JP2502024B2 - ゴ―シェ病：グルコセレブロシダ―ゼ遺伝子のイントロン２における新規変異の検出 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、米国政府の支持により成され、
米国政府は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘ
ルス・コントラクト DK 36639 及び RR 00833 に従っ
て、本発明についてある権利を有する。

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、通常のグルコセレブロ
シダーゼ遺伝子イントロン２のヌクレオチド位置１（介
在配列２（IVS2+1) とも呼ばれる）における、グアニン
ヌクレオチドに対するアデニンヌクレオチドによる点又
は置換変異を有するヒトにおけるゴーシェ病対立遺伝子
（allele) を検出する方法に関する。

【０００３】

【発明の背景】ゴーシェ病は、グルコセレブロシダーゼ
の欠陥によって生じる、常染色体劣性病である。この酵
素は、共有結合した糖を含むリピド（グリコリピド）の
リソソーム分解に必要である。ブラディー(Brady) らの
J. Biol. Chem. 240:39-43 (1965) 参照。グルコセレブ
ロシダーゼがないと、非常に不溶性のグルコシル−セラ
ミド（グルコセレブロシド）が蓄積する。グルコセレブ
ロシダーゼに対する遺伝子は、染色体１の q21の領域に
位置する。シャフィット−ザガード(Shafit-Zagardo)ら
の Am. J. Hum Genet. 33:564-575 (1981); ギンス(Gin
ns) らのProc. Natl. Acad. Sci., USA 82:7101-7105
(1985) を参照。多くの異なる変異によってゴーシェ病
が発病するという事実が臨床観察で推論され（ボイトラ
ー(Beutler) のGenetic Diseases Among Ashkenazi Jew
s 、ボードマン(Boudman) ら編集、ラバンプレス、ニュ
ーヨーク、157-169 頁(1979))及びこの病気にかかって
いる異なる患者における、残留酵素の動力学的特性の違
いから推論されている（グラボースキー（Grabowski)ら
のAm. J. Hum.Genet. 37:499-510 (1985)) 。しかしな
がら、この病気の遺伝学の本当の理解は、cDNAのクロー
ニング及び配列特定を待たねばならず（ソージ(Sorge)
らのProc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7289-7293 (1985)
及びツジイ(Tsuji) らのN. Engl.J. Med. 316:570-621
(1987) また、遺伝子のクローニング及び配列特定を待
たねばならなかった（ホロウィッツ(Horowitz)らのGeno
mics 4:87-96 (1989))。変異の分析は、グルコセレブロ
シダーゼ遺伝子の約１６キロ塩基(Kb)下流にある疑似遺
伝子(psuedogene)の存在によって複雑化する。ジムラン
(Zimran)らの J. Clin. Invest. 86:1137-1141 (1990)
参照。疑似遺伝子は、機能的遺伝子に対して約９５％の
相同性を有する。この疑似遺伝子は、転写される（ソー
ジらの J. Clin. Invest. 86:1137-1141 (1990))が、コ
ード配列の多くの欠失により、グルコセレブロシダーゼ
に翻訳されない。

【０００４】ゴーシェ病を引き起こす点変異は、最近纏
められている。ラタム(Latham)らのDNA Cell Biol. 10:
15-21 (1991)及びグラボースキーらのCRC Crit. Rev. B
iochem. Mol. Biol. 25:385-414 (1990)参照。更に、5'
配列が活性な遺伝子のそれであり、かつ3'配列が疑似遺
伝子のそれである融合遺伝子が報告されている。ジムラ
ンらの J. Clin. Invest. 85:219-222 (1991); ラタム
らのDNA Cell Biol. 10:15-21 (1991); イヤール(Eyal)
らのGene 96:277-283 (1990)参照。ゲノムレベルで調べ
ると、少なくともそのような融合遺伝子は、その遺伝子
と疑似遺伝子との間に遺伝子の喪失を伴う、不等な交又
の結果と思われる（ジムランらの J. Clin. Invest. 8
5:219-222 (1990))。この病気は、ユダヤ人の間で最も
流行している病気であり、ヘテロ接合体頻度が９％に近
いものとして評価されている。ジムランらの Am. J. Hu
m. Genet. (1991)を参照。臨床的に重要なゴーシェ病の
ユダヤ患者において、病原対立遺伝子の約７７％は、cD
NAヌクレオチド位置(nt)１２２６における特徴的なアデ
ニン→グアニン（Ａ→Ｇ）変異（１２２６Ｇ変異と言
う）を含む。この変異は、成熟蛋白質のアミノ酸残基３
７０をコードするコドンにある。ツジイらの Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA 85:2349-2352 (1989); ジムランら
の Lancet 2:349-352 (1989)を参照。グルコセレブロシ
ダーゼ遺伝子における変異の対応する位置は、ヌクレオ
チド位置２のエクソン９にある。エクソン９におけるこ
のヌクレオチド位置は、配列番号：１の通常のグルコセ
レブロシダーゼ遺伝子配列におけるヌクレオチド位置５
８５４に相関する。同一の変異は、非ユダヤ人において
も共通する。そこでは、その変異が病原性の対立遺伝子
の約２５％を説明することが分かる。この変異は、ゲノ
ム nt 3938における酵素Pvu IIによる特徴的なRFLP(res
triction fragment length polymorphism)を含む遺伝子
で常に見出され、変異が一度だけ起こり得ることを示唆
している。ジムランら Am. J. Hum. Genet. 46:902-905
(1990) 参照。

【０００５】次に、遙かに低頻度で共通に起こる変異
は、シトシンがチミンを置換する（Ｔ→Ｃ）cDNAヌクレ
オチド位置１４４８である。ツジイらの N. Engl. J. M
ed. 316:570-621 (1987); ダール(Dahl)らの Am. J. Hu
m. Genet. 47:275-278 (1990)参照。機能的グルコセレ
ブロシダーゼ遺伝子における変異の対応する位置は、エ
クソン１０のヌクレオチド位置６０である。エクソン１
０のこのヌクレオチド位置は、配列番号：１における通
常のグルコセレブロシダーゼ遺伝子配列におけるヌクレ
オチド位置６４４５に相関する。この１４４８Ｃ変異
は、ユダヤ人のゴーシェ病原因対立遺伝子のほんの約２
％を説明し、非ユダヤ人のゴーシェ病対立遺伝子の約４
０％を説明する。従って、ユダヤ人及び非ユダヤ人患者
において、ゴーシェ病対立遺伝子の多くは、特定されな
いまま今日に到り、疑問の状態のままである。機能的グ
ルコセレブロシダーゼ遺伝子におけるＴ→Ｃ点変異は、
グルコセレブロシダーゼ疑似遺伝子cDNAに通常見出され
る配列と正確に対応する。ホロウィッツらの Genomics
4:87-96 (1989); ツジイらの上記文献; 及びスコージら
の Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7289-7293 (1985)
参照。更に、エクソン１０におけるＴ→Ｃ点変異の存在
は、グルコセレブロシダーゼ遺伝子複合体における DNA
の再配列の結果である融合遺伝子において同定された。
ジムランらの J. Clin.Invest. 85:219-222 (1990) 参
照。この融合遺伝子は、機能的グルコセレブロシダーゼ
遺伝子と疑似遺伝子との間における非等価な交又から生
じた。

【０００６】この特殊な融合遺伝子において、転写され
たcDNAの5'末端は、機能的遺伝子であったが、3'末端は
疑似遺伝子であった。この交又は、エクソン１０の5'
で、又はその上流で生じた。従って、機能的遺伝子にお
ける点変異に対応するシトシンヌクレオチドを含有する
疑似遺伝子の領域は、融合遺伝子の3'領域にある。この
状況において、シトシンヌクレオチドのヌクレオチド位
置は変化しないであろう。しかし、非等価の交又が変異
の5'で充分に起これば、エクソン１０の変異のヌクレオ
チド位置は、変わるかも知れない。従って、cDNAにおけ
るヌクレオチド位置１４４８に対応するエクソン１０に
おけるヌクレオチド位置６０の規定はもはや正しくない
であろう。しかし、変異を囲む領域は、同一の意味内容
で見出し得る。即ち、周囲のヌクレオチドは同一であろ
う。

【０００７】cDNA１４４８Ｃ以外のもっと共通の別の変
異が、最近同定された。ボイトラーらの N. Engl. J. M
ed. 325:1354-1359 (1991)及び Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 88:10544-10547 (1991) 参照。変異は、グルコ
セレブロシダーゼ遺伝子のエクソン２におけるヌクレオ
チド位置５７に通常存在するグアニンに隣接したグアニ
ンヌクレオチド挿入である。これを発現する別の方法
は、エクソン２のヌクレオチド位置５７（nt５７）が１
つ又は２つのヌクレオチドで占拠されることである。通
常の（正常な）（野性型の）遺伝子においては、nt５７
は単一のグアニンで占められているのに対して、変異遺
伝子では、nt５７は２つのグアニンによって占められて
いる。エクソン２のこのヌクレオチド位置は、配列番
号：１で示される通常のグルコセレブロシダーゼ遺伝子
におけるヌクレオチド位置１０３６に対応する。介在配
列がスプライシングされるcDNA内の対応する位置は、ヌ
クレオチド８４である。従って、変異は、そのゲノム位
置又はそのcDNA位置によって言及され、その後者の表示
は、８４ＧＧである。グアニンヌクレオチド挿入によっ
て、 DNAの読枠が変わり、mRNAの通常量の生成にも係わ
らず、読枠の変移によって早期に停止してしまうので、
グルコセレブロシダーゼ活性が全体として喪失してしま
う。このゴーシェ病変異は、1226/?Pv1.1 ^- /Pv1.1⁺ ｌ
遺伝子型を有する患者に見出された。７２人のゴーシェ
病のユダヤ人に関するボイトラーの研究では、１２２
６、１４４８及び８４ＧＧ変異のスクリーニングによ
り、患者におけるゴーシェ病原因対立遺伝子の９4.４％
が説明できた。

【０００８】ゴーシェ病の３種類のサブタイプが、詳細
に説明されている。ボイトラーの Blood Rev. 2:59-70
(1988); マーチン(Martin)らの Adv. Pediatr. 36:277-
306(1989)参照。タイプＩは、大変一般的なものであ
る。即ち、ゴーシェ病患者の９９％以上がタイプＩの病
気である。この型は、全く神経的な弊害(neurologicali
nvolvement)がないものとして定義される。タイプIIの
病気は、電撃性の病気であり、厳しい精神的な兆候を示
し、始めの１８カ月以内に死亡する。タイプIIIは、病
気の少年期形態であり、タイプＩの病気よりも神経的兆
候が遅く現れ、また慢性的となる点で特徴を有する。ゴ
ーシェ病では、全ての体細胞のグルコセレブロシダーゼ
活性は不足しているが、非神経病の全ての兆候をもたら
すのは、グリコリピドを貪食したマクロファージであ
る。肝臓及び脾臓は、通常拡大する。巨脾症(splenomeg
aly)は、血小板減少症(thrombocytopenia)となり又はそ
れに貢献する。肝臓の関与が、しばしば線維症及び異常
な肝臓機能試験と関連する。ある患者では、右から左へ
の肺の短絡が、多分肝臓病の二次的なものとして発生す
る。肺実質の直接関与は稀に起こり得る。シュナイダー
(Schneider) らの Am. J. Med. 63:475-480 (1977)参
照。骨の関与は、ゴーシェ病に共通である。末端大腿骨
のフレア、所謂、エーレンマイヤーフラスコ変形は、こ
の病気の古典的な徴候である。大腿部頭部の無菌的壊
疽、骨梗塞及び長骨の病原性骨折は、全てゴーシェ病の
しばしば見られる合併症である。ストーウェンス(Stowe
ns) らのMedicine 64:310-322 (1985)参照。骨の危機
（ヨシポビッチ(Yosipovitch) らの Isr. J. Med. Sci.
26:593-595 (1990)) 及び、時として熱を伴うが、Ｘ線
変化を伴わない痛み及び腫れの事例は、この病気の共通
に繰り返し現れる徴候である。

【０００９】最少の病気の兆候を経験し又は全く経験し
ないタイプＩの患者がいる。このような大変に温和な病
気にかかっている患者は、しばしば中年又は老人に見ら
れる。かかる患者におけるゴーシェ病の存在は、ある関
連しない不調に対して又は最も温和な血小板減少症の検
査過程において骨髄検査を行った場合にのみ、しばしば
発見される。更に注意深い検査によって、軽い巨脾症が
しばしば検出され、病気の最少の徴候は、骨格X-線を行
う時に明らかになるかもしれない。かかる患者は、通常
処置は不要である。タイプＩＩの病気では、神経性の知
見は、第１年目の半ばに通常明白となり、動眼失調、斜
視、高張性及び頭部後屈が進展する。最初の数年で起こ
る又は場合によっては、更に遅れて起こる同様の神経症
状は、タイプIII の病気を特徴付ける。白血球のβ−グ
ルコシダーゼ活性の決定は、ゴーシェ病を診断するため
の信頼性のあるかつ簡単な方法である。残念ながら、こ
の病気にかかっている殆どの患者は、未だ骨髄検査によ
って診断されている。診断が疑わしくない場合には、こ
のことは理解できるが、ゴーシェ病が判別診断に含まれ
た場合には、不適切でありかつ時代錯誤的なことであ
る。ボイトラー及びサビン(Savin) のBlood 、76:646-6
48 (1990) 参照。有用な補助的な試験には、血清酸ホス
ファターゼの活性決定（ロビンソン(Robinson)らのCli
n. Chem. 26:371-382 (1980))及びアンギオテンシン転
換酵素の活性決定が含まれる。リーバーマン(Lieberma
n) らの N. Engl. J. Med. 294:1442-1444 (1976)参
照。これらの酵素のレベル及び臨床実験において通常測
定されない多くのリソソーム酵素は、ゴーシェ病患者の
殆ど（全てではない）において増加する。最近、共通の
変異、例えば、cDNAヌクレオチド位置１２２６ (ボイト
ラーらのClin. Chim. Acta. 194:161-166 (1990)) 、cD
NAヌクレオチド位置1448 (ジムランらのLancet 2:349-3
52 (1989))及びcDNAヌクレオチド位置84GG (ボイトラー
らの Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10544-10547 (19
91))における変異の検出のための手軽な技術が、ポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって発展し
てきた。

