JP2559439B2

JP2559439B2 - プロテアーゼ、その製造および用途

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Publication number: JP2559439B2
Application number: JP62505134A
Authority: JP
Inventors: オウトルプ，ヘレ; ダムブマン，クラウス; ブランナー，スベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1986-08-14
Filing date: 1987-08-14
Publication date: 1996-12-04
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: DK158233B; DE3787009D1; DK197388D0; JPH01500642A; DK386586D0; EP0277216A1; EP0277216B1; DE3787009T2; WO1988001293A1; DK158233C; ATE92957T1; DK197388A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、秀れた酸化安定性を有する新規なアルカリ
プロテアーゼ調製品、その製法並びに洗浄剤に対する添
加剤としてその使用に関する。典型的洗浄剤は洗たく用
の洗剤組成物に関する。

背景技術適当な培地中でバシラス（Bacillus）属員を培養する
ことによって産生されるタンパク質分解酵素が、洗浄組
成物中で広く用いられている。のような商業的プロテア
ーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ALCALASE）、エスペラ
ーズ（ESPERASE）およびサビナーゼ（SAVINASE）（これ
らは登録商標である）であり、これらは全てノボインダ
ストリー社（デンマーク）から提供されている。これら
は、洗剤組成物の通常の成分、例えば金属イオン封鎖
剤、界面活性剤およびペルオキシ型の漂白剤の存在下で
十分な貯蔵安定生を示す。但し、それらは、例えば適当
にコートされた粒子内にそれらを導入することにより、
洗剤中組成物中で物理的環境から好ましくは保護されて
いることを条件とする。

しかし、可溶性酵素が溶液中の該漂白剤にさらされる
ような洗たくの過程において、可溶性は次のような意味
において重要となる。すなわち、酵素はその意図された
よごれの除去作用が完了する前に、特にペルオキシ型の
漂白剤、例えばパーカーボネート、パーボレエートおよ
びパースルフェート塩の存在下で破壊しがちである。当
業者に公知の全てのバシラス誘導プロテアーゼは、ペル
オキシ化合物の存在下50℃を超える洗たく温度で相当の
不安定性を示すので、洗浄剤組成物を用いる場合、低温
度での保持時間を含めることによって、洗たくプログラ
ムを延長することがしばしば推賞されている。

対応する遺伝子に部位特異性突然変異の手法を適用す
ることにより酸化剤に対するバシラス由来セリンプロテ
アーゼの安定生を増加する試みは、例えばヨーロッパ特
許第0130756公報より公知であり、この公報は活性部位
セリン残基の隣りのメチオニン残基をより酸化されにく
いアミノ酸残基で置換することにより安定化したズブチ
リシンを開示している。しかし、組換えDNA計画を大規
模製造プロセスに採用することに関しての障害は、周知
であり、最も頻繁なものは遺伝子材料の損失による処理
微生物の不安定さ並びに野生株又はその通常の突然変異
株から得られるものに比較して低収率であることにあ
る。

本発明者の知る限りにおいて、普通のバシラスプロテ
アーゼに比し、酸化に対し秀れた安定生を示す非処理バ
シラス由来セリンプロテーゼについての従来技術は存し
ない。

本発明の目的は、今日まで知られたバシラス由来アル
カリプロテアーゼ調製品を用いて上記の不安定生の目題
を克服することにある。本発明によれば、この目的は以
下のような驚くべき知見を得ることによって達成された
のである。すなわち、同じ新規の種として本発明で定義
されたものに属する多数のバシラス菌株はアルカリプロ
テアーゼを産生し、このプロテアーゼは洗たく用に好都
合に用いられるペルオキシ型の漂白剤に対して高められ
た安定性を示す。

すなわち、本発明の新規バシラス種によって産生され
るアルカリプロテアーゼは、三種の主成分、相互に区別
し得るアルカリプロテアーゼ（本発明ではA,BおよびＣ
と称す）を、プロテアーゼ活性単位で測定して、各々の
おゝよそ1/3の割合でしばしば含有する。しかし、変異
株はこれらの成分プロテアーゼの少なくとも１種を生産
する能力を欠いているであろう。偶然にも全てのこれら
の三種の成分プロテアーゼは、同様の洗浄力および安定
生を示す。

発明の概要かくして、第一の面によれば、本発明は菌株NCIB 122
88およびNCIB 12289によって定義される新規好アルカリ
性バシラス種から産生されるアルカリプロテアーゼを含
んで成るプロテアーゼ調製品が提供され、該アルカリプ
ロテアーゼは、1.75g/のトリポリリン酸ナトリウム
（STPP）、1.0g/の過硼酸ナトリウムおよび0.1g/の
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）の溶液中、pH
9.5で30分後のカゼインプロテアーゼ単位（CPU下記参
照）で測定した残留活性が過硼酸ナトリウムおよびTAED
の不存在下、25℃での残留活性の少なくとも80％および
60％（それぞれ40℃および50℃での）を保持しているこ
とを特徴とするプロテアーゼ調製を提供する。

好ましい態様によれば、プロテアーゼ調整品は第１図
のピークＢ並びに第１図および第２図のそれぞれピーク
Ｃによって同定されるプロテアーゼＢおよびＣを本質的
に含んでいない。

更に本発明の他の好ましい態様において、プロテアー
ゼ活性の残りは、プロテアーゼＢおよびＣにより共に提
供されているか、又はそれらのいずれかにより単独に提
供されている。該プロテアーゼＢおよびＣが互いに免疫
化学的に同一であるが該プロテアーゼＡとは異なる。

他の面によれば、本発明は添附図面の第１図ピークＡ
の位置によって同定されたプロテアーゼと免疫化学的に
同一である成分プロテアーゼＡをCPU活性として少なく
とも10％を含んでなるプロテアーゼ調製品を提供しそし
て該プロテアーゼＡは次の付加的特徴：約41.5kDの分子
量、約9.3の等電点、およびタンパク質1g当り少なくと
も150アンソン単位および250ヘモグロビンプロテアーゼ
単位（それぞれ、AUおよびHPU、下記参照）の比活性、
および過硼酸ナトリウムおよびTAEDの不存在下、25℃の
残留活性の、トリポリリン酸ナトリウム（STPP、1.75g/
）、過硼酸ナトリウム（1.0g/）およびテトラアセ
チルエチレンジアミン（TAED、0.1g/）の溶液中でpH
9.5で30分後CPU単位で測定した残留活性の少なくとも80
％および60％（それぞれ40℃および50℃の温度で）を有
する。プロテアーゼＢおよびＣは、約28.5および31.0kD
の分子量を更にそれぞれ約8.8および5.2の等電点を有す
る。

