JP2024537925A - 巨大なオルガネラの回収及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、当該巨大な細胞外オルガネラ小胞を産生するための、特定の浸透圧膨潤と、適応し、制御された原形質膜溶解及び除去との組合せに基づく新規方法、並びにタンパク質又は外来分子の活性をスクリーニングするための当該巨大な細胞外オルガネラ小胞の使用に関する。

Description

本発明は、体積に対する表面積の比が増大してマイクロメートルを超える、膨潤細胞内オルガネラを生み出す、特定の低張水性培養液への浸漬による浸透圧膨潤と、続いて安定し、かつ機能的で巨大な細胞外オルガネラ小胞（ｇｉａｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＧＥＯＶ）を細胞から単離かつ回収するための適当な細胞膜溶解との組合せに基づく新規方法、並びにタンパク質又は外来分子若しくは薬物の活性のスクリーニングを含むいくつかの用途向けの、かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞の使用に関する。

細胞生物学、生化学、創薬、病理発生における主な目標と限界は、所与の環境変化時に各オルガネラに起こる事象を知ることである。タンパク質が局在している正確な場所、タンパク質が動員状態となってオルガネラの特性にいかに影響するか、タンパク質の機能が何であるのかを知ることは重要である。イオンチャネル又は酵素などの細胞内タンパク質は、例えば重要な薬理学的薬物標的を構成する。こうした限界は、オルガネラ（その大部分が二重膜結合コンパートメント）がサイズにして数マイクロメートルを超えており、かつ自体の宿主細胞の外部で調整可能である場合に回避された可能性がある。

細胞内断片を抽出するための現在の方法は、多くの場合、細胞溶解バッファ（低張バッファ、バッファ＋界面活性剤分子）、続いて均質化を組み合わせた工程による細胞膜断片の回収に基づいており、この方法によって、ナノ断片（数百ナノメートルサイズ）が入手される。この方法については、所望のオルガネラのナノ断片が存在していることを同定するために精製工程が必要となる限りは、光学的可視化及び操作が不可能であり、このことによって工業的用途が難しいものとなっている。細胞手術はまた、オルガネラ（ミトコンドリア、リソソーム、核）の１つの微小断片を抽出するために光ピンセット、レーザ、ＡＦＭ、ピペット吸引を用いてその多くを実施してきた。かかる技術によって、それぞれの型のオルガネラについてマイクロメートルのオルガネラを回収することは可能ではないが、細胞につきオルガネラ１つのみを一度に回収することは可能である。このことによって工業的用途が難しいものとなっている。

近年の研究では、２Ｄ培養細胞を低張バッファに数分間供することで、その支持体から細胞を分離することなくオルガネラの膨潤がもたらされることが示されている。これらの実験では、細胞は無傷のまま維持されており、中でも細胞外マトリックスのおかげで依然としてその支持体に付着している。そのため、内部のオルガネラは中に限定されており、サイズと利用のしやすさといった点ではその潜在能力すべてを呈さず、２Ｄ付着細胞での空間を十分有さない（支持体付着膨潤は、分離可能である細胞よりも効率的ではない）。オルガネラは捕捉もされるが、細胞の原形質膜を破壊し、かつオルガネラをナノ断片へと破壊することなく完全に取り外した状態にするのが非常に困難であることによる。

細胞溶解キットを販売している一部の企業は、界面活性剤を含むわずかに低張な培養液を使用し、続けて肉眼で視認可能なシリンジ（半径０．５ｍｍ超）を使用し、高圧（１ｂａｒ超）で細胞に誘発されるせん断によって細胞溶解をもたらすプロトコール（https://www.thermofisher.com/sn/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/traditional-methods-cell-lysis.html;https://www.sigmaaldrich.com/FR/fr/product/sigma/mcl1?gclid=Cj0KCQjw0K-HBhDDARIsAFJ6UGgiWEUGjKbual-z_q3z21w7hBtnBD_z3iEBRTtuqNDZ4NRz_rFxdXwaAqM5EALw_wcB）を開発した。これらのキットと古典的なプロトコールでは、抽出前に巨大な細胞内オルガネラ小胞は形成されない：この膨潤プロトコールは、安定し、かつ機能的な巨大なオルガネラ小胞を生み出すには十分なものではなく、原形質膜を破壊するためのそのせん断プロセスが非常に強力なものであるので、オルガネラは、生化学的組成物（内腔タンパク質及び膜タンパク質は、プロセス中に緩む可能性がある）、活性、機能性及び／又は膜の生理学的特性が潜在的に欠損した状態のオルガネラの細胞外ナノ断片へとばらばらに破壊される。

そのため、供給源である細胞質基質を含まず、原形質膜に囲まれておらず、かつ工業的及び学術的な操作目的の両方にとって十分大きく（例えば、５～２０μｍ）、安定し、かつ機能的な細胞由来の巨大なオルガネラ（その他の場合では、巨大な細胞外オルガネラ小胞と呼ばれる）を、任意の細胞から生み出し、抽出及び回収する必要性が依然として存在している。

発明の説明

したがって、本発明者らは、安定し、かつ機能的な細胞由来の巨大なオルガネラを産生、抽出及び回収する、すなわち巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）を生み出すための、浸透圧摂動、生理学的摂動及び物理化学的摂動と、原形質膜を標的とした破壊アプローチとの特定の組合せに基づいた方法を確立した。この目的のために、本発明者らは、（ｉ）その元々の形態と比較して、体積に対する表面積の比が増大した細胞内オルガネラを生み出すための浸透圧膨潤工程であって、細胞は、０．５分間、３分間、５分間、７分間、１０分間、１５分間、２０分間～３０分間の間、０．１～１００ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは１～５０ｍＯｓｍ／Ｌ、より好ましくは５～５０ｍＯｓｍ／Ｌ、最も好ましくは１０ｍＯｓｍ／Ｌ～４０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する低張水溶液と接触した状態であり、水性培養液は、最終的に化学物質と組み合わせられて細胞内オルガネラ小胞（二重膜結合コンパートメント）のサイズを増大させ、巨大な（細胞内）オルガネラ小胞（ＧＩＯＶ）と呼ばれる、先行技術文献で報告されたことがないサイズ分布で拡大した小胞の形成をもたらし、原形質膜溶解の張力値を減少させる、工程と、（ｉｉ）低張水性培養液の前後運動が生成されて０．０１秒～１０分間にわたって０．０１ｍ／ｓ～１０ｍ／ｓの範囲の速度で細胞を移動させる工程であって、この工程が、原形質膜溶解張力を減少させ、かつ溶解後、原形質膜の完全開口を引き起こすために細胞の細胞骨格及び細胞外マトリックスの両方の破裂を促進させる、工程と、（ｉｉｉ）細胞の細胞膜張力が、１０^－４～１００秒間にわたって、工程（ｉ）又は工程（ｉ）＋（ｉｉ）の細胞から、機械的に増大（１０^－３～５ｍＮ／ｍ、好ましくは５．１０^－３～４ｍＮ／ｍ、より好ましくは１０^－２～２ｍＮ／ｍ、更により好ましくは１０^－２～１ｍＮ／ｍ、最も好ましくは５．１０^－２～０．７５ｍＮ／ｍ）し、原形質膜の溶解及び完全な除去と、平均サイズが概して約５～２０μｍの範囲であり、体積に対する表面積の比（幾何学的形状、大半の場合には球状の体積で表面を除する）が３μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、好ましくは２μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、より好ましくは１．５μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、最も好ましくは１．２μｍ^－１～０．１５μｍ^－１の範囲であり、溶解することなく低張培養液中で安定し、かつ機能的である巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）の放出をもたらす、工程と、に基づいた方法を開発した。例えば、ＧＥＯＶは、概して１．２μｍ^－１（５μｍ超のサイズの場合）～０．３μｍ^－１（２０μｍ未満のサイズの場合）の範囲である、増大した体積に対する表面積の比を有する。要約すると、プロトコール全体では、強力な浸透圧ショックによって巨大な細胞内小胞が生み出され、かつ細胞の原形質膜が特に不安定な状態となるが、原形質膜溶解と除去のために本発明者らが開発したプロトコールによって破壊されることがない巨大な細胞外オルガネラ小胞を完全に破壊し、放出するためには、小さな機械的摂動のみを必要とする。