【００１０】

【発明が解決しょうとする課題】本発明は、グルコセレ
ブロシダーゼ遺伝子のイントロン２におけるヌクレオチ
ド位置１（介在配列２(IVS2+1)とも呼ばれる）のグアニ
ンがアデニンに置換した点変異によって特徴付けられる
新規なゴーシェ病変異の検出に関する。点変異のこのイ
ントロン２ヌクレオチド位置は、配列番号：１で示され
るグルコセレブロシダーゼ遺伝子のヌクレオチド位置１
０６８に対応する。従って、一つの態様においては、ヒ
トの遺伝子スクリーニング方法が企図される。この方法
は、グルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロン２のヌク
レオチド位置１におけるグアニンヌクレオチドがアデニ
ンヌクレオチドに置換されていることを特徴とするグル
コセレブロシダーゼ遺伝子の点変異の存在について、ヒ
トから単離した核酸試料を分析することを含む。好まし
い態様においては、この方法は、ヒトからのゲノム DNA
試料をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対とと
もに増幅条件下で処理して、グルコセレブロシダーゼ遺
伝子イントロン２のヌクレオチド位置１を含むヒトゲノ
ム DNAの領域を増幅することを含む。このＰＣＲ処理に
よって、アデニンヌクレオチド点変異の存在を分析する
ための領域を含む増幅生産物が得られる。

【００１１】本発明の１つの目的は、単一の核酸試料に
おける少なくとも２つ、好ましくは３乃至４のグルコセ
レブロシダーゼ遺伝子変異をスクリーニングする方法を
提供することにある。かかる多重スクリーニングは、２
種類のＰＣＲ増幅生産物、即ち、１つは、ゲノム DNAエ
クソン２ヌクレオチド位置５７及びイントロン２のヌク
レオチド位置１を含むもの、及び１つは、エクソン９の
ヌクレオチド位置２及びエクソン１０のヌクレオチド位
置６０を含むもの、を１つのＰＣＲ増幅工程において提
供することによって、最も有利に行うことができる。従
って、（１）グルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロン
２のヌクレオチド位置１及びグルコセレブロシダーゼ遺
伝子エクソン２のヌクレオチド位置５７を含むゲノム D
NA領域、及び（２）エクソン９のヌクレオチド位置２及
びエクソン１０のヌクレオチド位置６０を含むゲノム D
NA領域を増幅するためのプライマーを準備する。次い
で、ＰＣＲ増幅生産物を、イントロン２のヌクレオチド
Ｇ→Ａ変異、エクソン２のヌクレオチド５７ＧＧ変異、
エクソン９ヌクレオチド２のＡ→Ｇ変異、及びエクソン
１０のヌクレオチド６０のＴ→Ｃ変異について分析す
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】

Ａ．定義 対応表コード群 ヌクレオチド Ａ Ａ アデニン Ｃ Ｃ シトシン Ｇ Ｇ グアニン Ｔ Ｔ チミン（ DNA） Ｕ Ｕ ウラシル（ RNA) Ｙ Ｃ又はＴ（Ｕ） ピリミジン Ｒ Ａ又はＧ プリン Ｍ Ａ又はＣ アミノ Ｋ Ｇ又はＴ（Ｕ） ケト Ｓ Ｇ又はＣ 強い相関（３つの水素結合） Ｗ Ａ又はＴ（Ｕ） 弱い相関（２つの水素結合） Ｈ Ａ又はＣ又はＴ（Ｕ） 非Ｇ Ｂ Ｇ又はＴ（Ｕ）又はＣ 非Ａ Ｖ Ｇ又はＣ又はＴ（Ｕ） 非Ｔ又は非Ｕ Ｄ Ｇ又はＡ又はＴ（Ｕ） 非Ｃ Ｎ Ｇ、Ａ、Ｃ又はＴ（Ｕ） 全て

【００１３】対立遺伝子(Allele) 特定の遺伝子の DNA配列の変異。二倍体細胞において
は、最大２つの対立遺伝子が存在する。それぞれ、同一
の相対的な位置にあるか、又は染色体セットの相同染色
体上の遺伝子座にある。何れかの遺伝子座にある対立遺
伝子が、ともに同一であれば、個々の対立遺伝子は、そ
の遺伝子座に対してホモ接合であると言われ、それぞれ
が異なる場合には、その遺伝子座に対してヘテロ接合と
呼ばれる。ある遺伝子の異なる対立遺伝子が１塩基だけ
異なることができる場合には、その遺伝子に対する対立
遺伝子の可能な数は、大変に大きい。対立遺伝子が異な
り、一方が他方に対してしばしば優性である。（この場
合、他方は、劣性と呼ばれる。）優性は、発現型の特性
であり、優性対立遺伝子による劣性対立遺伝子の不活性
化を意味するものではない。多くの例において、通常機
能する対立遺伝子（野性型）は、多少欠陥のある機能を
有する全ての変異対立遺伝子に対して優性である。この
ような場合、一般に、２つの内の１つの機能的対立遺伝
子は、生物の通常の発生を支持するための充分に活性な
遺伝子を生産するに充分である（即ち、遺伝子生産物の
量において、２倍の安全性の余地が通常存在する）。ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸及び窒素含有ヘテロ環塩基
からなる DNA又は RNAのモノマー単位である。塩基は、
グリコシド炭素（ペントースの1'炭素）を介して糖部分
に連結されており、塩基と糖とのこのような結合は、ヌ
クレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの3'又
は5'位置に結合する燐酸を含む場合には、それは、ヌク
レオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオチドの
配列は、ここでは、「塩基配列」又は「ヌクレオチド配
列」又はそれと言葉上等価なものと一般に呼ばれ、左か
ら右への方向が5'−末端から3'−末端の通常の方向であ
る式によって代表される。

【００１４】塩基対(bp) 二本鎖 DNA分子における、アデニン（Ａ）とチミン
（Ｔ）との関係及び、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）
との関係を言う。 RNAでは、ウラシル（Ｕ）は、チミン
を置換する。核酸 一本鎖又は二本鎖のヌクレオチドのポリマーを言う。ポリヌクレオチド 一本鎖又は二本鎖ヌクレオチドのポリマーを言う。ここ
では、「ポリヌクレオチド」及びその言葉上の等価物
は、核酸の全範囲を含む。ポリヌクレオチドは、２以上
のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチ
ドの直鎖からなる核酸分子を言う。正確な大きさは、こ
の技術分野において周知のように、用途の最終的な条件
に依存する、多くの因子による。本発明のポリヌクレオ
チドは、プライマー、プローブ、 RNA／ DNAセグメン
ト、オリゴヌクレオチド（又は「オリゴ」（相対的に短
いポリヌクレオチド））、遺伝子、ベクター、プラスミ
ド、などを含む。

【００１５】遺伝子 ヌクレオチド配列が RNA又はポリペプチドをコードする
核酸を言う。遺伝子は、 RNAであるか又は DNAである。二本鎖 DNA 二本鎖核酸分子を言い、実質的に相補的なポリヌクレオ
チドの２つのストランド（鎖）が、二本鎖における塩基
対に存在する各相補的な塩基の間で、１以上の水素結合
によって結合されている。塩基対を形成するヌクレオチ
ドが、リボヌクレオチド塩基又はデオキシリボヌクレオ
チド塩基であるので、用語「二本鎖 DNA」は、２本の D
NA鎖からなる DNA− DNA二本鎖（ds DNA) であるか又は
１本の DNA鎖と１本の RNA鎖とからなる RNA− DNA二本
鎖である。相補的塩基 DNA又は RNAが二本鎖形態を形成する時に、通常対を形
成するヌクレオチドを言う。相補的ヌクレオチド配列 別の DNA又は RNAの一本鎖分子におけるヌクレオチド配
列と、形成する水素結合によって特異的にハイブリダイ
ズするに充分相補的なヌクレオチド配列を言う。

【００１６】保存された ヌクレオチド配列は、所定の（参照の）配列の正確な相
補体と非ランダム的にハイブリダイズする場合は、その
所定の配列に関して、保存されている。ハイブリダイゼーション 実質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸の鎖）が対を
形成して、相補的塩基対の間で水素結合を形成すること
によって、二本鎖又はヘテロ二本鎖を形成すること。そ
れは、競争的に阻害され得る、２つの相補的ポリヌクレ
オチドの間の特異的な（非ランダムな）相互作用であ
る。ヌクレオチド類似体 Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵと構造的に異なるプリン又はピリ
ミジンヌクレオチドであり、核酸分子中の通常のヌクレ
オチドを置換するに充分類似しているものを言う。

【００１７】DNA相同体(homolog) 所定の保存されたヌクレオチド配列及び所定のリガンド
と結合することのできるリセプターをコードする配列を
有する核酸を言う。上流 DNA転写の方向と反対の方向、従って、非コード鎖にお
いて5'から3'へ向かう方向、又はmRNAにおいて3'から5'
へ向かう方向を言う。下流 DNAの非コード鎖に沿って3'−から5'−方向に移動する
又は RNA転写に沿って5'−から3'−方向に移動する配列
転写又は読出の方向における DNA配列に沿って更に進ん
だ方向を言う。停止コドン アミノ酸をコードしない３つのコドンの何れかであっ
て、蛋白質合成を停止させるコドンを言う。それらは、
ＵＡＧ、ＵＡＡ及びＵＧＡであり、ナンセンス又は停止
コドンとも呼ばれる。

【００１８】リーダーポリペプチド 蛋白質のアミノ末端におけるアミノ酸配列の短い長さで
あり、内膜を通して蛋白質を搬送し又は方向付けし、細
胞周辺腔に又はこれを越えて最終的に分泌させるものを
言う。リーダー配列蛋白質は、その蛋白質が活性となる
前に、共通に除去される。読枠 翻訳で使用される隣接するヌクレオチドトリプレット
（コドン）の特定の配列を言う。読枠は、翻訳開始コド
ンの位置による。

【００１９】Ｂ．方法 本発明は、ゴーシェ病に関連するグルコセレブロシダー
ゼ対立遺伝子に対するヒトのスクリーニングのための新
規な方法を提供する。本発明は、ゴーシェ病がグルコセ
レブロシダーゼ遺伝子 DNA配列におけるイントロン２の
ヌクレオチド位置１における（介在配列２とも呼ばれ
る）点変異（塩基置換）によって起こるという発見に基
づく。この変異は、時折IVS2+1と呼ばれる。ヌクレオチ
ド塩基置換は、mRNAスプライシングに必要なイントロン
5'ドナー部位の消失によってエクソン２の欠失をもたら
す。変異遺伝子からの転写によって、5'スプライスコン
センサスにおけるグアニンヌクレオチドが存在しないの
で、エクソン２も消失する。エクソン２の欠失によっ
て、機能的なグルコセレブロシダーゼ蛋白質が生成しな
い。グルコセレブロシダーゼ疑似遺伝子において、アデ
ニンヌクレオチドはこの部位に通常見出されるので、エ
クソン２は疑似遺伝子転写物をも失っている。ゴーシェ
病の原因となる対立遺伝子における変異をスクリーニン
グするためのDNAに基づく分析により、以前は検出でき
なかったイントロン２の新規な変異を検出することがで
きる。本発明に対しては、１００人の非関連患者（９７
人はユダヤ人で、３人は半ユダヤ人である）からの DNA
を、ゴーシェ病を起こすことが知られている２２の変異
について分析した。対立遺伝子の７つを除いて、全ての
対立遺伝子は、以前記載されていた変異を有することが
同定された。非同定変異の内５つは、IVS2+1変異の結果
であることが分かった。

【００２０】その病気自身又はヘテロ接合キャリヤー状
態を診断するために、この分析方法を使用することがで
きる。一般に、その方法には、スクリーニングのための
核酸試料を調製すること及び１以上のゴーシェ病対立遺
伝子についてその試料を分析することが含まれる。グル
コセレブロシダーゼ遺伝子は、グルコセレブロシダー
ゼ、変異グルコセレブロシダーゼ又はグルコセレブロシ
ダーゼ疑似遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有す
る核酸である。それは、ゲノム DNA、mRNA又はcDNAの形
態であり得る。また、一本鎖又は二本鎖形態であり得
る。ゲノム DNAは、mRNAに比べて生物学的試料において
相対的に安定であるので、好ましくは、ゲノム DNAが使
用される。通常の（野性型の）グルコセレブロシダーゼ
遺伝子の完全なゲノム配列のセンス鎖は、配列番号：１
として配列表に記載した。この遺伝子は、１１個のエク
ソンと、１０個のイントロンとからなり、そのヌクレオ
チド位置は、配列番号：１の特徴に示した。

【００２１】核酸試料は、細胞、典型的には末梢血液白
血球から得られる。mRNAを使用する場合には、細胞を、
RNase 阻害条件下で溶解する。１つの態様においては、
第１工程では、全細胞mRNAを単離する。ポリＡ＋mRNAを
次いで、オリゴ−ｄＴセルロースカラムにハイブリダイ
ズすることによって選択する。好ましい態様において
は、核酸試料を、グルコセレブロシダーゼ対立遺伝子材
料の存在に対して富化する。富化は、ここで記載するポ
リヌクレオチド合成プライマーを使用して、ゲノム DNA
又はmRNAをプライマー延長反応させることによって典型
的に達成される。特に、分析すべて試料を製造するため
の好ましい方法では、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に
おいてプライマーとして所定のポリヌクレオチドを使用
し、増幅した（ＰＣＲ）生産物を形成させる。（１）ポリヌクレオチドプライマーの調製 プライマー延長によって合成すべきプライマー、プロー
ブ及び核酸フラグメント又はセグメントに関してここで
使用する「ポリヌクレオチド」と言う用語は、２以上、
好ましくは３以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボ
ヌクレオチドからなる分子を言う。その正確な大きさ
は、多くの因子（これらの因子はまた用途の最終的な条
件に依存する）に依存する。

