成
に関与するものと思われる各ドメイン内の最初及び最後
のシステイン残基間のアミノ酸配列により定義されてき
た。隣接領域からのこれらのシステイン残基の前及び後
のアミノ酸は結合配列（Ｊ）と定義される。エキソン−
イントロン結合（上記参照）の位置はこれらのＪ領域内
にある。

即ち一本鎖ｔ−PAは次式により表わすことができる。

Ｔ−Ｆ−J₁−Ｇ−J₂−K₁−J₃−K₂−J₄−TPA^B 式中、Ｔはアミノ酸１〜５よりなるＮ−末端部分を表
わし、Ｆはアミノ酸６〜43よりなるフィンガードメイン
であり、Ｇはアミノ酸51〜84よりなる成長因子ドメイン
であり、K₁はアミノ酸92〜173よりなるクリングル１構
造であり、K₂はアミノ酸180〜261よりなるクリングル２
構造であり、TPA^Bはアミノ酸307〜527よりなる触媒作用
セリンプロテアーゼドメインであり、そしてJ₁（アミノ
酸44〜50）、J₂（アミノ酸85〜91）、J₃（アミノ酸174
〜179）及びJ₄（アミノ酸262〜306）はドメインセグメ
ントを結合する結合配列である。

一本鎖ｕ−PAは次式により表わすことができる。

Ｔ′−Ｕ−J₅−Ｋ−J₆−UPA^B 式中、Ｔ′はアミノ酸１〜12よりなるＮ−末端部分を
表わし、Ｕはアミノ酸13〜42よりなる成分因子ドメイン
であり、Ｋはアミノ酸50〜131よりなるクリングル構造
であり、UPA^Bはアミノ酸184〜411よりなる触媒作用セリ
ンプロテアーゼドメインであり、そしてJ₅（アミノ酸43
〜49）及びJ₆（アミノ酸132〜188）はドメインセグメン
トを結合する結合配列である。

結合配列J₄及びJ₆は各々活性化（プロセシング）部
位、及びそれへのＮ−末端に、触媒作用（Ｂ−鎖）領域
へのイオウ−イオウ架橋に関与するシステイン残基を包
含する。

驚くべきことに、一つのPA（TPA^B或いはUPA^B）の触媒
作用セリンプロテアーゼ領域を他のPAの全ての又は個別
のＡ−鎖ドメイン或いは両者のPAの個別のドメインを含
有するアミノ酸配列に結合してなる一本鎖ハイブリッド
PAが貴重な薬学的性質を示すことが発見された。

従って、本発明はヒトｕ−PAの全ての又は個別のＡ−
鎖ドメイン或いはヒトｕ−PA及びヒトｔ−PAの個別のＡ
−鎖ドメインを含有するアミノ酸配列をヒトｔ−PA（TP
A^B）の触媒作用領域に一続きに結合してなる一本鎖ハイ
ブリッドPA、及びヒトｔ−PAの全ての又は個別のＡ−鎖
ドメイン或いはヒトｔ−PA及びｕ−PAの個別のＡ−鎖ド
メインを含有するアミノ酸配列をヒトｕ−PA（UPA^B）の
触媒作用領域に一続きに結合してなる一本鎖ハイブリッ
ドPAに関する。

好ましい実施態様において、本発明のハイブリッドPA
はヒトｕ−PA（UPA^B）の触媒作用領域を含む。

特に、本発明はヒトｔ−PAの全てのＡ−鎖ドメインを
含有するアミノ酸配列、ヒトｔ−PAの個別のＡ−鎖ドメ
イン例えばヒトｔ−PAのフィンガードメイン或いはクリ
ングル特にグリングル２ドメインなどを含有するアミノ
酸配列、及びヒトｔ−PA及び／又はヒトｕ−PAの２個、
３個又は４個のＡ−鎖ドメイン特にヒトｔ−PAの２個又
は３個のドメイン或いはヒトｕ−PA及びヒトｔ−PAの２
個又は３個のドメイン例えばヒトｔ−PAのフィンガー、
成長因子、クリングル２ドメイン、ヒトｔ−PAのフィン
ガー及びクリングル２ドメイン或いはｕ−PA成長因子及
びｔ−PAクリングル２ドメインなどを含有するアミノ酸
配列から選ばれるアミノ酸配列よりなり、そのアミノ酸
配列が一続きにヒトｕ−PAの触媒作用領域に結合してい
る一本鎖PA、及びｕ−PA成長因子及びｔ−PAクリングル
２ドメインを含有するアミノ酸配列を含有し、そのアミ
ノ酸配列が一続き的にヒトｔ−PAの触媒作用触媒に結合
している一本鎖PAに関する。

好ましくは、このハイブリッドPAアミノ酸配列はｔ−
PA（Ｔ、アミノ酸１〜５）或いはｕ−PA（Ｔ′、アミノ
酸１〜12）のＮ−末端配列よりスタートし、或いはハイ
ブリッドPAの第１ドメインに自然にＮ−末端結合した任
意の結合配列、或いはその断片が少なくとも５個のアミ
ノ酸残基を有するその様な結合配列の断片でスタートす
るのがよい。

本発明によるハイブリッドPAにおいてＡ−鎖ドメイン
は天然結合配列（例、J₁,J₂、J₃及びJ₅）、融合結合配
列、或いはハイブリッド結合配列或いはその断片を介し
て連結されている。即ち、第１ドメインは該第１ドメイ
ンのＣ−末端に自然に存在する結合配列により、第２ド
メインのＮ−末端に自然に存在する結合配列により、該
結合配列により構成される融合結合配列により、或いは
それらの断片により、第２のドメインに結合されてい
る。

本発明のハイブリッドPAのＡ−鎖ドメインはＢ−鎖セ
リンプロテアーゼドメイン（TPA^B或いはUPA^B）に、ヒト
ｔ−PAにおいてＡ−鎖をＢ−鎖に結合する結合配列J₄、
ヒトｕ−PAにおいてＡ−鎖をＢ−鎖に結合する結合配列
J₆、及び該結合配列の部分配列より構成されるハイブリ
ッド配列よりなる群から選ばれた結合配列により結合さ
れており、該結合配列はプラスミンにより切断されるこ
とのできるプロセシング部位、及びそれに対してＮ−末
端にある、触媒作用Ｂ−鎖領域へのイオウ−イオウ架橋
に参加することのできるシステイン残基を含み、この結
合配列は好ましくは少なくとも40個〜60個までのアミノ
酸残基を有する。

最も好ましいのは、対応するDNA上のエキソン−イン
トロン結合により規定される位置におけるドメインの結
合である。Ａ−鎖対Ｂ−鎖の結合は、最も好ましくは活
性化部位にある。

特に、本発明は、uPAのＡ−鎖又はuPA成長因子ドメイ
ンとｔ−PAクリングルドメイン２とから本質的に成るＡ
−鎖がｔ−PAの触媒作用領域（Ｂ−鎖）と一続きに結合
したものを含んで成るハイブリッドプラスミノーゲンア
クチベータ；並びにｔ−PAのＡ−鎖、本質的にｔ−PAの
フィンガードメインよりなるＡ−鎖、本質的にｕ−PA成
長因子ドメインとｔ−PAクリングル２ドメインとからな
るＡ−鎖、本質的にｔ−PAフィンガードメインとクリン
グル２ドメインとからなるＡ−鎖、或いは本質的にｔ−
PAフィンガードメインと成長因子ドメインとクリングル
２ドメインとからなるＡ−鎖であって、該Ａ−鎖がｕ−
PAの触媒作用領域（Ｂ−鎖）に一続きに結合されている
ものを含んでなるプラスミノーゲンアクチベータよりな
る群から選ばれる一本鎖ハイブリッドプラスミノーゲン
アクチベータであって、Ａ−鎖が、活性化部位及びＢ−
鎖へのイオウ−イオウ結合を形成することのできるシス
テイン残基を含んでなる結合配列を介してＢ−鎖に結合
しているものに関する。

特に、本発明は同様に活性化部位においてｕ−PAの触
媒作用領域（Ｂ−鎖）に結合した、ｔ−PAクリングル２
ドメインより本質的になるＡ−鎖を含んでなる一本鎖ハ
イブリッドプラスミノーゲンアクチベータに関する。

特に好ましいのは、ｔ−PAの触媒作用領域（Ｂ−鎖）
に一続きに結合した、ｕ−PA成長因子ドメインとｔ−PA
クリングル２ドメインとから本質的になるＡ−鎖を含ん
でなるハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ、並
びにｕ−PAの触媒作用領域（Ｂ−鎖）に一続きに結合し
た、ｔ−PAクリングル２ドメインから本質的になるＡ−
鎖或いはｔ−PAフィンガードメインとクリングル２ドメ
インから本質的になるＡ−鎖を含んでなるハイブリッド
プラスミノーゲンアクチベータ、からなる群より選ばれ
た一本鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータに
おいて、Ａ−鎖領域及びＢ−鎖間の結合が活性化部位に
あるものである。

本発明による好ましいハイブリッドPAは UPA^ATPA^B（BC）＝〔uPA（１−158）−tPA（276−52
7）〕， UPA^ATPA^B（BR）＝〔uPA（１−131）−tPA（263−52
7）〕， TPA^AUPA^B（BC）＝〔tPA（１−275）−uPA（159−41
1）〕， TPA^AUPA^B（BR）＝〔tPA（１−262）−uPA（132−41
1）〕， UK₂UPA^B（BR）＝〔uPA（１−44）−tPA（176−261）−u
PA（134−411）〕， FUPA^B（BC）＝〔tPA（１−49）−tPA（262−275）−uPA
（159−411）〕， FUPA^B（BR）＝〔tPA（１−49）−uPA（134−411）〕， FK₂UPA^B（BC）＝〔tPA（１−49）−tPA（176−275）−u
PA（159−411）〕， FK₂UPA^B（BR）＝〔tPA（１−49）−tPA（176−262）−u
PA（132−411）〕， UK₂TPA（BC）＝〔uPA（１−44）−tPA（176−527）〕， K₂UPA^B（BC）＝〔tPA（１−３）−tPA（176−275）−uP
A（159−411）〕， FGK₂UPA^B（BC）＝〔tPA（１−86）−tPA（176−275）−
uPA（159−411）〕及び FGK₂UPA^B（BR）＝〔tPA（１−86）−tPA（176−262）−
uPA（132−411）〕， 茲に、UPA^Aはｕ−PAのＡ−鎖であり、TPA^Aはｔ−PAの
Ａ−鎖であり、UPA^Bはｕ−PAのＢ−鎖であり、TPA^Bはｔ
−PAのＢ−鎖であり、Ｕはｕ−PAの成長因子ドメインを
示し、K₂はｔ−PAのクリングル２ドメインを示し、Ｆは
ｔ−PAのフィンガードメインを示し、Ｇはｔ−PAの成長
因子ドメインを示し、（BC）はＡ−鎖ドメイン及びＢ−
鎖間の結合が活性化部位にあることを示し、そして（B
R）はＡ−鎖ドメインが、活性化部位及びそれに対して
Ｎ−末端にＢ−鎖へのイオウ−イオウ架橋に関与するシ
ステイン残基を含むＢ−鎖に自然に結合した連結配列を
介して、Ｂ−鎖に結合していることを示す。数字はそれ
ぞれｕ−PA及びｔ−PAからとられたアミノ酸配列を示
す。例えばUK₂UPA^B（BR）＝〔uPA（１−44）−tPA（176
−261）−uPA（134−411）〕はｕ−PAのアミノ酸１−44
（成長因子ドメイン、Ｕ）及びｔ−PAのアミノ酸176−2
61（クリングル２ドメイン、K₂）がｕ−PAのアミノ酸13
4−411（Ｂ−鎖、UPA^B）に線状に結合してなる一本鎖ハ
イブリッドプラスミノーゲンアクチベータを示す。

特に好ましいのはハイブリッドプラスミノーゲンアク
チベータTPA^AUPA^B（BC）、FUPA^B（BC）、FGK₂UPA^B（B
C）、特にUK₂TPA^B（BC）、FK₂UP^B（BC）及びK₂UPA^B（B
C）である。

本発明は更にＮ−グリコシル化部位の少なくとも一つ
好ましくは全てがグリコシル化がこの（これら）の部位
において生ずることができないように変形されている本
発明によるハイブリッドPAの変異体に関する。

哺乳動物細胞におけるＮ−結合グリコシル化の前提条
件はトリペプチド配列−Asn−Ｌ−Ser（或いはThr）−
（Asnはアクセプターであり、そしてＬは、グリコシル
化を防止するプロリン或いはアスパラギン酸を除く20個
の遺伝的にコード化されたアミノ酸の任意のものであり
得る）の存在であることが良く確立されている。ｔ−PA
分子内にはＮ−グリコシド結合のための３個の部位があ
る（数字はｔ−PAのアミノ酸配列中のAsnの位置を指す
第１図参照）。即ち、−Asn¹¹⁷−Ser−Ser−（クリング
ル１中に存在）、Asn¹⁸⁴−Gly−Ser（クリングル２中に
存在）、及びAsn⁴⁴⁸−Arg−Thr（ｔ−PA B−鎖中に存
在）である。ｕ−PAのこの唯一のＮ−結合グリコシル化
部位はＢ−鎖中にある（Asn³⁰²−Ser−Thr、第３図参
照）。ｔ−PAクリングル１、ｔ−PAクリングル２、ｔ−
PAのＢ−鎖及び／又はｕ−PAのＢ−鎖を含んでなるハイ
ブリッドPAが又それぞれのＮ−結合グリコシル化部位を
含むことは明らかである。

個々の（１個以上の）Ｎ−グリコシル化部位における
グリコシル化を予防するためにＮ−グリコシル化のため
のシグナルとして認識されているトリペプチド配列が変
更されなければならない。上記トリペプチド配列内のAs
n及び／又はSer（又はThr）残基の任意のその他のアミ
ノ酸による置換はこれらの部位におけるグリコシド結合
の形成を廃止する。便宜的には、Ｎ−グリコシル化部位
の変更はタンパク質レベルにおいてはなされない。その
代り、このハイブリッドPAをコードする遺伝子を、該修
飾遺伝子の宿主による発現の際に１個以上のＮ−グリコ
シル化部位がグリコシル化がこれらの部位において起こ
らないように変更されている突然変異ハイブリッドPAが
生成されるように変更するのが有利である。本発明によ
れば、ハイブリッドPA中に存在する全てのＮ−グリコシ
ル化部位を変更するのが好ましい。

特に、アスパラギンがバリン、ロイシン、イソロイシ
ン、アラニン或いは特にグルタミンで置換され、及びセ
リン及びスレオニンがバリン、メチオニン或いは特にア
ラニンで置換される。

特に好ましいのは下記の修飾されたハイブリッドPAで
ある： FuPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−49）−tPA（262−
275）−uPA（159−301,Gln,303−411）〕， FK₂（Ala186）UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−49）
−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA（159−301,Gln,
303−411）〕， UK₂（Ala186）TPA^B（Ala450）（BC）＝〔uPA（１−44）
−tPA（176−185,Ala,187−449,Ala,451−527）〕， K₂（Ala186）UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−３）
−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA（159−301,Gln,
303−411）〕， FGK₂（Ala186）UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−8
6）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA（159−301,G
ln,303−411）〕， 及び更に FK₂UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−49）−tPA（176
−275）−uPA（159−301,Gln,303−411）〕， K₂UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−３）−tPA（176
−275）−uPA（159−301,Gln,303−411）〕， UK₂TPA^B（Ala450）（BC）＝〔uPA（１−44）−tPA（176
−449,Ala,451−527）〕，及び FGK₂UPA^B（Gln302）（BC）＝〔tPA（１−86）−tPA（17
6−275）−uPA（159−301,Gln,303−411）〕。

本発明のハイブリッドPA及びその突然変異体は、例え
ばハイブリッドPAタンパク質或いはその突然変異体を発
現する形質転換宿主をその発現を許す条件下に培養し、
そしてハイブリッドPAタンパク質及び突然変異ハイブリ
ッドPAタンパク質をそれぞれ単離することよりなる組換
えDNA技術により製造することができる。より具体的に
は、目的化合物は、 ａ）ハイブリッドPAタンパク質或いはその突然変異体を
コードするDNAを用意し、或いはその様なDNAを化学的に
合成し、 ｂ）このDNAを適当な発現ベクター中に導入し、 ｃ）得られたハイブリッドベクターを受容宿主中に移
し、 ｄ）形質転換宿主を未形質転換宿主から例えば形質転換
された宿主のみが生残る条件下に培養することにより選
択し、 ｅ）形質転換宿主をハイブリッドPAタンパク質の発現を
許す条件下に培養し、そして ｆ）ハイブリッドPAタンパク質及びその突然変異体を単
離する、 ことにより製造される。

組換えDNA技術によるハイブリッドPAタンパク質の製
造に含まれる工程を以下により詳細に説明する。

ハイブリッドPAタンパク質をコード化するDNA 本発明はアミノ酸の同一性及び数において、ヒトｕ−
PA及びヒトｔ−PAの部分配列に対応する少なくとも２個
の部分配列により構成されるハイブリッドPAをコードす
る或いはその突然変異体をコード化する配列を有するDN
Aに関する。特に、本発明は前記好ましいものとして述
べたハイブリットPAタンパク質及びその突然変異体の任
意のものをコード化する配列を有するDNAに関する。

好ましくは本発明によるDNAはそれらの末端に隣接配
列（flanking sequence）を有する。特に、これらの隣
接配列（flanking sequence）には、DNAを適当なベクタ
ー中に組みこむのに適当な制限部位が含まれる。

更に、本発明のDNAは成熟ハイブリッドPAコード配列
の第１コドンに結合したｕ−PA或いはｔ−PAのシグナル
配列を含む。あるいは、酵母細胞内で発現される場合
に、本発明のこれらのDNAは用いられる酵母プロモータ
ーに自然に連結しているシグナル配列特にPHO5或いはイ
ンベルターゼシグナル配列などの酵母シグナル配列を含
んでよい。

好ましくは、DNA部分配列のヌクレオチド配列はそれ
ぞれｕ−PA cDNA及びｔ−PA cDNAに見られるヌクレオチ
ド配列と同一であるのがよい。しかしながら、遺伝子コ
ドンの縮重により得られるアミノ酸部分配列が未変化で
留どまるならばヌクレオチド配列が異なってよい。突然
変異体ハイブリッドPAをコードするDNAにおいては、ハ
イブリッドPAタンパク質のＮ−グリコシル化に必須のア
ミノ酸をコードする少なくとも１個のコドンがＮ−グリ
コシル化の認識部位を廃止する異ったアミノ酸をコード
する他のコドンにより置換される。

ｕ−PA cDNA及びｔ−PA cDNAのヌクレオチド配列は公
知である〔W.E.Holmes et al.,Biotechnology3,923−92
9（1985）;D.Pennica et al.,Nature301,214−221（198
3）参照〕。更に、全てのイントロン及びエクソンを含
むゲノムｕ−PA及びｔ−PA遺伝子の完全なヌクレオチド
配列が確立されている〔A.Riccio et al.,Nucl.Acids R
es.13,2759−2771（1985）;S.J.Friezner−Degen et a
l.,J.Biol.Chem.261,6972−6985（1986）参照〕。

ｕ−PA及びｔ−PAのcDNA及びゲノムDNA配列を知って
いれば、本発明によるDNAは公知の方法により作ること
ができる。これらのDNAの作製方法としては、これらのD
NAを化学的に合成するか、或いはｕ−PA cDNA及びｔ−P
A cDNAのポリヌクレオチド部分配列をコードする断片を
調製し、そしてそれらを所定順序で再連結し、任意に１
以上例えば２或いは３の突然変異工程を含む方法が挙げ
られる。

本発明の突然変異ハイブリッドPAをコードするDNAは
公知の方法により製造することができる。これらのDNA
の製造方法は親ハイブリッドPA遺伝子から不所望のアミ
ノ酸残基に対するコドンよりなるDNA部分を切出し、そ
してそれを該コドンが所望アミノ酸残基をコードするデ
オキシリボヌクレオチドトリプレットで置換されたDNA
セグメントと置換するか、或いはデオキシリボヌクレオ
チド置換を部位−指向突然変異誘発により達成すること
を含む。

DNAの化学合成は良く知られており、通常の技術を利
用するものである。適当な技術はS.A.Narang〔Tetrahed
ron39,3（1983）〕により編集されている。特に、ヨー
ロッパ特許出願146,785号明細書に記載されている方法
が用いられ、茲に準用する。

本発明によるDNAの合成のもう一つの手法はｕ−PA及
びｔ−PAのポリヌクレオチド部分配列をコード化する適
当な制限断片をｕ−PA cDNA及びｔ−PAc DNA（或いはゲ
ノムｕ−PA DNA或いはｔ−PA DNA）から切出し、そして
これらの断片を全体ハイブリッドPA構造遺伝子の製造に
用いることにある。二つのストラテジーを適用すること
ができる。いづれのストラテジーを用いるにせよ、断片
の融合がドメインを無傷に保つためにドメイン間の部位
において行われるように注意が払われなければならな
い。第１のストラテジーは適当な制限部位を利用するも
のである。適当な制限部位がｕ−PA及びｔ−PA DNA両者
において利用可能である場合には、これらのDNAを対応
する制限酵素で消化し、断片を平滑末端或いはジグザク
末端（選ばれた制限酵素に応じて）連結により結合す
る。或いは又、有用な制限部位は例えば、部位−指向突
然変異誘発〔M.J.Zoller et al.,Methods Enzymol100,4
68（1983）参照〕により突然変異されたDNAが変異され
たアミノ酸配列を生じないように注意を払いながら導入
することができる。特に好ましい天然の或いは人工的に
導入される制限部位はＡ−及びＢ−鎖をコードするDNA
或いはＡ−鎖に含有される個別のドメインをコードする
DNAを分離するものである。この様にして、Ａ−鎖ドメ
インと触媒作用セリプロテアーゼ領域間に所望の結合を
有するハイブリッドPAをコードするハイブリッドDNAを
生成することができる。第２番目のストラテジーは、ド
メイン境界が、ゲノムDNAにおけるエキソン−イントロ
ン結合部〔L.Patthy,Cell41,657−663（1985）参照〕の
位置、即ちイントロンがそこでスプライスされるcDNAに
おける位置により最良に規定されるという仮定より発す
るものである。これらの位置は制限部位とは稀にしか一
致しないので、任意の新しい造成のために用いることの
できる方式が採用される。即ち、第一工程においては、
特定のドメインをコードするが、しかし、又予想される
融合点を越える追加のDNA配列（数百個の塩基対まで）
を含有する便利な制限断片がバクテリオファージm13に
連結されその中サブクローン化される。第二工程におい
ては、過剰DNA配列がin vitroの突然変異誘発によりル
ープアウトされる〔Zoller et al.上記〕。この操作
は、任意の所定ヌクレオチド位置における正確なイン−
フレーム融合を可能にするので好ましい。

突然変異体ハイブリッドPAの製造のためには、成熟ハ
イブリッドDNAの一部の切取りは制限酵素を用いて行わ
れる。この方法の前提条件は変更されるべきコドンの近
傍の適当な制限部位が利用可能なことである。不所要の
アミノ酸のコドンを含有する小さい制限断片がエンドヌ
クレアーゼ切断により除去される。対応する二本鎖DNA
配列は例えば所望アミノ酸をコードするトリプレットが
用いられる化学合成により調製される。DNA断片は残存
する大断片と適当な方向に連結されて突然変異体ハイブ
リッドをコードする二本鎖DNA配列が得られる。便宜上
及びハイブリッド遺伝子の取扱いを容易にするために、
後者はセグメントの挿入及びクローニングをクローニン
グベクター中で行うことを可能にする適当なリンカーを
有するより大きなDNAセグメント中に含まれるのが有利
である。

本発明の好ましい実施態様においては、突然変異体ハ
イブリッドPAをコードするDNAの調製は部位−指向突然
変異誘発により行われる。この方法は、クローン化され
たDNAの領域内のある規定部位が変更されることのでき
るin vitroの突然変異誘発操作である〔M.J.Zoller及び
M.Smithの総説文献,Methods Enzymol.100、468（198
3）;D.Botstein及びD.Shortle,Science229、1193（198
5）参照〕。突然変異誘発は完全ハイブリッドPA遺伝子
或いは不所望アミノ酸のコドンを含有するその機能的部
分のいづれについても行うことができる。突然変異誘発
後、突然変異された機能的部分をハイブリッドPAのその
他の部分と結合させて突然変異体ハイブリッドPAを与え
る。

ハイブリッドPA遺伝子或いはその機能的部分の突然変
異方法は、一本鎖遺伝子或いはPA遺伝子又はその部分を
含んでなる一本鎖DNAが、突然変異を指令するミスマッ
チ以外は突然変異されるべきハイブリッド遺伝子の領域
に相補的であるオリゴデオキシリボヌクレオチドプライ
マーにハイブリダイズされ、このハイブリダイズされた
オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして用
いて相補DNA鎖の合成を開始し、得られた（部分的）二
本鎖DNAを受容体微生物菌株中に形質転換し、この微生
物菌株を培養し、そして変更されたハイブリッドPA遺伝
子（変異体）を有するDNAを含有する形質転換体を選択
することを特徴とする。

ハイブリッドPA DNAを含有するハイブリッドベクター 本発明はアミノ酸の同一性及び数においてヒトｕ−PA
及びヒトｔ−PAの部分配列に対応する少なくとも２個の
部分配列より構成されるハイブリッドPAをコードする或
いはその突然変異体をコードするDNAを含んでなるハイ
ブリッドベクター及びその製造方法に関する。

ベクターは形質転換のために予定される宿主細胞に応
じて選択される。原理的には、本発明に従う所望ポリペ
プチド遺伝子を選ばれた宿主内で複製し、そして発現す
る全てのベクターが適当である。適当な宿主の具体例は
制限酵素或いは修飾酵素のない或いは乏しい真核生物例
えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビジアエ（Secc
haromyces cerevisiae）、例えばS.セレビジアエGRF18
などがあり、更に哺乳動物細胞特に確立されたヒト或い
は動物細胞系統、例えばミエローマ細胞、ヒト胚肺繊維
芽細胞Ｌ−132、COS細胞、LTK細胞、ヒト悪性メラノー
マBowes細胞、HeLa細胞、アフリカミドリ猿COS−７のSV
−40ウイルス形質転換腎臓細胞或いはチャイニーズハム
スター卵巣（CHO）細胞及びそれらの変種などがある。
上記哺乳動物細胞及びサッカロミセス・セレビジアエの
菌株、例えばS.セレビジアエGRF18が宿主微生物として
好ましい。

a.酵母用ベクター 酵母中における複製及び発現のために適したベクター
は酵母複製開始点及び酵母用選択的遺伝子マーカーを含
有する。酵母複製開始点を含有するハイブリッドベクタ
ー例えば染色体自己複製セグメント（ars）は形質転換
後、酵母細胞内に染色外的に保持され、自己複製され
る。更に、酵母２μプラスミドDNAに相同な配列を含有
するベクターを使用することができる。その様なハイブ
リッドベクターは既に細胞内に存在する２μプラスミド
中に組換により一体化されるか、或いは、自己複製す
る。２μ配列は高形質転換頻度を有するプラスミドには
特に適しており、高コピー数を可能にする。

酵母用に適当なマーカー遺伝子は特に宿主に坑生物質
耐性を付与するものであり、或いは、栄養素要求性酵母
突然変異体の場合には、宿主の欠陥を補完する遺伝子で
ある。対応する遺伝子は、例えば抗生物質G418に対する
耐性を付与し、或いは栄養要求性酵母突然変異体例えば
URA3、LEU2、HIS3或いはTRP1遺伝子内に原栄養性を与え
るものである。酵母ハイブリッドベクターは更に好まし
くはハイブリッドベクター及びそれらの中間体の造成及
びクローニングが細菌宿主内で行われるように細菌宿主
特にE. coliのための複製開始点及びマーカー遺伝子を含
有するのが好ましい。

