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JP2518911B2 - ｃ―ｆｍｓ癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法 - Google Patents

ｃ―ｆｍｓ癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法

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JP2518911B2
JP2518911B2 JP63509366A JP50936688A JP2518911B2 JP 2518911 B2 JP2518911 B2 JP 2518911B2 JP 63509366 A JP63509366 A JP 63509366A JP 50936688 A JP50936688 A JP 50936688A JP 2518911 B2 JP2518911 B2 JP 2518911B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に蛋白レセプター、ｃ−fmsの過剰発
現によって特徴づけられた様々な癌の処置に関連する。
さらに特に、本発明は細胞毒性剤に結合したＭ−CSFポ
リペプチドを含むこのような処置に対する組成物に関連
する。
［発明の背景］ 様々な癌遺伝子が特定の癌と結びつけられてきた。癌
遺伝子fmsは、胸、肺膵臓卵巣、腎臓およびおそらく急
性骨髄性白血病（AML）を含む他の腫瘍に関連するもの
として最近の研究対象になっている。例えばD.J.スラモ
ン等、サイエンス224巻256−262頁（1984年）、C.ウォ
ーカー等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエスエイ
1804−1808頁（1987年４月）参照。さらに、J.H.オーヤ
シキ等、カンサー・ジェネティックス・アンド・サイト
ジェネティックス25巻341−350頁（1987年）、H.D.プレ
イスラー等、カンサー・リサーチ47巻874−880頁（1987
年２月）、C.W.レッテンマイヤー等、ジャーナル・オブ
・セルラー・バイオケミストリー33巻109−115頁（1987
年）およびR.サッカ等、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ユーエスエイ82巻3331−3335頁（1986年）参照。ｃ−fm
s癌原遺伝子の生成物はマクロファージコロニー刺激因
子（Ｍ−CSF）のレセプターと関係がありおそらく同一
であると考えられている。例えばC.J.シェアー等、セル
41巻665−676頁（1985年）参照。
ほかの点では患者に大きな副作用を起こさずに腫瘍細
胞を破壊できる治療用生成物が、上記癌の処置において
必要である。
［発明の簡単な説明］ 本発明はひとつの態様として、ｃ−fms癌原遺伝子/M
−CSFレセプター遺伝子の高水準発現によって特徴づけ
られた癌の処置用組成物を提供する。その組成物は細胞
毒性剤に架橋したＭ−CSFポリペプチド（またはその活
性フラグメント）を含み、これはｃ−fms遺伝子生成物/
M−CSFレセプターを有する細胞膜を通過し、細胞質内で
作用して細胞を破壊することが可能である。好ましい細
胞毒性剤としては、ＡおよびＢ鎖毒素、Ａ鎖毒素および
遺伝子操作技術毒素を含んでいる。
別の態様としては、組成物は細胞毒性剤とコンジュゲ
ートしたｃ−fms遺伝子生成物/M−CSFレセプターに対す
るモノクローナル抗体（またはその一部）を含むことが
できる。上記モノクローナル部分はｃ−fms遺伝子生成
物/M−CSFレセプターを認識し、結合する。抗体は標的
部位への化合物の送達に役立ち、その製造方法は当業者
によく知られた方法である。アメリカ特許第4,671,958
号参照。
さらに本発明の別の態様では、Ｍ−CSF/細胞毒性剤組
成物を作る方法を含む。Ｍ−CSFおよび毒素は１つまた
はそれ以上のヘテロ官能性または二価官能性蛋白架橋剤
を使用によってまたは遺伝子融合によって結合すること