【００２２】ここで使用する用語「プライマー」とは、
核酸制限分解物から精製したものか又は合成的に製造し
たかに依らず、ポリヌクレオチドを意味し、核酸鎖に相
補的なプライマー延長生産物の合成が誘導される条件の
下（即ち、ヌクレオチド、 DNAポリメラーゼのような重
合剤、逆転写酵素等の存在及び適当な温度及びpHの下
で）で、核酸合成の開始点として作用することができる
ものである。このプライマーは、最大の効率のために
は、好ましくは一本鎖であるが、二本鎖のものでもよ
い。二本鎖の場合には、延長生産物を調製する前に、ま
ず、そのプライマーを処理して相補的鎖から相互に分離
する。このプライマーは、重合剤の存在の下で合成を始
める（プライム）のに充分長くなければならない。この
プライマーの正確な長さは、温度及びプライマーの由来
等の多くの因子による。例えば、標的配列の複雑さによ
って、ポリヌクレオチドプライマーは、典型的には１５
〜２５以上のヌクレオチドを含む（但し、それよりも少
ないものでもよい）。短いプライマー分子は、テンプレ
ートと充分安定したハイブリッド複合体を形成するの
に、一般により低温を必要とする。

【００２３】ここで使用するプライマーは、合成又は増
幅すべき各特定の配列の異なる鎖に実質的に相補的とな
るように選択される。このことは、プライマーが、その
対応するテンプレート鎖と非ランダムにハイブリダイズ
するに充分相補的でなければならないことを意味する。
従って、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列
を反映してもしなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレ
オチドフラグメントは、プライマーの5'末端に結合する
ことができ、そのプライマー配列の残りの部分は、その
鎖に対して実質的に相補的である。かかる非相補的フラ
グメントは、典型的にエンドヌクレアーゼ制限部位をコ
ードする。これとは別に、そのプライマー配列が、合成
又は増幅すべき鎖の配列と充分に相補的であり、そのた
めその鎖に非ランダムにハイブリダイズし、もってポリ
ヌクレオチド合成条件下で延長生産物を形成できる場合
には、非相補的塩基又はより長い配列をそのプライマー
に散在させることもできる。

【００２４】本発明のプライマーは、 DNA依存 RNAポリ
メラーゼプロモーター配列又はその相補体を含むことが
できる。例えば、クリーグ(Krieg) らのNucl. Acids Re
s. 12:7057-70 (1984); スタディール(Studier) らの
J. Mol. Biol. 189:113-130 (1986);及びMolecular Clo
ning: A Laboratory Manual, Second Edition, Maniati
sら編集、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク(1989)参照。DNA依存 RNAポリメラーゼプロモータ
ーを含有するプライマーを使用する場合には、そのプラ
イマーは、増幅すべきポリヌクレオチド鎖にハイブリダ
イズさせ、 DNA依存 RNAポリメラーゼプロモーターの第
２のポリヌクレオチド鎖を、 E.coli DNAポリメラーゼ
Ｉのような誘導剤又は E. coli DNAポリメラーゼのクレ
ノーフラグメントを使用して完成する。出発ポリヌクレ
オチドは、 RNAポリヌクレオチド及び DNAポリヌクレオ
チドの製造を交互に行うことによって増幅させる。プラ
イマーは、テンプレート配列又は RNA指示(RNA-directe
d) RNAポリメラーゼに対する複製開始部位を含んでもよ
い。典型的な RNA指示 RNAポリメラーゼは、リザーディ
(Lizardi) らのBiotechnology 6:1197-1202 (1988)に記
載されるように、ＱＢレプリカーゼを含む。 RNA指示ポ
リメラーゼは、テンプレート配列又は複製開始部位を含
む少量のテンプレート RNA鎖から多量の RNA鎖を製造す
る。これらのポリメラーゼは、典型的に、クラマー(Kra
mer)らの J. Mol. Biol. 89:719-736 (1974)に記載され
たように、テンプレート鎖を１００万倍増幅する。

【００２５】ポリヌクレオチドプライマーは、例えば、
ホスホトリエステル又はホスホジエステル法（ナラン(N
arang)らの Meth. Enzymol. 68:90 (1979); 米国特許第
4,356,270号、同第 4,458,066号、同第 4,416,988号、
同第 4,293,653号; 及びブラウンらの Meth. Enzymol.
68:109 (1979) を参照）のような適当な方法によって調
製することができる。プライマーのヌクレオチド配列の
選択は、核酸上におけるハイブリダイズ点から検出すべ
き変異をコードする領域までの距離や、使用する他のプ
ライマーに対する核酸上におけるハイブリダイズ部位等
の因子に依存する。核酸試料を、ＰＣＲ増幅によりグル
コセレブロシダーゼ遺伝子材料に対して富化したら、２
つのプライマー、即ち、ＰＣＲプライマー対を使用し
て、核酸の各コード鎖を増幅しなければならない。第１
のプライマーは、非コード（アンチセンス又はマイナス
又は相補的）鎖の一部となり、プラス又はコード鎖上の
ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。第２のプライ
マーは、コード（センス又はプラス）鎖の一部となり、
マイナス又は非コード鎖上でヌクレオチド配列とハイブ
リダイズする。第１及び第２プライマーの一方又は両方
は、エンドヌクレアーゼ認識部位を規定するヌクレオチ
ド配列を含むことができる。この部位は、増幅されるグ
ルコセレブロシダーゼに対してヘテロローガスであり得
る。

【００２６】１つの態様において、本発明は、プライマ
ーの3'末端に位置するプライム領域を有するプライマー
を形成するポリヌクレオチドのセットを利用する。この
プライム領域は、典型的に、3'最端(most)（3'末端）１
５〜３０ヌクレオチド塩基である。各プライマーの3'末
端プライム部分は、核酸合成を触媒する、即ち、その3'
末端からのプライマー延長反応を開始するプライマーと
して機能し得る。プライマーの一方又は両方とも、更
に、5'末端（5'最端）非プライム部分、即ち、好ましい
テンプレートとのハイブリダイズに関与しない領域を含
む。ＰＣＲにおいて、各プライマーは、第２のプライマ
ーと組合さって働き、標的核酸配列を増幅する。ＰＣＲ
プライマー対をＰＣＲに使用する選択は、グルコセレブ
ロシダーゼ遺伝子領域を形成するためのここで議論する
検討項目によって統制される。プライマー配列を、グル
コセレブロシダーゼ遺伝子対立遺伝子イントロン内にお
いて標的配列にハイブリダイズ（アニール）するのに選
択する場合には、その標的配列は、分析すべき標的配列
の一般化を確保するために対立遺伝子間で保存されるべ
きである。有用なプライム配列は、表２、並びに実施例
３及び４に示す。

【００２７】（２）ポリメラーゼ鎖反応 グルコセレブロシダーゼ遺伝子は、mRNA及び／又はゲノ
ム DNAのセンス鎖のようなポリヌクレオチドコード鎖か
らなる。分析すべき遺伝子材料が二本鎖ゲノムDNAの形
態である場合には、まず典型的には溶融することによっ
てそれを変性し、一本鎖にすることが普通である。この
核酸は、その試料をＰＣＲプライマー対（対のそれぞれ
構成要素が、所定のヌクレオチド配列を有する）で処理
する（又は接触させる）ことによって、ＰＣＲ反応に付
する。このＰＣＲプライマー対は、グルコセレブロシダ
ーゼ対立遺伝子内で保存されている、ヌクレオチド配列
と、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドの長さ
で、更に好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長
さで、最も好ましくは少なくとも約１７ヌクレオチドの
長さにおいて、ハイブリダイズすることによって、プラ
イマー延長反応を開始することができる。ＰＣＲプライ
マー対の第１のプライマー、核酸の非コード又はアンチ
センス鎖（即ち、コード鎖と相補的な鎖）とハイブリダ
イズするので、ここでは時に「アンチセンスプライマ
ー」と呼ばれる。ＰＣＲプライマー対の第２のプライマ
ーは、核酸のコード又はセンス鎖とハイブリダイズする
ので、ここでは時に「センスプライマー」と呼ばれる。

【００２８】ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ま
しくは所定量のＰＣＲプライマー対を、試料の核酸、好
ましくは所定量の核酸と、ＰＣＲバッファー中で混合
し、ＰＣＲ反応混合物を形成することによって行う。こ
の混合物を、グルコセレブロシダーゼ遺伝子材料につい
て分析すべき試料を富化するに充分なＰＣＲ反応生成物
を形成するような、典型的な所定の回数の周期（サイク
ル）で熱周期(thermocycle) する。ＰＣＲは、熱周期に
よって、即ち、約３０〜５５℃の低温から、約９０〜１
００℃の高温の温度範囲内において、ＰＣＲ反応混合物
の温度を繰り返し昇温及び低下させることによって典型
的に行う。昇温及び低下は、連続的であってもよいが、
好ましくはポリヌクレオチド合成、変性及びハイブリダ
イゼーションを良好にする各温度において、相対的に温
度安定性の時間間隔を設けた相的(phasic)である。複数
の第１プライマー及び／又は複数の第２プライマーを各
増幅において使用することができる。例えば、第１プラ
イマーの一種を、多数の異なる第２プライマーと対を形
成させ、数種類の異なるプライマー対を形成させること
ができる。これとは別に、第１及び第２プライマーの個
々の対を使用することもできる。何れの場合において
も、同一又は異なる組合せの第１及び第２プライマーを
使用して増幅したことよる増幅生産物は、変異分析に組
合せて使用することができる。

【００２９】ＰＣＲ反応は、好適な方法を使用すること
よって実行することができる。一般には、緩衝水溶液中
で、即ち、ＰＣＲバッファー、好ましくはpH７〜９、特
に好ましくは約８のＰＣＲバッファー中で行われる。好
ましくは、モル過剰（ゲノム核酸に対して、通常約10⁶:
1 のプライマー対テンプレート）のプライマーが、テン
プレート鎖を含むバッファーに添加される。方法の効率
を改善するには、モル過剰が大きいことが好ましい。Ｐ
ＣＲバッファーは、デオキシリボヌクレオチドトリホス
フェート（ポリヌクレオチド合成基質）dATP、dCTP、dG
TP、及びdTTP並びに典型的に熱安定なポリメラーゼ（全
ては、プライマー延長（ポリヌクレオチド合成）反応に
対して適当な量で存在する）をも含む。得られた溶液
（ＰＣＲ混合物）は、約９０〜１００℃に約１〜１０
分、好ましくは１〜４分加熱される。この加熱期間後、
溶液は５４℃まで放冷され、この温度はプライマーハイ
ブリダイゼーションに好ましい。合成反応は、室温か
ら、ポリメラーゼ（誘導剤）がもはや効率的に機能し得
なくなる温度まででも起こり得る。従って、例えば、 D
NAポリメラーゼを誘導剤として使用する場合には、温度
は一般にはせいぜい約４０℃までである。熱周期は、Ｐ
ＣＲ生産物の所望量が生成するまで繰り返す。例示的な
ＰＣＲバッファーは、以下のものを含む。50mM KCl; 10
mM Tris-HCl (pH 8.3); 1.5 mM MgCl₂; 0.001%(wt/vo
l)ゼラチン; 200 μM dATP; 200 μM dTTP; 200 μM dC
TP; 200 μM dGTP; 及びバッファー１００マイクロリッ
トル（μl ）当たり2.5 単位のテルムス・アクアティカ
ス(Thermus aquaticus) (Taq) DNAポリメラーゼＩ（米
国特許第 4,889,818号）。

【００３０】誘導剤としては、プライマー延長生産物の
合成を達成する機能を有するものであれば、酵素を含む
何れの化合物又は系も使用できる。この目的に対する好
適な酵素としては、例えば、 E. coli DNAポリメラーゼ
Ｉ、 E. coli DNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメン
ト、T₄ DNAポリメラーゼ、他の利用可能な DNAポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、熱安定性酵
素が挙げられ、これらの酵素は、ヌクレオチドを適当な
方法で組合せて、各核酸鎖に相補的なプライマー延長生
産物を形成する。一般に、この合成は、各プライマーの
3'末端で開始し、合成が終結するまでテンプレート鎖に
沿って5'方向に進み、異なる長さの分子を生成する。し
かし、誘導剤を存在させてもよく、この誘導剤は、上記
と同一の方法を使用して、5'末端での合成を開始させ、
上記方向に進行させる。誘導剤としては、 RNAプライマ
ー延長生産物の合成を達成する機能を有するものであれ
ば、酵素を含め、如何なる化合物又は系を使用できる。
好ましい態様においては、誘導剤は、T₇ RNAポリメラー
ゼや、T₃ RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ等の
DNA依存 RNAポリメラーゼであってもよい。これらのポ
リメラーゼは、相補的 RNAポリヌクレオチドを生成す
る。 RNAポリメラーゼの高ターンオーバー速度は、チェ
ンバレンらの The Enzymes（ピー・ボイヤー編集）、p
p.87-108 、アカデミック・プレス、ニューヨーク(198
2)に記載されているように、出発ポリヌクレオチドを増
幅する。転写に基づく増幅系は、ジンジャラス(Gingera
s)らの PCR Protocols, A Guide to Methods and Appli
cations 、pp. 245-252、イニス(Innis) ら編集、アカ
デミック・プレス社、サン・ディエゴ、カリフォルニア
(1990)に記載されている。

【００３１】誘導剤が DNA依存 RNAポリメラーゼであ
り、従ってリボヌクレオチドトリホスフェートを導入す
る場合には、充分量の ATP、CTP 、GTP 及びUTP をプラ
イマー延長反応混合物に混合し、得られた溶液を上記の
ように処理する。新たに合成された鎖及びその相補的核
酸鎖は、方法の引き続く工程に使用できる二本鎖分子を
形成する。ＰＣＲ反応は、生産物中に、グルコセレブロ
シダーゼ遺伝子中の変異を検定するのに有用な所定の制
限部位を導入するために有利に使用することができる。
ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第 4,683,192号、同 4,68
3,202号、同 4,800,159号及び同 4,965,188号、並びに
PCR Technology: Principles and Applications for D
NA Amplification 、エイチ・エーリッヒ(H. Erlich)
編集、ストックホルム出版、ニューヨーク(1989); 及び
PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications
、pp. 245-252 、イニスら編集、アカデミック・プレ
ス、サン・ディエゴ、カリフォルニア(1990)を含む幾つ
かの文献に詳細に記載されている。

