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JP2024537854A - 免疫原性ｌｎｐ組成物およびその方法 - Google Patents

免疫原性ｌｎｐ組成物およびその方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ抗原、例えば、ヘマグルチニン抗原を好ましくはコードするポリヌクレオチド分子を含むリボ核酸免疫原性組成物および／またはワクチンの調製、製造および治療的使用のための組成物および方法に関し、この組成物は、凍結または凍結乾燥されている。

Description

本開示は、抗原、例えば、ヘマグルチニン抗原をコードするポリヌクレオチド分子を含むリボ核酸免疫原性組成物および／またはワクチンの調製、製造および治療的使用のための組成物および方法に関し、この組成物は、好ましくは凍結または凍結乾燥された液体である。
ＲＮＡベースのワクチンは、既存および新興の感染性疾患に対処する際の大きな将来性を示す。しかし、ワクチンＲＮＡ分子は、遍在するリボヌクレアーゼによって切断されやすい場合がある。さらに、ＲＮＡ単独では、注射の際に、容易には、細胞膜を横断して標的細胞に進入しない。ＲＮＡ送達製剤（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））は、ＲＮＡ分子を安定化し、それをリボヌクレアーゼによる分解から保護し、ＲＮＡペイロードの効率的な細胞取込みおよび細胞内送達を増強することを助けるために使用されている。しかし、ＬＮＰ製剤中でＲＮＡの長期安定性を維持することは、零下の温度での貯蔵を要求し、これは、凍結／解凍後のＬＮＰのコロイド安定性およびＲＮＡ曝露の程度に対して有害な結果を潜在的に生じ得る。
したがって、有効かつ熱安定性なＲＮＡ組成物の必要性が依然として存在する。これらの必要性などを満たすために、好ましくは筋肉内注射によってｍＲＮＡベースのワクチンおよび複製性ＲＮＡベースのワクチンの両方を効率的に送達するための、凍結乾燥可能かつ熱安定性であり得る組成物およびその方法が、本明細書で開示される。
インフルエンザに対するワクチンもまた、有効かつ熱安定性なＲＮＡ組成物の必要性を有する。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科の成員であり、それらの核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質間の抗原の差異に基づいて、３つの型（Ａ、ＢおよびＣ）に分類される。インフルエンザＡウイルスのゲノムは、以下が含まれるいくつかのポリペプチドをコードする直鎖の負の極性の一本鎖ＲＮＡの８つの分子（インフルエンザＣウイルスについては７つ）を含む：ヌクレオカプシドを形成するＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）および核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（Ｍ１、ウイルス膜中に包埋された表面曝露されたタンパク質でもあるＭ２）；リポタンパク質エンベロープから突出する２つの表面糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）。ヘマグルチニンは、インフルエンザＡおよびＢウイルスの主要エンベロープ糖タンパク質であり、インフルエンザＣウイルスのヘマグルチニン－エステラーゼ（ＨＥ）が、ＨＡと相同なタンパク質である。
従来のワクチンを使用するインフルエンザおよび他の感染症に対する治療および予防の課題は、幅広さにおけるワクチンの制限であり、近縁のサブタイプに対する保護のみが提供される。さらに、現行の標準的なインフルエンザウイルスワクチン産生プロセスを完了するために要求される時間の長さは、パンデミック状況における適応されたワクチンの迅速な開発および産生を阻害する。インフルエンザに対する改善された免疫原性組成物の必要性が存在する。
一態様では、本開示は、（ａ）第１の脂質ナノ粒子；（ｂ）第２の脂質ナノ粒子；および（ｃ）凍結保護剤を含む免疫原性組成物、例えば、液体の、凍結された、または凍結乾燥された免疫原性組成物であって、第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含み；第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの抗原、好ましくはインフルエンザ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入し；第２の脂質ナノ粒子が、核酸をカプセル封入せず、第１の脂質ナノ粒子の組成を改変することなしに、第１の脂質ナノ粒子の有効濃度の増加を生じる、免疫原性組成物に関する。第１の脂質ナノ粒子の有効濃度は、それらの微小環境の近傍での水分子の入手可能性の関数である。理論に束縛されることは望まないが、一部の態様では、さらなる製剤緩衝溶液による製剤の希釈は、第１の脂質ナノ粒子の減少した有効濃度を生じ、コロイド不安定性および増加したレベルのＲＮＡ曝露（即ち、減少した％カプセル封入）を生じる；一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子の添加は、第１の脂質ナノ粒子の有効濃度における増加を可能にし、したがって、上述の第１の脂質ナノ粒子に対する有害な影響を防止する。
一態様では、本開示は、（ａ）第１の脂質ナノ粒子；および有効量の凍結保護剤を含む免疫原性組成物、例えば、液体の、凍結された、または凍結乾燥された免疫原性組成物であって、第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含み；第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入し、少なくとも１つの目的のポリペプチドが、抗原を含み、好ましくは、抗原が、インフルエンザ抗原であり；凍結保護剤が、糖類を含み；有効量の凍結保護剤が、組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖ、例えば、組成物の少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、多くても２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖのうちのいずれか２つの間、または正確に２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖである、免疫原性組成物に関する。一部の態様では、組成物は、第２の脂質ナノ粒子をさらに含み、第２の脂質ナノ粒子は、ＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル封入しない。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子の含有は、同一な条件下で測定した場合に、第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、組成物の安定性をさらに増加させる。
一部の態様では、第１の脂質ナノ粒子および第２の脂質ナノ粒子の合計比は、１：１～１：４９９９の範囲内である。一部の態様では、第１の脂質ナノ粒子および第２の脂質ナノ粒子の合計比は、１：４～１：４９９９が含まれる、１：１～１：４９９９の範囲内である。例えば、表３を参照されたい。
比は、第１の脂質ナノ粒子に関連する総脂質構成要素の質量割合（単位体積当たりのＲＮＡペイロードの等価な質量に基づいて報告される）の、コロイド安定性（粒子サイズおよびサイズ分布）および％カプセル封入を維持するために第１の脂質ナノ粒子の有効濃度を増加させるために要求される第２の脂質ナノ粒子中の総脂質の質量割合に対する比として定義される。
一部の態様では、製剤中のＲＮＡの少なくとも６０％が、完全に、第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されているまたは第１の脂質ナノ粒子と会合している。一部の態様では、組成物中の総ＲＮＡの少なくとも８０％が、第１の脂質ナノ粒子内にカプセル封入されているまたは第１の脂質ナノ粒子と会合している。一部の態様では、製剤中のＲＮＡの０％が、第２のナノ粒子中にカプセル封入される。
一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質は、第１の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数は、第１の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、リポソームである。一部の態様では、リポソームは、ｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびにｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む。一部の態様では、リポソームは、カチオン性脂質をさらに含む。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、４０ｍｏｌパーセントと５０ｍｏｌパーセントとの間のカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４１～４９ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４１～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４２～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４３～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４４～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４５～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４６～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４７～４８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、４７．２～４７．８ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、組成物は、約４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９または４８．０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子は、０～１０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。ある特定の具体的な態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセント、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセント、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。
一部の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、５～１５ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。一部の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、７～１３ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。一部の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、９～１１ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。一部の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、約９．５、１０または１０．５ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。他の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、４０～６０ｍｏｌ％の範囲の濃度で存在する。ある特定の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、４０～６０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、リン脂質および／または中性脂質は、約４８、４９または５０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。一部の態様では、カチオン性脂質のリン脂質および／または中性脂質に対するモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。
一部の態様では、ステロイドは、３２～４０ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。一部の態様では、ステロイドは、３９～４９ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。一部の態様では、ステロイドは、約４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の態様では、ステロイドは、４０～６０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、ステロイドは、約４８、４９または５０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。一部の態様では、カチオン性脂質のステロイドに対するモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２の範囲である。一部の態様では、総カチオン性脂質のステロイドに対するモル比は、１．０：１．０～１．０：１．２の範囲である。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、ｉ）６．０よりも大きい有効ｐＫａを有するカチオン性脂質；ｉｉ）５～１５ｍｏｌパーセントの中性脂質；ｉｉｉ）１～１５ｍｏｌパーセントのアニオン性脂質；ｉｖ）３０～４５ｍｏｌパーセントのステロイド；ｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質；およびｖｉ）脂質ナノ粒子内にカプセル封入されたまたは脂質ナノ粒子と会合している、治療剤またはその薬学的に許容できる塩もしくはプロドラッグを含み、ｍｏｌパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。一部の態様では、カチオン性脂質は、６．２５よりも大きい有効ｐＫａを有する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、４０～５５ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、ｉ）４５～５５ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質；ｉｉ）５～１０ｍｏｌパーセントの中性脂質；ｉｉｉ）１～５ｍｏｌパーセントのアニオン性脂質；およびｉｖ）３２～４０ｍｏｌパーセントのステロイドを含む。
一部の態様では、組成物は、ＡＬＣ－０３１５（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））を含む。一部の態様では、組成物は、ＡＬＣ－０１５９（２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド）を含む。一部の態様では、組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む。一部の態様では、組成物は、コレステロールを含む。一部の態様では、組成物は、０．９～１．８５ｍｇ／ｍＬのＡＬＣ－０３１５；０．１１～０．２４ｍｇ／ｍＬのＡＬＣ－０１５９；０．１８～０．４１ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ；および０．３６～０．７８ｍｇ／ｍＬのコレステロールを含む。
一部の態様では、脂質ナノ粒子サイズは、少なくとも４０ｎｍである。一部の態様では、脂質ナノ粒子サイズは、多くても１８０ｎｍである。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、第１の脂質ナノ粒子よりも５０％小さいサイズを有する。一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、第１の脂質ナノ粒子よりも５０％大きいサイズを有する。一部の態様では、組成物は、少なくとも２回凍結－解凍されている。一部の態様では、組成物は、少なくとも５回凍結－解凍されている。一部の態様では、第１の脂質と第２のナノ粒子との混合物は、凍結－解凍サイクリングおよび／またはフリーズドライ後に、２０～１８０ｎｍの範囲内の、より好ましくは、３０～１５０ｎｍの範囲内の、最も好ましくは、４０～１２０ｎｍの範囲内の、好ましいサイズを有する。
一部の態様では、凍結保護剤は、糖類である。一部の態様では、凍結保護剤は、二糖である。一部の態様では、凍結保護剤は、スクロースである。一部の態様では、凍結保護剤は、スクロースを含み、組成物は、少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖのスクロース、例えば、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、多くても２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖのうちのいずれか２つの間、または正確に２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖのスクロースを含む。一部の態様では、凍結保護剤は、スクロースを含み、組成物は、少なくとも約１０％ｗ／ｖ～２５％ｗ／ｖのスクロースを含む。一部の態様では、凍結保護剤は、スクロースを含み、組成物は、少なくとも約１０．３％ｗ／ｖ～２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含む。一部の態様では、凍結保護剤の濃度は、凍結および／またはフリーズドライ前に、組成物中１０～６００ｍｇ／ｍＬである。
一部の態様では、組成物は、凍結されている。一部の態様では、組成物は、凍結乾燥されている。一部の態様では、組成物は、噴霧フリーズドライによって凍結乾燥されている。一部の態様では、組成物は、凍結乾燥され復元されている。一部の態様では、組成物は、液体である。一部の態様では、組成物は、総組成物の約１０％未満の水含量を有する。一部の態様では、組成物は、総組成物の約０．１％と５％との間の水含量を有する。
一部の態様では、組成物は、薬学的に許容できる緩衝液をさらに含む。一部の態様では、組成物は、トリスを含む。一部の態様では、組成物は、スクロースを含む。一部の態様では、組成物は、塩化ナトリウムをさらに含まない。一部の態様では、組成物は、１０ｍＭのトリスを含む。一部の態様では、組成物は、３００ｍＭのスクロースを含む。一部の態様では、組成物は、ｐＨ７．４を有する。一部の態様では、組成物は、１２．５ＥＵ／ｍＬ未満またはそれと等しい細菌内毒素を有する。
一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも１カ月間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または約２℃～３０℃の温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または約２℃～３０℃の温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約４週間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、約２週間～約１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間または２年間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、約２５℃での液体としての貯蔵後に、少なくとも１週間、好ましくは、少なくとも２週間、より好ましくは、少なくとも３週間、最も好ましくは、少なくとも４週間にわたって安定であるように構成されている。一部の態様では、組成物は、約４０℃での液体としての貯蔵後に、少なくとも１日間、好ましくは、少なくとも２日間、より好ましくは、少なくとも３日間、最も好ましくは、少なくとも４日間にわたって安定であるように構成されている。
一部の態様では、組成物は、少なくとも２回凍結－解凍されている。一部の態様では、組成物は、少なくとも３回凍結－解凍されている。一部の態様では、組成物は、少なくとも４回凍結－解凍されている。一部の態様では、組成物は、少なくとも５回凍結－解凍されている。一部の態様では、凍結された後および／またはフリーズドライされた後に復元された場合の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。一部の態様では、少なくとも１回凍結－解凍された後の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。一部の態様では、少なくとも２回凍結－解凍された後の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。一部の態様では、少なくとも３回凍結－解凍された後の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。一部の態様では、少なくとも４回凍結－解凍された後の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。一部の態様では、少なくとも５回凍結－解凍された後の組成物の安定性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、より高い。
一部の態様では、ＲＮＡの濃度は、約１０ｐｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは、約０．１μｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの範囲内である。
一部の態様では、核酸は、ＲＮＡであり、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも約２週間後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトなＲＮＡを有するように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも１カ月後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトなＲＮＡを有するように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の約２週間～約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年または２年後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトなＲＮＡを有するように構成されている。一部の態様では、組成物は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の約２週間後に、少なくとも８０％のインタクトなＲＮＡを有するように構成されている。
一部の態様では、ＲＮＡは、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、好ましくは、少なくとも約６０％またはそれよりも高い、より好ましくは、少なくとも約７０％またはそれよりも高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％またはそれよりも高いＲＮＡ完全性を有する。一部の態様では、ＲＮＡは、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、少なくとも約５０％高い、好ましくは、少なくとも約６０％高い、より好ましくは、少なくとも約７０％高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％高いＲＮＡ完全性を有する。一部の態様では、同一な条件は、凍結された液体組成物、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後である。
