JP2596466B2

JP2596466B2 - ダニの主要アレルゲンの還伝情報を有するｄｎａおよび該アレルゲンの製造方法

Info

Publication number: JP2596466B2
Application number: JP2050848A
Authority: JP
Inventors: 敏文結城; 康奥村; 洋志山川
Original assignee: Asahi Breweries Ltd; Torii Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd; Torii Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-03-03
Filing date: 1990-03-03
Publication date: 1997-04-02
Anticipated expiration: 2012-04-02
Also published as: US5876722A; AU640450B2; US5798099A; JPH03254683A; CA2037333A1; GR3034065T3; US5958415A; ATE192488T1; EP0445971B1; ES2144994T3; DE69132152D1; AU7127791A; DE69132152T2; CA2037333C; DK0445971T3; EP0445971A1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ダニの主要アレルゲンの遺伝的情報DNA、
このDNAに関連した複製ベクター、プラスミド、宿主細
胞、および該DNAを用いたダニ主要アレルゲンDerf IIの
製造方法に関する。

（従来の技術）アレルギー疾患の多くは、その疾患の原因抗原に感作
されることにより、血清および組織でアレルゲンに特異
的なIgE抗体（レアギン抗体）が産生され、再びその抗
原に暴露されることにより、各組織上で抗原とIgE抗体
が抗原抗体反応を起こし、その際、生じる種々の症状に
よるものと考えられている。

このアレルギー疾患を根本的に治療する方法として、
滅感作療法がある。この方法は、その原因抗原を少量ず
つ、また、症状に応じて投与量を徐々に増量しながら、
反復投与する方法である。この療法により遮断抗体産
生、IgE抗体産生抑制、マスト細胞から遊離するヒスタ
ミン量の低下が起こり、治療効果が得られると考えられ
ている。

一方、気管支喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎など
のアレルギー性疾患は、室内塵中に生息しているダニに
対するアレルギーが主な原因であることが明らかになっ
ており、既にいくつかのダニ主要アレルゲンタンパク質
が同定されている（プラッツミルズ（Platts−Mills）
ら、ザ・ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリ
ニカル・イムノロジー（J.Allergy Clin.Immunol.）、8
0巻、755頁、1987年）。従って、この主要アレルゲンを
用いた上記アレルギー疾患の滅巻作療法は、きわめて有
効であるが、多量の精製アレルゲンを必要とする。しか
し、これまで精製ダニ主要アレルゲンを多量に調製する
ことは、実質的に不可能であった。

（発明が解決しようとする課題）本発明者らは、これらの問題は、ヒョウヒダニ（Derm
atophagoides farinae）虫体からmRNAを調製し、それに
対応するcDNA遺伝子ライブラリーを作成し、探索するこ
と、およびコロニーイムノアッセイ法でダニ主要アレル
ゲンタンパク質Derf IIを発現しているクローンを単離
し、当該クローンから目的とする遺伝子を含むDNA断片
を単離することにより解決できることを見出した。

それゆえ、本発明の目的は、遺伝子工学を使ってダニ
主要アレルゲンタンパク質をコードするDNA配列を得る
ことであり、かつそのDNAがコードしているダニ主要ア
レルゲンを製造する方法を提供することである。

（課題を解決するための手段）本発明は、ヒョウヒダニ主要アレルゲン（Derf II）
の生化学的および免疫学的性質を有するタンパク質の遺
伝的情報の少なくとも一部分をコードするDNAである。

