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JP2025002086A - 試料分析方法及び試料分析装置 - Google Patents

試料分析方法及び試料分析装置 Download PDF

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JP2025002086A JP2023102011A JP2023102011A JP2025002086A JP 2025002086 A JP2025002086 A JP 2025002086A JP 2023102011 A JP2023102011 A JP 2023102011A JP 2023102011 A JP2023102011 A JP 2023102011A JP 2025002086 A JP2025002086 A JP 2025002086A
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Abstract

【課題】試料に含まれる成分の濃度によらず、試料に含まれる成分を特定することが可能な試料分析方法及び試料分析装置を提供する。
【解決手段】キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する工程と、試料のエレクトロフェログラムを得る工程と、エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程と、取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む、試料分析方法等。
【選択図】図１

Description

本開示は、試料分析方法及び試料分析装置に関するものである。
臨床検査の現場においてヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」とも記す。）の分析が日常的に行われている。分析対象となるＨｂ種は検査の目的に応じて異なる。糖尿病の診断や病状把握のための分析対象としてはＨｂＡ１ｃが良く知られている。異常Ｈｂ症の診断のための分析対象としては、ＨｂＳ（鎌状赤血球Ｈｂ）、ＨｂＣ、ＨｂＤ及びＨｂＥなどに代表される変異Ｈｂが使用されている。また、βサラセミアの診断のための分析対象としては、ＨｂＡ２及びＨｂＦ（胎児Ｈｂ）が広く用いられている。
Ｈｂの分析は、イオン交換クロマトグラフィー法等の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）法などにより行われる。
特許文献１には、擬似固定相としてカチオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陰イオン交換動電クロマトグラフィーによる、ＨｂＡ２の分析方法が記載されている。
特許文献２及び特許文献３には、イオン交換動電クロマトグラフィーによる、界面到達時点を利用したＨｂＡ１ｃ等の成分を同定する方法の分析方法が記載されている。
特開２０１６－１３６１３５号公報 特許第６８４６３２４号公報 特許第６８７１１２９号公報
特許文献１に記載の方法を用いた場合、装置の小型化や、測定時間の短時間化が可能である。また、特許文献２又は特許文献３に記載の方法と組み合わせることで、簡便な装置により、相対検出時間に基づいて各ピークのＨｂ種を特定することが可能である。しかしながら、これらの方法では、検体中のＨｂ濃度が変動すると、ピークが重なる場合があった。ピークが重なると、Ｈｂ種を特定することが困難である。
本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、試料に含まれる成分の濃度によらず、試料に含まれる成分を特定することが可能な試料分析方法及び試料分析装置を提供することである。
本開示は、以下の態様を含む。
＜１＞
キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する工程と、
前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程と、
前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程と、
取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む、試料分析方法。
＜２＞
前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程は、
前記試料を光学的に測定して吸光度を得る工程と、
前記吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形として取得する工程と、
前記元波形を前記時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形を取得する工程と、を含み、
前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程は、
前記時間微分波形における各ピークの検出時間を取得し、取得した各ピークの検出時間に対応する吸光度を取得する工程を含み、
前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
取得した検出時間と取得した吸光度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と吸光度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する工程を含む、＜１＞に記載の試料分析方法。
＜３＞
前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られるパラメータである、＜１＞又は＜２＞に記載の試料分析方法。
＜４＞
前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとの近似直線の傾きのデータであり
前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
前記傾きのデータを用いて、前記取得した検出時間を補正し、補正検出時間を算出する工程と、
前記補正検出時間に基づいて、前記試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む、＜３＞に記載の試料分析方法。
＜５＞
前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとに分離する境界線のデータであり、
前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
前記境界線のデータを用いて、前記境界線で隔てられる各領域において、前記取得した検出時間と前記取得した吸光度とが属する領域を特定する工程と、
特定した領域に基づいて、前記試料に含まれる成分を特定する工程を含む、＜３＞に記載の試料分析方法。
＜６＞
前記成分は、ヘモグロビンである、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の試料分析方法。
＜７＞
キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する手段と、
前記試料のエレクトロフェログラムを得る手段と、
前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する手段と、
取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する手段と、を含む、試料の分析装置。
本開示の一実施形態によれば、試料に含まれる成分の濃度によらず、試料に含まれる成分を特定することが可能な試料分析方法及び試料分析装置が提供される。