酵母内で発現するのに適した発現制御配列は例えば良
く発現される酵素遺伝子のものである。即ち、TRP1遺伝
子、ADH I或いはADH II遺伝子、酸ホスファターゼ（PHO
3或いはPHO5）遺伝子、イソ−チトクローム遺伝子のプ
ロモーター、或いは解糖系遺伝子のプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、３−ホスホグリセレート
キナーゼ（PGK）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル
ボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−
６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェー
トイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、イソ
ベルターゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターを
用いることができる。本発明の好ましいベクターは転写
制御を有するプロモータ例えば生育条件の変化によりオ
ン或いはオフにすることのできるPHO5及びADH II遺伝子
のプロモーターなどを含有する。例えば、PHO5プロモー
ターは単に培地中の無機リン酸塩の濃度を増大或いは減
少することによって抑制或いは抑制解除することができ
る。

好ましくは、本発明の酵母ハイブリッドベクターは又
転写停止及びポリアデニル化に適した適当なシグナルを
含有する酵母遺伝子の３′隣接配列（flanking sequenc
e）も又含んでなる。適当な３′隣接配列は用いられる
プロモーターに自然に結合した遺伝子のもの、例えば酵
素PHO5遺伝子の３′隣接配列である。

b.哺乳動物細胞用ベクター 哺乳動物細胞において複製及び発現するためのベクタ
ーはしばしばウイルス起源例えばシミアンウイルス40
（SV40）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイル
ス２、ウシパピロマウイルス（BPV）、パポバウイルスB
K突然変異体（BKV）、或いはマウス或いはヒトサイトメ
ガロウイルス（それぞれMCMV及びHCMV）からのDNAを備
えるものである。

哺乳動物用に適した発現制御配列は特にSV40の初期及
び後期プロモーター、アデノウイルスの主要後期（majo
r late）プロモーター、ネヅミメタロチオネイン遺伝子
のプロモーター及びマウス或いはヒトサイトメガロウイ
ルスの主要即時−初期（immediate−early）遺伝子のエ
ンハンサー−プロモーター領域、ヒトイムノグロブリン
エンハンサー−プロモーター領域、任意にSV40エンハン
サーと組合わされたヒトα−グロビンプロモーター及び
ヒートショック遺伝子から得られたプロモーターなどが
挙げられる。

哺乳動物細胞に適したマーカー遺伝子は例えば抗生物
質G418及びプレオマイシン−タイプ抗生物質に耐性を与
えるトランスポリンTn5からのそれぞれneo及びble遺伝
子、ハイグロマイシン−Ｂ耐性のためのE.coli遺伝子、
DHFR^-細胞の表現型をDHFR⁺細胞に変化させるかそして／
又はメトトレキセートに耐性を与える哺乳動物細胞或い
はE.coliからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）及
びTK^-細胞を表現型的にTK⁺細胞にする単純ヘルペスウイ
ルスのチミジンキナーゼ遺伝子などである。

好ましくは、哺乳動物細胞のためのハイブリッドベク
ターは適当な転写停止及びポリアデニル化のためのシグ
ナル例えばβ−グロビン遺伝子の３′隣接領域（flanki
ng sequence）を含有する哺乳動物遺伝子の３′非翻訳
領域を含有する。ポリペプチドコード領域に隣接する領
域がそれらの末端において適当なスプライシングシグナ
ルを有する１個以上の生来のイントロンを含むのが有利
である。cDNA及び上記選択遺伝子の様な原核生物DNAは
一般的にその様な転写及びプロセッシングシグナルに欠
けるので、その様な付加が必要であると認められる。

好ましくは、その様なベクターはE.coli中の増加のた
めの複製開始点及び抗生物質耐性遺伝子を含有する。哺
乳動物の複製開始点はベクターの造成中にSV40或いは他
のウイルス源から得られた様な真核生物開始点を含ませ
るか或いはベクターを宿主細胞染色体中に一体化した際
に宿主細胞染色体により与えられる。

哺乳動物細胞用の好ましいハイブリッドベクターは、
その上流側がネヅミサイトメガロウイルスの主要即時−
初期（major immediate−early）遺伝子エンハンサー−
プロモーターに、そして下流側がその適当なスプライシ
ングシグナル及びポリアデニル化配列を有する第二イン
トロンを含むウサギβ−グロビン遺伝子の３′末端に作
用可能に隣接されているハイブリッドPA或いは突然変異
体ハイブリッドPA cDNAを含んでなる。更に、それらは
トランスポソンTn5或いは場合によってはTn9からのネオ
マイシン耐性遺伝子をコードする配列又はハイクロロマ
イシンホスホトランスフェラーガをコードする配列を含
有し、これらはその上流側において逐次SV40の複製開始
点及びTn5_neo遺伝子の天然プロモーターも含むSV40ウイ
ルスからの初期プロモーターにより隣接され、そしてそ
の下流側において小ｔ−抗原スプライシング及びポリア
デニル化シグナルを含むSV40初期遺伝子のセグメントに
より隣接されている。全体造成物は、プラスミド複製起
源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むが、しかし、哺乳
動物細胞におけるSV40−モードDNA複製を抑制する所謂
毒性配列に欠けるE. coliプラスミドpBR322の断片中にク
ローン化される。任意にジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）
をコードする遺伝子がベクター中に含まれ、好ましくは
R.J.Kaufman et al.〔Mol.Cell.Biol.2、1304−1319（1
982）〕により説明されたモジュールDHFR遺伝子が用い
られる。このモジュールDHFR遺伝子は逐次アデノウイル
スタイプ２の主要後期プロモーター、イムノグロブリン
遺伝子の断片、ウサギDHFR cDNAのコード部分及びSV40
の初期アデニル化部位により構成される。

哺乳動物用の新規の好ましいハイブリッドベクターは
当業界における進歩を構成するものである。それらはマ
ウスサイトメガロウイルス即時−初期プロモーター／エ
ンハンサー中及びベーターグロビンスプライシング／ポ
リアデニル化配列中に位置するクローン化されたcDNAの
ための強い発現シグナルを極めて広範囲の脊椎動物細胞
タイプにおいて高レベルの発現を可能にする環境内に含
む点においてこれ迄知られたベクターに比較してより優
れたものである。より具体的には、これらのベクターは
（ａ）通常の、即ちSV40−形質転換されない組織培養細
胞系において、cDNAを一時的に発現するために、（ｂ）
しかし更に良好にはSV40T−抗原を発現する霊長類細胞
中でより高いコピー数においてベクターをそのSV40複製
開始点を介して複製させるために、しかし、又、（ｃ）
ベクターが宿主細胞染色体中に一体化することができる
場合には通常の組織培養細胞系において安定にその様な
クローン化されたcDNAを発現するために、及び（ｄ）ベ
クターがエピゾームとして複製することができるSV40T
−抗原産生霊長類細胞系にベクターを導入する場合に
は、より高いコピー数のために更により良好に用いるこ
とができる。

MCMVのエンハンサー−プロモーター領域は、例えば、
MCMVの主要即時−初期遺伝子のクレオチド−835〜443に
おいて開始し、そして５′領域のヌクレオチド＋50（mR
NA開始からカウント）のおいて終了するDNAを含んでな
る。好ましいMCMVのエンハンサー−プロモーター領域は
ヌクレオチド−542〜＋50を含んでなる。

ウサギβ−グロビン遺伝子の３′隣接領域は、第２エ
キソン中で、好ましくはBamH I部位において開始し、従
って、その隣接配列においてスプライシングのためのシ
グナルを有する第２イントロンを含み、そしてポリアデ
ニル化シグナルの背後で、好ましくは上記BamH I部位の
後1.2kbに位置するBgl II部位で終了する。ウサギβ−
グロビン遺伝子の２番目の半分よりなる〔P.Dierks et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78、1411〜1415（1981）;
A.van Ooyen et al.,Science206,337−344（1979）〕。

SV40の複製開始点は例えばウイルスDNAのHind III−S
ph I断片に含まれている〔ヌクレオチド5171〜128、開
始点＝位置1;Tooze J.（編者）DNA Tumor Viruses,Part
2、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,ニューヨーク、1982〕。しかしながら、好ま
しい実施態様は複製開始点に加えて、さらにベクターの
選択遺伝子の転写を促進するのに有用なウイルスの初期
エンハンサー／プロモーターをも含有するHind III−Hp
a II断片（ヌクレオチド5171〜346）である。

ネオマイシン遺伝子は組織培養細胞において活性なプ
ロモーター、好ましくは上記Hpa II−Hind III断片上に
位置するSV40の初期プロモーターの後にクローニングさ
れる。ネオマイシンのコード配列は例えばトランスポソ
ンTn5からのBal II−Sma I断片上に含まれる〔E.Beck e
t al.,Gene19、327−336（1982）;P.Southern et al.,
J.Mol.Appl.Genet.１,327−341（1982）;F.Colbere−Ga
rapin et al.,J.Mol.Biol.150、１−14（1981）〕。ネ
オマイシン遺伝子はE. coliにおける転写も又可能にする
第二プロモーターを備えるのが好ましい。例えば、Hind
III−Bgl II断片上に好ましく含まれるTn5ネオマイシ
ン遺伝子の天然プロモーターをneoコード配列の前で真
核生物プロモーターの後に置くことができ（Southern e
t al.上記）、或いは更に上流で真核生物プロモーター
の前に置くことができる（Colbre−Garapin et al.上
記）。組織培養細胞内で発現されるためには、細菌neo
遺伝子に続いてポリアデニル化シグナル、好ましくは、
スプライシングシグナルをさらに含有するSV40t抗原遺
伝子の部分が存在しなければならない。ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ、特に上記Tn5断片のBgl II−S
ma I部分は又、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼのコード配列により、好ましくはプラスミドpLG8
9のBamHI断片の形態〔L.Gritz et al.Gene25,179−188
（1983）〕で置換されることもでき、このプラスミドは
最も便利にはBgl IIリンカーがベクターのSma I部位に
導入されているpSV2911neoの誘導体であるpSVd〔Luedin
et al.,EMBO−J.6、109−144（1987）〕中に便利に挿
入することのできる。

もう一つの好ましい選択遺伝子は、pSV2dhfr（ATCC37
145）におけるような控訴ジヒドロ葉酸還元酵素のコー
ド化配列を用い、これは、形質転換細胞の選択のみなら
ず、プラスミド付随DNA配列の増幅もしばしば本発明に
おるプラスミド−コード化タンパク質の比例した産生の
増大を伴って可能にする。

E. coliプラスミドpBR322から得られる断片はpBR322の
複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。この断
片は好ましくはベクターのSV40t抗原−駆動複製を阻害
する所謂毒性配列が除去されているpSVOd〔P.Mellon et
al.,Cell27、279−288（1981）〕などのpBR322誘導体
からとられるのがよい。

好ましい実施態様において、本発明はプロモーター及
びハイブリッドPA或いは突然変異体ハイブリッドPAをコ
ード化するDNAを含んでなる、真核生物宿主菌株内にお
いて複製及び表現型選択を行うことのできるハイブリッ
ドベクターに関し、該DNAは、形質転換された宿主内に
おいてそれが発現されてタンパク質が産生されるよう
に、該プロモーターの制御下に転写開始及び終了シグナ
ル並びに翻訳開始及び停止シグナルと共に該ハイブリッ
ドベクター内に配置されている。

本発明のハイブリッドベクターは、例えばプロモータ
ー、ハイブリッドPA或いは突然変異体ハイブリッドPAコ
ード化領域、３′隣接配列、及びベクターDNAを含有す
るDNAセグメントを連結することにより公知の方法によ
り調製される。

DNAセグメントをin vitroで連結するために、各種技
術が使用される。ある種の制限酵素により生産された平
滑末端（完全に塩基対形成されたDNA二本鎖）は直接にT
4DNAリガーゼで連結されてよい。より普通には、DNAセ
グメントはそれらの一本鎖粘着末端により連結され、DN
Aリガーゼ、例えばT4DNAリガーゼにより共有結合的に閉
じられる。その様な一本鎖「粘着末端」は、DNAをジグ
ザグ末端（DNA二本鎖の二本の鎖が幾つかのヌクレオチ
ドだけ離れた点で切断される）を生成するもう一つのク
ラスのエンドヌクレアーゼによりDNAを切断することに
より形成される。一本鎖は又、末端トランスフェラーゼ
を用いて平滑末端或いはジグザグ末端にヌクレオチドを
付加することによって（「ホモポリマーテーリン
グ」）、或いは単に平滑末端DNAセグメントの一本鎖を
適当なエキソヌクレアーゼ例えば入エキソヌクレアーゼ
でチューバックすることによって形成することができ
る。ジグザグ末端の生成への更に一つの手法は、平滑末
端DNAセグメントにジグザグ末端形成エンドヌクレアー
ゼの認識部位を含有する化学的に合成されたリンカーDN
Aを連結し、そして得られたDNAを対応するエンドヌクレ
アーゼで消化することにある。本発明によるハイブリッ
ドベクターの成分は適当な機能を確実にするために所定
順序で一緒に結合される。

ハイブリッドPA DNAを含有するハイブリッドベクターで
形質転換された宿主 本発明のもう一つの面はアミノ酸の同一性及び数にお
いてヒトｕ−PA及びｔ−PAの部分配列に対応する少なく
とも２個の部分配列により構成されるハイブリッドPAを
コードする或いはその突然変異体をコードするDNAを含
んでなるハイブリッドベクターで形質転換された真核生
物宿主生物、及びその宿主の突然変異体、及びそれらの
製法を含むものである。

適当な真核生物宿主の具体例は上記のものであり、特
に酵母及び哺乳動物細胞株である。形質転換宿主生物体
の突然変異体は特にハイブリッドPA或いは突然変異体ハ
イブリッドPAを分解するプロテアーゼに乏しくそれぞれ
ハイブリッドPA及び突然変異体ハイブリッドPAのより高
い収率を与える突然変異体が挙げられる。

形質転換体真核生物宿主の製造方法は、発現制御配列
により制御される本発明のDNAを含んでなる発現ベクタ
ーで真核生物宿主を形質転換即ちトランスフェクション
することを特徴とする。

真核生物宿主細胞の形質転換は公知の方法により達成
される。例えば、酵母の形質転換はHinnen et al.〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA75.1919（1978）〕により説明され
ている方法に従って達成される。この方法は次の三工程
に分けることができる： （１） 酵母細胞壁或いはその部分の除去。

（２） 「裸」の酵母細胞（スペロプラスト）のPEG
（ポリエチレングリコール）及びCa²⁺イオンの存在下に
おける形質転換DNAによる処理。

（３） 寒天の固体層中における細胞壁の再生及び形質
転換細胞の選択。

好ましい方法： 工程1:酵母細胞壁は、各種グルコシダーゼの調製物、例
えばカタツムリ胃液（例.Glusulase 或いはHelicas
e ）或いは微生物から得られた酵素混合物（例.Zymoly
ase ）により、浸透圧的に安定化された溶液（例.1Mソ
ルビトール）中において酵素的に除去される。

工程2:PEGの存在下で酵母スフェロプラストが凝集し、
そして細胞質膜の局所的融合が誘発される。「融合様」
条件の生成が重要であり、多くの形質転換酵母細胞は形
質転換の過程において２倍体或いは３倍体にさえもな
る。融合したスフェロプラストの選択を可能にする操作
を用いて形質転換体を濃縮することができる。即ち、形
質転換された細胞は予備選択された融合生成物中から容
易にスクリーニングすることができる。

工程3:細胞壁のない酵母細胞は分裂しないので細胞壁は
再生されなければならない。この再生はスフェロプラス
トを寒天中に包埋することによりなされるのが便利であ
る。例えば、溶融寒天（約50℃）をスフェロプラストと
混合する。溶液を酵母生育温度（約30℃）まで冷却する
と、固体層が得られる。この寒天層はスフェロプラスト
からの必須巨大分子の迅速的な拡散及び損失を防止して
細胞壁の再生を容易にする。しかしながら、細胞壁再生
は又（より低い効率であるが）スフェロプラストを予備
形成された寒天層の表面上にプレート培養することによ
っても得られる。

好ましくは、再生寒天は形質転換細胞の再生及び選択
を同時に行うようにして調製される。アミノ酸生合成経
路の酵素をコードする酵母遺伝子が一般的に選択マーカ
ー（上記）として用いられるので、再生は好ましくは酵
母最小培地寒天内で行われる。極めて高い再生効率が必
要とされる場合には、次の二つの工程操作が有利であ
る：（１）富んだ複合培地内における細胞壁の再生、及
び（２）細胞層の選択寒天プレート上へのレプリカプレ
ーティングによる形質転換細胞の選択。

ハイブリッドベクターの哺乳動物細胞中への導入はヘ
ルパー化合物例えばジエチルアミノエチルデキストラ
ン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレ
ングリコールなど、或いは共沈澱としてのベクターDNA
及びリン酸カルシウムの存在下におけるトランスフェク
ションによりなされる。更に適当な方法としては、ベク
ターDNAの細胞核中への直接マイクロインジェクション
及びエレクトロポレーション即ち細胞膜の透過性を増大
する短い電気パルスによるDNAの導入などが挙げられ
る。トランスフェクションされた細胞の引続く選択は、
発現ベクターに共有結合により一体化されるか或いは別
の存在として添加される選択マーカーを用いて行うこと
ができる。選択マーカーとしては抗生物質に対する耐性
を与える遺伝子或いは宿主細胞の遺伝的欠陥を補完する
遺伝子が挙げられる（上記）。

一つの好ましい選択系は外因的DHFR遺伝子が供給され
なければ成長に絶対にチミジン、グリシン及びプリン類
を必要とするジヒドロ葉酸還元酵素（DHRF^-）に欠ける
細胞、例えばCHO細胞を利用する。ハイブリッドPA遺伝
子を含有するベクター及びこれに加えてDHFR遺伝子を適
当なDHFR^-細胞例えばCHO細胞に導入すると、形質転換細
胞は抗−葉酸剤メトトレキセートの濃度を培地中におい
て増大することにより選択される。

特に、好ましいのは適当な哺乳動物細胞例えばCHO細
胞がハイブリッドPA遺伝子及び抗生物質耐性例えばＧ−
418に対する耐性をコードする遺伝子を含有するベクタ
ーDNAと、リン酸カルシウムとの共沈澱により処理され
る選択方法である。形質転換された細胞は対応する抗生
物質例えばＧ−418中で培養し、そして／又はハイブリ
ッドPA発現についてスクリーニングすることにより選択
される。

本発明の形質転換された宿主生物体は公知の突然変異
及び選択適用方法によりハイブリッドPA或いは突然変異
体ハイブリッドPAの産生について改良される。この突然
変異は例えば紫外線照射或いは適当な化学薬品により行
うことができる。特に好ましいのは、産生されたハイブ
リッドPA及び突然変異体ハイブリッドPAのタンパク質分
解的破壊をそれぞれ回避するためのプロテアーゼ−欠陥
突然変異体、特に酵母突然変異体の製造である。

形質転換された宿主細胞の培養 本発明は更にアミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ
−PA及びヒトｕ−PAの部分配列に対応する少なくとも２
個の部分配列により構成されるアミノ酸配列を有する一
本鎖ハイブリッドPA或いはその突然変異体の製造方法で
あって、適当な栄養条件下において該ハイブリッドPA或
いは突然変異体ハイブリッドPAをコード化するDNA配列
を含有する形質転換真核生物宿主を培養し、そして該ハ
イブリッドPA或いはその突然変異体を単離することを特
徴とする方法に関する。

形質転換された宿主細胞は同化可能な炭素源、窒素源
及び無機塩類を含有する液体培地中において公知の方法
により培養される。

本発明の形質転換された酵母細胞の培養のためには、
各種炭素源を用いることができる。好ましい炭素源の具
体例は同化可能な炭水化物、例えばグルコース、マルト
ース、マンニトール或いはラクトース或いはアセテート
であり、これらはそれ自体或いは適当な混合物として用
いることができる。適当な窒素源の具体例としては、ア
ミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド類及びタンパク質
及びそれらの劣化生成物例えばトリプトン、ペプトン或
いは肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、及び又アンモ
ニウム塩例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
或いは硝酸アンモニウムなどであり、それらはそれ自体
或いは適当な混合物として用いることができる。更に使
用することのできる無機塩類はナトリウム、カリウム、
マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩塩化物、リン酸
塩、及び炭酸塩である。

培地は更に例えば成長促進物質、例えば微量元素例え
ば鉄、亜鉛、マンガンなど、及び好ましくは選択圧力を
働かせて発現プラスミドを失った細胞の成長を防止する
物質を含有する。即ち、例えば、必須アミノ酸中で栄養
素要求性である酵母菌株が宿主微生物として用いられる
場合に、プラスミドはこの宿主の欠陥を補完する酵素を
コード化する遺伝子を含有するのが好ましい。この酵母
菌株の培養は該アミノ酸に欠ける最小培地中において行
われる。

培養は公知の方法により行われる。培養条件例えば温
度、培地のpH値、及び発酵時間は本発明のPAタンパク質
の最大力価が得られるように選ばれる。即ち、酵母菌株
は通気条件下に浸透或いは撹拌しながら液内培養により
約20〜40℃、好ましくは約30℃の温度、５〜８のpH値好
ましくは約pH7において約４〜30時間、好ましくは本発
明のタンパク質の最大収量に達するまで培養されるのが
好ましい。

哺乳動物細胞は任意に成長促進物質及び／又は哺乳動
物血清を補給された市販の培地を用いて組織培養条件下
に生育される。細胞は固体支持体例えばマイクロキャリ
ヤー或いは多孔性ガラス繊維に付着するか或いは適当な
培養容器内で自由浮遊されて生育される。培養培地は選
択圧力が働いて遺伝子マーカーを含むハイブリッドベク
ターDNAを尚含有する細胞のみが生残るようにして選択
される。即ち、例えば、ハイブリッドベクターが対応す
る抗生物質耐性遺伝子を含む場合に抗生物質が培地に添
加される。

細胞密度が十分な値に到達した時点で培養を中断し、
タンパク質を単離する。哺乳動物細胞を用いる場合に
は、ハイブリッドPA或いは突然変異体ハイブリッドPAタ
ンパク質は通常培地中に分泌される。この生成物を含有
する培地を細胞から分離し、この細胞に新たな培地を与
えられて連続製造に用いることができる。酵母細胞が用
いられる場合には、タンパク質は又細胞内、特にペリプ
ラズム空間にも蓄積することができる。後者の場合、PA
タンパク質の回収のための第１工程はタンパク質を細胞
内部から放出することにある。殆んどの操作において、
細胞壁を先ずグルコシターゼ類（上記）による細胞壁の
酵素消化により除去する。或いは又、細胞壁を化学薬品
例えばチオール試薬或いはEDTAなどによる処理により除
去するが、これは細胞壁に傷を生ぜしめ、産生されたハ
イブリッドPA或いはその変異体を放出させる。得られた
混合物は通常の手段に例えばポリエチレンイミンを用い
る処理による殆んどの非タンパク質物質の除去、硫酸ア
ンモニウムを用いるタンパク質の沈澱、ゲル電気泳動、
透析、クロマトグラフィ、例えばイオン交換クロマトグ
ラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、HPLC或いは逆相
HPLC、適当なSephadex カラム上における分子サイジン
グなどにかけてハイブリッドPA或いはその変異体の濃縮
を行う。この予備精製された生成物の最終精製は、例え
ばアフィニティクロマトグラフィ例えば抗体アフィニテ
ィクロマトグラフィ、特に公知の方法で不溶性マトリッ
クス上に固定されたモノクローナル抗−ｔ−PA或いは抗
−ｕ−PA抗体を用いるモノクローナル抗体アフィニティ
クロマトグラフィ或いはｔ−PAの触媒作用Ｂ−鎖を含有
するハイブリッドPAの場合には、DE−３アフィニティク
ロマトグラフィ（DE−３はErytrinalatissimaから単離
されたプロテアーゼ阻害剤である）などにより達成され
る。

ｔ−PA或いはｕ−PAの特異的ドメインに向けられたモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統及
び該モノクローナル抗体は又本発明の目的である。

二本鎖形態を実質的伴わない一本鎖形態のハイブリッ
ドPA或いは突然変異体ハイブリッドPAの便利な製造のた
めには、培養培地中に存在し、一本形態の二本鎖形態へ
の（部分的）転換を引起こすことのある微量のプロテア
ーゼを阻害するために、プロテアーゼ阻害剤例えばアプ
ロチニン（Trasylol ）或いは塩基性膵臓トリプシン阻
害剤を精製操作時に含ませるのが有利である。最終精製
は、次いで、選択的アフィニティ試薬を含有するカラム
上でのクロマトグラフィにより達成される。

5.医薬組成物 本発明によって得ることのできる新規一本鎖ハイブリ
ッドPAタンパク質及びその突然変異体は貴重な薬学的性
質を示す。それらはプラスミノーゲン活性の機構を介し
て局所的フィブリ分解或いはタンパク質分解活性をもた
らしたい場合の血栓症その他の状態例えばアテローム性
動脈硬化症、心筋及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓
症、手術後血栓症、血栓静脈炎及び糖尿性血管症などの
予防或いは治療のためにヒトにおける公知のプラスミノ
ーゲンアクチベータと同様に用いることができる。

驚くべきことに、本発明による新規ハイブリッドPAタ
ンパク質及びその突然変異体は天然ｔ−PA及びｕ−PAの
有益な性質を合わせ持つことが判明した。即ち、新規ハ
イブリッドPAタンパク質及びその突然変異体は繊維素分
解活性を有する。この独特なフィブリン−指向特性即ち
フィブリンの存在下において優先的にプラスミノーゲン
活性化する能力が保持されている。更に新規タンパク質
は真性のｔ−PAに比較して長時間のin vivo安定性を有
する。

本発明は又治療的に有効量の有効成分（ハイブリッド
PA或いはその突然変異体）を非経口的、即ち筋肉内、皮
下或いは腹腔内投与に適し、有効成分と悪い相互作用を
行わない有機或いは無機の固体或いは液体の薬学的に許
容可能な担体と共に含んでなる医薬組成物にも関する。

適当な注入溶液、好ましくは水溶性或いは水性分散液
があり、これらは使用前に例えば有効成分単独、或いは
マンニトール、ラクトース、グルコース、アルブミンな
どの担体と共に含有する凍結乾燥調剤から調製すること
が可能である。この医薬組成物は殺菌され及び必要に応
じて補助剤例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、
緩衝剤及び／又は浸透圧を制御するための塩類などと混
合される。殺菌は小孔径（0.45μｍ直径以下）のフィル
ターを通す殺菌過により達成することができ、その後
組成物を必要に応じて凍結することができる。殺菌性を
保存するのが助けるために抗生物質も又添加されてよ
い。

本発明による医薬組成物は単位投与形態、例えば単位
投与当り１〜2000mgの薬学的に許容可能な担体及び単位
投与当り約１〜200mg、好ましくは約５〜100mgの有効成
分を含んでなるアンプルとして調剤される。

病気のタイプ及び患者の年令、状態に応じて、約70kg
の体重の患者の治療に投与される毎日の投与量は24時間
当り３〜100mg、好ましくは５〜50mgである。心筋梗塞
の場合には、好ましくは約30〜80mgが60〜120分以内
に、好ましくは約90分以内に３回分けて投与される。ハ
イブリッドPA或いは突然変異体ハイブリッドPAの全量は
又ボーラス注射としても投与することができる。

本発明は又本発明により生物学的に活性なタンパク質
が薬学的に許容可能な担体と混合されることを特徴とす
る医薬組成物の製造方法も提供する。

新規タンパク質の人体の予防的及び治療的治療の使用
も又本発明の目的である。

本発明は特に実施例において説明されたDNA類、ハイ
ブリッドベクター、形質転換された宿主菌株、ハイブリ
ッドPAタンパク質、突然変異体ハイブリッドPAタンパク
質、ハイブリドーマ細胞系統、モノクロナール抗体及び
それらの製造方法に関する。