本発明は更に本質的に前記プロテアーゼＢを含んで成
る、プロテアーゼ調製品を提供する。

更に本発明は本質的に前記プロテアーゼＣを含んで成
る、プロテアーゼ調製品を意図する。

更に本発明の別の面によれば、プロテアーゼ調製品の
製法が提供され、この方法は菌株NCIB 12288およびNCIB
12289によって定義される新規バシラス（Bacillus）種
の菌株を、炭素、窒素およびリンの同化源を含有する栄
養培地中好気性条件で培養し、次いで好ましくは発酵ブ
ロスからのプロテアーゼ調製品を回収することを含んで
成る。

プロテアーゼ調製品を製造する好ましい態様におい
て、発酵が前記で定義されるバシラスの菌株を用いて行
なわれ、該菌株は、残りの１種又は複数の成分プロテア
ーゼを産生するその能力を保持しつつ、１種又は２種の
成分プロテアーゼを合成するその可能性を本質的に阻止
するために突然変異せしめられている。

プロテアーゼ調製品を製造する他の好ましい形式にお
いて発酵がNCIB12288、NCIB 12289、NCIB12512およびNC
IB12513から成る群から選ばれるバシラス菌株で行われ
る。

別の面によれば、洗浄剤100g当たり、本発明のプロテ
アーゼ調製品の含有量、好ましくは少なくとも0.1AU、
更に好ましくは0.5〜10AUを含んで成る洗浄剤が提供さ
れる。洗浄剤は、粉末又は液体の形でよく、ここにおい
て、プロテアーゼ調製品は例えば顆粒に配合することに
より又は疏水性媒質中に懸濁液として保護される。

図面の簡単な説明第１図は、CMセファロースCL6Bカラム次いでセファ
デックスG25を用いたゲルロ過による、NCIB 12289由
来のプロテアーゼ調製品の溶出クロマトグラフィーを示
す。

第２図は、バシトラシンカラムによるプロテアーゼＣ
のアフィニティクロマトグラフィーを示す。

第３図および第４図は、本発明のプロテアーゼ調製品
のpH−活性度および温度−活性度の曲線をそれぞれ示
し、全てのプロテアーゼ成分は類似の温度−活性および
pH−活性を示す。

第５図および第６図は二種の異なる洗浄剤を用いる本
発明のプロテアーゼ調製品およびアルカラーゼについて
行った洗浄比較実験の結果を示す。実験条件は以下の例
５に示す。

第７図は、成分プロテアーゼの各々について行った洗
浄実験の結果を示す。

発明の詳細微生物、分類学、形態学、生物化学的反応、微生物：本発明のアルカリプロテアーゼの微生物生産物は、英
国特許1,243,784に記載された好アルカリ性バチル（Bac
illi）の選択方法によって本質的に単離された。それら
は、もしも0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.0〜9.7又はNaClの７
％（W/V）溶液、0.1M炭酸塩緩衝液（0.1M炭酸塩緩衝
液、pH9が好ましい）のいずれかにより補なわれない場
合には、それらはバシラス（Bacillus）菌株に対し通常
の培地では増殖しない。二種の培養物が、下記の日付に
ついて特許の手続きをする目的でナショナルコレックシ
ョンオブインダストリアルバクテリー（NCIB）
（トリーリサームステーション、アバディーン、英
国）に寄託された。1977年ブダプスト条約のもとで設立
された国際寄託当局であるNCIBはそれぞれ上記条約の第
９規則および第11規則に従い、寄託の永久性と公衆によ
るそれらの入手を可能にしている。

寄託日寄託者の番号 NCIB番号 1986年７月８日 C608 12288 1986年７月８日 C609 12289 1987年８月５日 C610 12512 1987年８月５日 C611 12513 分類学：培地TYを分類学的研究に用いたが、この研究はルーツ
ゴルドン等の方法（The Genus Bacillus,Agriculture H
andbook No.427,U.S.D.A.1973）に従って行なわれた。

培地TYの組成：トリプティカーゼ 20 g 酵母エキス 5 g FeCl₃・6H₂O 7mg MnCl₂・4H₂O 1mg MgSO₄・7H₂O 15 g 蒸留水で1000mlとする。

pHは121℃で15分間オートクレーブ処理する前にKOHで
7.3で調整される。

炭水化物からの酸の産生を決定するための液体培地
に、オートクレーブ処理前に10％NaClを添加した。

固体培地はオートクレーブ処理前に２％寒天を加え、
次いで殺菌炭酸塩緩衝液（pH9.0）を、斜面に注加する
直前に最終濃度0.1Mに無菌的に添加した。

本発明の微生物は好気性であり、バシルス（Bacillu
s）属に属する胞子形成細菌である。

形態：直径0.6〜0.8ミクロン、長さ1.2〜３ミクロンの
栄養型桿菌。

胞子：中央部から端部、卵形、胞子のうは膨潤せず。

菌株NCIB 12288およびNCIB 12289のいずれも、アラビ
ノース、マンノース、メリビオース、ラフィノース又は
ソルビトールから酸は生産しなかった。

最適増殖条件は、30〜37℃、pH9.0である。

上記形態学的結果は、以下の内容を示している。すな
わち、二種の菌株はすでに述べた種のいずれにも属さな
いが、新規なバシラス（Bcillus）種と定義すべきであ
る。

菌株NCIB 12512およびNCIB 12512に対する形態学的結
果は、上記に極めて類似しており、全ての４種の菌株は
同種に属する。

タンパク質分解作用の分析 OPA−カゼイン法タンパク分解活性を基質としてカゼインを用いて測定
する。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準条
件、すなわち25℃、pH9.5で30分間インキュベーション
した後１分当たり第一アミノ基の１ミリモルを遊離する
酵素の量として定義される（セリン標準と比較して決
定）。