図１Ａは、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す上面図である。図１Ｂは、図１Ａに示す電気泳動チップの断面図である。 図２は、元波形の例を示した図である。 図３は、図２の元波形に対する時間微分波形を示した図である。 図４は、横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図である。 図５は、Ｈｂ種と、補正検出時間との関係の一例を示す図である。 図６は、横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図である。 図７は、本実施態様の試料分析方法を実行するのに使用することができる試料分析システムを示すシステム概略図である。 図８は、図７の試料分析システムに用いられる分析チップを示す平面図である。 図９は、図８のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。 図１０は、制御部のハードウェア構成を示すブロック図である。 図１１は、Ｈｂ種と、相対検出時間との関係を示す図である。
以下、本発明の一例である実施形態について説明する。これらの説明および実施例は、実施形態を例示するものであり、発明の範囲を制限するものではない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、「工程」という語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても、その工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において図面を参照して実施形態を説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
[試料分析方法]
本開示に係る試料分析方法は、キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する工程（以下、「分離工程」ともいう）と、試料のエレクトロフェログラムを得る工程（以下、「エレクトロフェログラム取得工程」ともいう）と、エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程（以下、「検出時間・濃度取得工程」ともいう）と、取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する工程（以下、「成分特定工程」ともいう）と、を含む。
本開示に係る試料分析方法によれば、試料に含まれる成分の濃度によらず、試料に含まれる成分を特定することができる。
例えば、変異ヘモグロビン保有者の遺伝子型は、ＨｂＡ／ＨｂＶのヘテロ接合体（ＨｂＶはＨｂＡ以外の変異ヘモグロビン）、又はＨｂＶ／ＨｂＶのホモ接合体である。ヘテロ接合体を持つ人の血液と比べてホモ接合体を持つ人の血液の方が、そのＨｂ（ＨｂＶ）の濃度が高く、ピークが前倒しになる傾向がある。ピークが前倒しになることにより、複数のピークが重なる場合がある。
従来、試料に含まれるＨｂ種の特定において、ピークが重なるとＨｂ種の特定が難しい場合があった。
本発明者は、エレクトロフェログラムより取得できる各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度との間に相関があることを見出した。そして、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いることにより、各成分の濃度によらず、試料に含まれる成分を正確に特定できることを見出した。
＜分離工程＞
本開示に係る試料分析方法は、キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する工程を含む。
試料としては、キャピラリ電気泳動法で分析可能な成分を含み、かつ、そのような溶媒に溶解可能なものであれば、液体、固体又は気体等その態様は問わない。
試料に含まれる成分のうち分析の対象となるものとしては、ヘモグロビン（Ｈｂ）、アルブミン（Ａｌｂ）、グロブリン（α１、α２、β、γグロブリン）、フィブリノーゲン等が挙げられる。上記ヘモグロビンとしては、例えば、ＨｂＡ、ＨｂＡ２、ＨｂＦ（胎児ヘモグロビン）、変異ヘモグロビン（ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等）等の複数のヘモグロビン種が挙げられる。健常人及び変異ヘモグロビン保有者の全血のいずれにも、僅かなＨｂＡ２が含まれる。これらの成分は、構成要素であるアミノ酸の変異が蛋白分子に電気的に反映されやすいため、キャピラリ電気泳動法による分析には好適である。
なお、分析対象となる成分によっては、試料を適当な試薬で事前処理したり、別途の方法（例えば、クロマトグラフィ法）によって予備的な分離処理をしておくこととしてもよい。
Ｈｂの分離は、通常、泳動液中で行われる。泳動液は、アルカリ性溶液であってもよく、酸性溶液であってもよいが、アルカリ性溶液であることが好ましい。
試料は、例えば、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等を含有する。
アルカリ性溶液中におけるキャピラリ電気泳動による試料中のＨｂの分離は、キャピラリ流路を備える装置を使用することにより行うことができる。
具体的には、アルカリ性溶液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入し、試料の導入後、キャピラリ流路の全体又は一部に電圧を印加することにより行うことができる。上記電圧の印加により、試料中のＨｂを電気泳動させることができ、分離することができる。
キャピラリ流路への電圧の印加は、キャピラリ流路の試料導入側に負電極を接触させ、アルカリ性溶液供給側に正電極を接触させることにより行うことができる。
キャピラリ流路の断面形状は、特に限定されるものではなく、円形状であってもよく、矩形状であってもよく、その他の形状であってもよい。
矩形状の場合、キャピラリ流路の流路高さ及び流路幅は、それぞれ、１μｍ～１０００μｍであることが好ましく、１０μｍ～２００μｍであることがより好ましく、２５μｍ～１００μｍであることが更に好ましい。円形状の場合、キャピラリ流路の内径は、１０μｍ以上又は２５μｍ以上が好ましく、１００μｍ以下又は７５μｍ以下が好ましい。
キャピラリ流路の流路長は、５ｍｍ～１５０ｍｍであることが好ましく、１０ｍｍ～１５０ｍｍであることがより好ましく、２０ｍｍ～６０ｍｍであることが更に好ましい。
キャピラリ流路の材質は特に限定されず、例えば、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等が挙げられる。プラスチックとしては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等が挙げられる。
分離工程においては、上記キャピラリ流路がマイクロチップ化されたキャピラリ電気泳動チップを使用してもよい。後述する図１Ａ及び図１Ｂに示すキャピラリ電気泳動チップ、並びに、後述する図８及び図９に示す分析チップは、キャピラリ電気泳動法で用いるチップの一例である。
キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有することができ、試料保持槽と泳動液保持槽とはキャピラリ流路により連通する。
キャピラリ電気泳動チップのサイズは、特に限定されるものではなく、適宜調整することが好ましい。キャピラリ電気泳動チップのサイズは、例えば、長さ１０ｍｍ～２００ｍｍ、幅１ｍｍ～６０ｍｍ、厚み０．３ｍｍ～５ｍｍとすることができる。
試料保持槽及び泳動液保持槽の容積は、キャピラリ流路の内径及び長さに応じて適宜決定されるが、それぞれ、１ｍｍ３～１０００ｍｍ３であることが好ましく、５ｍｍ３～１００ｍｍ３であることがより好ましい。
試料保持槽に充填する試料の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
泳動液保持槽に充填するアルカリ性溶液の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
キャピラリ流路の両端に印加する電圧は、５００Ｖ～２００００Ｖであることが好ましく、５００Ｖ～１００００Ｖであることがより好ましく、５００Ｖ～５０００Ｖであることが更に好ましい。
キャピラリ流路内において、負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせてもよい。液流としては、電気浸透流等が挙げられる。
キャピラリ流路は、その内壁がカチオン性物質又はアニオン性物質で被覆されていることが好ましい。
カチオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆することによって、キャピラリ流路の内壁をプラスに帯電させることができる。その結果、キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
アニオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆した場合、キャピラリ流路の内壁はマイナスに帯電するが、アルカリ性溶液に含有されるカチオン性ポリマーがマイナスに帯電したキャピラリ流路の内壁に結合する。これにより、キャピラリ流路の内壁はプラスに帯電され、上記と同様にキャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
カチオン性物質は、特に限定されるものではなく、カチオン性官能基を有するシランカップリング剤等を使用することができる。分離精度を向上する観点から、カチオン性物質は、第４級アンモニウム塩基を有するポリマーであることが好ましく、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドがより好ましい。
アニオン性物質は、特に限定されるものではなく、アニオン性基を有する多糖類、アニオン性官能基を有するシランカップリング剤等を使用することができる。
アニオン性基を有する多糖類としては、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類等が挙げられる。
硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、これらの塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、これらの塩等が挙げられる。
図１Ａ及び図１Ｂに、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す。図１Ａは、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す上面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示す電気泳動チップの断面図である。
図１Ａ及び図１Ｂに示すキャピラリ電気泳動チップは、キャピラリ流路１、試料保持槽２及び泳動液保持槽３を備え、試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１により連通している。キャピラリ流路１には検出部４が形成されている。
試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１の両端に電圧を印加するための電極をそれぞれ備えていてもよい（図示せず）。具体的には、試料保持槽２（試料導入側）が負電極を備え、泳動液保持槽３（アルカリ性溶液供給側）が正電極を備えることができる。
検出部４の位置、すなわち、分離に要する長さ（試料保持槽２から検出部４までの距離、図１Ａにおけるｘ）は、キャピラリ流路１の長さ等により適宜決定できる。キャピラリ流路１の長さ（図１Ａにおけるｘ＋ｙ）が１０ｍｍ～１５０ｍｍである場合、試料保持槽２から検出部４までの距離（ｘ）は、５ｍｍ～１４０ｍｍであることが好ましく、１０ｍｍ～１００ｍｍであることがより好ましく、１５ｍｍ～５０ｍｍであることが更に好ましい。
－アルカリ性溶液－
本開示において、「アルカリ性」とは、ｐＨ７．０超であることを意味する。アルカリ性溶液のｐＨは、Ｈｂの等電点よりも高いことが好ましく、７．５～１２．０であることが好ましく、８．５～１１．０であることがより好ましく、９．５～１０．５であることが更に好ましい。
なお、本開示において、アルカリ性溶液のｐＨは、２５℃におけるアルカリ性溶液のｐＨであり、電極を浸漬してから３０分経過後にｐＨメータを用いて測定する。ｐＨメータとしては、堀場製作所社製のＦ－７２又はこれと同程度の装置を使用することができる。
アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを含有する。アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを２種以上含有してもよい。
本開示において、「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性基を有するポリマーを意味する。
本開示において、「カチオン性基」とは、カチオン基及びイオン化されてカチオン基となる基を包含する。
カチオン性基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩基、イミノ基等が挙げられる。
カチオン性ポリマーは、水溶性であることが好ましい。なお、本開示において、「水溶性」とは、対象物質が２５℃の水に対して１質量％以上溶解することを意味する。
第１級～第３級アミノ基又は第１級～第３級アミノ基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリジアリルアミン、ポリメチルジアリルアミン、ポリエチレンイミン、ジアリルアミン－アクリルアミド重合物、ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重合物、アリルアミン－ジアリルアミン重合物等が挙げられる。上記したカチオン性ポリマーは塩の状態であってもよく、塩酸塩等が挙げられる。
イミノ基又はイミノ基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
第４級アンモニウム塩基又は第４級アンモニウム塩基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリクオタニウム、ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重合物、ジメチルアミン－エピクロルヒドリン重合物等が挙げられる。
本開示において「ポリクオタニウム」とは、第４級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(InternationalNomenclatureforCosmeticIngredients)directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム－６（poly(diallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－７（copolymerofacrylamideanddiallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－４（Diallyldimethylammoniumchloride-hydroxyethylcellulosecopolymer）、ポリクオタニウム－２２（copolymerofacrylicacidanddiallyldimethylammoniumchloride）等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及びポリクオタニウム－２（poly[bis(2-chloroethyl)ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]）等が挙げられる。
また、カチオン性ポリマーとしては、上記アンモニウム塩以外にも、一又は複数の実施形態において、ホスホニウム塩、オキソニウム塩、スルホニウム塩、フルオロニウム塩、クロロニウム塩等のオニウム塩のカチオンポリマーも利用できる。
ヒドラジド基又はヒドラジド基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、アミノポリアクリルアミド等が挙げられる。
分離時間を短縮する観点からは、カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、１０，０００～５００，０００であることが好ましい。
本開示において、カチオン性ポリマーの重量平均分子量はカタログ値を参照する。重量平均分子量のカタログ値がない場合、重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定されるポリエチレングリコール換算の重量平均分子量とする。