実験の部 実施例1:ヒトｔ−PA cDNAにおけるクリングル構造及び
酵素ドメイン間の連結部におけるSca I部位の導入 ｔ−PA及びｕ−PA両者のドメインを含有するキメラ或
いはハイブリッド分子を造成するために用いられる一つ
の手法は、各々のクローンから得られた目的制限断片を
調製し、それらを溶液中において再編成し、次いで得ら
れた造成物をクローン化することにある。クローン化
後、キメラ分子の構造は制限マッピング及びDNA配列分
析により検証される。

ハイブリッド分子を得るためには、ｔ−PA及びｕ−PA
cDNAの両者を各々のクリングル構造及び酵素ドメイン
の間の連結部において切断する。これはｕ−PAについて
は、非−触媒作用ドメインを酵素ドメイン及びその３′
末端における関連配列と分離する制限酵素Mst Iによる
部分的消化を行うことにより達成される。ｔ−PA中には
これに匹敵し得る有用な潜在的切断部位が存在しないの
で従って、これを以下の様にして導入する。

Ａ）プラスミドpEco0.47ΔSca Iの造成（第５図参照） この造成において、ｔ−PA cDNAのヌクレオチド位置9
40−945における非反復Sca I部位（AGTACT）を破壊し、
（AGTACT→AGTATT）及びもう一つのSca I部位をクリン
グル２の３′末端におけるヌクレオチド位置963−968
（TCCACC→AGTACT）において導入する（第１図及び第２
図参照）。これらの変化によってはいづれのアミノ酸の
コードを影響も及ぼされない。

全ての制限消化は製造元（New England Biolabs,Beth
esda Research Labs）の指示事項に従って行われ、得ら
れた消化物は3.5％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動により分析された。ゲルはエチジウムブロマイド（1.
0μg/ml）で染色し、紫外線で可視化された。適当なバ
ンドを切出し、0.5×TBE（１×TBE＝90mM Tris−ホウ酸
塩、pH8.3、2.5mM EDTA）中で電気溶出された。電気溶
出された物質をElutip−ｄカラム（Schleicher and Sch
uell）にかけ、結合DNAを高塩中に溶出させ、エタノー
ルを添加して沈澱した。ペレットをエタノールで洗浄
し、乾燥し、水に溶解した。

ヒトｔ−PA cDNA（HeLaS3細胞から単離したmRNAから
合成したプラスミドpBR322のPst I部位中にクローン化
したもの）を含有するプラスミドpW349F（ヨーロッパ特
許出願143,081号明細書）をEcoRIで消化し、470塩基対
（bp）断片（第２図参照）を単離した。470bp EcoRI断
片をSca I及びHae IIIでそれぞれ消化することにより、
150bp EcoRI−Sca I及び290bp EcoRI−Hae III断片を得
た。DNAをDMSO緩衝液（30％DMSO,1mM EDTA,0.5％キシレ
ンシアノール、0.05％プロムフェノールブルー）中にお
いて変性し、そして0.5×TBE中において５％ポリアクリ
ルアミドゲル中で８ボルト/cmにおいて電気泳動するこ
とにより、470bp EcoRI断片の二本の鎖を分離した。〔M
aniatis et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory:1982〕。分離された
鎖は、電気溶出及びそれに続くエタノール沈殿により回
収した。ホスホトリエステル法を用いて31−マーデオキ
シオイゴヌクレオチド（５個の目的ヌクレオチド変化を
含む、第５図参照）が合成された。50pモルの31−マー
を、１×キナーゼ緩衝液（10×キナーゼ緩衝液＝0.5M T
ris・HCl、pH7.5、0.1M MgCl₂50mM DTT、1mMスペルミジ
ン、1mM EDTA）、30μCi〔α³²P〕ATP（Amersham、約30
00Ci/mモル）及び10単位のT₄ポリヌクレオチドキナーゼ
（Bethesda Research Labs.）を含有する20μ反応液
中において５′末端において³²P−標識化した。反応液
を37℃で30分間インキュベート後、１μの10mM ATP、
10単位のT₄キナーゼを添加し、更に32℃で30分間インキ
ュベートした。反応は68℃において10分間加熱すること
より終了させた。その配列が非転写鎖のそれである標識
化された31−マーをドットブロット分析におけるプロー
ブとして使用して［Zoller and Smith,Nucl.Acids Re
s.,10,6487−6500（1982）に従って行った；但しプリハ
イブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは50
℃において行われ、洗浄は60℃において行われた］、二
本鎖のいづれかそれにハイブリダイズするか即ち転写さ
れた鎖を表わすかを決定した。四つのDNAを0.3pモルの
転写鎖、各2pモルの150bp EcoRI−Sca I断片及び290bp
EcoRI−Hae III断片、25pモルのホスホリル化31−マー
及び１×アニーリング緩衝液（５×アニーリング緩衝液
＝0.5M NaCl、32.5mM Tris.HCl pH7.5、40mM MgCl₂及び
5mMβ−メルカプトエタノール）よりなる20μのアニ
ーリング反応液において一緒に混合した。この混合物を
100℃で３分間、30℃で30分間、４℃で30分間インキュ
ベートした後、10分間氷上で冷却後400単位のT₄DNAリガ
ーゼ（New England Biolabs）を添加し、反応液を12.5
℃で一昼夜インキュベートした。470bpのアニーリング
された断片を上記の如く3.5％ポリアクリルアミドゲル
から回収し、12℃における一昼夜のインキュベーション
により、50mM Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DT
T、1mM ATP、1mMスペルミジン、0.1mg/mlウシ血清アル
プミン中において、EcoRI消化された脱ホスホリル化pBR
322DNA（New England Biolabs）に連結した。50μg/ml
のアンピシリンを含有するＬ−寒天上でアンピシリン耐
性コロニー選択し、470bp断片を含有するコロニーを31
−マーをプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼ
ーションにより確認した〔D.Woods,Focus６,1−３（198
4）］。プラスミドDNAを幾つかの陽性にハイブリダイズ
するコロニーから小規模に単離し［Holmes et al.,Anal
yt.Biochem.114,193−197（1981）］、そして新しいSca
I部位の生成をEcoRI及びSca I消化の組合せにより検証
した。純度を確実にするために、陽性コロニーからのプ
ラスミドDNAをE.coli HB101の第２ラウンドの形質転換
に用いた。大規模プラミド調製はその様な第二世代陽性
コロニーから行われ［Katz et al.,J.Bacteriol.114,57
7−591（1973）;Biochemistry16,1677−1683（197
7）］、そして元のSca I部位の破壊及び新しいSca I部
位の生成はMaxam及びGilbertの方法［Methods Enzym.6
5,499−560（1980）］を用いるDNA配列分析により検証
された。このプラスミドをpEco0.47ΔSca Iと命名す
る。

Ｂ）ヒトｔ−PAの変異体Sca I部位による再造成（第６
図参照） この造成においては野生型ヒトｔ−PA上に存在する47
0bp EcoRI断片と交換した。ヒトｔ−PA cDNAを含有する
プラスミドpW349F（上記参照）をCla Iで消化し、得ら
れた粘着末端を各々50μｍのdCTP、dGTP及び10単位のDN
AポリメラーゼＩ、クレノウ断片（Boehringer,Mannhei
m）を添加することにより、平滑化した。反応液を室温
で30分間インキュベート後、フェノール及びエーテル抽
出及びエタノール沈澱を行った。ペレットを水に溶解
し、EcoRI及びSca Iで消化し、そして1.5kb EcoRI−Sca
I断片及び4.3kb Cla I（平滑末端）−EcoRI断片を単離
した。これらの二つの断片を、EcoRI消化後にプラスミ
ドpEco0.47ΔSca Iから回収した470bp断片と混合し、上
記の如く一昼夜12℃において連結させた。コンピテント
E.coli HB101細胞を連結ミックスで形質転換し、テトラ
サイクリン耐性コロニーを12.5μg/mlテトラサイクリン
を含有するＬ−寒天上で選択した。470bp突然変異体断
片を含有するコロニーを前記31−マーをプローブとして
用いるコロニーハイブリダイゼーションにより確認し
た。幾つかの陽性にハイブリダイズするコロニーのミニ
溶解物からDNAを調整し、適当な制限消化を行うことと
により造成物の正確な性質を検証した。所望の変化を起
こしたその様な一つのプラスミドをph・t PAΔSca Iと
称する。

実施例2:u−PA/t−PAハイブリッド分子の造成；プラス
ミドpUNC・tc（第７図参照） この造成はｕ−PAの非触媒作用ドメイン（５′非コー
ド化領域、シグナル、成長因子及びクリングル配列を含
有する）とヒトｔ−PAの触媒作用即ち酵素ドメイン間の
ハイブリッドである。

ウロキナーゼcDNAをヒトHep3細胞から得られるmRNAか
ら調製した［T.Maniatis et al.,Molecular Cloning（1
982）,p.188−246参照］。ｕ−PA cDNA1.3kb Sma I−Ba
mHI断面及び1kb BamHI−EcoRI断片をpUN121のSma I、Ec
oRI部位中にクローン化し［B.Nilsson et al.,Nucl.Aci
ds Res.11,8019−8030（1983）］、プラスミドpcUK176
を得た。ヒトｕ−PA cDNAインサートの制限酵素地図を
第４図に示す。ｕ−PAインサートのヌクレオチド配列及
び推定アミノ酸配列を第３図に示す。

プラスミドpcUK176をXma I（第４図参照、Xma IはSma
Iのアイソジゾマーである）及びMst Iで消化し、521bp
断片を単離した。制限酵素Mst IはDNA配列 （矢印は切断部位を示す）を認識し、消化時に平滑末端
を生成する。この酵素は従ってｕ−PA cDNAをヌクレオ
チド520−525において、即ち最後のシスティン残基（ア
ミノ酸残基131）直後のクリングルよりなるところで切
断し［Holmes et al.,Biotechnology３,923−929（198
5）］、従って非触媒作用ドメイン及び触媒ドメインの
ためのコード配列を明確に分離する。

プラスミドph・tPAΔSca IをSca I及びHind III（Hin
d IIIはベクター中に存在する）で消化し、1.8kb断片を
回収した。制限酵素Sca IはDNA配列 （矢印は切断部位を示す）を認識し、又消化時に平滑末
端を生ずる。Sca Iはph・tPAΔSca I DNAをセリン残基2
62の後で切断する〔クリングル２の最後のシスティンを
過ぎた１アミノ酸;Pennica et al.,Nature301,214−221
（1983）〕、従って、非触媒作用ドメイン及び触媒作用
ドメインを分離する。

これらの二つの断片を混合し、Xma I、Hind III切断p
UC18ベクターDNAに連結した。E.coli HB101の形質転換
後、正しいインサートを有するコロニーをヒトｔ−PAの
2.0kbBgl II断片（第２図参照）をプローブとして用い
るコロニーハイブリダイゼーションにより確認した〔こ
のプローブはランダムプライミング法により標識化され
た:Feinberg et al.,Analyt.Biochem.132,6−13（198
3）〕。ｕ−PA及びｔ−PA断片の連結部におけるDNA配列
はDNA配列分析により検証された。一つの正しいクロー
ンをpUNC・tcと命名する。

実施例3:t−PA/u−PAハイブリッド分子の造成；プラス
ミドptNC・UC（第８図参照） この造成物は、ph・tPAΔSca Iの非触媒作用ドメイン
（５′非コード化領域、リーダー、フィンガー、成長因
子、クリングル１及びクリングル２ドメインを含有す
る）がヒトｕ−PAの触媒作用ドメインに融合している点
において正にpUNC・tcの逆である。プラスミドph・tPA
ΔSca IをSac I及びSca I（第８図参照）で消化し、約
1.0kb断片を単離した。プラスミドpcUK176を先ずBamHI
で消化し、次いでMst Iで部分的に切断し、約800bpの断
片を回収した。次いでBamHI消化物をEcoRIで切断し、約
1.0kbの断片を単離した。これらの三つの断片をSac I、
EcoRIで消化されたpUC19ベクターと混合し、連結した。
E.coli HB101をこの連結ミックスで形質転換し、正しい
インサートを有するコロニーを上記と同一の2.0kb Bgl
IIを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより確認
した。ｔ−PA及びｕ−PA DNAの連結部におけるDNA配列
はDNA配列分析により検証した。一つの正しいクローン
をptNC・UCと称する。

実施例4:哺乳動物細胞用の発現ベクターの造成 Ａ）ｔ−PAcDNAにおけるHgiAI部位のHind III部位への
転換 これは五工程により達成される（第９図）。

プラスミドpW349F（コーロッパ特許出願143,081号明
細書）を、プラスミドの二次的切断を抑制するために10
μg/mlのエチジウムブロマイドを補給された以外は製造
元（Bethesda Research Laboratories）により推薦され
た緩衝液中において、12U/mlの酵素により37℃で１時
間、20μg/ml DNAのインキュベーションにより制限酵素
HgiA Iで部分的に切断した。線形化されたプラスミドDN
Aを次いでTBE緩衝液（TBE:1mM EDTAを含有する89mM Tri
sホウ酸塩、pH8.9）中の0.8％アガロースゲルにかけ、
同一緩衝液内で電気泳動的に溶出させ、フェノールで２
回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、最後に0.1容の3
M酢酸ナトリウム（pH5.2）を添加後に−20℃でアクコー
ルで沈澱させた。ペレット化されたDNAを0.2mg/mlでTE
（TE:10mM Tris−HCl pH7.2及び0.1mM EDTA）中におい
て溶解した。

63μの線形化されたDNAを次いでリガーゼ緩衝液〔3
3mM Tria−酢酸塩（pH7.9）、66mM酢酸カリウム、10mM
酢酸マグネシウム、0.5mMジチオスレイトール及び0.1mg
/mlウシ血清アルブミン〕中15UのT4DNAポリメラーゼで3
7℃において30分間インキュベート後60℃において10分
間加熱することにより酵素を不活性化した。このインキ
ュベーションの目的はT4ポリメラーゼのエキソヌクレオ
チド分解活性を用いてHgiA Iで消化後残された突出する
４個のヌクレオチドを除去して平滑末端DNA分子を得る
ことである。

Hind IIIリンカー（CAAGCTTG）をブランド（平滑）末
端DNAに連結するために６μ（300ng）のキナーゼ化リ
ンカーを４μの10mM ATP及び３μのT4DNAリガーゼ
（New England Biolabs,400u/μ）と共に上記溶液に
添加した後16℃で16時間インキュベートした。混合物を
68℃で10分間加熱することにより停止し連結をその後DN
AをHind III及びBgl IIで消化した。即ち、15μ（135
U）Hind IIIを1.5μ4M NaCl、0.2μ1M MgCl₂及び11
μ1mg/mlウシ血清アルブミンと共に添加し、１時間37
℃でインキュベート後40U Bgl IIを添加して更に37℃で
１時間インキュベートした。得られた177塩基対の断片
をTBE中で６％ポリアクリルアミドゲル上において精製
し、TNE（TNE:100mM NaCl及び1mM EDTAを含有する10mM
Tris−HCl、pH8.8）中で溶出し、DEAEセルロース（What
man DE52）に吸着させ、TNE中1M NaClで溶出し、４容の
水で稀釈し、2.5容のエタノール添加後−20℃で沈澱さ
せ最後に17μTE（TE:1mM EDTAを含有する10mM Tris−
HCl、pH8.0）中に溶解した。

プラスミドpRSVneoは、SV40−由来Pvu II−Hind III
断片が、pRSVcatがpSV2catから造成されれた〔C.M.Gorm
an et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,6777−6781（198
2）〕と同様にして、ラウス肉腫ウイルスからのLTRプロ
モーターを含有するPvu II−Hind IIIで置換されたプラ
スミドpSV2neoの誘導体である〔P.J.Southern and P.Be
rg,J.Mol.Appl.Genet.１,327−341（1982）〕。５μｇ
のこのプラスミドを製造元の指示事項に従って24U Bgl
IIで50μ容量に切断した。37℃で１時間インキュベー
ション後40U Hind IIIを添加し、インキュベーションを
1.5時間継続し、その後大きい5.4kb断片を上記の如く精
製した。

17μの精製177bp断片を２μ（20ng）のpRSVneo断
片と、0.25μ（100U）T4リガーゼを用いて全容量22μ
リガーゼ緩衝液中において16℃で18時間連結させ、そ
の後プラスミドDNAを用いて、D.Hanahan〔J.Mol.Biol.1
66,557−580（1983）〕に従ってE.coliを形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性菌株から、制限分析によ
り証明された177kb Hind III−Bgl II断片を有するptPA
Lと称するプラスミドを含有するものが選択された。0.1
μｇのプラスミドを製造者により推薦されるように16U
Bal IIで60μ中において37℃で1.5時間切断した。こ
の溶液に次いで20Uの仔ウシ腸アルカリホスファターゼ
（Boehringer Mannheim）を添加し、インキュベーショ
ンを30分間継続し、その後DNAを２度フェノール、２度
クロロホルムで抽出し、0.1容の3.0M酢酸ナトリウム（p
H5.2）及び0.6容のイソプロパノールを添加後沈澱さ
せ、TEに溶解し、更に上記の如くアガロースゲル電気泳
動により精製し、フェノールで２度、クロロホルムで２
度抽出し、2.5容のエタノール及び0.1容の3M酢酸ナトリ
ウム（pH5.2）を添加後−20℃で沈澱させ、最後に30μ
TEに溶解した。次いで2.1kb tPA Bgl II断片を、20U
Bgl IIを用いて25μ反応溶液中において37℃において
２時間５μｇのpW349Fから切出し、0.8％アガロースゲ
ル上で精製し、上記の如く電気泳動的に溶出させ、フェ
ノールで２度、クロロホルムで２度抽出し、2.5容のエ
タノール及び0.1容の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を添加
後、−20℃で沈澱させ、そして8ng/μの濃度でTE中に
溶解した。１μのこのｔ−PA断片を次いで10μの反
応液中において100U T4リガーゼ（Biolabs）を用いて16
℃において17時間7.5ng Bgl II切断ベクターDNAに連結
させ、引続いてE.coli中に形質転換させた。pD02と命名
された得られたクローンの一つは、プラスミドがヒトｔ
−PAの連続的オープンリーディングフレームを含有する
ように挿入されたｔ−PA Bgl II断片を含有する。

Ｂ）ｔ−PAcDNAとベータグロビン断片との結合 プラスミドpD101（第10図）を、次の３個のDNA断片を
共連結することにより造成した：（ｉ）全ｔ−PAコード
配列を含有するHind III部位で開始し、Bgl II部位で終
了する2.1kb断片を、Bgl IIで部分的に及びHind IIIで
完全に切断した10μｇのpD02DNAを負荷したアガロース
ゲルから単離した。（ii）pUBは、プラスミドpUC9〔J.V
ieira and J.Messing.Gene19,259−268（1982）；同19,
269−276（1982）〕のBamHI部位中にBal II部分消化物
としてサブクローン化されたウサギベータグロビン遺伝
子を含有するプラスミドである〔A.Van Ooyen et al.,S
cience206,337（1979）〕。このプラスミドから第２イ
ントロン及びポリアデニル化部位を含有する1.2kb BamH
I−Hind III断片を切出し、アガロースゲル電気泳動に
より精製した。（iii）ベクターpD01は、複製の起点を
含むpBR322のHind III−Acc I断片のHind III部位（第1
0図）から左過りの順序で、合成Xba I部位で終了するヒ
トサイトメガロウィルス（HCMV）のエンハンサを含有す
る0.3kb断片合成Hind III部位において終了する相同プ
ロモーターに付着したこのエンハンサーの第２番目のコ
ピーから構成されている。このベクターDNAをHind III
で切断し、6.3kb線状プラスミドをアガロースゲル電気
泳動により精製した。

Ｃ）tPA/グロビン組合せのpSP62Pst33中への挿入（第11
図参照） pSP62Pst33（第11図）は、ウィルスの即時初期（IE）
プロモーターを含むマウスサイトメガロウィルス（MCM
V）DNAの2.1kb Pst I断片を、図示したプラスミドpSP62
（Boehringer Mannheim）のPst I部位に挿入して含有す
るプラスミドである。pSP62Pst33のこのHind III部位中
にはpD010からのHind III部位が挿入される。ｔ−PAコ
ード配列がMCMV IEプロモーターからの「センス」方向
に転写されることができるように挿入されているプラス
ミドpCGA26が選択される。

Ｄ）MCMV/tPA/グロビンユニットのpFASV2911neo中への
挿入（第12図参照） プラスミドpSV2911neo〔F.Asselbergs et al.,J.Mol.
Biol,189,401−411（1986）〕はSV40発現カセット内に
トランスポソンTN5からのネオマイシン（neo）ホスホト
ランスフェラーゼを含有する（第12図）。即ち、それは
哺乳動物組織培養細胞中に導入された際にネオマイシン
及びカナマイシンに耐性を付与する。pSV2911neoDNAをB
amHIで切断し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理
し、フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出し、ア
ルコールで沈澱され最後にTE中に溶解してクローン化の
準備をする。プラスミドpCGA26は、MCMVエンハンサー／
プロモーター領域中の位置345における配列GT/ACAC〔K.
Doersch−Haessler et al.,Proc.Nacl.Acad.Sci.USA82,
8325−8329（1985）〕及びグロビン部分の後の配列GT/C
GAC（又Sal Iで切断することもできる）を切断する制限
酵素Acc Iで切断される。切断後に生ずるこの二つの塩
基突出部をE.coli（大断片）DNAポリメラーゼＩにより
フィルインし、この平滑化された末端をBamHIリンカー
（CGGATCCG）に連結し、これらをBamHI酵素で切断す
る。このBamHI末端を有するMCMV/tPA/グロビンを担持す
る3.8kb断片をアガロースゲルにより精製し、次いで上
記の如く調製したpSV2911neoDNAに連結して発現プラス
ミドpCGA28を得た。

Ｅ）pCGA28から得られる発現ベクター pCGA48は、neoコード配列（Bgl II部位及びSam I部位
間）がハイグロマイシン耐性遺伝子のコード配列により
置換されたpCGA28の誘導体である。これは、プラスミド
pSV2911neoをその非反復Sam I部位において切断し、Bgl
IIリンカー（CAGATCTG）をDNAに連結後Bgl IIで切断す
ることにより達成される（第13図）。得られたベクター
マイナスneoコード化配列よりなる大DNA断片をアガロー
スゲル上で精製し、同様にアガロースゲルで精製された
プラスミドpLG89〔L.Gritz et al.,Gene25,179−188（1
983）〕からの小BamHI断片に連結し、ハイグロマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子をセンス及びアンチセ
ンス方向にそれぞれ含有する。プラスミドpCGA25c及びp
CGA25dに導いた。標準条件においてCHO DUKXBI細胞中に
トランスフェクションした際に（実施例16参照）、pCGA
25cは、ハイグロマイシン耐性をコードしないプラスミ
ド例えばpCGA28を含有するCHO細胞を殺す濃度の0.2μg/
mlハイグロマイシンＢに耐性の60コロニー／μgDNAを与
える。pCGA25c中で、ハイグロマイシン−Ｂ耐性をコー
ドする配列はE.coli中においてそれらがTn5プロモータ
ー（トランスポソンTn5においてカナマイシン耐性遺伝
子を転写する）から転写されるように配置されている。
このように、E.coli DHI細菌の一夜培養物すなわち飽和
培養物（50mg/アンピシリン選択下に生育）0.05mlを
接種された40mg/ハイグロマシン−Ｂを含有するLuria
ブロス（LB）の2.5ml培養液は37℃における３時間の通
気培養後に少なくとも10倍高い細菌密度に到達し、次い
でE.coli中で機能するハイグロマイシン遺伝子を含有し
ないプラスミド例えばpCGA25d、pCGA28或いはpAT153を
有する細菌〔A.J.Twing et al.,Nature283,216−218（1
980）〕を試験した。動物組織培養細胞及びE.coliの両
者におけるハイグロマイシン−Ｂ耐性の機能性はプラス
ミドpCGA25c及びその誘導体の使用を極めて容易にす
る。次いで、プラスミドpCGA42を、MCMV/t−PA/ベータ
ーグロビンカセットを含有するpCGA28からのBamHI断片
をpCGA25c中に挿入することにより造成した。その使用
はゲネティシン耐性に形質転換することのできない或い
は既にゲネティシン耐性である細胞中にｔ−PA発現遺伝
子を転移するためである。又、pCGA42は、E.coliにおい
てこのハイグロマイシン遺伝子を発現することができ、
pCGA42を含有するE.coli DHIを、上記の如く試験された
際に例えばpCGA28を含有するE.coliよりも少なくとも10
倍より高い密度に成長させる。

プラスミドpCGA28は２個のSac I部位を有し、一つは
元々MCMVプロモーターの直ぐ後のリンカーの一部であ
り、他方はｔ−PA cDNA中にあるものである。これらのS
ac I部位間の配列は、先ず制限酵素で切断し、大断片を
アガロースゲルにより精製し、そしてこの線状DNAをDNA
リガーゼを用いて環化させてプラスミドpCGA44（第12
図）を形成することにより削除される。pCGA44のこの様
に唯一のものとなったSac I部位中へ適当な方向でクロ
ーン化された任意のcDNAは、pCGA28中のｔ−PAコード配
列を有効に置換し、そして効率的に発現される。

pCGA42dは、1.4kb Sac I断片を削除することによりpC
GA42から得られる（第13図参照）。この様に唯一のもの
となったSac I部位にはｔ−PA以外のcDNAを挿入するこ
とができ、組織培養細胞中で高割合で発現することがで
きる。

実施例5:u−PA,t−PA及びハイブリッドPA cDNAの発現ベ
クターpCGA28中への挿入 Ａ）ｔ−PA cDNAの挿入（第15図参照） この造成において、プラスミドph・tPA△Sca Iからの
ｔ−PA cDNA断片がpCGA28に挿入された。この造成はSca
I部位の再構成時に偶然に生じるかもしれないなんらか
の変化のための対照として働くように必要であるものと
思われる。この1.4kb Sac I断片はSca I消化後にプラス
ミドph.tPA△Sca Iから回収された。この発現ベクターp
CGA28はSac Iで切断され、8.2kbベクター断片が単離さ
れ、そして0.1mM Tris pH8.0、0.1％SDS及び0.02単位の
細菌アルカリ性ホスファターゼを含有する100μ反応
液中において脱ホスホリル化される。60℃において30分
間のインキュベーション後、反応液を２回フェノール及
びエーテルで抽出し、次いでエタノール沈澱させる。ペ
レットを水に溶解し、そのアリコートをph.tPA Sca Iか
らの1.4kb Sac I断片との連結に用いた。この連結ミッ
クスを用いてE.coliHB101を形質転換させそしてアンピ
シリン−耐性コロニーから造成されたミニ細胞溶解物DN
Aを適当な制限酵素で消化してSac Iインサートが所望方
向にあるかどうかを検証した。所望方向を有するプラス
ミドをpBR1Aと称する。反対方向にあるSac I断片を有す
るプラスミドをpBR1Bと称する。

Ｂ）ハイブリッドUPA^ATPA^BcDNAの挿入（第16図参照） この造成においては、プラスミドpUNC.tcからのハイ
ブリッドUPA^ATPA^BcDNA断片を発現ベクターpCGA28に挿入
した。pUNC.tcDNAをSma I（第７図参照）で消化し、1.2
4kb断片を単離し、そしてSac I消化、脱ホスホリル化8.
2kb pCGA28ベクターDNAに連結した。E.coli HB101細胞
を連結ミックスで形転換し、Sac Iインサートを所望方
向に含有するコロニーをミニ細胞溶解物DNA上で制限消
化を行うことにより確認した。所望方向にpUNC.tcDNAイ
ンサートを有するプラスミドをpBR2Aと命名し、そして
反対方向のものをpBR2Bと命名する。

