JP2534989B2 - ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−ト - Google Patents
ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−トInfo
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） チロキシンは、甲状腺により分泌される、哺乳類の生
理機能上重要なホルモンである。チロキシンの測定は病
気の決定における重要な診断手段である。放射線免疫検
定法、拮抗蛋白質結合法、クロマトグラフィー等を含む
様々な技術がチロキシンの測定に用いられてきた。これ
らの技術は実行困難な点および放射線免疫検定法の場合
に不安定な試薬を用いる点で多くの不都合さを欠点とし
て伴う。
理機能上重要なホルモンである。チロキシンの測定は病
気の決定における重要な診断手段である。放射線免疫検
定法、拮抗蛋白質結合法、クロマトグラフィー等を含む
様々な技術がチロキシンの測定に用いられてきた。これ
らの技術は実行困難な点および放射線免疫検定法の場合
に不安定な試薬を用いる点で多くの不都合さを欠点とし
て伴う。
（先行技術の記載） 米国特許第3817837号は酵素イムノアッセイについて
記載している。米国特許第4040907号はヨードチロニン
酵素コンジュゲートについて記載している。米国特許第
4171244号は酵素結合ポリヨードチロニンについて開示
している。ポリヨードチロニンイムノアッセイは米国特
許第4043872号に記載されている。米国特許第4121975号
はポリヨードチロニンアッセイに用いる試料の前処理に
ついて記述している。ゲルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いる酵素イムノアッセイは米国特許第3875
011号に記載されている。液体試料中の遊離チロキシン
または3,5,3′−トリヨードチロニンの測定方法は米国
特許第4410633号に記載されている。ヨードチロニン免
疫源および抗体は米国特許第4399121号に記載されてい
る。チロキシン放射線免疫検定法は米国特許第4018883
号に記述されている。血清中のチロキシンおよびトリヨ
ードチロニンを測定する放射線免疫検定法は米国特許第
3911096号に開示されている。トリヨードチロニンおよ
びチロキシンの放射線免疫検定法は米国特許第3928553
号に記載されている。
記載している。米国特許第4040907号はヨードチロニン
酵素コンジュゲートについて記載している。米国特許第
4171244号は酵素結合ポリヨードチロニンについて開示
している。ポリヨードチロニンイムノアッセイは米国特
許第4043872号に記載されている。米国特許第4121975号
はポリヨードチロニンアッセイに用いる試料の前処理に
ついて記述している。ゲルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いる酵素イムノアッセイは米国特許第3875
011号に記載されている。液体試料中の遊離チロキシン
または3,5,3′−トリヨードチロニンの測定方法は米国
特許第4410633号に記載されている。ヨードチロニン免
疫源および抗体は米国特許第4399121号に記載されてい
る。チロキシン放射線免疫検定法は米国特許第4018883
号に記述されている。血清中のチロキシンおよびトリヨ
ードチロニンを測定する放射線免疫検定法は米国特許第
3911096号に開示されている。トリヨードチロニンおよ
びチロキシンの放射線免疫検定法は米国特許第3928553
号に記載されている。
［発明の要約］ この発明はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（G6PDH）にコンジュゲートしたポリヨードチロニン類
似体（PIA）をイムノアッセイに用いることを目的とし
て提供する。G6PDHコンジュゲート（複合体）は抗体結
合部位で試料中のポリヨードチロニンと拮抗し得る。PI
A−G6PDHコンジュゲートとの抗体の結合は実質的に酵素
コンジュゲートの酵素活性を低減させる。既知標準値に
関連づけて試料含有アッセイ溶液の酵素活性を決定する
ことにより、試料中のポリヨードチロニンの量を測定す
ることができる。
（G6PDH）にコンジュゲートしたポリヨードチロニン類
似体（PIA）をイムノアッセイに用いることを目的とし
て提供する。G6PDHコンジュゲート（複合体）は抗体結
合部位で試料中のポリヨードチロニンと拮抗し得る。PI
A−G6PDHコンジュゲートとの抗体の結合は実質的に酵素
コンジュゲートの酵素活性を低減させる。既知標準値に
関連づけて試料含有アッセイ溶液の酵素活性を決定する
ことにより、試料中のポリヨードチロニンの量を測定す
ることができる。
本発明のコンジュゲート化合物は、ポリヨードチロニ
ン類似体とG6PDHとが１原子長の結合基（linking grou
p）によりコンジュゲート（conjugate）したものであ
り、さらに詳しくは、後記定義の非オキソカルボニル基
またはスルホニル基を結合基としてG6PDHとポリヨード
チロニン類似体とが結合したコンジュゲート化合物であ
る。
ン類似体とG6PDHとが１原子長の結合基（linking grou
p）によりコンジュゲート（conjugate）したものであ
り、さらに詳しくは、後記定義の非オキソカルボニル基
またはスルホニル基を結合基としてG6PDHとポリヨード
チロニン類似体とが結合したコンジュゲート化合物であ
る。
［実施態様の記載］ この発明の組成物はG6PDHにコンジュゲートしたポリ
ヨードチロニン類似体であり、ポリヨードチロニンに対
して特異的な抗体と結合すると酵素コンジュゲートの酵
素活性は実質的に低下する。鎖長１原子の結合基により
ポリヨードチロニン類似体がG6PDHとコンジュゲートさ
れる。この結合（linkage）には窒素および硫黄類似体
を含む非オキソカルボニル基またはスルホニル基を伴
い、これはG6PDHのアミノ基に結合する。（非オキソカ