分離時間を短縮する観点からは、アルカリ性溶液の総質量に対するカチオン性ポリマーの含有率は、０．５質量％～１０質量％であることが好ましく、０．７５質量％～５．０質量％であることがより好ましく、１．０質量％～３．０質量％であることが更に好ましい。
カチオン性ポリマーは、従来公知の方法により合成したものを使用してもよく、市販されるものを使用してもよい。
アルカリ性溶液は、水を含有してもよい。水としては、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水等が挙げられる。
アルカリ性溶液の総質量に対する水の含有率は、特に限定されるものではなく、１０質量％～９９．９質量％とすることができる。
アルカリ性溶液は、非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質、微生物の繁殖等を抑制するための保存剤などの添加剤を含有してもよい。保存剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、エチルパラベン、プロクリン等が挙げられる。
－試料－
試料の総質量に対するＨｂの含有量の和は、特に限定されるものではなく、０．００１質量％～１００質量％とすることができる。
試料の形態は特に限定されるものではなく、試料原料を調製したものであってもよく、試料原料そのものであってもよい。
試料原料としては、Ｈｂを含む原料、生体試料等が挙げられる。
生体試料としては、血液、赤血球成分等を含む血液由来物等が挙げられる。
血液は、生体から採取された血液が挙げられ、ヒト以外の哺乳類の血液、ヒトの血液等が挙げられる。
赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであり、且つ赤血球成分を含むものが挙げられる。例えば、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。
分離精度を向上する観点から、試料は、カチオン性ポリマーを含有するアルカリ性溶液を含有することが好ましい。
上記アルカリ性溶液を含有する試料は、上記アルカリ性溶液を用いて試料原料を希釈することにより得ることができる。希釈率は、質量基準で、１．２倍～１００倍であることが好ましく、２倍～６０倍であることがより好ましく、３倍～５０倍であることが更に好ましい。希釈に使用する材料は特に限定されるものではなく、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸等）、界面活性剤（例えば、エマルゲンＬＳ－１１０（花王製）等）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、イオン強度調整剤（例えば、塩化ナトリウム等）、屈折率調整剤（例えば、スクロース等の糖類）などが挙げられる。
また、上記アルカリ性溶液は、キャピラリ流路に充填されるアルカリ性溶液と同一であってもよく、異なっていてもよい。
＜エレクトロフェログラム取得工程＞
本開示に係る試料分析方法は、試料のエレクトロフェログラムを得る工程を含む。具体的には、エレクトロフェログラム取得工程は、試料を光学的に測定して吸光度を得る工程と、吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形として取得する工程と、元波形を時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形を取得する工程と、を含むことが好ましい。
図２は、元波形の例を示した図である。
図３は、図２の元波形に対する時間微分波形を示した図である。
（試料を光学的に測定して吸光度を得る工程）
吸光度は、例えば、以下の方法により測定される。
試料は、連続的にキャピラリ流路に導入され、キャピラリ流路において試料に含まれる複数の成分が電圧の印加により分離される。キャピラリ流路の途中に設けられている検出部４において、波長４１５～４２０ｎｍの光を照射し、吸光度測定装置により、吸光度を測定する。
たとえば、分析対象の成分がＨｂである場合、アルカリ性溶液中においてその分子表面は負電荷を帯びているので、キャピラリ流路の上流に陰極を、下流に陽極を配置することで、分析対象の成分は陽極に向かって泳動される。その際、分子表面の荷電状態によって、電気的な泳動速度が異なってくる。すなわち、分子表面の負電荷が強いほど、泳動速度は高くなる。したがって、試料がキャピラリ流路に導入された後、泳動速度の高い成分は、より速く検出部に到達することになる。
そして、泳動速度の低い成分が検出部に到達した時点では、後から導入された試料に由来する、泳動速度の高い成分も検出部に到達することになる。すなわち、キャピラリ流路においては、泳動速度の高い成分が先に検出部に到達すると、試料がキャピラリ流路に導入され続ける限り、当該成分は持続的に到達し続けることになる。また、泳動速度がより低い成分は遅れて検出部に到達するが、一旦検出部に到達すると、試料がキャピラリ流路に導入され続ける限り、やはり当該成分は持続的に検出部に到達し続けることになる。
換言すると、検出部においては、泳動速度の高い成分が先に到達し、以後は泳動速度のより低い成分が累積的に到達することになる。よって、検出部において測定される吸光度は、経時的に累積的に単調増加していくことになる。
（吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形として取得する工程）
吸光度を一方の軸（たとえば、Ｙ軸）とし、時間を他方の軸（たとえば、Ｘ軸）とした二次元平面上にプロットし、元波形として取得する。なお、吸光度は、二次元平面上にプロットすることが可能なデータとして取得されていればよく、このようなデータを基に実際にグラフとして描画されることは必須ではない。
（元波形を時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形を取得する工程）
上記元波形を時間軸に沿って見た場合、勾配の大きい部分は、ある成分が検出部４に初めて到達したことによる吸光度の増加に由来するものである。また、勾配の小さい部分は、次の成分がまだ検出部４に到達していないことを示すものである。すなわち、元波形で勾配が大きくなっている部分は、試料溶液中の成分が検出部４に到達していることを示すものである。このような元波形における勾配の大きい部分は、元波形を時間軸に沿って微分して得られる波形（「時間微分波形」と称する。）において現れるピーク波形として表される。これらのピーク波形は、試料に含まれる各成分に由来する。なお、時間軸においては、より左側にあるピーク波形に対応する成分の方が、より右側にあるピーク波形に対応する成分よりも泳動速度が高いことを表す。
＜検出時間・濃度取得工程、及び、成分特定工程＞
本開示に係る試料分析方法は、エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程を含む。
また、本開示に係る試料分析方法は、取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する工程を含む。
検出時間・濃度取得工程は、時間微分波形における各ピークの検出時間を取得し、取得した各ピークの検出時間に対応する吸光度を取得する工程を含むことが好ましい。
成分特定工程は、取得した検出時間と取得した吸光度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と吸光度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する工程を含むことが好ましい。
既知の成分を用いて算出された検出時間と吸光度との相関関係を示すパラメータ（以下、「特定パラメータ」ともいう）は、分析対象とする試料を分析する前に、試料分析装置において、あらかじめ設定されていることが好ましい。
特定パラメータは、既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られるパラメータであることが好ましい。
以下、特定パラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する具体的な方法について説明する。
（方法Ａ）
方法Ａにおいて、特定パラメータは、既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとの近似直線の傾きのデータである。