Ｃ）ｕ−PA cDNAの挿入（第17図参照） この造成において、ヒトｕ−PA DNAを発現ベクターpC
GA28中に挿入した。pBR1と共にこのプラスミドは親プラ
スミド対照として働き、pCGA28−タイプベクターの有用
性が確認された。プラスミドpcUK176をSma I、及びAha
III（第４図参照）で消化し、2.25kb断片を単離し、上
記の如くホスホリル化Sac Iリンカーに連結した。Sac I
消化後、2.25kb断片を回収し、Sac I消化、脱ホスホリ
ル化8.2kb pCGA28DNA断片に連結した。E.coli HB101を
形質転換し、制限酵素でミニ細胞溶解物DNAを消化する
ことにより所望プラスミドを有するコロニーを確認し
た。正しい方向にヒトｕ−PA DNAを有するプラスミドを
pBR23Aと命名し、そして反対方向のものをpBR3Bと命名
する。

Ｄ）ハイブリッドTPA^AUPA^BcDNA（第18図）の挿入 茲で、プラスミドptNC.UCからのハイブリッドTPA^AUPA
^BcDNAを発現ベクターpCGA28中に挿入した。2.75kb Sma
I（ベクター中に存在）−Aha III断片をptNC.UC DNAか
ら単離し、ホスホリル化Sac Iリンカーに連結し、リン
カー連結2.75kb断片を回収し、Sac I消化、脱ホスホリ
ル化ベクターDNAに連結し、そして所望コロニーを上記
の如く確認した。正しい方向にptNC.UC DNAインサート
を有するプラスミドをpBR4Aと称する。

実施例6:PH05プロモーター、インベルターゼシグナル配
列及びｔ−PAコード領域を含有する酵母発現ベクターの
造成 Ａ）インベルターゼシグナル配列のためのオリゴデオキ
シヌクレオチドの合成 四つのオリゴデオキシリポヌクレオチド:I−１、Ｉ−
２、Ｉ−３、Ｉ−４をDNAシンセサイザー（モデル380BA
pplied Biosystems）により合成した。脱保護後、合成
断片を8M尿素を含有する12％ポリアクリルアミドゲル上
で精製した。塩のない純粋オリゴデオキシリボヌクルオ
チドをSep.Pak（Waters Associates）を用いて得た。こ
れらの断片は、しばしば用いられる酵母コドンを有する
インベルターゼシグナル配列をコードする二本鎖を構成
する。

Ｂ）インベルターゼシグナル配列のプラスミドp31にお
けるサブクローン化 ａ）ベクターの調製 1.5μｇのp31R/SS−TPA2（ヨーロッパ特許出願143,08
1号明細書）を50μの10mM Tris・HCl pH7.5、6mM MgC
l₂、100mM NaCl、6mMメルカプトエタノール中において1
0UのEcoRI（Boehringer）で37℃において１時間消化し
た。１μの2.5M NaClの添加後、10UのXho I（Boehrin
ger）を添加し、37℃で１時間インキュベートした。4.2
kbベクターを0.8％調製アガロースゲル上で単離した。
このゲルスライスをMicro Colloidorチューブ（Sartori
us GmbH）に移し、200μのTEで被覆し、及び電気溶出
させた（90mMで50分間電気泳動）。このTE溶液を集め、
0.1容の10×TNEの添加後2.5容の無水エタノール中で沈
澱させた。DNAペレットを冷80％エタノールで洗浄し、
真空乾燥させた。このDNAを６μTE（40pモル／μ）
中に再懸濁させた。

ｂ）オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ−１、Ｉ−
２、Ｉ−３、Ｉ−４）のアニーリング、リン酸化及びベ
クターとの連結 これらの四つのデオキシリボヌクレオチドの各10pモ
ルを10μの0.5M Tris・HCl pH8中に含有する溶液を水
浴上で５分間95℃でインキュベートした。この水浴を30
℃でゆっくり５時間に亘って冷却した。このアニーリン
グされた混合物に各２μの0.1M MgCl₂、0.1M NaCl、3
0mM DTT、4mM ATP及び8U（１μ）のポリヌクレオチド
キナーゼ（Boehringer）を添加した。リン酸化は37℃で
１時間行った。このアニーリングされた、リン酸化オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド及び60pモルのp31R/SS−TP
A2切断ベクター（1.5μ）を400U（１μ）のT4DNAリ
ガーゼ（Biolabs）で14℃において17時間連結させた。6
5℃で10分間インキュベートして反応を停止させた。10
μのこの連結混合物を用いてE.coli HB101Ca⁺⁺細胞
〔M.Dagert and S.D.Ehrlich,Gene56、23−28（197
9）〕を形質転換させた。20amp^Rコロニーを拾い上げ
た。DNAを迅速単離法により調製した（D.S.Holmes and
M.Quigley.Anal.Biochem.114,193−197（1981）〕。

DNAをEcoRI及びXho Iで消化し、EcoRI末端おいて放射
線標識し、放射線標識pBR322Hae III切断DNAをマーカー
として用いて8M尿素を含有する６％ポリアクリルアミド
ゲル上で分析した。正しい大きさのバンドが20クローン
全てから得られたDNAについて観察された。一つのクロ
ーンを100μg/mlのアンピシリンを含有する100mlLB培地
中において生育させた。プラスミドDNAを単離し、p31RI
T−12と称する。

Ｃ）pJDB207/PH05−Ｉ−TPAの造成（第19図参照） ａ）ベクターの調製 ３μｇのpJDB207/PH05−TPA18（ヨーロッパ特許出願1
43,081号明細書）を10UのBamHIと共に50μの10mM Tri
s・HCl pH7.5、6mM Mgcl₂、100mM NaCl、6mMメルカプト
エタノール中において37℃で１時間インキュベートし
た。TBE緩衝液中において１％アガロースゲル上でアリ
コートをチェックして完全な消化を確認した。この消化
物を65℃で10分間インキュベートした。次いで0.5μ
の5M NaClを添加した後15UのXho I（Boehringer）を添
加した。これを37℃で１時間インキュベートした。6.8k
bベクターを0.8％調製用アガロースゲル上で単離した。
DNAを電気溶出により抽出し、沈澱後TE中に溶解した。

ｂ）p31/PH05−TPA18のXho I消化 30μｇのp31/PH05−TPA18（ヨーロッパ特許出願143,0
81号明細書）を60UのXho I（15U/μ）と共に200μ
の10mM Tris・HCl pH8、6mM MgCl₂、150mM NaCl、6mMメ
ルカプトエタノール中で37℃において１時間インキュベ
ートし、等容量のフェノール−クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール中で沈澱させた。

ｃ）Xho I切断p31/PH05−TPA18の部分的Pat I消化 沈澱したXho I切断p31/PH05−TPA18DNAを250μの10
mM Tris・HCl pH7.5、6mM MgCl₂、50mM NaCl、6mMメル
カプトエタノール、2.5mgエチジウムブロマイド中に再
懸濁させ、22.5UのPst Iと共に37℃で35分間インキュベ
ートし、等モル容量のフェノールで抽出した後、等容量
のクロロホルム−イソアミルアルコール（50:1）で抽出
した。1.6kb断片を１％調製用アガロースゲル上で単離
した。DNAを電気溶出により抽出し、沈澱させた〔イン
サート１〕。

ｄ）p31RIT−12のSal I−Xho I消化 30μｇのp31RIT−12を60UのSal I（Boehringer12U/μ
）及び60UのXho I（15U/μ）と共に200μの10mM
Tris・HCl pH8、6mM MgCl₂、150mM NaCl、6mMメルカプ
トエタノール中で37℃で１時間インキュベートし、等容
量のフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール中
で沈澱させた。869bp断片を1.2％調製アガロースゲル上
で単離した。DNAを電気溶出により抽出し、DE−52上で
脱塩し、エタノール中で沈澱させた。

ｅ）Sal I−Xho I切断p31RIT−12のHga I消化 Sal I−Xho I切断p31RIT−12を100μの6mM Tris・H
Cl pH7.5、10mM MgCl₂、50mM NaCl、1mMジチオスレイト
ール、10mgウシ血清アルブミン中に再懸濁させ、6UのHg
a I（Biolabs、0.5U/μ）と共に37℃で１時間インキ
ュベートした。600bp断片を1.2％アガロースゲル上で単
離した。このDNAを電気溶出により抽出し、エタノール
中で沈澱させた。

ｆ）リンカーオリゴヌクレオチドのアニーリング 90pモルの下記配列を有する二つのオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをシリコーン処理をしたEppendolf管中
において10μの0.5mM Tris・HCl pH8内に懸濁させ
た： この溶液を95℃で５分間インキュベートし、次いで一
昼夜ゆっくり室温まで冷却した。

ｇ）リンカーのリン酸化 上記溶液に２μの0.1M KCl、２μの0.1M MgCl₂、
３μの30mM DTT、１μの200mM ATP、8Uのポリヌク
レオチド（8U/μ）を添加した。これを37℃で１時間
インキュベートした。

ｈ）p31RIT−12からのHga I断片のキナーゼ処理された
リンカーとの連結 キナーゼ処理されたリンカー溶液を乾燥Hga I断片を
含有する管を移し、次いで400UのT4DNAリガーゼを添加
した。この溶液を室温（21〜22℃）で90分間インキュベ
ートし、TEで100μに稀釈し、等容量のフェノール−
クロロホルムで抽出した。0.6容のイソプロパノール及
び0.1容の3M酢酸ナトリウムを室温においてこの水溶液
に添加することにより断片を沈澱させた。

ｉ）上記断片のBamHI−Pat I消化 上記乾燥DNAを10UのBamHI及び10UのPst Iにより20μ
の10mM Tris・HCl pH7.5、100mM MgCl₂、6mMメルカプ
トエタノール中で37℃で１時間消化した。100μに稀
釈後、溶液を等容量のフェノール−クロロホルムで抽出
し、水層をイソプロパノール中で沈澱させた〔インサー
ト２〕。

ｊ）三つの断片の連結 100fモルのpJDB207/PH05−TPA18BamHI−Xho I切断ベ
クター断片、200fモルのその他の二つのインサート断片
〔１及び２〕の各々を10μの50mM Tris・HCl pH7.5、
10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.5μｇゼラチン中に
おいて400UのT4DNAリガーゼで15℃で16時間連結した。6
5℃で10分間インキュベーションすることにより反応を
停止した。５μのこの連結混合物を用いてE.coli HB1
01Ca⁺⁺細胞を形質転換した。10amp^Rコロニーを拾い上
げ、DNAを迅速単離法により調製した。

EcoRI、Pst I及びBamHI−Hind IIIで分析して正しい
大きさの断片を観察した。一つのクローンを100mlの100
μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で生育させ
た。プラスミドDNAを単離し、pJDB207/PH05−Ｉ−TPAと
称する。

実施例7:u−PAコード化領域を含んでなるプラスミドpCS
16/UPAの造成 Ａ）プラスミドpC16の造成（第20図参照） ファージラムダのcI遺伝子及びテトラサイクリン耐性
遺伝子の部分を含んでなるプラスミドpUN121の1.5kb Ps
t I−BamHI断片〔B.Nilsson et al.,Nucl.Acids Res.1
1,8019−8030（1983）〕をpUC18〔J.Norrander et al.,
Gene26,101−106（1983）〕中にクローン化し、Pst I及
びBamHIで切断した。得られたクローンをPst Iで消化し
た。３′突出末端をT4DNAポリメラーゼを用いる反応で
除去し、そしてXho Iリンカーを平滑末端に連結した。X
ho Iで消化後、分子を連結により再環化した。連結混合
物のアリコートを用いてCa⁺⁺処理E.coli HB101細胞を形
質転換した。個々のアンピシリン耐性、形質転換コロニ
ーのDNAを分析した。幾つかの正しいコロニーの一つを
選びpCS16と称する。

Ｂ）プラスミドpCS16/UPAの造成（第21図参照） プラスミドpcUK176（実施例２参照）内に含まれるウ
ロキナーゼcDNAをプラスミドpCS16中においてサブクロ
ーン化した。このサブクローン化cDNAは５′非翻訳領域
（第４図）中のSma I部位から３′非翻訳領域中のヌク
レオチド位置1439−1444（第３図による付番）における
Pvu II部位に延びる。

15μｇのプラスミドpcUK176をPvu IIで消化した。379
bp Pvu II断片をTris−ホウ酸塩−EDTA緩衝液（pH8.3）
中において1.5％アガロースゲル上で他の断片から単離
した。このDNAを電気溶出し、DE52（Whatman）イオン交
換クロマトグラフィにより精製し、そしてエタノールで
沈澱させた。1.2μｇの一本鎖Xho Iリンカー（５′−CC
TCGAGG−３′）をそれらの５′末端でホスホリル化し、
75℃で10分間加熱し、室温までの冷却時に自己アニーリ
ングし、−20℃で貯蔵した。0.9μｇのキナーゼ処理さ
れた、二本鎖Xho Iリンカーを80−倍モル過剰でpcUK176
（上記参照）の379bp Pvu II断片の平滑末端に、20μ
の60mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5mM DTT、3.5mM
ATP及び400単位のT4DNAリガーゼ（Biolabs）中で15℃
で16時間連結した。この混合物を85℃で10分間加熱し
た。過剰リンカー分子を0.54容のイソプロパノールで10
mM EDTA及び300mMの酢酸ナトリウムpH6.0の存在下にお
いて室温で30分間沈澱させて、除去した。DNAをXho I及
びBamHIで消化した。121bp BamHI−Xho I断片をTris−
ホウ酸塩−EDTA緩衝液（pH8.3）中1.5％アガロースゲル
上で単離した。６μｇのプラスミドpcUK176をSma I及び
BamHIで消化した。ｕ−PAコード配列の殆んどを含んで
なる1.3kb Sma I−BamHI断片を単離した。６μｇのプラ
スミドpCS16をSma I及びXho Iで消化した。2.7kbベクタ
ー断片を単離した。DNA断片をゲルから電気溶出し、エ
タノール沈澱させた。0.2pモルの1.3kb Sma I−BamHI断
片、0.2pモルの121bp BamHI−Xho I断片（両者の断片は
一緒になって全ｕ−PAコード化配列を含む）及び0.1pモ
ルの2.7kbベクター断片を10μの60mM Tris・HCl pH7.
5、10mM MgCl₂、5mM DTT、3.5mM ATP及び400単位のT4DN
Aリガーゼ中で15℃において連結した。連結混合物の１
μ及び３μのアリコートを100μのCa⁺⁺処理E.col
i HB101細胞に添加した。形質転換は記載されているよ
うに行われた〔A.Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA75,1929（1978）〕。12個のアンピシリン耐性コロニ
ーを100mg/アンピシリンを含有するLB培地中で生育さ
せた。DNAをHolmes等〔Anal.Biochem.114,193（198
1）〕に従って単離し、EcoRI、Pvu II及びXho I制限消
化により分析した。期待された制限断片を有する一つの
クローンをpCS16/UPAと称する。

実施例8:プラスミドpJDB207/PH05−Ｉ−UPAの造成（第2
2図） pJDB207/PH05−Ｉ−UPAは、PH05プロモーター、イン
ベルターゼシグナル配列、成熟ウロキナーゼのコード配
列及びPH05転写ターミネーターをタンデム列でpJDB207
酵母発現ベクターにクローン化して含有する。

20μｇのプラスミドpCS16/UPAを40単位のEcoRIで完全
に消化した。フェノール抽出及びエタノール沈澱後、Ec
oRI消化DNAを更にTaq Iにより65℃で切断した。得られ
た断片を調製用1.2％アガロースゲル上で分離した。462
bp Taq I−EcoRI断片をゲルからの電気溶出及びエタノ
ール沈澱により単離した。

次式 （Ｉ）５′−CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT−３′ （II）３′TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC−５′ を有するオリゴデスオキシリボヌクレオチドリンカーを
DNA断片のTaq I部位に連結した。このリンカーは成熟ｕ
−PAのコード配列（ヌクレオチド130−154、第３図）の
５′末端を回復し、インベルターゼシグナル配列とのイ
ンフレーム融合を確立する。このリンカーの５′−CTGC
A配列はHga I切断により創出されるインベルターゼシグ
ナル配列の対応する３′陥凹末端を充たす。

各々300pモルのオリゴデスオキシヌクレオチドＩ及び
IIをホスホリル化し、アニーリングした。5.25μｇ（60
0pモル）のホスホリル化、二本鎖リンカーDNAを1.7μｇ
（5.6pモル）の462bp Taq I−EcoRI断片（上記参照）と
175μの60mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、1mM AT
P、5mM DTT及び800単位のT4DNAリガーゼ中において15℃
で16時間連結した。T4DNAリガーゼを85℃で10分間不活
性化させた。過剰のリンカーを10mM EDTA、300mM酢酸ナ
トリウムpH6.0及び0.54容のイソプロパノール中におい
て沈澱させて除去した。このDNAをPst Iで消化した。ｕ
−PAをヌクレオチド436までコードするDNA配列（Pst I
部位、第３図参照）に結合したリンカーを含有するユニ
ーリ312bp断片を単離した。このDNA断片を電気溶出及び
エタノールによる沈澱で精製した。

プラスミドpCS16/UPAをXho I及びPst Iで消化した。1
007bp Pst I−Xho I断片を単離し、精製した。この断片
はウロキナーゼのコード配列の殆んどを含有する。

プラスミドp31RIT−12（実施例６参照）をSal I及びX
ho Iで消化した。882bp Sal I−Xho I断片を電気溶出及
びエタノール沈澱によりゲルから単離した。この断片を
更にBamHI及びHga Iで消化した。PH05プロモーター領域
及びインベルターゼシグナル配列を含有する591bp BamH
I−Hga I断片を単離した。

プラスミドpJDB207/PH05−TPA18（ヨーロッパ特許出
願143,081号明細書参照）をBamHI及びXho Iで消化し
た。6.8kbベクター断片をTris−酢酸緩衝液pH8.2中調製
0.6％アガロースゲル上で単離した。このDNAを電気溶出
し、エタノールで沈澱させた。

全てのDNA断片を0.1pモル／μの濃度で水中に再懸
濁した。0.2pモルの591bp BamHI−Hga I断片、0.2pモル
の312bp Hga I−Pst I断片、0.2pモルの1007bp Pst I−
Xho I断片及び0.1pモルの6.8kb BamHI−Xho Iベクター
断片を10μの50mM Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5m
M DTT、1mM ATP及び400単位のT4DNAリガーゼ中で15℃で
15時間連結した。１μの連結混合物を用いてE.coli H
B101Ca⁺⁺細胞を形質転換した。12amp^Rコロニーを拾い上
げ、100mg/のアンピシリンを含有するLB培地中におい
て生育させた。DNAは迅速単離法〔D.S.Holmes et al.,A
nal Biochem.114,193（1981）〕により調製した。この
プラスミドDNAをHind III及びEcoRIの制限消化した時に
期待された制限断片が観察された。単一クローンのプラ
スミドDNAを選択し、pJDB207/PH05−Ｉ−UPAと称する。

実施例9:t−PA A−鎖領域及びｕ−PA B−鎖を有するｔ
−PA/u−PAハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
（一次DNA造成物） ｔ−PAのＡ−鎖及び所定位置のｕ−PAのＢ−鎖をコー
ドする。DNA配列のインフレーム融合の造成のためのも
う一つの手法は次の二段階よりなる。先ず、便利なコー
ド配列を有する制限断片を連結する。DNAをE.coli中に
おいて調製し、M13中にサブクローン化して一本鎖鋳型
を得る。第二段階において、過剰ヌクレオチド配列をin
vitro突然変異誘発により除去する。ｔ−PA A−鎖及び
ｕ−PA B−鎖間の正確なインフレーム結合は活性化部位
にある。変異体DNAを酵母及び哺乳動物細胞系のための
適当な発現ベクター内でサブクローン化する。

ａ）ｔ−PA A−鎖をコードするDNA断片の単離 10μｇのプラスミドpJDB207/PH05−Ｉ−TPA（実施例
６参照）をBamHI及びPvu IIで消化した。1.7kb BamHI−
Pvu II断片をTris−ホウ酸塩−EDTA緩衝液（pH8.3）中
で0.8％アガロースゲル上で分離した。このDNA断片はPH
05プロモーター、インベルターゼシグナル配列及びPvu
II制限部位までの成熟ｔ−PAのコード配列〔第１図参
照、ヌクレオチド位置1305−1310〕を含有する。このDN
Aを電気溶出し、エタノール沈澱させ、0.1pモル／μ
の濃度でH₂O中に再懸濁させた。

ｂ）ｕ−PA B−鎖をコードするDNA断片の単離 プラスミドpCS16/UPA（実施例7B参照）をBal I（第３
図及び第４図参照、ヌクレオチド位置573−578）及びXh
o Iで消化した。この868bp Bal I−Xho I断片を上記の
如く単離し、0.1pモル／μの濃度でH₂O中に再懸濁し
た。

ｃ）断片のベクター断片への連結 プラスミドpJDB207/PH05−TPA18（ヨーロッパ特許出
願143,081号明細書）をBamHI及びXho Iで消化した。6.7
kbベクター断片をTris−酢酸緩衝液pH8.2中で0.8％アガ
ロースゲル上で単離した。このDNAを電気溶出し、エタ
ノール沈澱させ、0.1pモル／μの濃度でH₂O中に再懸
濁した。

0.2pモルの1.7kb BamHI−Pvu II断片、0.2pモルの868
bp Bal I−Xho I断片及び0.1pモルの6.7kb BamHI−Xho
Iベクター断片を10μの60mM Tris−HCl pH7.5、10mM
MgCl₂、5mM DTT、3.5mM ATP及び400単位のT4DNAリガー
ゼ（Biolabs）中で15℃で16時間連結した。この連結混
合物の１μ及び３μのアリコートを100μのCa⁺⁺
処理E.coli HB101細胞に添加した。形質転換は常法によ
り行った。

六つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニーを
100mg/アンピシリンを含有するLB培地内で生育させ
た。プラスミドDNAをHolmes et al.〔Analyt.Biochem.1
14,193（1981）〕の方法に従って調製し、BamHI及びPst
Iを用いる制限消化により分析した。期待された制限断
片を有する一つのクローンをpJDB207/PH05−Ｉ−TPA^AUP
A^Bと称する。

実施例10:u−PA A−鎖領域及びｔ−PA B−鎖を有するｕ
−PA/t−PAハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
（一次DNA造成物） 主たるハイブリッドDNA造成物は、Sca I部位（位置94
0−945）からKho Iリンカーを介して1800位に導入され
たXho I部位までのｔ−PAヌクレオチド配列に連結され
た、Sma IからEcoRI部位までのｕ−PAヌクレオチド配列
（第４図参照）を含んでなる。得られたハイブリッドDN
A配列は過剰のヌクレオチドを含有し、これはin vitro
突然変異誘発により除去される。正確なｕ−PA A−鎖及
びｔ−PA B−鎖間のインフレーム結合部は活性化部位に
ある。

ａ）ｕ−PA A−鎖をコード化するDNA断片の単離 ７μｇのプラスミドpCS16/UPAをEcoRIで消化した。得
られた三つの断片の粘着末端を7.5単位のクレノウDNAポ
リメラーゼ（BRL）を用いる60mM Tris・HCl pH7.5、10m
M MgCl₂、0.1mM dATP及び0.1mM dTTPの存在下における2
5℃での30分間のフィルイン反応により平滑末端に転換
した。反応はEDTAを12.5mMの最終濃度まで添加すること
により停止した。このDNAを更にKpn Iで消化した。619b
p kpn I−平滑〔EcoRI〕末端断片をTris−ホウ酸−EDTA
緩衝液（pH8.3）中1.5％アガロースゲル上で単離し、電
気溶出し及びエタノール沈澱させた。

ｂ）ｔ−PA B−鎖をコード化するDNA断片の単離 ６μｇのプラスミドpJDB207/PH05−TPA18をSca I及び
Xho Iで消化した。860bp断片をTris−ホウ酸EDTA緩衝液
pH8.3中1.2％アガロースゲル上で単離し、電気溶出し、
エタノール沈澱させた。

ｃ）DNA断片のpUC18誘導ベクターへの連結 ５μｇのプラスミドpCS16/UPA（実施例７参照）をKpn
I及びXho Iで消化した。得られた2.7kb断片をTris−ホ
ウ酸−EDTA緩衝液pH8.3中0.8％アガロースゲル上で単離
した。DNAを電気溶出し、エタノール沈澱させた。全て
のDNA断片を0.1pモル／μの濃度でH₂O中に再懸濁させ
た。

0.2pモルの619bp Kpn−平滑末端ｕ−PA断面、0.2pモ
ルの860bp Sca I−Xho It−PA断片及び0.1pモルの2.7kb
Kpn I−Xho Iベクター断片を上記の如く連結した（実
施例９）。Ca⁺⁺処理E.coli HB101細胞を形質転換した。
12個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーをアン
ピシリン（100mg/）を補給した培養培地内で生育させ
た。DNAはHolmes et al.（上記）に従って調製し、EcoR
I及びPst Iを用いる制限消化により分析した。期待され
た制限断片を有する単一クローンをpCS16/UPA^ATPA^Bと称
する。

実施例11:t−PAの第２クリングル及び触媒作用Ｂ−鎖を
有するｕ−PA/t−PAハイブリッドプラスミノーゲンアク
チベータ（一次造成物） ウロキナーゼ「成長因子様」（Ｕ）−ドメイン、ｔ−
PAの第２クリングルドメイン（K₂）及びｔ−PAの触媒作
用Ｂ−鎖のDNA配列を含んでなるハイブリッドプラスミ
ノーゲンアクチベータ遺伝子を次の様にして造成した。
ｕ−PA成長因子ドメイン及びｔ−PA K₂クリングル及び
Ｂ−鎖をそれぞれコード化する二つのDNA制限断片を連
結し、プラスミドpCS16中に挿入した。得られたクロー
ンをpCS16/UK₂TPA^Bと称する。ｕ−PA及びｔ−PAコード
化配列を含有する断片をM13中にサブクローン化した。i
n vitro突然変異誘発を一本鎖DNA上に行いｕ−PA及びｔ
−PA配列間の結合において過剰のDNA配列を除去した。

５μｇのプラスミドpCS16/UPAをNco I（ヌクレオチド
位置326−331、第４図参照）で消化した。この制限断片
の粘着末端を反応において５単位のクレノウDNAポリメ
ラーゼＩ（BRL）を用いて50μ中各々0.1mM dATP、dTT
P、dCTP、dGTP、60mM Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂の
存在下において室温で30分間フィルインした。反応はED
TAを12.5mMの最終濃度まで添加することにより停止し
た。このDNAをエタノール沈澱させ更にXho Iで消化し
た。3kb Xho I−平滑末端〔Nco I〕断片をTris−ホウ酸
−EDTA pH8.3中0.8％アガロースゲル上で単離し、電気
溶出しそしてエタノール沈澱させた。この断片はpCS16
ベクター及びｕ−PA成長因子ドメインのコード領域を含
有する。10μｇのプラスミドpJDB207/PH05−TPA18（ヨ
ーロッパ特許出願143,081号明細書）をBstXI〔ヌクレオ
チド位置577−588〕で消化した。３′突出末端を有する
この線状DNA断片を100μの33mM Tris−酢酸pH7.9、66
mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT及
び0.1mg/mlのウシ血清アルブミン中の10単位のT4DNAポ
リメラーゼ（BRL）で37℃において2.5分間インキュベー
トした。次いでインキュベーションを全容量200μ中
の各々0.1mMのdATP、dCTP、dTTP、dGTPの存在下におい
て37℃で35分間継続した。DNAをエタノール沈澱させ、
更にXho Iで消化した。1.2kb平滑末端〔BstXI〕−Xho I
断片を0.8％アガロースゲル上で分離し、電気溶出し、
エタノール沈澱させた。この断片はK2のコード化領域及
びｔ−PAのＢ−鎖を含有する。