【００３２】好ましい態様において、増幅反応当たり、
２対の第１及び第２プライマーを使用する。それぞれ複
数の異なるプライマー対を使用して、異なる複数の増幅
から得られたこの増幅反応生産物は、組合せてもよく、
また別個に分析することもできる。しかしながら、本発
明は、またただ１対の第１及び第２プライマーを使用す
る増幅及び多重増幅（約８、９又は１０対まで使用）を
企図する。（３）核酸配列分析 核酸配列分析は、（ａ）プローブ鎖及びその相補的標的
物のハイブリダイゼーション及び変性に基づく物理化学
的技術、及び（ｂ）エンドヌクレアーゼ、リガーゼ及び
ポリメラーゼとの酵素反応を組合せることによって、試
みることができる。核酸は、 DNA又は RNAレベルで分析
することができる。前者は、個々の人間の遺伝子潜在性
を分析し、後者は、特定の細胞の発現情報を分析する。
核酸ハイブリダイゼーションを使用する分析において
は、本発明の方法における DNA二本鎖の存在の検出は、
種々の方法によって行うことができる。DNA二本鎖の存
在を検出するための試みの一つとしては、 DNA二本鎖に
おいてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、二本
鎖を検出し得るようにするラベル又は指示基を含む。典
型的には、かかるラベルは、放射線原子、化学的修飾さ
れたヌクレオチド塩基等を含む。

【００３３】オリゴヌクレオチドは、ラベルされ、即
ち、指示手段又は基に作動可能に連結され、標的テンプ
レート中の特定のヌクレオチド配列の存在を検出するの
に使用される。オリゴヌクレオチドプローブに作動可能
に連結された又はその一部として存在する放射線要素
（ラベルされたオリゴヌクレオチド）は、 DNA二本鎖の
検出を可能とする有用な手段を提供する。典型的な放射
線要素は、ベータ線を放出するものである。ベータ線を
放射する要素、例えば³H、¹²C 、³²P 及び³⁵S は、ベー
タ線放出放射性元素ラベルの群を代表する。放射性ポリ
ヌクレオチドプローブは、典型的には、放射活性ラベル
されたヌクレオチドを DNAキナーゼを使用して核酸中に
酵素的に導入することによって調製することができる。
放射活性ラベルされたオリゴヌクレオチドに代わるもの
としては、金属錯化剤、ビオチン−含有基、蛍光化合物
などを含むように化学的に修飾されたオリゴヌクレオチ
ドが挙げられる。１つの有用な金属錯化剤は、ランタニ
ドと芳香族ベータジケトンとによって形成されたランタ
ニドキレートである。このランタニドは、 EDTA 類似体
のようなキレート形成化合物を介して、核酸又はオリゴ
ヌクレオチドに結合し、蛍光ランタニド複合体を形成す
る。米国特許第 4,374,120号、同 4,569,790号、公表さ
れた特許出願 EP 0139675 及び WO87/02708 を参照。

【００３４】ビオチン又はアクリジンエステル−ラベル
化オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドをラベルす
るためのその使用は、既に記載されている。例えば、米
国特許第 4,707,404号、公表された特許出願 EP 021295
1 及びヨーロッパ特許第 0087636号を参照。有用な蛍光
マーカー化合物は、フルオレッセイン、ローダミン、テ
キサス・レッド、 NBD等を含む。DNA二本鎖中に存在す
るラベル化オリゴヌクレオチドは、その二本鎖自体をラ
ベルし、従って、分析されるべき試料中に存在する他の
核酸から区別する。二本鎖中のラベルの存在の検出、従
って二本鎖の存在の検出は、 DNA二本鎖を、そのDNA二
本鎖とハイブリダイズしないラベル化されたオリゴヌク
レオチドプローブから単離することを典型的に含む。一
本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、非ハイブリダイズ化
し、ラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブを、 D
NA二本鎖カラーインデックス単離する技術は周知であ
り、典型的には、それらの化学的特性に基づいて、一本
鎖のものを二本鎖から単離することを含む。更に頻繁に
使用される分離技術は、不溶性マトリックスに結合した
DNA二本鎖から、例えば洗浄によって非ハイブリダイズ
化プローブを分離する不均一ハイブリダイズフォーマッ
トを使用することを含む。例えば、サザーンブロット技
術が挙げられる。この場合、マトリックスはニトロセル
ロースシートであり、ラベルは³²P である。サザーンの
J. Mol. Biol. 98:503 (1975)参照。

【００３５】オリゴヌクレオチドは、固体マトリック
ス、即ち水性不溶性固体支持体に、典型的にはその5'末
端で又はその近辺において、有利に結合することができ
る。有用な固体マトリックスは、この技術分野で周知で
あり、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（ピスカタ
ウェー(Piscataway)、ニュージャージー州）から商品名
SEPHADEXとして入手可能なもののような架橋デキストラ
ン；アガロース、ポリスチレン又はラテックスビーズ
（直径約１μｍ〜５mm）；塩化ポリビニル、ポリスチレ
ン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、又は
ナイロンベースウェブ（例えば、シート、ストリップ、
パドル、プレート、マイクロタイタープレートウェルな
どを含む。要素オリゴヌクレオチドの5'又は3'末端に
「連結（linking)」ヌクレオチドを添加したり、またそ
の要素を固体支持体に操作可能に連結するために連結ヌ
クレオチドを使用することもできる。ヌクレオチドハイ
ブリダイズ分析において、ハイブリダイゼーション反応
混合物は、ハイブリダイズ条件の下において、テンプレ
ート上の所定の配列と相補性を有するオリゴヌクレオチ
ドが、テンプレート中に存在する相補的核酸配列とハイ
ブリダイズして、ハイブリダイゼーション生産物、即
ち、オリゴヌクレオチド及び標的核酸を含む複合体を形
成するに充分な時間、企図する方法に維持する。

【００３６】表現「ハイブリダイズ条件(hybridizing c
ondition) 」及びその用語的に等価な表現は、維持期間
とともに使用する場合には、ハイブリダイゼーション反
応生産物を、その混合物における反応体及びそれに伴う
試薬の濃度の意味において、１以上のオリゴヌクレオチ
ドが標的配列とアニールして、核酸二本鎖を形成するに
充分な時間、温度及びpH条件に曝すことを意味する。ハ
イブリダイゼーションを達成するのに必要なかかる時
間、温度及びpH条件は、この技術分野において周知であ
るように、ハイブリダイゼーションの動力学に影響する
かも知れないものとして、ハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドの長さ、そのオリゴヌクレオチドと標的との
相補性の程度、そのオリゴヌクレオチドにおけるグアニ
ンとシトシンとの含有量、所望のハイブリダイゼーショ
ンの緊縮(stringency)、及びハイブリダイゼーション反
応混合物中の塩又は付加的な試薬の存在に依存する。所
定のハイブリダイゼーション反応混合物についてハイブ
リダイゼーション条件を最良化する方法は、当技術分野
において周知である。典型的なハイブリダイズ条件に
は、４〜９の間のpH値に緩衝された溶液の使用が含ま
れ、この条件は、４〜３７℃、好ましくは約１２〜約３
０℃、更に好ましくは約２２℃において、０．５秒〜２
４時間、好ましくは２分〜１時間である。例示的な条件
は、実施例４に記載されるような条件である。

【００３７】ハイブリダイゼーションは、周知のよう
に、均一又は不均一形態で実施することができる。均一
ハイブリダイゼーション反応は、溶液中において全体的
に起こり、そこでは、オリゴヌクレオチド及びハイブリ
ダイズされるべき核酸配列（標的）の両者が、溶液中に
おいて可溶性形態で存在する。不均一反応は、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチドプローブ又は標的核酸が
結合する反応媒体で不溶性のマトリックスを使用するこ
とを含む。標的配列を含む核酸が二本鎖(ds)形態である
場合には、ハイブリダイゼーション反応を行う前に、例
えば加熱又はアルカリ処理によって、その dsDNAをまず
変性することが好ましい。 dsDNAの変性は、ハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドと混合する前に、又は dsD
NAをオリゴヌクレオチドと混合した後で実施することが
できる。オリゴヌクレオチドとテンプレートとの間の所
定の相補性は、２種類の択一的態様で達成される。テン
プレート DNA中の配列は、公知であるかも知れない。例
えば、形成するプライマーは、公知のグルコセレブロシ
ダーゼ配列とハイブリダイズできる場合、ここで記載し
たような以後の分析目的とともに、配列の目的でDNAの
領域へプライマー延長を開始させることができる場合、
又は予配列によってヌクレオチド配列化(sequencing)の
領域を決定し、そのプライマーが最近の配列領域から未
知配列の領域へと延長するように設計されている場合で
ある。この後者の方法は、配列化の各周期が予め決定さ
れた配列に基づいて設計されるプライマーによって指示
されるので、「指示配列化(directed sequencing) 」を
呼ばれた。

【００３８】ハイブリダイゼーション反応混合物中に存
在するオリゴヌクレオチドの効果的な量は、一般に周知
であり、典型的には、ハイブリダイズされるべきオリゴ
ヌクレオチドとテンプレートとの間のモル比で表され
る。好ましい比は、標的配列とオリゴヌクレオチドとの
等量モルを含むハイブリダイゼーション反応混合物であ
る。周知のように、等モル比からの変移は、効率を低め
るが、ハイブリダイゼーション反応生産物を生成する。
従って、１成分が、他の成分に対して１００倍モルもの
過剰であるような比であり得るが、５０倍より少ない過
剰、好ましくは１０倍より少ない過剰、更に好ましくは
２倍より少ない過剰が本発明の実施において望ましい。

【００３９】（ａ）膜固定化標的配列の検出 DNA（サザーン）ブロット技術において、 DNAは、既述
のようにＰＣＲ増幅によって調製される。このＰＣＲ生
産物（DNA フラグメント）は、アガロースゲルにおける
大きさに従って分離され、ニトロセルロース又はナイロ
ン膜上に移転（ブロット）される。通常の電気泳動によ
って、１００〜３０，０００塩基対のフラグメントが分
離でき、一方、パルス化電場(pulsed field)ゲル電気泳
動により、長さ２０００万塩基対までのフラグメントが
分離できる。特定のＰＣＲ生産物を含む膜上の位置は、
特定のラベルされた核酸プローブによるハイブリダイゼ
ーションによって決定される。好ましい態様において、
ＰＣＲ生産物は、ドット−ブロット（スロット−ブロッ
ト）装置を使用して、固体マトリックス（ニトロセルロ
ース膜）上に直接固定され、プローブハイブリダイゼー
ションによって分析される。米国特許第 4,582,789号及
び同第 4,617,261号参照。固定された DNA配列は、対立
遺伝子特異性オリゴヌクレオチド(ASO) プローブで検索
することによって分析することができる。このプローブ
は、約２０ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチド
長の合成 DNAオリゴマーである。これらのプローブは、
ゲノム中の特有の配列を代表するに充分長いが、標的分
子にハイブリダイゼーションする際に、内部ミスマッチ
による不安定化されるに充分に短い。従って、単一ヌク
レオチドだけ相違する配列は、注意深く調整したハイブ
リダイゼーション条件下において、ＡＳＯプローブと通
常の又は変異標的とのハイブリッドの異なる変性挙動に
よって区別できるかも知れない。

【００４０】（ｂ）溶液中での標的配列の検出 核酸の精製又は固定化を必要としない幾つかの迅速な技
術が開発された。例えば、プローブ／標的ハイブリッド
を、ヒドロキシルアパタイトのような固体マトリックス
上で選択的に単離することができる。このヒドロキシル
アパタイトは、二本鎖核酸に優先的に結合する。これと
は別に、プローブの核酸を固体マトリックス上に固定
し、溶液から標的配列を捕獲するのに使用することがで
きる。標的配列の検出は、第２の、ラベル化されたプロ
ーブ（競争型分析において標的配列により支持体から置
換されるか又はサンドイッチ型形態において標的配列の
橋かけ作用を経て、支持体に結合するもの）によって達
成することができる。オリゴヌクレオチド結合分析(lig
ation assay)(OLA) において、酵素 DNAリガーゼを使用
して、２つの合成オリゴヌクレオチド配列を共有結合さ
せ、もってそれらを正確な頭−尾並列で、標的配列と塩
基対を形成させる。２つのオリゴマーの結合は、連結領
域においてミスマッチヌクレオチドの存在によって阻害
される。この操作によって、 DNA精製の必要なく、細胞
試料における公知配列の変異体間で区別が可能となる。
２つのオリゴヌクレオチドは、その一方を固定化し、第
２の、ラベル化されたオリゴヌクレオチドが獲得される
かどうかを観察することによって、モニターすることが
できる。

【００４１】（ｃ）塩基置換の検出のためのスキャニン
グ技術 ３種類の技術によって、未知の単一ヌクレオチド置換又
は他の配列差のプローブ／標的二重鎖の分析を行うこと
ができる。リボヌクレアーゼ(RNase) Ａ技術において、
酵素は、ラベル化された RNAプローブが標的 RNA又は D
NA配列とミスマッチする位置で、そのラベル化された R
NAプローブを開裂させる。このフラグメントは、大きさ
に応じて分離し、変異のおおよその位置を決定すること
を可能とする。米国特許第 4,946,773号参照。変性勾配
ゲル(denaturing gradient gel) 技術において、プロー
ブ−標的二重鎖は、増大する強度の変性勾配中で電気泳
動によって分析される。変性は、移動速度の増大によっ
て達成される。ミスマッチした塩基対を有する二重鎖
は、完全にマッチ（対応）する二重鎖よりも迅速に変性
する。第３の方法は、ミスマッチした塩基対の化学的開
裂に依存する。Ｔと、Ｃ、Ｇ又はＴとのミスマッチは、
Ｃと、Ｔ、Ａ又はＣとのミスマッチとともに、ヘテロ二
重鎖で検出することができる。四酸化オスミウム（Ｔ及
びＣミスマッチ）又はヒドロキシルアミン（Ｃミスマッ
チ）との反応及びピペリジン処理によって、適当なミス
マッチにおいてプローブが開裂する。

【００４２】（４）好ましい態様 上記の通り、本発明は、増幅条件下において、ヒトから
単離したゲノム DNA試料をＰＣＲプライマー対で処理し
て、グルコセレブロシダーゼイントロン２のヌクレオチ
ド（nt）位置１（IVS2+1とも呼ばれる）を含むヒトゲノ
ム DNAの領域を増幅することを含むスクリーニング方法
を企図する。増幅条件は、 DNA合成に効果的な量におい
て、ＰＣＲバッファー及び熱周期温度の存在を含む。こ
のようにして得られたＰＣＲ生産物を、イントロン２の
nt位置１におけるアデニンヌクレオチド点変異に関して
分析する。好ましくは、ＰＣＲ生産物は、以下の式で示
される5'から3'の方向で記載された場合に、３５８塩基
対（bp）を含む連続したヌクレオチド配列を有する。 5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＡＧ
ＧＧＴＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣ
ＡＣＡＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧ
ＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴ
ＣＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＡＧＣＡＣＡＧＡ
ＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＧＴＣＣＴＴ
ＴＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧ
ＴＡＧＡＣＴＴＴＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡ
ＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣ
ＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＧ
ＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧ
ＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧ
ＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＴ
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴ−3'（配列番号：２）