ができる。二価官能性架橋剤はＭ−CSF/毒素組成物が標
的細胞へ行く間安定であることが確実なように選ばれ
る。同時に架橋剤はＭ−CSF/毒素組成物が細胞にはいっ
た後毒素部分の遊離を可能としなければならない。例え
ばP.コヘンおよびS.ファン・ハイニゲン等編集、エルセ
ビア、ニューヨーク、モレキュラー・アクション・オブ
・トキシンズ・アンド・ビールス51−105頁（1982年）
参照。
他の態様として、ｃ−fms癌原遺伝子/M−CSFレセプタ
ー遺伝子の過剰表現によって特徴づけられる癌の処置の
ための方法を開示している。本方法は、本発明の組成物
をこのような癌の生体内部位へ局部的に投与することま
たは細胞混合物の生体外除去処置における本組成物の投
与を含む。組成物は癌上でｃ−fms蛋白に結合し、細胞
膜を通って毒素を放出する作用をもち、そこで毒素が細
胞を破壊する。上記レセプター過剰発現癌の中には急性
骨髄性白血病、卵巣癌、肺癌および上記で挙げたものが
含まれる。
他の態様および本発明の利点はその実施を説明する下
記実施例を含む本発明の詳細な説明を考慮すると明らか
になる。
［図面の簡単な説明］ 第１図はＭ−CSFポリペプチドのDNAおよびアミノ酸配
列を示している。
［本発明の詳細な記載］ 本発明の治療組成物は、ある種の癌細胞上のｃ−fms
癌原遺伝子/M−CSFレセプター遺伝子生成物に結合でき
るＭ−CSFと、細胞膜を通って輸送され細胞質中で作用
して細胞を破壊することができる細胞毒性剤とのコンジ
ュゲートである。
本発明に用いるＭ−CSFは天然源から採取し、精製す
ることができる（イギリス特許第2,016,477号およびPCT
公開番号WO86/04587号参照）。そのほかには、Ｍ−CSF
は組換え技術により製造することができる。本発明にお
いて有益な組換えＭ−CSFポリペプチドの１つはPCT公開
番号第WO/8604607号に記載されている。別のＭ−CSFポ
リペプチドは、係属中の同一人が所有するアメリカ特許
出願第940,362号およびG.G.ウォング等、サイエンス、2
35巻1504−1508頁（1987年）に記載されている。記載さ
れたＭ−CSFのアミノ酸およびDNA配列は、第１図に表さ
れている。活性部位を有するＭ−CSFの他の形も、合成
的に製造されたポリペプチドまたは組換え技術によって
修飾されたポリペプチドを含めて、本組成物に使用する
ことができる。
「Ｍ−CSF」という語は、天然に産出するひとポリペ
プチドＭ−CSFおよび天然に産生するポリペプチドの対
立遺伝子変異を含むと定義されている。対立遺伝子変異
は種集団における自然発生的塩基変化であり、ポリペプ
チドまたは蛋白におけるアミノ酸変化をもたらすものも
そうでないものもある。上記定義に付加的に含むものて
してはポリペプチドＭ−CSFの組換え体および合成的変
形があり、これらはペプチドおよびそれらのDNA配列に
おける誘導修飾を含むことができる。
例えば、本発明の組成物におけるＭ−CSFポリペプチ
ドは、第１図に示すアミノ酸配列と同一または実質的に
相同であるペプチド配列によって特徴づけられる。これ
らの配列は第１図に描かれたDNA配列または塩基または
アミノ酸配列における対立遺伝子変異を含む配列または
Ｍ−CSFの生物学的特性をもつポリペプチドをコード化
する意図的修飾構造によりコード化することができる。
本発明の組成物に使用する合成Ｍ−CSF蛋白は第１図
のアミノ酸残基の連続配列を全部または部分的に複製す
ることができる。例えば第１図のポリペプチドの活性部
位のようなＭ−CSFポリペプチドの構造的および形態的
特性を共有することにより、これらの配列はまたＭ−CS
Fの生物学的特性をも持つことができる。こうしてそれ
らの合成または組換えポリペプチドまたはそのフラグメ
ントは本発明の組成物および方法におけるＭ−CSFポリ
ペプチドの生物学的または免疫学的均等物として使用さ
れ得る。
本発明で使用するＭ−CSFは第１図に類似している
が、修飾が自然に実施されるか故意に操作された配列に
よってコード化される因子を含む。Ｍ−CSFのペプチド
または配列における修飾は既知技術を使用して当業者が
行なうことができる。Ｍ−CSFに関連した配列における
興味ある特定の修飾はコード配列における９個のシステ