本発明によれば、「巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）」という用語は、その宿主細胞から生み出され、抽出かつ回収され、これを取り囲んでいる原形質膜を含まない、小胞（二重膜結合した内腔を有する）としての膨潤二重膜結合オルガネラを意味している。これは、３μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、好ましくは２μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、より好ましくは１．５μｍ^－１～０．１５μｍ^－１、最も好ましくは１．２μｍ^－１～０．１５μｍ^－１の範囲の体積に対する表面積の平均比（Ｓ／Ｖ）を有する。これは、約２～４０μｍ、好ましくは３～４０μｍ、より好ましくは４～４０μｍ、最も好ましくは５～４０μｍの範囲の平均サイズに対応する。かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞は、小胞体、ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ体、液胞、葉緑体、オートファゴソーム、オートリソソーム、エンドソーム、ペルオキシゾーム、多胞体からなる群からのオルガネラに由来する。かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞の膜と内腔の両方は、タンパク質、脂質及び代謝産物から構成されている。かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞の生化学物質の総量は、産生されているオルガネラの全組成の一部である。この一部は、少なくとも０．０１％よりも大きく、好ましくは０．１％よりも大きく、より好ましくは１％よりも大きく、最も好ましくは１０％よりも大きい。かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞が産生されるが、これは、他のＧＥＯＶと接触しないか、１箇所で接触するか、複数箇所で接触する。かかる巨大なオルガネラ小胞が産生されるが、細胞質基質生体分子、微小管、アクチン、フィラメント、細胞核、脂質滴、リボソーム、中心小体、原形質膜といった細胞成分と一切接触しないか、１箇所で接触するか、複数箇所で接触する。

本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞によって、今では業界関係者にとって以前には考えられなかった用途への転向が可能になる。加えて、かかる巨大なオルガネラ小胞間での接触を保持することができる。別の利点は、顕微鏡（例えば、約５～２０μｍのサイズ）を用いて容易に画像化された巨大なオルガネラ小胞の迅速な単離であり、例えばこれによって薬物相互作用及び／又はタンパク質活性における作用の迅速な定量化が可能になる。これによって、オルガネラの断片を濃縮し、次いでいくつかの生化学定量化を行う必要がある当技術分野の他の技術と比較するとこのプロセスが容易となる。

かかる巨大な細胞外オルガネラ小胞は機能的であり、標識可能であり、その上に所望する任意のタンパク質を有し、かつ容易に採取かつ操作することができる。そのため、この技術によって、膜／内腔タンパク質の活性及び／又は外来分子若しくは薬物の作用のスクリーニングを含む、いくつかの用途に使用され得る巨大な細胞外オルガネラ小胞の産生が可能になる。製薬研究開発分野では、この活性は、薬物の存在の有無にかかわらず測定されることができる。これは、例えばイオンチャネル、リボソームなどといった膜及び可溶性タンパク質又は酵素に関する。更に全体的には、この技術によって、薬物－オルガネラ相互作用のマッピング可能性が最初に提供され、所与のオルガネラに局在しているタンパク質と相互作用する薬物候補の選択性／特異性、及び／又は毒性が確立される。

そのため、本発明は、巨大な細胞外オルガネラ小胞を任意の細胞から産生するための方法であって、当該方法が、
ａ）細胞とその細胞内二重膜結合オルガネラの両方を膨潤すること、細胞骨格と細胞外マトリックスの両方を破壊すること、細胞を球状化することを目的として、細胞と、０．１～１００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する低張水性培養液とを０．５～３０分間にわたって接触させることと、
ｂ）細胞原形質膜の溶解及び除去を目的として、１０^－４～１００秒間にわたって１０^－３～５ｍＮ／ｍの範囲の細胞への膜張力を印加することと、
ｃ）低張水性培養液中での巨大な細胞外オルガネラ小胞の回収
を含む、方法に関する。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、巨大な細胞外オルガネラ小胞が得られる細胞は、支持体上で、若しくは当技術分野で周知の任意の適切な培養液中にバルクが存在する懸濁液中での培養、又はオルガノイド、組織、器官若しくは生物からの回収が可能になる。任意の種類の細胞（哺乳動物、植物又は細菌細胞）は、本発明の方法に従って巨大なオルガネラを生み出すために使用することができる。例えば、Ｃｏｓ７、Ｈｕｈ、哺乳動物細胞、ヒト細胞、腫瘍細胞由来の細胞は、市場、研究所及び病院の患者から得られる。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、工程ａ）は、安定し、かつ機能的な巨大なオルガネラ小胞を生み出すことを目的として、０．５分間、３分間、５分間、７分間、１０分間、１５分間、２０～３０分間にわたって、例えば、バッファ溶液（希釈ＤＰＢＳ）、希釈細胞培地（ＤＭＥＭ）、イオン溶液、塩溶液（例えば、ＣａＣｌ_２又はＫＣｌ溶液）、希釈バッファ、水などの０．１～１００ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは１～５０ｍＯｓｍ／Ｌ、より好ましくは、５～５０ｍＯｓｍ／Ｌ、最も好ましくは１０～４０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する任意の水溶液である低張水性培養液を使用して実施される。そのため、例えば、ＣＯＳ－７細胞については、細胞質の浸透圧は約３００ｍＯｓｍ／Ｌである。これは、巨大なオルガネラ小胞を生み出すためには、約１００ｍＯｓｍ／Ｌ未満、０．１ｍＯｓｍ／Ｌ超の浸透圧を有するすべての種類の水溶液を使用することができることを意味している。かかる低張水性培養液によって、適度に非破壊的であり、迅速かつ効果的な浸透圧ショックを細胞及びその細胞内オルガネラに即座に適用して、球状の膨潤細胞及び拡大したオルガネラ小胞を生み出すことが可能になる。これ以外の手段では、膨潤プロトコールが過度に長く、かつ効果的ではないため、非球状のコンパートメント及びタンパク質分解がもたらされ、ＧＥＯＶの産生が困難になる。膨潤速度パラメータの制御は、巨大な細胞外オルガネラ小胞の産生にとって重要である。