方法Ａでは、試料に含まれる成分を特定する工程は、傾きのデータを用いて、取得した検出時間を補正し、補正検出時間を算出する工程と、補正検出時間に基づいて、試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む。
方法Ａにおける特定パラメータは、例えば、以下の方法で算出される。
キャピラリ電気泳動により、濃度の異なる既知のＨｂ種を用いて、吸光度を得る。吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形Ａとして取得し、元波形Ａを時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形Ａを取得する。Ｘ軸を時間、Ｙ軸を吸光度変化量とする。
時間微分波形Ａより、以下のデータを取得する。
・ＰｋＴｉｍｅ：ピークの極大値をＰｋＴｏｐとし、ＰｋＴｏｐにおける検出時間を意味する。
・ＰｋＢｔＴｉｍｅ：ＰｋＴｏｐの直前にある極小値をＰｋＢｔとし、ＰｋＢｔにおける検出時間を意味する。
・ＰｋＴｌＴｉｍｅ：ＰｋＴｏｐの直後にある極小値をＰｋＴｌとし、ＰｋＴｌにおける検出時間を意味する。
・ＥＯＦＴｉｍｅ：吸光度変化量が０．２ｍＡｂｓ／ｓｅｃを超えたＰｋＴｏｐにおける検出時間の中で、最も早い検出時間を意味する。
・ＰｋＡｒｅａ：ＰｋＴｏｐにおける、ＰｋＢｔＴｉｍｅからＰｋＴｌＴｉｍｅまでの吸光度変化量の積算値を意味する。
・Ｐｋ％：全てのＰｋＡｒｅａに占める各ＰｋＡｒｅａの割合（％）を意味する。
・Ａ２Ｔｉｍｅ：ＨｂＡ２のＰｋＴｉｍｅを意味する。ＥＯＦＴｉｍｅの直後にある、Ｐｋ％が１％以上となるピークにおけるＰｋＴｉｍｅを、Ａ２Ｔｉｍｅとした。
以下の式Ａに基づいて、ＰｋＴｉｍｅを相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔへ変換する。
ＰｋＴｉｍｅＲｔ＝（ＰｋＴｉｍｅ－ＥＯＦＴｉｍｅ）／（Ａ２Ｔｉｍｅ－ＥＯＦＴｉｍｅ） …式Ａ
なお、上記式Ａでは、Ａ２Ｔｉｍｅを用いて相対検出時間を算出しているが、Ａ２Ｔｉｍｅの代わりに、血中のＨｂＡ、又は外部から試料に添加したタンパク質（４１５ｎｍの波長を吸収し、かつＨｂと同じ挙動を示すタンパク質）の検出時間を用いてもよい。
次に、元波形Ａより、ＰｋＴｌＴｉｍｅに対応する吸光度ＴｌＡｂｓを取得する。
なお、吸光度ＴｌＡｂｓの代わりに、ＰｋＴｉｍｅに対応する吸光度を取得してもよい。
図４は、横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図である。
図４に示すように、Ｈｂ種ごとに近似直線を描き、近似直線の傾きをそれぞれ算出する。そして、近似直線の傾きの平均値を算出する。
以下の式Ｂに基づいて、Ｈｂ種ごとに補正検出時間を算出する。
補正検出時間＝ＰｋＴｉｍｅＲｔ＋｛ＴｌＡｂｓ／（－近似直線の傾きの平均値）｝ …式Ｂ
図５は、Ｈｂ種と、補正検出時間との関係の一例を示す図である。
図５より、Ｈｂ種と、Ｈｂ種に対応する補正検出時間の範囲を決定する。
・ＨｂＥ：補正検出時間が１．０１０以上１．０７０未満である。
・ＨｂＣ：補正検出時間が１．０７０以上１．１１０未満である。
・ＨｂＤ：補正検出時間が１．１１０以上１．１４５未満である。
・ＨｂＳ：補正検出時間が１．１４５以上１．１９０未満である。
・ＨｂＧ：補正検出時間が１．１９０以上１．２５０未満である。
・ＨｂＡ：補正検出時間が１．２５０以上１．４５０未満である。
図５に示すように、Ｈｂ種によって、補正検出時間は重なっていない。そのため、分析対象とする試料について、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得し、式Ｂに基づいて補正検出時間を算出し、補正検出時間に基づいて、試料に含まれるＨｂ種を特定することができる。
分析対象とする試料（含まれるＨｂ種が不明である試料）について、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得する方法は、濃度の異なる既知のＨｂ種について、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得する方法と同様である。
（方法Ｂ）
方法Ｂにおいて、特定パラメータは、既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとに分離する境界線のデータである。
方法Ｂでは、試料に含まれる成分を特定する工程は、境界線のデータを用いて、境界線で隔てられる各領域において、取得した検出時間と取得した吸光度とが属する領域を特定する工程と、特定した領域に基づいて、試料に含まれる成分を特定する工程を含む。
方法Ｂにおける特定パラメータは、例えば、以下の方法で算出される。
方法Ａと同様に、濃度の異なる既知のＨｂ種について、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得する。
図６は、横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図である。
図６に示すように、Ｈｂ種ごとに分離する境界線を描き、境界線の一次式を算出する。 Ｅｌｉｎｅは、ＨｂＥとＨｂＣとを分離する境界線である。
Ｃｌｉｎｅは、ＨｂＣとＨｂＤとを分離する境界線である。
Ｄｌｉｎｅは、ＨｂＤとＨｂＳとを分離する境界線である。
Ｓｌｉｎｅは、ＨｂＳとＨｂＧとを分離する境界線である。
Ｇｌｉｎｅは、ＨｂＧとＨｂＡとを分離する境界線である。
各境界線の一次式は、例えば、以下のように設定される。
Ｅｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４５８３－４２５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｃｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４４５０－４０００×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｄｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４５５０－３９５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｓｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４７９４－３９６７×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｇｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝５０７９－３９９１×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
図６に示すように、Ｈｂ種が境界線で分離されている。そのため、分析対象とする試料について、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得し、境界線で隔てられる各領域において、取得した相対検出時間と取得した吸光度が属する領域を特定する。特定した領域に基づいて、試料に含まれるＨｂ種を特定することができる。
以下の式Ｅ１及びＥ２を満たす場合、ＨｂＥであると特定する。
ＰｋＴｉｍｅＲｔ＞１ …式Ｅ１
ＴｌＡｂｓ＜４５８３－４２５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ …式Ｅ２
以下の式Ｃ１を満たす場合、ＨｂＣであると特定する。
４５８３－４２５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ≦ＴｌＡｂｓ＜４４５０－４０００×ＰｋＴｉｍｅＲｔ …式Ｃ１
以下の式Ｄ１を満たす場合、ＨｂＤであると特定する。
４４５０－４０００×ＰｋＴｉｍｅＲｔ≦ＴｌＡｂｓ＜４５５０－３９５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ …式Ｄ１
以下の式Ｓ１を満たす場合、ＨｂＳであると特定する。
４５５０－３９５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ≦ＴｌＡｂｓ＜４７９４－３９６７×ＰｋＴｉｍｅＲｔ …式Ｓ１
以下の式Ｇ１を満たす場合、ＨｂＧであると特定する。