イン残基の１つまたはそれ以上を他のアミノ酸で置きか
えることを含む。好ましくは各々の配列における数個の
システインは例えばセリンなどの別のアミノ酸で置換さ
れ、蛋白におけるそれらの点でのジスルフィド架橋が排
除される。例えば、アミノ酸位置163でのリジン（第１
図）は、トリプシン様プロテアーゼに対するＭ−CSF領
域の感受性を排除するために欠失または別のアミノ酸で
置換することができる。上記置換の突然変異原性技術
は、当業者によく知られている（アメリカ特許第4,518,
584号参照）。
Ｍ−CSF配列の他の具体的変異は、配列中のグリコシ
ル化部位の１つまたはそれ以上の修飾を含む。グリコシ
ル化の欠如または部分的グリコシル化は、Ｍ−CSF配列
に存在するアスパラギン結合グリコシル化認識部位の
１、２、３または全てでのアミノ酸の置換または除去に
より生じる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は
適当な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識され
るトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列
は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン
−Ｘ−セリン（式中、Ｘは通常任意のアミノ酸である）
のいずれかである。グリコシル化認識部位の第１または
第３アミノ酸位置の１つまたは両方の多様なアミノ酸置
換または除去（および／または第２位置でのアミノ酸除
去）は修飾トリペプチド配列で非グリコシル化を生じ
る。ＯまたはＮ結合グリコシル化部位に結合するオリゴ
糖の型の修飾および変異は哺乳類、細菌、酵母または昆
虫細胞のいずれかにおいて配列を産生させることにより
おこすことができる。上記蛋白における修飾はＭ−CSF
という語に含まれる。
さらに別のＭ−CSFポリペプチド修飾は、例えばポリ
エチレングリコールなどにより薬物動態学上の改善を目
的としてデザインされた配列を使用することができる。
そのほかには成熟蛋白の最終25−35アミノ酸は適当な遺
伝子除去技術によって脱離することができ、本発明で用
いる別のＭ−CSF型が提供される。上記の除去Ｍ−CSFは
細胞毒性剤の遺伝子融合に使用することができる。アミ
ノ酸残基464−485は強力な疎水生膜浸透領域を含む。本
配列を含むＭ−CSF分子は本発明の組成物を使用するこ
とが好ましいが、その理由はこれらの残基は細胞膜にお
いて接合体をうめこみそれによって細胞毒性剤の細胞質
ゾルへの輸送を促進するからである。
様々なＭ−CSFペプチドの生成における代表的なDNA配
列は、メリーランド、ロックビル、パークラーン・ドラ
イブ12301番のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに寄託されている。ベクターp3ACSF−69におけ
る以下に示す第１図のcDNA配列はE.コリHB101に含ま
れ、1986年４月16日に寄託され、受託番号ATCC67092が
与えられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の
国際承認に関するブダペスト条約およびそれに従う規則
（ブダペスト条約）の下で行なわれた。
Ｍ−CSFポリペプチドと結合した細胞毒性剤は細胞質
中で作用することのできる毒素または化学薬品であるこ
とが好ましい。毒素は、細胞膜を通って移動させる輸送
物性および殺す能力を与える細胞溶解ドメインを有する
ものを使用することができる。本組成物によく適した毒
素の好ましい群の１つはＡおよびＢと呼ばれている２つ
の機能的に相違する部分であり、ジスルフィド結合によ
って結ばれているものからなる。Ａ鎖部分は、細胞質ゾ
ルに入り込みおよび細胞を死亡させる酵素活性を含む。
Ｂ鎖部分は細胞へ毒素を結合する役目をもち、Ａ鎖を細
胞膜に通すのに役立つドメインを含むと推測できる。上
記用途に良好な毒素の例には、天然または遺伝学的に操
作したリシン、アブリン、モデシン、ビスクミン、シュ
ードモナス・エルギノーサ外毒素、ジフテリア毒素、コ