一部の態様では、組成物は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、約２０％未満少ない遊離ＲＮＡ、好ましくは、約１５％未満少ない遊離ＲＮＡ、より好ましくは、約１０％未満少ない遊離ＲＮＡ％を含む。
一部の態様では、組成物は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、６０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％超多いカプセル封入されたＲＮＡを含む。一部の態様では、組成物は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、６０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡを含む。
一部の態様では、ＲＮＡの完全性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満減少する。一部の態様では、遊離ＲＮＡの量は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、１０％よりも大きくは増加しない、好ましくは、５％よりも大きくは増加しない。
一部の態様では、ＲＮＡをカプセル封入する脂質ベースの担体のＺ－平均サイズは、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、２０％よりも大きくは増加しない、好ましくは、１０％よりも大きくは増加しない。一部の態様では、組成物の濁度は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、２０％よりも大きくは増加しない、好ましくは、１０％よりも大きくは増加しない。
一部の態様では、ｐＨおよび／または浸透圧は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、２０％よりも大きくは増加も減少もしない、好ましくは、１０％よりも大きくは増加も減少もしない。
一部の態様では、組成物の有効性は、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満減少する。
一部の態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つの精製ステップによって精製されており、第１の脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの精製ステップによって、好ましくは、接線流濾過（ＴＦＦ）の少なくとも１つのステップおよび／または清澄化の少なくとも１つのステップおよび／または濾過の少なくとも１つのステップによって精製されている。一部の態様では、ＲＮＡは、精製されたＲＮＡ、好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたＲＮＡおよび／または接線流濾過（ＴＦＦ）精製されたＲＮＡである。
一部の態様では、組成物は、細胞において目的のポリペプチドを産生するための有効量のＲＮＡを含む。一部の態様では、ＲＮＡは、オープンリーディングフレームを含み、オープンリーディングフレームは、コドン最適化される。一部の態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを含む。
一部の態様では、抗原は、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせである。一部の態様では、ＲＮＡは、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原は、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）である。一部の態様では、ＲＮＡは、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原は、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。
一部の態様では、抗原は、アレナウイルス；アストロウイルス；ブニヤウイルス；カリシウイルス；コロナウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ヘパドナウイルス；ヘペウイルス；オルトミクソウイルス；パラミクソウイルス；ピコルナウイルス；レオウイルス；レトロウイルス；ラブドウイルス；トガウイルス；または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である。
一部の態様では、抗原は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）の種、コロナウイルス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）の種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）の種、ＧＳＳプリオン、グアナリト（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ）ウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレド（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｄ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１ ９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）もしくはネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）の種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡もしくは小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である。
一部の態様では、組成物は、ａ）インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ｂ）ヘマグルチニン２（ＨＡ２）またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ｃ）少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）、またはそれらの免疫原性断片である、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド；ならびにｄ）少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）、またはそれらの免疫原性断片である、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、組成物は、カチオン性脂質をさらに含む。一部の態様では、組成物は、ａ）インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包囲する脂質ナノ粒子；ｂ）ヘマグルチニン２（ＨＡ２）またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包囲する脂質ナノ粒子；ｃ）少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包囲する脂質ナノ粒子であって、抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）、またはそれらの免疫原性断片である、脂質ナノ粒子；ならびにｄ）少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを包囲する脂質ナノ粒子であって、抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）、またはそれらの免疫原性断片である、脂質ナノ粒子を含む。
一部の態様では、ＲＮＡは、改変されたヌクレオチドをさらに含む。一部の態様では、ＲＮＡは、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（Methylpseudourodine）－５’－三リン酸（ｍ１ΨＴＰ）を含む改変されたヌクレオチドを含む。一部の態様では、ＲＮＡは、抗原をコードする翻訳可能な領域を含み、１－メチル－プソイドウリジンを含む改変されたヌクレオシドを含む。
一部の態様では、ＲＮＡは、５’キャップアナログをさらに含む。一部の態様では、ＲＮＡは、５’キャップアナログをさらに含み、５’キャップアナログは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ヒストンステム－ループおよびポリ－Ａテイルを含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列ＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣ（５’ＵＴＲ１）を含む。一部の態様では、５’ＵＴＲは、配列：ＡＧＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣ（５’ＵＴＲ１）を含む。一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列
ＣＵＣＧＡＧＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＣＧＵＣＣＵＧＧＧＵＡＣＣＣＣＧＡＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＵＣＧＧＧＵＣＣＣＡＧＧＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＵＧＧＡＧＣＵＡＧＣ（３’ＵＴＲ２）
を含む。
一部の態様では、３’ＵＴＲは、配列
ＣΨＣＧＡＧＣΨＧＧΨＡＣΨＧＣＡΨＧＣＡＣＧＣＡＡΨＧＣΨＡＧＣΨＧＣＣＣＣΨΨΨＣＣＣＧΨＣＣΨＧＧＧΨＡＣＣＣＣＧＡＧΨＣΨＣＣＣＣＣＧＡＣＣΨＣＧＧＧΨＣＣＣＡＧＧΨＡΨＧＣΨＣＣＣＡＣＣΨＣＣＡＣＣΨＧＣＣＣＣＡＣΨＣＡＣＣＡＣＣΨＣΨＧＣΨＡＧΨΨＣＣＡＧＡＣＡＣＣΨＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡΨＧＣＡＧＣΨＣＡＡＡＡＣＧＣΨΨＡＧＣＣΨＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧΨＧＡΨΨＡＡＣＣΨΨΨＡＧＣＡＡΨＡＡＡＣＧＡＡＡＧΨΨΨＡＡＣΨＡＡＧＣΨＡΨＡＣΨＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧΨΨＧＧΨＣＡＡΨΨΨＣＧΨＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣΨＧＧＡＧＣΨＡＧＣ（３’ΨＴＲ２）
を含む。
一部の態様では、細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含み、組成物が、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、増加した量のポリペプチドを産生する、方法もまた、本明細書で開示される。
一部の態様では、細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、請求項９１から１５１のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、組成物が、同一な条件下で測定した場合に、第１の脂質ナノ粒子を含み有効量の凍結保護剤を含まない組成物と比較して、増加した量のポリペプチドを産生する、方法もまた、本明細書で開示される。
方法の一部の態様では、組成物は、哺乳動物に投与される。方法の一部の態様では、組成物は、ヒトに投与される。方法の一部の態様では、組成物は、インフルエンザを有するリスクがある哺乳動物に投与される。
一部の態様では、第１の脂質ナノ粒子および第２の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、第２の脂質ナノ粒子が、第２の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを欠如し、方法が、凍結および／またはフリーズドライ前に、組成物を精製して、複数の第２の脂質ナノ粒子の第１の部分を組成物から除去するステップを含み、複数の第２の脂質ナノ粒子の第２の部分が、組成物中に残留する、方法もまた、本明細書で開示される。
一部の態様では、第１の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、方法が、組成物を第２の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、第２の脂質ナノ粒子が、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入しない、方法もまた、本明細書で開示される。
一部の態様では、第１の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、方法が、組成物を有効量の凍結保護剤と接触させるステップを含み、凍結保護剤が、糖類を含み、有効量の凍結保護剤が、組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖである、方法もまた、本明細書で開示される。方法の一部の態様では、組成物は、第２の脂質ナノ粒子をさらに含み、第２の脂質ナノ粒子は、ＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル封入しない。
方法の一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む。方法の一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質は、第１の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである。方法の一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数は、第１の脂質ナノ粒子のｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる。方法の一部の態様では、第２の脂質ナノ粒子は、リポソームを含む。方法の一部の態様では、リポソームは、ｉ）リン脂質および／もしくは中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む。方法の一部の態様では、リポソームは、カチオン性脂質をさらに含む。
方法の一部の態様では、凍結保護剤は、二糖を含む。方法の一部の態様では、凍結保護剤は、スクロースを含む。方法の一部の態様では、有効量の凍結保護剤は、組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖ、例えば、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、多くても２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖ、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖのうちのいずれか２つの間、または正確に２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％もしくは３０％ｗ／ｖのスクロースである。方法の一部の態様では、有効量の凍結保護剤は、組成物の少なくとも約１５％ｗ／ｖ～２５％ｗ／ｖである。方法の一部の態様では、有効量の凍結保護剤は、組成物の少なくとも約１０％ｗ／ｖ～２５％ｗ／ｖである。方法の一部の態様では、有効量の凍結保護剤は、組成物の少なくとも約１０．３％ｗ／ｖ～２０．５％ｗ／ｖである。方法の一部の態様では、凍結保護剤の濃度は、凍結および／またはフリーズドライ前に、組成物中５～６００ｍｇ／ｍＬである。
方法の一部の態様では、安定性の増加は、凍結された場合および／またはフリーズドライされた場合の組成物の貯蔵安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、凍結された後に解凍された場合および／またはフリーズドライされた後に復元された場合の組成物の安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、組成物が少なくとも１回凍結－解凍されている場合の組成物の安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、組成物が少なくとも２回凍結－解凍されている場合の組成物の安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、組成物が少なくとも３回凍結－解凍されている場合の組成物の安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、組成物が少なくとも４回凍結－解凍されている場合の組成物の安定性を含む。方法の一部の態様では、安定性の増加は、組成物が少なくとも５回凍結－解凍されている場合の組成物の安定性を含む。
方法の一部の態様では、組成物を第２の脂質ナノ粒子と接触させるステップは、本明細書で開示される免疫原性組成物を形成する。方法の一部の態様では、凍結および／またはフリーズドライ前に、組成物を精製して、複数の第２の脂質ナノ粒子の第１の部分を組成物から除去するステップは、本明細書で開示される免疫原性組成物を形成する。方法の一部の態様では、組成物を有効量の凍結保護剤と接触させるステップは、本明細書で開示される免疫原性組成物を形成する。
本開示の他の目的、特色および利点は、以下の図面、詳細な説明および実施例から明らかになる。しかし、図面、詳細な説明および実施例は、本発明の具体的な態様を示しているが、例示としてのみ提供されているのであって、限定を意味しないことを理解すべきである。本明細書に記載される態様は、本開示の他の態様に適用可能な本開示の態様であると理解される。本開示の一態様に関連して議論される任意の態様は、本発明の他の態様にも当てはまり、逆もまた然りである。さらに、本開示の精神および範囲内の変化および改変は、この詳細な説明から、当業者に明らかになることが企図される。さらなる態様では、具体的な態様からの特色は、他の態様からの特色と組み合わされ得、および／または本発明の任意の方法もしくは組成物に関連して実行され得、逆もまた然りである。例えば、一態様からの特色は、他の態様のうちのいずれかからの特色と組み合わされ得る。さらなる態様では、さらなる特色が、本明細書に記載される具体的な態様に追加され得る。さらに、本開示の組成物およびシステムは、本開示の方法を達成するために使用され得る。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含められる。本開示は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせた、これらの図面のうちの１つまたは複数に対する参照によって、より良く理解され得る。
図１は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図２は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図４は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図５は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のＬＮＰ ＰＤＩに対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図６は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図７は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図８は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のＬＮＰ ＰＤＩに対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図９は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図１０は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図１１は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のＬＮＰ ＰＤＩに対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図１２は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図１３Ａ～Ｅは、ＶＳＶｇ ｓａＲＮＡ凍結乾燥薬物産物安定性データ：（Ａ）断片分析器データ、経時的（月）なＦＡによる％完全性；（Ｂ）経時的（月）な％発現；（Ｃ）経時的（月）な、％カプセル封入でのカプセル封入効率（ＥＥ）；（Ｄ）経時的（月）なサイズ；および（Ｅ）経時的（月）な多分散指数（ＰＤＩ）を示す図である。 図１４は、第１の脂質ナノ粒子のコロイド安定性およびパーセントカプセル封入を維持するための、第２の脂質ナノ粒子、即ちブランクＬＮＰの存在下で、ＲＮＡをカプセル封入する第１の脂質ナノ粒子の有効濃度を増加させる態様を示す図である。 図１５Ａ～Ｅは、ＨＡ ｓａＲＮＡ ＬＮＰ凍結乾燥からの結果を示す図である。それぞれのマトリックス中１０ｕｇ／ｍｌのＨＡ ｓａＲＮＡ ＬＮＰを凍結乾燥した。２ｍＬのバイアルを、０．３５ｍＬで充填し、０．３３ｍＬで水および食塩水で復元した。マトリックス「１０Ｔ１０Ｓ」は、１０％スクロース中１０ｍＭのトリスを指す。マトリックス「１０Ｔ２０Ｓ」は、２０％スクロース中１０ｍＭのトリスを指す。凍結乾燥された材料および凍結乾燥前の材料の両方が、さらなる凍結－解凍を有する。図１５（Ａ）経時的（月）な、％カプセル封入でのカプセル封入効率（ＥＥ）；（Ｂ）凍結乾燥前および凍結乾燥後データについての説明文；（Ｃ）断片分析器データ、経時的（月）な、ＦＡによる％完全性；（Ｄ）経時的（月）なサイズ；および（Ｅ）経時的（月）な多分散指数（ＰＤＩ）。 図１６は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図１７は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図１８は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１～Ｆ４）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図１９は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２０は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２１は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１０～Ｆ１３）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２２は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２３は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２４は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ５～Ｆ９）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２５は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２６は、ブランク脂質ナノ粒子の存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２７は、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）（Ｆ１４～Ｆ１５）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図２８は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図２９は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－平均）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図３０は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図３１は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図３２は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．