２％（W/V）カゼイン溶液（Hammarsten、メルク社、
西ドイツ）をpH9.5に調整した、ブリトンおよびロビン
ソンによるニュバーサルバッファー（Journ.Chem.Soc.1
931,1451頁）により調製する。

2mlの基質溶液を水溶中、25℃で10分間予備インキュ
ベートする。ブリトン−ロビンソン緩衝液（pH9.5）約
0.2〜0.3CPU/muに対応する、bg/1mlの酵素調製品を含有
する1mlの酵素溶液を添加する。25℃で30分間インキュ
ベーョン後、停止剤（三塩化酢酸（17.9g）、酢酸ナト
リウム（29.9g）および酢酸（19.8g）、脱イオン水で50
0mlに調整）を添加して反応を停止する。試験溶液とし
て同様の方法でブランクを調製する。

反応混合物を水溶で20分間保持し、しかる後、ワトマ
ン（登録商標）42ロ紙でロ過する。

第一アミノ基を、Ｏ−フルルジアルデヒド（OPA）を
用いて色変化により測定する。

ジナトリウムテトラボレートデカヒドラート（7.62
g）およびナトリウムドデシルスルフュートを150mlの水
をとかす。4mlのメタノールにとかしたOPA（160mg）
を、400μｍのβ−メルカプトエタノールを共に添加
し、その後溶液を水で200mlとする。

OPA試薬（3ml）に、上記400mlのロ液を混合しながら
添加する。340nmの光学を、５分後に測定する。

OPAテストは又、ブリトン−ロビンソン緩衝液（pH9.
5）00ml中にセリン10mgを含有するセリン標準液を用い
て行う。緩衝液はブランクとして用いる。

プロテアーゼ活性は次式により光学密度測定から計算
する。

CPU/1gの酵素調製品＝CPU/ml:b ここでOD_t,OD_b,OD_serおよびOB_bはそれぞれ試験溶液、
ブランク、セリン標準液および緩衝液の光学密度であ
り、C_serは標準液中1ml当たりのセリン濃度（ｇ）であ
り、MW_serはセリンの分子量である。Ｑは酵素溶液に対
する希釈因子（この例では８に等しい）であり、t_iはイ
ンキューベション時間（分）である。

OPA−ヘモグロビン法タンパク分解活性を、基質として尿素変性ヘモグロビ
ンで測定する。１ヘモグロビンプロテアーゼ単位（HP
U）は、標準条件、すなわち25℃、pH9.5で30分間インキ
ュベーションした後１分当たり、第一アミノ基の１ミリ
モルを遊離する酵素の量として定義される。（セリン標
準と比較して決定）。

尿素変性ヘモグロビン２％（W/V）溶液を、pH9.5に調
節した0.2Mボレート緩衝液で調製する。

2mlの基質溶液を水溶中10分間25℃で予備インキュベ
ートする。約0.2〜0.3HPU/1mlのボレート緩衝液当た
り、bg/1mlの酵素溶液を含有する1mlの酵素溶液を添加
する。インキュベーション、反応停止およびOPA試剤に
よる第一アミノ基の測定は、OPA−カゼイン法に対して
の上述のものと同じである。

OPAテストは、100mlのボレート緩衝液中10mlのセリン
を含むセリン標準液で行い、緩衝液はそれ自身ブランク
として作用する。

プロテアーゼ活性（HPU単位）を、OPA−カゼイン法で
用いたものと同一の式から計算する。

変性アンソン−ヘモグロビン法タンパク分解活性を決
定するためのアンソン−ヘモグロビン法で、未消化ヘモ
グロビンは三塩化酢酸（TCA）で沈でんさせ、次いでTCA
可溶性製品の量をフォリン−チオカルテウ（Folin−Cio
calteu）フェノール試剤で測定する。

１アンソン単位（AU）は、標準条件下、フェノール試
剤により１ミリ当量のチオシンと同じ色を与えるTCA溶
解性製品の量を毎分放出するような初期速度でヘモグロ
ビンを消化する酵素の量である。

標準反応条件は、次の通りである、温度25℃、反応時
間10分、pH7.5。

更にM.L.アンソン、Journal of general Phsiology 2
2巻（1939年）、79〜89;O.フォリンおよびV.シオカルテ
ウ、The Journal of Biological Chemistry,73巻（1972
年）、627−636頁。

タンパク分解活性の種々の値は、分析法の選択に応じ
て不変的に得られる。一方、OPA−カゼイン分析は実験
室的および生産目的のためタンパク分解活性を監視する
のに好都合であり、ヘモグロビンの如き基質を含有する
ポリフィリンに対するタンパク分解活性は、洗浄剤プロ
テアーゼの利用生を評価するのにより密接である。と言
うのは、血液およびクロロフィルから菌株を除去するの
は一般的実験では困難を伴うからである。基質を含有す
るポリフィリンに対する洗浄剤プロテアーゼの高特異活
性は好ましい。

プロテアーゼ調製品本発明のプロテアーゼ生産バシラス（Bacallus）菌株
を、他の必須の栄養素と共に同化性炭素およびチッ素を
有する栄養培地中好気性条件下で培養するが、培地は公
知方法により得る。

適当な炭素源は炭水化物、例えば、シュクロース、グ
ルコースおよびデンプン：又は穀類、米、モロコシの如
き原料を含む炭水化物である。多糖類は、発酵プロセス
の前に適当な加水分解酵素により発酵糖に少なくとも部
分的に通常変換される。培地に混入される炭水化物の濃
度は、広く、例えば25％まで更に１〜５％まで変化する
が、通常１〜15％が適当であり、％はグルコースの当量
として計算される。

栄養培地中のチッ素源は、無機および／又は有機性で
ある。適当な無機チッ素源は、ニトレートおよびアンモ
ニウム塩である。有機チッ素源の内、多くのものが細菌
の培養を含む発酵プロセスで通常用いられている。代表
例は、大豆ミル、綿実油ミル、ピーナッツミル、カゼイ
ン、コーンスティープリカー、酵母エキス、尿素、およ
びアルブミンである。加えて、栄養培地は通常の微量物
質を含むべきである。