レラ毒素、シゲラ毒素およびE.コリ熱不安定毒素が含ま
れる。本発明により製造された接合体の毒素部分は細胞
毒性Ａ鎖部分単独、天然ホロ毒素、または操作したホロ
毒素すなわちレシチン結合特性を欠如した毒素を含む。
単鎖（Ａ鎖部分）だけを含む他の毒素もまた使用され
る。これらの毒素の例はアメリカヤマゴボウ抗ウイルス
蛋白およびゲロニンのようなリボゾーム不活性化蛋白で
ある。L.バルビエリ等、カンサー・サービース、１巻48
9−520頁（1982年）を参照するとリボゾーム不活性化蛋
白のより完全なリストがある。
変異毒素または遺伝子操作した毒素もまた使用され
る。さらに微生物が産生する細胞毒性剤および他の非蛋
白有機分子も細胞毒性剤として使用することができる。
Ｍ−CSFリガンドは、例えばドキソルビシン、ドーノマ
イシンなどのようなアンスラサイクリン類およびビンデ
シン、ビンブラスチン、ビンクリスチンのようなビンカ
アルカロイド類のような細胞毒性薬に結合することもで
きる。メタトレキサートおよびその誘導体もまた細胞毒
性として使用できる。より効果的な剤は多分子の薬剤
（５−50の間）が例えばデキストランのようなポリマー
担体によりＭ−CSFを結合したものである。担体に薬剤
が連結する結合は細胞内の化学的環境により開裂するも
のでなければならない。
Ｍ−CSFおよび細胞毒性剤は、様々な方法で連結する
ことができる。これらの成分の連結方法の一つは、例え
ばサクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（SPDP）またはサクシンイミジル−アセチル
チオプロプリエート（SATP）などのような１つまたはそ
れ以上の標準二価性蛋白架橋剤を使用することによるも
のである。これらの架橋剤は、Ｍ−CSFおよび毒素また
は他の細胞毒性剤の間で安定なジスルフィド結合を形成
し、例えば細胞内グルタチオンのような細胞内化学物質
によってジスルフィド結合が開裂し細胞内で組成物の毒
素部分を遊離することができる。これらの連結方法は当
業者に既知である。例えばJ.カールソン等、バイオケミ
カル・ジャーナル、173巻723−737頁（1978年）および
N.藤井等、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・ブレタン、33巻362−367頁（1985年）参照。また、毒
素が蛋白に共役する他の一般的方法については、A.J.ク
ンバー等、メソッズ・イン・エンザイモロジー、112巻2
07−225頁（1985年）を参照。
例えば本発明による１つの方法は、両方およびＡおよ
びＢ鎖を有する毒素を使用するＭ−CSF−毒素組成物を
作ることを含む。
方法は次の段階、 （ａ）Ｍ−CSF分子あたり１−６個の反応基を導入する
に充分な架橋剤とＭ−CSFを反応させること。本目的で
使用することのできる架橋剤の充分な量はＭ−CSF2量体
のモルあたりおよそ６−50モルの範囲である。
（ｂ）少なくとも１つのジスルフィド結合で接続するＡ
およびＢ鎖サブユニットを有する毒素蛋白を常用還元剤
と反応させ、それにより鎖を互いに遊離させること （ｃ）還元毒素の遊離Ａ鎖サブユニットと段階（ａ）の
誘導Ｍ−CSFを反応させること、および （ｄ）Ａ鎖サブユニットにジスルフィド結合により連結
されたＭ−CSFを含むコンジュゲートを反応混合物から
分離すること を含む。典型的な成長因子／毒素共役体の１つはＭ−CS
FをSPDPで修飾してこの方法により製造され、続いてジ
スルフィド結合によりリシンＡ鎖を結合させる。
本発明の組成物を作る別の方法は次の段階 （ａ）Ｍ−CSF分子あたり１−６個の反応基を導入する
に充分な架橋剤とＭ−CSFを反応させること。
（ｂ）少なくとも１つのジスルフィド結合により結合し
たＡおよびＢサブユニットを有するホロ毒素を段階
（ａ）の誘導Ｍ−CSFと反応させる（ホロ毒素はＢサブ
ユニットに結合しているのが好ましい蛋白架橋剤で官能
化されている）、および （ｃ）反応混合物中の遊離Ｍ−CSFおよび毒素から、Ｂ
サブユニットに結合するようになったＭ−CSFにより形
成されたコンジュゲートを分離すること を含む。
本発明の組成物の成分を連結する別の方法は、遺伝的