ルボニルは少なくとも１個のヘテロ原子で置換されたカ
ルボニル基を意味する。これを具体的に示すと、非オキ
ソカルボニルはカルボン酸のカルボニル基 を含み、窒素類似体はアミド酸のイミノカルボニル基 を含み、硫黄類似体はチオ酸のチオカルボニル基 を含む。スルホニル基はスルホン酸由来の基 である。
ヨードチロニン類似体であり、ポリヨードチロニンに対
して特異的な抗体と結合すると酵素コンジュゲートの酵
素活性は実質的に低下する。鎖長１原子の結合基により
ポリヨードチロニン類似体がG6PDHとコンジュゲートさ
れる。この結合（linkage）には窒素および硫黄類似体
を含む非オキソカルボニル基またはスルホニル基を伴
い、これはG6PDHのアミノ基に結合する。（非オキソカ
ルボニルは少なくとも１個のヘテロ原子で置換されたカ
ルボニル基を意味する。これを具体的に示すと、非オキ
ソカルボニルはカルボン酸のカルボニル基 を含み、窒素類似体はアミド酸のイミノカルボニル基 を含み、硫黄類似体はチオ酸のチオカルボニル基 を含む。スルホニル基はスルホン酸由来の基 である。
上記非オキソカルボニル基またはスルホニル基はいず
れもアミンに結合してヒドロキシの置換によりアミドを
形成し得る。） 酵素にコンジュゲートしたPIAの数は少なくとも１、
通常少なくとも２、一般的には12以下、通常10以下およ
び好ましくは平均して約３〜８の範囲内である。PIAは
アラニン基を欠く点でチロキシンとは異なり、１〜４個
のヨウ素が臭素およびｔ−ブチルのようなアイソスター
性基と置換され、またヨウ素の１個が水素と置換され得
る。
れもアミンに結合してヒドロキシの置換によりアミドを
形成し得る。） 酵素にコンジュゲートしたPIAの数は少なくとも１、
通常少なくとも２、一般的には12以下、通常10以下およ
び好ましくは平均して約３〜８の範囲内である。PIAは
アラニン基を欠く点でチロキシンとは異なり、１〜４個
のヨウ素が臭素およびｔ−ブチルのようなアイソスター
性基と置換され、またヨウ素の１個が水素と置換され得
る。
イムノアッセイにおいて酵素コンジュゲートを受容
体、好ましくは抗体およびチロニン誘導体を含む疑のあ
る未知の試料と組み合わせて用いることが可能なため、
アッセイ試料の酵素活性を既知標準値と比較することに
より未知の試料中のチロニン誘導体の量を測定すること
ができる。
体、好ましくは抗体およびチロニン誘導体を含む疑のあ
る未知の試料と組み合わせて用いることが可能なため、
アッセイ試料の酵素活性を既知標準値と比較することに
より未知の試料中のチロニン誘導体の量を測定すること
ができる。
本発明のPIA−G6PDHコンジュゲートは下式 ［式中、 Ｚは、活性部位以外で結合したG6PDHであり、（「活
性部位」の語は酵素作用に必要なアミノ酸単位または基
を意味する）、 ｍは、１ないし16の数、通常２〜12の範囲および好ま
しくは３〜８の範囲の数であり、 α1-4は通常ヨウ素、臭素またはｔ−ブチル、好まし
くはヨウ素であるが、ただし１個が水素であり得、 Ｗは、炭素または硫黄であり、 Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素、またはＷは炭素のと
きにはＸはＹと一緒になって酸素、窒素、硫黄または炭
素（ただし、炭素は２個の置換基を有し得、各々の置換
基はカルボキシ、低級アルキル、またはヒドロキシ、ア
ミノ、アルコキシ、カルボキシ、チオ等で置換された低
級アルキル等のように炭素、酸素、窒素および硫黄から
なる群から選ばれた原子１〜５個を有する）と二重結合
を形成し得、またはその他の場合水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であるか、またはＹ
は、低級アルキルまたはカルボキシ、またはヒドロキ
シ、カルボキシ、アミノ、アルコキシ、チオ等で置換さ
れた低級アルキル等のように炭素、酵素、窒素および硫
黄からなる群から選ばれた１〜５個の原子を有する置換
基である］ を有する。このような化合物の例を挙げると、アミド結
合によりG6PDHにコンジュゲートされた４−（４−ヒド
ロキシ−3,5−ジヨードフエノキシ）−3,5−ジヨード安
息香酸または４−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフエノ
キシ）−3,5−ジヨード安息香酸がある。
性部位」の語は酵素作用に必要なアミノ酸単位または基
を意味する）、 ｍは、１ないし16の数、通常２〜12の範囲および好ま
しくは３〜８の範囲の数であり、 α1-4は通常ヨウ素、臭素またはｔ−ブチル、好まし
くはヨウ素であるが、ただし１個が水素であり得、 Ｗは、炭素または硫黄であり、 Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素、またはＷは炭素のと
きにはＸはＹと一緒になって酸素、窒素、硫黄または炭
素（ただし、炭素は２個の置換基を有し得、各々の置換
基はカルボキシ、低級アルキル、またはヒドロキシ、ア
ミノ、アルコキシ、カルボキシ、チオ等で置換された低
級アルキル等のように炭素、酸素、窒素および硫黄から
なる群から選ばれた原子１〜５個を有する）と二重結合
を形成し得、またはその他の場合水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であるか、またはＹ
は、低級アルキルまたはカルボキシ、またはヒドロキ
シ、カルボキシ、アミノ、アルコキシ、チオ等で置換さ
れた低級アルキル等のように炭素、酵素、窒素および硫
黄からなる群から選ばれた１〜５個の原子を有する置換
基である］ を有する。このような化合物の例を挙げると、アミド結
合によりG6PDHにコンジュゲートされた４−（４−ヒド
ロキシ−3,5−ジヨードフエノキシ）−3,5−ジヨード安
息香酸または４−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフエノ
キシ）−3,5−ジヨード安息香酸がある。
大抵の場合、この発明のG6PDHコンジュゲートは下式 ［式中、 ｍおよびＺは前記の意味、 α４は水素またはヨウ素、および Ａは酸素またはイミンである］ を有する。