【００４３】好ましくは、グルコセレブロシダーゼ遺伝
子の増幅領域で使用されるＰＣＲプライマー対は、エク
ソン２のヌクレオチド８８の位置5'において、そのエク
ソンのアンチセンス鎖とハイブリダイズする第１のプラ
イマーと、イントロン２のヌクレオチド１の位置3'にお
いてそのイントロンのセンス鎖とハイブリダイズする第
２のプライマーとを含む。好ましい第１のプライマー
は、式：5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ
−3'（配列番号：３）で示され、好ましい第２のプライ
マーは、式：5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡ
ＴＣＧ−3'（配列番号：４）で示される。好ましい態様
において、増幅生産物をハイブリダイゼーション条件下
においてIVS2+1変異に特異的なオリゴヌクレオチドプロ
ーブで処理し、そしてハイブリダイゼーション生産物の
形成を検出することによって、ＰＣＲ生産物を、IVS2+1
変異について分析する。好ましいオリゴヌクレオチドプ
ローブは、式：5'−ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡ
Ｇ−3'（配列番号：５）で示されるヌクレオチド配列を
含む。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイ
ゼーションは、米国特許第 4,530,901号に記載されてい
る。別の好ましい態様において、ＰＣＲプライマー対
は、IVS2+1変異が存在しない場合には、所定の Hph I制
限酵素部位を含む増幅生産物を形成する。この Hph I制
限酵素は、以下の式で示される二本鎖 DNA配列上のアス
テリスクでマークされた位置で開裂する。

【００４４】 5'−ＧＧＴＧＡ（Ｎ）₈*−3'（配列番号：６） 3'−ＣＣＴＣＴ（Ｎ）₇*−5'（配列番号：７） 但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴである。Hph I制限部位
を含む生産物を増幅するための好ましい第１プライマー
は、式：5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ
−3'（配列番号：３）で示され、好ましい第２プライマ
ーは、式：5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴ
ＣＧ−3'（配列番号：４）で示される。好ましくは、Ｐ
ＣＲ生産物は、配列番号：２で示される式によって表示
される5'から3'の方向に記載された場合に、３５８bpを
含む連続ヌクレオチド配列を有する。分析には、制限条
件下において、配列番号：６及び７部位によって示され
る配列を認識する Hph I制限酵素で増幅生産物を処理
し、次いで制限生産物の存在を検出することが含まれ
る。実施例３に示されるように、増幅生産物がIVS2+1変
異を含まない場合には、得られる Hph I制限酵素は、エ
クソン２の末端及びイントロン２の始めにおける（配列
番号：１におけるヌクレオチド位置１０６７〜１０７
１）天然 Hph I部位を切断する。生成した消化生産物
は、３つのフラグメント１４１、１１７及び１００bp長
を含む。増幅生産物が、グアニンヌクレオチドに代わっ
てアデニンのIVS2+1変異を含む変異対立遺伝子からのも
のである場合には、生成 Hph I制限酵素は、エクソン２
−イントロン２連結部に形成する部位を切断しない。通
常の対立遺伝子の生成消化生産物は、従って長さ２４１
及び１１７bpの２つのフラグメントを含む。

【００４５】多重グルコセレブロシダーゼ変異IVS2+1、
エクソン２nt５７Ｇ（８４ＧＧ）、エクソン９nt２Ｇ
（１２２６Ｇ）及びエクソン１０nt６０Ｃ（１４４８
Ｃ）の検出のためのスクリーニング方法であって、ＰＣ
Ｒバッファー中において、ゲノムDNA及び２種類のグル
コセレブロシダーゼ遺伝子特異性プライマー対（その各
対が5'及び3'プライマーで規定される）を組合せること
により、ＰＣＲ混合物を形成するスクリーニング方法も
企図される。第１のセット（対）における5'プライマー
は、グルコセレブロシダーゼ遺伝子のヌクレオチド位置
１〜５７に対応するヒトゲノム DNAの領域内でプライム
することができる。第１の3'プライマーは、イントロン
２のヌクレオチド位置１のヒトゲノム DNA3'の領域（グ
ルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロン２のヌクレオチ
ド位置２５１〜２７０に対応する）内でプライムするこ
とができる。第２の対における5'プライマーは、グルコ
セレブロシダーゼ遺伝子イントロン７のヌクレオチド位
置８４１〜８６０に対応するヒトゲノム DNAの領域内で
プライムすることができる。第２の3'プライマーは、グ
ルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロン１０のヌクレオ
チド位置２６〜４５に対応するヒトゲノム DNAの領域内
でプライムすることができる。

【００４６】このようにして形成したＰＣＲ混合物は、
複数の熱周期に付され、グルコセレブロシダーゼ遺伝子
増幅生産物を製造する。増幅生産物は、次いでハイブリ
ダイゼーション条件の下で、各変異に特異的なオリゴヌ
クレオチドプローブで処理される。ハイブリダイゼーシ
ョン生産物は、次いで検出される。好ましい第１の5'プ
ライマーは、式：5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴ
ＴＴＧＡ−3'（配列番号：３）で示され、第１の3'プラ
イマーは、式：5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡ
ＡＴＣＧ−3'（配列番号：４）で示される。好ましい第
２の5'プライマーは、式：5'−ＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧ
ＡＴＣＡＧＴＴＧＣ−3'（配列番号：８）で示され、好
ましい第２の3'プライマーは、式：5'−ＡＡＣＧＣＴＧ
ＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ−3'（配列番号：９）で示
される。増幅生産物は、変異に特異的なプローブと、通
常の遺伝子配列に特異的なプローブとによって分析され
る。グルコセレブロシダーゼ遺伝子変異IVS2+1、エクソ
ン２nt５７Ｇ（８４ＧＧ）、エクソン９nt２Ｇ（１２２
６Ｇ）及びエクソン１０nt６０Ｃ（１４４８Ｃ）にハイ
ブリダイズする好ましいプローブは、それぞれ配列番
号：５、配列番号：１２、配列番号：１４及び配列番
号：１６によって示される配列を有する。

【００４７】Ｃ．プライマー及びプローブ 本発明は、更に配列番号：３、配列番号：４、配列番
号：８及び配列番号：９によって示されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチド合成プライマーを企図す
る。また、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：
１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１
４、配列番号：１５及び配列番号：１６によって示され
るヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプロー
ブをも企図する。

【００４８】

【実施例】以下の実施例は、説明の目的で記載するもの
であり、明細書及び特許請求の範囲の範囲を如何なる形
態においても限定するものとして解釈されるものではな
い。実施例１ ゲノム DNAの調製及び予備スクリーニング 高分子量 DNAを、１００人の非関連患者（その内９７人
はユダヤ人であり、残りの３人は、半ユダヤ人である）
からの白血球細胞から抽出した。ゲノム DNAの始めのス
クリーニングとして、上記患者の了承後、血液を収集
し、0.14 Mクエン酸、0.2 M のクエン酸三ナトリウム、
及び0.22 Mのデキストロースの混合物で凝固防止した。
凝固防止血液を、室温で１５分800 ×g で遠心分離し、
血小板富化血漿上澄を廃棄した。ペレット化した赤血
球、単核及び多核細胞を再懸濁し、冷0.14 M燐酸緩衝塩
水(PBS) （pH7.4)で、出発血液容積と等しい量まで希釈
した。末梢血液の白血球細胞を、低エンドトキシンフィ
コール−ハイペーク(Ficoll-Hypaque)（シグマ化学社、
セントルイス、ミズーリ州）上で、１８℃、１０分、40
0 ×g で遠心分離することによって、希釈細胞懸濁液か
ら回収した。ペレット化した白血球細胞は、次いで再懸
濁し、高分子量 DNAのソースとして使用した。

【００４９】高分子量 DNAは、当業者にとって周知の方
法（マニアティスらの Molecular Cloning: A laborato
ry Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Sections 9.16-9.23 (1989) 及び米国特許第 4,683,195
号に記載) によって単離した白血球細胞から精製した。
グルコセレブロシダーゼ遺伝子型は、時としてグルコセ
レブロシダーゼ遺伝子のイントロン６中に存在する制限
酵素 Pvu II による制限多形性で特徴付けられるので、
全ての試料を、まず、この制限酵素 Pvu II による制限
多形性の存在についてスクリーニングした。ジムランら
の Am. J. Hum.Genet. 46:902-905 (1990) 参照。簡潔
に述べれば、この Pvu II ポリモルフィズムは、グルコ
セレブロシダーゼゲノム DNAのイントロン６を実施例３
に記載されるようにＰＣＲ増幅し、次に Pvu II 制限エ
ンドヌクレアーゼ（ニューイングランド・バイオラブ、
ベバリー、マサチューセッツ）で制限消化することによ
って分析する。イントロン６を増幅するのに使用される
エクソン６中の領域に対応する5'アンチセンスオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列：5'−ＴＣＡＡＧＡＣＣ
ＡＡＴＧＧＡＧＣＧＧＴＧ−3'（配列番号：１７）であ
った。エクソン７中の領域に対応する3'センスオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列：5'−ＣＴＡＧＧＴＣＡ
ＣＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧ−3'（配列番号：１８）であ
った。生成したＰＣＲで増幅した生産物は、７９４塩基
対長であった。 Pvu II 多形性部位は、配列番号：１に
示される通常のグルコセレブロシダーゼ遺伝子のヌクレ
オチド位置３９３８においてＧ→Ａ単一塩基置換であ
る。従って、通常の遺伝子は、制限部位を欠失し、
「＋」対立遺伝子として示される。一方、変異遺伝子
は、制限部位を有し、「−」対立遺伝子として示され
る。この多形性を有する対立遺伝子は、 Pu1.1^- として
示す。

【００５０】グルコセレブロシダーゼcDNAの１２２６ヌ
クレオチド位置における、アデニンヌクレオチドに対す
るグアニンヌクレオチドによる点変異に関して、実施例
３及び４に示されるようにして、 DNAの各試料を調べ
た。この変異を、以下で、グルコセレブロシダーゼ遺伝
子のエクソン９におけるヌクレオチド位置２におけるエ
クソン位置によって示す。この変異は、 Pu1.1^- 遺伝子
型の意味（即ち、関連して）必ず見出される。ジムラン
らの上記文献(1990)参照。この変異に対してホモ接合で
ある、従って、両対立遺伝子に Pv1.1^- ／ Pv1.1^- の多
形性を有する個人からの DNAは、更に検討しなかった。
ゴーシェ病の診断は、骨髄の組織病理学的研究又は末梢
血球細胞における酸ベータグルコシダーゼの診断的に低
いレベルを示すことによって、全ての患者において充分
確立されている。人種起源による分類は、各患者によっ
て提供された家族歴による。ヘテロ接合であると決定さ
れたゲノム DNAの試料は、ヌクレオチド（nt）５７のエ
クソン２（cDNA位置に対応して８４ＧＧとも呼ばれる）
における挿入変異の存在及びnt６０のエクソン１０（cD
NA位置に対応して１４４８Ｃとも呼ばれる）における点
変異に関して、更に調べた。非同定ゴーシェ病対立遺伝
子は、「？」として示した。予備スクリーニングによっ
て同定されない変異を有する患者に対しては、対応する
cDNAを実施例２に記載するように分析した。

【００５１】実施例２ cDNAの調製及び配列化 １２２６Ｇ／？ Pv1.1^- ／ Pv1.1⁺ 遺伝子型の患者に由
来する培養リンパ芽球又は線維芽細胞から全細胞 RNAを
精製した。精製操作は、コムクジンスキー(Chomczynsk
i) らの Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)に記載さ
れるようにして行った。簡単に述べれば、細胞を、実施
例１に記載のようにして調製した。この細胞を、4.0 M
グアニジンチオシアネート、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)
、及び0.1M ベータメルカプトエタノールを含む変性溶
液１０ml中で均一化して、細胞溶解物を形成した。ラウ
リルサルコシネートナトリウムをその細胞溶解物に、最
終濃度が0.5 % となるように混合し、その後、混合物を
室温で、１０分間、5000×gで遠心分離した。全 RNAを
含む生成上澄を、5.7 M 塩化セシウム及び0.01 M EDTA
のクッション(pH 7.5)上に層を形成させ、次いで遠心分
離によりペレット化した。生成 RNAペレットを、10 mM
Tris-HCl (pH 7.6) の溶液及び0.1 % ドデシル硫酸ナト
リウム(SDS) を含む1 mM EDTA (TE)に溶解した。フェノ
ール−クロロホルム抽出及びエタノール析出の後、精製
全細胞 RNA濃度を、２６０nmにおける光学濃度を測定す
ることにより評価した。

【００５２】上記のようにして調製した全 RNAをテンプ
レートとして使用し、逆転写酵素を使用してcDNA合成を
行い、第１の鎖を調製し、5'及び3'フラグメントと名付
ける２つの重複するフラグメントとしてcDNAを増幅する
ように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーでＰＣ
Ｒを行った。本発明の実施に使用したオリゴヌクレオチ
ドは、アプライド・バイオシステム３８１Ａ DNA合成機
上で、その製造指示に従って合成した。5'フラグメント
を作製するために、第１鎖の合成は、グルコセレブロシ
ダーゼcDNAにおいてヌクレオチド１２９８から始まり、
ヌクレオチド１３１７まで延長する領域に対応する3'セ
ンスプライマー（センス又はコードテンプレート鎖にハ
イブリダイズし、本明細書の詳細な既述部分で記載する
ように、非コード鎖の合成をプライムするものとして定
義される）を使用して実施した。典型的な５０μl 転写
反応において、上記で調製し、かつ水で希釈した２〜４
μｇの RNAをまず、ヌクレオチド配列：5'−ＡＣＴＧＴ
ＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＡＣＧＣＡ−3'（配列番号：１
９）を有する3'センスオリゴヌクレオチドプライマー、
２５０ngと、６５℃で５分間アニールした。この3'プラ
イマーは、グルコセレブロシダーゼエクソン９のヌクレ
オチド位置７４〜９３（配列番号：１におけるnt５９２
６〜５９４５）に対応した。次いで、第１鎖cDNA合成反
応混合物の１２μl を、各1.0 mMの dATP 、dCTP、dGTP
及びdTTP、40 mM Tris-HCl (pH 8.0) 、8 mM MgCl₂、50
mM NaCl、2 mM スペルミジン、1 U の RNase ブロッ
ク（ストラタジーン(Stratagene)、及び 25 U のAMV 逆
転写酵素を含む系、20μl に添加した。この溶液を、４
２℃で１時間維持し、次いで６５℃で５分間維持して、
第１鎖cDNAを形成した。