0.2pモルの1.2kb t−PA断片及び0.1pモルの3kb u−PA
/ベクター断片（上記参照）を上記の如く連結した。こ
の連結混合物のアリコートを用いてコンピテントE.coli
HB101細胞を形質転換した。アンピシリン耐性コロニー
を100mg/アンピシリンを含有するLB寒天プレート上で
選択した。DNAは個々の形質転換体から調製し、Sca I及
びSma I制限消化により分析した。0.5kb Sca I及び1.55
kb Sma I結合断片を含有するクローンを選択し、pCS16/
UK₂TPA^Bと称する。

実施例12:t−PAの第２クリングル及びｕ−PAの触媒作用
Ｂ−鎖を有するｔ−PA/u−PAハイブリッドプラスミノー
ゲンアクチベータ（一次造成） ウロキナーゼ「成長因子様」（Ｕ）ドメイン、ｔ−PA
の第２クリングル（K2）及びｕ−PAの触媒作用Ｂ−鎖の
DNA配列を含んでなるハイブリッドプラスミノーゲンア
クチベータ遺伝子を実施例11で説明した方法と同様の方
法により造成した。

プラスミドpCS16/UK₂UPA^Bの造成 ５μｇのプラスミドpCS16/UPAをBgl II及びNco I（そ
れぞれヌクレオチド位置391−396及び326−331、第４図
参照）で消化した。これらの制限断片の粘着末端を上記
の如く反応においてクレノウDNAポリメラーゼＩ（BRL）
を用いてフィルインした。平滑末端を有する4.2kb DNA
断片をTris−酢酸緩衝液pH8.2中0.8％アガロースゲル上
で単離した。DNAを電気溶出し、エタノール沈澱させ
た。この断片はベクター分子に連結したｕ−PA G−領域
及びｕ−PA B−鎖を含有する。

10μｇのプラスミドp31/PH05−TPA18（ヨーロッパ特
許出願143,081号明細書）をAlu Iで消化した。ｔ−PAの
全K2ドメインを含有する447bp Alu I断片をTris−ホウ
酸EDTA緩衝液pH8.3中1.5％アガロースゲル上で単離し
た。このDNA断片を電気溶出し、エタノール沈澱させ
た。

0.2pモルの447bp断片及び0.1pモルの4.2kb断片を連結
した。この連結混合物のアリコートを用いてコンピテン
トE.coli HB101細胞を形質転換した。形質転換された細
胞を100mg/アンピシリンを有するLB寒天プレート上で
選択した。DNAをアンピシリン耐性細胞から調製し、Eco
RI及びSca I消化により分析した。551bp EcoRI断片及び
403bp Sca I断片を示す単一クローンは正しい方向に挿
入されたAlu I断片を有する。このクローンをpCS16/UK₂
UPA^Bと称する。

実施例13:主たるハイブリッドDNA造成物のM13mp18中に
おけるクローニング Ａ）pJDB207/PH05−Ｉ−TPA^AUPA^BBamHI断片のM13mp18中
におけるクローニング 迅速DNA調製から得られた1.5μｇのpJDB207/PH05−Ｉ
−TPA^AUPA^B（実施例９参照）を20μの10mM Tris・HCl
pH7.5、6mM MgCl₂、100mM NaCl、6mMメルカプトエタノ
ール中において37℃で１時間9UのBamHI（Boehringer）
で消化した。１μのRNase（Serva、1mg/ml）を添加
し、37℃で15分間インキュベートし、そしてフェノール
化後、2.5kbインサートを0.8％調製アガロースゲル上で
単離した。DNAを電気溶出により抽出し沈澱させた。

１μｇのM13mp18（RF）をBamHIで切断し、仔ウシ腸ア
ルカリホスファターゼで処理し、及び7.3kbベクター断
片を0.7％調製アガロースゲル上で単離した。DNAを電気
溶出し、沈澱させた。

100pモルのM13mp18BamHI切断ベクター及び200pモルの
BamHI TPA^AUPA^Bインサートを10μの50mM Tris・HCl p
H7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.5μｇゼラチ
ン中において400UのT4DNAリガーゼで15℃で７時間連結
した。65℃で10分間インキュベーション後、５μのこ
の連結混合物を用いてAmershamより発行されたマニュア
ル「M13 Cloning and sequencing handbook」に従って
E.coli JM101のコンピテント細胞を形質転換した。36個
の無色プラークをつゝき出し、一本鎖及び複製形（RF）
DNAを調製した。RF−DNAを分析すると、全てのクローン
はBamHI消化後に正しい大きさのインサートを示す。Eco
RI及びPst I消化後の正しい大きさの断片は全てのクロ
ーンにおけるDNAインサートが誤った方向にあることを
示した（一本鎖鋳型DNAは非コード鎖であった）。これ
らのクローンの一つをmp18/BamHI/TPA^AUPA^Bと称し、削
除突然変異誘発に用いた。

B.pCS16/UPA^ATPA^BKpn I−Hind III断片のM13mp18中にお
けるクローニング 迅速DNA調製から得られた1.5μｇのpCS16/UPA^ATPA
^B（実施例10参照）を20μの10mM Tris・HCl pH7.5、6
mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノール中において37℃で
１時間12UのKpn Iで消化した。１μの1M NaClを添加
後、DNAを12UのHind IIIで37℃で１時間消化した。1.5k
b断片を0.8％調製アガロースゲル上で単離した。DNAを
電気溶出により抽出し沈澱させた。

0.5μｇのM13mp18（RF）をKpn I及びHind IIIで消化
した。7.3kbベクター断片を0.7％調製アガロースゲル上
で単離した。DNAを電気溶出し沈澱させた。

100fモルのM13mp18Kpn I−Hind III切断ベクター及び
200fモルのKpn I−Hind IIIインサートを10μの50mM
Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.
5μｇゼラチン中において400UのT4DNAリガーゼを用いて
15℃で７時間連結した。65℃で10分間インキュベーショ
ンして反応を停止した。この連結混合物５μを用いて
E.coli JM101コンピテント細胞を形質転換した。10個の
無色プラークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（RF）DNA
を調製した。RF−DNAを分析すると、全てのクローンは
正しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片を示
した。これらのクローンの一つをmp18/Kpn I−Hind III
/UPA^ATPA^Bと称し、削除突然変異誘発に用いた。

C.pCS16/UK₂TPA^BKpn I−Hind III断片のM13mp18中にお
けるクローニング 迅速DNA調製から得られた1.5μｇのpCS16/UK₂TPA
^B（実施例11参照）を20μの10mM Tris−HCl pH7.5、6
mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノール中において37℃で
１時間、12UのKpn I（Boehringer）で消化した。１μ
の1M NaClを添加後、DNAを12UのHind IIIで37℃におい
て１時間消化した。1.5kb断片を0.8％調製アガロースゲ
ル上で単離した。DNAを電気溶出により抽出し、沈澱さ
せた。

0.5μｇのM13mp18（RF）をKpn I及びHind IIIで消化
した。7.3kbベクター断片を0.7％調製アガロースゲル上
で単離した。このDNAを電気溶出し沈澱させた。

100fモルのM13mp18Kpn I−Hind III切断ベクター及び
200fモルのKpn I−Hind IIIインサートを10μの50mM
Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.
5μｇゼラチン中で400UのT4DNAリガーゼを用いて15℃で
７時間連結した。65℃で10分間インキュベーションによ
り反応を停止した。この連結混合物５μを用いてE.co
li JM101の受容能力のある細胞を形質転換した。７つの
無色のプラークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（RF）DN
Aを調製した、RF−DNAを分析すると、全てのクローンは
正しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片を示
した。これらのクローンの一つをmp18/Kpn I−Hind III
/UK₂TPA^Bと称し、削除突然変異誘発に用いた。

D.pCS16/UK₂UPA^BKpn I−Hind III断片のM13mp18におけ
るクローニング 迅速DNA調製から得られた1.5μｇのpCS16/UK₂UPA
^B（実施例12参照）を12UのKpn Iで20μの10mM Tris−
HCl pH7.5、6mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノール中で3
7℃で１時間消化した。１μの1M NaClを添加後DNAを1
2UのHind IIIで37℃において１時間消化した。1.7kp断
片を0.8％調製アガロースゲル上で単離した。DNAを電気
溶出により抽出し、沈澱させた。

0.5μｇのM13mp18（RF）をKpn I及びHind IIIで消化
した。7.3kbベクター断片を0.7％調製アガロースゲル上
で単離した。DNAを電気溶出し沈澱させた。

100fモルのM13mp18Kpn I−Hind III切断ベクター及び
200fモルのKpn I−Hind IIIインサートを10μの50mM
Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.
5μｇゼラチン中において400UのT4DNAリガーゼを用いて
７時間15℃で連結した。65℃で10分間インキュベーショ
ンにより反応を停止した。５μのこの連結混合物を用
いてE.coli JM101のコンピテント細胞を形質転換した。
10個の無色プラークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（R
F）DNAを調製した。RF−DNAを分析すると全てのクロー
ンは正しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片
を示した。これらのクローンの一つをmp18/Kpn I−Hind
III/UK₂UPA^Bと称し、削除突然変異誘発に用いた。

実施例14:一次ハイブリッドDNA造成体の削除突然変異誘
発 Ａ）削除突然変異誘発の一般的実験方法 ａ）突然変異誘発プライマーのホスホリル化 突然変異誘発のために、200pモルの突然変異プライマ
ーを、8UのT₄ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer,8
U/μ）を用いて20μの、１μの10mM ATPを含有す
る50mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5mM DTT、0.1mM
スペルミジン、0.1mM EDTA中においてホスホリル化し
た。37℃で１時間インキュベーション後、65℃で10分間
加熱することにより反応を停止した。

ハイブリダイゼーションスクリーニングのために、20
pモルの突然変異誘発プライマーを唯一のATP源において
30μCiγ³²P−ATP（3000Ci/mモル;Amersham Internatio
nal）を用いて上記の如くホスホリル化した。このプラ
イマーを3.5ml・６×SSCで稀釈し、直後プローブとして
用いた。

ｂ）突然変異プライマー及びユニバーサル配列決定プラ
イマーの一本鎖鋳型へのアニーリング 0.2pモルの一本鎖鋳型を20pモルのホスホリル化突然
変異誘発オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
（10pモル／μ）及び10pモルのユニバーサルM13配列
決定プライマーと共に10μの20mM Tris・HCl pH7.5、
10mM MgCl₂、50mM NaCl.1mM DTT中において95℃で５分
間インキュベートした。溶液をゆっくり室温まで30分間
に亘って冷却させた。

ｃ）延長−連結反応 上記アニーリングされた混合物に１μの緩衝液〔0.
2M Tris・HCl（pH7.5）、0.1MgCl₂、0.1M DTT〕、４μ
の2.5mM dNTP混合物、１μの10mM ATP、0.5μT4D
NAリガーゼ（Biolabs,400U/μ）、0.67μのクレノ
ウDNAポリメラーゼ（BRL,2.99U/μ）を含有する10μ
の酵素−dNTP（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）溶液を添加
した。この混合物を15℃で１時間インキュベート後、８
〜９℃で16時間インキュベートした。65℃で10分間イン
キュベートすることにより反応を停止した。

ｄ）連結混合物の形質転換 連結混合物をTEで1:20及び1:200に稀釈し、これらの
稀釈溶液のそれぞれ１μ及び５μを用いて0.2mlの
E.coli BMH71−18mutSの修復マイナス菌株〔BMH71−18
（△Clac−pro AB）、thi、supE、Ｆ′laci^q、Ｚ△M1
5、proA ^＋ Ｂ ^＋〕のコンピテント細胞を形質転換した。
E.coli BMH71−18mutS（BMH71−18、mutS215::Tnio）の
造成はKramer et al.〔Cell 38,879−887（1984）〕に
より記載されている。トランスフェクション後、修復マ
イナス株の変異表現型へのファージの曝露を最少にする
ために、E.coli JM101の修復＋菌株によりラウン（law
n）細胞を与えた〔P.Carter,H.Bedouelle and G.Winte
r,Nucl.Acids Res.13、4431−4443（1985）〕。

ｅ）ファージのスクリーニング トランスフェクションされたDNAから得られた100個の
プラークをYTプレート上につま揚子で移し、感染細菌の
コロニーとして15〜18時間生育させた。コロニーブロッ
ティングはGrunstein及びHogness〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA72、3961−3965（1985）〕から適用された。ニト
ロセルロースフィルター（Millipore S.A.,Cat.No.HAWP
090、孔径0.45μｍ）をコロニープレート上に室温で10
分間置いた。フィルターを0.5N NaOHで変性し、1M Tris
・HCl pH7.5で中和し、次いで高塩溶液（0.5M Tris・HC
l pH7.5＋1.5M NaCl）で処理した。これらのフィルター
を80℃で30分間真空焼付けし、密封可能なプラスチック
袋内で100mlの10×デンハルト溶液（D.T.Denhardt,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.23,641−646）、６×SSC及び
0.2％SDS中においてプリハイブリダイズした。

ハイブリダイゼーションスクリーニングのために、プ
リハイブリダイズされたフィルターを50mlの６×SSC中
で１分間洗浄し、次いで³²P−標識化突然変異誘発プラ
イマーを含有する3.5mlのプローブ内で30分間ハイブリ
ダイズせしめた。ハイブリダイズされたフィルターを10
0ml6×SSC中において室温で合計２分間３回洗浄し、次
いでオートラジオグラフにかけた。野性種と突然変異フ
ァージ間の良好な区別が100mlの0.1×SSC＋0.1％SDS中
における60℃での簡単な洗浄（５分間）により得られ
た。

ｆ）ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
における削除突然変異の確認 陽性クローンからのファージを1mlの２×YT中につま
揚子で移し、70℃で20分間加熱して細菌を殺し、次いで
100μのこのファージ懸濁液を1.5mlの新たに生育する
E.coli JM101培養液（OD₆₀₀約0.45）に接種した。培養
液を37℃で４時間激しく振盪した（300rpm）。陽性クロ
ーンからのファージ−ストック及び複製形DNAを調製し
た〔J.Messing,Methods in Enzyomology,101,21−78（1
983）〕。突然変異体（削除突然変異誘発後）からのDNA
を適当な制限酵素で分析し、野性種（削除突然変異誘発
前）DNAの制限断片と対比した。制限分析による確認
後、一つの正しい突然変異体からのDNAをプラーク精製
した。突然変異は更に制限分析及び鎖−ターミネーター
法を用いる配列決定により検証した〔F.Sanger,S.Nicle
n及びA.R.Coulson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463−54
67（1977）〕。

Ｂ）mp18/BamHI/TPA^AUPA^Bに対する削除突然変異誘発
（第23図参照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法で説明したように
して行った。ハイブリダイゼーションから得られた陽性
クローンは制限分析により確認された。333bpをBamHI断
片から削除突然変異誘発により除去した。BamHIを用い
る制限分析で2150bp断片を確認した。EcoRIを用いる制
限分析は野性種に見られた660、472、416及び287断片の
代りに突然変異体上に660、416、287、230bp断片をもた
らした。Pst Iを用いる分析は突然変異体について611及
び414bpの大きさの二つの断片を示した。野性種DNAは62
2、611及び414bpの三つの断片を示した。正しい構造を
有する一つの変異体クローンをmp18/BamHI/MOTPA^AUPA^B
と称する。

ｔ−PA A鎖及びｕ−PA B鎖の間の結合におけるDNA配
列は５′CAGAGCCCCCCCGGTGC3′の配列の配列プライマー
を有する鎖ターミネーター配列決定方法により検証し
た。このプライマーはｕ−PA（682−666）のコード化鎖
に相補的である。

Ｃ）mp18/Kpn I−Hind III/UPA^ATPA^Bに対する削除突然
変異誘発（第24図参照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はPst Iを用いる制限分析により確認した。突然変異体
においては、544bp断片をもたらす野性種に対比して、4
67bpバンドが観察された。正しい構造を有する一つの変
異体クローンをmp18/Kpn I−Hind III/MOUPA^ATPA^Bと称
する。削除は５′CAAAGATGGCAGCCTGC3′の配列の配列決
定プライマーを用いる鎖−ターミネーター配列決定法に
より検証された。このプライマーはｔ−PA（1062−104
6）のコード化鎖に相補的である。

Ｄ）mp18/Knp I−Hind III/UK₂TPA^Bに対する削除突然変
異誘発（第25図参照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はKpn I−Hind III、EcoRI及びPst Iを用いる制限分析
により確認された。得られた断片は下記の通りである： 正しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片が
変異体について観察された。正しい構造を有する一つの
変異体クローンをmp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂TPA^Bと称
する。削除は ５′CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3′ 配列の配列決定プライマーを用いる鎖−ターミネーター
配列決定法により検証された。このプライマーはｔ−PA
（853−821）のコード鎖に相補的である。

Ｅ）mp18/Kpn I−Hind III/UK₂UPA^Bに対する削除突然変
異誘発（第26図参照） UK₂UPA^Bの造成においては二つの別々の削除突然変異
が用いられた。第一の削除突然変異誘発は一般的実験方
法と同様にして行われた。ハイブリダイゼーションから
得られた陽性クローンはEcoRIを用いる制限分析により
確認された。変異体には549,452,416bp断片をもたらす
野性種に対比して、549,416,351bpバンドが観察され
た。正しい構造を有する一つの変異体クローンをmp18/K
pn I−Hind III/MOUK₂UPA^B−１と称される。削除は ５′CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3′ の配列の配列決定プライマーを用いる銀−ターミネータ
ー配列決定法により検証された。このプライマーはｔ−
PA（853−821）のコード化鎖に相補的である。

削除突然変異誘発の第二工程において、削除は点突然
変異の導入と共になされた。削除突然変異誘発は一般的
実験方法と同様にして行われた。ハイブリダイゼーショ
ンから得られた陽性クローンはEcoRIを用いる制限分析
により確認された。突然変異体において、549,416及び3
51bp断片をもたらす野性種に対比して、416、351、259b
pバンドが観察された。正しい構造を有する一つの変異
体クローンをmp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂UPA^Bと称す
る。この削除は配列５′CAGAGCCCCCCCGGTGC3′の配列決
定プライマーを用いる鎖−ターミネーター配列決定方法
により検証された。このプライマーはｕ−PA（682−66
6）のコード鎖に相補的である。

実施例15:ハイブリッドｔ−PA/u−PA cDNA造成体の酵母
発源ベクターpJDB207中へのクローニング Ａ）TPA^AUPA^Bハイブリッド遺伝子のpJDB207中へのクロ
ーニング RF−DNAを迅速DNA単離法によりmp18/BamHI/MOTPA^AUPA
^Bについて調製した〔D.S.Holmes及びM.Quingley,Anal.B
iochem.114,192−197（1981）〕。

RF−DNA（〜1.5μｇ）を9UのBamHIで20μの10mM Tr
is・HCl（pH7.5）、6mM MgCl₂、100mM NaCl、6mMメルカ
プトエタノール中において37℃で１時間消化した。１μ
のRNase（1mg/ml）を添加し、37℃で10分間インキュ
ベート後、2.1kbインサートを0.7％調製用アガロースゲ
ル上で単離した。このDNAインサートを電気溶出により
抽出し、エタノール中で沈澱させた。

1.5μｇのpJDB207/PH05−Ｉ−TPA^AUPA^BをBamHIで切断
し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そして
6.7kbベクターを単離した。電気溶出後ベクターDNAを沈
澱させた。

100fモルのpJDB207/PH05−Ｉ−TPA^AUPA^BBamHI切断ベ
クター、200fモルのTPA^AUPA^Bインサートを400UのT₄DNA
リガーゼで、10μの50mM Tris・HCl pH7.5、10mM MgC
l₂、10mM DTT、2mM ATP、0.5μｇのゼラチン中において
15℃で８時間連結した。65℃で10分間インキュベーショ
ンして反応を停止した。５μのこの連結混合物を用い
てE.coli HB101Ca²⁺細胞〔M.Dagert及びS.D.Ehrlich,Ge
ne６,23−28（1979）〕を形質転換した。12amp^Rコロニ
ーを拾い上げ、迅速単離方法によりDNAを調製した。DNA
を分析すると、５個のクローンが共に正しい大きさのイ
ンサート及び正しい方向を示した。一つのクローンを10
0mg/mlのアンピシリンを含有する100mlのLB培地中にお
いて生育せしめた。プラスミドDNAを単離し、pJDB207/P
H05−Ｉ−MOTPA^AUPA^Bと称する。

Ｂ）MOUPA^ATPA^B、MOUK₂TPA^B及びMOUK₂UPA^B遺伝子インサ
ートのプラスミドpCS16中へのクローニング RF−DNAを、迅速DNA単離法により、mp18/Kpn I−Hind
III/MOUPA^ATPA^B、mp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂TPA^B、m
p18/Kpn I−Hind III/MOUK₂UPA^Bについて調製した。

これらの三つのRF−DNA（約1.5μｇ）をそれぞれ12U
のKpn I及び12UのHind IIIで20μの10mM Tris・HCl p
H7.5、6mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノール中において
37℃で１時間消化した。１μの1M NaClを添加し、こ
れらのDNAを更に12UのHind IIIで消化した。１μのRN
ase（1mg/ml）を添加し、37℃で10分間インキュベート
後、1.4kbインサートを各々0.8％調製アガロースゲル上
で単離した。これらのDNAインサートを電気溶出により
抽出し、エタノール中で沈澱させた。

３μｇのpCS16/UPAをKpn I及びHind IIIで消化し、2.
7kbベクター断片を単離した。電気溶出後、ベクターDNA
をエタノール中で沈澱させた。

100fモルのpCS16Kpn I−Hind III切断ベクター、200f
モルのKpn I−Hind III切断インサート断片を10μの5
0mM Tris・HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM AT
P、0.5μｇゼラチン中において400UのT₄DNAリガーゼで1
5℃において８時間連結した。65℃で10分間インキュベ
ーションして反応を停止し、５μのこの連結混合物を
用いてE.coli HB101Ca²⁺細胞を形質転換した。

これらの三つの連結の各々から６個のamp^Rコロニーを
つゝき出した。DNAを迅速単離法により調製した。DNAを
Kpn I−Hind IIIで分析すると、正しい大きさのインサ
ートバンドが観察された。これら三つの各々の連結体か
ら一つのクローンを100μg/mlのアンピシリンを含有す
る100mlLB培地中で生育させた。mp18/Kpn I−Hind III/
MOUPA^ATPA^B,mp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂TPA^B及びmp18/
Kpn I−Hind III/MOUK₂UPA^Bから誘導されたプラスミドD
NAを単離し、それぞれpCS16/MOUPA^ATPA^B、pCS16/MOUK₂T
PA^B及びpCS16/MOUK₂UPA^Bと称する。

Ｃ）MOUPA^ATPA^B、MOUK₂TPA^B及びMOUK₂UPA^B遺伝子インサ
ートのpJDB207中へのクローニング ５μｇのpJDB207/PH05−Ｉ−UPAを15UのSca I及び5U
のXho I（Boehringer）により15μの10mM Tris・HCl
（pH7.5）、6mM MgCl₂、150mM NaCl、6mMメルカプトエ
タノール中で37℃で１時間消化した。１μのRNase（1
mg/ml）を添加後、6.7kbベクター断片を単離した。電気
溶出後、ベクターDNAを沈澱させた。

各々15μｇのpCS16/MOUPA^ATPA^B,pCS16/MOUK₂UPA^Bを30
UのXho Iと共に200の10mM Tris・HCl pH8、6mM MgCl₂、
150mM NaCl、6mMメルカプトエタノール中において37℃
で１時間インキュベートし、等容量のフェノール−クロ
ロホルムで抽出し、エタノール中で沈澱させた。沈澱し
たXho I切断pCS16/MOUPA^ATPA^B、pCS16/MOUK₂TPA^B、及び
pCS16/MOUK₂UPA^BDNA遺伝子を各々150μの10mM Tris・
HCl pH7.5、6mM MgCl₂、150mM NaCl₂、6mMメルカプトエ
タノール中に再懸濁させ、37℃で40分間12UのSca I（部
分消化物）とインキュベートし、等容量のフェノールで
抽出した後、等容量のクロロホルム−イソアミルアルコ
ール（50:1）で抽出した。1.2kb断片を各々は１％調製
アガロースゲル上で単離した。これらのDNAを電気溶出
により抽出し、沈澱させた。

100fモルのpJDB207/PH05−Ｉ−UPA Sca I−Xho I切断
ベクター及び200fモルのXho−Sca I切断pCS16/MOUPA^ATP
A^B、pCS16/MOUK₂TPA^B或いはpCS16/MOUK₂UPA^B1.2kbイン
サートを各々10μの50mM Tris・HCl、pH7.5,10mM MgC
l₂、10mM DTT、2mM ATP、0.5μｇのゼラチン中で、400U
のT₄DNAリガーゼを用いて15℃で16時間連結した。65℃
で10分間インキュベーションすることにより反応を停止
した。５μのこの連結混合物を用いてE.coli HB101Ca
²⁺細胞を形質転換した。

６個のamp^Rコロニーをこれらの三つの連結体の各々か
ら拾い上げた。DNAを迅速単離法により調製した。DNAの
制限分析は正しい大きさのインサートバンドを示す。こ
れら三つの連結体のそれぞれからの一つのクローンを10
0μg/mlのアンピシリンを含有する100mlLB培地中で生育
せしめた。pCS16/MOUPA^ATPA^B、pCS16/MOUK₂TPA^B、pCS16
/MOUK₂UPA^Bから誘導されたプラスミドDNAはそれぞれpJD
B207/PH05−Ｉ−MOUPA^ATPA^B、pJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂
TPA^B及びpJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂UPA^Bと称される。

実施例16:サッカロミセス・セレビジアエGRF18の形質転
換及び酵母細胞抽出液の調製 プラスミドpJDB207/PH05−Ｉ−MOTPA^AUPA^B、pJDB207/
PH05−Ｉ−MOUPA^ATPA^B、pJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂TPA^B
及びpJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂UPA^Bを各々Hinnen et al.
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA75、1929（1978）〕により記
載されている形質転換方法を用いてサッカロミセス・セ
レビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）菌株GRF18中
に導入した。各々５μｇのプラスミドDNAを100μのス
フェロプラスト懸濁液に添加し、混合物をポリエチレン
グリコールで処理した。スフェロプラストを10ml再生寒
天と混合し、酵素最少培地プレート上にロイシンなしに
プレーティングした。30℃で３日間インキュベーション
後約200個の形質転換細胞が得られた。

酵母転換体の各々から一つのコロニーをつゝき出し
た。これらの異ったコロニーを Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05−Ｉ−MOTPA^AUPA^B Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05−Ｉ−MOUPA^ATPA^B Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂TPA^B Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05−Ｉ−MOUK₂UPA^B と称する。

酵母細胞を、30℃において20mlのHE−17培地〔8.4gの
酵母窒素ベース（Difco）、10gのＬ−アスパラギン（Si
gma）、1gのＬ−ヒスチジン（Sigma）、40mlの50％グル
コース/1溶液〕中において50mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ内で８−10×10⁷細胞/mlの密度に到達するまで24
時間振盪しながら生育させた。細胞を遠心分離し、10ml
の0.9％NaCl中に再懸濁させた。2mlの再懸濁細胞を用い
て50mlの低−Pi最小培地（ヨーロッパ特許出願143081号
明細書記載のもの）を接種し、これに10g/Ｌ−アスパ
ラギン（Sigma）、及び10g/Ｌ−ヒスチジン（Sigma）
を250mlのエルレンマイヤーフラスコ内で添加した。イ
ンキュベーションは250rpmにて30℃で行った。

10mlの低−Pi最小培地からの細胞を48時間後に3000rp
mの10分間の遠心分離によりFalcon2070チューブ内に集
めた。これらの細胞を一度10mlの低−Pi培地で洗浄し、
遠心分離した。細胞プレットを溶解緩衝液〔66mMリン酸
カリウムpH7.4、4mM Zwittergent（Calbiochem.）〕中
に浮遊させた。この細胞浮遊液に8gのガラスビーズ（0.
5〜0.75mm直径）及び小ガラス棒を添加し、浮遊液をVor
tex Mixer（Scientific Instruments Inc.,USA）上でフ
ルスピードで４×２分間氷上で２分間の間隔をもって振
盪した。これらの90％を越える細胞はこの方法により破
壊された。細胞破片及びガラスビーズを４℃で3000rpm
にて５分間遠心分離により沈澱させた。上澄液をPA活性
の測定及びPAの精製及び単離に用いた。