大抵の場合、G6PDHとの結合基はアミド（その窒素類
似体すなわちアミジンを含む）またはスルホンアミド、
通常アミドであり、リジンから得られるアミノ基または
末端アミノ基由来のものである。
似体すなわちアミジンを含む）またはスルホンアミド、
通常アミドであり、リジンから得られるアミノ基または
末端アミノ基由来のものである。
この発明のPIA−G6PDHコンジュゲートは、酵素イムノ
アッセイで用いられる場合これと非常に近い関係の（鎖
長の）長い結合基を有するポリヨードチロニンG6PDHコ
ンジュゲートに勝る利点を有することがわかった。例え
ば、この発明のコンジュゲートは本来の酵素活性の実質
的な部分、約50〜50％を保有する。保有された酵素活性
はポリヨードチロニンに対する抗体のコンジュゲートと
の結合時約40〜60％阻害され得る。
アッセイで用いられる場合これと非常に近い関係の（鎖
長の）長い結合基を有するポリヨードチロニンG6PDHコ
ンジュゲートに勝る利点を有することがわかった。例え
ば、この発明のコンジュゲートは本来の酵素活性の実質
的な部分、約50〜50％を保有する。保有された酵素活性
はポリヨードチロニンに対する抗体のコンジュゲートと
の結合時約40〜60％阻害され得る。
大抵の場合この発明のコンジュゲートを用いるアッセ
イで検出され得るポリヨードチロニンアナライト（anal
ytes分析質）は下式 （式中、α２およびα４は共にヨウ素であるかまたは一
方がヨウ素で他方が水素であり得る） を有する。
イで検出され得るポリヨードチロニンアナライト（anal
ytes分析質）は下式 （式中、α２およびα４は共にヨウ素であるかまたは一
方がヨウ素で他方が水素であり得る） を有する。
このようなアナライトの例としてはＯ−（４−ヒドロ
キシ−3,5−ジヨードフエニル）−3,5−ジヨードチロシ
ンおよびＯ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフエニル）
−3,5−ジヨードチロシンがある。
キシ−3,5−ジヨードフエニル）−3,5−ジヨードチロシ
ンおよびＯ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフエニル）
−3,5−ジヨードチロシンがある。
PIA−G6PDHコンジュゲートは、広範な種類のイムノア
ッセイ、すなわち分離段階を用いる（ヘテロジニアスア
ッセイ）かまたは分離段階を用いない（ホモジニアスア
ッセイ）に使用され得る。これらのタイプのアッセイは
文献に広範に記載されている。例えばマジオ著「エンザ
イム−イムノアッセイ」（Enzyme−Immunoassay）、シ
ー・アール・シー・プレス、インコーポレイテッド、ボ
カ・レイトン、フロリダ、1980年、米国特許第3817837
および3935074号（これらの内容を引用して説明の一部
とする）参照（ここで列挙したもので完全に網羅した訳
ではない）。
ッセイ、すなわち分離段階を用いる（ヘテロジニアスア
ッセイ）かまたは分離段階を用いない（ホモジニアスア
ッセイ）に使用され得る。これらのタイプのアッセイは
文献に広範に記載されている。例えばマジオ著「エンザ
イム−イムノアッセイ」（Enzyme−Immunoassay）、シ
ー・アール・シー・プレス、インコーポレイテッド、ボ
カ・レイトン、フロリダ、1980年、米国特許第3817837
および3935074号（これらの内容を引用して説明の一部
とする）参照（ここで列挙したもので完全に網羅した訳
ではない）。
アッセイは少なくとも２種の異なる方法で行なわれ得
る。具体的な説明をするためにチロキシンを例にあげ
る。
る。具体的な説明をするためにチロキシンを例にあげ
る。
ヘテロジニアス法の場合、PIA−G6PDHコンジュゲー
ト、試料および抗チロキシン抗体を適当な緩衝媒質中で
合わせ、混合物を充分な時間インキュベートし、好便な
手段で抗体に結合した酵素コンジュゲートを結合してい
ない酵素コンジュゲートと分離する。例えば、抗チロキ
シンに対する抗体を用いると、アッセイ媒質から酵素コ
ンジュゲートと、・抗チロキシン複合体の完全な分離が
容易となる。次いでアッセイ媒質中の残存するPIA−G6P
DHコンジュゲートの酵素活性を測定することができる。
ト、試料および抗チロキシン抗体を適当な緩衝媒質中で
合わせ、混合物を充分な時間インキュベートし、好便な
手段で抗体に結合した酵素コンジュゲートを結合してい
ない酵素コンジュゲートと分離する。例えば、抗チロキ
シンに対する抗体を用いると、アッセイ媒質から酵素コ
ンジュゲートと、・抗チロキシン複合体の完全な分離が
容易となる。次いでアッセイ媒質中の残存するPIA−G6P
DHコンジュゲートの酵素活性を測定することができる。
ホモジニアス法の場合、PIA−G6PDHコンジュゲート、
抗チロキシン抗体および試料を合わせたものを充分な時
間インキュベートする。溶液の酵素活性を分離せずに測
定する。
抗チロキシン抗体および試料を合わせたものを充分な時
間インキュベートする。溶液の酵素活性を分離せずに測
定する。
試料中のチロキシンの量は、アッセイの結果と既知の
標準値を比較することにより測定する。例えば、既知量
のチロキシンを有する試料を製造し、アッセイを行い、
酵素活性を測定する。次いで酵素活性をチロキシン濃度
に対するグラフに表わし、このグラフを用いて未知のチ
ロキシンの量を測定する。
標準値を比較することにより測定する。例えば、既知量
のチロキシンを有する試料を製造し、アッセイを行い、
酵素活性を測定する。次いで酵素活性をチロキシン濃度
に対するグラフに表わし、このグラフを用いて未知のチ
ロキシンの量を測定する。
アッセイの条件は用いられた特定の方法により異な
る。ホモジニアス技術を用いる場合、受容体による結合
時の酵素コンジュゲートの活性における変化を最適化す
るように条件を選択する。通常、pH値は約5.5〜10の範
囲、普通約７〜9.5の範囲であり、この範囲で受容体お
よびチロキシン間の強い結合が起こる。温度は緩和な温
度、通常約０゜〜45゜の範囲であり、さらに一般的には