【００５３】5'フラグメントの第１鎖cDNAの２０μl
を、各1.0 mMの dATP 、dCTP、dGTP及びdTTP、40 mM Tr
is-HCl (pH 8.0) 、8 mM MgCl₂、50 mM NaCl、2 mM ス
ペルミジン、5% DMSO 及び 3.5 UのTaq （テルムス・ア
クアティカス） DNAポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）の最
終濃度の溶液中に、２５０ngの配列：5'−ＣＴＣＴＧＧ
ＡＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＴ−3'（配列番号：２０）
を有する5'アンチセンスオリゴヌクレオチド及び２５０
ngの配列：5'−ＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＴ
ＣＡ−3'（配列番号：２１）を有する3'センスオリゴヌ
クレオチドを含むＰＣＲ反応混合物、８０μl で希釈し
た。5'プライマーは、グルコセレブロシダーゼエクソン
１のヌクレオチド位置１８４〜２０３（配列番号：１の
nt５３９〜５５８）に対応した。3'プライマーは、グル
コセレブロシダーゼエクソン９のヌクレオチド位置４７
〜６６（配列番号：１のnt５８９９〜５９１８）に対応
した。反応混合物を、鉱油上に層を形成し、 DNAサーマ
ル・サイクラー（パーキン・エマルー、サウス・プレイ
ンフィールド、ニュージャージー州：シータス、エメリ
ービル、カリフォルニア州）上で、３５サイクルの増幅
に付した。各増幅サイクルは、９２℃で３０秒の変性、
５８℃で３０分のアニール、及び７２℃で３０秒の延長
を含んだ。増幅されたcDNA試料を、次いでフェノール／
クロロホルムで２度、クロロホルムで１度抽出し、エタ
ノールで析出させ、そして水中に−７０℃で保存した。
増幅したcDNAは、エクソン１の5'部分に対応するcDNAの
リーダー配列の部分からなり、ゲノム配列のエクソン９
に対応する全cDNAの殆どまで延長していた。増幅したcD
NA5'生産物の長さは、約１３３６塩基対であった。

【００５４】生成した増幅cDNA5'フラグメントの配列化
について、一本鎖 DNAを先ず形成させた。上記で調製し
た増幅cDNA生産物の５〜１０％は、配列：5'−ＣＴＣＴ
ＴＣＡＴＣＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧ−3'（配列番号：２
２）を有する5'アンチセンスオリゴヌクレオチドプライ
マー又は配列：5'−ＣＴＡＧＧＴＣＡＣＧＧＧＣＡＡＴ
ＧＡＡＧ−3'（配列番号：２３）を有する3'センスオリ
ゴヌクレオチドプライマーの何れかを使用するアンバラ
ンスＰＣＲ増幅において、テンプレートとして作用し
た。この5'プライマーは、グルコセレブロシダーゼ遺伝
子エクソン１のヌクレオチド位置２０５〜２２４（配列
番号：１のnt５６０〜５７９）に対応した。3'プライマ
ーは、グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン７のヌク
レオチド位置１３０〜１４９（配列番号：１のnt４２４
６〜４２６５）に対応した。異なるプライマーを使用す
ることを除いて、ＰＣＲ増幅を上記のように実施した。
一本鎖ＰＣＲ生成cDNAの配列化を、その一本鎖cDNAに沿
って、約２００ヌクレオチド離れているcDNAプライマー
によって行った。

【００５５】グルコセレブロシダーゼcDNAの3'フラグメ
ントに対する第１鎖の合成は、異なるオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用することを除き、5'フラグメントに
関して上記したように、実施した。グルコセレブロシダ
ーゼcDNAにおける、ヌクレオチド２０１１から始まり、
ヌクレオチド２０３０まで延長する領域に対応するヌク
レオチド配列：5'−ＧＣＴＣＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＧＴ
ＴＣＴＧ−3'（配列番号：２４）を有する3'センスプラ
イマーを、転写反応に使用した。3'プライマーは、グル
コセレブロシダーゼエクソン１１のヌクレオチド位置５
０７〜５２６（配列番号：１のnt７１０２〜７１２１）
に対応した。3'フラグメントの第１鎖cDNAの２０μl
を、各1.0 mMの dATP 、dCTP、dGTP及びdTTP、40 mM Tr
is-HCl (pH 8.0) 、8 mM MgCl₂、50 mM NaCl、2 mM ス
ペルミジン、5% DMSO 及び 3.5 UのTaq ポリメラーゼ
（ベーリンガー・マンハイム）の最終濃度の溶液におい
て、２５０ngの配列：5'−ＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＡ
ＣＣＣＡＴＧＧ−3'（配列番号：２５）を有する5'アン
チセンスオリゴヌクレオチド及び２５０ngの配列：5'−
ＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＣＴ−3'（配列
番号：２６）を有する3'センスオリゴヌクレオチドを含
むＰＣＲ反応混合物、８０μl で希釈した。5'プライマ
ーは、グルコセレブロシダーゼエクソン５のヌクレオチ
ド位置１４〜３３（配列番号：１のnt３０６０〜３０６
９）に対応した。3'プライマーは、グルコセレブロシダ
ーゼエクソン１１のヌクレオチド位置３１６〜３３５
（配列番号：１のnt６９１２〜６９３１）に対応した。
反応を、その5'フラグメントに対して上記したように実
行した。増幅したcDNA生産物の長さは、約１３７２塩基
対であった。

【００５６】生成増幅したcDNA3'フラグメントの配列化
については、まず一本鎖 DNAを形成した。上記で増幅し
たcDNA生産物の５〜１０％は、配列：5'−ＡＣＣＣＣＴ
ＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡ−3'（配列番号：２７）
を有する5'アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー
又は配列：5'−ＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＧ
ＴＡ−3'（配列番号：２８）を有する3'センスオリゴヌ
クレオチドプライマーの何れかを使用するアンバランス
ＰＣＲ増幅において、テンプレートとして作用した。5'
プライマーは、グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン
７のヌクレオチド位置１１０〜１２９（配列番号：１の
nt４２２６〜４２４５）に対応した。3'プライマーは、
グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン１１のヌクレオ
チド位置１１６〜１３５（配列番号：１のnt６７１２〜
６７３１）に対応した。異なるプライマーを使用するこ
とを除き、上記のようにしてＰＣＲ増幅を行った。一本
鎖ＰＣＲ生成cDNAの配列化は、その一本鎖cDNAに沿って
約２００ヌクレオチド離れているcDNAプライマーで行っ
た。

【００５７】１２２６Ｇ／？ Pv1.1^- ／ Pv1.1⁺ 遺伝子
型を有するゴーシェ病患者からのＰＣＲ増幅cDNAから直
接決定される配列は、エクソン２の欠失を示した。エク
ソン２の欠失をもたらす変異の特性を決定するために、
これらの患者からのゲノム DNAを先ず増幅し、以下の実
施例３及び４にそれぞれ記載されるように、制限消化分
析及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーションに付した。

【００５８】実施例３ IVS2+1点変異を含むＰＣＲ増幅ゲノム DNAの調製及び H
ph I制限消化による検出 イントロン２点変異（IVS2+1）を２つの方法を使用して
決定した。この実施例で記載するように、ゲノム DNAを
ＰＣＲで増幅し、次いで Hph I制限エンドヌクレアーゼ
消化することによって変異を同定した。ゲノム DNAのＰ
ＣＲによる増幅及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションによる変異の検出は、実施例
４に記載した通りである。制限消化分析を実施するにつ
いては、通常のグアニンヌクレオチドが存在する場合に
は、天然の Hph I制限酵素部位を含む増幅生産物を生成
するＰＣＲプライマー対を選択した。従って、その位置
におけるアデニンヌクレオチドのIVS2+1変異は欠失して
いた。 Hph I制限酵素は、以下の式： 5'−ＧＧＴＧＡ（Ｎ）₈*−3'（配列番号：６） 3'−ＣＣＴＣＴ（Ｎ）₇*−5'（配列番号：７） （但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴである。）で示される
二本鎖 DNA配列におけるアステリスクで表示された位置
を開裂した。

【００５９】ここで示されるように、増幅生産物がIVS2
+1変異を含まない場合には、生成する Hph I制限酵素部
位は、エクソン２の末端でかつイントロン２の初め（配
列番号：１のヌクレオチド位置１０６７〜１０７１）に
おける天然 Hph I部位を認識した。生成した消化生産物
は、１４１、１１７及び１００bp長の３つのフラグメン
トを含んでした。増幅生産物が、グアニンヌクレオチド
の代わりに、アデニンヌクレオチドのIVS2+1変異を含む
変異対立遺伝子から由来する場合には、生成 Hph I制限
酵素は、エクソン２−イントロン２連結部に形成する部
位を切断しなかった。従って、通常の対立遺伝子の生成
消化生産物は、２４１及び１１７bp長の２つのフラグメ
ントを含んでした。

【００６０】疑似遺伝子は、通常のグルコセレブロシダ
ーゼ遺伝子におけるグアニン残基の代わりに、イントロ
ン２のヌクレオチド位置１にアデニン残基を通常有する
ので、点変異を有する DNAの領域を増幅くするためのプ
ライマーは、機能的なグルコセレブロシダーゼ遺伝子だ
けが増幅され、疑似遺伝子が増幅しないように設計し
た。5'アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーは、
エクソン２のヌクレオチド位置１７及び１９の２つの位
置で、疑似遺伝子とミスマッチし、配列：5'−ＧＡＡＴ
ＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ−3'（配列番号：３）
を有する。5'プライマーは、グルコセレブロシダーゼエ
クソン２のヌクレオチド位置１〜１９に対応した。グル
コセレブロシダーゼイントロン２のヌクレオチド位置２
５１〜２７０に対応する3'センスオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、配列：5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡ
ＧＡＡＴＣＧ−3'（配列番号：４）を有する。

【００６１】挿入変異の存在又は不存在を決定するため
のＰＣＲ増幅を、それぞれ0.5 mMのdATP、dGTP、dCTP及
びdTTP、5 % DMSO、300 ngの上記各オリゴヌクレオチド
プライマー、及び3 U Taq DNAポリメラーゼ（ベーリン
ガー・マンハイム）を含む1XPCRバッファー（20X PCR
バッファーは、最終濃度において、670 μl の2 M Tris
-HCl(pH 8.8)、166 μl の2 M 硫酸アンモニウム、134
μl の 1 M MgCl₂、42.5μl の牛血清アルブミンの80
mg/ml 溶液、及び2 mlまでの水からなる）において、実
施例１で調製したゲノム DNA、0.5 μｇにおいて行っ
た。 PCRの２８回の増幅周期を実施例２に記載されるよ
うにして行って、グルコセレブロシダーゼ遺伝子のエク
ソン２からイントロン２の部分に伸びる増幅ゲノム DNA
生産物（エクソン２／イントロン２と言う）を形成し
た。各増幅周期は、９２℃で３０秒の変性、５９℃で３
０秒のアニール、及び７２℃で４０秒の延長を含んでい
た。

【００６２】増幅グルコセレブロシダーゼエクソン２／
イントロン２生産物の１５μl を、1Xニュー・イングラ
ンド・バイオラブズのバッファー番号２（ニュー・イン
グランド・バイオラブズ）及び 20 U Hph I制限エンド
ヌクレアーゼとともに、50μl 消化系において、６０℃
で1.5 時間維持した。2.5 容積のエタノールを混合し、
次いで冷却した後、析出物を乾燥し、１５μl ゲル負荷
染色バッファーで再溶解し、１２％のアクリルアミドゲ
ル上で電気泳動を行った。グルコセレブロシダーゼイン
トロン２にＧヌクレオチドの点変異を有する PCR増幅ゲ
ノム DNAエクソン２／イントロン２生産物を開裂して、
２４１及び１１７bpの２つのフラグメントを形成した。
変異対立遺伝子の生成 PCR生産物は、配列番号：２に示
される5'から3'の方向で記載した場合、２５８bpを含む
連続ヌクレオチド、列を含んでいた。通常の対立遺伝子
は、１４１、１１７及び１００bpの３つのフラグメント
を形成する２つの位置で開裂した。従って、実施例１で
記載した遺伝子型を有するヘテロ対合患者からのゲノム
DNAの PCR増幅及び Hph Iによる制限消化によって、グ
ルコセレブロシダーゼイントロン２のヌクレオチド位置
１での点変異の存在が確認された。

【００６３】実施例４ IVS2+1点変異を含む PCR増幅ゲノム DNAの調製及び対立
遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンによる検出 グルコセレブロシダーゼイントロン２のヌクレオチド位
置１における点変異を、その変異を含む PCR増幅ゲノム
DNAをその領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイゼーションすることによって
検出する別の方法によって決定した。オリゴヌクレオチ
ド特異的プローブとのハイブリダイゼーションのための
点変異を有するイントロン２領域の増幅のために、 PCR
増幅を、以下のプライマーのそれぞれ１８０ngにより実
施例３に本質的に記載したようにして行った。5'アンチ
センスオリゴヌクレオチドプライマーは、エクソン２の
ヌクレオチド位置１７及び１９において疑似遺伝子とミ
スマッチし、配列：5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣ
ＴＴＴＧＡ−3'（配列番号：３）を有する。5'プライマ
ーは、グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン２のヌク
レオチド位置１〜１９に対応した。3'センスオリゴヌク
レオチドプライマーは、イントロン２のヌクレオチド位
置１の領域3'（nt２５１〜２７０）に対応し、配列：5'
−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧ−3'（配
列番号：４）に対応した。エクソン２から始まりイント
ロン２の部分まで伸びる生成 PCR生産物（エクソン２／
イントロン２）は、配列番号：２に示される式によって
示される5'から3'の方向で３５８bpのヌクレオチド配列
を含んでいた。