いくつかの添加された分子（ノコダゾール、ナベルビン、ラトランクリンＡ、ラトランクリンＢ、サイトカラシンなどの細胞骨格破壊剤；ブレビスタチン、ベンジルトルエンスルホンアミド、ブタンジオンモノオキシムといったキネシン、ミオシン及びダイニンモータ阻害剤）によってもまた、細胞骨格を分解し、かつ細胞の溶解張力を減少することが可能になる。かかる低張水性培養液によって、大半の場合、細胞内コンパートメントは細胞溶解後、先行技術によるプロセスでは以前は決して到達できなかったサイズ及び体積に対する表面積の比を備えたオルガネラから巨大な細胞外球状小胞を形成することが確実となる。そのため、本発明の方法の低張培養液はまた、巨大な細胞外オルガネラ小胞の分解を防止しつつ、巨大な細胞外オルガネラ小胞の体積に対する表面積の比分布及び原形質膜を溶解する表面張力値を調節する１つ以上の分子を含有することができる（例えば、プロテアーゼ阻害剤、分子モータ阻害剤、オルガネラ－細胞骨格接触阻害剤、細胞骨格破壊剤、界面活性剤）。いくつかの添加された分子（例えば、イオンチャネル調節剤／遮断剤：タプシガルギン、カフェイン、ベンゾチアセピン；トリプシンなどの細胞外マトリックス破壊剤；タンパク質輸送阻害剤；キセロスポンギンなどのタンパク質シグナル伝達阻害剤；Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、オクチル－グルコシド、ＤＤＭ、カルボン酸などの化学洗剤）によって、細胞はより速く膨潤することが可能になり、それによって産生された巨大な細胞外オルガネラ小胞の体積に対する表面積の比をより迅速に低下させることが可能になる。最終的には、細胞膨潤速度は、工程ｂ）での細胞の原形質膜を溶解するための入力エネルギーを減少させるためだけでなく、工程ｃ）の終わりに産生されたＧＥＯＶのサイズを制御するためにも重要である。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、低張水性培養液は、ノコダゾール、ラトランクリン、トリプシン、ミサキノライド、ミカロライド、アプリロニド（aplyronides）、ビンブラスチン、ロテノン、スウィンホライド、ジャスプラキノリド、ビンクリスチン、デメコルシン、サイトカラシン、コルヒチン、ビンカアルカロイド、ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ベンゾチアゼピン、ガバペンチノイド、ブレビスタチン、ベンジルトルエンスルホンアミド、ブタンジオンモノオキシム、タプシガルギン、キセロスポンギン、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、マグネシウムからなる群から選択される１つ以上の分子を含み、当該分子は、工程ａ）前、工程ａ）にて、工程ａ’）にて、工程ｂ）にて、及び／又は工程ｃ）にて添加される。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、巨大な細胞外オルガネラ小胞を生み出す前に、細胞は、タンパク質分解を防ぎ、オルガネラでの生化学反応を調節する分子で処理されてもよい。この結果、巨大な細胞外オルガネラ小胞は特定の生化学特性を有することができる。そのため、代謝条件並びに細胞及びそのオルガネラの構造は、化学物質によって、並びに／又は細胞及び／若しくはそのオルガネラの構造及び／若しくは代謝条件に影響を及ぼすタンパク質の発現レベルを修飾することによって、工程ｂ）前に更に修飾され得る。実際に、工程ａ）前には、細胞は化学物質を用いて処理され得るか、細胞及びそのオルガネラの構造（特に、体積に対する表面積の比及び複数のオルガネラによる互いに対する相対的な位置づけ）並びに代謝条件に影響を及ぼすいくつかのタンパク質のレベルを過剰発現又は抑制するように修飾され得る。これらの操作によって、回収した巨大な細胞外オルガネラ小胞のサイズ及びそれらの接触を制御すること、浸透圧膨潤前に、近い将来に回収される巨大なオルガネラのサイズに影響を及ぼす体積に対する表面積の比を適切な浸透圧膨潤によって調整すること、が可能になる。例えば、浸透圧膨潤を誘発する前に、近い将来産生される巨大な細胞外オルガネラ小胞の体積に対する表面積の比は、（１）オルガネラ形状並びに他のオルガネラ、原形質膜及び細胞骨格との接触部位に影響を及ぼすタンパク質の発現レベルを変更することで、（２）細胞骨格及び分子モータ、（他のオルガネラ、原形質膜及び細胞骨格との）オルガネラの接触部位、原形質膜及びオルガネラに局在している分子輸送タンパク質活性、シグナル伝達タンパク質活性のいずれもを変性する分子で細胞を処理することで、（３）オルガネラの数及び形状、表面に影響を及ぼす細胞の代謝経路を変性することによって、（４）オルガネラの体積に対する表面積の比及びオルガネラ内での接触における任意の処理媒介変更を、調節することができる。例えば、巨大な細胞外オルガネラ小胞の生成及び回収前にＣｌｉｍｐ６３を過剰発現することによって、３０μｍよりも大きいサイズを有する小胞体から放出するより大きく巨大な細胞外オルガネラ小胞がもたらされる。同様の方法で、巨大な細胞外オルガネラ小胞の生成及び回収前にＭｆｎ２を過剰発現することによって、０．７５μｍ^－１よりも小さい体積に対する表面積の比を有するミトコンドリアから放出するより大きく巨大な細胞外オルガネラ小胞がもたらされる。膨潤前に１～９０分、ノコダゾール（又はラトランクリンＡ）で細胞を前処理することによって、ＥＲからより大きく巨大なオルガネラの形成が可能となる。膨潤形成前に１２～２４時間、ラパマイシンを添加することによって、エンドソーム、リソソーム、オートリソソーム及び多胞体からより大きく巨大な細胞外オルガネラ小胞を形成することが可能になる。膨潤及び抽出前にバフィロマイシンを添加することによっても、オートファゴソームに由来する、より大きな巨大な細胞外オルガネラ小胞を得ることが可能になる。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、当該方法は更に、工程ａ）の後及び工程ｂ）の前に、細胞の細胞骨格及び細胞外マトリックスの両方を破壊するために、約０．０１秒～１０分間にわたって、約０．０１ｍ／ｓ～１０ｍ／ｓの範囲の速度で細胞を移動させる、低張水性培養液の前後運動を発生させることを含む工程ａ’）を含む。したがって、工程ａ）の膨潤細胞に適用されるこの任意の工程ａ’）によって、工程ｂ）にてさほど重要ではない伸展膜張力を更に印加して細胞を溶解し、これらを完全開口して溶解なしでＧＥＯＶを放出することが可能になる。これは、細胞骨格が細胞の原形質膜に更なる抗力をもたらすことが理由である。そのため、工程ａ）の膨潤細胞及びオルガネラがかかる運動に供されないときには、工程ｂ）で必要となる平均溶解張力は、約７ｍＮ／ｍ（一部の細胞溶解は、実施例に示されるように、約１ｍＮ／ｍ未満、その他は約１０ｍＮ／ｍ）であるが、工程ａ’）で前述の運動に供された工程ａ）の膨潤細胞及びオルガネラが工程ｂ）で必要となる平均溶解張力は、約２ｍＮ／ｍ（細胞溶解の大部分は、実施例に示されるように、１ｍＮ／ｍ未満の張力）である。したがって、溶解することなく細胞に運動を供することによって、依然として内部にある巨大な（細胞内）オルガネラ小胞に損傷を与えることなく更なる溶解張力を低下させることが可能になる。本文献では、膜破裂は、ほぼ常に細胞溶解に関係する。本発明の方法では、細胞溶解によって、細胞の内容物（オルガネラを含む）のすべて、又はほぼすべてが細胞外培養液へと放出される。最新の技術は、膜破裂後に何が起こるかを示してはおらず、細胞内化合物の放出がないことを理由にして細胞溶解という用語が誤って使用されている。事実、原形質膜破裂によって小胞形成、又は閉鎖する二重膜孔の開口がもたらされることは極めて一般的である。こうした場合、最新の技術は原形質膜破裂及び／又は細胞溶解測定といった用語に言及しているが、オルガネラは全く放出されていない。このことは膜破裂及び／又は細胞溶解があることが理由なのではなく、細胞内含有物が放出されることが理由である。本発明の方法によって、穏やかな溶解により細胞を溶解させることなく、細胞溶解に達する膜張力、原形質膜のすべての除去、及び細胞由来のＧＥＯＶ（実施例１に示される）のすべて、又はほぼすべての放出を劇的に減少（２ｍＮ／ｍ以下）することが可能になる。

本発明の方法の特定の実施形態によれば、工程ｂ）は、細胞の原形質膜を迅速に破壊するものの、低張水性培養液中で溶解細胞から放出された巨大な（細胞外）オルガネラ小胞の構造を保持するために、１０^－４～１００秒間にわたって、１０^－３～５ｍＮ／ｍ、好ましくは５．１０^－３～４ｍＮ／ｍ、より好ましくは１０^－２～２ｍＮ／ｍ、更により好ましくは１０^ー２～１ｍＮ／ｍ、最も好ましくは５．１０^－２ｍＮ／ｍ～０．７５ｍＮ／ｍの範囲である伸展膜張力（二重膜張力）を細胞に印加するために実施される。概して、本発明の方法によって、約２ｍＮ／ｍ未満の値に伸展膜張力を低下させて、ＧＥＯＶを培養液中へと抽出かつ回収することが可能になる。細胞を溶解するための最新の技術から公知である通常の伸展膜張力が平均で５ｍＮ／ｍより高いものである場合であっても、すべてのオルガネラは、培養液中へとその内容物を放出する細胞外ナノ小胞へと断片化される。したがって、特許請求されるＧＥＯＶとは異なり、それ以上操作可能ではない。工程ｂ）は、機械的力（例えば、吸引圧、伸展、せん断又は音波）、化学薬剤及び／又は界面活性剤、電界又はレーザ（光）励起を使用することで実施され得る。例えば、機械的力は、予想される細胞への伸展膜張力を発生させる吸引圧（概して、約０．１～６００ｍｂａｒ、より好ましくは約５～２００ｍｂａｒ（前述のバルク技術は、１ｂａｒよりもはるかに大きい圧力を使用する）を有するマイクロピペット（約０．５～２０μｍの半径）を用いて印加され、これによって原形質膜の溶解と、巨大な細胞外オルガネラ小胞の回収がもたらされる（実施例の節を参照されたい）。例えば、本発明の方法の工程ａ）による細胞膨潤及び巨大な細胞内オルガネラ小胞形成後、数秒間（例えば、０．１～１００秒間）にわたる超音波範囲（好ましくは、約１６ｋｈｚ～１０００ｋｈｚ、より好ましくは約２０ｋｈｚ～４００ｋｈｚ）の音場（圧力波）によって予想される細胞への伸展膜張力を発生させることが可能になり、これによって原形質膜の溶解と、巨大な細胞外オルガネラ小胞の回収がもたらされる（実施例の節を参照されたい）。例えば、本発明の方法の工程ａ）による細胞膨潤及び巨大な細胞内オルガネラ小胞形成後、例えば、カルボン酸（原形質膜溶解を発生させるのに十分な濃度を有する）、ＴｒｉｔｏｎＸ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＰＳＯ及びその他のものなど、界面活性剤として機能する化学物質は、制御方式で添加され、原形質膜の溶解と巨大な細胞外オルガネラ小胞の回収をもたらす、予想される細胞への伸展膜張力を生成することができる。界面活性剤を使用することで、巨大なオルガネラの特性が修飾される（実施例の節を参照されたい）。