０１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図３３は、ブランク脂質ナノ粒子または漸増するスクロース濃度（１５．４％または２０．５％ｗ／ｖ）の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（０．００５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で４回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、２ＦＴ、３ＦＴ、４ＦＴ）の影響を示す図である。 図３４は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズおよびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３５は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３６は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズおよびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３７は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３８は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡＬＣ－０３１５によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズおよびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図３９は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡＬＣ－０３１５によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図４０は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズおよびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図４１は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のｍＲＮＡカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、最大で５回の凍結－解凍サイクル（１ＦＴ、３ＦＴ、５ＦＴ）の影響を示す図である。 図４２Ａ～４２Ｂは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（図４２Ａ）およびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）（図４２Ｂ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４３は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４４Ａ～４４Ｂは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（図４４Ａ）およびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）（図４４Ｂ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４５は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９から構成されたブランク脂質ナノ粒子の存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡ９によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４６Ａ～４６Ｂは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡＬＣ－０３１５によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（図４６Ａ）およびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）（図４６Ｂ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４７は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＡＬＣ－０３１５によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４８Ａ～４８Ｂは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のＬＮＰ粒子サイズ（図４８Ａ）およびＬＮＰ多分散指数（ＰＤＩ）（図４８Ｂ）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。 図４９は、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されたリポソームの存在下での、ｆｌｕ ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＭＣ３によってカプセル封入された３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）のカプセル封入効率（カプセル封入％）に対する、凍結乾燥（凍結の間のアニーリングありおよびなし）および復元（水または食塩水中）の影響を示す図である。
詳細な説明
本発明者らは、凍結保護剤、好ましくは、炭水化物凍結保護剤の存在下での、および／またはさらには核酸を欠く、例えば、ＲＮＡをカプセル封入しておらずＲＮＡと会合していない脂質ナノ粒子（本明細書で「ブランク」ＬＮＰとも呼ばれる）もしくはリポソーム、またはより高い凍結保護剤濃度存在下での、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した、凍結または凍結乾燥された脂質ナノ粒子に関連する組成物およびその方法が、同一な条件下で評価した場合に、ブランクＬＮＰもしくはリポソーム、またはより高い凍結保護剤濃度の非存在下での、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した脂質ナノ粒子を含む組成物と比較して、例えば、延長された期間にわたるおよび／または非冷却条件下での貯蔵などに関して、とりわけ、それぞれの凍結または凍結乾燥プロセスの完了後のＲＮＡの改善された完全性によって特徴付けられ、増加した貯蔵安定性によってさらに特徴付けられる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰを含む組成物を生じるという着想を驚くべきことに得た。言い換えると、一部の態様では、組成物は、好ましくは、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物またはワクチンなどとしての使用のための、凍結または凍結乾燥プロセス後にカプセル封入されたＲＮＡの改善された特徴を生じる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した第１の脂質ナノ粒子と、核酸を欠く第２の脂質ナノ粒子と、凍結保護剤との混合物を含む。一部の態様では、組成物は、好ましくは、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物またはワクチンなどとしての使用のための、凍結または凍結乾燥プロセス後にカプセル封入されたＲＮＡの改善された特徴を生じる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した第１の脂質ナノ粒子と、増加した凍結保護剤濃度との混合物を含む。一部の態様では、組成物は、好ましくは、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物またはワクチンなどとしての使用のための、凍結または凍結乾燥プロセス後にカプセル封入されたＲＮＡの改善された特徴を生じる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した第１の脂質ナノ粒子と、核酸を欠く第２の脂質ナノ粒子との混合物を含む。一部の態様では、組成物は、好ましくは、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物またはワクチンなどとしての使用のための、凍結または凍結乾燥プロセス後にカプセル封入されたＲＮＡの改善された特徴を生じる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した第１の脂質ナノ粒子と、リポソームとの混合物を含む。一部の態様では、組成物は、好ましくは、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物またはワクチンなどとしての使用のための、凍結または凍結乾燥プロセス後にカプセル封入されたＲＮＡの改善された特徴を生じる、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した第１の脂質ナノ粒子と、リポソームと、増加した凍結保護剤濃度との混合物を含む。
有利には、本明細書に記載される組成物およびその方法は、産業規模での使用に適切である。本明細書に記載される方法は、再現性のあるコスト効率の良い様式で、例えば、上述の特性を有する、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰを含む凍結または凍結乾燥された組成物を産生するために使用され得る。ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰを含む組成物は、有利には、例えば、ワクチンなどとして、コールドチェーンなしで貯蔵、出荷および適用され得るが、組成物中のＲＮＡの完全性および生物学的活性は、予想外に高いままである。
凍結された組成物は、組成物が、例えば、少なくとも０℃未満でありかつ約－８０℃よりも高い、少なくとも０℃未満でありかつ約－９０℃よりも高い、もしくは少なくとも０℃未満でありかつ約－４０℃よりも高い温度、または－３０℃未満、例えば、約－４０℃～約－３０℃、もしくは約－４０℃～約－１５℃、もしくは約－４０℃～約－２０℃の温度を有し、それにより、凍結された組成物を形成するように、凍結プロセスを受けた組成物を指す。凍結乾燥またはフリーズドライは、生物学的材料および製薬材料の保存のために製薬産業において広く使用されるプロセスである。凍結乾燥では、材料中に存在する水は、凍結ステップの間に氷に変換され、次いで、一次乾燥ステップの間に、低圧条件下での直接的昇華によって、材料から除去される。しかし、凍結の間、水の全てが氷に変換されるわけではない。水の一部の部分は、例えば、製剤構成要素および／または活性成分を含有する固体のマトリックス中に捕捉される。マトリックス内の過剰な結合水は、二次乾燥ステップの間に所望のレベルの残存水分まで低減され得る。全ての凍結乾燥ステップ、凍結、一次乾燥および二次乾燥が、最終産物の特性を決定する。
本開示の態様は、インフルエンザウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本明細書で提供されるインフルエンザウイルスＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチン接種に関連するリスクの多くを伴わずに、細胞性免疫および体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導するために使用され得る。
一部の態様では、ウイルスは、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢの株またはそれらの組み合わせである。
一部の態様では、抗原性ポリペプチドは、ヘマグルチニンタンパク質またはその免疫原性断片をコードする。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはそれらの免疫原性断片である。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、ヘッドドメインを含まない。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、ヘッドドメインの一部分を含む。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインを含まない。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、細胞質ドメインの一部分を含む。一部の態様では、短縮型ヘマグルチニンタンパク質は、膜貫通ドメインの一部分を含む。
一部の態様は、カチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化された、ヘマグルチニンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドと薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含むインフルエンザワクチンを提供する。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、Ｈ１、Ｈ７およびＨ１０から選択される。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ノイラミニダーゼタンパク質をさらにコードする。一部の態様では、ヘマグルチニンタンパク質は、インフルエンザＡウイルスもしくはインフルエンザＢウイルスの株またはそれらの組み合わせに由来する。一部の態様では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９およびＨ１０Ｎ８から選択される。
一部の態様は、本明細書に記載される免疫原性組成物および／またはワクチンのうちのいずれかを対象に投与するステップを含む、インフルエンザウイルス感染症を予防または処置する方法を提供する。一部の態様では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。一部の態様では、抗原特異的免疫応答は、Ｂ細胞応答を含む。一部の態様では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を含む。一部の態様では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、免疫原性組成物および／またはワクチンの単回投与を含む。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、皮内、筋肉内注射、皮下注射、鼻腔内接種または経口投与によって、対象に投与される。
一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドまたはその部分は、インフルエンザ株の１つまたは複数のポリペプチドまたはその断片を、抗原としてコードし得る。
Ｉ．定義の例
本明細書を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用されている測定または定量化方法について固有の変動または誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞および分子生物学の分野におけるその明白かつ通常の意味に従って使用される。例えば、一部の態様では、用語「約」は、測定または定量化の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満以内のある範囲の値を包含し得る。
単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つよりも多く」の意味とも一致する。
語句「および／または」は、「および」または「または」を意味する。例示のために、Ａ、Ｂおよび／またはＣは、以下を含む：Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢの組み合わせ、ＡおよびＣの組み合わせ、ＢおよびＣの組み合わせ、またはＡ、ＢおよびＣの組み合わせ。言い換えると、「および／または」は、包含的またはとして機能する。
語句「本質的に全て」は、「少なくとも９５％」として定義される；ある群の本質的に全ての成員がある特定の特性を有する場合、その群の成員の少なくとも９５％が、その特性を有する。一部の例では、本質的に全ては、その群の成員の９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％のうちのいずれか１つ、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％のうちの少なくともいずれか１つ、または９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％のうちのいずれか２つの間がその特性を有する、と等しい意味である。
組成物およびそれらの使用のための方法は、本明細書を通じて開示される成分またはステップのいずれかを「含み」得る、それ「から本質的になり」得るまたはそれ「からなり」得る。本明細書を通じて、文脈が他を要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包括的またはオープンエンドであり、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の含有を暗示するが、いずれの他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除も暗示しないと理解される。用語「含む」の文脈で本明細書に記載される態様は、用語「からなる」または「から本質的になる」の文脈でも実行され得ることが企図される。開示された成分またはステップのうちのいずれか「から本質的になる」組成物および方法は、特許請求された開示の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない特定された材料またはステップに、特許請求の範囲を限定する。単語「からなる」（ならびにからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）の任意の形態、例えば、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」）は、語句「からなる」の後ろに続くものを全て含み、それらに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙された要素が要求されるかまたは義務的であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。
「一態様」、「ある態様」、「特定の態様」、「関連の態様」、「ある特定の態様」、「さらなる（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）態様」もしくは「さらなる（ｆｕｒｔｈｅｒ）態様」またはそれらの組み合わせに対する、本明細書を通じた言及は、その態様に関連して記載される特定の特色、構造または特徴が、本開示の少なくとも１つの態様中に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じた種々の場所での上述の語句の出現は、全てが同じ態様を必ずしも指すわけではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１つまたは複数の態様において任意の適切な様式で組み合わされ得る。
用語「阻害する」もしくは「低減させる」もしくは「減少させる」またはこれらの用語の任意のバリエーションは、所望の結果を達成するための、任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。用語「促進する」もしくは「増加させる」またはこれらの用語の任意のバリエーションは、所望の結果またはタンパク質もしくは分子の産生を達成するための、任意の測定可能な増加を含む。
本明細書で使用される場合、用語「参照」、「標準」または「対照」は、それに対する比較が実施される値を記載する。例えば、目的の薬剤、対象、集団、試料または値は、目的の参照、標準または対照の薬剤、対象、集団、試料または値と比較される。参照、標準もしくは対照は、目的の薬剤、対象、集団、試料もしくは値についての目的の試験もしくは決定と実質的に同時におよび／もしくはそれと共に試験および／もしくは決定され得、ならびに／または評価されている目的の薬剤、対象、集団、試料もしくは値と匹敵する条件もしくは状況下で決定もしくは特徴付けされ得る。
用語「ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド残基を含む（例えば、ヌクレオチド塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）および／またはウラシル（Ｕ）を含有する）核酸分子を意味する。例えば、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含有し得る。本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。一態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。当業者に公知のように、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ポリペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含有する。いずれの限定もなしに、ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生されたＲＮＡ、および改変されたＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を包含し得る。
本明細書で企図される場合、いずれの限定もなしに、ＲＮＡは、ヒトが含まれる哺乳動物におけるいくつかの状態を処置および／または予防するための治療モダリティとして使用され得る。本明細書に記載される方法は、哺乳動物、例えばヒトへの、本明細書に記載されるＲＮＡの投与を含む。例えば、一態様では、ＲＮＡについての使用のかかる方法は、好ましくは最小限のワクチン用量で保護的免疫化を達成するためのロバストな中和抗体および付随的な／随伴するＴ細胞応答を誘導するための抗原コードＲＮＡワクチンを含む。投与されるＲＮＡは、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡである。
例えば、かかるＲＮＡは、当該哺乳動物において免疫応答を生じさせることを意図した少なくとも１つの抗原をコードするために使用され得る。抗原は、がん、病原体、変異体タンパク質、ミスフォールディングされたタンパク質、プリオンなど由来のペプチドまたはタンパク質であり得る。病原体抗原は、病原体アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）の種、コロナウイルス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）の種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレド（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｄ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１ ９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）もしくはネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）の種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡もしくは小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）およびエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する抗原から好ましくは選択される、感染性疾患に関連する病原体に由来するペプチドまたはタンパク質抗原であり得る。