約20゜〜40゜の範囲である。
る。ホモジニアス技術を用いる場合、受容体による結合
時の酵素コンジュゲートの活性における変化を最適化す
るように条件を選択する。通常、pH値は約5.5〜10の範
囲、普通約７〜9.5の範囲であり、この範囲で受容体お
よびチロキシン間の強い結合が起こる。温度は緩和な温
度、通常約０゜〜45゜の範囲であり、さらに一般的には
約20゜〜40゜の範囲である。
使用する緩衝液は普通アッセイ媒質に、約0.001〜.05
Mの濃度、通常約0.01〜0.2Mの濃度をもたらす濃度であ
る。酵素を安定化するために蛋白質を含有させることが
多い。蛋白質はアルブミン、例えばウサギ血清アルブミ
ン、および／またはゼラチンであり得、一般に最終的な
アッセイ混合物中約0.005〜0.5重量パーセント、さらに
一般的には約0.01〜0.2重量パーセントで存在する。望
ましいと判明した他の添加物、例えばグリセロール、チ
メロサール（Thimerosal）、アジ化ナトリウム等も存在
し得る。
Mの濃度、通常約0.01〜0.2Mの濃度をもたらす濃度であ
る。酵素を安定化するために蛋白質を含有させることが
多い。蛋白質はアルブミン、例えばウサギ血清アルブミ
ン、および／またはゼラチンであり得、一般に最終的な
アッセイ混合物中約0.005〜0.5重量パーセント、さらに
一般的には約0.01〜0.2重量パーセントで存在する。望
ましいと判明した他の添加物、例えばグリセロール、チ
メロサール（Thimerosal）、アジ化ナトリウム等も存在
し得る。
PIA−G6PDHコンジュゲートの濃度は、興味の対象であ
るポリヨードチロニンの濃度により大きく異なる。普
通、PIA−G6PDHコンジュゲート濃度は約10-5〜10-13M、
さらに一般的には約10-7〜10-11Mである。コンジュゲー
トしたポリヨードチロニンの濃度に対する結合部位の比
率は一般に少なくとも約0.5ないし1000未満、通常約１
〜100である。
るポリヨードチロニンの濃度により大きく異なる。普
通、PIA−G6PDHコンジュゲート濃度は約10-5〜10-13M、
さらに一般的には約10-7〜10-11Mである。コンジュゲー
トしたポリヨードチロニンの濃度に対する結合部位の比
率は一般に少なくとも約0.5ないし1000未満、通常約１
〜100である。
試薬を加える順序は厳密なものではない。しかしなが
ら、試料を加える前にPIA−G6PDHコンジュゲートおよび
受容体を合わせない方が好ましい。加える順序は好まし
くは試料および抗体、次に酵素コンジュゲートである。
都合により特定の酵素基質を加えることもできる。各々
の段階後、アッセイ混合物をインキュベートし得る。通
常、インキュベーション期間は約10秒〜１時間である。
ら、試料を加える前にPIA−G6PDHコンジュゲートおよび
受容体を合わせない方が好ましい。加える順序は好まし
くは試料および抗体、次に酵素コンジュゲートである。
都合により特定の酵素基質を加えることもできる。各々
の段階後、アッセイ混合物をインキュベートし得る。通
常、インキュベーション期間は約10秒〜１時間である。
酵素活性測定は、約５秒〜60分間、一般的には約0.25
〜30分間行なわれ得る。２分未満、好ましくは１分未満
の急速な測定がこの発明の有用な具体例である。大部分
の場合、分光測定技術が用いられる。しかしながら、他
の技術としては蛍光測定法、滴定法等も挙げられる。
〜30分間行なわれ得る。２分未満、好ましくは１分未満
の急速な測定がこの発明の有用な具体例である。大部分
の場合、分光測定技術が用いられる。しかしながら、他
の技術としては蛍光測定法、滴定法等も挙げられる。
PIA−G6PDHコンジュゲートは文献に記載されたものと
同様の技術により製造され得る。例えば、酵素と低分子
量化合物のコンジュゲーションは米国特許第4040907号
に記載されており、この内容を引用して説明の一部とす
る。例えば、PIAの非オキソカルボニル基、例えばカル
ボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるエス
テル形成によりG6PDHのアミノ基との反応に対し活性化
することができる。PIAは公知化合物である。
同様の技術により製造され得る。例えば、酵素と低分子
量化合物のコンジュゲーションは米国特許第4040907号
に記載されており、この内容を引用して説明の一部とす
る。例えば、PIAの非オキソカルボニル基、例えばカル
ボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるエス
テル形成によりG6PDHのアミノ基との反応に対し活性化
することができる。PIAは公知化合物である。
以下、実施例をあげて説明するが、これらに限定する
訳ではない。
訳ではない。
［実施例］ （特記しない限り、温度はすべて摂氏である。特記しな
い限り、パーセントとあるはすべて重量パーセントであ
る。） 実施例１ G6PDHと４−（４−ヒドロキシ−3,5−ジヨードフエノ
キシ）−3,5−ジヨード安息香酸（HDDA）のコンジュゲ
ーション。
い限り、パーセントとあるはすべて重量パーセントであ
る。） 実施例１ G6PDHと４−（４−ヒドロキシ−3,5−ジヨードフエノ
キシ）−3,5−ジヨード安息香酸（HDDA）のコンジュゲ
ーション。
HDDAのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステ
ルを常法により製造した（米国特許第4040907号参
照）。ジシクロヘキシルカルボジイミド（32mg）（DC
C）、HDDA（100mg）およびNHS（17.4mg）を溶媒として1
mlのテトラヒドロフラン（THF）中で合わせた。ジシク
ロヘキシル尿素（DCU）の白色不溶性沈澱の形成で示さ
れるように室温で容易にエステルが生成した。反応を室
温で一夜そのまま持続させた。
ルを常法により製造した（米国特許第4040907号参
照）。ジシクロヘキシルカルボジイミド（32mg）（DC
C）、HDDA（100mg）およびNHS（17.4mg）を溶媒として1