ダニ主要アレルゲンDerf IIをコードする遺伝子を得
るには、ダニを動物飼育用飼料（たとえば、実験動物飼
育用配合飼料、家畜飼育用飼料、愛玩動物飼育用飼料な
ど）、またはその組成物で人工的に飼育し、特開昭49−
69820号公報に開示されている方法等を使用して、ダニ
虫体を単離することができる。得られたダニ虫体からmR
NAを得るには、チャーグウィン（Chirgwin J.M.）らの
方法などが利用できる（バイオケミストリー（Biochemi
stry）、18巻、5294〜5299頁、1979年）。さらには、市
販のRNA抽出キット（アマシャム社製、商品名、RPN.126
4）を使用することができる。一般に真核性mRNA群は、
その３′末端にポリ（Ａ）テールを持つことから、オリ
ゴ（dT）セルロースを用いたアフィニテイクロマトグラ
フィーで簡便に精製できる（オーフレー（Auffray C.）
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Eur.J.Biochem.）、107巻、303〜304頁、1980
年）。さらには、市販のmRNA精製キット（ファルマシア
社製、商品名、mRNA精製キット27−9258−01）の使用が
便利である。

精製mRNAは逆転写酵素およびプライマーを用いて行う
cDNA第一鎖の合成テンプレートとして用いる。用いるプ
ライマーはオリゴ（dT）または合成プライマーが使用で
きる。cDNAの第二鎖は種々の従来法によって合成できる
（ハイン（Huynh,T.V.）ら、DNAクローニング、１巻、
２章、49〜78頁、1985年、グローバー（D.M.Glover）
編）。さらには、市販のcDNA作成キット（アマシャム社
製、商品名、RPN.1256 Y）も使用できる。しかして得ら
れた２本鎖cDNAは適当なベクター、好ましくは、プラス
ミドpUEX1（ブレッサン（Bressan G.）、スタンレイ（S
tanley K.）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nuc
l.Acids Res.）、15巻、10056頁、1987年）のクローニ
ング部位に挿入することができる。２本鎖cDNAの挿入は
従来用いられてきた種々の方法を使うことが可能である
（マニアチス（Maniatis T.M.）ら、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）、1982年）。しかして得られたダニ虫体由
来のcDNA遺伝子ライブラリーは適当な宿主、特に好まし
くは大腸菌を形質転換することによって遺伝子産物を発
現させることができる。

次に、形質転換した大腸菌の中から目的とするダニ主
要抗原Derf IIを生産しているコロニーを検索しなけれ
ばならない。このためには種々の方法が使用できるが、
コロニーイムノアッセイ法を用いるのが有利である。例
えばプラスミドとして、pUEX1を用いた場合は以下に記
載した方法で検索できる。

形質転換した大腸菌をＬブロス寒天培地（１％バクト
トリプトン、0.5％イーストエキストラクト、0.5％塩化
ナトリウム、1.5％バクトアガー、50μg/mlアンピシリ
ン、pH7.4）上に生育させた後、生じたコロニーをニト
ロセルロースフィルター（アマシャム社製、ハイボンド
Ｃ）などの上へレプリカしてフィルター上で生育させ、
さらに外来タンパク質を生産させた後、このフィルター
をクロロホルム蒸気に暴露して溶菌させ、産生している
タンパク質をこのフィルター上に固定した。

挿入されたダニ虫体由来DNAはβ−ガラクトシダーゼ
をコードしているDNAの下流に連結されており、それに
対応するタンパク質はβ−ガラクトシダーゼとの融合タ
ンパク質の形で生産されていた。ダニ主要アレルゲンで
あるDerf IIに対する抗体をウサギを用いて調製してお
き、その抗体を用いて目的とするDerf IIタンパク質を
このフィルター上で検出し、陽性のクローンを２個得る
ことができた。保存しておいた元の寒天プレートから対
応する大腸菌コロニーを選択し、Ｌブロス液体培地（Ｌ
ブロス寒天培地から寒天を除いたもの）へ接種した。30
℃で約18時間振盪培養する。培養液から菌体を集め、常
法のアルカリ抽出によってプラスミドを回収した。続い
て得られたプラスミドを種々の制限酵素で消化した後、
あるいは消化せずにアガロースゲル電気泳動に供し、挿
入されているダニ虫体由来のDNAを分析した。得られた
二つのプラスミドpFL1およびpFL11にはそれぞれ約500ベ
ースペアのDNAが挿入されていた。