本発明の方法によれば、巨大な細胞外オルガネラ小胞は、任意の標識を行うことなく工程ｃ）から回収され、光学的アプローチ、形態学的アプローチ、機械的アプローチを含むいくつかの非侵襲的方法を使用することで後で分類され得る。ただし、本発明の方法の特定の実施形態によれば、工程ａ）の細胞は、オルガネラ同定を容易にするために、少なくとも１種のオルガネラタンパク質マーカ、又はオルガネラについて伝える受容分子によってトランスフェクトされた細胞、を含むことができる。例えば、細胞は、膨潤前後に使用される蛍光物質又は化学マーカを用いてタグ付けされた少なくとも１種のオルガネラタンパク質でトランスフェクトされる。例えば、ＫＤＥＬはＥＲ内腔に印をつけ、Ｔｏｍ２０はミトコンドリアに印をつけ、ＬＣ３Ｂはオートファゴソームに印をつけ、Ｌａｍｐ１はリソソームに印をつけ、Ｇｏｌｇｉ７はゴルジ体に印をつける。

本発明はまた、本発明の方法で得られる巨大な細胞外オルガネラ小胞に関し、当該巨大な細胞外オルガネラ小胞が、以下を特徴とする。
ａ）二重膜結合した内腔体積を有し、少なくとも３μｍ^－１、２μｍ^－１、１．５μｍ^－１、１．２μｍ^－１、１μｍ^－１、０．８５μｍ^－１、０．７５μｍ^－１、０．６６μｍ^ー１、０．６μｍ^－１、０．５μｍ^－１、０．４２μｍ^－１、０．３８μｍ^－１、０．３３μｍ^－１、０．２８μｍ^－１、０．２５μｍ^－１、０．２μｍ^－１、０．１５μｍ^－１未満の体積に対する表面積比を有する。
ｂ）小胞体、ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ体、液胞、葉緑体、オートファゴソーム、オートリソソーム、エンドソーム、ペルオキシゾーム、多胞体を包含する、供給源である細胞のオルガネラから産生される。
ｃ）それらが産生される供給源となる細胞の原形質膜によって取り囲まれているが、これは、ＧＥＯＶが細胞外培養液中にあることを意味している。
ｄ）タンパク質、脂質及び代謝産物から構成される膜及び内腔を有し、生化学組成物は、ＧＥＯＶが産生されるオルガネラの全組成の一部であり、この割合は、少なくとも、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、１００％よりも大きい。
ｅ）少なくとも５μｍ^３、１５μｍ^３、３０μｍ^３、６０μｍ^３、１００μｍ^３、１８０μｍ^３、２６０μｍ^３、３８０μｍ^３、５２０μｍ^３、１０００μｍ^３、１５００μｍ^３、２０００μｍ^３、３０００μｍ^３、４５００μｍ^３よりも大きい体積を有する。
ｆ）すべての空間方向において、少なくとも２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１４μｍ、１６μｍ、１８μｍ、２０μｍよりも大きいサイズを有する。
ｇ）他のＧＥＯＶとの接触を一切有さないか、１箇所有するか、複数箇所有する。
ｈ）細胞質基質生体分子、微小管、アクチン、フィラメント、細胞核、脂質滴、リボソーム、中心小体、ペルオキシゾーム、原形質膜及びその他のオルガネラといった細胞成分と一切接触しないか、１箇所で接触するか、複数箇所で接触する。

本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞は、異なる細胞成分、又はその他のＧＥＯＶ（図４Ａ～図４Ｃに示される）と接触した状態である対象の任意の種類のタンパク質とともに回収することができる。最初にこれらの細胞外複合構造を産生かつ操作することによって、新規方法による細胞成分間でのオルガネラの相互作用と、細胞内タンパク質及び脂質の役割とを研究することが可能になる。創薬、標的とバイオマーカの同定における新規用途は、かかるＧＥＯＶ複合構造を使用して展開され得る。

本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞は、機能的であり、当該ＧＥＯＶが中性種及びイオンを輸送し（例えば供給源となる細胞といった参照用細胞における膜輸送活性の膜輸送タンパク質活性のうち、少なくとも０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の範囲である膜輸送タンパク質活性）、例えば供給源となる細胞といった参照用細胞における膜輸送活性の膜輸送タンパク質活性のうち、少なくとも０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の範囲であるタンパク質活性を含む。本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞は貯蔵されることができ、後に研究目的で送達され得る。本発明の巨大な細胞外小胞は、少なくとも１、２、３、６若しくは１２時間、１、２、３、４、５若しくは６日間、１、２、３若しくは４週間、１、２、３若しくは６ヶ月間、又は１、２、３、４若しくは５年間にわたって、４℃未満、又は－２０℃未満、又はー８０℃未満の温度で安定状態にある。

本発明はまた、対象の分子の活性をスクリーニングするための方法であって、当該方法が、
ａ）少なくとも１種類の本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞と対象の分子を接触させることと、
ｂ）当該少なくとも１種類の巨大な細胞外オルガネラ小胞のフラックスとの相互作用を通じて、対象分子の活性の調整を測定することと、
ｃ）工程ｂ）で測定された活性と、何らかの接触前の対象分子の初期活性とを任意選択的に比較することと
を含む、方法に関する。

そのため、本発明のスクリーニングのための方法によって、巨大な細胞外オルガネラ小胞上の少なくとも１種のタンパク質と相互作用する対象分子の能力を測定すること、例えば、本発明によって得られる巨大な細胞外オルガネラ小胞に局在する少なくとも１種のタンパク質を有する任意の薬物候補の有効性、親和性、選択性、特異性、毒性、バイオアベイラビリティ、薬理動態、透過性をスクリーニングすることが可能になる。更には、本発明の方法によって、例えば巨大な細胞外オルガネラ小胞間の接触伝達の調節、当該巨大な細胞外オルガネラ小胞を標的とする分子の同定、巨大な細胞外オルガネラ小胞の活性を遮断する分子の毒性の検査も可能になり得る。そのため、この方法によって、正確な医療と、健常な／疾患状態の患者から直接抽出した巨大な細胞外オルガネラ小胞上で認識される早期診断が可能になる。

本発明はまた、対象の分子の活性をスクリーニングするための、本発明による少なくとも１種類の巨大な細胞外オルガネラ小胞の使用に関する。本発明の当該少なくとも１種類の巨大な細胞外オルガネラ小胞薬物、タンパク質（例えば、障害に関与するもの）又はイオンといった化合物の相互作用又は影響並びにその間の接触及び伝達はしたがって、巨大な細胞外オルガネラ小胞の生成及び回収前に評価され得る。本発明の巨大な細胞外オルガネラ小胞はしたがって、生化学反応を研究するため、又は例えば疾患状態の患者から疾患のパターンを定義し、彼らと健常な患者とを比較することによって疾患を診断するために使用され得る。