バシラス菌株の増殖およびプロテアーゼの生産に対す
る最適温度は、当業者に日常的に確定される。培養は、
25℃〜35℃で、好ましくはアルカリ性pHで行われる。後
者は増殖培地を殺菌後、適当な緩衝液、炭酸ナトリウム
又は炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウム混合物
を、添加して得られる。タンク発酵器内の培養に対し、
人工的通気が必要である。通気温度は通常のタンク発酵
と同様である。

発酵後、液体酵素コンセントレートがブロスから粗物
質を除き、更に所望により低温度で蒸発させ又は逆浸透
により濃縮して得られる。

固体酵素調製品は、精製しおよび／又は濃縮したブロ
スから、塩例えばNa₂SO₄で又は水和性溶剤、エタノール
又はアセトン等で沈でんさせることにより得られ、スプ
レー乾燥の如き適当な乾燥法によるブロス中の水の除去
がなされる。

得られたプロテアーゼ調製品のタンパク分解活性は通
常0.1〜10CPU/gである。

本発明によるpH−活性および温度−活性曲線を第１図
および第２図に示す。

用いたサンプルは、以下の例１で得たものであり、活
性は前記CPU法で決定する。但し、pH又は温度は変え
た。曲線は次の内容を示す。すなわち、基質としてのカ
ゼインと共に最適pHは約６〜11であり、30分の反応での
最適温度は約50〜60℃である。

成分プロテアーゼの精製第1,2および３プロテアーゼ（以下、それぞれプロテ
アーゼＡ、プロテアーゼＢ、およびプロテアーゼＣとい
う）を公知方法で分離精製する。

精製プロテアーゼの最初の精製は、例えば適当な緩衝
液中に溶解し、次いで例えば塩、例えば（NH₄）₂SO₄又
はアセトンの如き水和性有機溶剤でタンパクを沈でんさ
せて行った。

回収沈でん物を更に精製するには、初期工程として緩
衝液系中でゲルロ過を含むクロマトグラフィー法が通常
行われる。溶出流のフラクションを含むプロテアーゼは
UV吸光度を監視しおよび／又はプロテアーゼ活性を測定
して場所決めされる。

更にゲルロ過精製は、例えばセファデックスアニオ
ン又はカチオン交換剤によるイオン交換クロマトグラフ
ィーより通常行なわれ、この際、構成ブロテアーゼの少
なくとも部分的分割が適当な緩衝剤−塩−勾配系を用い
て行なわれる。同種又は別種のイオン交換剤によりその
ピーク物質のレクロマトグラフィーは通常十分純粋な状
態でプロテアーゼ種を与える。必要なら、個々のプロテ
アーゼの更なる精製は、例えばバシトラシンカラムでア
フィニィティクロマトグラフィーにそれらを委ねること
により行なわれる。

成分プロテアーゼの精製は、ナトリウムドデシルベン
ゼンスルホメート（SDS）と共に又はなしで、ポリアク
リルアミドゲル（PAGE）中、ゲル電気泳動法により好都
合に監視される。プロテアーゼの自動消化は、例えばク
エニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を用い電気
泳動前に活性部位遮断により防止される。

マーカータンパク中のSDS−PAGEおよびエレクロフォ
ーカシング（1EF）は、それぞれ分子量（MW）および等
電点（pI）に対し好都合の手段である。

これらの方法に従い、プロテアーゼＡ、ＢおよびＣは
それぞれ分子量約41.5,28.5および31.0kD並びにそれぞ
れ等電点約9.3,9.2および5.2を有する。更にプロテアー
ゼＡはタンパク1g当たり比活性約180AU/gおよび270HPU/
gを特徴とする。

免疫化学的特性精製プロテアーゼの各々に対する単一特異性抗血清
は、例えばＮ、アケルセン等による方法に従って家兎を
免疫することにより上昇する（A manual of Quantitati
ve Immunoelectrephoresis、Blackwell Scientific Pub
lications、1973、23章）。精製イムノグロブリンは、
例えば、塩沈殿（（NH₄）₂SO₄）より、次いで透析並び
にDEAF−セファデックスによるイオン交換クロマトグラ
フィーにより抗血清から得ることができる。

タンパクの免疫化学的特性は、オウキテロニー二重拡
散分析（オウキテロニーHandbook of Experimental Imm
unology（D.M.Weir、Ed.）、Blackwell Scientific Pub
lications、1967、pp.655−706）により、又は、交差免
疫電気泳動法（Ｎ、アケルセン等、上記、第３章および
第４章）のいずれかによって通常行なわれる。

本発明のプロテアーゼＢおよびＣは、互いに免疫化学
的に同一であり、双方ともプロテアーゼＡに対し同一性
を示さない。本発明のプロテアーゼＡ、ＢおよびＣは次
の公知のアルカリバシラスプロテアーゼに対し免疫化学
的非同一性を示す： −アルカラーゼ（ノボインダストリー社、（デンマー
ク）の製品）、有効成分としてズブチリシンカルスベ
ルクを有し、バシラスリケニフォルミスから由来。

−サビナーゼおよびエスパラーゼ（ノボ社の製品）、米
国特許3,723,250に従って好気性バシラス種から得る。

−API−21（米国特許4,480,037）。

−デンマーク特許出願番号DK87/0544のプロテアーゼ。

洗浄剤本発明の洗浄剤は、典型的には液体又は粉末の洗たく
用洗剤である。液体洗剤の場合には、保存中のプロテア
ーゼの安定性は不満足であり、従って、製剤中に酵素安
定性を含むことが好ましい。かくして、液体製剤は１、
２−プロパノール（プロピレングリコール）のようなポ
リオールを典型的には１〜20％含む。所望により、製剤
はホウ酸（又は、別に酸化ホウ素、ホウ砂又はボラッ
ク）を典型的には10％まで含む。また、所望により、他
の低級脂肪酸のホルメート又は塩が例えば10％まで含ま
れる。液体洗剤中のカルシウム含量は0.001〜0.1％（全
て重量％）である。