かかるＲＮＡ治療薬で処置され得る状態および／または疾患には、がん、タンパク質の過剰産生、変異体タンパク質の産生、タンパク質のミスフォールディング、ならびに／または病原体によって引き起こされるものおよび／もしくは影響されるもの、例えば、ウイルス感染症が含まれるがこれらに限定されない。開示されたＲＮＡ治療薬がそれを処置するために使用され得るがんの代表的であるが非限定的なリストには、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓がん、肺（ｌｕｎｇ）がん、例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣がん、膵がん、前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｅ）がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮頸癌、乳房がん、上皮がん、腎がん、泌尿生殖器がん、肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）がん、食道癌、頭頸部癌、大腸がん、造血がん；精巣がん；結腸および直腸のがん、前立腺（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ）がん、ならびに膵がんが含まれるがこれらに限定されない。開示されたＲＮＡ治療薬がそれを処置するために使用され得るウイルスの代表的であるが非限定的なリストには、アレナウイルス（例えば、ラッサウイルスまたはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））；アストロウイルス；ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）；カリシウイルス；コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ） － 例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス）；フィロウイルス（例えば、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス）；フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））；ヘパドナウイルス；ヘペウイルス；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスまたはインフルエンザＣウイルス）；パラミクソウイルス（例えば、はしかウイルスまたはルブラウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルスまたはライノウイルス）；レオウイルス（例えば、ロタウイルス）；レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））；ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスまたは狂犬病リッサウイルス）；トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）または風疹ウイルス）が含まれるがこれらに限定されない。
「単離されたＲＮＡ」は、組換えであり得るか、または総ゲノム核酸から単離されている、ＲＮＡ分子として定義される。
「改変されたＲＮＡ」または「ｍｏｄＲＮＡ」は、天然に存在するＲＮＡと比較して、１つまたは複数のヌクレオチドの少なくとも１つの付加、欠失、置換および／または変更を有するＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を指す。かかる変更は、内部ＲＮＡヌクレオチドへの、またはＲＮＡの５’および／もしくは３’末端への、非ヌクレオチド材料の付加を指し得る。一態様では、かかるｍｏｄＲＮＡは、少なくとも１つの改変されたヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドの塩基に対する変更を含有する。例えば、改変されたヌクレオチドは、１つまたは複数のウリジンおよび／またはシチジンヌクレオチドを置き換え得る。例えば、これらの置き換えは、ＲＮＡ配列中のウリジンおよび／もしくはシチジンの全ての場合に生じ得るか、または選択されたウリジンおよび／もしくはシチジンヌクレオチドのみに生じ得る。ＲＮＡ中の標準的なヌクレオチドに対するかかる変更には、非標準的なヌクレオチド、例えば、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドが含まれ得る。例えば、ＲＮＡ配列中の少なくとも１つのウリジンヌクレオチドは、１－メチルプソイドウリジンで置き換えられ得る。他のかかる変更されたヌクレオチドは、当業者に公知である。かかる変更されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡのアナログとみなされる。一部の態様では、ＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生され、ここで、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含有する核酸を指す。一部の態様では、ＲＮＡは、レプリコンＲＮＡ（レプリコン）、特に、自己複製性ＲＮＡまたは自己増幅性ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であり得る。
用語「ＤＮＡ」は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド残基を含む（例えば、ヌクレオチド塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）および／またはチミン（Ｔ）を含有する）核酸分子を意味する。例えば、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含有し得る。本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位においてヒドロキシル基を欠如するヌクレオチドを意味する。いずれの限定もなしに、ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、単離されたＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換え産生されたＤＮＡ、および改変されたＤＮＡを包含し得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、生物において天然に存在する分子の内因性バージョンを指す。一部の態様では、タンパク質またはポリペプチドの野生型バージョンが使用されるが、本開示の多くの態様では、改変されたタンパク質またはポリペプチドが、免疫応答を生じさせるために使用される。上記用語は、相互交換可能に使用され得る。「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」または「バリアント」は、その化学的構造、特にそのアミノ酸配列が、野生型タンパク質またはポリペプチドに対して変更されている、タンパク質またはポリペプチドを指す。一部の態様では、改変された／バリアントタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの改変された活性または機能を有する（タンパク質またはポリペプチドが複数の活性または機能を有し得ることを認識する）。改変された／バリアントタンパク質またはポリペプチドは、１つの活性または機能に関して変更され得るが、他の点では野生型の活性または機能、例えば免疫原性をなおも保持し得ることが、具体的に企図される。タンパク質が本明細書で具体的に言及される場合、ネイティブ（野生型）または組換え（改変された）タンパク質が一般に言及される。タンパク質は、それがネイティブである生物から直接単離され得るか、組換えＤＮＡ／外因性発現法によって産生され得るか、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって産生され得るか、または他のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって産生され得る。特定の態様では、ポリペプチド（例えば、抗原またはその断片）をコードする核酸配列を取り込む単離された核酸セグメントおよび組換えベクターが存在する。用語「組換え」は、ポリペプチド、または特定のポリペプチドの名称と併せて使用され得、これは一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された核酸分子から産生された、またはかかる分子の複製産物である、ポリペプチドを指す。
ＩＩ．ｍＲＮＡ分子
本発明は、ｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンに一般に関する。いくつかのｍＲＮＡワクチンプラットフォームが、先行技術において利用可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡの基礎構造は一般に、「成熟」真核生物ｍＲＮＡと酷似しており、（ｉ）タンパク質コードオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、それに隣接する（ｉｉ）５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および末端側における（ｉｉｉ）７－メチルグアノシン５’キャップ構造、ならびに（ｉｖ）３’ポリ（Ａ）テイルからなる。ｍＲＮＡ分子は、目的のポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳可能なコドンの配列であり得る、１つ（単シストロン性）、２つ（二シストロン性）またはそれよりも多く（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。ｍＲＮＡ分子は、１つの目的のポリペプチド、またはそれよりも多くの、例えば、１つの抗原もしくは１つよりも多くの抗原、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれよりも多くのポリペプチドをコードし得る。あるいは、またはさらに、１つのｍＲＮＡ分子はまた、１つよりも多くの目的のポリペプチド、例えば、抗原をコードし得、例えば、二シストロン性または三シストロン性ｍＲＮＡ分子は、異なるまたは同一な抗原をコードする。非コード構造特色は、ｍＲＮＡの薬理学において重要な役割を果たし、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率および免疫原性をモジュレートするために個々に最適化され得る。
改変されたヌクレオシドを取り込むことによって、「ヌクレオシド改変されたｍＲＮＡ」または「ｍｏｄＲＮＡ」と呼ばれるｍＲＮＡ転写物は、低減された免疫刺激活性を有して産生され得、したがって、改善された安全性プロファイルが得られ得る。さらに、改変されたヌクレオシドは、強く増強された安定性および翻訳能を有するｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンの設計を可能にするが、それは、これらが、ＩＦＮ型によって誘導され、侵入するｍＲＮＡを分解および阻害するようにプログラムされる直接的な抗ウイルス経路を回避できるからである。例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ中のウリジンのプソイドウリジンによる置き換えは、ＲＮａｓｅ ＬによるｍＲＮＡ切断を調節する２’－５’－オリゴアデニル酸シンテターゼの活性を低減させる。さらに、より低い活性が、ｍＲＮＡ翻訳プロセスの阻害に関連する酵素であるタンパク質キナーゼＲについて測定される。
改変されたヌクレオチドの取込みに加えて、他のアプローチが、ｍＲＮＡの翻訳能および安定性を増加させることが立証されている。１つの例は、「配列操作されたｍＲＮＡ」の開発である。ここで、ｍＲＮＡ発現は、例えば、ＧＣ含量を富化させることによる、または天然の長寿命ｍＲＮＡ分子のＵＴＲを選択することによる、ｍＲＮＡのＯＲＦおよびＵＴＲにおける配列最適化によって強く増加され得る。別のアプローチは、「自己増幅性ｍＲＮＡ」構築物の設計である。これらは、大部分がアルファウイルスに由来し、ウイルスレプリカーゼをコードするさらなるＯＲＦと一緒に、目的の抗原によって置き換えられたＯＲＦを含有する。後者は、ｍＲＮＡの細胞内増幅を駆動し、したがって、抗原発現能を有意に増加させることができる。また、いくつかの改変が、ｍＲＮＡの末端構造において実行されている。アンチリバースキャップ（ＡＲＣＡ）改変は、５’末端における正確なキャップ配向を確実にすることができ、これは、リボソームに効率的に結合することができるｍＲＮＡのほぼ完全な画分を生じる。他のキャップ改変、例えば、ホスホロチオエートキャップアナログは、真核生物翻訳開始因子４Ｅに対する親和性をさらに改善し得、ＲＮＡキャップ除去複合体に対する抵抗性を増加させ得る。
逆に、その構造を改変することによって、自然免疫応答を誘発するｍＲＮＡの有効性は、翻訳能に不利益を及ぼすが、さらに改善され得る。ｍＲＮＡをホスホロチオエート骨格によって安定化することによって、またはカチオン性タンパク質プロタミンによるその沈殿によって、抗原発現は減退され得るが、より強い免疫刺激能が得られ得る。
一態様では、本発明は、抗原としてのインフルエンザ株の１つまたは複数のポリペプチドまたはその断片をコードするｍＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物に関する。一部の態様では、ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオシド改変されたｍＲＮＡを含む。一部の態様では、ｍＲＮＡ分子は、改変されたヌクレオシドを取り込まない自己増幅性ＲＮＡなど、ヌクレオシド改変されたｍＲＮＡを含まない。一部の態様では、ｍＲＮＡ分子は、自己増幅性ＲＮＡ分子である。
本開示において有用なｍＲＮＡは、典型的には、目的のポリペプチドをコードする連結されたヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域（例えば、５’－ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域（例えば、３’－ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’－キャップ領域、および３’安定化領域を含む。一部の態様では、本発明のｍＲＮＡは、ポリ－Ａ領域またはＫｏｚａｋ配列を（例えば、５’－ＵＴＲ中に）さらに含む。一部の例では、本発明のｍＲＮＡは、ポリヌクレオチドから切り出されることが可能な１つまたは複数のイントロンヌクレオチド配列を含有し得る。一部の態様では、本発明のｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。核酸の領域のうちのいずれか１つは、１つまたは複数の代替的構成要素（例えば、代替的ヌクレオシド）を含み得る。例えば、３’安定化領域は、代替的ヌクレオシド、例えば、Ｌ－ヌクレオシド、反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）チミジンもしくは２’－Ｏ－メチルヌクレオシドを含有し得、ならびに／またはコード領域、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲもしくはキャップ領域は、代替的ヌクレオシド、例えば、５－置換されたウリジン（例えば、５－メトキシウリジン）、１－置換されたプソイドウリジン（例えば、１－メチル－プソイドウリジン）および／もしくは５－置換されたシチジン（例えば、５－メチル－シチジン）を含み得る。
一部の態様では、ｍＲＮＡ分子は、約２０～約１００，０００ヌクレオチドのうちのいずれか１つ、約２０～約１００，０００ヌクレオチドのうちの少なくともいずれか１つ、約２０～約１００，０００ヌクレオチドのうちの多くてもいずれか１つ、または約２０～約１００，０００ヌクレオチドのうちのいずれか２つの間と等しい（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００および２，０００～１００，０００のうちのいずれか１つ、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００および２，０００～１００，０００のうちの少なくともいずれか１つ、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００および２，０００～１００，０００のうちの多くてもいずれか１つ、または３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～３，０００、３０～５，０００、３０～７，０００、３０～１０，０００、３０～２５，０００、３０～５０，０００、３０～７０，０００、１００～２５０、１００～５００、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～３，０００、１００～５，０００、１００～７，０００、１００～１０，０００、１００～２５，０００、１００～５０，０００、１００～７０，０００、１００～１００，０００、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～３，０００、５００～５，０００、５００～７，０００、５００～１０，０００、５００～２５，０００、５００～５０，０００、５００～７０，０００、５００～１００，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～５，０００、１，０００～７，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～２５，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～７０，０００、１，０００～１００，０００、１，５００～３，０００、１，５００～５，０００、１，５００～７，０００、１，５００～１０，０００、１，５００～２５，０００、１，５００～５０，０００、１，５００～７０，０００、１，５００～１００，０００、２，０００～３，０００、２，０００～５，０００、２，０００～７，０００、２，０００～１０，０００、２，０００～２５，０００、２，０００～５０，０００、２，０００～７０，０００および２，０００～１００，０００のうちのいずれか２つの間と等しい）ヌクレオチドを含む。一部の態様では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。例えば、一部の態様では、ｍＲＮＡは、１００ヌクレオチドと１５，０００ヌクレオチドとの間；７，０００ヌクレオチドと１６，０００ヌクレオチドとの間；８，０００ヌクレオチドと１５，０００ヌクレオチドとの間；９，０００ヌクレオチドと１２，５００ヌクレオチドとの間；１１，０００ヌクレオチドと１５，０００ヌクレオチドとの間；１３，０００ヌクレオチドと１６，０００ヌクレオチドとの間；７，０００ヌクレオチドと２５，０００ヌクレオチドとの間の長さを有する。一部の態様では、ｍＲＮＡの長さは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００、５００００、５１０００、５２０００、５３０００、５４０００、５５０００、５６０００、５７０００、５８０００、５９０００、６００００、６１０００、６２０００、６３０００、６４０００、６５０００、６６０００、６７０００、６８０００、６９０００、７００００、７１０００、７２０００、７３０００、７４０００、７５０００、７６０００、７７０００、７８０００、７９０００、８００００、８１０００、８２０００、８３０００、８４０００、８５０００、８６０００、８７０００、８８０００、８９０００、９００００、９１０００、９２０００、９３０００、９４０００、９５０００、９６０００、９７０００、９８０００、９９０００、もしくは１０００００ヌクレオチド、多くても３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、
３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００、５００００、５１０００、５２０００、５３０００、５４０００、５５０００、５６０００、５７０００、５８０００、５９０００、６００００、６１０００、６２０００、６３０００、６４０００、６５０００、６６０００、６７０００、６８０００、６９０００、７００００、７１０００、７２０００、７３０００、７４０００、７５０００、７６０００、７７０００、７８０００、７９０００、８００００、８１０００、８２０００、８３０００、８４０００、８５０００、８６０００、８７０００、８８０００、８９０００、９００００、９１０００、９２０００、９３０００、９４０００、９５０００、９６０００、９７０００、９８０００、９９０００、もしくは１０００００ヌクレオチド、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００、５００００、５１０００、５２０００、５３０００、５４０００、５５０００、５６０００、５７０００、５８０００、５９０００、６００００、６１０００、６２０００、６３０００、６４０００、６５０００、６６０００、６７０００、６８０００、６９０００、７００００、７１０００、７２０００、７３０００、７４０００、７５０００、７６０００、７７０００、７８０００、７９０００、８００００、８１０００、８２０００、８３０００、８４０００、８５０００、８６０００、８７０００、８８０００、８９０００、９００００、９１０００、９２０００、９３０００、９４０００、９５０００、９６０００、９７０００、９８０００、９９０００、もしくは１０００００ヌクレオチドのうちのいずれか２つの間、または正確に３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００、５００００、５１０００、５２０００、５３０００、５４０００、５５０００、５６０００、５７０００、５８０００、５９０００、６００００、６１０００、６２０００、６３０００、６４０００、６５０００、６６０００、６７０００、６８０００、６９０００、７００００、７１０００、７２０００、７３０００、７４０００、７５０００、７６０００、７７０００、７８０００、７９０００、８００００、８１０００、８２０００、８３０００、８４０００、８５０００、８６０００、８７０００、８８０００、８９０００、９００００、９１０００、９２０００、９３０００、９４０００、９５０００、９６０００、９７０００、９８０００、９９０００、もしくは１０００００ヌクレオチドである。一部の態様では、リスト中のヌクレオチドサイズ範囲のうちの１つまたは複数は、排除され得る。
一部の態様では、ＬＮＰは、１つまたは複数のＲＮＡを含み、１つまたは複数のＲＮＡ、脂質およびそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比を提供するために選択され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、１つまたは複数の脂質中の窒素原子の、ＲＮＡ中のリン酸基の数に対するモル比を指す。一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質およびそれらの量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するために選択され得る。ある特定の態様では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。他の態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１または約７．０：１であり得る。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
本開示のｍＲＮＡは、カノニカルヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）またはＴ（チミジン）のうちのいずれかが含まれる、１つまたは複数の天然に存在する構成要素を含み得る。一態様では、（ａ）５’－ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｃ）３’－ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡテイル、および（上記ａ、ｂ、ｃまたはｄ）の任意の組み合わせを含むヌクレオチドの全てのまたは実質的に全ては、天然に存在するカノニカルヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）またはＴ（チミジン）を含む。