本発明はまた、本発明による担体としての巨大な細胞外オルガネラ小胞の少なくとも１種類の使用に関する。こうした使用によって、薬物送達用途については、外因性分子、又は巨大な細胞外オルガネラ小胞の生成前に細胞によって発現される分子／タンパク質といった、対象の分子のカプセル化又は隔離が可能になる。

（Ａ）上部：蛍光原形質膜タンパク質（ＧＰＩ－ｍｃｈｅｒｒｙ）を過剰発現しているＣｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表し、核はＨｏｅｔｓｃｈを用いて探索された。下部：工程ａ）の低張水性培養液と接触した状態である膨潤Ｃｏｓ７の共焦点顕微鏡のスナップを表し、細胞は上述のものと同じトランスフェクションを有する。（Ｂ）工程ａ）前に蛍光性の体積ＥＲタンパク質（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ）と膜ミトコンドリアタンパク質（Ｍｆｎ２－ＹＦＰ）との両方を過剰発現するＣｏｓ７細胞の、共焦点顕微鏡のスナップを表す。（Ｃ）工程ａ）後に蛍光性の体積ＥＲタンパク質（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ）と膜ミトコンドリアタンパク質（Ｍｆｎ２－ＹＦＰ）との両方を過剰発現する膨潤Ｃｏｓ７細胞の、共焦点顕微鏡のスナップを表す。これらのスナップは、巨大な（細胞内）オルガネラ小胞（ＧＩＯＶ）の形成を明確に示した：ここでは、小胞体の巨大な細胞内オルガネラ小胞（ＥＲ－ＧＩＯＶ）と、ミトコンドリアの巨大な細胞内オルガネラ小胞（Ｍｉｔｏ－ＧＩＯＶ）とが可視化されており、一部は、０．６μｍ^－１未満の体積に対する表面積の比を有する（サイズについては１０μｍよりも大きい）。（Ｄ）以下のオルガネラ：ＥＲ（ＥＲ－ＧＩＯＶ）、ミトコンドリア（Ｍｉｔｏ－ＧＩＯＶ）、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ－ＧＩＯＶ）、オートファゴソーム／オートリソソーム（Ａｕｔｏ－ＧＥＯＶ）、リソソーム（Ｌｙｓｏ－ＧＥＯＶ）、エンドソーム（Ｅｎｄｏ－ＧＩＯＶ）、多胞体（ＭＶＢ－ＧＩＯＶ）から生み出される各種類のＧＩＯＶを区別するための長方形のパネルを表す。核は、ＧＩＯＶとは見なされない。（Ｅ）化学物質を添加することなく、工程ａ）後の各種類のオルガネラについてのＧＩＯＶの平均直径のプロットを表す。図１Ｄに関連する。平均＋／－標準偏差であり、ｎは、各条件について分析されたオルガネラ数を報告する。分析されたすべてのＧＩＯＶは球状であった。これは、３μｍよりも大きい球状サイズを有する（例えば、２μｍ^－１未満の体積に対する表面積の比を有する）ＧＩＯＶの形成を示す。核は、ＧＩＯＶとは見なされない。（Ｆ）オルガネラの種類に応じたＧＩＯＶ直径の相対頻度分布のプロットを表す。図１Ｄ～図１Ｅに関する。核は、ＧＩＯＶとは見なされない。 （Ａ）工程ａ）後に、以下の蛍光タンパク質：ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ（ＥＲ－ＧＩＯＶの体積マーカ）、ｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎ（Ｍｉｔｏ－ＧＩＯＶの膜マーカ）並びにＥＲ－ＧＩＯＶ（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌを含むＰ５８シグナル）及びＧｏｌｇｉ－ＧＩＯＶ（Ｇｏｌｇｉの巨大な細胞内オルガネラ小胞）（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌを含まないＰ５８シグナル）について伝えるＰ５８－ＧＦＰを過剰発現する膨潤Ｃｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。（Ｂ）化学物質（ノコダゾール）を用いて、工程ａ）前及び工程ａ中（低張培養液と混合される）に１時間インキュベートされた、図２Ａと同じタンパク質を過剰発現する膨潤Ｃｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。工程ａ）前後でノコダゾールを添加することによって、微小管の組織化を妨害することが可能になり、平均してより大きなＥＲ－ＧＩＯＶの産生がもたらされる。（Ｃ）工程ｃ）後に産生されたＥＲ（ＥＲ－ＧＥＯＶ）の巨大な細胞外オルガネラ小胞の可視化を表す。工程ａ）前にＣｏｓ７細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ－ｃｌｉｍｐ６３タンパク質を過剰発現することによって、より大きな（サイズにして２０μｍ超であり、０．３μｍ^－１よりも小さい体積に対する表面積の比を有する）ＥＲ－ＧＥＯＶを産生することが可能になる。（Ｄ）工程ａ）で検査された３つの異なる条件を区別するために使用される異なるマーカを示す長方形パネルを表しており、これによって工程ｃ）後にＥＲ－ＧＩＯＶの異なるサイズ分布がもたらされる。（Ｅ）パネル２Ｄの各条件についての、工程ｃ）後に産生されたＥＲ－ＧＩＯＶの平均直径のプロットを表す。平均＋／－標準偏差であり、ｎは、各条件について分析された小胞の数を報告する。（Ｆ）パネル２Ｄの各条件についての、ＥＲ－ＧＩＯＶ直径の相対頻度分布のプロットを表す。（Ｇ）工程ｃ）後に産生された、すなわち、ｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎ又はＭｆｎ２－ＹＦＰを過剰発現する細胞から回収された２つの異なる種類のＭｉｔｏ－ＧＩＯＶを定義する長方形パネルを表す。（Ｈ）図２Ｇの両方の条件についてのＭｉｔｏ－ＧＩＯＶの平均直径のプロットを表す。平均＋／－標準偏差であり、ｎは、各条件について分析された小胞の数を報告する。Ｍｆｎ２－ＹＦＰ（ミトコンドリア接触部位及び融合に関連するミトコンドリアタンパク質）を過剰発現することによって、５μｍよりも大きい（すなわち、１．２μｍ^－１よりも小さい体積に対する表面積の比）より多くのＥＲ－ＧＩＯＶを更に産生することが可能になる。（Ｉ）Ｍｉｔｏ－ＧＩＯＶ直径（図２Ｇ～図２Ｈに関連する）の相対頻度分布のプロットを表す。 工程ｃ）後に産生された異なるオルガネラから誘導されたＧＥＯＶ（蛍光レポータ：ＥＲ－ＧＥＯＶ：ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ；Ｍｉｔｏ－ＧＥＯＶ：ｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎ；Ｅｎｄｏ－ＧＥＯＶ：ｐｍＣｈｅｒｒｙ－２Ｘ－ＦＹＶＥ；Ｇｏｌｇｉ－ＧＥＯＶ：Ｐ５８－ＧＦＰ；Ｌｙｓｏ－ＧＥＯＶ：ｐＭＲＸＩＰ Ｌａｍｐ１－Ｖｅｎｕｓ；Ａｕｔｏ－ＧＥＯＶ：ＬＣ３－ＥＧＦＰ）の共焦点顕微鏡を表す。これらの工程後、本発明者らはまた、示されている膨潤核（Ｈｏｅｓｔｃｈ３３３４２）及び原形質膜小胞（ＧＰＩ－２ｘｍＣｈｅｒｒｙ）も得る。このパネルは、サイズ（すなわち、体積に対する表面積）にして５μｍよりも大きい各種類のＧＥＯＶを示す。（Ｂ）膜溶解を引き起こすために、例えばマイクロピペットを用いて印加され得る、細胞又はＧＥＯＶの膜表面張力を計算するための、ラプラスの法則から導出された数式を表す。ΔＰは、マイクロピペットへと加えられる吸引圧に対応し、Ｒ_ｐは、ＧＥＯＶの吸引された膜部分の半径に対応し（この場合では、これはマイクロピペット半径に対応する）、Ｒ_小胞は、ＧＥＯＶの半径に対応する。