一方、大腸菌を、得られた二つのプラスミドおよびダ
ニ由来DNAが挿入されていないベクターpUEX1で形質転換
し、それぞれ前述したＬブロス培地に接種した。30℃で
約３時間振盪培養した後、培養温度を42℃に上げて、さ
らに、約３時間培養を継続した。菌体を集めて緩衝液
（トリス塩酸緩衝液、10mM、pH7）にて洗浄したのち、
マルストン（Marston）およびキャロル（Carroll）らの
方法（DNAクローニング（DNA Cloning）、IRLプレス、
３巻、４章、1985年）で融合タンパク質を抽出した。抽
出したタンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供した。電気泳動した後、ウエスタンブロッティ
ング法（トゥビン（Towbin,H.）ら、プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.,76巻、4350頁、1979
年）で産生されているタンパク質をセルロースフィルタ
ーに転写した。タンパク質が転写されたフィルターをウ
シ血清アルブミンでブロッキングし、ウサギで作成して
おいた抗Derf II抗体を反応させた。その後に緩衝液
（トリス塩酸緩衝液、10mM、pH7.4、塩化ナトリウム150
mM、Tween20、0.05％）で洗浄した後、そのフィルター
をさらにパーオキシダーゼで標識された抗ウサギIgG抗
体（アマシャム社製）で反応させた。再び、同じ緩衝液
で洗浄し、反応しないで残存しているパーオキシダーゼ
標識抗体を除去した。さらに、このフィルターを過酸化
水素および色素４−クロロ−１−ナフトールを用いて反
応させた。

その結果、プラスミドpFL1およびpFL11で形質転換し
た大腸菌から得られた上清中には、分子量約13万のタン
パク質のバンドが陽性反応を示したが、DNAが挿入され
ていないベクターで形質転換した大腸菌からの上清中に
は陽性を示すタンパク質は検出されなかった。この結
果、プラスミドpFL1およびpFL11中にはダニ主要抗原で
あるDerf IIをコードしているDNAが存在し、かつその遺
伝子はβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として
大腸菌中で発現していることが明らかとなった。

前述したプラスミドpFL1およびpFL11に挿入されてい
るダニ由来DNA断片は、適当な制限酵素、好ましくは、B
am HIによる完全分解、またはNco Iによる部分分解で切
り出すことができる。切り出されたDNA断片は、ダイデ
オキシ法（サンガー（Sanger F.）ら、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、162
巻、729〜773頁、1982年）などを用いてその塩基配列を
決定できる。しかして、決定されたダニ主要アレルゲン
タンパク質をコードしているDNA配列を式ＩおよびIIに
示した。また、式ＩおよびIIにはその配列に対応するア
ミノ酸も示してある。

式I: 式II: 尚、式中の下線部分は下記の表Ｉに示したアミノ酸配
列と一致する配列を示す。＊＊＊は終止コドンを示す。

式ＩおよびIIに示した塩基配列が本来のダニ主要アレ
ルゲンであるDerf IIをコードしているものであること
を確認するために、Derf IIタンパク質を精製し、その
アミノ酸配列を決定して、式ＩおよびIIに示したアミノ
酸配列とを比較した。アレルゲンタンパク質Derf IIの
精製は従来から用いられている種々の精製法（生科学実
験講座１巻、タンパク質の化学、山川民夫、今堀和友
編、東京化学同人）を組み合わせて使用できるが、逆相
高速液体クロマトグラフィーを用いる方法が有利であ
る。得られた精製アレルゲンDerf IIをペプチドシーケ
ンサー471A型（アプライドバイオシステムズ社製）に供
して、そのアミノ酸配列を決定した。その結果を表Ｉに
示した。これらの結果を併せて、本発明者らが単離した
その配列を決定したDNA配列は、確かにダニ主要アレル
ゲンであるDerf IIをコードしていることが確かめられ
た。