一部の態様では、ＲＮＡ分子は、アナログであり、改変、特に、ヌクレアーゼ抵抗性を増加させる改変、結合親和性を改善する改変、および／または結合特異性を改善する改変を含み得る。例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分が炭素環式部分によって置き換えられる場合、それはもはや糖ではない。さらに、他の置換、例えば、糖間ホスホジエステル連結についての置換が行われる場合、得られた材料は、もはや真の種ではない。全てのかかる化合物は、アナログであるとみなされる。本明細書を通じて、核酸種の糖部分に対する言及は、真の糖、または野生型核酸の糖の構造的位置につく種のいずれかを指すと理解するものとする。さらに、糖間連結に対する言及は、野生型核酸の方式で糖または糖アナログ部分を接続するように機能する部分を含むと解釈するものとする。
改変されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、それらの天然に存在する対応物と比較して、増加した化学的および／または酵素的安定性を示し得る。細胞外および細胞内ヌクレアーゼは一般に、骨格改変された化合物を認識せず、したがって、骨格改変された化合物に結合しない。プロトン化された酸の形態として存在する場合、負に荷電した骨格の欠如は、細胞透過を容易にし得る。
一部の例では、改変されたヌクレオシド間連結が、ヌクレアーゼ抵抗性および増強された細胞取込みを、得られた化合物に付与するために、天然に存在するホスホジエステル－５’－メチレン連結を４原子連結基で置き換えるために意図される。
本発明のｍＲＮＡは、増加した安定性および／またはポリヌクレオチドが導入された細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如が含まれる有用な特性を付与する、本明細書に記載される１つまたは複数の代替的構成要素を含み得る。例えば、ｍＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡは、対応する未変更のｍＲＮＡ、または代替的構成要素を含有することもなく代替的構成要素が導入されてもいないｍＲＮＡもしくはｍｏｄＲＮＡと比較して、それぞれのｍＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡが導入された細胞において、低減された分解を示し得る。これらの代替的種は、タンパク質産生の効率、ポリヌクレオチドの細胞内保持、および／または接触された細胞の生存度を増強し得るだけでなく、低減された免疫原性を保有し得る。一部の例では、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入された細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特色には、以下が含まれ得る：１）炎症促進性サイトカインの増加した発現、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、および／または３）タンパク質翻訳における終結もしくは低減。
本発明のｍＲＮＡは、１つまたは複数の改変された（例えば、変更されたまたは代替的な）核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ＬＮＰにおいて有用なｍＲＮＡは、例えば、核酸塩基に対する、糖に対する、またはヌクレオシド間連結に対する（例えば、連結リン酸に対する／ホスホジエステル連結に対する／ホスホジエステル骨格に対する）任意の有用な改変または変更を含み得る。ある特定の態様では、変更（例えば、１つまたは複数の変更）は、核酸塩基、糖およびヌクレオシド間連結の各々において存在する。本開示に従う変更は、リボ核酸（ＲＮＡ）の変更、例えば、リボフラノシル環の２’－ＯＨの、２’－Ｈへの置換、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドであり得る。さらなる変更は、本明細書に記載される。
本発明のｍＲＮＡは、分子の長さ全体に沿って均一に変更されていてもいなくてもよい。例えば、１つもしくは複数のまたは全ての型のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つもしくは複数または全て）は、ｍＲＮＡにおいて、またはその所与の所定の配列領域において、均一に変更されていてもいなくてもよい。一部の例では、ｍＲＮＡ中（またはその所与の配列領域中）の全てのヌクレオチドＸが変更され、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
異なる糖変更および／またはヌクレオシド間連結（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチド中の種々の位置に存在し得る。当業者は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に減少されないように、ヌクレオチドアナログまたは他の変更がポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることを理解する。変更はまた、５’末端または３’末端変更であり得る。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、３’末端における変更を含む。ポリヌクレオチドは、約１％～約１００％の代替的ヌクレオチド（ヌクレオチド含量全体との関連で、または１つもしくは複数の型のヌクレオチド、即ち、Ａ、Ｇ、ＵもしくはＣのうちのいずれか１つもしくは複数との関連で）または任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％および９５％～１００％）（例えば、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％、多くても０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の代替的ヌクレオチド）を含有し得る。任意の残りのパーセンテージは、カノニカルヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣ）の存在によって説明されることが理解される。
ポリヌクレオチドは、最低でゼロかつ最高で１００％の代替的ヌクレオチド、または任意の介在するパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の代替的ヌクレオチド、少なくとも１０％の代替的ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替的ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替的ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替的ヌクレオチドまたは少なくとも９０％の代替的ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、代替的ピリミジン、例えば、代替的ウラシルまたはシトシンを含有し得る。一部の態様では、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）は、代替的ウラシル（例えば、５－置換されたウラシル）で置き換えられる。代替的ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。一部の例では、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）は、代替的シトシン（例えば、５－置換されたシトシン）で置き換えられる。代替的シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。
一部の態様では、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の代替的ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。代替的ヌクレオシドおよびヌクレオチドには、代替的核酸塩基が含まれ得る。核酸の核酸塩基は、有機塩基、例えば、プリンもしくはピリミジンまたはそれらの誘導体である。核酸塩基は、カノニカル塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）であり得る。これらの核酸塩基は、増強された特性、例えば、増加した安定性、例えば、ヌクレアーゼに対する抵抗性を有するポリヌクレオチド分子を提供するために、変更され得るか、または完全に置き換えられ得る。非カノニカル塩基または改変された塩基は、例えば、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシおよび／もしくはチオ置換；１つもしくは複数の縮合環もしくは開放環；酸化；ならびに／または還元が含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の置換または改変を含み得る。
一部の態様では、核酸塩基は、代替的ウラシルである。代替的ウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウラシル、６－アザ－ウラシル、２－チオ－５－アザ－ウラシル、２－チオ－ウラシル（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウラシル（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウラシル、５－ハロ－ウラシル（例えば、５－ヨード－ウラシルまたは５－ブロモ－ウラシル）、３－メチル－ウラシル（ｍＵ）、５－メトキシ－ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｎｍＶｕ）、５－メチルアミノメチル－ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｍｎｍＶｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル（ｃｍｎｍＶｕ）、５－プロピニル－ウラシル、１－プロピニル－プソイドウラシル、５－タウリノメチル－ウラシル（ｘｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウラシル（ｘｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－ウラシル（ｍ５Ｕ、即ち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチル－プソイドウリジン（ｍＶ）、５－メチル－２－チオ－ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、ｌ－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ ｘｊ／）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ ＼｜／）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチル－ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウラシル、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウラシル、２－メトキシ－４－チオ－ウラシル、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎｌ－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐＵ）、ｌ－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｅｍ Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ Ｕｍ）、および５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウラシル、デオキシチミジン、５－（２－カルボメトキシビニル）－ウラシル、５－（カルバモイルヒドロキシメチル）－ウラシル、５－カルバモイルメチル－２－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチル－２－チオ－ウラシル、５－シアノメチル－ウラシル、５－メトキシ－２－チオ－ウラシル、ならびに５－［３－（ｌ－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウラシルが含まれる。
一部の態様では、核酸塩基は、代替的シトシンである。代替的シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、５－アザ－シトシン、６－アザ－シトシン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シトシン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シトシン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シトシン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シトシン（例えば、５－ヨード－シトシン）、５－ヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シトシン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シトシン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シトシン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル（methy 1）－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シトシン、２－メトキシ－５－メチル－シトシン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、ライシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１－チオ－シトシン、５－ヒドロキシ－シトシン、５－（３－アジドプロピル）－シトシン、および５－（２－アジドエチル）－シトシンが含まれる。
一部の態様では、核酸塩基は、代替的アデニンである。代替的アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデニン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデニン（ｍｌ Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデニン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍｌＡｍ）、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデニン、８－アジド－アデニン、Ｎ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデニン、２，８－ジメチル－アデニン、Ｎ６－ホルミル－アデニン、およびＮ６－ヒドロキシメチル－アデニンが含まれる。
一部の態様では、核酸塩基は、代替的グアニンである。代替的グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍｉｌ）、ウィオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）（ｉｍＧ）、メチルウィオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ウィオシン（ｉｍＧ－１４）、イソウィオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、過少改変された（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱＯ）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱｌ）、アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ）（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアニン、６－チオ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－グアニン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアニン、７－メチル－グアニン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアニン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアニン、１－メチル－グアニン（ｍｌＧ）、Ｎ２－メチル－グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアニン、７－メチル－８－オキソ－グアニン、１－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアニン、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍｌＧｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍｌｌｍ）、１－チオ－グアニン、およびＯ－６－メチル－グアニンが含まれる。
ヌクレオチドの代替的核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログであり得る。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはヒポキサンチンの代替物であり得る。別の態様では、核酸塩基には、例えば、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ（例えば、８－ブロモ）、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシおよび他の８－置換されたアデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換されたウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、デアザグアニン、７－デアザグアニン、３－デアザグアニン、デアザアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５－ａ］１，３，５トリアジノン、９－デアザプリン、イミダゾ［４，５－ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、ピラジン－２－オン、１，２，４－トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンが含まれる、塩基の天然に存在する誘導体および合成誘導体もまた含まれ得る。ヌクレオチドが、簡略表現Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを使用して示される場合、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニンまたはアデニンアナログ、例えば、７－デアザアデニンを含む。
５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ｍＲＮＡへと転写されるがタンパク質へは翻訳されないタンパク質コード配列の５’末端に位置するＤＮＡの調節領域である。５’ＵＴＲは、翻訳開始の制御において役割を果たし得る種々の調節エレメント、例えば、５’キャップ構造、ステム－ループ構造および内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る。タンパク質コード配列の下流に位置する３’ＵＴＲは、転写物の切断、安定性およびポリアデニル化、翻訳、ならびにｍＲＮＡ局在化が含まれる調節プロセスに関与し得る。一部の態様では、ＵＴＲは、ｍＲＮＡ発現がそこに標的化される特定の組織（例えば、リンパ組織）において天然に豊富なｍＲＮＡに由来する。一部の態様では、ＵＴＲは、タンパク質合成を増加させる。機構にも理論にも束縛されないが、ＵＴＲは、ｍＲＮＡが翻訳中のポリソーム中に残留する時間（メッセージ安定性）および／またはリボソームがメッセージ上で翻訳を開始する速度（メッセージ翻訳効率）を増加させることによって、タンパク質合成を増加させ得る。したがって、ＵＴＲ配列は、タンパク質合成を組織特異的様式で延長させ得る。一部の態様では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列は、コンピューターにより導き出される。一部の態様では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、組織中に天然に豊富なｍＲＮＡに由来する。組織は、例えば、肝臓、幹細胞またはリンパ組織であり得る。リンパ組織は、例えば、リンパ球（例えば、Ｂリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球および網状赤血球のうちのいずれか１つを含み得る。
ｍＲＮＡは、５’－キャップ構造を含み得る。ポリヌクレオチドの５’－キャップ構造は、核エクスポートおよびポリヌクレオチド安定性の増加に関与し、ＣＢＰとポリ－Ａ結合タンパク質との会合を介して細胞中でのポリヌクレオチド安定性および翻訳コンピテンシーを担うｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡスプライシングの間の５’近位イントロンの除去をさらに補助する。内因性ポリヌクレオチド分子は、５’末端キャップされて、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸連結を生成し得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップはメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ポリヌクレオチドの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写されたヌクレオチドのリボース糖もまた、２’－Ｏ－メチル化されていていてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介した５’－キャップ除去は、分解のためにポリヌクレオチド分子、例えばｍＲＮＡ分子を標的化し得る。ポリヌクレオチドに対する変更は、キャップ除去を防止し、したがって、ポリヌクレオチド半減期を増加させる、加水分解不能なキャップ構造を生成し得る。キャップ構造加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ）連結の切断を要求するので、代替的ヌクレオチドが、キャッピング反応の間に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素が、５’－ｐｐｐ－５’キャップ中にホスホロチオエート連結を創出するために、製造業者の指示書に従って、ａ－チオ－グアノシンヌクレオチドと共に使用され得る。
さらなる代替的グアノシンヌクレオチド、例えば、ａ－メチル－ホスホネートおよびセレノホスフェートヌクレオチドが使用され得る。さらなる変更には、糖の２’－ヒドロキシ基上での、ポリヌクレオチドの５’末端および／または５’末端前ヌクレオチド（上述の通り）のリボース糖の２’－Ｏ－メチル化が含まれるがこれらに限定されない。複数の別個の５’－キャップ構造が、ｍＲＮＡ分子の５’－キャップを生成するために使用され得る。
本明細書で合成キャップアナログ、化学的キャップ、化学的キャップアナログ、または構造的もしくは機能的キャップアナログとも呼ばれるキャップアナログは、キャップ機能を保持しつつ、それらの化学的構造が、天然の（即ち、内因性、野生型または生理的）５’－キャップとは異なる。キャップアナログは、化学的に（即ち、非酵素的に）または酵素的に合成され得るおよび／ポリヌクレオチドに連結され得る。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアノシンを含有し、一方のグアノシンは、Ｎ７－メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基を含有する（即ち、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと同等に示され得る、Ｎ７，‘－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ）。他方の未変更のグアノシンの３’－Ｏ原子は、キャップされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化されたグアノシンは、キャップされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。別の例示的なキャップは、ＡＲＣＡと類似しているが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有するｍＣＡＰ（即ち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）である。
キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログであり得る。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップアナログは、そのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５１９，１１０号に記載されるジヌクレオチドキャップアナログなど、異なるリン酸位置においてボラノリン酸基またはホスホロセレノエート（phophoroselenoate）基で改変され得る。あるいは、キャップアナログは、当該分野で公知のおよび／または本明細書に記載される、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換されたジヌクレオチドキャップアナログであり得る。Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換されたジヌクレオチドキャップアナログの非限定的な例には、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ（例えば、そのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０～４５７４に記載される、種々のキャップアナログおよびキャップアナログを合成する方法を参照されたい）が含まれる。他の例では、本開示のポリヌクレオチドにおいて有用なキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。キャップアナログは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応におけるポリヌクレオチドの随伴するキャッピングを可能にするが、転写物の最大で２０％は、未キャップのままである。これ、ならびに内因性の細胞転写機械によって産生されたポリヌクレオチドの内因性５’－キャップ構造とキャップアナログとの構造的差異は、低減された翻訳コンピテンシーおよび低減された細胞安定性をもたらし得る。
代替的ポリヌクレオチドはまた、より真正の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）５’－キャップ構造を生成するために、酵素を使用して転写後にキャップされ得る。本明細書で使用される場合、語句「より真正の」は、構造的または機能的にのいずれかで、内因性または野生型の特色を密接にミラーリングまたは模倣する特色を指す。即ち、「より真正の」特色は、先行技術の合成特色またはアナログと比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理的な細胞機能および／もしくは構造をより良く代表し、または１つもしくは複数の点において、対応する内因性、野生型、天然もしくは生理的な特色よりも優れている。本開示のポリヌクレオチドにおいて有用なより真正の５’－キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該分野で公知の合成５’－キャップ構造（または野生型、天然もしくは生理的な５’－キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の増強された結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低減された感受性、および／または低減された５’キャップ除去を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドとの間にカノニカル５’－５’－三リン酸連結を創出することができ、キャップグアノシンは、Ｎ７－メチル化を含有し、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。かかる構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該分野で公知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、より高い翻訳コンピテンシー、細胞安定性、および細胞性炎症促進性サイトカインの低減された活性化を生じる。他の例示的なキャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）およびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が含まれる。代替的ポリヌクレオチドは、転写後にキャップされ得、このプロセスは、より効率的であるので、ｍＲＮＡのほぼ１００％がキャップされ得る。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の過程においてキャップアナログがポリヌクレオチドに連結される場合の－８０％とは対照的である。
５’末端キャップには、内因性キャップまたはキャップアナログが含まれ得る。５’末端キャップは、グアノシンアナログを含み得る。有用なグアノシンアナログには、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシンおよび２－アジド－グアノシンが含まれる。一部の例では、ポリヌクレオチドは、改変された５’－キャップを含有する。５’－キャップ上の改変は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させ得、ポリヌクレオチドの半減期を増加させ得、ポリヌクレオチド翻訳効率を増加させ得る。改変された５’－キャップには、以下の改変のうちの１つまたは複数が含まれ得るがこれらに限定されない：キャップされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位および／または３’位における改変、メチレン部分（ＣＨ２）による糖環酸素の置き換え（炭素環式環を生じた）、キャップ構造の三リン酸架橋部分における改変、または核酸塩基（Ｇ）部分における改変。
５’－ＵＴＲは、ｍＲＮＡに対する隣接領域として提供され得る。５’－ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中で見出されるコード領域に対して同種または異種であり得る。複数の５’－ＵＴＲが隣接領域中に含まれ得、同じ配列または異なる配列であり得る。何もなしが含まれる隣接領域の任意の部分は、コドン最適化され得、いずれもが、コドン最適化の前および／または後に、１つまたは複数の異なる構造的または化学的変更を独立して含有し得る。ｍＲＮＡの１つまたは複数の特性を変更するために、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種の５’－ＵＴＲが、操作され得る。次いで、ｍＲＮＡは、細胞、組織または生物に投与され得、タンパク質レベル、局在化および／または半減期などの結果が、異種５’－ＵＴＲがｍＲＮＡに対して有し得る有益な効果を評価するために測定され得る。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧが含まれる１つまたは複数のヌクレオチドが、末端に付加されたまたは除去された、５’－ＵＴＲのバリアントが利用され得る。５’－ＵＴＲはまた、本明細書に記載される任意の様式で、コドン最適化または変更され得る。
一部の態様では、キャッピング領域には、単一のキャップ、またはキャップを形成する一連のヌクレオチドが含まれ得る。この態様では、キャッピング領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または少なくとも２、または１０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちのいずれか１つ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または少なくとも２、または１０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちの少なくともいずれか１つ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または少なくとも２、または１０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちの多くてもいずれか１つ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または少なくとも２、または１０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちのいずれか２つの間と等しい場合がある。一部の態様では、キャップは存在しない。一部の態様では、第１および第２の操作可能な領域は、３～４０、例えば、５～３０、１０～２０、１５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または少なくとも４、または３０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちのいずれか１つ、３～４０、例えば、５～３０、１０～２０、１５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または少なくとも４、または３０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちの少なくともいずれか１つ、３～４０、例えば、５～３０、１０～２０、１５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または少なくとも４、または３０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちの多くてもいずれか１つ、または３～４０、例えば、５～３０、１０～２０、１５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または少なくとも４、または３０もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長のうちのいずれか２つの間と等しい場合があり、開始および／または停止コドンに加えて、１つまたは複数のシグナルおよび／または制限配列を含み得る。
ｍＲＮＡは、例えば、ヒストンステムループであるがこれに限定されないステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり得る。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’側に（例えば、コード領域の３’末端に）位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの３’末端に位置し得る。一部の例では、ｍＲＮＡは、１つよりも多くのステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域中に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域中の非翻訳領域（例えば、３’－ＵＴＲ）内に位置し得る。
一部の例では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡは、３’安定化領域（例えば、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドを含む３’安定化領域）の付加によって安定化され得る。理論に束縛されることは望まないが、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの付加はまた、ポリヌクレオチドの分解を緩徐化し得、したがって、ポリヌクレオチドの半減期を増加させ得る。他の例では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡは、オリゴ（oligio）（Ｕ）の付加を防止および／または阻害し得る、ポリヌクレオチドの３’領域に対する変更によって安定化され得る。なお他の例では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡは、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、３’－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、ならびに当該分野で公知のおよび／または本明細書に記載される他の代替的ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
一部の例では、本開示のｍＲＮＡは、ヒストンステムループ、ポリ－Ａ領域および／または５’－キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリ－Ａ領域の前および／または後にあり得る。ヒストンステムループおよびポリ－Ａ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載される鎖終結ヌクレオシドを含み得る。他の例では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループおよび５’－キャップ構造を含み得る。５’－キャップ構造には、本明細書に記載されるものおよび／または当該分野で公知のものが含まれ得るがこれらに限定されない。一部の例では、保存されたステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例では、ステムループ領域は、ｍｉＲ－１２２シード配列を含み得る。ｍＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステム－ループおよびポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ある特定の例では、ヒストンステムループおよびポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、病原体抗原またはその断片をコードし得る。他の例では、ヒストンステムループおよびポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、治療的タンパク質をコードし得る。一部の例では、ヒストンステムループおよびポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、腫瘍抗原またはその断片をコードし得る。他の例では、ヒストンステムループおよびポリ－Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、アレルゲン性抗原または自己免疫性自己抗原をコードし得る。
ｍＲＮＡは、ポリ－Ａ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリ－Ａ配列は、完全にまたは大部分が、アデニンヌクレオチドまたはそのアナログもしくは誘導体から構成され得る。ポリ－Ａ配列は、核酸の３’非翻訳領域に隣接して位置するテイルであり得る。ＲＮＡプロセシングの間に、アデノシンヌクレオチドの長い鎖（ポリ－Ａ領域）が通常は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加されて、分子の安定性を増加させる。転写直後に、転写物の３’末端は切断されて、３’－ヒドロキシを解放する。次いで、ポリ－Ａポリメラーゼが、アデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００残基長と２５０残基長との間のポリ－Ａ領域を付加する。独自のポリ－Ａ領域長さが、本開示の代替的ポリヌクレオチドに、ある特定の利点を提供し得る。
一般に、本開示のポリ－Ａ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の態様では、ポリ－Ａ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の態様では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の態様では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
一部の例では、ポリ－Ａ領域は、本明細書に記載される代替的ポリヌクレオチド分子上で８０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長であり得る。他の例では、ポリ－Ａ領域は、本明細書に記載される代替的ポリヌクレオチド分子上で２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチド長であり得る。
一部の態様では、本開示のポリ－Ａ領域の長さは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、２０００、２０１０、２０２０、２０３０、２０４０、２０５０、２０６０、２０７０、２０８０、２０９０、２１００、２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、２１６０、２１７０、２１８０、２１９０、２２００、２２１０、２２２０、２２３０、２２４０、２２５０、２２６０、２２７０、２２８０、２２９０、２３００、２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０、２３６０、２３７０、２３８０、２３９０、２４００、２４１０、２４２０、２４３０、２４４０、２４５０、２４６０、２４７０、２４８０、２４９０、２５００、２５１０、２５２０、２５３０、２５４０、２５５０、２５６０、２５７０、２５８０、２５９０、２６００、２６１０、２６２０、２６３０、２６４０、２６５０、２６６０、２６７０、２６８０、２６９０、２７００、２７１０、２７２０、２７３０、２７４０、２７５０、２７６０、２７７０、２７８０、２７９０、２８００、２８１０、２８２０、２８３０、２８４０、２８５０、２８６０、２８７０、２８８０、２８９０、２９００、２９１０、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０、もしくは３０００ヌクレオチド、多くても３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、２０００、２０１０、２０２０、２０３０、２０４０、２０５０、２０６０、２０７０、２０８０、２０９０、２１００、２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、２１６０、２１７０、２１８０、２１９０、２２００、２２１０、２２２０、２２３０、２２４０、２２５０、２２６０、２２７０、２２８０、２２９０、２３００、２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０、２３６０、２３７０、２３８０、２３９０、２４００、２４１０、２４２０、２４３０、２４４０、２４５０、２４６０、２４７０、２４８０、２４９０、２５００、２５１０、２５２０、２５３０、２５４０、２５５０、２５６０、２５７０、２５８０、２５９０、２６００、２６１０、２６２０、２６３０、２６４０、２６５０、２６６０、２６７０、２６８０、２６９０、２７００、２７１０、２７２０、２７３０、２７４０、２７５０、２７６０、２７７０、２７８０、２７９０、２８００、２８１０、２８２０、２８３０、２８４０、２８５０、２８６０、２８７０、２８８０、２８９０、２９００、２９１０、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０、もしくは３０００ヌクレオチド、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、２０００、２０１０、２０２０、２０３０、２０４０、２０５０、２０６０、２０７０、２０８０、２０９０、２１００、２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、２１６０、２１７０、２１８０、２１９０、２２００、２２１０、２２２０、２２３０、２２４０、２２５０、２２６０、２２７０、２２８０、２２９０、２３００、２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０、２３６０、２３７０、２３８０、２３９０、２４００、２４１０、２４２０、２４３０、２４４０、２４５０、２４６０、２４７０、２４８０、２４９０、２５００、２５１０、２５２０、２５３０、２５４０、２５５０、２５６０、２５７０、２５８０、２５９０、２６００、２６１０、２６２０、２６３０、２６４０、２６５０、２６６０、２６７０、２６８０、２６９０、２７００、２７１０、２７２０、２７３０、２７４０、２７５０、２７６０、２７７０、２７８０、２７９０、２８００、２８１０、２８２０、２８３０、２８４０、２８５０、２８６０、２８７０、２８８０、２８９０、２９００、２９１０、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０、もしくは３０００ヌクレオチドのうちのいずれか２つの間、または正確に３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、２
０００、２０１０、２０２０、２０３０、２０４０、２０５０、２０６０、２０７０、２０８０、２０９０、２１００、２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、２１６０、２１７０、２１８０、２１９０、２２００、２２１０、２２２０、２２３０、２２４０、２２５０、２２６０、２２７０、２２８０、２２９０、２３００、２３１０、２３２０、２３３０、２３４０、２３５０、２３６０、２３７０、２３８０、２３９０、２４００、２４１０、２４２０、２４３０、２４４０、２４５０、２４６０、２４７０、２４８０、２４９０、２５００、２５１０、２５２０、２５３０、２５４０、２５５０、２５６０、２５７０、２５８０、２５９０、２６００、２６１０、２６２０、２６３０、２６４０、２６５０、２６６０、２６７０、２６８０、２６９０、２７００、２７１０、２７２０、２７３０、２７４０、２７５０、２７６０、２７７０、２７８０、２７９０、２８００、２８１０、２８２０、２８３０、２８４０、２８５０、２８６０、２８７０、２８８０、２８９０、２９００、２９１０、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０、もしくは３０００ヌクレオチドである。
一部の例では、ポリ－Ａ領域は、代替的ポリヌクレオチド全体の長さに対して相対的に設計される。この設計は、代替的ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、代替的ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の特定の特色もしくは領域の長さに基づき得るか、または代替的ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。代替的ポリヌクレオチド（例えば、ポリ－Ａ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）のいずれかの特色と比較した場合、ポリ－Ａ領域は、さらなる特色よりも、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％大きい場合がある。ポリ－Ａ領域は、それが属する代替的ポリヌクレオチドの割合としても設計され得る。この文脈では、ポリ－Ａ領域は、構築物の総長さまたは構築物マイナスポリ－Ａ領域の総長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％またはそれよりも長い場合がある。
ある特定の例では、ポリ－Ａ結合タンパク質へのｍＲＮＡの操作された結合部位および／またはコンジュゲート化が、発現を増強するために使用され得る。操作された結合部位は、ｍＲＮＡの局所的微小環境のリガンドに対する結合部位として機能し得るセンサー配列であり得る。非限定的な例として、ｍＲＮＡは、ポリ－Ａ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）およびそのアナログの結合親和性を変更するために、少なくとも１つの操作された結合部位を含み得る。少なくとも１つの操作された結合部位の取込みは、ＰＡＢＰおよびそのアナログの結合親和性を増加させ得る。