（Ｃ）ＧＥＯＶ及び原形質膜小胞の溶解を引き起こすために印加される膜張力のプロットを表す。これらの測定は、工程ｃ）後に産生されたＧＥＯＶ及び原形質膜小胞に実施された。 対象の異なる種類のタンパク質を過剰発現するＣｏｓ７細胞から、工程ｃ）後に産生されたＧＥＯＶ：上段は、ＹＦＰ－セイピン及びｓｅｃ６１β－ｍＣｈｅｒｒｙによって覆われたＥＲ－ＧＥＯＶ、中段は、ｄＧＡＴ１－ＥＧＦＰ及びｓｅｃ６１β－ｍＣｈｅｒｒｙによって覆われたＥＲ－ＧＥＯＶ、下段は、Ｍｆｎ２－ＹＦＰ及びｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎによって覆われ、ＥＲ－ＧＥＯＶと接触した状態で回収されたＭｉｔｏ－ＧＥＯＶの共焦点顕微鏡のスナップを表す。（Ｂ）共焦点顕微鏡のスナップを表し、ここではＧＥＯＶは、他のＧＥＯＶ又は細胞成分と接触した状態で産生される：上段には、脂質滴（Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬでタグ付けされている）と接触した状態で産生かつ単離されたＥＲ－ＧＥＯＶ（ｓｅｃ６１β－ｍｃｈｅｒｒｙ）が示されている。中段には、Ｍｉｔｏ－ＧＥＯＶ（ｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎ）と接触した状態で産生かつ単離されたＥＲ－ＧＥＯＶ（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ）が示されている。下段は、ペルオキシゾームと接触した状態で産生かつ単離されたＥＲ－ＧＥＯＶ（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ）を表す。（Ｃ）工程ｃ）後に回収された核（Ｈｏｅｓｔｃｈ３３３４２）と接触した状態で産生かつ単離されたＥＲ－ＧＥＯＶ（半球状小胞のように見える）の共焦点顕微鏡のスナップを表しており、これらのオルガネラ間の大きな接触領域を明らかにした。これらのＥＲ－ＧＥＯＶは特定の場合である。これは、球状ではないが依然として二重膜結合しており、かつ核と接触した状態で２μｍ^－１よりも小さい体積に対する表面積の比で細胞外に存在するからである。 （Ａ）工程ｃ）後に産生され、次いで３７℃でオレオイルＣｏＡ（ＮＢＤ－オレイルＣｏＡで補完）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とを与えたＥＲ－ＧＥＯＶ（ｓｅｃ６１β－ｍｃｈｅｒｒｙ）のスナップを表す。ＥＲ－ＧＥＯＶが、その膜上にｄＧＡＴ酵素を有するため（図４Ａに関連する、中段）、ＥＲ－ＧＥＯＶにオレイルＣｏＡ－ＮＢＤシグナルを組み込むことで、期間中、ＥＲ－ＧＥＯＶ膜上でのトリグリセリド合成が可視化されている。以下のこのシグナルによって、ＥＲタンパク質活性を介したＥＲ－ＧＥＯＶ機能性を提供することが可能になる。（Ｂ）供給実験（図５Ａに関連する）中にＥＲ－ＧＥＯＶ膜におけるオレオイルＣｏＡ－ＮＢＤの蛍光シグナルのプロットを表す。 （Ａ）工程ａ）後の膨潤Ｃｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。細胞は球状であり、その原形質膜は無傷である。膨潤細胞内部に捕捉された大量のＧＩＯＶは、可視化されることができる。（Ｂ）工程ａ）、及び工程ｂ）として蛍光性界面活性剤と混合された界面活性剤（オレイン酸）の添加後のＣｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。ａ）後でこうした界面活性剤を添加することによって、原形質膜の破壊及びＧＥＯＶの放出によるバルク中でのＧＥＯＶの産生が可能になる。ＧＥＯＶの膜は界面活性剤もまた組み込むが、界面活性剤は、組成、特性、膜の生物物理学的パラメータ並びにタンパク質の折りたたみ及び活性の両方を修飾することができる。（Ｃ）原形質膜を音場に供することによって実施された工程ａ）、工程ｂ）後のＣｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。正確には、細胞は超音波（約４０ｋｈｚの音波）に５分間供された。この音場によって、バルク中で一部のＥＲ－ＧＥＯＶ（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌとともに伝えられる）の放出が可能になる。一部の細胞は依然として無傷であるが、超音波パラメータの正確な制御は、細胞を破壊することなくＧＥＯＶを回収するために重要であることを意味する。 工程ａ）後の膨潤ｃｏｓ７細胞の共焦点顕微鏡のスナップを表す。工程ａ）は、低張水性バッファの浸透圧を１５０ｍＯｓｍから７５ｍＯｓｍ、３０ｍＯｓｍ、最終的に２０ｍＯｓｍへと順次変更することによって実施された。細胞は、各培養液で５分間インキュベートし、最後のものと接触した状態で画像化した。工程ａ）前には、細胞をトランスフェクトして、ＥＲ－ＧＩＯＶ（ＲＦＰ－Ｋｄｅｌ及びｋｄｅ－ＥＧＦＰ）並びにＭｉｔｏ－ＧＩＯＶ（ｍｃｈｅｒｒｙ－ＴＯＭＭ２０－Ｎ）を可視化した。細胞及び内部オルガネラ小胞は、効率的には膨潤しない：一部のＥＲ－ＧＩＯＶは球状ではなく、一部は非常に小さい（Ｍｉｔｏ－ＧＩＯＶは、３μｍよりも大きい）。連続的な膨潤のこれらの工程ａ）によって、大きなＧＩＯＶ及び球状細胞形成（溶解がより容易である）はもたらされない。これは、工程ａ）を調節することがＧＥＯＶの産生にとって非常に重要であることを示している。 Ａ）工程ａ）＋ａ’）に供された細胞に対して、工程ａ）に供された無傷の膨潤細胞（ＧＩＯＶを含有する）の原形質膜溶解張力のプロットを表す。工程ｂ）の張力は、５９秒未満にわたって印加された。平均＋／－標準偏差が示される。Ｂ）工程ａ）のみに供された無傷の膨潤細胞（ＧＩＯＶ）についての原形質膜溶解張力事象の相対頻度分布を表す。工程ｂ）の張力は、５９秒未満にわたって印加された。このプロットは、細胞が大きな二峰性分布を有することを示す。一部の細胞は、２ｍＮ／ｍ未満の溶解張力を有するが、その他の細胞は、５ｍＮ／ｍよりも大きい溶解張力（先行技術の範囲内）を有する。これらのうち最高の溶解張力を有するものは、ＧＥＯＶを破壊することなく穏やかな条件で溶解することが困難である（これは、図３Ｃに示されるその溶解張力値による）。Ｃ）工程ａ）とａ’）（工程ａ）と同様）との両方に供された無傷の膨潤細胞についての原形質膜溶解張力の相対頻度分布を表す。工程ｂ）の張力は、５９秒未満にわたって印加された。膨潤細胞の大部分は、２ｍＮ／ｍ未満の非常に低い溶解張力を有する（細胞の５０％超は、これらの条件では０．７５ｍＮ／ｍ未満の溶解張力を有する）。これは、ほとんどすべてのＧＥＯＶの溶解張力値よりも低い（図３Ｃ）。工程ａ’）によって、細胞の溶解が容易になり、工程ｃ）後により大きく、より多くのＧＥＯＶを回収することが可能になる。 Ａ）工程ａ）（インキュベーション＝１３分）、ａ’）、ｂ）及びｃ）後に産生されたＥＲ－ＧＥＯＶの共焦点顕微鏡のスナップを表す。これらのＥＲ－ＧＥＯＶは、１０μｍよりも大きいサイズ（すなわち、０．６μｍ^－１よりも小さい体積に対する表面積の比）を呈し、１つの細胞のみを抽出する。非常に強い浸透圧ショックで工程ａ）を調節し、工程ａ’）を加え、工程ｂ）の印加された張力を減少させることによって、最終的には１つの単独細胞からこれらのより大きなＥＲ－ＧＥＯＶすべてを産生することが可能になる。