４７９４－３９６７×ＰｋＴｉｍｅＲｔ≦ＴｌＡｂｓ＜５０７９－３９９１×ＰｋＴｉｍｅＲｔ …式Ｇ１
以下の式Ａ１を満たす場合、ＨｂＡであると特定する。
５０７９－３９９１×ＰｋＴｉｍｅＲｔ≦ＴｌＡｂｓ …式Ａ１
［試料分析装置］
本開示に係る試料分析装置は、キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する手段と、試料のエレクトロフェログラムを得る手段と、エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する手段と、取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する手段と、を含む。
試料のエレクトロフェログラムを得る手段は、試料を光学的に測定して吸光度を得る手段と、吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形として取得する手段と、元波形を時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形を取得する手段と、を含むことが好ましい。
エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する手段は、時間微分波形における各ピークの検出時間を取得し、取得した各ピークの検出時間に対応する吸光度を取得する手段を含むことが好ましい。
試料に含まれる成分を特定する手段は、取得した検出時間と取得した吸光度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と吸光度との相関関係を示すパラメータを用いて、試料に含まれる成分を特定する工程を含むことが好ましい。
具体的には、検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとの近似直線の傾きのデータであり、試料に含まれる成分を特定する工程は、傾きのデータを用いて、取得した検出時間を補正し、補正検出時間を算出する手段と、補正検出時間に基づいて、試料に含まれる成分を特定する手段と、を含むことが好ましい。
また、検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとに分離する境界線のデータであり、試料に含まれる成分を特定する手段は、境界線のデータを用いて、境界線で隔てられる各領域において、取得した検出時間と取得した吸光度とが属する領域を特定する手段と、特定した領域に基づいて、試料に含まれる成分を特定する手段を含むことが好ましい。
＜試料分析システム＞
図７は、本実施態様に係る試料分析方法を実行するのに使用することができる試料分析システムＡ１の概略構成を示している。試料分析システムＡ１は、試料分析装置１００及び分析チップ１０を備えて構成されている。試料分析システムＡ１は、試料Ｓａを対象としてキャピラリ電気泳動法による分析方法を実行するシステムである。
分析チップ１０は、試料Ｓａを保持し、かつ試料分析装置１００に装填された状態で試料Ｓａを対象とした分析の場を提供するものである。図８及び図９に示すように、分析チップ１０は、本体２１、混合槽２２、導入槽２３、フィルタ２４、排出槽２５、電極槽２６、流路２７及び連絡流路２８を備えている。図８は、分析チップ１０の平面図であり、図９は、図８のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿う断面図である。分析チップ１０は、ディスポーザブルタイプのものに限定されず、複数回の分析に用いられるものであってもよい。また、本実施態様の試料分析システムは、試料分析装置１００に装填される別体の分析チップ１０を備える構成に限定されず、分析チップ１０と同様の機能を果たす機能部位が試料分析装置１００に組み込まれた構成であってもよい。
本体２１は、分析チップ１０の土台となるものである。本体２１の材質は、上記キャピラリ流路の材質で説明したとおりである。本実施態様においては、本体２１は、図９における上側部分２Ａと下側部分２Ｂとが別体に形成されており、これらが互いに結合された構成である。なお、これに限らず、たとえば、本体２１を一体的に形成してもよい。
混合槽２２は、試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合される箇所である。混合槽２２は、たとえば、本体２１の上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。導入槽２３は、混合槽２２において試料Ｓａと希釈液Ｌｄとが混合されて得られた試料溶液が導入される槽である。導入槽２３は、たとえば、本体２１の上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。
フィルタ２４は、導入槽２３への導入経路の一例である導入槽２３の開口部に設けられている。フィルタ２４の具体的構成は限定されず、好適な例として、たとえばセルロースアセテート膜フィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．４５μｍ）が挙げられる。
排出槽２５は、流路２７の下流側に位置する槽である。排出槽２５は、たとえば、本体２１の上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。電極槽２６は、キャピラリ電気泳動法において、電極３１が挿入される槽である。電極槽２６は、たとえば、本体２１の上側部分２Ａに形成された貫通孔によって、上方に開口した凹部として構成されている。連絡流路２８は、導入槽２３と電極槽２６とを繋いでおり、導入槽２３と電極槽２６との導通経路を構成している。
流路２７は、導入槽２３と排出槽２５とを繋ぐキャピラリ管として形成され、電気泳動法における電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）が生じる場である。流路２７は、たとえば本体２１の下側部分２Ｂに形成された溝として構成されている。なお、本体２１には、流路２７への光の照射及び流路２７を透過した光の出射を促進するための凹部等が適宜形成されていてもよい。流路２７の断面形状及びサイズ（矩形状の場合における流路高さ及び流路幅、並びに、円形状の場合における内径及び流路長）は、上記キャピラリ流路の断面形状及びサイズで説明したとおりである。分析チップ１０全体のサイズは、流路２７のサイズ並びに混合槽２２、導入槽２３、排出槽２５及び電極槽２６のサイズや配置等に応じて適宜設定される。
なお、上記構成の分析チップ１０は一例であって、キャピラリ電気泳動法による成分分析が可能な構成の分析チップを適宜採用することができる。
試料分析装置１００は、試料Ｓａが点着された分析チップ１０が装填された状態で、試料Ｓａを対象とした分析処理を行う。試料分析装置１００は、電極３１、電極３２、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３、スリット４４、検出器４５、分注器６、ポンプ６１、希釈液槽７１、泳動液槽７２及び制御部８を備えている。なお、光源４１、光学フィルタ４２、レンズ４３及び検出器４５は、本実施態様でいう測定部４０を構成する。
電極３１及び電極３２は、キャピラリ電気泳動法において流路２７に所定の電圧を印加するためのものである。電極３１は、分析チップ１０の電極槽２６に挿入されるものであり、電極３２は、分析チップ１０の排出槽２５に挿入されるものである。電極３１及び電極３２に印加される電圧は、上記キャピラリ流路の両端に印加する電圧で説明したとおりである。
光源４１は、キャピラリ電気泳動法において光学測定値としての吸光度を測定するための光を発する部位である。光源４１は、たとえば所定の波長域の光を出射するＬＥＤチップを具備する。光学フィルタ４２は、光源４１からの光のうち所定の波長の光を減衰させつつ、その余の波長の光を透過させるものである。レンズ４３は、光学フィルタ４２を透過した光を分析チップ１０の流路２７の分析箇所へと集光するためのものである。スリット４４は、レンズ４３によって集光された光のうち、散乱などを引き起こしうる余分な光を除去するためのものである。
検出器４５は、分析チップ１０の流路２７を透過してきた光源４１からの光を受光するものであり、たとえばフォトダイオードやフォトＩＣなどを具備して構成されている。