例１ NCIB 12289から由来するプロテアーゼ調製品。

バシラス菌株NCIB 12289の細胞を、30℃で２日間イン
キュベーションした後0.1Mカーボネート緩衝液（pH9.
0）および１％スキンミルクを無菌的に加えたTY−寒天
斜面から採取した。細胞を、100mlのBP−Ｘ培地および
0.1Mカーボネート緩衝液（pH9.0）を含む500mlのバッフ
ル型振とうフラスコに移した。

培地 BP−X: ポテトスターチ 100g 大麦粉 50g 大豆粉 20g Na−カゼイナート 10g Na₂HPO₄,12H₂O 9g ターマミル60L（ノボ社） 0.1g プルロニック（商標） 0.1g 水道水で1000mlとする。

混合物をゆっくり60℃〜85℃に30分間撹拌しながらゆ
っくり加熱しデンプンを液化する。混合物をすみやかに
加熱し、冷却する前に10分間95℃超に保持し、振とうフ
ラスコに分配し次いで121℃で40分間オートクレーブ処
理される。

接種した振とうフラスコを240rpmの回振振とう器で４
日間25℃でインキュベートした。発酵ブロス（2.5、5
4CPU/、OPA−カゼイン法で分析）を30分間4000rpmで
濃縮した。遠心分離した液体（2.0）をDDS、RO−デビ
ジョン（デンマーク）からのミニーラボモデルで限外ロ
過し1.0に濃縮した。濃縮後、0.01モルのホウ酸ナト
リウム5.0（pH9.0）で洗い、最終的に400mlに濃縮し
た。凍結乾燥し、活性度3.0CUP/gを有する粗製生成物2
2.5g収率57％を得る。

例２成分プロテアーゼＡ、ＢおよびＣの分離 NCIB 12289による発酵を、例１と本質的に同様に行っ
た。

培養ブロス（75AU/kg）を、次の工程で精製した： −凝集 −遠心分離 −蒸発 −ブランクロ過 −Na₂SO₄による塩沈殿 −再溶解 −ブランクロ過 −滅菌ロ過 −限外ロ過による濃縮および洗浄 −凍結乾燥凍結乾燥粗製調製品（活性度15.3CPU/g又は24.5AU/
g）を精製し次いで次の一連の工程により成分プロテア
ーゼを分離した。

1.再溶解 2.5gのプロテアーゼを50mlの次の緩衝液に溶解した：ジメチルグルタル酸 0.01 M ホウ酸 0.1 Ｍ塩化カルシウム 0.002M 水酸化ナトリウムで pH7.0 2.遠心分離再溶解プロテアーゼを、25〜30℃で20分間18000rpm.
遠心分離した。

3.ロ過上澄液をワトマンガラスフィルタータイプGF/Fでロ過
し、42mlの澄明プロテアーゼ溶液を集めた。

4.セファデックスG25媒質のゲルロ過 40mlの澄明プロテアーゼ溶液を、工程１で用いた緩衝
液で平衡化したG25カラム（直径5cm×22.6cm）に適用し
た。10mlのフラックションを集めたが、流速は毎分3.3m
lであった。次いで活性度の試験を行った。適用される
活性の54％を含むフラックション19〜25を集め、100ml
に希釈し次いでミリポア0.45μフィルタータイプHAでロ
過した。

5.CMセファテックスCL6Bによるイオン交換クロマトグラ
フィーロ過された溶出液を、工程１で用いた緩衝液で平衡化
したCMセファロースCL6Bカラム（直径5cm×7.8cm）に適
用した。プロテアーゼＣおよび着色物質を同緩衝液でカ
ラムを洗浄した。他の成分は同緩衝液２の０〜0.05M
NaCl勾配により溶出した。10mlのフラックションを集
め、流速は3.3ml/分でありUV−吸光度で監視した。勾配
はフラックション37後に開始した。UV吸好フラックショ
ン５〜40および71〜150をプロテアーゼ活性に対しテス
トした。プロテアーゼ活性は第１図にみられるように３
個の明確なビーク中に見出された。

適用活性の23.1％を含むフラックション９〜25を集め
る（プロテアーゼＣ）。

適用活性の25.3％を含むフラックション76〜98を集
め、プロテアーゼＡと称した。

適用活性の23.7％を含むフラックション122〜140を集
め、プロテアーゼＢと称した。

6.バシトラシンカラムによるアフィニティクロマトグラ
フィーカラム（直径1.6cm×12cm）を工程１の緩衝液で平衡
化した。フラックション９〜25のプールをカラムに適用
した。プロテアーゼをNaCl（1M）およびイソプロパノー
ル（25％）を添加した同緩衝液で平衡化した。流速は、
5ml/分であり、フラックションサイズは10mlであった。
溶出の形を第２図に示す（280nmでのOD対時間）。適用
されるプロテアーゼ活性の73％を含むフラックション24
〜27を集め、プロテアーゼＣと称した。

例３菌株NCIB 12288から由来するプロテアーゼ調製品上記例１と同様の手順を、菌株NCIB 12288の培養に用
いた。発酵ブロス（0.3、35CPU/）は、0.39CPU/gの
活性度を有する粗製調製品11.7gを与える。収率43％。

例４菌株NCIB 12512から由来するプロテアーゼ調製品上記例１と同様の手順を、菌株NCIB 12512の培養に対
し行った。発酵ブロス（1.8、30CPU/）は、1.0CPU/
gの活性度を有する粗製調製品19.1gを与える：収率35
％。

例５菌株NCIB 12513から由来するプロテアーゼ調製品上記例１と同様の手順を、菌株NCIB 12513の培養に対
し行った。得られる調製品を前記例２の如く分離し、プ
ロテアーゼＢが含まれていないことが判明した。

例６ STPP、過ホウ酸ナトリウムおよびTAEDの溶液中のバシラ
スプロテアーゼの安定性各々がプロテアーゼ１当たり活性度0.2CPUを有しか
つ1.75g/のトリポリリン酸ナトリウム（STPP）、1.0g
/の過ホウ酸ナトリウムおよび0.1g/のテトラアセチ
ル−エチレンジアミン（TAED）を有する溶液を、40℃お
よび50℃で30分間インキュベートした。残留活性をOPA
−カゼイン法により測定し、過ホウ酸ナトリウムおよび
TAEDの不存在下25℃でインキュベーション後の活性を10
0℃として計算した。