実施例１：膨潤後に機械的力（吸引圧）を使用して巨大なオルガネラ小胞を生み出し、これを回収するための方法

細胞培養
Ｃｏｓ７哺乳動物細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）にて維持した。ＧＥＯＶの産生プロトコール前に、ＤＭＥＭ培地中にて、３７℃、５％ＣＯ_２で細胞を４８時間培養した。更には、細胞を指示されるプラスミドで２４時間トランスフェクトし、本発明の方法の工程ａ）前のオルガネラ、工程ａ）のＧＩＯＶ及び工程ｃ）後のＧＥＯＶを探索した。細胞を、接着剤で前処理した、又は前処理していない接着皿で培養した。

巨大な細胞外オルガネラ小胞について伝える細胞トランスフェクション
ＧＥＯＶ産生の２４時間前に、細胞を蛍光タンパク質構築物（例えば、ｅＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ）と融合した異なるプラスミドでトランスフェクトした。これらのプラスミドは、異なるＧＥＯＶについて伝えるタンパク質を発現するように機能する。Ｋｄｅｌ及びＳｅｃ６１βプラスミドを使用して小胞体を同定し、Ｔｏｍ２０及び／又はＭｉｔｏｆｕｓｉｎＩＩプラスミドを使用してミトコンドリアを同定し、ゴルジ体についてはＧＰ５８又はＫｄｅ、エンドソームについてはＦＹＶＥ、オートファゴソームについてはＬＣ３、並びにリソソームについてはＬａｍｐ１を同定した。

巨大な細胞内オルガネラ小胞形成及びサイズ分布測定
巨大な細胞内オルガネラ小胞の形成については、細胞がコンフルエントになる前に、細胞培地を、３７℃及び５％ＣＯ_２で、Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．４を用いて希釈した。工程ａ）後、すなわち膨潤後及びＧＥＯＶ産生前の膨潤細胞を参照されたい（図１Ｃ）。細胞の種類（１００ｍＯｓｍ／Ｌ～０．１ｍＯｓｍ／Ｌ）に応じて、膨潤溶液の浸透圧勾配を制御し、工程ａ）前及び／又は工程ａ）中にこれを調整した。工程ａ）中には、浸透圧勾配をある一定時間にわたって変更して調節し（図７Ａ）、ＧＩＯＶのサイズ分布及び細胞膨潤速度を制御することもできる。細胞膨潤（工程ａ））後、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎｅ、ＢＳＡ）１０％ｖ／ｖで前処理したガラスプレート上の透明な低張培養液中に、細胞溶液を注入した。次いで、各種類のＧＩＯＶを同定するための異なるタンパク質マーカを使用し、無傷の膨潤細胞について、共焦点顕微鏡のスナップを撮影した。ＧＩＯＶのサイズ分布について伝えるこれらの膨潤細胞の各スタック（スライスあたり１μｍ）について、各ＧＩＯＶの直径を測定した（図１Ｅ～図１Ｆ）。本発明者らはマイクロメートルを超える小胞に関心があったため、サイズ分布測定については０．７５μｍ超のサイズを有する小胞のみを検討した。

巨大な細胞外小胞のサイズ制御
ＧＥＯＶの産生を制御するために、低張水性培養液を使用してオルガネラの膨潤を実行した（図２Ａ）。化学薬剤をこの培養液に加えることによって、工程ｃ）後に産生されるＧＥＯＶの分布を更に制御することが可能になる（図２）。

巨大な小胞体（ＥＲ－ＧＥＯＶ）のサイズを増大させるために、本発明者らは工程ａ）の１時間前と工程ａ）中に、培地に２．５μＭノコダゾールを加えた（図２Ｂ）。他の条件を示すが、ここでは、工程ａ）前にＥＲ膜形成タンパク質であるＣｌｉｍｐ６３で細胞をトランスフェクトした（図２Ｃ）。ノコダゾールを用いるプロトコールによって、ノコダゾールを用いない場合よりも高い割合で巨大なＥＲを形成することが可能であった（図２Ｄ～図２Ｆ）。更には、細胞中でタンパク質Ｃｌｉｍｐ６３を過剰発現することによって、巨大なＥＲ－ＧＥＯＶ（１５μｍ～３５μｍ）の形成が可能になった（図２Ｄ～図２Ｆ）。

膜形成タンパク質を過剰発現するというこの考えに従い、Ｍｉｔｏ－ＧＥＯＶのサイズもまた調節した。ＴＯＭ２０ミトコンドリア膜タンパク質の代わりにｍｉｔｏｆｕｓｉｎＩＩタンパク質を過剰発現させた（図２Ｈ対図２Ｉ）。ｍｉｔｏｆｕｓｉｎＩＩタンパク質を過剰発現させることによって、より大きなＭｉｔｏ－ＧＥＯＶを形成することが可能になった（図２Ｇ～図２Ｉ）。

工程ａ’）及び近い将来に産生されたＧＥＯＶの実行可能性
細胞を膨潤し、低張培養液の前後運動にこれを供する条件下において（工程ａ’）。
工程ａ’）は５秒間にわたって実施される。前後運動は、低張水性培養液の全体積に対して、続けて３回実施される。この工程によって、細胞の細胞骨格を不安定化し、その溶解張力を減少させることが可能になる（図８）。これによって、原形質膜溶解中にこれらを溶解し、除去することなく（より良好なサイズ分布の）ＧＥＯＶの産生がもたらされる（図９）。

巨大な細胞外オルガネラ小胞及び細胞溶解張力測定：
巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）の二重膜溶解張力の推定値を決定するため、マイクロピペット吸引技術を使用した。マイクロピペット半径は約１μｍであった。わずかな吸引によって、ＧＥＯＶの舌状の二重膜（又は原形質膜）をマイクロピペットへと吸引した。次いでおよそ１０ｍｂａｒ／分で吸引を増加させ、これによって二重膜表面張力の比例的な増加を引き起こした。印加された特定の張力では、ＧＥＯＶ（又は原形質膜）は、細孔開口によって破裂した。したがって、測定された溶解張力を二重膜の破裂直前に到達したより高い張力として利用した。ラプラスの法則、並びにピペットの内径（Ｒ_ｐ）、小胞半径（Ｒ_小胞）及び界面の吸引圧ΔＰ、印加された表面張力γを計算した。
小胞

シリンジを使用して印加された吸引圧を実行した。得られた圧力を、圧力変換器（ＤＰ１０３、Ｖａｌｉｄｙｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｒｔｈ－ｒｉｄｇｅ，ＣＡ）を用いて測定し、デジタル電圧計を用いてこの出力電圧をモニタリングした。実験前に圧力変換器（範囲５５ｋＰａ）を較正した。

細胞溶解及び原形質膜の開口による、巨大な細胞外オルガネラ小胞の放出の調整。
工程ｂ）についての一例として、共焦点顕微鏡下で細胞を顕微鏡操作した。巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）を培地で観察した。原形質膜の溶解及び除去によって、巨大な細胞外オルガネラ小胞を放出した（データは示さず）。ＧＥＯＶを破壊することなくこれらの放出を生み出すように原形質膜に印加する張力を定量化するために、ＧＥＯＶの溶解表面張力、原形質膜小胞及び無傷の膨潤細胞（ａ）又はａ）＋ａ’）に供される）を測定し、平均化した（図３Ｃ及び図８Ａ～図８Ｃ）。平均して、工程ａ’）の無傷の膨潤細胞は、工程ａ’）に供されていない無傷の膨潤細胞よりも著しく低い溶解表面張力を有する（図８Ａ～図８ＣＤ）。工程ｃ）後には、原形質膜小胞の溶解張力は、その他のＧＥＯＶすべてよりも大幅に低いことが見出された（図３Ｃ）。平均して、ＧＥＯＶは、工程ａ’）に供された異なる種類の原形質膜（ａ）＋ａ’）の無傷の膨潤細胞、ａ）の一部の無傷の膨潤細胞、ｃ）の原形質膜小胞）よりも高い膜溶解張力（図３Ｃ及び図８Ａ～図８Ｃ）を有する。最終的には、ａ）とａ’）とを組み合わせることによって、大部分の細胞にとっては、非常に低い範囲の表面張力（０．７５ｍＮ／ｍ未満）で細胞溶解を引き起こすことが可能になる。これは、抽出中にＧＥＯＶ溶解を引き起こすことを防止する。かかる方法によって、機能的かつ安定しており、他のＧＥＯＶ又は細胞成分と接触している状態又は接触していない状態である、巨大な細胞外オルガネラ小胞を回収することが可能になる。