このように、光源４１から発した光が検出器４５へと至る経路が光路である。そして、当該光路が流路２７と交わる位置である測定位置２７Ａでその流路２７を流れる溶液（すなわち、試料溶液及び泳動液のいずれか又はその混合溶液）について光学測定値が測定される。すなわち、流路２７における測定位置２７Ａにおいて、測定部４０が試料溶液の光学測定値を測定する。この光学測定値としては、例えば吸光度が挙げられる。吸光度は、該光路の光が流路２７を流れる溶液によって吸収された度合いを表すものであり、入射光強度と透過光強度の比の常用対数の値の絶対値を表したものである。この場合、検出器４５としては汎用的な分光光度計を利用することができる。なお、吸光度を使用せずとも、単純に透過光強度の値そのものなど、光学測定値であれば利用することができる。以下においては、光学測定値として吸光度を使用した場合を例に説明する。
分注器６は、所望の量の希釈液Ｌｄや泳動液Ｌｍ及び試料溶液を分注するものであり、たとえばノズルを含む。分注器６は図示しない駆動機構によって試料分析装置１００内の複数の所定位置を自在に移動可能である。ポンプ６１は、分注器６への吸引源及び吐出源である。また、ポンプ６１は、試料分析装置１００に設けられた図示しないポートの吸引源及び吐出源として用いてもよい。これらのポートは、泳動液Ｌｍの充填などに用いられる。また、ポンプ６１とは別の専用のポンプを備えてもよい。
希釈液槽７１は、希釈液Ｌｄを貯蔵するための槽である。希釈液槽７１は、試料分析装置１００に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の希釈液Ｌｄが封入された容器が試料分析装置１００に装填されたものであってもよい。泳動液槽７２は、泳動液Ｌｍを貯蔵するための槽である。泳動液槽７２は、試料分析装置１００に恒久的に設置された槽でもよいし、所定量の泳動液Ｌｍが封入された容器が試料分析装置１００に装填されたものであってもよい。
希釈液Ｌｄは、試料Ｓａと混合されることにより、試料溶液を生成するためのものである。希釈液Ｌｄの主剤は特に限定されず、水、生理食塩水が挙げられ、好ましい例として後述する泳動液Ｌｍと類似の成分の液体が挙げられる。また、希釈液Ｌｄは、上記主剤の他に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。
泳動液Ｌｍは、電気泳動法による分析工程において、排出槽２５及び流路２７に充填され、電気泳動法における電気浸透流を生じさせる媒体である。泳動液Ｌｍの好ましい態様は、上記のとおりである。また、泳動液Ｌｍにも、希釈液Ｌｄの説明で述べたのと同様に、必要に応じて添加物が添加されてもよい。
制御部８は、試料分析装置１００における各部を制御するものである。制御部８は、図１０のハードウェア構成に示すように、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）８１、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）８２、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）８３及びストレージ８４を有する。各構成は、バス８９を介して相互に通信可能に接続されている。
ＣＰＵ８１は、中央演算処理ユニットであり、各種プログラムを実行したり、各部を制御したりする。すなわち、ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４からプログラムを読み出し、ＲＡＭ８３を作業領域としてプログラムを実行する。ＣＰＵ８１は、ＲＯＭ８２又はストレージ８４に記録されているプログラムに従って、上記各構成の制御及び各種の演算処理を行う。
ＲＯＭ８２は、各種プログラムおよび各種データを格納する。ＲＡＭ８３は、作業領域として一時的にプログラム又はデータを記憶する。ストレージ８４は、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｒｉｖｅ）又はフラッシュメモリにより構成され、オペレーティングシステムを含む各種プログラム、及び各種データを格納する。本実施態様では、ＲＯＭ８２又はストレージ８４には、本実施態様に係る試料分析方法を実行するためのプログラムや各種データが格納されている。
試料分析装置１００は、本実施態様に係る試料分析方法を実行する際に、上記のハードウェア資源及び前記した各構成を用いて、測定及び分析を行う。
以下に実施例について説明するが、本開示はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の説明において、特に断りのない限り、「部」及び「％」はすべて質量基準である。
＜分離デバイスと測定機器＞
分離デバイスとしては、図１に示す構造のキャピラリ流路１を有する樹脂製のチップ（流路幅４０μｍ、流路高さ４０μｍ、流路長：３０ｍｍ、試料保持槽２から検出部４までの距離（ｘ）２０ｍｍ）を用いた。試料保持槽２及び泳動液保持槽３の容量は１０μＬとした。キャピラリ流路の内壁は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドで被覆した。
分離デバイスはザ ラボ ００１Ａ１ｃ ＨＤ（アークレイ株式会社）、測定装置はザ ラボ ００１（アークレイ株式会社）を用いた。
＜キャピラリ電気泳動用溶液の調製＞
下記の各物質を混合して、ｐＨが９．８となるまで、水酸化ナトリウム及び水を加え、キャピラリ電気泳動用溶液を調製した。
・ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重縮合物（カチオン性ポリマー、センカ製、ユニセンスＫＨＥ １０００Ｌ、重量平均分子量１００，０００～５００，０００）…１．５質量％
・アジ化ナトリウム…０．０２質量％
・水酸化ナトリウム
・水
＜希釈用溶液の調製＞
下記の各物質を混合して、ｐＨが８．８となるまで、塩酸及び水を加え、キャピラリ希釈用溶液を調製した。
・ポリエチレンイミン（富士フイルム和光純薬製、重量平均分子量７０，０００）…１質量％
・エマルゲンＬＳ－１１０（花王製）…０．４質量％
・アジ化ナトリウム…０．０２質量％
・スクロース…７．８７質量％
・塩化ナトリウム…０．２６質量％
・塩酸
・水
＜Ｈｂ検体の準備＞
健常者全血及び各種変異Ｈｂキャリア全血のいずれにもＨｂＡ２が含まれる。
・健常者全血：ＡＡ（ＨｂＡ／ＨｂＡ）
・各種変異Ｈｂキャリア全血：ＡＥ（ＨｂＡ／ＨｂＥ）、ＡＣ（ＨｂＡ／ＨｂＣ）、ＡＤ（ＨｂＡ／ＨｂＤ）、ＡＳ（ＨｂＡ／ＨｂＳ）、ＡＧ（ＨｂＡ／ＨｂＧ）、ＣＣ（ＨｂＣ／ＨｂＣ）、ＤＤ（ＨｂＤ／ＨｂＤ）、ＳＳ（ＨｂＳ／ＨｂＳ）
［実施例１］
（特定パラメータの設定）
－分離工程－
キャピラリ電気泳動チップにおける泳動液保持槽３にキャピラリ電気泳動用溶液を９μＬ供給し、毛細管現象によりキャピラリ流路１内にキャピラリ電気泳動用溶液を充填した。
試料保持槽２に、健常者全血及び各種変異Ｈｂキャリア全血を、希釈用溶液で４１倍又は１２１倍に希釈したサンプル９μＬを供給した。
次いで、試料保持槽２に負電極、泳動液保持槽３に正電極を接触させ、７５μＡの定電流制御にて電圧を印加して電気泳動を開始した。電気泳動は９０秒間行った。
－エレクトロフェログラム取得工程－
電気泳動が行われている間、検出部４に４１５ｎｍの光を照射し、その吸光度を測定し、吸光度スペクトルの元波形Ａを得た。
元波形Ａを時間軸に沿って微分し、時間微分波形Ａを得た。
なお、光の照射、吸光度の測定及びエレクトロフェログラムの取得には、アークレイ社製のザラボ００１を使用した。
健常者全血及び各種変異Ｈｂキャリア全血について、上記測定を実施し、エレクトロフェログラムを取得した。キャピラリ電気泳動チップは、測定ごとに使い捨てとした。
－検出時間・濃度取得工程－
時間微分波形Ａより、ＰｋＴｉｍｅ、ＥＯＦＴｉｍｅ、ＰｋＴｌＴｉｍｅ、及びＡ２Ｔｉｍｅを取得した。
以下の式Ａに基づいて、ＰｋＴｉｍｅを相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔへ変換した。
ＰｋＴｉｍｅＲｔ＝（ＰｋＴｉｍｅ－ＥＯＦＴｉｍｅ）／（Ａ２Ｔｉｍｅ－ＥＯＦＴｉｍｅ） …式Ａ
また、元波形Ａより、ＰｋＴｌＴｉｍｅに対応する吸光度ＴｌＡｂｓを取得した。
横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図４において、Ｈｂ種ごとに近似直線を描き、近似直線の傾きをそれぞれ算出した。近似直線の傾きの平均値は、－４９２３であった。