結果を次の表に示す。

精製プロテアーゼ調製品による洗たく試験洗たく試験をトルグ−０−トメーター（Jay C.ハリス
著：「Detergency Evaluation and Testing」、インタ
ナショナルパブリッシャズ社（1954年）,60〜61頁）を
用い撹拌速度100rpmで10分間60℃で、EMPA 116試験布帛
見本5cm×10cm（血液、ミルクおよびカーボンブラック
で汚染した綿）（アイドノズッシェマテリアルプルー
フングスウンドウエズ−ヘザンスタルト、ザンクトゲ
レン、スイス国により提供）について行った。

次の洗浄剤組成物ＡおよびＢを９゜ドイツ硬度水中で
行った：ここでLASは直鎖アルキルスルホネート（NANSA 80S、
アルブライトアンドウィルソン社製造）であり、ST
PPはトリポリリン酸ナトリウムであり、TAEDはテトラア
セチルエチレンジアミンである。

液体に対する布の割合は、洗浄剤溶液900mlに対し９
個の見本であった。用いた洗浄剤酵素は、例１の酵素調
製品およびアルカラーゼプロテアーゼであり、双方の用
量レベルは、0.05,0.1および0.5CUP/であった。

洗浄剤ＡおよびＢを用いた二重洗たく試験の結果を、
それぞれ第５図および第６図に示す。ここで、洗浄力は
ZEISS ECREPHO光度計を用い460mmで低下測光により決定
し、規約反射率の平均値（％）として表わす。図面は以
下の内容を示す。すなわち、本発明のプロテアーゼの洗
浄作用は約0.05CPU/およびそれを越した用量で（洗浄
剤Ａ）の不存在下並びに過ホウ酸塩およびTAEDの存在
（洗浄剤Ｂ）下の双方でアルカラーゼプロテアーゼのそ
れよりも秀れている。

例７粗製プロテアーゼ調製品を用いた洗浄試験洗浄試験を、アイゲノズィッヘマテリアルプル−フ
ングウントウェズ−ヘサンヘルト、ザンクトガレ
ン、スイス国によって提供されるEMPAの116個の試験布
帛スワッチ5cm×10cm（血液、ミルクおよびカーボンブ
ラックより汚染した綿）を用い60℃で100rpmの撹拌速度
で10分間トルグ−０−メータ（ジェイC,ハリス：「Dete
rgency Evaluation and Testing」、インタナショナル
パブリシャズ社（1954年）60〜61頁）を用いて行っ
た。次の洗浄剤組成物ＡおよびＢをドイツ硬度９゜の水
中で行った。

ここでLASは直鎖アルキルスルホナート（NANSA 80S、
アルブライトアンドウィルソン社製造）であり、ST
PPは、トリポリリン酸ナトリウムであり、TAEDはテトラ
アセチルエチレンジアミンである。

液体に対する布の割合は、洗浄剤900ml当たり９個の
スワッチであった。用いた洗浄剤酵素は例１の酵素調製
品およびALCALASEプロテアーゼであり、それぞれ0.05、
0.1および0.5CPU/の用量レベルであった。

洗浄剤ＡおよびＢについての反復洗浄試験の結果をそ
れぞれ第５図および第６図に示す。ここで洗浄効果は、
ザイスエレホ光度計を用い460mmでの測光低下により決
定した規約反射率（％）の平均値として表わす。図面は
以下の内容を表わす。すなわち、約0.05CPU/およびそ
れを越える用量での本発明のフロテアーゼの洗浄作用
は、（洗浄剤Ａ）の非存在下並びにパーボレートおよび
TAEDの（洗浄剤Ｂ）の存在の双方のALCALASEプロテアー
ゼのそれよりも秀れている。

例８成分プロテアーゼＡ、ＢおよびＣを用いた洗浄試験
を、トルグ−０−メータを用い100rpmで10分間50℃で行
った。次の洗浄剤を９゜ドイツ硬度水中で用いた。

LAS 0.4 g/ AE 0.15 g/ Soap 0.15 g/ STPP 1.75 g/ ケイ酸ナトリウム 0.4 g/ CMC 0.05 g/ EDTA 0.01 g/ 硫酸ナトリウム 2.1 g/ 過ホウ酸ナトリウム 1.0 g/ TAED 0.1 g/ pH 9.5 ここで、LAS、STPPおよびTAEDは例７と同じであり、A
Eはアルコールエトチシレート（Berol 065、Berol Kemi
AB、スウェーデンにより製造）である。

アミラーゼ（BAN NOVO）でデサイズした白色綿織物か
ら成る、清潔な見本を乾燥し次いて小片（10×20cm）に
切断した。

清潔な見本をほうれん草のジュスーに浸し、二本ロー
ラーでしぼり、タンブラー内で60℃で乾燥した。これを
２回繰り返し汚染見本を得た。

液体に対する布の割合は、800mlの洗浄剤溶液中、８
個の基本（４個の清潔なものと４個の汚染物）であっ
た。例２のプロテアーゼA,BおよびＣを、0.1,0.5および
1.0CP/の用量で試験した。結果を第７図にプロテアー
ゼ用量に対する460nmでの規約反射率（％）として示
す。

図は全ての三個の構成プロテアーゼが50℃で過ホウ酸
塩を含む洗浄剤中で良好な洗浄作用を有することを示し
ている。

例９液体洗浄剤中の保存安定性液体洗浄剤を津のように処方した（２量）： TEAはトリエタノールアミンを表わし、DTPAはジエチ
レン−トリアミン−ペンタアセテートのナトリウム塩を
表わし、DGはナトリウムジグリコレートを表わし、MPG
はモノ−プロピレングリコールを表わし、AESはアルコ
ール−エトキシスルフェート（ドバノール25−3S/60、
シェル社製）を表わし、AEはアルコールエトキシレート
（Berol 160、ベロールケミAB、スイス国）を表わす。
各々の場合に、フラックションＩおよびIIの成分を混合
し、次いでフラックションIIを撹拌しながらフラックシ
ョンＩにゆっくり添加する。