融合方法による。例えばアメリカ特許第4,675,382号参
照。
Ｍ−CSFおよび毒素の両方を含む本発明の組成物は、
ｃ−fms癌原遺伝子/M−CSFレセプター遺伝子の過剰発現
により特徴づけられる癌の処置に関する方法に使用する
ことができる。上記癌の中には急性骨髄性白血病、卵巣
癌、乳癌、肺癌、膵臓癌および肝臓癌がある。本発明の
組成物は、組成物のＭ−CSF部分によりｃ−fms癌原遺伝
子を標的にすることによって作用する。このレセプター
に１度結合すると、Ｍ−CSF分子は細胞膜を通り細胞質
ゾルの中へ毒性剤を輸送するのを助ける。細胞内では、
Ｍ−CSFに毒性剤が連結する結合は自然に細胞内で化学
物質によって開裂し、剤は遊離され癌細胞を死亡させ
る。
本発明の組成物は全身的、局所的または分野的を含む
様々な方法で投与される。本組成物は腫瘍部位に分野的
に生体内で投与されることが望ましい。例えば腹腔内に
投与することができ、もし望まれる場合例えば卵巣癌の
ような適当な癌の処置に使用するため腹膜分布を含む。
肺癌の処置の場合、同様に、組成物は吸入剤の形で放出
することができる。もし望ましいなら、組成物を、例え
ば乳癌の場合腫瘍の外科的除去後生じた組織浴のように
皮下内に投与することができる。組成物は、例えば膀胱
内へ、嚢内投与するのが好ましい場合がある。さらに組
成物は、例えば患者から除去された細胞混合物の「浄
化」のような生体外適用に使用することができ、これは
分野的適用がふさわしくない全身癌を有する患者に対す
るものである。例えば急性骨髄性白血病の患者の処置
は、体からの骨髄細胞の除去を含む。これらの細胞はそ
の後ｃ−fms癌原遺伝子を過剰発現する細胞のサブセッ
トを破壊する本発明の組成物で対外で処理する。「浄
化」細胞はその後患者に再導入される。それによって、
本発明のＭ−CFS/毒素組成物は自己骨髄移植を受けよう
としているAML患者の骨髄において白血病細胞を破壊す
る浄化剤として役立つ。他の生体外浄化作用にも本発明
の組成物を使用することができる。
本発明に用いる治療組成物は発熱物質のない非経口に
許容される水性溶液の形であり得る。pH、等張、安定化
およびその他に関して上記非経口に許容される蛋白溶液
は当業者には既知である。
本発明による組成物での患者の処置を含む薬剤養生法
は、例えば患者の状態、体重、性および食品、感染の重
さ、投与時間および他の臨床的因子などの薬剤活性を修
飾する様々な因子を考慮して主治医によって決定され
る。さらに、投与方式は例えば生体外または生体内での
薬剤投与を可能にする。一般的に、日用量は体重kgあた
り２−2000マイクログラムの範囲のポリペプチドであ
る。
次の実施例はＭ−CSFポリペプチドの製造および本発
明のＭ−CSF/毒素共役体の構築を明らかにしている。
実施例１ Ｍ−CSFの組換え体製造 組換え体方法による組換え体Ｍ−CSFポリペプチドを
発現するため、ポリペプチドをコード化したDNAを適当
な発現ベクターに移入し、常法の遺伝子操作技術により
選択された宿主細胞に導入した。
例えばp3ACSF−69のようなＭ−CSF製造用哺乳類細胞
発現ベクターは当業者によく知られている技術によって
合成することができる。例えばレプリコン、選択遺伝
子、エンハンサー、プロモーターおよび同類のようなベ
クターの成分は既知の製法によって天然源または合成に
より得ることができる。カウフマン等、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー、159巻511−521頁（1
982年）およびカウフマン、ブロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ーエスエイ、82巻689−693頁（1985年）参照。これらの
組換え体Ｍ−CSFの発現に適当な細胞またはセルライン
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、さるCOS
−１またはCV−１細胞である。適当な哺乳類主細胞の選
択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび
生成物製造および精製方法の選択は当業者に知られてい