mlのテトラヒドロフラン（THF）中で合わせた。ジシク
ロヘキシル尿素（DCU）の白色不溶性沈澱の形成で示さ
れるように室温で容易にエステルが生成した。反応を室
温で一夜そのまま持続させた。
DCU沈澱を濾過により除去すると、澄明なエステル濾
液は微黄色をしていた。THFを回転濃縮により除去し
た。乾燥エステルを乾燥DMFに溶かし、再濾過して次のG
6PDHとのコンジュゲーションに備えた。
液は微黄色をしていた。THFを回転濃縮により除去し
た。乾燥エステルを乾燥DMFに溶かし、再濾過して次のG
6PDHとのコンジュゲーションに備えた。
天然G6PDHを４℃で一夜pH8.5の0.05M燐酸緩衝液を３
回かえて透析した（保存剤なし）。用いた酵素の濃度は
４〜6mg/mlであった。次いでDMFを酵素溶液に20％（v/
v）の割合となるまでゆっくりと加えた。コンジュゲー
ション中pHを９に維持した。
回かえて透析した（保存剤なし）。用いた酵素の濃度は
４〜6mg/mlであった。次いでDMFを酵素溶液に20％（v/
v）の割合となるまでゆっくりと加えた。コンジュゲー
ション中pHを９に維持した。
HDDAのNHSエステルを少量のアリコートでスポイトに
より、ゆっくりと加えた。少量のアリコートの酵素を各
々ハプテン添加後採取して非活性度％および阻害％を求
めた。非活性度は60％より大きくあるべきでない。
より、ゆっくりと加えた。少量のアリコートの酵素を各
々ハプテン添加後採取して非活性度％および阻害％を求
めた。非活性度は60％より大きくあるべきでない。
１％トウィーン（Tween）−20を含む塩基性緩衝液（5
5mMトリス、NaN3およびチメロサールを含む）で平衡状
態にしたセファデックス（Sephadex）Ｇ−100カラム上H
DDA−G6PDHコンジュゲートをクロマトグラフィーにかけ
た。活性を有するフラクションをプールし、0.45μミリ
ポア（Millipore）フィルターを用いて沈澱をすべて濾
去した。HDDA−G6PDHコンジュゲートはコンジュゲート
していない酵素の場合の50％の酵素活性を示した。平均
してG6PDHの各分子は６〜10のHDDA単位を含んでいた。
5mMトリス、NaN3およびチメロサールを含む）で平衡状
態にしたセファデックス（Sephadex）Ｇ−100カラム上H
DDA−G6PDHコンジュゲートをクロマトグラフィーにかけ
た。活性を有するフラクションをプールし、0.45μミリ
ポア（Millipore）フィルターを用いて沈澱をすべて濾
去した。HDDA−G6PDHコンジュゲートはコンジュゲート
していない酵素の場合の50％の酵素活性を示した。平均
してG6PDHの各分子は６〜10のHDDA単位を含んでいた。
T4−BAS免疫源を用いてヒツジにおいて抗T4抗体を製
造した。
造した。
実施例２ アッセイ アッセイプロトコル 使用した試薬の処方を次に列挙する。
前処理した試料…米国特許第4121975号記載の手順に
したがい、 0.25M NaOH 0.25％ α−シクロデキストリン 0.025％サリチル酸 により前処理した血清試料 アッセイ緩衝液 200mM トリス塩基 0.01％ NaN3 0.001％ チメロサール pH8.5 抗体試薬（試薬Ａ） 200μg/mlプールしたヒツジ抗T4（NH4）2SO4精製血清 300mM グルコース−６−リン酸・１、ナトリウム 300mM NAD+ 1.0％ BSA 200mM トリス塩基 0.05％ NaN3 0.005％ チメロサール pH5.5 酵素試薬（試薬Ｂ） ２〜８μ/ml HDDA−G6PDHコンジュゲート １％ BSA 0.9％ NaCl 55mM トリス塩基 0.05％ NaN3 0.005％ チメロサール pH8.0 既知量のチロキシンを20、40、80、120および200ng/m
lの濃度でチロキサン不含有ひと血清に溶かすことによ
り測定液を製造した。
したがい、 0.25M NaOH 0.25％ α−シクロデキストリン 0.025％サリチル酸 により前処理した血清試料 アッセイ緩衝液 200mM トリス塩基 0.01％ NaN3 0.001％ チメロサール pH8.5 抗体試薬（試薬Ａ） 200μg/mlプールしたヒツジ抗T4（NH4）2SO4精製血清 300mM グルコース−６−リン酸・１、ナトリウム 300mM NAD+ 1.0％ BSA 200mM トリス塩基 0.05％ NaN3 0.005％ チメロサール pH5.5 酵素試薬（試薬Ｂ） ２〜８μ/ml HDDA−G6PDHコンジュゲート １％ BSA 0.9％ NaCl 55mM トリス塩基 0.05％ NaN3 0.005％ チメロサール pH8.0 既知量のチロキシンを20、40、80、120および200ng/m
lの濃度でチロキサン不含有ひと血清に溶かすことによ
り測定液を製造した。
アッセイの段階的試験プロトコルは下記のとおりであ
った。
った。
1.ビーカーNo.1中、40μ測定液＋100μ前処理した
試料。
試料。
2.ビーカーNo.1中、50μ試薬Ａ＋300μアッセイ緩
衝液。
衝液。
3.ビーカーNo.1中、50μ試薬Ｂ＋300μアッセイ緩
衝液 4.フローセルに吸引、ステイサー（Stasar）III分光光
度計で測定 37℃ 340nm 10秒遅延 30秒読み取り時間 結果は次のようになった。
衝液 4.フローセルに吸引、ステイサー（Stasar）III分光光
度計で測定 37℃ 340nm 10秒遅延 30秒読み取り時間 結果は次のようになった。
平均＝6.75μg/dl 標準偏差＝0.27μg/dl CV％＝4.07％ Ｎ＝16 実施例３ G6PDHと４（４−ヒドロキシ−３−ヨードフエノキ
シ）−3,5−ジヨード安息香酸（HIDA）のコンジュゲー
ション。
シ）−3,5−ジヨード安息香酸（HIDA）のコンジュゲー
ション。
HDDAのNHSエステルの製造に関し実施例１で既述した
ものと同様の手順にしたがいHIDAのNHSエステルの製造
を行なった。生成したエステル誘導体を20％ヘキサン−
CH2Cl2溶離セルロースカラムに通過させることにより精
製した。
ものと同様の手順にしたがいHIDAのNHSエステルの製造