さらに、複数の別個のｍＲＮＡが、ポリ－Ａ領域の３’末端における代替的ヌクレオチドを使用して、３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリ－Ａ結合タンパク質）に一緒に連結され得る。トランスフェクション実験が、適切な細胞株において実施され得、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および７日後に、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。非限定的な例として、トランスフェクション実験は、少なくとも１つの操作された結合部位の付加の結果としての、ＰＡＢＰまたはそのアナログの結合親和性に対する影響を評価するために使用され得る。ある特定の例では、ポリ－Ａ領域は、翻訳開始をモジュレートするために使用され得る。理論に束縛されることは望まないが、ポリ－Ａ領域は、翻訳開始複合体と次に相互作用することができ、したがって、タンパク質合成にとって重要であり得るＰＡＢＰを動員する。一部の例では、ポリ－Ａ領域はまた、３’－５’－エキソヌクレアーゼ消化に対する保護をもたらすために、本開示において使用され得る。
一部の例では、ｍＲＮＡは、ポリ－Ａ－Ｇカルテットを含み得る。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧ－リッチ配列によって形成され得る、４つのグアノシンヌクレオチドの、環状の水素結合されたアレイである。この態様では、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａ領域の末端において取り込まれる。得られたｍＲＮＡは、安定性、タンパク質産生、および種々の時点における半減期が含まれる他のパラメーターについてアッセイされ得る。ポリ－Ａ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリ－Ａ領域単独を使用して見られるタンパク質産生の少なくとも７５％と等価なタンパク質産生を生じることが発見されている。
一部の例では、ｍＲＮＡは、ポリ－Ａ領域を含み得、３’安定化領域の付加によって安定化され得る。ポリ－Ａ領域を有するｍＲＮＡは、５’－キャップ構造をさらに含み得る。他の例では、ｍＲＮＡは、ポリ－Ａ－Ｇカルテットを含み得る。ポリ－Ａ－Ｇカルテットを有するｍＲＮＡは、５’－キャップ構造をさらに含み得る。一部の例では、ｍＲＮＡを安定化するために使用され得る３’安定化領域には、ポリ－Ａ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットが含まれる。他の例では、本開示で使用され得る３’安定化領域は、鎖終結ヌクレオシド、例えば、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、２’，３’－ジデオキシチミン、２’－デオキシヌクレオシドまたはＯ－メチルヌクレオシドを含む。他の例では、ポリ－Ａ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むｍＲＮＡは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止および／または阻害し得る、ポリヌクレオチドの３’領域に対する変更によって安定化され得る。なお他の例では、ポリ－Ａ領域またはポリ－Ａ－Ｇカルテットを含むｍＲＮＡは、３’－デオキシヌクレオシド、２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、３’－Ｏ－メチルヌクレオシド、３’－Ｏ－エチルヌクレオシド、３’－アラビノシド、ならびに当該分野で公知のおよび／または本明細書に記載される他の代替的ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ分子に対する改変は、手動で操作され得るまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ合成器の分野の当業者に一般に公知の方法論を使用してＤＮＡもしくはＲＮＡ合成器と併せて使用され得る固体支持体を使用して、達成され得る。一般に、この手順は、選択された配列中で互いに隣接する２つのヌクレオシドの糖部分を官能化することを含む。５’から３’センスで、構造Ｈなどの「上流の」シントンは、その末端３’部位において改変されるが、構造Ｈ１などの「下流の」シントンは、その末端５’部位において改変される。
ヒドラジン、ヒドロキシルアミン（hydroxylarnine）および他の連結基によって連結されたオリゴヌクレオシドは、５’－ヒドロキシルにおいてジメトキシトリチル基によって保護され得、３’－ヒドロキシルにおいて亜リン酸シアノエチルジイソプロピル部分とのカップリングのために活性化され得る。これらの化合物は、標準的な固相自動化ＤＮＡまたはＲＮＡ合成技法によって、任意の所望の配列中に挿入され得る。最も一般的なプロセスの１つは、ホスホラミダイト技法である。均一な骨格連結を含有するオリゴヌクレオチドは、ＣＰＧ－固体支持体および標準的な核酸合成機械、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．３８０Ｂおよび３９４ならびにＭｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ７５００および８８００ｓの使用によって合成され得る。最初のヌクレオチド（３’末端における１番）が、固体支持体、例えば、制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）に結合される。配列特異的順序で、各新たなヌクレオチドは、手動操作または自動化合成器システムのいずれかによって結合される。
遊離アミノ基は、例えば、酢酸中のアセトンおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムでアルキル化され得る。アルキル化ステップは、高分子上に、他の有用な機能的分子を導入するために使用され得る。かかる有用な機能的分子には、レポーター分子、ＲＮＡ切断基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、およびオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基が含まれ得るがこれらに限定されない。かかる分子は、骨格連結中の窒素原子への結合を介して、高分子に結合またはコンジュゲートされ得る。あるいは、かかる分子は、１つまたは複数のヌクレオチドの糖部分のヒドロキシル基から伸びるペンダント基に結合され得る。かかる他の有用な官能基の例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９３００７８８３によって、上で言及した特許出願の他のものにおいて、提供される。
固体支持体には、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル制御多孔性ガラス、ＴＥＮＴＡＧＥＬ（登録商標）支持体 － アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、またはＰｏｒｏｓ － ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーが含まれる、ポリヌクレオチド合成のために当該分野で公知のもののいずれかが含まれ得る。ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの結合および切断は、標準的な手順を介してもたらされ得る。本明細書で使用される場合、固体支持体という用語は、ＣＰＧなどの固定相に成長中のオリゴヌクレオシドを結合させるために使用される任意のリンカー（例えば、長鎖アルキルアミンおよびスクシニル残基）をさらに含む。一部の態様では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックトヌクレオチド、エチレン架橋されたヌクレオチド、ペプチド核酸または５’（Ｅ）－ビニル－ホスホネート（ＶＰ）改変を有するとさらに定義され得る。一部の態様では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート化されたＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を有する。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ分子は、種々の方法を使用して分析および特徴付けされ得る。分析は、キャッピングの前または後に実施され得る。あるいは、分析は、ポリ－Ａ捕捉ベースの親和性精製の前または後に実施され得る。別の態様では、分析は、さらなる精製ステップ、例えば、アニオン交換クロマトグラフィーなどの前または後に実施され得る。例えば、ｍＲＮＡ品質は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップベースの電気泳動システムを使用して決定され得る。他の態様では、ｍＲＮＡ純度は、分析的逆相ＨＰＬＣを使用して分析される。キャッピング効率は、例えば、全体的ヌクレアーゼ消化と、その後の、ジヌクレオチドキャップ種対キャップされていないＧＴＰ種のＭＳ／ＭＳ定量化とを使用して、分析され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、例えば、ｍＲＮＡ分子をヒト細胞株中にトランスフェクトすることによって分析され得る。目的のポリペプチドのタンパク質発現は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの方法を使用して定量化され得る。免疫原性は、例えば、ｍＲＮＡ分子を、自然免疫刺激を示す細胞株、例えばＰＢＭＣ中にトランスフェクトすることによって分析され得る。サイトカイン誘導は、例えば、サイトカイン、例えばインターフェロン－αを定量化するために、ＥＬＩＳＡなどの方法を使用して分析され得る。
一部の態様では、ＲＮＡ分子は、ｓａＲＮＡである。「ｓａＲＮＡ」、「自己増幅性ＲＮＡ」および「レプリコン」は、それ自体を複製する能力を有するＲＮＡを指す。自己増幅性ＲＮＡ分子は、ウイルス（単数または複数）、例えば、アルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、構造的ウイルスポリペプチドを、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、産生され得る。自己増幅性ＲＮＡ分子は、典型的には、細胞への送達後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を次に産生するＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを提供する。送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生をもたらす。これらの娘ＲＮＡ、ならびに同一直線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体翻訳されて、目的のコードされる遺伝子、例えばウイルス抗原のｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供し得るか、または目的のタンパク質、例えば抗原のｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供するように翻訳される送達されたＲＮＡと同じ意味を有するさらなる転写物を提供するように転写され得る。転写のこの配列の全体的な結果は、導入されるｓａＲＮＡの数における増幅であり、したがって、目的のコードされる遺伝子、例えば、ウイルス抗原は、細胞の主要なポリペプチド産物になり得る。
一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼおよび他の非構造ウイルスタンパク質のうちのいずれか１つから選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡは、５’末端および３’末端牽引（ｔｒａｃｔｉｖｅ）複製配列、ならびに任意選択により、所望のアミノ酸配列（例えば、目的の抗原）をコードする異種配列もまた含み得る。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己増幅性ＲＮＡ中に含まれ得る。任意選択により、異種配列（例えば、目的の抗原）は、自己増幅性ＲＮＡ中の他のコード領域とインフレームで融合され得、および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあり得る。
一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、ウイルス様粒子中にカプセル封入されない。本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、自己増幅性ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導できないように設計され得る。これは、例えば、自己増幅性ＲＮＡ中のウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を除外することによって達成され得る。例えば、自己増幅性ＲＮＡ分子が、アルファウイルス、例えば、シンドビス（Sinbis）ウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に基づく場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子は、除外され得る。
一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己増幅性ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）目的のポリペプチド、例えば、ウイルス抗原をコードする。一部の態様では、ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４のうちのいずれか１つ、およびそれらの任意の組み合わせを含む、アルファウイルスレプリカーゼであり得る。一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の改変されたヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン）を含み得る。一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、改変されたヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン）を含まない。
ｓａＲＮＡ構築物は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列の５’側または３’側に配置された少なくとも１つの非構造タンパク質（ＮＳＰ）をコードし得る。一部の態様では、少なくとも１つのＮＳＰをコードする配列は、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列の５’側に配置される。したがって、少なくとも１つのＮＳＰをコードする配列は、ＲＮＡ構築物の５’末端に配置され得る。一部の態様では、ＲＮＡ構築物によってコードされる少なくとも１つの非構造タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼｎｓＰ４であり得る。一部の態様では、ｓａＲＮＡ構築物は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４をコードする。当該分野で公知のように、ｎｓＰ１は、ウイルスキャッピング酵素であり、複製複合体（ＲＣ）の膜アンカーである。ｎｓＰ２は、ＲＮＡヘリカーゼであり、ｎｓポリタンパク質プロセシングを担うプロテアーゼである。ｎｓＰ３は、いくつかの宿主タンパク質と相互作用し、タンパク質のポリ－およびモノ－ＡＤＰ－リボシル化をモジュレートし得る。ｎｓＰ４は、コアウイルスＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼである。一部の態様では、ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１つまたは複数を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。
天然のアルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリペプチドに加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするが、一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしない。一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡは、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらし得るが、ビリオンを含むＲＮＡの産生はもたらさない。理論にも機構にも束縛されないが、これらのビリオンを産生できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己増幅性ＲＮＡ分子が、それ自体を感染性形態で永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおける永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本開示の自己増幅性ＲＮＡには存在していなくてもよく、それらの場所は、サブゲノム転写物が構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく免疫原をコードするように、目的の免疫原をコードする遺伝子によって占められ得る。
一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし得る；第２の（３’）オープンリーディングフレームは、目的の抗原を含むポリペプチドをコードし得る。一部の態様では、ＲＮＡは、例えば、さらなる抗原をコードするためまたはアクセサリーポリペプチドをコードするための、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。
一部の態様では、ｓａＲＮＡ分子は、（１）アルファウイルス５’複製認識配列、および（２）アルファウイルス３’複製認識配列をさらに含む。一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子の５’配列は、コードされるレプリカーゼとの適合性を確実にするように選択される。
任意選択により、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性の感染性ウイルス粒子の産生を誘導するため、または単一ラウンドの引き続く感染が可能なウイルス粒子を産生するためにも設計され得る。
一部の態様では、ｓａＲＮＡ分子は、アルファウイルスベースである。アルファウイルスは、トガウイルス科の遺伝的、構造的および血清学的に関連する節足動物媒介ウイルスのセットを含む。アルファウイルス属内の例示的なウイルスおよびウイルスサブタイプには、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスが含まれる。このように、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスのうちのいずれか１つに由来するＲＮＡレプリカーゼを取り込み得る。一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡは、変異体または野生型ウイルス配列に由来する配列を取り込み得、例えば、ＶＥＥＶの弱毒化されたＴＣ８３変異体が、ｓａＲＮＡにおいて使用されている。
アルファウイルスベースのｓａＲＮＡは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ－トランスクリプターゼ）の翻訳をもたらす、細胞への送達後に翻訳され得る（＋）鎖ｓａＲＮＡである。レプリカーゼは、送達された（＋）鎖ＲＮＡのゲノム（－）鎖コピーを創出する複製複合体を提供するように自己切断するポリタンパク質として翻訳される。これらの（－）鎖転写物は、（＋）鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを提供するため、およびまた、所望の遺伝子産物をコードするサブゲノム転写物を提供するために、それ自体転写され得る。したがって、サブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による所望の遺伝子産物のｉｎ ｓｉｔｕ発現をもたらす。適切なアルファウイルスｓａＲＮＡは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはそれらの変異体バリアント由来のレプリカーゼを使用し得る。
一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、例えば、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびに特に、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルスまたはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適切な野生型アルファウイルス配列は周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列受託機関から入手可能である。適切なアルファウイルスの代表的な例には、アウラ（Ａｕｒａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－３６８）、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６００、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４０）、キャバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６４、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６５、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４２）、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３６９、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４３）、キジラガチ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ ＶＲ－６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－１２７７）、ミドルバーグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７０）、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－５８０、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４４）、ンドゥム（Ｎｄｕｍｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７１）、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７２、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６８、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－４６９）、ウナ（Ｕｎａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７４）、ベネズエラウマ脳炎（ＡＴＣＣ ＶＲ－６９、ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ－７０、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ－６２２、ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５２）、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２６）およびＹ－６２－３３（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７５）が含まれる。一部の態様では、リスト中のアルファウイルスのうちの１つまたは複数は、排除され得る。