水分含量（他の成分中に含まれる水を含めたもの）は
全洗浄剤中約41％W/Wであった。

次のプロテアーゼ調製品をテストした。

−水およびMPG（１対１重量比）の混合水に溶解しかつ
2.5AU/gの活性度に希釈した、例２の凍結粗製調製品。

−エスベラーゼ8.0L（ノボインダストリー社：デンマー
ク国製品）、米国特許3,723,250に従って調製したアル
カリバシラスプロテアーゼの商業液体調製品。

各プロテアーゼ調製品のカルシウム含量をCaCl₂・2H₂
Oを添加して10％W/W（Ca⁺⁺として）に調節した。各実験
において、プロテアーゼ調製品１％W/W（Ca⁺⁺調整後）
を上記洗剤の一方に添加し、混合物を50℃でインキュベ
ートし、サンプルを0,23,47および134時間のインキュベ
ーション後に取り出した。各サンプルのプロテアーゼ活
性を決定し、結果を最初の活性（すなわち０日後の活
性）の残留活性（％）として下記に示す。pHは０および
134時間後に測定した。

pHは全ての実験で殆ど一定であった。以下の内容が明
らかである。すなわち、本発明のプロテアーゼは全ての
洗浄剤製剤においてEsperaseおよびAlcalaseよりもより
安定である。結果は、更にホウ酸塩およびMPGが液体洗
浄中、本発明のプロテアーゼに対し安定剤として極めて
有効であることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブランナー，スベンデンマーク国，デーコー‐2800 リュングビュ，ベドスメデバッケン７アー