【００６４】PCR増幅の後、増幅グルコセレブロシダー
ゼエクソン２／イントロン２ DNA生産物の２μl をニト
ロセルロースの別々のシート上にスポットした。このス
ポットした増幅 DNAを乾燥した後、ニトロセルロースを
２分間0.5 N NaOHで処理し、２分間1 M Tris-HCl(pH 7.
5)で処理し、次いで２分間、1.5 N NaClを含む0.5 MTri
s-HCl (pH 7.5) で処理して、 DNAを変性し、次いで中
和した。生成したフィルターを８０℃で１時間真空中で
ベークし、6X SSC (1X＝0.15 M NaCl 、0.15 Mクエン酸
ナトリウム）、5Xデンハート(Denhardt)溶液(5X ＝0.1
% ポリビニルピロリドン、0.1 % フィコール、及び0.1
% 牛血清アルブミン）、5 mM燐酸ナトリウムバッファー
(pH 7.0)、0.5 mg/ml 鮭精巣 DNA及び1 % SDS からなる
予備ハイブリダイゼーション溶液で４２℃で少なくとも
２０分間予備ハイブリタイズした。予備ハイブリダイゼ
ーション後、ニトロセルロースフィルターを別々に、予
備ハイブリダイゼーションバッファーで希釈した³²Ｐラ
ベルしたオリゴヌクレオチドプローブに暴露した。³²Ｐ
によるプローブのラベルは、2.5 μl の10X 濃度のキナ
ーゼバッファー(10X＝0.5 M Tris [ヒドロキシメチル]
アミノメタンシドロクロライド(Tris-HCl)(pH 7.6)、0.
1 M MgCl₂ 、50 mM ジチオトレイトール(DDT) 、1 mM
スペルミジン-HCl、及び1 mM エチレンジアミンテトラ
酢酸(EDTA))、1.1 μl の60μg/μl の所定のオリゴヌ
クレオチド、18.4μl の水、2 μl の6000 mCi/μl の
ガンマ³²Ｐ ATP( 濃度150 mCi/μl)、及び1 μl の10
U/μlポリヌクレオチドキナーゼを混合することによっ
て行った。ラベル混合物を、３７℃で２０分維持した
後、６８℃で２分間維持した。維持混合物を、次いでセ
ファデックスG50(ファルマシア社、ピスカタウェー、ニ
ュージャージー州) スピンカラムに付して、導入されな
かった³²ＰラベルATP を除去した。

【００６５】上記で調製したエクソン２／イントロン２
増幅生産物に含まれるイントロン２領域（IVS2+1）にハ
イブリダイズさせるのに使用するオリゴヌクレオチドプ
ローブは以下の表１に示される。このスクリーン及び実
施例５で使用したオリゴヌクレオチドプローブに対する
これらの配列及び対応する配列番号は、以下の表１に掲
げた。通常の遺伝子にハイブリダイズするプローブを
「Norm」と表示し、変異遺伝子にハイブリダイズするプ
ローブを「 Mut」と表示した。下線のヌクレオチドは、
変異ヌクレオチドに対応する。

【００６６】

【表１】 表１ 表示 配列番号 配列 イントロン２Norm １０ 5'−ＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧ−3' イントロン2 Mut ５ 5'−ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧ−3' エクソン２Norm １１ 5'−ＡＣＡＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＴ−3' エクソン２ Mut １２ 5'−ＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴ−3' エクソン９Norm １３ 5'−ＴＡＣＣＣＴＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＧ−3' エクソン９ Mut １４ 5'−ＴＡＣＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧ−3' エクソン10Norm １５ 5'−ＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＧ−3' エクソン10 Mut １６ 5'−ＧＡＡＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＧＣＡＧ−3'

【００６７】イントロン２通常（正常）及びイントロン
２変異をラベルしたプローブ、１０×10⁶ cpm を別々に
各フィルターと混合した。ニトロセルロースフィルター
を４２℃で一夜維持して、ハイブリダイゼーション生産
物を形成させた。イントロン２通常プローブに暴露した
ニトロセルロースフィルターを４６℃で、0.1%のSDSを
含有する6X SSCで洗浄し、イントロン２変異プローブに
暴露したフィルターを同一の溶液で、５２℃の更に緊縮
(stringent) な温度で洗浄した。このニトロセルロース
フィルターを次いで、乾燥し、ラジオオートグラフィー
に付した。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーションの結果から、イントロン２の位置１に
おけるグアニンヌクレオチドを有する増幅ゲノム DNAエ
クソン２／イントロン２生産物が、イントロン２通常プ
ローブとハイブリダイズすることが分かった。ヌクレオ
チド位置１にアデニンヌクレオチドの点変異を有するこ
れらのイントロン２生産物のみが、変異プローブとハイ
ブリダイズした。正及び負の調整を、 PCR増幅が上手く
進むか否かを決定するため、各分析に含めた。従って、
実施例１で調製した患者のゲノム DNAが、この別の方法
によって、グルコセレブロシダーゼイントロン２のヌク
レオチド位置１におけるスプライス部位での、グアニン
ヌクレオチドの代わりに置換されたアデニンヌクレオチ
ドの特異な点変異を有することを決定した。

【００６８】実施例５ ゴーシェ病患者からのゲノム DNAにおける挿入変異及び
２つの点変異の同時検出Ａ． PCR増幅ゲノム DNAの調製 グルコセレブロシダーゼエクソン２における挿入変異と
ともに、他の単一塩基点変異が、ゴーシェ病を引き起こ
すことが報告されている。ボイトラーらのClin. Chim.
Acta. 194:161-166 (1990); ジムランらのLancet ii:34
9-352 (1989);ツジイらの N. Engl. J. Med. 316:570-6
21 (1987); ツジイらの Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:2349-2352 (1988);レイナー(Reiner)らの DNA 7:107-
116 (1988);グラボースキーらの CRC Crit. Rev. Bioch
em. Mol. Biol. 25:385-414 (1990);及びグレイブズ(Gr
aves)らの DNA 7:521-528 (1988) 参照。塩基置換とも
呼ばれる最も共通の点変異は、cDNAヌクレオチド位置１
２２６に対応するグルコセレブロシダーゼ遺伝子のエク
ソン９におけるヌクレオチド位置２で起こる。この位置
において、アデニンヌクレオチドは、グアニンヌクレオ
チドによって置換されている。この変異は、臨床的に重
要なゴーシェ病を示すユダヤ人患者における病気の原因
となる対立遺伝子の約７７％を説明する。他の点変異
は、cDNAヌクレオチド位置１４４８に対応するグルコセ
レブロシダーゼ遺伝子のエクソン１０のヌクレオチド位
置６０で起こる。この変異は、ユダヤ人のゴーシェ病患
者の病原対立遺伝子の約２％を説明する。この位置で
は、チミジンヌクレオチドがシトシンヌクレオチドで置
換されている。

【００６９】グルコセレブロシダーゼ遺伝子のエクソン
２における余計なグアニンヌクレオチドの挿入変異は、
最近になって同定された。ボイトラーらの Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:10544-10547 (1991) 参照。この変
異は、ゴーシェ病に罹っているユダヤ人人口の約１３％
に存在する。挿入されたヌクレオチドは、エクソン２に
おいてcDNAのヌクレオチド位置８４に隣接しかつゲノム
配列のヌクレオチド位置５７に隣接して起こる。この変
異は、フレームのシフトを起こし、その転写によって、
停止コドンが生じ、グルコセレブロシダーゼタンパク質
の欠如に繋がる。機能性グルコセレブロシダーゼ遺伝子
と高い相同性を有するグルコセレブロシダーゼ疑似遺伝
子は、ゴーシェ病を起こす変異の検出を複雑化する。機
能性遺伝子に存在する変異を検出するために、疑似遺伝
子による汚染を生じることなく機能性遺伝子の領域を増
幅する方法が発展した。ボイトラーらのClin. Chim. Ac
ta194:161-166 (1990) 参照。最近、ゴーシェ病患者の
培養皮膚線維芽細胞から分離したmRNAからクローン化
し、配列化したcDNAが、機能性遺伝子からなる5'末端
と、疑似遺伝子からなる3'末端とを有する融合遺伝子の
存在を示した。ジムランらの J. Clin. Invest. 85:219
-222 (1990) 参照。従って、機能性及び非機能性疑似遺
伝子間のクロスオーバーが起こっていた。

【００７０】エクソン１０のヌクレオチド位置６０（cD
NA１４４８）における点変異（Ｔ→Ｃ）は、疑似遺伝子
に存在するので、集団における変異をスクリーニングす
る場合には、エクソン１０におけるその変異のような特
定の変異を含むこれらの融合遺伝子を包含する全ての遺
伝子をスクリーニングすることは有利である。もしクロ
スオーバーがエクソン１０の5'又は上流で起こる場合
は、エクソン１０における変異のヌクレオチド位置は同
一の状態で残るであろう。しかし、もし非等価なクロス
オーバーが変異の5'で十分に起これば、エクソン１０の
変異のヌクレオチド位置は変わるかもしれない。上記の
議論に基づいて、本発明の好ましい態様は、患者の病気
の重篤性と関連する変異の存在を分析する改良方法を得
るための、グルコセレブロシダーゼ遺伝子をスクリーニ
ングする容量である。通常の機能性遺伝子及びクロスオ
ーバーが起った融合遺伝子の両方における、イントロン
２（IVS2+1）、エクソン２、エクソン９及びエクソン１
０の変異の検出を達成する方法は、以下の通りである。

【００７１】ゲノム DNAを、実施例１に記載したよう
に、ゴーシェ病の患者から単離した。グルコセレブロシ
ダーゼ遺伝子の２つの別個のゲノム DNAフラグメント
を、対応する配列番号で以下に示す、表２の特定のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで増幅した。

【００７２】

【表２】 表２ 表示 配列番号 配列 エクソン２ ３ 5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ−3' イントロン2 ４ 5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧ−3' イントロン７ ８ 5'−ＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣ−3' イントロン10 ９ 5'−ＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴ−3' 第１ゲノム DNAフラグメントを、表２において、エクソ
ン２（5'アンチセンスプライマー）及びイントロン２
（3'センスプライマー）として示すオリゴヌクレオチド
プライマーで増幅した。これらのプライマーは、以下で
記載する PCR増幅において使用すると、イントロン２点
変異及びエクソン２挿入変異（cDNA８４ＧＧ）の両者を
同定（存在すれば）することのできる３５８塩基対フラ
グメントが形成した。エクソン２オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、２つのヌクレオチド位置で疑似遺伝子とミ
スマッチし、イントロン２オリゴヌクレオチドプライマ
ーは疑似遺伝子で欠失した領域に存在するので、機能性
グルコセレブロシダーゼ遺伝子のみが、エクソン２及び
イントロン２プライマー対で増幅した。

【００７３】第２ゲノム DNAフラグメントを、表２にお
いて、イントロン７（5'アンチセンスプライマー）及び
イントロン１０（3'センスプライマー）として表示され
るオリゴヌクレオチドプライマーで増幅した。これらの
プライマーは、以下で記述する PCR増幅で使用すると、
エクソン９及び１０の点変異（それぞれcDNA１２２６及
び１４４８）の両方を、もしこれらの変異が機能性遺伝
子及び融合クロスオーバー遺伝子に存在する場合に、同
定できる１３５３塩基対フラグメントを生成した。イン
トロン７オリゴヌクレオチドプライマーは、５つのヌク
レオチド位置で疑似遺伝子とミスマッチし、従って、機
能性遺伝子だけが増幅した。イントロン１０オリゴヌク
レオチドプライマーは、これとは対照的に、機能性遺伝
子及び疑似遺伝子の両者とミスマッチした。従って、イ
ントロン１０プライマーをイントロン７プライマーと組
合せて使用すると、機能性遺伝子と、機能性遺伝子及び
疑似遺伝子の２つのプライマーの領域間で起こるクロス
オーバーを有する遺伝子との両者が増幅した。上記した
生成 PCR生産物を増幅するのに使用した PCR条件は、実
施例３に記載したものと同様であった。但し、各オリゴ
ヌクレオチドプライマー、１８０ng及びTaq DNAポリメ
ラーゼ、０．７５Ｕを使用した。実施例３に示すよう
に、２８回の PCR周期を行った。生成 PCR生産物を、実
施例４に記載されるように、ニトロセルロースフィルタ
ーにブロットし、以下に記載するように、ラベルした対
立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズした。

【００７４】Ｂ．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーションによる変異の検出 上記実施例５Ａで調製した、ニトロセルロースフィルタ
ー上に固定した PCR生産物を、実施例４に記載するよう
に、ハイブリダイゼーション条件で処理した。イントロ
ン２、エクソン２、エクソン９、及びエクソン１０の変
異を検出するのに使用したオリゴヌクレオチドプローブ
を、実施例４の表１に示す。正規及び変異プローブの両
者を使用して、正規及び変異遺伝子型を有する対立遺伝
子を特定した。正規のプローブは、そのプローブの領域
で常態である対立遺伝子とのみハイブリダイズし、一
方、変異プローブは、特異的変異を有するこれらの対立
遺伝子とのみハイブリダイズした。ゴーシェ病患者から
のゲノム DNAに対して上記のようにして実施した PCR増
幅の結果から、１回の PCR反応から同時に４つの全ての
変異を増幅でき、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
プローブにより検出できたことが分かる。機能性グルコ
セレブロシダーゼ遺伝子並びに、機能性グルコセレブロ
シダーゼ遺伝子と疑似遺伝子との間におけるクロスオー
バーが２つのオリゴヌクレオチドプライマー対（イント
ロン７及びイントロン１０）間で起こる、融合遺伝子に
おいて存在する変異を、このプロトコールを使用して直
ちに検出できた。従って、変異の存在とこの病気の重症
性との相関は、この好ましい１工程の PCR増幅によって
更に直ちに確率される。