る。例えばケシングおよびサムブルック、ネイチャー、
293巻620−625頁（1981年）、またはそのほかにはカウ
フマン等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ
ジー、５（７）巻1750−1759頁（1985年）またはホーリ
ー等、アメリカ特許第4,419,446号参照。他の典型的な
哺乳類主細胞は、特に霊長類セルラインおよびげっ歯類
セルラインを含み、これらは形質転換したセルラインを
含む。正常な二倍体細胞、一次組織の生体外培養から誘
導された細胞株および一次外植片も適当である。候補の
細胞は、選択遺伝子が優勢に作用している限り選択遺伝
子が遺伝子型的に欠如している必要はない。CHO細胞
は、ベクターDNAの安定統合、および統合したベクターD
NAのそれにつづく増幅（何れも常法）に使用することが
できる。他の適当な哺乳類セルラインは、HeLa、マウス
Ｌ−929細胞、スイス、Balb−ＣまたはNIHマウスにより
誘導された3T3ライン、BHKまたはHaKハムスターセルラ
インを含むが限定されるものではない。
安定な形質転換体はその後標準免疫学的または酵素的
検定により生成物の発現についてスクリーニングする。
変異蛋白をコード化したDNAの存在は例えばサザンブロ
ット法のような標準法により検出できる。COS−１さる
細胞のような適当な宿主細胞の中へ発現ベクターDNA導
入後、数日間変異をコード化するDNAの一過性発現は、
培養培地中の蛋白の活性または免疫学的検定による選択
なしで測定する。適当な宿主細胞の中へのこれらのベク
ターの形質転換はＭ−CSFの発現を起す。
同様に、当業者は、細菌細胞によるＭ−CSFの細胞内
または細胞外発現用細菌ベクターをつくる細菌配列で、
コード化した配列の側面にある哺乳類調節配列を脱離ま
たは変換することによって第１図の配列を操作すること
ができる。因子をコード化するDNAはさらに当業者に知
られている細菌発現の異なったコドンを含むように修飾
することができる。配列は、当業者に知られた方法によ
り、細菌発現、分泌および成熟変異蛋白のフロセシング
を可能とする、分泌リーダーペプチドをコード化するス
クレオチド配列に枠内で操作可能に連結するのが好まし
い。細菌宿主細胞中で発現した化合物はその後既地方法
により採取、精製され、および／または物理化学的、生
物化学的および／または臨床的パラメーターにより特徴
づけられる。例えば、コード化したＭ−CSF配列はT.タ
ニグチ等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエイ、77巻
5230−5233頁（1980年）に記載された方法を使用して、
既知の細菌ベクターの中に挿入することができる。この
典型的な細菌ベクターはその後細菌宿主細胞に形質転換
され、それによってファクターが発現する。E.コリの様
々な株（例えばHB101、MC1061）が生物工学の分野にお
いて宿主細胞としてよく知られている。バチルス・スブ
チリス、シュードモナス、他の桿菌および同類の様々な
株も本方法に使用することができる。細菌細胞における
上記因子の細胞外発現の製造計略についてはヨーロッパ
特許出願EPA177,343号参照。
同様な操作は昆虫細胞中の発現に対する昆虫ベクター
（例えばヨーロッパ特許出願155,476号に記載された方
法を参照）の構築のために実施することができる。例え
ば、ミラー等、ジェネティック・エンジニアリング、８
巻、277−298頁（プレナム版1986）およびその引用例を
参照。
酵母ベクターは酵母細胞によるＭ−CSFの細胞内また
は細胞外発現に対する酵母調節配列を使用して組み立て
ることができる。当業者によく知られている多くの株が
本発明に使用するポリペプチドの発現用宿主細胞として
使用することができる。（PCT出願公開第WO8600639号お
よびヨーロッパ特許出願EP123,289号に記載された方法
を参照）。
実施例２ Ｍ−CSF毒素コンジュゲート 本発明によるＭ−CSF毒素コンジュゲートの組み立て
のため、成長因子Ｍ−CSFをアメリカ特許出願第940,346
号（その開示を引用して本書に包含させる）およびG.G.