を行なった。生成したエステル誘導体を20％ヘキサン−
CH2Cl2溶離セルロースカラムに通過させることにより精
製した。
コンジュゲーション中25％カルビトール（Carbitol）
を使用したこと以外は前記と同様の手順によりG6PDH酵
素とのコンジュゲーションを行なった。HIDA−G6PDHコ
ンジュゲートの精製は、0.055Mトリス緩衝液溶離セファ
デックスＧ−50カラムに通して行なった。活性を有する
フラクションをプールした。HIDA−G6PDHコンジュゲー
トはコンジュゲートしていない酵素の場合の約40％の酵
素活性を示した。
を使用したこと以外は前記と同様の手順によりG6PDH酵
素とのコンジュゲーションを行なった。HIDA−G6PDHコ
ンジュゲートの精製は、0.055Mトリス緩衝液溶離セファ
デックスＧ−50カラムに通して行なった。活性を有する
フラクションをプールした。HIDA−G6PDHコンジュゲー
トはコンジュゲートしていない酵素の場合の約40％の酵
素活性を示した。
T3−BSA免疫源を用いて抗T3抗体をヒツジにおいて製
造した。
造した。
実施例４ アッセイ アッセイプロトコル 用いた試薬の処方を以下に列挙する。
アッセイ緩衝液 0.055M トリス塩基 0.05％ NaN3 pH8.0 試薬Ａ ヒツジ抗T3（NH4）2SO4精製血清〜200μg/ml 0.055M トリス 0.05％ NaN3 0.132M G6P 0.08M NAD+ pH5 試薬Ｂ HIDA G6PDHコンジュゲート〜２〜８μg/ml 0.055M トリス塩基 0.05％ NaN3 0.032M G6P 0.2％ ゼラチン、タイプＡ pH6.2 T3測定液 ０、25、50、75、100、200ng/ml T3、0.05N−NaOH中または400ng/ml T4、血清中。
アッセイの試験プロトコルは次のとおりであった。
1.キュベットNo.1中に10μのT3測定液および100μ
のアッセイ緩衝液をピペットで採取。
のアッセイ緩衝液をピペットで採取。
2.25℃で５分インキュベーション。
3.キュベットNo.1中に50μの酵素作業試薬（25μ試
薬Ｂ＋25μアッセイ緩衝液）をピペットで採取。
薬Ｂ＋25μアッセイ緩衝液）をピペットで採取。
4.37℃で９秒インキュベーション。
5.キュベットNo.1中に25μの試薬Ａおよび250μの
アッセイ緩衝液をピペットで採取。
アッセイ緩衝液をピペットで採取。
6.340/380nmフィルターを用いて５分の反応時間にABA−
100分光側光分析器（アボット社製）をセット。
100分光側光分析器（アボット社製）をセット。
このアッセイは検定範囲を通じて（０〜200ng/ml
T3）0.166光学密度のアッセイ応答をもたらす。
T3）0.166光学密度のアッセイ応答をもたらす。
前記実施例の結果が示すところによると、この発明の
PIA−G6PDHコンジュゲートを用いる方法によって非常に
低濃度および非常に少量のポリヨードチロニン、例えば
チロキシンを検出できることがわかる。この方法は手を
わずらわす工程がほとんどない全く簡単なものである。
試薬を緩衝媒質中で合わせ、場合により混合物をインキ
ュベートし、次いで酵素基質を加えることにより、短時
間分光光度計の読み取りをすればポリヨードチロニンア
ナライトを測定することができる。このシステムはオー
トメーションが可能であるから試料および試薬を自動的
に混合し、読み取りをすることができる。PIA−G6PDHコ
ンジュゲートは、これと非常に近い関係があり鎖長が１
原子よりも長い、酵素およびポリヨードチロニン間の結
合基を有する化合物よりも優れた利点を示す。前記アッ
セイでこのような鎖長の長い結合基を有する化合物を用
いても意義のある結果は得られなかった。
PIA−G6PDHコンジュゲートを用いる方法によって非常に
低濃度および非常に少量のポリヨードチロニン、例えば
チロキシンを検出できることがわかる。この方法は手を
わずらわす工程がほとんどない全く簡単なものである。
試薬を緩衝媒質中で合わせ、場合により混合物をインキ
ュベートし、次いで酵素基質を加えることにより、短時
間分光光度計の読み取りをすればポリヨードチロニンア
ナライトを測定することができる。このシステムはオー
トメーションが可能であるから試料および試薬を自動的
に混合し、読み取りをすることができる。PIA−G6PDHコ
ンジュゲートは、これと非常に近い関係があり鎖長が１
原子よりも長い、酵素およびポリヨードチロニン間の結
合基を有する化合物よりも優れた利点を示す。前記アッ
セイでこのような鎖長の長い結合基を有する化合物を用
いても意義のある結果は得られなかった。
前記発明について明確に理解できるように例示および
実施例を用いてある程度詳しく記載したが、ある程度の
変化および修正を特許請求の範囲内で行ない得ることは
明らかである。
実施例を用いてある程度詳しく記載したが、ある程度の
変化および修正を特許請求の範囲内で行ない得ることは
明らかである。
Claims (10)
- 【請求項１】式 ［式中、 Ｚは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであ
り、 α１〜α４は、ヨウ素、臭素、ｔ−ブチルおよび水素か
らなる群から選ばれ（ただし、水素でありうるαは１個
だけである）、 Ｗは、炭素または硫黄であり、そして Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、Ｗが炭素のとき
にはＹと一緒になって炭素（ここで、この炭素は、２つ
の置換基を含有し、各置換基は、炭素、水素、酸素、窒
素および硫黄から成る群から選択される１ないし５の原
子を有する）、酸素、イミン窒素または硫黄との二重結
合を形成するか、または水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、またＹは炭素、
酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される１ない
し５の原子を有する置換基であり、そして ｍは、１〜16の数である］ で示される、非オキソカルボニルおよびスルホニルから