対象のタンパク質を発現する巨大な細胞外オルガネラ小胞
本発明の非常に大きな可能性のうちの１つは、選択されたタンパク質又はいくつかの選択されたタンパク質を過剰発現しているＧＥＯＶの産生である（図４Ａ）。

接触状態にある巨大な細胞外オルガネラ小胞は単離される
工程ｃ）後に、その他のＧＥＯＶと接触した状態のＧＥＯＶもまた産生し、これを単離する（ＥＲ－ＧＥＯＶ／Ｍｉｔｏ－ＧＥＯＶ接触及びＥＲ－ＧＥＯＶ／脂質滴）（図４Ｂ）。特定の系もまた、ＥＲ－ＧＥＯＶ／核接触と同様に単離した（図４Ｃ）。

実施例２：膨潤後に工程Ｂ）にて界面活性剤を使用して巨大な細胞外オルガネラ小胞を生み出すための方法

巨大な細胞内オルガネラ小胞形成：実施例１と同様のプロトコール
化学物質又は界面活性剤を加えることによる細胞溶解によっての巨大な細胞外オルガネラ小胞の放出の制御（図６Ｂ）
細胞の培養、トランスフェクション及び浸透、すなわち工程ａ）後に、界面活性剤として作用する化学物質を加えた。オレイン酸（界面活性剤）溶液（１０％ＢＳＡを含むＨ_２Ｏ中に可溶化）を、４００μＭ膨潤細胞溶液に加えた（Ｂｏｄｉｐｙ－Ｃ_１２蛍光プローブを加え、膜でのオレイン酸の組み込みを可視化した）。数分後、細胞を画像化した。巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）を産生し、原形質膜溶解及び除去を呈する細胞の外側で可視化された。

内部に捕捉された巨大な（細胞内）オルガネラ小胞を含む膨潤細胞上にこれらの化学物質を加えることによって、巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）の抽出及び回収が可能になる。予想されるように、ＧＥＯＶの膜内部に界面活性剤を蓄積させることによってＧＥＯＶの膜を修飾した（図６Ｂ）。

実施例３：膨潤後に超音波を使用して巨大な細胞外オルガネラ小胞を産生し、これを生み出すための方法（図６Ｃ）

巨大な細胞内オルガネラ小胞形成：実施例１と同様のプロトコール
細胞を音場に供する巨大な細胞外オルガネラ小胞の放出の制御
細胞培養、トランスフェクション及び浸透、すなわち工程ａ）後に、原形質膜表面張力の摂動を印加し、細胞溶解を引き起こすために、膨潤細胞溶液を数秒間、バスソニケータにて音場に供した。４０ｋＨｚ超音波周波数を使用し、細胞を溶解してバルク中に巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）を放出した。

実施例４：巨大な細胞外オルガネラ小胞の機能性
本ステップでは、ＧＥＯＶのタンパク質によってオレイル－ＣｏＡの同化と形質転換との両方に関する回収された巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＧＥＯＶ）の機能性を研究した。

トリグリセリド合成ＥＲの巨大な細胞外オルガネラ小胞（ＥＲ－ＧＥＯＶ）における油の合成
トリグリセリド合成：低張培地（ＤＭＥＭ：Ｈ_２Ｏ ５：９５）にてＢＳＡ（０．５重量％）と複合体化された８ｍＭジオレイン、２ｍＭオレイル－ＣｏＡ（＋２０μＭＮＢＤ－オレイル－ＣｏＡ）の混合物を実験前に調製した。これらの産生後（すなわち、工程ｃ後）、ＥＲ－ＧＥＯＶを、５０μＬの供給混合物を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間にわたりインキュベートした。最終濃度は、２ｍＬの低張培地中でジオレイン、オレイル－ＣｏＡ及びＮＢＤ－オレイル－ＣｏＡについてそれぞれ２００μＭ、５０μＭ及び０．５μＭであった。図５Ａについては、ＥＲ－ＧＥＯＶ膜におけるＮＢＤ－オレイル－ＣｏＡの蛍光シグナルによって、ＥＲ－ＧＥＯＶにおけるオレイン酸の組み込みをモニタリングした。トリグリセリド、ジグリセリド及びリン脂質合成を同定し、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）及び質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）によって定量化した（データは示さず）。

装置
すべての顕微鏡写真を、Ｃａｒｌ ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ８００にて作製した。ガラス製カバークリップは、Ｍｅｎｚｅｌ Ｇｌａｓｅｒ（２４～３６ｍｍ ＃０）製であった。マイクロピペットは、マイクロピペットプラー（モデルＰ－２０００；Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、キャピラリ（１．０ ＯＤ ０．５８ ＩＤ １５０ Ｌｍｍ ３０－００１７ ＧＣ１００－１５ｂ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）から作製した。ＴｒａｎｓｆｅｒＭａｎ ４ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、顕微鏡操作を実施した。圧力測定ユニット（ＤＰ１０３）は、Ｖａｌｉｄｙｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇから提供された。

Claims (12)

1. 細胞から巨大な細胞外オルガネラ小胞を産生するための方法であって、前記方法が、
   ａ）前記細胞を、０．５～３０分間にわたって、０．１～１００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する低張水性培養液と接触させることと、
   ｂ）１０^－４～１００秒間にわたって、１０^－３～５ｍＮ／ｍの範囲の細胞への膜張力を印加することと、
   ｃ）前記巨大な細胞外オルガネラ小胞を前記低張水性培養液へと回収することと
   を含む、方法。
2. 工程ａ）後及び工程ｂ）前に、０．０１秒～１０分間にわたって０．０１ｍ／ｓ～１０ｍ／ｓの範囲の速度で細胞を移動させるための低張水性培養液の前後運動を発生させる工程ａ’）を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記低張水性培養液が、ノコダゾール、トリプシン、ラトランクリン、ミサキノライド、ミカロライド、アプリロニド、ビンブラスチン、ロテノン、スウィンホライド、ジャスプラキノリド、ビンクリスチン、デメコルシン、サイトカラシン、コルヒチン、ビンカアルカロイド、ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ベンゾチアゼピン、ガバペンチノイド、ブレビスタチン、ベンジルトルエンスルホンアミド、ブタンジオンモノオキシム、タプシガルギン、キセロスポンギン、ＴｒｉｔｏｎＸ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、マグネシウムからなる群から選択される１つ以上の分子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記巨大な細胞外オルガネラ小胞が産生される前記細胞が、支持体上で、若しくはバルク中で培養される、又は組織、器官、オルガノイド若しくは生物から回収される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ｃ）が、３μｍ^－１～０．１５μｍ^－１の体積に対する表面積の比を有する巨大な細胞外オルガネラ小胞を生み出す、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程ｂ）が、機械的力、化学薬剤、界面活性剤、電界又は音場、及びレーザ励起を使用して実行される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程ａ）及び工程ｂ）の前記細胞が、少なくとも１種類のオルガネラタンパク質マーカ又はオルガネラについてリポートする受容分子で予めトランスフェクトされている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法によって得られた巨大な細胞外オルガネラ小胞であって、前記巨大な細胞外オルガネラ小胞が、３μｍ^－１～０．１５μｍ^－１の体積に対する表面積の比を有することを特徴とする、巨大な細胞外オルガネラ小胞。
9. 前記巨大な細胞外オルガネラ小胞が、内腔を有し、二重膜結合しており、宿主細胞の原形質膜を含まないことを特徴とする、請求項８に記載の巨大な細胞外オルガネラ小胞。
10. 小胞体、ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ体、液胞、葉緑体、オートファゴソーム、オートリソソーム、エンドソーム、ペルオキシゾーム、多胞体、プラスチドからなる群から選択される、請求項８又は９のいずれか一項に記載の巨大な細胞外オルガネラ小胞。
11. 対象の分子の活性をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    ａ）請求項８～１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種の巨大な細胞外オルガネラ小胞のフラックスと、対象の前記分子とを接触させることと、
    ｂ）前記少なくとも１種の巨大な細胞外オルガネラ小胞の前記フラックスとの相互作用を介して対象の前記分子の前記活性を測定することと、
    ｃ）工程ｂ）で測定された前記活性と、任意の接触前の対象の前記分子の初期活性とを場合により比較することと
    を含む、方法。
12. 対象の分子の活性をスクリーニングするための、請求項８～１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種の巨大な細胞外オルガネラ小胞の使用。