ウォング等、サイエンス、235巻前掲に記載されたよう
に哺乳類細胞で産生させた。0.1M NaHCO3（20ml）のＭ
−CSF（5mg、５ナノモル）をエタノール中のSPDPの20倍
モル過剰と反応させた。反応は摂氏４度で５時間続け、
Ｍ−CSF二量体の分子あたりおよそ４−６スルフヒドリ
ル基を導入した。過剰のSPDPを除去後、導入した成長因
子を市販のリシンＡ（15mg、500ナノモル）と、NaH2PO4
p.117.5/OIM NaCl50mM中で反応させた。ジスフィド結合
は摂氏４度で１晩で形成された。生じたＭ−CSF−リシ
ンＡ鎖コンジュゲートが、セファロゲル（商標）TSK−3
000高速液体クロマトグラフィーでのゲル濾過によって
過剰のリシンＡ鎖から分離し、コンジュゲートおよびＭ
−CSF（7.5mg）の混合物を得た。P.P.ノウルズおよびP.
E.トープ、アナルズ・オブ・バイオケミストリー、160
巻440−443頁（1987年）に記載されたNaCl勾配で展開し
ブルーセファロースカラムを２回通した後、コンジュゲ
ート（720mg）がＭ−CSFを含まない形で得られ、主とし
てＭ−CSF二量体あたり１つのリシンＡ鎖の種からなる
ものであった。
実施例３ Ｍ−CSF毒素共役体のインビトロ細胞毒性 Ｍ−CSF/リシンＡ鎖コンジュゲートの毒性および特異
性の水準は、NIH3T3およびNIH3T3−ｃ−fmsセルライン
を用いてストロング等、ブラッド、65巻627−635頁（19
85年）によって記載された方法と類似した方法で標準軟
寒天クローン遺伝子検定により測定された。後者のライ
ンは、M.F.ロセル等、ネイチャー、325巻549−552頁（1
987年）が、Ｍ−CSFレセプター陽性であることを記載し
ている。各々のセルラインは寒天およびペトリ皿の薄層
でコンジュゲートとまたはコンジュゲートなしの培地
（対照）と混合した。14日間標準CO2大気中37℃でイン
キュベートした後、各々の皿のコロニーの数を視覚的に
数えた。コンジュゲートを受入れなかったNIH3T3−Ｃ−
FMS細胞対照皿は、皿あたり103コロニーを示したが、４
×10-8M濃度のコンジュゲートで処理した同じ細胞はた
った３コロニーであった。媒地と混合したコンジュゲー
ト処理NIH3T3細胞および未処理対照細胞はそれぞれ皿あ
たり76および78コロニーであった。
実施例４ Ｍ−CSF毒素共役体の生体外検定 生体外骨髄浄化に関するＭ−CSF/リシンＡ鎖コンジュ
ゲートの効果はストロング等、前掲により記載された類
似方法で試験された。メリーランド、ロックビルのアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションで得られる
M1骨髄白血細胞（103）にマウス骨髄細胞（105）を加
え、その後37℃およそ４時間10-7−10-12M範囲のＭ−CS
F/リシンＡコンジュゲートで処理した。白血細胞および
一分化能および多分化能骨髄始原細胞の生存パーセント
は、T.R.ブラッドレイおよびD.メットカルフ、オースト
ラリアン・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・バ
イオロジー・アンド・メディカル・サイエンス、44巻28
7頁（1966年）の標準コロニー形成検定により測定さ
れ、効果および特異性がそれぞれ測定された。
本発明の方法および成分に対して多くの修飾が本書の
開示に基づいて当業者により可能である。
本発明により下記の各事項が可能となる。
（１）細胞毒性剤に結合したＭ−CSFポリペプチドおよ
びその医薬担体を含むｃ−fms癌原遺伝子/M−CSFレセプ