実施例17:ハイブリッドPAコード配列の哺乳動物細胞発
現ベクター中への挿入 Ａ）UPA^ATPA^B「完全」ハイブリッドコード配列の挿入 mp18/Kpn I−Hind III/MOUPA^ATPA^BのRF DNAをコード
配列の開始の直ぐ上流に位置するSma I部位において切
断し、Sac Iリンカー（CGAGCTCG）に連結した。引続き
このプラスミドをSac Iで切断し、それはリガンドリン
カーの位置及びハイブリッドPAコード配列のｔ−PA−由
来部分における自然Sac I部位において切断した。二つ
の得られた断片の小さい方をアガロースゲルにより精製
し、Sac I切断pCGA44（実施例４参照）に連結し、E.col
i HB101中に形質転換し、そして候補クローンからのDNA
をEcoRIで試験した。期待された制限パターンを有する
クローンをpCGC1/UPA^ATPA^Bと称する。

Ｂ）UK₂TPA^Bハイブリッドコード配列の挿入 mp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂TPA^BのRF DNAを、コード
配列の開始の直ぐ上流に位置するSma I部位で切断し、
上記の如くSac Iと連結した。Sac Iで切断後、得られた
小断片を上記の如くSac I−切断pCGA44中にクローニン
グし、そして期待された制限パターンを有するクローン
をpCGC2/UK₂TPA^Bと称する。

Ｃ）UK₂UPA^Bハイブリッドコード配列の挿入 mp18/Kpn I−Hind III/MOUK₂UPA^BのRF DNAをｕ−PA配
列の上流のSma I部位及びコード配列下流のXho I部位
（ベクターDNA中の）において切断した。このDNA断片の
粘着末端をE.coli DNAポリメラーゼＩ（実施例5D参照）
を用いてフィルインした。Sac Iリンカーを平滑末端に
連結し、DNAをSac Iで切断し、二つの得られた断片の小
さい方をアガロースゲルで精製し、Sac I−切断pCGA44
中にクローニングした。期待されたEcoRI制限パターン
を有するクローンをpCGC3/UK₂UPA^Bと称する。

Ｄ）TPA^AUPA^B「完全」コード配列の挿入 工程1:mp18/BamHI/MOTPA^AUPA^BのRF DNAをBamHIで切断
し、小さい（約2.1kb）断片をBamHI切断pJDB207/PH05−
Ｉ−TPA^AUPA^B（実施例９参照）ベクター中にクローニン
グした。正しい方向はHind IIIによる消化により選択さ
れ、一つの正しいプラスミドをpJDB207/PH05−Ｉ−MOTP
A^AUPA^Bと称する。

工程2:ptNC・UCからの約600bpのSac I−Nar I断片（実
施例３参照）及びpJDB207/PH05−Ｉ−TPA^AUPA^Bからの約
1350bp Nar I−Xho I断片を単離し、Sac I−Xho I切断p
CS16（実施例17参照）ベクター中にクローニングした。
この約1.9kbインサートはSac I−Xho I及びEcoRIによる
消化により確認した。一つの正しいプラスミドをpCS16/
MOTPA^AUPA^Bと称する。

工程3:プラスミドpCS16/MOTPA^AUPA^Bをｕ−PAコード配列
の下流に位置するXho I部位で切断し、粘着末端をE.col
i DNAポリメラーゼＩを用いてフィルインする。Sac Iリ
ンカーを平滑末端に連結し、DNAをSac Iで切断した。二
つの断片の小さい方をアガロースゲルにより精製し、Sa
c I−切断pBR4a（実施例５参照）ベクター断片中にクロ
ーニングした。正しい方向及び正しい大きさのインサー
トはそれぞれBamHI及びSac Iによる消化により確認し
た。一つの正しいプラスミドをpCGC4a/TPA^AUPA^Bと命令
する。

実施例18:他のハイブリッドPAコード配列の造成及びそ
の哺乳動物細胞発現ベクター中への挿入 Ａ）pCGC4a/TPA^AUPA^B断片のM13mp18中へのクローニング ３μｇのpCGC4a/TPA^AUPA^B（実施例17参照）を120のSa
c I（Boehringer）で20μの10mM Tris−HCl pH7.5、6
mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノール中において37℃で
１時間消化した。約1.9kbの断片を0.7％調製アガロース
ゲル上で単離した。このDNAを電気溶出により抽出し、
沈澱させた。

0.5μｇのM13mp18（RF）をSac Iで消化した。この7.3
kbベクター断片を0.7％調製アガロースゲル上で単離し
た。このDNAを電気溶出し、沈澱させた。

100fモルのM13mp18Sac I切断ベクター及び200fモルの
Sac Iインサートを10μの50mM Tris−HCl pH7.5、10m
M MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP、0.5μｇのゼラチン中に
おいて400UのT₄DNAリガーゼで15℃において７時間連結
した。65℃で10分間インキュベートして反応を停止し
た。５μのこの連結混合物を用いてE.coli JM101のコ
ンピテント細胞を形質転換した。６個の無色ブラークを
拾い上げ、一本鎖及び複製形（RF）DNAを調製した。RF
−DNAを分析すると、４個のクローンは正しい大きさの
インサート及び正しい方向を示した。これらのクローン
の一つをmp18/Sac I/TPA^AUPA^B（BC）と称する。

Ｂ）pBA4a Sac I断片のM13mp18へのクローニング pBR4a（実施例５参照）Sac I断片をM13mp18中でクロ
ーン化した。正しい大きさのインサート及び正しい方向
を有するこれらのクローンの一つをmp18/Sac I/TPA^AUPA
^B（BR）と称する。

Ｃ）TPA−UPAハイブリッド造成物上での削除突然変異誘
発 １）K₂UPA^B（BC）〔即ち、tPA（１−３）−tPA（176−2
75）−uPA（159−411）〕の造成 削除突然変異誘発を、mp18/Sac I/TPA^AUPA^B（BC）に
ついて一般的実験方法（実施例14参照）と同様にして行
った。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クロー
ンはSac Iを用いる制限分析により確認された。変異体
においては、約1900bp断片をもたらす野性種に対比して
約1380bpバンドが観察された。変異体を更にEcoRI消化
により確認した。正しい構造を有する一つの変異体クロ
ーンはmp18/Sac I/K₂UPA^B（BC）と称する。削除は配列 ５′CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG3′ の配列決定プライマーを用いる鎖ターミネーター配列決
定方法により検証された。

このプライマーは位置838（ｔ−PA）におけるミスマ
ッチを有するｔ−PA（853−821）のコード鎖に相補的で
あった。

２）FUPA^B（BC）〔即ちtPA（１−49）−tPA（262−27
5）−uPA（159−411）〕の造成 削除突然変異誘発を、mp18/Sac I/TPA^AUPA^B（BC）に
ついて一般的方法（実施例14参照）と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はSac Iを用いる制限分析により確認された。変異体に
おいては、約1900bp断片をもたらす野性種に対比して、
約1200bpのバンドが観察された。変異体は更にEcoRI消
化により確認された。正しい構造を有する一つの変異体
クローンはmp18/Sac I/FUPA^B（BC）と称される。削除は
Ｓ′CAGAGCCCCCCCGGTGC3′配列の配列決定プライマーを
用いる鎖ターミネーター配列決定法により検証された。

このプライマーはｕ−PA（666−682）のコード鎖に相
補的である。

３）FK₂UPA^B（BC）〔即ち、tPA（１−49）−tPA（176−
275）−uPA（159−411）〕の造成 削除突然変異誘発をmp18/Sac I/TPA^AUPA^B（BC）につ
いて一般的実験方法（実施例14参照）と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はSac Iを用いる制限分析により確認された。変異体に
おいては、約1900bpの断片をもたらす野性種に対比して
約1470bpのバンドが観察された。変異体は更にEcoRI消
化により確認された。正しい構造を有する一つの変異体
クローンはmp18/Sac I/KF₂UPA^B（BC）と称される。削除
は配列５′CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG3′の配
列決定プライマーを用いる鎖ターミネーター配列決定方
法により検証された。

このプライマーは位置838（ｔ−PA）におけるミスマ
ッチを伴ってｔ−PA（853−821）のコード化鎖に相補的
である。

４）FGK₂UPA^B（BC）〔即ちtPA（１−86）−tPA（176−2
75）−uPA（159−411）〕の造成 削除突然変異誘発はmp18/Sac I/TPA^AUPA^B（BC）につ
いて一般的実験方法（実施例14参照）と同様にして行わ
れた。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クロー
ンはSac Iを用いる制限分析により確認された。変異体
においては、約1900bpの断片をもたらす野性種に対比し
て約1580bpバンドが確認された。変異体は更にEcoRI消
化により確認された。正しい構造を有する一つの変異体
クローンはmp18/Sac I/FGK₂UPA^B（BC）と称される。削
除は配列５′CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG3′の
配列決定プライマーを用いる鎖ターミネーター配列決定
方法により検証された。

このプライマーは位置838（ｔ−PA）におけるミスマ
ッチを伴ってｔ−PA（853−821）のコード鎖に相補的で
ある。

５）同様な削除突然変異誘発実験方法を用いて K₂UPA^B（BA）〔tPA（１−３）−tPA（176−262）−uPA
（132−411）〕 FUPA^B（BR）〔tPA（１−49）−uPA（134−411）〕 FK₂UPA^B（BR）〔tPA（１−49）−tPA（176−262）−uPA
（132−411）〕及び FGK₂UPA^B（BR）〔tPA（１−86）−tPA（176−262）−uP
A（132−411）〕。

を生成した。

Ｄ）ハイブリッドPAコード配列の哺乳動物細胞発現ベク
ター中への挿入 1.FUPA^B（BC）,K₂UPA^B（BC）,FK₂UPA^B（BC）及びFGK₂UP
A^B（BC）の挿入 mp18/Sac I/K₂UPA^B（BC）,mp18/Sac I/FUPA^B（BC）,m
p18/Sac I/FK₂UPA^B（BC）及びmp18/Sac I/FGK₂UPA^B（B
C）からのRF DNAを各々Sac Iで切断した。二つの得られ
た断片の小さい方を単離し、Sac I断片pBR4a（実施例５
参照）ベクター断片に連結し、E.coli HB101中に転移
し、そして正しい方向及び正しい大きさのインサートを
それぞれBamHI及びSac Iによる消化により確認した。得
られたプラスミドをそれぞれpCGC5/K₂UPA^B,pCGC6/FUP
A^B,pCGC7/FK₂UPA^B及びpCGC8/FGK₂UPA^Bと命名する。

2.同様に、K₂UPA^B（BR）,FUPA^B（BR）,FK₂UPA^B（BR）及
びFGK₂UPA^B（BR）DNA（上記参照）を各々pBR4a中に挿入
した。得られたプラスミドをそれぞれpBR5,pBR6,pBR7及
びpBR8と命名する。

実施例19:DHFR遺伝子を含んでなる哺乳動物発現ベクタ
ー プラスミドpSV2dhfr（ATCC37145）は抗葉酸剤メトト
レキセートを用いる選択或いはDHFR^-CHO細胞のDHFR⁺形
質転換体の選択によりDHFR^-含有細胞の形質転換体の選
択を可能にするプラスミドである〔DUKXB1細胞;G.Urlau
b,Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.77,4216−4220（198
0）〕。このプラスミドの単一BamH I部位にモジュール
ｔ−PA遺伝子を含有するpCGA28のBamH I断片をクローン
化することができる。これらの二つの可能性のある方向
のいづれかを含有するプラスミドはpCGA700a/tPA及びpC
GA700b/tPAと命名される。両者を用いて組織培養細胞内
にｔ−PAを発現することができるが、しかし、ｔ−PA遺
伝子の転写がDHFR遺伝子のそれと同一方向であるpCGA70
0a/tPAの方がしばしば収束的に転写されるプラスミドよ
りも僅かにより高い発現レベルに導くので好ましい。

同様にしてプラスミドpBR1a/tPA,pBR2a/UPA^ATPA^B,pCG
C1/UPA^ATPA^B,及びpCGC2/UK₂TPA^Bからのハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベータ（下記）をコードするモジ
ュール遺伝子は、BamH I断片として、pCGA700a/tPAのDH
FR遺伝子と組合わせて、モジュールプラスミノーゲンア
クチベータ遺伝子がDHFB遺伝子と同一方向に転写される
プラスミドpCGA701a/tPA,pCGA70a/UPA^ATPA^B,pCGA705a/U
PA^ATPA^B,及びpCGA707a/UK₂TPA^Bからそれぞれ形成され、
そして両方の遺伝子が反対方向に転写されるpCGA701b/t
PA,pCGA702b/UPA^ATPA^B,pCGA705b/UPA^ATPA^B,pCGA707b/UK
₂TPA^Bが形成される。ｕ−PAB−鎖をコードする部分にお
けるBamH I配列の存在のために、モジュールプラスミノ
ーゲンアクチベータ遺伝子はneo^Rプラスミドの部分的切
断（３個のBamH I部位の２個）の後、アガロールゲル電
気泳動により適当な断片を単離（図面参照）することに
よってのみ単離することができる。この様にして、pBR3
a/uPA,pBR4a/TPA^AUPA^B,pBR5/K₂UPA^B,pBR6/FUPA^B,pBR7/F
K₂UPA^B,pBR8/FGK₂UPA^B,pCGC3/UK₂UPA^B,pCGC4a/TPA^AUP
A^B,pCGC5/K₂UPA^B,pCGC6/FUPA^B,pCGC7/FK₂UPA^B,及びpCGC
8/FGK₂UPA^Bから、プラスミノーゲンアクチベータ遺伝子
が全てDHFR遺伝子と同方向に転写されるpCGA703a/uPA,p
CGA704a/TPA^AUPA^B,pCGA705a/K₂UPA^B,pCGA708a/FUPA^B,pC
GA706a/FK₂UPA^B,pCGA707a/FGK₂UPA^B,pCGA709a/UK₂UPA^B,
pCGA711a/TPA^AUPA^B,pCGA712a/K₂UPA^B,pCGA713a/FUPA^B,p
CGA714a/FK₂UPA^B及びpCGA715a/FGK₂UPA^B,をそれぞれ造
成することができ、さらに更に両方の遺伝子が非収束的
に（inconvergently）転写されるpCGA703b/uPA,pCGA704
b/TPA^AUPA^B,pCGA708b/FUPA^B,pCGA705b/K₂UPA^B,pCGA706b
/FK₂UPA^B,pCGA707b/FGK₂UPA^B,pCGA709b/UK₂UPA^B,pCGA71
1b/TPA^AUPA^B,pCGA712b/K₂UPA^B,pCGA713b/FUPA^B,pCGA714
b/FK₂UPA^B及びpCGA715b/FGK₂UPA^B,を造成することがで
きる。

実施例20:形質転換哺乳動物細胞によるハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベータの製造 Ａ）組織培養細胞の維持及びDNAトランスフェクショ
ン；一般的操作 DHA造成体は酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素を欠乏する
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の変異体であ
るDUKXB1中で発現される〔G.Urlaub et al.,Proc.Nat.A
ead.Sci.USA77,4216−4220（1980）〕。DUKXB1細胞は５
％ウシ胎児血清を補給したヌクレオシドを含有するアル
ファーMEM培地（GIBCO）内で培養された。

細胞は６−ウエルマルチプレート（3.4cm直径）内に
おいて10,000個/cmの密度でプレート培養され、４μｇ
のDNAで形質転換された。DNAを0.1mM EDTAを含有する10
mM Tris/HCl pH7.0中に50μg/mlで溶解し、氷上で５分
間冷却し、0.25容量の1M CaCl₂を添加し、そして氷上で
10分間インキュベートした。この混合物を次いで等容量
の２×HBS（50mM Hepes,280mM NaCl、0.75mM Na₂HPO₄、
0.75mM NaH₂PO₄、pH7.12）と混合した後更に10分間氷上
でインキュベートした。最後に、このDNA−Ca−ホスフ
ェート共沈澱を培養培地に添加し、細胞をDNAと共に16
〜18時間インキュベートし、その後グリセロールショッ
クを与えた。即ち細胞をTBS（80g/ NaCl、3.8g/ HC
l、1g/ Na₂HPO₄・2H₂O、0.114g/ CaCl₂・2H₂O、0.1
1g/ MgCl₂・6H₂O、25mM Tris/HCl pH7.5）で濯ぎ、TB
S中20％（v/v）グリセロールで１分間インキュベート
し、再びTBSで濯ぎ、そして組織培養培地中で24時間培
養した。細胞を次いでトリプシン処理し、そして細胞を
8cm直径のペトリ皿に移した。次の日、初期培養培地を
選択剤なしに1mg/mlジュネテイシンを含有する培地で置
換えた。培地は３日目或いは４日目毎に置換した。コロ
ニーは約14日目に見ることができた。個々のコロニーか
らの細胞をそれらをピペットの先端でかき落すと共に同
時にそれらをトリプシン溶液を充填したチップ中に吹込
み、そして各々をジュネテイシンを含有する培地を供給
された24ウエルマルチプレートのウエルに移しながら単
離した。コンフルエントになった時点でこれらの培養液
を６ウエルマルチプレートのウエル及び引続いて8cm直
径のペトリ皿に分割した。

B.プラスミノーゲンアクチベータに対するアガロースプ
レートアッセイ これらのプラスミノーゲンアクチベータに対する高感
度アッセイはプラスミノーゲン（プラスミノーゲンSigm
a A−6877を1mg/mlにて100容量の50mM Tris/HCl（pH8.
0）中に溶解し、そしてそれに対して２回透析すること
により調製された原液）或いはガゼイン（非−脂肪ミル
クとして添加）、或いはフィブリン（フィブリノーゲン
＋トロンビンとして添加）が添加されたアガロースゲル
を使用する。プラスミノーゲンアクチベータを含有する
試料を4mm厚のアガロース層中に開けられた穴に適用
し、そしてゲルを引続いて37℃でインキュベートする。
次いで、酵素活性は、プラスミノーゲンアクチベータが
試料ウエルから放射状に拡散し、ゲル内のプラスミノー
ゲンをプラスミンに転換し、それが次いでカゼイン或い
はフィブリンを消化してサンプルウエルの周りの不透明
なゲル内に透明なハローを生成することにより検知され
る。ハローの半径（試料ウエルの縁から測定）が活性化
されたプラスミノーゲン量の目安である。このアッセイ
は添加されたプラスミノーゲンアクチベータの量に直線
的応答を示さない。低い量のプラスミノーゲンアクチベ
ータのアッセイのためにはインキュベーションは数日間
延長することができる。カゼインアッセイの操作及び検
量は２％（w/v）carnation非−脂肪ミルク粉末の代りに
Migros Corp.（スイス）からの12.5％（v/v）殺菌（UH
T）無脂肪ミルクを用いは他はTang et al.〔Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.434,536−540（1984）〕に記載されたものと同
様であった。フィブリン〔Granelli−Piperno and Reic
h,J.Exp.Med.148,223−234（1978）〕が基質として用い
られた場合には、0.2gアガロースが15mlの0.9％NaClに
溶解され、42℃冷却された。この時点において、80mgの
ウシフィブリノーゲン（Sigma F−8630）を含有する5ml
の0.9％NaCl、0.1mlのプラスミノーゲン溶液（上記）及
び0.1mlの100mg/mlナトリウムアジドが42℃で添加され
た。最後に、0.2mlのウシトロンビン（Sigma T−6634、
16.6NIH単位/mlで0.9％NaCl中に溶解）を添加し、混合
物を迅速にペトリ皿（8cm直径）中に注ぎ１時間で室温
に冷却した。得られたゲルは約4mm厚であり、４℃で数
日間貯蔵することができるか或いは上記カゼイン含有ゲ
ルと同様に直ちに用いることができた。

C.ハムスター細胞におけるハイブリッドPAタンパク質の
生産 CHO DUKXB1細胞を上記の如く（実施例20A）、それぞ
れプラスミドpBR1A,pBR1B,pBR2A,pBR2B,pBR3A,pBR3B,pB
R4A,pBR5,pBR7,pBR8,pCGC1,pCGC2,pCGC3,pCGC4a,pCGC5,
pCGC6,pCGC7及びpCGC8のDNAで形質転換した。コロニー
は10日目頃に現われ、コロニーを15日目頃上記の如く拾
い上げ２週間後に細胞数は上記の如くPAを測定するのに
十分増加した。未形質転換細胞及び挿入Sac I断片をア
ンチセンス方向に含有するpBR1B,pBR2B,pBR3Bで形質転
換された細胞系統は検出可能な量のPAを産生しなかっ
た。

D.形質転換CHO細胞により条件化された培地中における
酵素活性 プラスミド形質転換及び対照CHO細胞からの条件化培
地はヌクレオシド類及び５％ウシ胎児血清を有するアル
ファーMEM中において200,000−500,000細胞/mlを24時間
培養することにより調製され、そして0.03mlをカゼイン
或いはフィブリンを含有するアガロースプレート上で下
記に示す時間インキュベートした。フィブリンプレート
上では、おそらく内在ハムスターｔ−PAによる最小のバ
ッグラウンド活性がDUKXB1条件化培地中に検出された。
ハイブリッドタンパク質の試料が３μのウサギ抗−tP
A抗体（精製Bowesメラノーマｔ−PAに対して産生）或い
は抗−ウロキナーゼ抗体（Seronoウロキナーゼに対して
産生）と混合された場合にはカゼインプレート上にはハ
ローが現われない。

抗−tPA抗体はｕ−PA酵素を阻害せず、又抗ウロキナ
ーゼ抗体もｔ−PAを有意な程度に阻害しない。これらの
結果を表１にまとめて示す。

実施例21:ハイブリドーマ細胞の調製及びモノクローナ
ル抗体の単離 ａ）免疫原：推定純度＞90％を有する準−精製天然ヒト
の試料（メラノーマｔ−PA）。

ｂ）免疫感作実験方法:10〜14週令のBALB/cマウス（Tie
rfarm Sisseln、スイス）三つの群を完全フロイントア
ジュバント（Difco）中に乳化した100μｇのメラノーマ
ｔ−PAを二つの後足及び皮下に注射することにより免疫
感作した。引続いて第１群（Nr.405）には毎週６週間に
亘り10μｇの不完全アジュバンド中のｔ−PAを投与した
のに対し、第２群（406）には同一量を２週間ごとに投
与した。第３群（407）には３週間間隔で２回50μｇの
ｔ−PAを与えた。全ての動物を４週間目及び８週間目に
採血した。最後の注射ではPBS中100μｇが腹腔内に与え
られ、そして４日後に脾臓細胞を標準的操作によりSP2/
oミエローマ系統と融合せしめた。高抗−ｔ−PA抗体力
価を有するマウスのみを融合に用いた。

ｃ）細胞融合：全ての融合実験はG.Khler及びC.Milst
ein〔Nature256,495（1975）〕に従って非分泌Sp2/O−A
g14ミエローマ系統〔M.Shulman,C.D.Wilde及びG.Khle
r,Nature276,269（1978）〕を用いて行った。10⁸個の脾
臓細胞を10⁷個のミエローマ細胞と1mlと50％ポリエチレ
ングリコール（PEG1500,Serva）の存在下において混合
した。洗浄後、細胞を48mlの標準ダルベッコ最小必須培
地（Gibco No.0422501）中に再浮遊させた。融合当り３
×10⁶個の正常マウス腹腔浸出液細胞をフィーダー細胞
として添加した。これらの細胞は48×1mlコスターウエ
ル中に分配され、毎週３回標準HAT選択培地が３〜６週
間に亘って供給された。ハイブリドーマ細胞の生育が目
に見えるようになった時点で、上澄液を直接抗原結合ア
ッセイ（ELISA）及び中和（カゼイン）アッセイ（下記
参照）の両方によりスクリーニングした。四つの融合実
験の結果は次の通りである。接種した192個のウエルの
うち、192個のハイブリドーマが得られた。それらのう
ち、24個は抗−ｔ−PA抗体を産生した。24個の陽性ハイ
ブリドーマのうち14個がクローニングされ、得られた57
4個のクローンから31が抗−ｔ−PAmAbを安定に産生する
ことが判明した。これらの内、３個（クローン405B.33.
3,406A.23.7、及び407A.15.27）をマウスに注射し、腹
水を更に研究するために生産した。

ｄ）モノクローナル抗体の単離及び精製 ８〜10週令のBALB/cマウス（Tierfarm Sisseln,スイ
ス）を0.3mlプリスタン（Aldrich）により腹腔内前処理
した。２〜３週間後２〜５×10⁶個のクローニングされ
たハイブリドーマ細胞405B.33.3,406A.23.7及び407A,1
5.27、並びに0.2mlのプリスタンを腹腔に接種した。８
〜10日後腹水を集め、800xgで遠心分離し、−20℃で貯
蔵した。

解凍された腹水を50000xgで60分間遠心分離された。
表面に浮かぶ脂肪層を注意深く取除きタンパク質濃度を
10〜12mg/mlの濃度に調整した。

粗製イムノグロブリンを0.9容量等量の飽和硫酸アン
モニウムを０℃で滴加することにより沈澱させ、次いで
20mM Tris−HCl/50mM NaCl（pH7.9）中に溶解し、同一
緩衝液に対して透析した。イムノグロブリン画分は20mM
Tris−HCl/25−400mM NaCl（pH7.9）の緩衝液勾配系を
用いてDEAE−D52セルロース（Whatman）クロマトグラフ
ィにより得られた。このイムノグロブリンを再び硫酸ア
ンモニウムで沈澱させ、PBS中に10mg/mlの濃度で溶解し
た。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）は95％を越えるモノクローナル抗体
の純度を示す。

ｅ）モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの決定 クローン化されたハイブリドーマ細胞により産生され
るモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスはクラス
及びサブクラス特異的ウサギ抗体（Bionetics）を用い
てOuchterlonyの公知の免疫拡散技術（寒天−ゲル免疫
拡散法）により決定した。

mAbsのサブクラスは下記の通りである： 405B.33.3:γ₁K 406A.23.7:γ₂bK 407A.15.27:γ₂bK ｆ）酸素イムノアッセイ（ELISA）：マイクロタイター
プレートを、ウエル当り0.5μｇの100μPBS中ｔ−PA
調製物（純度＞95％）で被覆した。このプレートの遊離
結合能力を0.2％NaN₃（w/v）（pH7.4）を含有するPBS中
0.2％ゼラチンの緩衝液で飽和した。それぞれモノクロ
ーナル抗体405B.33.3,406A.23.7及び407A.15.27を含有
する100μのプローブをウエル内で37℃で２時間イン
キュベートした。プレートを0.05％Tween20を含有するP
BSで洗浄し、次いでホスファターゼ結合ウサギ抗−マウ
スイムノグロブリン調製物と共に37℃で２時間インキュ
ベートした。固定された酵素を、酵素基質ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート〔0.5mM MgCl₂及び0.02％（w/v）Na
N₃、pH9.8を含有するジエタノールアミン緩衝液10％中1
mg/ml〕と共にインキュベート（37℃、30〜60分）する
ことにより発色せしめ、そして405nmにおける光学密度
を測定した。

同じELISAをウロキナーゼを用いて行った。mAbのいづ
れもウロキナーゼに結合しなかった。全てのmAbはｔ−P
A特異性であった。

ｇ）カゼイン溶解アッセイ（中和試験）： mAb類の阻害作用を求めるために、ｔ−PAを先ずそれ
ぞれmAb405B.33.3,406B.23.7及び407A.15.27と混合し、
４℃で30〜60分間インキュベートした後、通常のカゼイ
ン／プラスミノーゲン寒天アッセイを行った（実施例20
B参照）。mAbのいづれも、mAb405B.33.3がカゼイン溶解
において遅れ（６時間を越える）を引起こす他は、ｔ−
PA活性を阻害しなかった。