以下の式Ｂに基づいて、補正検出時間を算出した。
補正検出時間＝ＰｋＴｉｍｅＲｔ＋｛ＴｌＡｂｓ／（－近似直線の傾きの平均値）｝… 式Ｂ
図５より、Ｈｂ種と、Ｈｂ種に対応する補正検出時間の範囲を決定した。
・ＨｂＥ：補正検出時間が１．０１０以上１．０７０未満である。
・ＨｂＣ：補正検出時間が１．０７０以上１．１１０未満である。
・ＨｂＤ：補正検出時間が１．１１０以上１．１４５未満である。
・ＨｂＳ：補正検出時間が１．１４５以上１．１９０未満である。
・ＨｂＧ：補正検出時間が１．１９０以上１．２５０未満である。
・ＨｂＡ：補正検出時間が１．２５０以上１．４５０未満である。
（成分特定工程）
得られた補正検出時間が、上記補正検出時間の範囲のいずれに該当するかを判定し、Ｈｂ種を特定することができた。
［実施例２］
試料保持槽２に、上記健常者全血及び各種変異Ｈｂキャリア全血を用いた場合と同様の方法で、分離し、エレクトロフェログラムを取得した。
エレクトロフェログラムより、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓを取得した。
図６は、横軸を相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔとし、縦軸を吸光度ＴｌＡｂｓとした図である。
図６に示すように、Ｈｂ種ごとに分離する境界線を描き、境界線の一次式を算出した。
各境界線の一次式は、以下のように設定した。
Ｅｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４５８３－４２５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｃｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４４５０－４０００×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｄｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４５５０－３９５０×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｓｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝４７９４－３９６７×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
Ｇｌｉｎｅ： ＴｌＡｂｓ＝５０７９－３９９１×ＰｋＴｉｍｅＲｔ
（成分特定工程）
得られた相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔ及び吸光度ＴｌＡｂｓが属する領域を特定し、特定した領域に基づいて、Ｈｂ種を特定することができた。
［比較例１］
実施例１と同様に、健常者全血及び各種変異Ｈｂキャリア全血を用いて、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔを取得した。
図１１は、Ｈｂ種と、相対検出時間との関係を示す図である。
図１１に示すように、各Ｈｂ種に対して相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔが重なっている部分がある。すなわち、相対検出時間ＰｋＴｉｍｅＲｔのみでは、試料に含まれる成分を特定することができないことが分かる。
１：キャピラリ流路
２：試料保持槽
３：泳動液保持槽
４：検出部
Ｔｘ：Ｘピークの検出時間
Ｔａ２：ＨｂＡ２ピークの検出時間
Ｔｙ：Ｙピークの検出時間
Ａ１：分析システム
Ｓａ：試料
Ｌｄ：希釈液
Ｌｍ：泳動液、
１００：成分分析装置
１０：分析チップ
２Ａ：上側部分
２Ｂ：下側部分
２１：本体
２２：混合槽
２３：導入槽
２４：フィルタ
２５：排出槽
２６：電極槽
２７：流路
２７Ａ：測定位置
２８：連絡流路
３１：電極
３２：電極
４０：測定部
４１：光源
４２：光学フィルタ
４３：レンズ
４４：スリット
４５：検出器
６：分注器
６１：ポンプ
７１：希釈液槽
７２：泳動液槽
８：制御部
８１：ＣＰＵ
８２：ＲＯＭ
８３：ＲＡＭ
８４：ストレージ
８９：バス

Claims (7)

  1. キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する工程と、
    前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程と、
    前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程と、
    取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む、試料分析方法。
  2. 前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程は、
    前記試料を光学的に測定して吸光度を得る工程と、
    前記吸光度を時間軸に沿って二次元平面上にプロットした元波形として取得する工程と、
    前記元波形を前記時間軸に沿って微分して得られる波形である時間微分波形を取得する工程と、を含み、
    前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する工程は、
    前記時間微分波形における各ピークの検出時間を取得し、取得した各ピークの検出時間に対応する吸光度を取得する工程を含み、
    前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
    取得した検出時間と取得した吸光度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と吸光度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する工程を含む、請求項１に記載の試料分析方法。
  3. 前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
    既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られるパラメータである、請求項１に記載の試料分析方法。
  4. 前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
    既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとの近似直線の傾きのデータであり、
    前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
    前記傾きのデータを用いて、前記取得した検出時間を補正し、補正検出時間を算出する工程と、
    前記補正検出時間に基づいて、前記試料に含まれる成分を特定する工程と、を含む、請求項３に記載の試料分析方法。
  5. 前記検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータは、
    既知の成分を用いて二次元平面上に検出時間と吸光度とをプロットすることによって得られる、成分ごとに分離する境界線のデータであり、
    前記試料に含まれる成分を特定する工程は、
    前記境界線のデータを用いて、前記境界線で隔てられる各領域において、前記取得した検出時間と前記取得した吸光度とが属する領域を特定する工程と、
    特定した領域に基づいて、前記試料に含まれる成分を特定する工程を含む、請求項３に記載の試料分析方法。
  6. 前記成分は、ヘモグロビンである、請求項１に記載の試料分析方法。
  7. キャピラリ電気泳動により試料に含まれる複数の成分を分離する手段と、
    前記試料のエレクトロフェログラムを得る手段と、
    前記エレクトロフェログラムより、各ピークの検出時間と各ピークに対応する濃度を取得する手段と、
    取得した検出時間と取得した濃度に対して、既知の成分を用いて算出された検出時間と濃度との相関関係を示すパラメータを用いて、前記試料に含まれる成分を特定する手段と、を含む、試料分析装置。
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