（分析No.8、21および27のアミノ酸はペプチドシーケン
サー471A型にて分析できなかったのでＸと表現した。）本DNA断片およびその一部は適当なベクター、例えばY
Ep13（ブローチ（Broach J.R.）ら、ジーン（Gene）,8
巻、121〜133頁、1979年）などを用いて、酵母中で発現
させることができる。本発明に従ったダニDerf II遺伝
子を伴う発現カセットを持つ酵母ベクターを用い、適当
な酵母細胞を形質転換することができる。この目的のた
め本発明に従ったDNA配列は、大腸菌プロモーターでは
なく、強力な真核性プロモーター、例えばΔP8（大竹
ら、アグリカルチャラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agric.Biol.Chem.）,52巻、2753〜2762
頁、1988年）などの制御下におかなければならない。

遺伝子工学により調製した、本発明に従うダニDerf I
Iタンパク質、その一部およびそれらが他のタンパク質
と融合した形のもので、生化学的、免疫学的にダニ主要
アレルゲンDerf IIの性質を有するタンパク質は、ダニ
に起因する各種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に
使用できる。

（発明の効果）本発明によれば、遺伝子工学を使ってヒョウヒダニ主
要アレルゲンタンパク質Derf IIを発現しているクロー
ンを単離し、当該クローンから目的とする遺伝子を含む
DNA断片を単離することができた。

それゆえ、このDNAがコードしているダニ主要アレル
ゲンを発現、生産してアレルゲンタンパク質を提供する
ことができ、このタンパク質を用いて各種のアレルギー
疾患の治療あるいは診断に使用することができる。

（実施例）次に、実施例に基づき本発明を一層具体的に説明す
る。

実施例１ cDNA遺伝子ライブラリーの作成温度25℃、湿度75％の条件下、実験動物飼育用飼料中
で約30日間人工飼育したダニを、飽和食塩水で餌と分離
し、吸引濾過してダニ虫体のみを調製した（特開昭49−
69820号公報）。得られた虫体（約5g）を液体窒素につ
けて、急速凍結させ、それから総RNAをRNA抽出キット
（アマシャム社製RPN.1264）を用いて抽出精製した。そ
の総RNAからmRNAをオリゴ−dTカラム（ファルマシア社
製、商品名、mRNA精製キット27−9258−01）を用いて精
製し、約３μｇのmRNAが得られた。その全量を用いてcD
NAを合成したがその合成には、cDNA合成システム・プラ
スを用いた（アマシャム社製、商品名、RPN.1256 Y）。
RNA抽出、mRNA精製およびcDNA合成は、すべてキットに
添付されているマニュアルに従って実施した。

発現ベクターは、ブレッサン（Bressan）等によって
報告されているpUEX1（ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ（Nucl.Acids Res.）15巻、10056頁、1987年）を用
いた。この発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子の下流にcDNA断片を挿入し、目的遺伝子を融合蛋白質
として発現できる。またその発現量は上流のラムダ
（λ）P_Rプロモーターにより決定され、培養温度を42℃
へシフトすると大きく増大させることができる。クロー
ニング手順は、ハイメール（Haymerle）等の方法（ヌク
レイック・アシッド・リサーチ（Nucl.Acids Res.）14
巻、8615〜8624頁、1986年）に従い、試薬等は、cDNAク
ローニングシステムpUEX1（アマシャム社製、商品名、R
PN.1282）を用いた。このとき形質転換に用いる細胞と
しては、大腸菌MC1061（遺伝子型araD139,Δ［ara,le
u］7697,ΔlacX74,galU^-,galK^-,hsr^-,hsm⁺,strA,mcrA^-,
mcrB^-）を用い、コンピテント・セルの調製はハナハン
（Hanahan）の方法（DNAクローニング（DNA cloning,A
practical approach）,Ed.Glover,D.,IRL Press,1巻、1
09頁、1985年）に従った。