実施例22:ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
の精製、一般的操作 形質転換された酵母細胞からの抽出液を実施例16と同
様にして調製した。プラスミドにより形質転換された哺
乳動物細胞例えばCHO細胞からの抽出液は下記の様にし
て調製された。

細胞は先ず70〜80％のコンフルエンスまで培養した。
次いで細胞単層を血清を省略する以外は上記と同様に培
地で濯ぎ、次いで細胞を更に５〜７日間培養した。培地
を24時間毎に採集し、同時に新しい培地を細胞に供給し
た。この様にして得られた条件化培地を次いで5000×ｇ
で30分間遠心分離し、0.45μｍフィルターを通して過
して望ましくない細胞破片を除去してアフィニテイクロ
マトグラフィを行った。アフィニテイマトリックスとし
てはエリスリナ・ラテシマ（Erythrina latissima）か
らの固定化プロテアーゼ阻害剤DE−３、或いはｕ−PA又
はｔ−PAに対する固定化抗体のいづれかが用いられた。

ｔ−PAの触媒作用Ｂ−鎖を含有するハイブリッドPA
を、上記の如く調製された条件化培地から或いはメラノ
ーマ細胞−条件化培地から、酵母細胞抽出液からのｔ−
PAの精製のために元々開発された実験方法〔C.Heussen
et al.,J.Biel.Chem.259,11635−11638（1984）参照〕
を用いて精製する。

全てのハイブリッドPA類は、親ｕ−PA及びｔ−PA酵素
に対してウサギ或いはヤギ中で産生されたポリクローナ
ル抗体を用いて、或いは親酵素に対して産生されたモノ
クローナル抗体（マウス起源）（これらが問題のハイブ
リイッドPA内に存在するエピトープを認識する場合）を
用いて精製された（実施例21参照）。選択された抗体は
Affigel或いはSepharose−4Bなどの不溶性マトリックス
上に固定化された。上記の如く調製された条件化培地或
いは酵素細胞抽出液を次いでアフイニテイ−マトリック
スのカラムにかけ、望ましくないタンパク質を適当な緩
衝液例えばダルベッコのPBS〔0.1g/ CaCl₂,0.2g/ K
Cl,0.2g/ KH₂PO₄,0.047g/ MgCl₂,8.0g/ NaCl,115
g/ Na₂HPO₄;J.Exp.Med.99,167（1954）〕を用いて洗
流し、次いでPAをカオトロピック（chaotropic）剤チオ
シアン酸カリウム〔M.Einarsson et al.,Bicehem.Bioph
ys.Acta830,1−10（1985）〕或いは低pH緩衝液例えば0.
1−0.2Mグリシン−HCl（pH2.1）を用いてカラムから溶
出した。

モノクローナル抗体を用いる精製の後、ハイブリッド
PA類は90％を越える純度を有する。

実施例23:UK₂TPA^B（BC）の精製 a.DE−3Sepharose カラムの調製 シアノーゲンブロマイド活性化Sepharose4B （Pharm
acia）に、ml当り5mgのエリスリナ・ラテイシマ（Eryth
rina latissima）からの精製された阻害剤〔F.J.Joube
rt et al.,Hoppe−Seyler′s Zeitschr.Physiol.Chem.3
02.531（1981）〕を製造元の指示事項に従ってカップリ
ングさせた。マトリックスを0.2M NaCl,0.1％Synperoni
c 及び0.02％ナトリウムアシドを含有する0.2M酢酸ア
ンモニウム緩衝液pH7.0で平衡化させた。

b.DE−3 Sepharose4B 上でのUK₂TPA^B（BC）のクロマト
グラフ精製 条件化培地（実施例22参照）をSynperonie に対して
0.1％とし、次いでDE−3Sepharose にかけた。４℃で
１時間ゆっくり撹拌後、DE−3Sepharose4B をカラムに
注ぎ280nmにおけるUV吸光度が溶出液中のタンパク質の
不存在を示すベースラインレベルの到達するまで0.2mM
NaCl,0.1％Synperonicで洗浄した。洗浄を次いで0.2Mチ
オシアン酸アンモニウム及び0.1％Synperonieを含有す
る0.2M酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.0）を用いて継続
した。280nmにおけるUV吸光度が溶出液中のタンパク質
の不存在を示した後、カラムを1.6Mチオシアン酸アンモ
ニウム及び0.1％Synperonic を含有する0.2M酢酸アン
モニウム緩衝液（pH7.0）で溶出した。Cbz−Gly−Gly−
Arg−AMCを基質として用いる〔M.Zimmerman et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.75,750（1978）〕螢光定量アッセ
イを用いて測定した最高のアミド分解活性を有する画分
をプールした。DE−3Sepharose4B 物質に適用された活
性の少なくとも80％が単一ピーク内に回収された。

プールされた活性画分を、0.1％Synperonie を含有
する0.2M酢酸アンモニウム緩衝液に対して透析し、内在
ｔ−PAを除去するために、ｔ−PAの第１クリングル領域
に向けられたモノクローナル抗体であって、Sepharose4
B にカップリングされ、そして0.1％Synperonic を含
有する0.2M酢酸アンモニウム緩衝液中（pH7.0）で平衡
化されたモノクローナル抗体407A.15.27を含有するカラ
ムにかけた。UK₂TPA^B（BC）を含有する抽出液を集め
た。

寸法４×110mmを有するNucleosil 300−５−C18カラ
ム上での精製UK₂TPA^B（BC）の逆相HPLCは、0.1％トリフ
ルオロ酢酸を含有する水よりなる溶液A70％及び0.08％
のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルよりなる
溶液B30％から出発し、そして40％Ａ及び60％Ｂで終る3
0分間に亘る線形勾配による溶出で単一ピークを示す。
この精製タンパク質は最初の10個のアミノ酸残基のＮ−
末端配列分析をした際に配列SNELHQVPSNを示し、これは
この分子をコードするDNA配列から期待された配列と同
一であった。

実施例24:FK₂UPA^B（BC）及びK₂UPA^B（BC）の精製 a.抗体アフィニテイカラムの調製 ウサギ抗−uPA血清から精製したウサギ抗−uPA抗体、
並びにモノクローナル抗体405B.33.3及び406A.23.7を、
活性化されたSepharosse ml当り6mgの抗体を用いて、製
造者の指示事項に従ってシアノーゲンブロマイド活性化
Sepharose4B （Pharmacia）にカップリングした。ゲル
マトリックスは0.1％Synperonic 及び0.1％のナトリウ
ムアシドを含有するPBSで平衡化した。

b.抗体Sepharose4B上のFK₂UPA^B（BC）及びK₂UPA^B（BC）
上のクロマトグラフ精製 条件化培地（実施例22参照）をSynperonic に関して
0.1％とし、抗−uPA Sepharose−4B或いは405B.33.3或
いは406A.23.7Sepharose4Bにかけた。後者の二つの抗体
はｔ−PAの第２クリングルドメインに向けられたもので
あった。４℃において２時間ゆっくり撹拌後、抗体Seph
aroseをカラム内に注ぎ、280nmにおけるUV吸光度が溶出
液におけるタンパク質の不存在を示すまで1M NaCl及び
0.1％Synperonic を含有するPBSで洗浄した。カラムを
次いで0.2Mグリシン−HCl緩衝液（pH2.5）で溶出した。
画分を中和量の1M Trisを含有する管内に集めた。Cbz−
Gly−Gly−Arg−AMCを基質として用いる螢光定量アッセ
イ〔M.Zimmermann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75,
750（1978）〕で測定した高度アミド分解活性を含有す
る画分をプールした。

寸法４×110mmを有するNucleosil 300−５−C18カラ
ム上での精製FK₂UPA^B（BC）及びK₂UPA^B（BC）の逆相HPL
Cは、0.1％トリフルオロ酢酸を含有する水よりなる溶液
A70％及び0.08％のトリフルオロ酢酸を含有するアセト
ニトリルよりなる溶液B30％から出発し、そして40％Ａ
及び60％Ｂで終る30分間にわたる直線勾配による溶出で
単一ピークを示す。精製タンパク質の最初の５個の残基
のＮ−末端配列分析の結果、K₂UPA^B（BC）について配列
SYQGN、及びFK₂UPA^B（BC）について配列からSYQVIが得
られ、これらは各分子のDNA配列から期待される配列に
同一であった。

実施例25:フィブリノーゲン断片の存在下或いは不存在
下におけるハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
の活性測定 プラスミノーゲンアクチベータによるプラスミノーゲ
ンのプラスミンへの転換、及びこれに続くプラスミンと
発色プラスミン基質Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−ロイシン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩との反応に基
づき、Verheyen et al.〔Thromb.Haemost.48,266（198
2）〕により記載されている二重速度アッセイを用い
た。このアッセイは96個のウエルを有するマイクロタイ
タープレート中においてTitertek マイクロタイタープ
レート読取器を用いて行った。これらのウエルは、0.1
％Tween80を含有する0.1モル／ Tris/HCl緩衝液（pH
7.5）120−X μ、上記Tris緩衝液中1.3μモル／のG
lu−プラスミノーゲン20μ、Tris緩衝液中0.7mモル／
のプラスミン基質100μ、公知濃度の試料（Ｘはそ
れぞれ10,20,40及び60μに対応する）X μ或いは国
際単位で表わされた規定された活性のウロキナーゼ標準
X μ、及び蒸留水中3mg/mlの刺戟剤（フィブリノーゲ
ン断片）10μ或いは実験が刺戟剤なしに行われる場合
には10μの蒸留水、を含有する。インキュベーション
時間の平方で除された光吸収の増加は、既知アクチベー
タ濃度におけるプラスミノーゲンアクチベータ活性に比
例し、国際単位で表わされる。国際単位で表わされる定
義された活性を有する高分子量ウロキナーゼ（American
Diagnostics）が標準として用いられた。各プラスミノ
ーゲンアクチベータはそれぞれフィブリノーゲン断片の
不存在下或いは存在下において同一条件下で分析され
た。これらの条件下において得られた活性の差異はフィ
ブリノーゲン断片によるプラスミノーゲンアクチベータ
の刺戟の目安となる。表２は分析結果を示し、それはウ
ロキナーゼの触媒作用ドメインを含有する新規プラスミ
ノーゲンアクチベータ分子に対してフィブリノーゲン断
片により及ぼされる刺戟とは対照的に、ウロキナーゼ標
準に対する刺戟の不存在を示す。組織プラスミノーゲン
アクチベータの１個以上の非触媒作用ドメインF,G,K1、
或いはK2の不存在の如何に拘らず全ての試験されたハイ
ブリッド分子に対してフィブリノーゲン断片による刺戟
が観察された。

表 ２ プラスミノーゲンアクチベータ I.U.刺戟/I.U.非刺戟 ｕ−PA標準 1.0 FGK₂UPA^B（BC） 5.0 FK₂UPA^B（BC） 10.0 K₂UPA^B 6.0 FUPA^B 3.6 実施例26:変異体プラスミノーゲンアクチベータの血餅
溶解活性 血餅溶解活性はR.D.Philc及びP.J.Gaffney〔Thromb.H
aemost.45,107−109（1981）〕により記載されたアッセ
イを用いて求めた。溶解時間対プラスミノーゲンアクチ
ベータ濃度の対数プロットの結果、直線が得られた。プ
ラスミノーゲンアクチベータの比活性は組織プラスミノ
ーゲンアクチベータ或いはウロキナーゼの標準調製物か
ら得られた曲線と対比することにより得られた。

測定された全てのアクチベータの曲線は血餅溶解に必
要とされた時間とそれらの比活性の直接の関係を許容す
るほぼ同一の傾斜を有した。異ったプラスミノーゲンア
クチベータは同一分子量を有しないので、異った分子の
効率に対して意味のある標準を得るためには、通常の重
量濃度の代りに比活性をモル濃度で表わさなければなら
ない。UK₂TPA^B（BC）は少なくとも標準ｔ−PAと同程度
に活性であることが判明したのに対し、FGK₂UPA^B（BC）
及びFK₂UPA^B（BC）は殆んどｔ−PAに等しいが、しか
し、ｕ−PA標準よりは相当に高い活性を示した。K₂UPA^B
（BC）はｕ−PA標準と殆んど同一の活性を有することが
判明した。分析活性を表３にまとめて示す。

表 ３ プラスミノーゲンアクチベータ 血餅溶解単位/Pモル^＊ ｔ−PA標準 23.6 UK₂TPA（BC） 28.6 ｕ−PA標準 13.2 FGK₂UPA^B（BC） 24.3 FK₂UPA^B（BC） 20.7 K₂UPA^B（BC） 10.4 FUPA^B（BC） 2.7 ＊血餅溶解単位はそのアミノ酸配列に基づくｔ−PAの分
子量及び400,000血餅溶解単位/mgの比活性を用いてピコ
モルｔ−PAで表わされる。

実施例27:プラスミノーゲンアクチベータ変異体分子の
ウサギの循環系からのクリアランス 1.標識化 全ての変異体分子をヨードゲン法〔P.J.Fraker et a
l.,Biochem.Biophys.Res.Comman.80,849−857（197
8）〕を用いて¹²⁵Iで放射線標識化した。

過剰の遊離¹²⁵Iを除去するために、変異体分子を実施
例３（ｔ−PA Ｂ−鎖を有するPA）に記載される方法或
いは実施例24（ｕ−PA Ｂ−鎖を有するPA）に記載され
る方法のいづれかを用いてアフィニテイ精製した。

２−20μCi/μｇタンパク質の比放射性活性が通常得
られた。標識化された分子の均質性はSDS電気泳動に引
続き、Ｘ−線オートラジオグラフィを行って推定した。
全ての場合において、変異体分子は非還元化条件下にお
いて単一バンドとして移動し、そしてMrは非標識化タン
パク質と同一であった。

2.クリアランス研究 実験は1.8〜2.4kgの体重のニュージーランド白色ウサ
ギにおいて行った。これらの動物は1750mg/kgのUrethan
（Merck,Darmstadt,西ドイツ）を用いて皮下投与麻酔
した。気管切開を行い、プラスチックチューブを外部頚
静脈及び共通頚動脈に挿入した。変異体PA約300〜500ng
を含有する0.5mlリン酸緩衝塩溶液を頚静脈中に注射
し、そして逐次血液試料（各2ml）を頚動脈を介して60
分間に亘って逐次獲得した。

血液試料をクエン酸塩上に集め、直ちに3000rpmで15
分間遠心分離し、血漿を傾瀉分離した。アリコートを10
％トリクロロ酢酸中で沈澱させペレットをγ−カウンタ
ー中でカウントした。

Bowesメラノーマ細胞系統から単離したｔ−PAに対比
して、変異体分子は循環系における次の様な半減期を示
す。

ｔ−PAのクリアランスパターンは典型的に極めて迅速
なα−期に引続きより遅いβ−期クリアランスを伴い、
典型的に二次指数的である。UK₂TPA^B（BC）及びK₂UPA^B
（BC）のクリアランスは殆んど単相的であり、第二コン
パートメントへ分布が抑制されていることを示唆する。

3.器官分布 ウサギは上記の如く処理した。ヨード化変異体分子の
注射の20分後にウサギを殺し、主たる器官を取出し重量
を測定し、均質化後のアリコートをγ−カウンター中で
カウントした。

表 ５ 回収放射活性のパーセント ｔ−PA UK₂TPA^B（BC） K₂UPA^B（BC） 肝臓 40 10 ７ 心臓 ＜１ ＜１ ＜１ 肺 ＜１ ＜１ ＜１ 脾臓 ＜１ ＜１ ＜１ 腎臓 1.6 ２ ４ 変異体PAは、放射性活性分子の大部分がなお循環系
（上記）に残存することを示し、はるかに減少した肝臓
−クリアランスと一致する。肝臓による減少した摂取は
従って、変異体分子特にUK₂TPA^B（BC）及びK₂UPA^B（B
C）の延長された半減期及び単相クリアランスパターン
に対する説明となる。

実施例28〜34においては、プラスミドpCGC5/K₂UPA^B,p
CGC6/FUPA^B,pCGC7/FK₂UPA^B及びpCGC8/FGK₂UPA^B（実施例
18参照）を用いて酵母発現プラスミドを造成した。酵母
インベルターゼシグナル配列を異るコード化配列にイン
フレーム融合した。それらは誘導性PHO5プロモーターの
制御下に発見された。ある造成体においては、グリコシ
ル化部位を変異させた。

実施例28:ファージF1複製原の発現ベクターpJDB207中へ
のクローニング pEMBL系のプラスミド〔Dente et al.,Nucl.Acids Re
s.11,1645−55（1983）〕はDNA複製及び形態形成に対す
る全てのシス−作用要素を与えるファージF1ゲノムの領
域を含有する。ファージF1（ヘルパー）によるスーパー
インフェクション時にのみ多量の一本鎖プラスミドDNA
が培地中に排出される。

プラスミドpEMBL19（＋）をSea I及びEcoR Iで消化し
た。pBR322（Sca I部位）のアンピシリン耐性遺伝子の
部分、F1遺伝子間領域及びポリリンカー領域（EcoR I部
位）までのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分を含有す
る2.2kb断片を単離した。

プラスミドpJDB207をHpa Iで切断することにより線状
化した。10μｇの線状化されたプラスミドを0.1mg/mlの
エチジウムブロマイドの存在下において37℃において24
0分間7.5単位のEcoR Iで部分的に消化した。反応は10mM
EDTAを添加することにより停止した。1.8kbのEcoR I−
Hpa I断片を調製0.8％アガロースゲル上で単離した。

３μｇのHpa I切断pJDB207を更にSca Iで消化した。
4.8kbの大Hpa I−Sca I断片を単離した。DNA断片をアガ
ロースゲルブロックから電気溶出し、DE52クロマトグラ
フィ及びエタノール沈澱により精製した。

各々0.2pモルの2.2kb Sea I−EcoR I断片及び1.8kb E
coR I−Hpa I断片、並びに0.1pモルのHpa I−Sca Iベク
ター断片を連結した。この連続混合物を用いてコンピテ
ントE.coli HB101 Ca²⁺細胞を形質転換した。

12個のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドDNAをE
coR I/Pst I二重消化により分析した。正しい制限断片
を有する単一クローンのDNAを選択し、pJDB207F1lacと
称する。

実施例29:プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^Bの造成 プラスミドpCGC7/FK₂UPA^Bに存在するFK₂UPA^Bのコード
配列を、酵母インベルターゼシグナル配列を融合し、そ
してこの遺伝子をPHO5プロモーターの制御下に発現する
ことにより酵母内で発現するよう適応させた。

プラスミドpCGC7/FK₂UPA^B（実施例18D参照）をPst I
及びBamH Iで消化した。この1147bp Pst I−BamH I断片
はｔ−PAのヌクレオチド位置199におけるPst I部位（第
１図）からｕ−PAの位置1322におけるBamH I部位（第３
図）までのFK₂UPA^Bコード配列を含有する。

プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−TPA（実施例6C参照）
をSal I及びPst Iで切断した。891bp断片を単離した。
それはPHO5プロモーター、インベルターゼシグナル配列
及びｔ−PAの19塩基（Pst I部位）を含有する。

プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−UPA（実施例８参照）
をSal I及びBamH Iで消化した。6.6kbベクター断片はヌ
クレオチド位置1323（第３図）におけるBamH I部位から
位置1441（付加したXho IリンカーのPvu II部位）及びP
HO5転写停止シグナルまでのｕ−PA遺伝子の３′部分を
含有する。

各々0.2pモルの891bp Sal I−Pst I断片及び1147bp P
st I−BamH I断片及び0.1pモルの6.6kb Sal I−BamH I
ベクター断片を連結し、E.coli HB101Ca²⁺細胞の形質転
換に用いた。

８アンピシリン耐性コロニーをアンピシリン（100mg/
）を含有するLB培地中において生育せしめた。プラス
ミドDNAを単離し、EcoR I及びHind III制限消化により
分析した。期待された制限断片を有する一つのプラスミ
ドを選びpJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^Bと称する。

プラスミドpCGC6/FUPA^B及びpCGC8/FGK₂UPA^BをpCGC7/F
K₂UPA^Bと同様にして使用することができる。得られた酵
母発現プラスミドをそれぞれpJDB207/PHO5−Ｉ−FUPA^B
及びpJDB207/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^Bと称する。

実施例30:ウロキナーゼＢ−鎖の〔Asn302〕におけるグ
リコシル部位の突然変異 ａ）ｕ−PAのPst I−BanH I断片のM13mp18中へのクロー
ニング： プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−UPA（実施例８参照）
はウロキナーゼの完全コード領域を含有する。このDNA
をPst I及びBamH Iで切断した。ウロキナーゼ遺伝子か
らの886bp Pst I−BamH I断片はヌクレオチド位置1033
−1041にグリコシル部位（Asn302）を含有する。同様な
大きさのもう一つの断片を更にBstE IIにより切断し
た。この886bp Pst I−BamH I断片を調製0.8％アガロー
スゲル上で単離した。

M13mp18 RF−DNAをPst I及びBamH Iで切断した。この
7.3kb断片を調製用0.8％アガロースゲル上で単離した。
DNA断片をアガロースゲルから電気溶出し、DE52クロマ
トグラフィ及びエタノール沈澱により精製した。

0.1pモルの7.3kb Pst I−BamH I切断ベクター及び0.2
pモルの886bp Pst I−BamH I u−PA断片を連結した。こ
の連結混合物の１μ及び３μを用いてAmershamによ
り発行されたマニュアル“M13 eloning and sequeneing
handbook"に従ってE.col JM109Ca²⁺細胞の形質転換を
行った。12個の無色プラークを拾い上げ、一本鎖DNAを
調製した〔J.Messing,Methods in Enzymology101,21−7
8（1983）〕。この一本鎖DNAを用いてM13万能プライマ
ーをクレノウポリメラーゼでアニーリングし、延長する
ことにより部分的に二本鎖DNAを調製した。反応生成物
をフェノール／クロロホルムで抽出し、DNAをエタノー
ルで沈澱させた。このDNAをPst I及びBamH Iで切断し
た。886bp断片はｕ−PA断片がM13mp18ベクターにクロー
ン化されたことを示す。一つのクローンを更に分析し、
正しいインサートが配列決定により確認された。このク
ローンをM13mp18/UPAと称する。

ｂ）Asn302におけるグリコシル化部位の突然変異： 突然変異誘発及び配列決定プライマーはホスホルアミ
ダイト法〔M.H.Caruthers,in:Chemical and Enzymatic
Synthesis of Gene Fragments（編者H.G.Gassen and A.
Lang）Verlag Chemie,Weinheim,ドイツ連邦共和国〕を
用いてApplied Biosystem Model380Bシンセサイザー上
で合成した。

一本鎖鋳型DNA上でのin vitro突然変異誘発はT.A.Kun
kel〔Proc.Nat.Acad.Sci.USA82、488−492（1985）〕に
より記載されるようにして行った。ウラシル含有一本鎖
鋳型DNAをE.coli菌株RZ1032（dut^-,ung^-）の１サイクル
の増殖により生産した。

100pモルの突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマ
ーＷを20μの50mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5m
M DTT、0.5mM ATP及び20UのT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Boehringer）中でホスホリル化した。37℃で30分
後、反応を70℃で10分間加熱することにより停止した。

0.3pモルのウラシル含有M13mp18/UPA鋳型DNAを10pモ
ルのホスホリル化突然変異誘発オリゴデスオキシリボヌ
クレオチドプライマーＷ及び10pモルのM13万能配列決定
プライマーと30μの10mM Tris−HCl pH8.0、10mM MgC
l₂中でインキュベートした。試料を80℃に加熱し、小さ
な水浴中において室温まで冷却した。

ｃ）延長−連結反応： 上記アニーリングされた試料に10μの1mM dNTPs、1
0mM Tris−HCl pH8.0、10mM MgCl₂、20mM DTT、1mM AT
T、400単位T4 DNAリガーゼ（Biolabs,400U/μ）及び
６単位のクレノウDNAポリメラーゼ（Boehringer,6U/μ
）を含有する酵素−dNTP混合物を添加した。インキュ
ベーションは15℃で一昼夜行われた。

ｄ）E.coli BMH71細胞の形質転換： この連結混合物をTEで200μに稀釈した。この延長
−連結混合物の0.1μ,1μ及び10μをコンピテン
トE.coli BMH71Ca²⁺細胞（Kunkel,上記）に添加した。
氷上で30分後細胞を42℃において３分間ヒートショック
を与え、次いで氷上に保った。細胞を上層寒天及びE.co
li JM101インジケーター細胞と共にプレートした。

６個のプラークを拾い上げE.coli JM109を感染させ
た。ファージをPEG沈澱により上澄液から単離した。一
本鎖DNAをフェノールによる抽出及びエタノールによる
沈澱により調製した。鋳型DNAをTE中に再懸濁した。

AATコドン（Asn302）からCAAコドン（Gln302）への突
然変異は一つのクローンに対して鎖ターミネション法
〔F.Sanger et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA74、5463−6
7（1977）〕を用いて上記配列決定プライマーによるDNA
配列決定により確認された。この突然変異の結果、ｕ−
PAのアミノ酸位置302においてAsn→Gln変化が生じてウ
ロキナーゼにおける単一グリコシル化部位が除去され
る。Ｗはｕ−PA B−鎖におけるグリコシル化部位の突然
変異を示す（Asn302→Gln302）。陽性クローンはM13mp1
8/UPA−Ｗと称される。

実施例31:ウロキナーゼＢ−鎖中の突然変異〔Gln302〕
のKK₂UPA^Bハイブリッドへの転移 プラスミドpJDD207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^BをSal I及びXh
o Iで消化した。この2.2kb Sal I−Xho I断片を単離
し、アガロースゲルから電気溶出し、DE52クロマトグラ
フィで精製しそしてエタノール中で沈澱させた。このDN
A断片はPHO5プロモーター及びｕ−PA配列において２個
のMst I部位を含有する。３μｇの2.2kb Sal I−Xho I
断片を３単位のMst Iで37℃において10分間消化した。
反応生成物を調製用0.8％アガロースゲル上で分離し、1
651bp Sal I−Mst I断片を単離し、そしてゲルから電気
溶出した。このDNA断片はpBR322のSal I−BamH I配列、
PHO5プロモーター、インベルターゼシグナル配列及びヌ
クレオチド位置935におけるｕ−PA部のMst I部位までの
FK₂UPA^Bコード配列を含有する。

RF−DNAをM13mp18/UPA−Ｗ（実施例30参照）について
迅速DNA単離法〔D.S.Holmes et al.Analyt.Biochem.11
4、193−97（1981）〕により調製した。５μｇのDNAをB
amH I及びMst Iに消化した。２μｇのRNase（Serva）を
添加し、37℃で５分間インキュベート後、387bp Mst I
−BamH I断片を調製0.8％アガロースゲル上で単離し
た。このDNA断片を電気溶出し、エタノール中で沈澱さ
せた。この断片はウロキナーゼＢ−鎖におけるヌクレオ
チド位置1033−1035（Asn302→Gln）においてAAT→CAA
の突然変異を含む。

プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−UPAをSal I及びBamH I
で切断した。この6.6kbのベクター断片（実施例29参
照）を単離した。0.2pモルの1651bp Sal I−Mst I断
片、0.2pモルの387bp Mst I−BamH I断片及び0.1pモル
の6.6kb Sal I−BamH Iベクター断片を連結した。コン
ピテントE.coli HB101Ca²⁺細胞を形質転換した。