【００７５】実施例６ ゴーシェ病原因対立遺伝子の頻度を決定するための DNA
に基づく分析の利点 病気原因遺伝子が集団において多形性レベルで存在する
場合には、その遺伝子は、特にヘテロ接合において、あ
る選択的利点を提供すると考えることができる。かかる
選択的利点か存在する場合には、２以上の変異は、エク
ソン２挿入変異及びエクソン９点変異がユダヤ人の集団
において高頻度で発現するようなゴーシェ病で見られる
ように、しばしば高い集団頻度を生じさせる。大多数の
変異は、それらが非関連的な個人で繰り返し見出される
と言う点で、「公的(public)」であると見ることができ
るが、新しい「私的(private) 」変異の基本頻度(basel
ine frequency)が起こるであろう。従って、病気の診断
及び／又はヘテロ接合のスクリーニングは、特異的で優
勢な変異の検出に基づく場合には、１００％正確である
ことはない。どの病気の対立遺伝子がその集団に存在す
るのかを知り、及びその頻度を評価するには、多数の対
立遺伝子を調査することが必要である。ここで記載する
本発明は、そのような群をスクリーニングし、新しい
「私的」変異を同定し、更に公的及び私的変異の両者の
相対的な頻度を特定するための合理的な方法を構成す
る。

【００７６】ゴーシェ病患者１００人からの DNA試料
（その内、１９７の対立遺伝子は、ユダヤ人起源のもの
である）をスクリーニングすることによって、イントロ
ン２における新しい変異を発見した。ゴーシェ病を起こ
す幾つかの他の変異と同様に、通常グアニンヌクレオチ
ドの占める位置におけるアデニンヌクレオチドのイント
ロン２変異は、通常の疑似遺伝子配列を示す。従って、
通常のグルコセレブロシダーゼ遺伝子及び疑似遺伝子の
両者は、イントロン２のヌクレオチド位置１の5'スプラ
イスコンセンサス部位に起こる変異の結果として、エク
ソン２を欠失する。IVS2+1変異は、ゴーシェ病の臨床段
階において、ユダヤ人患者の約２．５４％に存在するこ
とが決定された。イントロン２、エクソン２、エクソン
９及びエクソン１０の４つの変異についてスクリーニン
グすることによって、この病気の原因となる対立遺伝子
の９５％以上が、ゴーシェ病に罹っている９７人のユダ
ヤ人及び３人の半ユダヤ人において DNAレベルで同定さ
れた。エクソン９（cDNA１２２６Ｇ）における変異は、
必ずしも全てのヘテロ接合が医学的に注目されるわけで
はないので、患者集団において過少評価されたために、
DNA分析を使用して４つの変異についてアシュケナジ(A
shkenazi) 集団をスクリーニングすると、全てのヘテロ
接合の約９８％を検出した。グルコセレブロシダーゼ遺
伝子における変異は、エクソン２及びイントロン２の変
異が、5'末端で起こり、エクソン９及びエクソン１０変
異が3'末端で起こるという２つの群で存在する。変異の
群分析により、全ての変異のスクリーニングを、実施例
５で記載した４つの別個のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用して、遺伝子の単なる２つのセグメントを都合
のよい１つの工程において PCR増幅することによって行
うことができる。従って、本発明は、グルコセレブロシ
ダーゼ遺伝子複合体における、エクソン２、エクソン９
及びエクソン１０とともに、イントロン２における新規
な点変異を同時に検出する方法を提供する。

【００７７】特定の実施態様及び実施例を含み、上記明
細書は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲
を制限するものではない。多くの他の変更及び修正を、
本発明の本来の精神及び範囲を逸脱することなく、実施
することができる。

【００７８】配 列 表 (1) 一般情報 (i) 出願人：アーネスト・ボイトラー (ii) 発明の名称：ゴーシェ病：グルコセレブロシダー
ゼ遺伝子のイントロン２における新規変異の検出 (iii) 配列の数：２８ (iv) 連絡住所： (A) 連絡先：スクリプス・リサーチ・インスティテュー
ト、パテント・カウンセル (B) 通り：１０６６６ ノース・トレイ・パインズ・ロ
ード、ＴＰＣ ８ (C) 都市：ラ・ホラ (D) 州：カリフォルニア州 (E) 国：アメリカ合衆国 (F) ジップコード：９２０３７ (v) コンピューター読取り可能形式 (A) 媒体の型：フロッピーディスク (B) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性 (C) 操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (D) ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.０，バ
ージョン＃1.２５ (vi) 最新出願データ： (A) 出願番号： (B) 出願日：１９９２年２月２４日 (C) 分類： (vii) 先の出願のデータ： (A) 出願番号： (B) 出願日： (viii)代理人／エージェント情報： (A) 名前：ダグラス・エイ・ビンガム (B) 登録番号：３２，４５７ (C) 参照／ドケット番号：ＳＣＲ０６７０Ｐ (iv) 通信情報： (A) 電話：６１９−５５４−２９３７ (B) テレックス：６１９−５５４−６３１２

【００７９】(2) 配列番号：１ (i) 配列の特徴： (A) 長さ：７６２０ 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 356..611 (C) 他の情報：／生産物−“エクソン１”

【００８０】(ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 612..979 (D) 他の情報：／機能−“イントロン１” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 980..1067 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン２” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 1068..1619 (D) 他の情報：／機能−“イントロン２” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 1620..1811 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン３” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 1812..1934 (D) 他の情報：／機能−“イントロン３” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 1935..2081 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン４” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 2082..3046 (D) 他の情報：／機能−“イントロン４” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 3047..3180（Ｄ） 他の情報：／生産物−
“エクソン５”

【００８１】(ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 3181..3390 (D) 他の情報：／機能−“イントロン５” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 3391..3563 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン６” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 3564..4116 (D) 他の情報：／機能−“イントロン６” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 4117..4354 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン７” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 4355..5227 (D) 他の情報：／機能−“イントロン７” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 5228..5452 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン８” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 5453..5852 (D) 他の情報：／機能−“イントロン８”

【００８２】(ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 5853..6016 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン９” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 6017..6385 (D) 他の情報：／機能−“イントロン９” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 6386..6502 (D) 他の情報：／生産物−“エクソン１０” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置： 6503..6596 (D) 他の情報：／機能−“イントロン１０” (ix)配列の特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置： 6597..7245

【００８３】(xi)配列番号：１ （表３に示す通り。）

【００８４】

【表３】

【００８５】

【表４】

【００８６】

【表５】

【００８７】

【表６】

【００８８】

【表７】

【００８９】

【表８】

【００９０】(2) 配列番号：２の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ： ３５８塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 二本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： cDNA (iii) ハイポセティカル配列： NO (iv) アンチセンス： NO (xi)配列番号：２ （表４に示す通り。）

【００９１】

【表９】

【００９２】(2）配列番号：３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １９ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ３ GAATGTCCCA AGCCTTTGA

【００９３】(2) 配列番号：４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ４ AAGCTGAAGC AAGAGAATCG (2) 配列番号：5 の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ５ GGCATCAGAT GAGTGAG

【００９４】(2) 配列番号：６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １３ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 二本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ６ GGTGANNNNN NNN

【００９５】(2) 配列番号：７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １２ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 二本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ７ CCTCTNNNNN NN (2) 配列番号：８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ８ CAAGGTCCAG GATCAGTTGC

【００９６】(2) 配列番号：９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ９ AACGCTGTCT TCAGCCCACT (2) 配列番号：１０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １０ GGCATCAGGT GAGTGAG

【００９７】(2) 配列番号：１１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １１ ACAGGATTGC TTCTACT (2) 配列番号：１２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １８ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １２ ACAGGATTGG CTTCTACT

【００９８】(2) 配列番号：１３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １３ TACCCTAGAA CCTCCTG

【００９９】(2) 配列番号：１４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １４ TACCCTAGAG CCTCCTG

【０１００】(2) 配列番号：１５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １５ GAACGACCTG GACGCAG (2) 配列番号：１６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： １７ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １６ GAACGACCCG GACGCAG

【０１０１】(2) 配列番号：１７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １７ TCAAGACCAA TGGAGCGGTG (2) 配列番号：１８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １８ CTAGGTCACG GGCAATGAAG

【０１０２】(2) 配列番号：１９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： １９ ACTGTCGACA AAGTTACGCA

【０１０３】(2) 配列番号：２０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２０ CTCTGGAACC CCTGTGGTCT

【０１０４】(2) 配列番号：２１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２１ GGGTCCTCCT TCGGGGTTCA (2) 配列番号：２２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２２ CTCTTCATCT AATGACCCTG

【０１０５】(2) 配列番号：２３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２３ CTAGGTCACG GGCAATGAAG (2) 配列番号：２４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２４ GCTCCACGGG CCCAGTTCTG

【０１０６】(2) 配列番号：２５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２５ CATCATCCGG GTACCCATGG (2) 配列番号：２６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２６ ATGGGGGCTG GGGGGACACT

【０１０７】(2) 配列番号：２７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２７ ACCCCTGAAC ATCAGCGAGA

【０１０８】(2) 配列番号：２８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ： ２０ 塩基対 (B) 型 ： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) ハイポセティカル配列： ＮＯ (iv) アンチセンス： ＮＯ (xi) 配列番号： ２８ GCCCAGTGCC TCCTTGAGTA

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロ
   ン２のヌクレオチド位置１において、グアニンヌクレオ
   チドがアデニンヌクレオチドに置換していることを特徴
   とするグルコセレブロシダーゼ遺伝子の点変異の存在に
   ついて、ヒトから単離した核酸試料を分析することを含
   む、ヒト遺伝子スクリーニング方法。
2. 【請求項２】 グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン
   ２のヌクレオチド位置５７に隣接してグアニンヌクレオ
   チドが挿入されていることを特徴とするグルコセレブロ
   シダーゼ遺伝子挿入変異の存在について、ヒトから単離
   した核酸試料を更に分析することを含む、請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン９
   のヌクレオチド位置２におけるアデニンヌクレオチドか
   らグアニンヌクレオチドへの変化を特徴とするグルコセ
   レブロシダーゼ遺伝子点変異の存在について、ヒトから
   単離した核酸試料を分析することを更に含む、請求項１
   記載の方法。
4. 【請求項４】 グルコセレブロシダーゼ遺伝子エクソン
   １０のヌクレオチド位置６０におけるチミンヌクレオチ
   ドからシトシンヌクレオチドへの変化を特徴とするグル
   コセレブロシダーゼ遺伝子点変異の存在について、ヒト
   から単離したグルコセレブロシダーゼ遺伝子試料を分析
   することを更に含む、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ヒト遺伝子スクリーニング方法であっ
   て、以下の工程： （１） 増幅条件下で、ヒト由来のゲノム DNAの試料
   を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理
   して、グルコセレブロシダーゼ遺伝子イントロン２のヌ
   クレオチド位置１を含むヒトゲノム DNAの領域を増幅
   し、前記処理によって前記領域を含む増幅生産物が得ら
   れ、そして（２） 前記イントロンのヌクレオチド位置
   １におけるアデニン（Ａ）ヌクレオチドの点変異の存在
   について、工程（１）の前記増幅生産物を分析する、を
   含む方法。
6. 【請求項６】 前記領域が、配列番号：２によって示さ
   れるヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む、請
   求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 前記領域が、配列番号：２によって示さ
   れるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項５記載
   の方法。
8. 【請求項８】 前記分析が、ハイブリダイゼーション条
   件下で、工程（１）の前記増幅生産物を、前記点変異に
   特異的なオリゴヌクレオチドプローブで処理し、次い
   で、ハイブリダイゼーション生産物の形成を検出するこ
   とを含む、請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドプローブが、
   式：5'−ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧ−3'（配
   列番号：５）によって示されるヌクレオチド配列を含
   む、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記ＰＣＲプライマー対が、前記変異
    が存在しない場合には、予め選定された制限酵素部位を
    含む増幅生産物を製造し、工程（２）の前記分析が、制
    限条件下で、工程（１）の前記増幅生産物を、前記部位
    を認識する制限酵素で処理し、そして、制限生産物の存
    在を検出することを含む、請求項５記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ＰＣＲプライマー対が、(i) ヒ
    トゲノム DNA領域内の、エクソン２のヌクレオチド８８
    の5'位置に対応するアンチセンス鎖とハイブリダイズす
    る、第１のプライマー、及び(ii) 前記イントロン２の
    ヌクレオチド１の3'位置のセンス鎖とハイブリダイズす
    る第２のプライマー、を含む、請求項５記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記第１のプライマー(i) が、式：5'
    −ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ−3'（配列
    番号：３）で表される、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記第２のプライマー(ii)が、式：5'
    −ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧ−3'（配
    列番号：４）で表される、請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記制限酵素が、Hph I であり、前記
    予め選定された制限酵素部位が、次式： 5'−ＧＧＴＧＡ(N)₈−3' （配列番号：６） 3'−ＣＣＡＣＴ(N)₇−5' （配列番号：７） （但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴであり得る。）で表さ
    れる、請求項１０記載の方法。
15. 【請求項１５】 グルコセレブロシダーゼ遺伝子イント
    ロン２のヌクレオチド位置１における、グアニン（Ｇ）
    ヌクレオチドに対するアデニン（Ａ）ヌクレオチドによ
    る置換を含む点変異を含有するゴーシェ病対立遺伝子を
    検出する方法であって、以下の工程： （１）ＰＣＲバッファーにおいて、ヒト由来ゲノムＤＮ
    Ａの試料と、５’及び３’プライマーによって規定され
    るグルコセレプロシダーゼ遺伝子特異的ＰＣＲプライマ
    ー対とを結合して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）混合
    物を形成し、前記５’プライマーは、グルコセレプロシ
    ダーゼ遺伝子エクソン２のヌクレオチド位置１〜８８に
    対応するヒトゲノムＤＮＡの領域内でプライムし、前記
    ３’プライマーは、前記グルコセレブロシダーゼ遺伝子
    イントロン２のヌクレオチド位置２〜２７０に対応する
    ヒトゲノムＤＮＡの領域内でプライムする、 （２）前記ＰＣＲ混合物を複数のＰＣＲ熱サイクルに付
    して、グルコセレブロシダーゼ遺伝子増幅生産物を製造
    し、 （３）ハイブリダイゼーション条件下で、前記増幅生産
    物を、前記変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
    で処理し、そして （４）工程（３）で生産したハイブリダイゼーション生
    産物を検出する、 ことを含む方法。
16. 【請求項１６】 工程（１）の前記5'プライマーが、
    式：5'−ＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡ−3'
    （配列番号：３）で表される、請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 工程（１）の前記3'プライマーが、
    式：5'−ＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧ−
    3'（配列番号：４）で表される、請求項１５記載の方
    法。
18. 【請求項１８】 工程（３）の前記プローブが、式：5'
    −ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧ−3'（配列番
    号：５）によって示される、請求項１５記載の方法。