実施例２ pFL1およびpFL11の検出得られた形質転換株からウサギ由来の抗Derf II抗体
と反応するクローンを、コロニーイムノアッセイ法で検
出した。形質転換株は、アンピシリンを50μg/ml含むＬ
ブロス寒天培地（１％トリプトン（tryptone、ディフコ
社製）、0.5％イースト・イクストラクト（Yeast Extra
ct、ディフコ社製）、0.5％塩化ナトリウム、1.5％寒
天）上に散布し、30℃でコロニーの直径が1mm程度にな
るように培養した。ニトロセルロースフィルター（ハイ
ボンド−Ｃ、アマシャム社製、商品名、RPN.1782 C）を
菌がずれないように注意深くコロニーの上に重ね、菌体
を写し取った。写し取ったプレートはもう一度、30℃で
培養した。

一方、コロニーを転写したニトロセルロースフィルタ
ーは、新しいＬブロス寒天プレートにコロニーの面を上
側にして置き、42℃で２時間培養した。タンク中にクロ
ロホルムを充満させ、培養後のニトロセルロースフィル
ターをその中に釣り下げ、約25分間、クロロホルムに暴
露した。フィルターを一枚ずつペトリ皿にコロニー面を
下にして置き、4mgのリゾチームと100μｇのデオキシリ
ボヌクレアーゼを含むTBS緩衝液（10mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.4）、150mM塩化ナトリウム）10mlに浸し、室温
で１時間、ゆっくり振盪し、溶菌させた。20mlのTBS緩
衝液で５分間振盪する洗浄操作を４回繰り返した後、抗
体の非特異的吸着を防ぐためブロッキング操作として、
２％牛血清アルブミンを含むTBS緩衝液10mlに１時間浸
した。

一次抗体としてのウサギ由来のDerf II抗体を、0.2％
牛血清アルブミンを含むTBS緩衝液10mlで希釈（1000〜3
000倍）した溶液にフィルターを浸し１時間振盪した。T
BST緩衝液（0.05％、ツイーン20を含むTBS緩衝液）20ml
で４回洗浄して吸着しなかった一次抗体を洗い流した。

二次抗体はパーオキシダーゼ標識したウサギ抗IgG抗
体（バイオラッド社製）を用い、一次抗体の時と同様に
吸着、洗浄操作を行った。発色試薬のジアミノベンチジ
ンを0.4mg/mlの濃度でTBS緩衝液に溶解し、過酸化水素
水を最終濃度0.01％になるように添加した後、フィルタ
ーを浸し発色を行った。

この操作を約1,600株の形質転換株について行ったと
ころ、強いシグナルを示すコロニーが２株見出された。
それぞれ対応するコロニーを、30℃で培養している元プ
レートからＬブロス培地に植え継ぎ、培養した後、それ
ぞれからプラスミドを調製し、その解析を行った。この
ときのプラスミド抽出法、制限酵素切断、ゲル電気泳動
等の方法はマニアテス（Maniatis）等の方法（モレキュ
ラークローニング、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス、1982年）に準拠した。この様にして得た２種の
大腸菌はどれもcDNA由来と考えられる断片（約500ベー
ス・ペア）が挿入されたプラスミドを保持しており、そ
れぞれのプラスミドをpFL1およびpFL11と命名した。

実施例３ Derf II遺伝子（pFL1およびpFL11）の塩基配列決定 pFL1およびpFL11のcDNA断片の制限酵素処理、及びラ
イゲーション、及び大腸菌宿主JM105（遺伝子型 thi,r
psL,endA,sbcB15,hsdR4,Δ（lac−proAB），［Ｆ′,pro
AB,lacI⁹ΔDM15,traD36］）のトランスフォーメーショ
ンは通常の方法（マニアテス（Maniatis）等、モレキュ
ラークローニング、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス、104頁、146頁、396頁、1982年;DNAクローニン
グ、IRLプレス、１巻、６章、1985年）によって、サン
ガーの配列決定法（サイエンス（Science）214巻、1205
〜1210頁、1985年）に適したベクター（pUC118及びpUC1
19（メッシング（Messing）等、メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology）101巻、20〜78
頁、1978年））へのクローニングを行った。