12個のアンピシリン耐性形質転換体を生育せしめた。
プラスミドDNAを単離し、EcoR I及びHind III制限切断
により分析した。グリコシル化部位における突然変異
（Ｗ）はヌクレオチド位置1032−1037におけるEcoR I部
位を破壊した。突然変異の存在はDNA配列決定により確
認された。ｕ−PAB−鎖内に突然変異を有する一つのプ
ラスミドDNAはpJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−Ｗと称され
る。このプラスミドはクリングルK₂において無傷のグリ
コシル化部位を有するが、しかしｕ−PA B−鎖において
は突然変異部位Ｗ（Asn302→Gln）を有した。

プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−FUPA^B−Ｗ及びpJDB207
/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−Ｗを対応する未突然変異プラス
ミド（実施例29参照）から出発して同様にして造成し
た。

pJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−Ｗの4.8kb Sal I−Hpa
Iベクター部分をpJDB207F1Lac（実施例28参照）の6.2kb
Sal I−Hpa Iベクター断片により置換した。この6.2kb
断片は、pJDB207の4.8kb断片中にクローニングされたpE
MBL19の1.4kb F1Lacインサートを有した。連結の後、形
質転換しそして新しい造成物を分析してF1Lacインサー
トを有する一つの正しいプラスミドをpJDB207F1Lac/PHO
5−Ｉ−FK₂UPA^B−Ｗと称する。

プラスミドpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−Ｗを
同様にして得た。

同様にして、pJDB207/PHO5−Ｉ−MOU−K₂TPA^B（実施
例15C参照）の4.8kb Sal I−Hpa Iベクター部分をpJDB2
07F1Lacの6.2kb Sal I−Hpa Iベクター断片により置換
した。得られたプラスミドをpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−U
K₂TPA^Bと称する。プラスミドpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−U
K₂UPA^B、pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−TPA^A−UPA^B及びpJDB2
07F1Lac/PHO5−Ｉ−UPA^ATPA^BはF1Lacベクター断片なし
にこれらのプラスミドから同様にして得られた。

実施例32:FK₂UPA^B−ＷのクリングルK₂におけるグリコシ
ル部位〔Asn184Gly Ser〕の突然変異 ａ）一本鎖鋳型の調製 プラスミドpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−Ｗを用
いてコンピテントE.coli RZ2032Ca²⁺細胞〔T.A.Kunkel,
上記〕を形質転換した。一つのアンピシリン耐性コロニ
ーを100μg/mlのアンピシリン、20μg/mlのチミジン及
び20μg/mlのデスオキシアデノシンを補給したLB培地中
において生育せしめた。１・10⁸個/mlの細胞密度におい
て細胞を集め、LB培地中で洗浄し、そして100μg/mlの
アンピシリン、及び0.25μg/mlのウリジンを含有するLB
培地中に再浮遊させた。0.3のOD₆₀₀においてヘルパーフ
ァージR408（Pharmacia−PL Biochemicals,Inc.）を20
m.o.i.において添加した。この培養液を37℃において５
時間激しく振盪した。この培地中ウラシル含有一本鎖DN
AをT.A.Kunkel（上記）により説明されるのと同様にし
て単離した。pEMBL19（＋）（実施例28参照）から出発
して、F1領域を左廻り方向にpJDB207中にクローン化し
た。単離一本鎖DNAは発現プラスミド内のFK₂UPA^Bインサ
ートのセンス鎖であった。

ｂ）ｔ−PAのクリングルK₂のAsn184におけるグリコシル
化部位の突然変異： この突然変異はグリコシル化のコンセンサスアミノ酸
認識配列の第３位置に関する。Ser186がAlaにより置換
された。

突然変異実験方法は実施例30と同様であった。M13ユ
ニバーサル配列決定プライマーの代りに式５′−AGTCGA
GGTTAGTATGGC−３′のPHO5オリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いたところ、それはPHO5プロモーターにおけるAT
Gからのヌクレオチド−60〜−77にハイブリダイズし
た。延長及び連結反応の後、コンピテントE.coli BMH71
Ca²⁺細胞〔Kunkel上記〕を形質転換した。アンピリシン
耐性コロニーを拾い上げ、100mg/のアンピシリンを含
有するLB培地中において生成せしめた。プラスミドDNA
を調製し、DNA配列決定により突然変異の存在を分析し
た。TCAコドンのGCAへの突然変異の結果、ｔ−PAのアミ
ノ酸位置186においてSer→Alaの変化が生じた。コンセ
ンサス配列の第３位置における突然変異はグリコシル化
部位を除去した。突然変異DNAを有する一つのクローン
をpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−WYと称する。

Ｙはｔ−PAのK₂におけるAsn184のグリコシル化部位の
突然変異を示し、Ｗはｕ−PAB−鎖内のAsn302における
突然変異を示す。得られた非グリコシル化FK₂UPA^Bハイ
ブリッドタンパク質は次の二つのアミノ酸変化即ちｔ−
PAクリングルK₂におけるSer186→Ala及びｕ−PAB−鎖に
おけるAsn302→Glnを有する。

プラスミドpJDB207L1Lac/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−Ｗ
（実施例31参照）の同様な突然変異は非グリコシル化FG
K₂UPA^Bハイブリッドタンパク質をコードするプラスミド
pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−WYを導く。

実施例33:プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−K₂UPA^B−WYの
造成 アミノ酸配列tPA（Ser1−Gln3）（Gly176−Arg275）
−uPA（Ile159−Leu411）により定義されるハイブリッ
ドK₂UPA^Bタンパク質をコードするヌクレオチド配列はプ
ラスミドpCGC5/K₂UPA^B中に含有させた。酵母内での発現
のために、誘導性PHO5プロモーターを用いインベルター
ゼシグナル配列をK₂UPA^Bコード化領域にインフレーム融
合した。プラスミドpCGC5/K₂UPA^BをBal II及びAcc Iで
切断した。487bp Bgl II−Acc I断片を単離した。それ
はｔ−PAのBgl II部位（ヌクレオチド位置178）からｕ
−PA内のAcc I部位（ヌクレオチド位置779）までのコー
ド領域を含有した。この断片をHph Iで切断したところ
４個の断片が得られた。

次式で表わされる二つのオリゴデスオキシリボヌクレ
オチド （II）３′−AGAATGGTTCCTTTGTCACTGACGAT GAAACCCTTACCCCGTCGGATGGCACCGTG−５′ をApplied Biosystem Model380Bシンセサイザー上でホ
スホルアミダイト法を用いて合成した。オリゴヌクレオ
チド類Ｉ及びIIは二本鎖DNAリンカーを形成した。ジグ
ザグ状５′末端の５個のヌクレオチドは酵母インベルタ
ーゼシグナル配列の部分であり、これに続いてヌクレオ
チド位置752における第１のHph I切断部位へのｔ−PAコ
ード配列（Ser1−Gln3）（Gly176−Thr191）がある。位
置729−737（Asn Gly Ser）におけるグリコシル化部位
はTCA（Ser）〜GCA（Ala）までの合成配列において突然
変異され、グリコシル化認識配列が除去される。ｔ−PA
のアミノ酸位置184−186におけるグリコシル化部位（例
えば、真性ｔ−PAにおける第２番目のグリコシル化部
位）の突然変異はＹにより示される。

オリゴヌクレオチドＩ及びIIはこれらの５′末端にお
いてホスホリル化され、85℃で10分間加熱され、室温に
冷却される際にアニーリングされた。10.5μｇ（270pモ
ル）のキナーゼ処理された二本鎖リンカーDNAを実施例8
Bに記載したように30倍モル過剰にてHph I切断DHA断片
（上記参照）に連結した。過剰リンカー分子をイソプロ
パノールによる沈澱により除去した。このDNAを更にSca
Iで消化した。この252bp断片を調製用1.5％アガロース
ゲルで単離し、電気溶出し、そしてエタノール中で沈澱
させた。

プラスミドp31RIT−12（実施例6B参照）をSal I及びX
ho Iで消化した。単離された断片を更にHga I（実施例6
C参照）及びBamH Iで消化した。得られた591bp BamH I
−Hga I断片を単離した。それはPHO5プロモーター及び
インベルターゼシグナル配列を含有した。

プラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−ＷをBamH I
で消化した。５μｇのこの線状DNAを10単位のSca Iで10
分間部分的に消化した。10mM EDTAを添加することによ
り反応を停止した。7.7kb BamH I−Sca Iベクター断片
を単離し、電気溶出しそしてエタノール中で沈澱させ
た。これはｔ−PAにおけるSca I部位（位置953）からｕ
−PA B−鎖の末端（Xho Iリンカーが添加された位置144
1におけるPvu II部位）までのコード化領域の３′部
分、PHOターミネーター及びpJDB207ベクター配列を含
む。各々0.2pモルの591bp BamH I−Hga I断片及び252bp
粘着末端（リンカー）−Sca I断片及び0.1pモルの7.7kb
ベクター断片を連結した。E.coli HB101Ca²⁺細胞を形質
転換後、12個のアンピシリン耐性コロニーを生育させ
た。プラスミドDNAを単離し、EcoR I及びHind III消化
により分析した。突然変異の存在はDNA配列決定により
検証した。一つの正しいクローンを選びpJDB207/PHO5−
Ｉ−K₂UPA^B−WYと称する。ｔ−PA及びｕ−PAB−鎖にお
けるクリングルK₂のグリコシル化部位は共に突然変異さ
れた（それぞれＹ及びＷ）。

得られた未グリコシル化K₂UPA^Bハイブリッドタンパク
質は二つのアミノ酸変化（ｔ−PA K₂領域におけるSer18
6→Ala及びｕ−PA B−鎖におけるAsn302→Gln）を有し
た。

実施例34:UK₂TPA^Bハイブリッドにおけるグリコシル化部
位〔Asn184Gly Ser〕及び〔Asn448Arg Thr〕の突然変異 プラスミドpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−UK₂TPA^B（実施例
31参照）のウラシル含有一本鎖鋳型〔T.A.Kunkel,上
記〕を実施例30と同様にして調製した。Asn184における
グリコシル化部位の突然変異方式は実施例32に説明した
のと同様であった。Asn448におけるグリコシル化部位の
突然変異の結果Thr450→Alaアミノ酸変化が生じた。

突然変異実験方法は実施例30において説明したと同様
であった。ホスホリル化された突然変異誘発プライマー
Ｙ及びＺを共にpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−UK₂TPA^Bのウラ
シル含有一本鎖鋳型にアニーリングした。PHO5オリゴヌ
クレオチドプライラー（実施例32参照）の追加の使用は
任意である。

延長及び連結反応の後、コンピテントE.coli BMH71Ca
²⁺細胞を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体の
プラスミドDNAを調製し、示された配列決定プライマー
により両方の突然変異の存在を分析した。

両方の突然変異を有する一つのクローンのプラスミド
DNAをpJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−UK₂TPA^B−YZと称する。
ＹはAsn184におけるグリコシル化部位の突然変異を示
し、及びＺはAsn448における突然変異を示す。この非グ
リコシル化UK₂TPA^Bハイブリッドタンパク質は次の二つ
のアミノ酸変化、即ちｔ−PAのK₂クリングルにおけるSe
r186→Ala及びｔ−PA B−鎖におけるThr450→Alaを有し
た。

この突然変異実験方法は又、pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ
−UK₂UPA^B,pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−TPA^AUPA^B及びpJDB2
07F1Lac/PHO5−Ｉ−UPA^ATPA^B（実施例31参照）の鋳型に
も適用可能であり、この場合、ｕ−PA B−鎖におけるグ
リコシル化部位の突然変異のための突然変異誘発プライ
マーＷ及び／又は突然変異誘発プライマーＹ及びＺ、並
びにｔ−PAにおけるグリコシル化部位の突然変異のため
にヨーロッパ特許出願225286号明細書に記載されている
その他のものが使用される。

実施例35:サッカロミセス・セレビジアエGRF18の形質転
換及び酵母細胞抽出液の調製 プラスミド pJDB207/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B, pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−W, pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FK₂UPA^B−WY, pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−UK₂TPA^B, pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−UK₂TPA^B−YZ, pJDB207/PHO5−Ｉ−K₂UPA^B−WY, pJDB207/PHO5−Ｉ−FUPA^B, pJDB207/PHO5−Ｉ−FUPA^B−W, pJDB207/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B, pJDB207/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−W, pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−Ｗ及び pJDB207F1Lac/PHO5−Ｉ−FGK₂UPA^B−WY をサッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cere
visiae）菌株GRF18（DSM3665）中に形質転換した。形質
転換、細胞の生育及び細胞抽出液の調製は実施例16に記
載されている。

得られたハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
は実施例22〜24に説明された方法と同様にして精製する
ことができる。

実施例36:凍結乾燥ハイブリッドプラスミノーゲンアク
チベータの調製 実施例22〜24のいづれかで得られた溶液を更に下記の
如く精製しそして凍結乾燥した。

溶液を10容の0.1M酢酸アンモニウム（pH5.0）（全容
量80ml）で稀釈し、5mlのCM−Sepharose Fast Flow（Ph
armacia）を含有するカラムに室温で25ml/hの流速で適
用した（カラムは0.1M酢酸アンモニウムで予備平衡化さ
れた）。生成物を含有しない過液を廃棄した。カラム
を15mlの0.1M酢酸アンモニウム（pH5.0）及び10μの
酢酸アンモニウム（pH7.0）で洗浄した。次いで、吸着
ハイブリッドPAの溶出を1M酢酸アンモニウムpH8.6によ
り室温で行った（流速5ml/h）。カラム上でのガス形成
を防止するために、溶出は１〜1.5バールの過剰圧力に
て行った。溶出液のハイブリッドPA含量はUVモニター
（280nm）により測定した。溶出ハイブリッドPAの約90
％を含有する画分を集め、凍結乾燥に付した。固体ハイ
ブリッドPA凍結乾燥物の純度はHPLCにより判断して約95
％を越えるものであった。生成物には洗剤が含まれなか
った。

実施例37:非経口投与用第一番目の医薬組成物 上記の如く得られた純粋uPA（１−44）−tPA（176−5
27）を含有する溶液を0.01％Tween80 を含有する0.3モ
ル濃度の塩化ナトリウムに対して透析し、−80℃で貯蔵
した。投与前に濃度を75μg/mlの全PA及び0.3M NaClに
調整した。溶液を0.22μｍ膜フィルターを通過させる
過により殺菌した。

上記PAの代りに同一量の前記実施例において説明した
異ったPA、例えば uPA（１−158）−tPA（276−527）， uPA（１−131）−tPA（263−527）， tPA（１−275）−uPA（159−411）， tPA（１−262）−uPA（132−411）， uPA（１−44）−tPA（176−261）−uPA（134−41
1）， tPA（１−49）−tPA（262−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−49）−uPA（134−411）， tPA（１−49）−tPA（176−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−49）−tPA（176−262）−uPA（132−41
1）， tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−86）−tPA（176−275）−uPA（159−411） 或いは tPA（１−86）−tPA（176−262）−uPA（132−41
1）， 或いは変異体ハイブリッドPA、例えば tPA（１−49）−tPA（262−275）−uPA（159−301,Gl
n,303−411）， tPA（１−49）−tRA（176−185,Ala,185−275）−uPA
（159−301,Gln,303−411）， uPA（１−44）−tPA（176−185,Ala,187−449,Ala,45
1−527）， tPA（１−３）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA
（159−301,Gln,303−411）或いは tPA（１−87）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA
（159−301,Gln,303−411）， などを用いることも可能である。

実施例38:非経口投与用の第二番目の医薬組成物（注射
用分散液） 169.3mgの大豆レシチン（大豆ホスファチドNC95、製
造者:Nattermann、Cologne、西ドイツ；純度90〜96％；
脂肪酸組成：リノール酸61〜71％、リノレン酸４〜７
％、オレイン酸６〜13％、パルミチン酸10〜15％、ステ
アリン酸1.5〜3.5％）、及び92.7mgの純粋ナトリウムグ
リコレートを752.5mlの殺菌水中に溶解した。溶液を1N
NaOHでpH7.4に調整した。10mgの凍結乾燥したuPA（１−
44）−tPA（176−527）を添加した。溶液を0.22μｍ膜
フィルターを通過させる過により殺菌し、アンプル中
に充填した。

上記PAの代りに、同一量の前記実施例に説明した異っ
たPA、例えば uPA（１−158）−tPA（276−527）， uPA（１−131）−tPA（263−527）， uPA（１−275）−uPA（159〜411）， tPA（１−262）−uPA（132−411）， uPA（１−44）−tPA（176−261）−uPA（134−41
1）， tPA（１−49）−tPA（262−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−49）−uPA（134−411）， tPA（１−49）−tPA（176−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−49）−tPA（176−262）−uPA（132−41
1）， tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（159−41
1）， tPA（１−86）−tPA（176−275）−uPA（159−411） 又は tPA（１−86）−tPA（176−262）−uPA（132−41
1）， 或いは変異体ハイブリッドPA、例えば tPA（１−49）−tPA（262−275）−uPA（159−301,Gl
n,303−411）， tPA（１−49）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA
（159−301,Gln,303,411）， uPA（１−44）−tPA（176−185,Ala,187−449,Ala,45
1−527）， tPA（１−３）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA
（159−301,Gln,303−411）又は tPA（１−86）−tPA（176−185,Ala,187−275）−uPA
（159−301,Gln,303〜411）， などを用いることも可能である。

実施例39:非経口投与用第三番目の医薬組成物（ボーラ
ス注射を含む） 100mgの実施例37及び38で述べたようなハイブリッド
プラスミノーゲンアクチベータ或いは変異体ハイブリッ
ドプラスミノーゲンアクチベータを0.7％NaClを含有す
る100mlの50mMグルタミン酸／グルタミン酸ナトリウ
ム、pH4.5中に溶解した。この溶液をアンプルに充填し
たが、これを静脈内（ボーラス）注入に使用することが
できる。

微生物の寄託 次の菌株はDeutsche Sammlung fr Mikroorganismen
（DSM）,Grisebachstrasse8,D−3000 Gttingenに1987
年１月23日に寄託された。

与えられた受入番号 受入番号 E.coli HB101/pW349F DSM 4291E.coli HB101/pCS16 DSM 4294E.coli HB101/pcUK176 DSM 4290E.coli HB101/pCGA26 DSM 4296E.coli HB101/pSV2911neo. DSM 4292 次のハイブリドーマ細胞系統は“Collection Nationa
le de Cultures de Microorganismes",Institut Pasteu
r,Paris（CNCM）に1987年11月20日に寄託された。ハイブリドーマ 受入番号 405B.33.3 Ｉ−715 406A.23.7 Ｉ−716 407A.15.27 Ｉ−717

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第３−３図はそれぞれヒトｔ−PA cDNA及
びヒトｕ−PA cDNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ
酸配列を図示する。成熟タンパク質の第１アミノ酸には
下線が付されている。 第２図及び第４図はそれぞれヒトｔ−PA cDNA及びヒト
ｕ−PA cDNAの制限酵素地図である。 第５図はプラスミドpEco0.47ΔSca Iを造成するために
用いられる技術の概略図である。 第６図は突然変異されたｔ−PA cDNAを含有するプラス
ミドph・tPAΔSca Iの造成の概略図である。 第７図はｕ−PAのＡ−鎖領域及びｔ−PAのＢ−鎖を含ん
でなるcDNAインサートを含有するプラスミドpUNC・tc造
成の概略図である。 第８図はｔ−PAのＡ−鎖領域及びｕ−PAのＢ−鎖を含ん
でなるcDNAインサートを含有するプラスミドptNC−UCの
造成の概略図である。 第９図はプラスミドpD02の造成の概略図である。 第10図はｔ−PA cDNAをベータグロビン断片と組合わせ
て含有するプラスミドpD010の造成の概略図である。 第11図はMCMV IEプロモーターの制御下のｔ−PA cDNA及
びベータグロビン断片を含有するプラスミドpCGA26の造
成の概略図である。 第12図は共にネオマイシン耐性遺伝子を含むｔ−PA発現
プラスミドpCGA28及びユニバーサル発現プラスミドpCGA
44の造成の概略図である。 第13図は共にハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｔ−PA
発現プラスミドpCGA42及びユニバーサル発現プラスミド
pCGA42dの造成の概略図である。 第14図はネオマイシン耐性遺伝子及びDHFR遺伝子を含む
ｔ−PA発現プラスミドpCGA48の造成の概略図である。 第15図はプラスミドph・tPAΔSca Iの突然変異されたｔ
−PA cDNAインサートを含有する発現プラスミドpBR1aの
造成の概略図である。 第16図はｕ−PAのＡ−鎖ドメイン及びｔ−PAのＢ−鎖を
含んでなるハイブリッドPA cDNAインサートを含有する
発現プラスミドpBR2aの造成の概略図である。 第17図はｕ−PA発現プラスミドpBR3aの造成の概略図で
ある。 第18図は、ｔ−PAのＡ−鎖ドメイン及びｕ−PAのＢ鎖を
含んでなるハイブリッドPA cDNAインサートを含有する
発現プラスミドpBR4aの造成の概略図である。 第19図は、PHO5プロモータ、インベルターゼシグナル配
列及びｔ−PA cDNAを含有する酵母発現ペクターpJDB207
/PHO5−Ｉ−TPAの造成の概略図である。 第20図はプラスミドpCS16の造成の概略図である。 第21図はｕ−PA cDNAを含んでなるプラスミドpCS16/UPA
の造成の概略図である。 第22図はプラスミドpJDB207/PHO5−Ｉ−UPAの造成の概
略図である。 第23〜26図はＡ−鎖ドメイン及びｕ−PA又はｔ−PAの触
媒作用Ｂ−鎖領域を含む一次ハイブリッドPA造成物を、
これらの領域の結合か活性化部位及び／又は天然エキソ
ン−イントロン結合部位にある最終造成物に転換するた
めに用いられる技術の概略図である。 第23図はｔ−PAのＡ鎖ドメイン及びｕ−PAのＢ−鎖を含
んでなるハイブリッドPAをコードする遺伝子の造成を示
す。 第24図はｕ−PAのＡ−鎖ドメイン及びｔ−PAのＢ鎖を含
んでなるハイブリッドPAをコードする遺伝子の造成を示
す。 第25図はｕ−PA成長因子ドメイン、ｔ−PAのグリングル
２ドメイン及びｔ−PAのＢ−鎖を含んでなるハイブリッ
ドPAをコードする遺伝子の造成を示す。 第26図はｕ−PA成長因子ドメイン、ｔ−PAのクリングル
２ドメイン及びｕ−PAのＢ−鎖を含んでなるハイブリッ
ドPAをコード化する遺伝子の造成を示す。 第27−１図〜第27−３図は実験の部に例示されるハイブ
リッドPAと変異体ハイブリッドPAの集成である。 添付図面に用いられた記号は下記意味を有する： AMP、Amp^R……アンピシリン耐性遺伝子（ベーターラク
タマーゼ） TET、Tet^R……テトラサイクリン耐性遺伝子 NEO……Tn5ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ TN5PR……トランスポソンTN5の細菌プロモーター HPH……ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ pBRori……プラスミドpBR322の複製開始点 POIS……‘毒性配列’、すなわちSV40複製に抑制的であ
るpBR322配列 SV40ori……SV40の複製開始点、初期及び後期プロモー
ターと一致 SV40enh,SV40E……72bpエンハンサー、SV40初期プロモ
ータの部分、 HCMVE……ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）の主要即
時初期遺伝子のエンハンサー MCMVP……マウスサイトメガロウィルス（MCMV）の主要
即時初期遺伝子のプロモーター/mRNAスタート部位 RSV……ラウス肉腫ウィルスLTR（プロモーター） CAP……真核性mRNAの５′m7GP‘cap'の位置 polyA……mRNAのポリアデニル化部位 SPLD……スプライスドナー部位、イントロンの５′末端 SPLA……スプライスアクセプター部位、イントロンの
３′末端 BAP……細菌アルカリ性ホスファターゼ CIP……仔ウシ腸ホスファターゼ （BamH1/Bg12）……BamH1及びBgl II部位を共連結する
ことから生ずるSau3a部位 Scal（del）……変異されたSca I部位 ｘ＜ｙ……ｙから右廻りに位置する制限酵素部位ｘ ｐ……プロモーター inv.SS……インベルターゼシグナル配列 ｔ……転写ターミネーター Ｌ……リンカーDNA DHFR……ジヒドロ葉酸還元酵素 mtPA……Bowesメラメーマｔ−PA

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２９０ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２９１ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２９２ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２９４ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４２９６ 微生物の受託番号 ＣＮＣＭ Ｉ−７１５ 微生物の受託番号 ＣＮＣＭ Ｉ−７１６ 微生物の受託番号 ＣＮＣＭ Ｉ−７１７ (72)発明者 フレデリクス アルフォンズス マリア アセルベルクス スイス国，4125 リーヘン，ラインアレ ー 88／３ (72)発明者 ベルント マイハック スイス国，4312 マクデン，ヘーエンベ ーク ９ (72)発明者 ユタ ハイム スイス国，4133 プラテルン，ランカッ カーベーク 18 (72)発明者 ジャン バン オーストルム スイス国，4142 ミュンヒェンシュタイ ン，メルヒオル ベリシュトラーセ 10 (72)発明者 セフィック アルカン スイス国，4125 リーヘン，ビンセンア ッカーシュトラーセ ３

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ａ）ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのア
   ミノ酸180−261、ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸18
   9−411並びにヒトｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ
   −PAのアミノ酸159−188から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、
   ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒト
   ｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸15
   9−188から成る連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PA成長因子ドメインのアミノ酸51−84、ヒトｔ
   −PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、ヒトｕ
   −PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒトｔ−PA
   のアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸159−188
   から成る連結配列； から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアク
   チベータ。
2. 【請求項２】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）、tPA（１−49）−tPA（176−275）−uPA（15
   9−411）及びtPA（１−86）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）から成る群から選択された、請求項１に記載
   の単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ。
3. 【請求項３】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）である、請求項１に記載の単鎖ハイブリッド
   プラスミノーゲンアクチベータ。
4. 【請求項４】ａ）ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのア
   ミノ酸180−261、ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸18
   9−411並びにヒトｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ
   −PAのアミノ酸159−188から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、
   ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒト
   ｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸15
   9−188から成る連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PA成長因子ドメインのアミノ酸51−84、ヒトｔ
   −PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、ヒトｕ
   −PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒトｔ−PA
   のアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸159−188
   から成る連結配列； から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアク
   チベータの製造方法において、該ハイブリッドプラスミ
   ノーゲンアクチベータをコードするDNAを含有する形質
   転換された酵母又は哺乳類宿主を適当な栄養条件下で培
   養し、そして該ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベ
   ータを単離することを含んで成る方法。
5. 【請求項５】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）、tPA（１−49）−tPA（176−275）−uPA（15
   9−411）及びtPA（１−86）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）から成る群から選択された単鎖ハイブリッド
   プラスミノーゲンアクチベータの製造のための請求項４
   に記載の方法。
6. 【請求項６】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）である単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンア
   クチベータの製造のための請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】ａ）ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのア
   ミノ酸180−261、ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸18
   9−411並びにヒトｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ
   −PAのアミノ酸159−188から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、
   ヒトｕ−PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒト
   ｔ−PAのアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸15
   9−188から成る連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−PAフィンガードメインのアミノ酸６−43、
   ヒトｔ−PA成長因子ドメインのアミノ酸51−84、ヒトｔ
   −PAクリングル２ドメインのアミノ酸180−261、ヒトｕ
   −PA触媒ドメインのアミノ酸189−411並びにヒトｔ−PA
   のアミノ酸262−275及びヒトｕ−PAのアミノ酸159−188
   から成る連結配列； から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアク
   チベータを含んで成る血栓症又はプラスミノーゲンの活
   性化による繊溶の発生が望まれる他の状態の治療のため
   の医薬組成物。
8. 【請求項８】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）、tPA（１−49）−tPA（176−275）−uPA（15
   9−411）及びtPA（１−86）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）から成る群から選択された単鎖ハイブリッド
   プラスミノーゲンアクチベータを含んで成る請求項７に
   記載の医薬組成物。
9. 【請求項９】tPA（１−３）−tPA（176−275）−uPA（1
   59−411）である単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンア
   クチベータを含んで成る請求項７に記載の医薬組成物。