成る群から選択される結合基によりグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼにコンジュゲートしたポリヨード
チロニン類似体である化合物。 - 【請求項２】結合基が非オキソカルボニル基である、特
許請求の範囲第１項記載の化合物。 - 【請求項３】Ｗが炭素である、特許請求の範囲第１項記
載の化合物。 - 【請求項４】Ｗが炭素であり、ＸがＹと一緒になってオ
キソを形成する、特許請求の範囲第１項記載の化合物。 - 【請求項５】α１〜α４がヨウ素および水素からなる群
から選ばれたものである、特許請求の範囲第１項記載の
化合物。 - 【請求項６】α１〜α４がヨウ素である、特許請求の範
囲第１項記載の化合物。 - 【請求項７】式 ［式中、 α４はヨウ素または水素、 Ｚはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、 ｍは２〜12の数、および Ａは酸素またはイミノ（NH）である］ で示される特許請求の範囲第１項記載の化合物。
- 【請求項８】α４がヨウ素およびＡが酸素である、特許
請求の範囲第７項記載の化合物。 - 【請求項９】ポリヨードチロニンを含む疑のある試料中
におけるポリヨードチロニンの存在または量の検出方法
であって、 水性媒質中で試料、式 ［式中、 Ｚは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであ
り、 α１〜α４は、ヨウ素、臭素、ｔ−ブチルおよび水素か
らなる群から選ばれ（ただし、水素でありうるαは１個
だけである）、 Ｗは、炭素または硫黄であり、そして Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、Ｗが炭素のとき
にはＹと一緒になって炭素（ここで、この炭素は、２つ
の置換基を含有し、各置換基は、炭素、水素、酸素、窒
素および硫黄から成る群から選択される１ないし５の原
子を有する）、酸素、イミン窒素または硫黄との二重結
合を形成するか、または水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、またはＹは炭
素、酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される１
ないし５の原子を有する置換基であり、そして ｍは、１〜16の数である］ で示される、非オキソカルボニルおよびスルホニルから
成る群から選択される結合基によりグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼにコンジュゲートしたポリヨード
チロニン類似体化合物、ポリヨードチロニンに対して特
異的な抗体を合わせ、さらに 該試料中のポリヨードチロニン量に関連する、上記媒質
の酸素活性を測定することからなる方法。 - 【請求項１０】対応するポリヨードチロニン類似体とグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコンジュゲー
トすることからなる、式 ［式中、 Ｚはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであり、 α１〜α４は、ヨウ素、臭素、ｔ−ブチルおよび水素か
らなる群から選ばれ（ただし、水素でありうるαは１個
だけである）、 Ｗは、炭素または硫黄であり、そして Ｘは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、Ｗが炭素ときに
はＹと一緒になって炭素（ここで、この炭素は、２つの
置換基を含有し、各置換基は、炭素、水素、酸素、窒素
および硫黄から成る群から選択される１ないし５の原子
を有する）、酸素、イミン窒素または硫黄との二重結合
を形成するか、または水素であり、 Ｙは、Ｗが硫黄のときには酸素であり、またはＹは炭
素、酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される１
ないし５の原子を有する置換基であり、そして ｍは、１〜16の数である］ で示される、非オキソカルボニルおよびスルホニルから
成る群から選択される結合基によりグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼにコンジュゲートしたポリヨード
チロニン類似体である化合物の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73973285A | 1985-05-31 | 1985-05-31 | |
| US739732 | 1985-05-31 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236186A JPS6236186A (ja) | 1987-02-17 |
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| JP61127110A Expired - Fee Related JP2534989B2 (ja) | 1985-05-31 | 1986-05-30 | ポリヨ−ドチロニンアツセイに有用なグルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼコンジユゲ−ト |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0204523B1 (ja) |
| JP (1) | JP2534989B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72831T1 (ja) |
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| DE (1) | DE3683953D1 (ja) |