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】菌株NCIB12288又はNCIB12289によって定義
される新規好アルカリ性バシラス種から産生されるアル
カリプロテアーゼを含んで成るプロテアーゼ調製品であ
って、該アルカリプロテアーゼが、1.75g/のトリポリ
リン酸ナトリウム（STPP）、1.0g/の過硼酸ナトリウ
ムおよび0.1g/のテトラアセチルエチレンジアミン（T
AED）の溶液中、pH9.5で30分後のカゼインプロテアーゼ
単位（CPU）で測定した残留活性が過硼酸ナトリウムお
よびTAEDの不存在下、25℃での残留活性の少なくとも80
％および60％（それぞれ40℃および50℃での）を保持し
ており、該プロテアーゼが約41.5kDの分子量（SPS−PAG
E）および約9.3の等電点（IEF）、約28.5kDの分子量（S
PS−PAGE）および約8.8の等電点（IEF）、又は約31.0kD
の分子量（SPS−PAGE）および約5.2の等電点（IEF）を
有しており、更に該プロテアーゼは少なくともカゼイン
および変性ヘモグロビンに作用する、前記プロテアーゼ
調製品。
【請求項２】添附図面の第１図のピークＡの位置によっ
て同定されたプロテアーゼと免疫化学的に同一である成
分プロテアーゼＡをCPU活性として少なくとも10％を含
んで成るプロテアーゼ調製品であって、該プロテアーゼ
Ａが次の付加的特徴：約41.5kDの分子量、約9.3の等電
点、およびタンパク質1g当たり少なくとも150アンソン
単位および250ヘモグロビンプロテアーゼ単位（それぞ
れ、AUおよびHPU）の比活性、および過硼酸ナトリウム
およびTAEDの不存在下、25℃の残留活性の、トリポリリ
ン酸ナトリウム（STPP,1.75g/）、過硼酸ナトリウム
（1.0g/）およびテトラアセチルエチレンジアミン（T
AED,0.1g/）の溶液中でpH9.5で30分後CPU単位で測定
した残留活性の少なくとも80％および60％（それぞれ40
℃および50℃の温度で）を有することを特徴とする、請
求の範囲第１項記載のプロテアーゼ調製品。
【請求項３】前記第一のプロテアーゼＡ以外の他のプロ
テアーゼを本質的に含んでいない、請求の範囲第２項記
載のプロテアーゼ調製品。
【請求項４】プロテアーゼ活性の残りが、プロテアーゼ
ＢおよびＣにより共に供給されているか、又はそれらの
いずれかにより単に提供されており、該プロテアーゼが
第１図のピークＢにより、更に第１図および第２図のピ
ークＣにより、約28.5および31.0kDの分子量により、更
にそれぞれ約8.8および5.2の等電点により同定され、該
プロテアーゼＢおよびＣが互いに免疫化学的に同一であ
るが該プロテアーゼＡとは異なる、請求の範囲第２項記
載のプロテアーゼ調製品。
【請求項５】本質的に前記プロテアーゼＢ（これは約2
8.5kDの分子量および約8.8の等電点を有する）を含んで
成る、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ調製品。
【請求項６】本質的に前記プロテアーゼＣ（これは約31
kDの分子量および約5.2の等電点を有する）を含んで成
る、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ調製品。
【請求項７】菌株NCIB12288又はNCIB12289によって定義
される新規好アルカリ性バシラス種から産生されるアル
カリプロテアーゼを含んで成るプロテアーゼ調製品であ
って、該アルカリプロテアーゼが、1.75g/のトリポリ
リン酸ナトリウム（STPP）、1.0g/の過硼酸ナトリウ
ムおよび0.1g/のテトラアセチルエチレンジアミン（T
AED）の溶液中、pH9.5で30分後のカゼインプロテアーゼ
単位（CPU）で測定した残留活性が過硼酸ナトリウムお
よびTAEDの不存在下、25℃での残留活性の少なくとも80
％および60％（それぞれ40℃および50℃での）を保持し
ており、該プロテアーゼが約41.5kDの分子量（SPS−PAG
E）および約9.3の等電点（IEF）、約28.5kDの分子量（S
PS−PAGE）および約8.8の等電点（IEF）、又は約31.0kD
の分子量（SPS−PAGE）および約5.2の等電点（IEF）を
有しており、更に該プロテアーゼは少なくともカゼイン
および変性ヘモグロビンに作用する、前記プロテアーゼ
調製品の製造方法であって、菌株NCIB12288又はNCIB122
89によって定義される新規バシラス（Bacillus）種の菌
株を、炭素、窒素およびリンの同化源を含有する栄養培
地中好気性条件で培養し、次いで好ましくは発酵ブロス
からのプロテアーゼ調製品を回収することを含んで成
る、前記製造方法。
【請求項８】発酵が前記で定義されるバシラス菌株を用
いて行なわれ、該株が、成分プロテアーゼの１種又は２
種を合成する能力を本質的に阻止するが、残りの１種又
は複種の成分プロテアーゼを生産する能力を保持してい
るように変異せしめられたものである、請求の範囲第７
項記載の方法。
【請求項９】発酵が、NCIB12288,NCIB12289,NCIB12512
およびNCIB12513から成る群から選ばれるバシラス菌株
で行われる、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１０】菌株NCIB12288又はNCIB12289によって定
義される新規好アルカリ性バシラス種から産生されるア
ルカリプロテアーゼを含んで成るプロテアーゼ調製品の
有効量を含有する洗剤であって、該アルカリプロテアー
ゼが、1.75g/のトリポリリン酸ナトリウム（STPP）、
1.0g/の過硼酸ナトリウムおよび0.1g/のテトラアセ
チルエチレンジアミン（TAED）の溶液中、pH9.5で30分
後のカゼインプロテアーゼ単位（CPU）で測定した残留
活性が過硼酸ナトリウムおよびTAEDの不存在下、25℃で
の残留活性の少なくとも80％および60％（それぞれ40℃
および50℃での）を保持しており、該プロテアーゼが約
41.5kDの分子量（SPS−PAGE）および約9.3の等電点（IE
F）、約28.5kDの分子量（SPS−PAGE）および約8.8の等
電点（IEF）、又は約31.0kDの分子量（SPS−PAGE）およ
び約5.2の等電点（IEF）を有しており、更に該プロテア
ーゼは少なくともガゼインおよび変性ヘモグロビンに作
用する、前記洗剤。
【請求項１１】洗剤が少なくとも0.1AUのプロテアーゼ
調製品を含有する、請求の範囲第10項記載の洗剤。
【請求項１２】洗剤が0.5〜10AUのプロテアーゼ調製品
を含有する、請求の範囲第10項記載の洗剤。
【請求項１３】プロテアーゼ調製品が添附図面の第１図
のピークＡの位置によって同定されたプロテアーゼと免
疫化学的に同一である成分プロテアーゼＡをCPU活性と
して少なくとも10％を含んで成るプロテアーゼ調製品で
あって、該プロテアーゼＡが次の付加的特徴：約41.5kD
の分子量、約9.3の等電点、およびタンパク質1g当たり
少なくとも150アンソン単位および250ヘモグロビンプロ
テアーゼ単位（それぞれ、AUおよびHPU）の比活性、お
よび過硼酸ナトリウムおよびTAEDの不存在下、25℃の残
留活性の、トリポリリン酸ナトリウム（STPP,1.75g/
）、過硼酸ナトリウム（1.0g/）およびテトラアセ
チルエチレンジアミン（TAED,0.1g/）の溶液中でpH9.
5で30分後CPU単位で測定した残留活性の少なくとも80％
および60％（それぞれ40℃および50℃の温度で）を有す
ることを特徴とする、請求の範囲第10項記載の洗剤。
【請求項１４】プロテアーゼ調製品が前記第一のプロテ
アーゼＡ以外の他のプロテアーゼを本質的に含んでいな
い、請求の範囲第13項記載の洗剤。
【請求項１５】プロテアーゼ活性の残りが、プロテアー
ゼＢおよびＣにより共に供給されているか、又はそれら
のいずれかにより単に提供されており、該プロテアーゼ
が第１図のピークＢにより、更に第１図および第２図の
ピークＣにより、約28.5および31.0kDの分子量により、
更にそれぞれ約8.8および5.2の等電点により同定され、
該プロテアーゼＢおよびＣが互いに免疫化学的に同一で
あるが該プロテアーゼＡとは異なる、請求の範囲第13項
記載の洗剤。
【請求項１６】プロテアーゼ調製品が本質的に前記プロ
テアーゼＢ（これは約28.5kDの分子量および約8.8の等
電点を有する）を含んで成る、請求の範囲第10項記載の
洗剤。
【請求項１７】プロテアーゼ調製品が本質的に前記プロ
テアーゼＣ（これは約31kDの分子量および約5.2の等電
点を有する）を含んで成る、請求の範囲第10項記載の洗
剤。
【請求項１８】菌株NCIB12288又はNCIB12289によって定
義される新規好アルカリ性バシラス種から産生されるア
ルカリプロテアーゼを含んで成るプロテアーゼ調製品で
あって、該アルカリプロテアーゼが、1.75g/のトリポ
リリン酸ナトリウム（STPP）、1.0g/の過硼酸ナトリ
ウムおよび0.1g/のテトラアセチルエチレンジアミン
（TAED）の溶液中、pH9.5で30分後のガゼインプロテア
ーゼ単位（CPU）で測定した残留活性が過硼酸ナトリウ
ムおよびTAEDの不存在下、25℃での残留活性の少なくと
も80％および60％（それぞれ40℃および50℃での）を保
持しており、該プロテアーゼが約41.5kDの分子量（SPS
−PAGE）および約9.3の等電点（IEF）、約28.5kDの分子
量（SPS−PAGE）および約8.8の等電点（IEF）、又は約3
1.0kDの分子量（SPS−PAGE）および約5.2の等電点（IE
F）を有しており、更に該プロテアーゼは少なくともカ
ゼインおよび変性ヘモグロビンに作用する、前記プロテ
アーゼ調製品の有効量を含有する洗剤であって、該プロ
テアーゼ調製品が菌株NCIB12288およびNCIB12289によっ
て定義される新規バシラス（Bacillus）種の菌株を、炭
素、窒素およびリンの同化源を含有する栄養培地中好気
性条件で培養し、次いで好ましくは発酵ブロスからのプ
ロテアーゼ調製品を回収することによって生産されたも
のである、前記洗剤。