ター遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる癌の処置
用治療組成物。
（２）細胞毒性剤が、二重鎖リシン、リシンＡ鎖、アブ
リン、アブリンＡ鎖、モデシンおよびモデシンＡ鎖、シ
ュードモナス・アエルギノーサ外毒素、コレラ毒素、シ
ゲラ毒素、エシェリヒア・コリ熱不安定毒素およびジフ
テリア毒素、それらの変異毒素およびそれらの組み換え
変形体からなる群から選択された毒素である、１記載の
組成物。
（３）細胞毒性剤が、リボゾーム不活性蛋白、アメリカ
ヤマゴボウ抗ウイルス性蛋白およびゲロニンおよびそれ
らの変異毒素およびその組み換え変形体からなる群から
選択されたものである、１記載の組成物。
（４）細胞毒性剤が、アンスラサイクリン類、ドキソル
ビチン、ドーノマイシン、ビンカアルカロイド類、ビン
デシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メトトレキ
サートおよびそれらの誘導体からなる群から選択される
ものである、１記載の組成物。
（５）Ｍ−CSFポリペプチドがヘテロ官能蛋白架橋剤に
より細胞毒性剤と結合している、１記載の組成物。
（６）架橋剤が、サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオンネートまたはサクシンイミジルア
セチルチオプロプリエートからなる群から選択されたも
のである、５記載の組成物。
（７）SPDPにより完全なリシン分子に結合しているＭ−
CSFを含む、１記載の組成物。
（８）癌の部位に、レセプターを有する細胞膜を通り、
細胞中に入り、細胞を殺すことのできる細胞毒性剤と結
合したＭ−CSFを含む組成物を生体内で区域的に投与す
ることからなる、ｃ−fms癌原遺伝子/M−CSFレセプター
の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置方法。
（９）レセプターを有する細胞膜を通り、癌細胞中に入
り、細胞を殺すことのできる細胞毒性剤と結合したＭ−
CSFを含む組成物で、患者からとり出した癌細胞を含む
細胞混合物を生体外で浄化することからなる、ｃ−fms
癌原遺伝子/M−CSFレセプターの過剰発現によって特徴
づけられた癌の処置方法。
（10）細胞毒性剤に結合したモノクローナル抗体であっ
てｃ−fms遺伝子生成物/M−CSFレセプターに対するモノ
クローナル抗体およびその医薬担体を含むｃ−fms癌原
遺伝子/M−CSFレセプター遺伝子の過剰表現により特徴
づけられた癌の処置用組成物。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．106（1987），抄録番号 132830 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．106（1987），抄録番号 82856 免疫の新しい考え方Ｑ＆Ａ，（昭和61 年），協和企画通信，ｐ．444−447 ドラッグデリバリーシステム, （1986），南江堂，ｐ．146−161

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｍ−CSFポリペプチドに結合した細胞毒性
    剤を有効成分とする、ｃ−fms癌原遺伝子/M−CSFレセプ
    ター遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる癌の処置
    剤。
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