この様に単離したBam HI−cDNA断片をそのまま、もし
くはNco Iを始めとする数種類の制限酵素で切断し、同
様に処理したベクターに挿入した後に、大腸菌のコンピ
テント・セルをトランスフォームした。この組換えプラ
スミドの一本鎖DNAをそれぞれ単離、精製し、サンガー
（Sanger）の方法に従い、塩基配列を決定した。この配
列は日立ソフトウエアエンジニアリング社製のコンピュ
ータプログラム（DNASIS）で処理した。

実施例４ Derf II蛋白のＮ末端アミノ酸配列決定逆相HLPCで精製したDerf II蛋白質アミノ酸配列を決
定した。配列決定は、アプライド・バイオシステムズ社
製の気相シークエンサー（モデル471A）で行った。10μ
ｇの初期量でＮ末端から45アミノ酸残基までの配列決定
が可能であった。得られたアミノ酸配列へ上記表Ｉに示
したように、期待された配列、即ちcDNAの塩基配列から
の推定アミノ酸配列と100％一致していた。

実施例５融合蛋白質の抽出と抗原性の確認 Derf IIを融合蛋白質として発現している２種の大腸
菌（それぞれpFL1およびpFL11を保持している）のう
ち、代表としてpFL1を保持する大腸菌をＬブロス培地で
液体培養して、融合蛋白の抽出及びその抗原性を確認し
た。50μg/mlアンピシリンを含むＬブロス培地（Ｌブロ
ス−Ap培地）5mlに接種し、30℃一晩振盪培養した。そ
れを本培養としてＬブロス−Ap培地１％接種した。30℃
で振盪培養し、OD₆₆₀nmが0.6になった所で、あらかじめ
54℃に温めておいたＬブロス−Ap培地を同量加え、42℃
でさらに２時間振盪培養した。培養後の菌体を回収しマ
ルストン（Marston）及びキャロル（Carroll）等の方法
（DNAクローリング、IRLプレス、３巻、４章、５章、19
85年）により融合蛋白質を抽出した。このときの菌体を
位相差顕微鏡にて観察（1,000倍）すると、融合蛋白質
が菌内にインクルージョンボディとして存在しているの
が確認された。

得られた融合蛋白質をSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動（第一化学製、垂直型カセット電気泳動システム、
ゲル濃度４〜20％）で分離し、一部はクーマシーブリリ
アントブルーで染色し、一部はウエスタン・ブロット法
（トゥビン（Towbin）等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）69巻、1409〜1412頁、1972年）を用い
て、メンブラン（イモビロン・ミリポア社製）上に転写
した後、抗Derf II抗体によって、Derf II抗原蛋白質が
発現していることを確認した。陽性反応を示した蛋白質
は分子量約13万を示し、β−ガラクトシダーゼとの融合
蛋白質として生産されていることが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，83 ［６］（1989−６）Ｐ．1055−1067

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒョウヒダニ主要アレルゲン（Derf II）
の生化学的および免疫学的性質を有するタンパク質の遺
伝情報の少なくとも一部をコードする、次の式Ｉ又はII
に従うヌクレオチド配列からなるDNA。式I: 式II:
【請求項２】請求項１に記載したDNA配列を含むことを
特徴とする、少なくとも一つの選択マーカー、および、
複製開始点の外でかつ他の基本的遺伝子領域の外に少な
くとも一つの制限酵素の認識部位を有する複製ベクタ
ー。
【請求項３】請求項１に記載したDNA配列を含む発現カ
セットを持ち、安定した形で原核性または真核性宿主を
形質転換でき、該宿主細胞中で複製可能で、かつ、その
中に含まれるDerf IIの遺伝情報が正しく転写されるプ
ラスミド。
【請求項４】請求項１に記載したDNAを含む宿主細胞。
【請求項５】請求項１に記載したDNAの発現を可能とす
る条件下で、請求項４に記載した宿主細胞を培養するこ
とを特徴とするDerf IIを製造する方法。