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| CA2283597C (en) | 1998-10-02 | 2008-02-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Reduced cortisol conjugates |
| US6638977B1 (en) * | 1999-11-19 | 2003-10-28 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| AU1624801A (en) | 1999-11-19 | 2001-05-30 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists related applications |
| GR1004119B (en) * | 2000-07-26 | 2003-01-23 | Αυτοματοι Αναλυτες Και Διαγνωστικα Αντιδραστηρια Medicon Hellas Α.Ε. | DEVELOPMENT OF A NEW HOMOGENEOUS IMMUNOENZYMIC METHOD FOR THE PRODUCTION OF A CLINICAL LABORATORY TEST SYSTEM (kit) FOR THE QUANTIFICATION OF THYROXINE AND TRIIODOTHYRONINE IN HUMAN SERUM, UTILIZINGPOLYIODOTHYRONINE CONJUGATED WITH GLYCOGEN PHOSPHO.... |
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| US6991911B2 (en) * | 2003-12-15 | 2006-01-31 | Dade Behring Inc. | Assay for entactogens |
| US7022492B2 (en) * | 2003-12-15 | 2006-04-04 | Dade Behring Inc. | Ecstasy haptens and immunogens |
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| US7115383B2 (en) * | 2004-03-22 | 2006-10-03 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine |
| US7037669B2 (en) * | 2004-03-22 | 2006-05-02 | Dade Behring Inc. | Assays for amphetamine and methamphetamine using stereospecific reagents |
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| EP2283149A1 (en) * | 2008-05-13 | 2011-02-16 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
| EP3761036A1 (en) | 2015-03-03 | 2021-01-06 | ARK Diagnostics, Inc. | Pregabalin immunoassays |
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| US4171244A (en) * | 1975-02-20 | 1979-10-16 | Syva Company | Enzyme-bound-polyidothyronine |
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| US4043872A (en) * | 1975-02-20 | 1977-08-23 | Syva Company | Polyiodothyronine immunoassay |
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| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
-
1986
- 1986-05-30 AT AT86304125T patent/ATE72831T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-05-30 EP EP86304125A patent/EP0204523B1/en not_active Expired
- 1986-05-30 DE DE8686304125T patent/DE3683953D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-30 JP JP61127110A patent/JP2534989B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-30 CA CA000510483A patent/CA1282024C/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-24 US US07/125,805 patent/US4847195A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0204523A3 (en) | 1988-11-23 |
| CA1282024C (en) | 1991-03-26 |
| EP0204523B1 (en) | 1992-02-26 |
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| JPS6236186A (ja) | 1987-02-17 |
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