一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、他の型のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）よりも大きい。典型的には、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含む。例えば、自己増幅性ＲＮＡは、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂのうちのいずれか１つ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂのうちの少なくともいずれか１つ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂのうちの多くてもいずれか１つ、または３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂのうちのいずれか２つの間と等しい場合がある。一部の例では、自己増幅性ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂよりも多くを含み得る。ある特定の例では、自己増幅性ＲＮＡは、約４ｋｂ～約１２ｋｂ、約５ｋｂ～約１２ｋｂ、約６ｋｂ～約１２ｋｂ、約７ｋｂ～約１２ｋｂ、約８ｋｂ～約１２ｋｂ、約９ｋｂ～約１２ｋｂ、約１０ｋｂ～約１２ｋｂ、約１１ｋｂ～約１２ｋｂ、約５ｋｂ～約１１ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約６ｋｂ～約１２ｋｂ、約６ｋｂ～約１１ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約７ｋｂ～約１１ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約８ｋｂ～約１１ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約９ｋｂ～約１１ｋｂ、約９ｋｂ～約１０ｋｂまたは約１０ｋｂ～約１１ｋｂである。
一部の態様では、自己増幅性ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド抗原、または任意選択により、アミノ酸配列として発現された場合に配列の各々がそのアイデンティティーを保持するような方法で一緒に連結された（例えば、連続して連結された）２つもしくはそれよりも多くのポリペプチド抗原をコードし得る。次いで、自己増幅性ＲＮＡから生成されたポリペプチドは、融合ポリペプチドとして産生され得るか、または別々のポリペプチドもしくはペプチド配列を生じるような様式で操作され得る。
一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡは、ある範囲のエピトープを含む１つまたは複数のポリペプチド抗原をコードし得る。一部の態様では、本明細書に記載される自己増幅性ＲＮＡは、ヘルパーＴ細胞応答もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答のいずれかまたはその両方を惹起することが可能なエピトープをコードし得る。
ＩＩＩ．脂質および脂質ナノ粒子
ある態様では、本明細書で開示される組成物は、脂質を含む。例えば、組成物は、脂質およびｍＲＮＡ（例えば、ｍｏｄＲＮＡ）を含み得、脂質およびｍＲＮＡ（例えば、ｍｏｄＲＮＡ）は、一緒になってナノ粒子を形成し得、それにより、ｍＲＮＡ含有の、脂質を含むナノ粒子を産生する。脂質は、ＲＮＡ／脂質ナノ粒子の安定性、細胞進入および細胞内放出を助けるために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で、ｍＲＮＡをカプセル封入し得るまたはｍＲＮＡと会合し得る。
一部の例では、ＬＮＰは、ミセル、固体脂質ナノ粒子、ナノエマルジョン、リポソームなど、またはそれらの組み合わせを含む。
ＬＮＰの脂質構成要素には、例えば、カチオン性脂質、リン脂質（例えば、不飽和脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、ポリマー－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ化脂質）、構造脂質、イオン化可能な脂質、中性脂質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。脂質構成要素の要素は、特定の割合で提供され得る。本開示の方法に適切なカチオン性脂質、リン脂質、ポリマー－脂質コンジュゲート、構造脂質、イオン化可能な脂質および中性脂質は、本明細書でさらに開示される。
一部の態様では、ＬＮＰの脂質構成要素には、カチオン性脂質、リン脂質、ポリマー－脂質コンジュゲート、構造脂質、イオン化可能な脂質、および／または中性脂質のうちのいずれか１つまたは複数が含まれる。ある特定の態様では、脂質ナノ粒子の脂質構成要素は、約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質）；約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のリン脂質（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のリン脂質）；約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の構造脂質（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ｍｏｌ％の構造脂質）；約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のポリマー－脂質コンジュゲート（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のポリマー－脂質コンジュゲート）；約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のイオン化可能な脂質）；および／または約０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の中性脂質（例えば、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％のうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌ％の中性脂質）を含む。ＬＮＰは、総ｍｏｌ％が１００％を超えないことを条件として、任意の量の上述の脂質構成要素を有し得る。本明細書で使用される場合、「ｍｏｌパーセント」は、ＬＮＰ中の全ての脂質構成要素の総ｍｏｌ（即ち、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート化脂質の総ｍｏｌ）と比較した、構成要素のモルパーセンテージを指す。
一部の態様では、脂質ナノ粒子の脂質構成要素は、約３５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％のカチオン性脂質の化合物、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のポリマー－脂質コンジュゲートを含む。特定の態様では、脂質構成要素は、約５０ｍｏｌ％の当該カチオン性脂質、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約４０ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のポリマー－脂質コンジュゲートを含む。別の特定の態様では、脂質構成要素は、約４０ｍｏｌ％の当該カチオン性脂質、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約４０ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のポリマー－脂質コンジュゲートを含む。特定の態様では、脂質ナノ粒子の脂質構成要素は、カチオン性脂質、リン脂質、構造脂質およびポリマー－脂質コンジュゲートを、約４７．５：１０：４０．７：１．８のモル比で含む。
一部の態様では、脂質ナノ粒子の脂質構成要素は、約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のカチオン性脂質の化合物、約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のリン脂質、および約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の構造脂質を含む。特定の態様では、脂質構成要素は、約２ｍｏｌ％の当該カチオン性脂質、約４９ｍｏｌ％のリン脂質、および約４９ｍｏｌ％の構造脂質を含む。特定の態様では、脂質ナノ粒子の脂質構成要素は、カチオン性脂質、リン脂質および構造脂質を、約１．８：４９．１：４９．１のモル比で含む。
一部の態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであり得る。他の態様では、ポリマー－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－ＤＭＧであり得、および／または構造脂質は、コレステロールであり得る。他の態様では、ポリマー－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－２０００ ＤＭＧであり得、および／または構造脂質は、コレステロールであり得る。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、
ｉ）４０ｍｏｌパーセントと５０ｍｏｌパーセントとの間のカチオン性脂質；
ｉｉ）リン脂質および／または中性脂質；
ｉｉｉ）構造脂質；
ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質；ならびに
ｖ）脂質ナノ粒子内にカプセル封入されたまたは脂質ナノ粒子と会合した治療剤（即ち、ＲＮＡ）
を含む。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、
ｉ）０ｍｏｌ％と１０ｍｏｌ％との間のカチオン性脂質；
ｉｉ）リン脂質および／または中性脂質；ならびに
ｉｉｉ）ステロイド
を含む。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、４１～５０ｍｏｌパーセント、４２～５０ｍｏｌパーセント、４３～５０ｍｏｌパーセント、４４～５０ｍｏｌパーセント、４５～５０ｍｏｌパーセント、４６～５０ｍｏｌパーセント、または４７～５０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。ある特定の具体的な態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも約４１．０、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２．０、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３．０、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４．０、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５．０、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６．０、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８．０、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９．０、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、もしくは５０ｍｏｌパーセント、多くても約４１．０、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２．０、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３．０、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４．０、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５．０、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６．０、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８．０、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９．０、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、もしくは５０ｍｏｌパーセント、４１．０、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２．０、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３．０、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４．０、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５．０、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６．０、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８．０、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９．０、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、もしくは５０ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に４１．０、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２．０、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３．０、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４．０、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５．０、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６．０、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８．０、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、４９．０、４９．１、４９．２、４９．３、４９．４、４９．５、４９．６、４９．７、４９．８、４９．９、もしくは５０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。
他の態様では、脂質ナノ粒子は、０～１０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。ある特定の具体的な態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセント、多くても約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセント、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質を含む。
一部の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、５～１５ｍｏｌパーセント、７～１３ｍｏｌパーセントまたは９～１１ｍｏｌパーセントの範囲の濃度で存在する。ある特定の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、少なくとも約５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、もしくは１５ｍｏｌパーセント、多くても約５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、もしくは１５ｍｏｌパーセント、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、もしくは１５ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、もしくは１５ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、リン脂質および／または中性脂質は、約９．５、１０または１０．５ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。
他の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、４０～６０ｍｏｌ％の範囲の濃度で存在する。ある特定の態様では、リン脂質および／または中性脂質は、少なくとも約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセント、多くても約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセント、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、リン脂質および／または中性脂質は、約４８、４９または５０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。
一部の態様では、カチオン性脂質のリン脂質および／または中性脂質に対するモル比は、約４．１：１．０～約４．９：１．０、約４．５：１．０～約４．８：１．０または約４．７：１．０～４．８：１．０の範囲である。他の態様では、リン脂質および／または中性脂質のカチオン性脂質に対するモル比は、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８または１：４．９である。
一部の態様では、構造脂質は、ステロイドである。一部の態様では、ステロイドは、コレステロールである。一部の態様では、構造脂質は、３９～４９モルパーセント、４０～４６モルパーセント、４０～４４モルパーセント、４０～４２モルパーセント、４２～４４モルパーセントまたは４４～４６モルパーセントの範囲の濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、構造脂質は、少なくとも約３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、もしくは４９ｍｏｌパーセント、多くても約３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、もしくは４９ｍｏｌパーセント、３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、もしくは４９ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に３９、３９．１、３９．２、３９．３、３９．４、３９．５、３９．６、３９．７、３９．８、３９．９、４０、４０．１、４０．２、４０．３、４０．４、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１、４１．１、４１．２、４１．３、４１．４、４１．５、４１．６、４１．７、４１．８、４１．９、４２、４２．１、４２．２、４２．３、４２．４、４２．５、４２．６、４２．７、４２．８、４２．９、４３、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５、４３．６、４３．７、４３．８、４３．９、４４、４４．１、４４．２、４４．３、４４．４、４４．５、４４．６、４４．７、４４．８、４４．９、４５、４５．１、４５．２、４５．３、４５．４、４５．５、４５．６、４５．７、４５．８、４５．９、４６、４６．１、４６．２、４６．３、４６．４、４６．５、４６．６、４６．７、４６．８、４６．９、４７、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９、４８、４８．１、４８．２、４８．３、４８．４、４８．５、４８．６、４８．７、４８．８、４８．９、もしくは４９ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、構造脂質は、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６モルパーセントの濃度で存在する。
他の態様では、構造脂質は、４０～６０ｍｏｌ％の範囲の濃度で存在する。ある特定の態様では、構造脂質は、少なくとも約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセント、多くても約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセント、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセントのうちのいずれか２つの間、または正確に４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。ある特定の具体的な態様では、構造脂質は、約４８、４９または５０ｍｏｌパーセントの濃度で存在する。
ある特定の態様では、カチオン性脂質の構造脂質に対するモル比は、１．０：０．９～１．０：１．２または１．０：１．０～１．０：１．２の範囲、例えば、１：０．９、１：１、１：１．１または１：１．２である。
好ましい態様では、カチオン性脂質は、以下の構造（ＩＥ）：
Figure 2024537854000001
 を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩もしくは立体異性体であり、式中、
Ｇ１およびＧ２は各々独立して、未置換のアルキレンであり；
Ｇ３は、未置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンであり；
Ｒ１およびＲ２は各々独立して、Ｃ６～Ｃ２４アルキルであり；
Ｒ３は、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４またはＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。
一部の態様では、化合物は、以下の構造：
Figure 2024537854000002
 を含み、式中、Ｒ６は、各存在においてＨであり；ｎは、２～１２の範囲の整数であり；ｙおよびｚは各々独立して、６～９の範囲の整数である。一部の態様では、ｎは、３、４、５または６．４である。一部の態様では、ｙおよびｚは、各々６である。一部の態様では、ｙおよびｚは、各々９である。一部の態様では、Ｒ１およびＲ２は各々独立して、以下の構造を有し、式中、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各存在において、独立してＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり；ａは、２～１２の整数であり、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａは各々、Ｒ１およびＲ２が各々独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。一部の態様では、ａは、８～１２の整数である。一部の態様では、Ｒ７ａの少なくとも１つの存在は、Ｈである。一部の態様では、Ｒ７ａは、各存在において、Ｈである。一部の態様では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの存在は、Ｃ１～Ｃ８アルキルである。一部の態様では、Ｃ１～Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。一部の態様では、Ｒ３は、ＯＨである。一部の態様では、Ｒ３は、ＣＮである。一部の態様では、Ｒ３は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。一部の態様では、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。一部の態様では、化合物は、以下の構造：
Figure 2024537854000003
 を有する。
さらなる例示的なイオン化可能な脂質には、当該分野で公知の
Figure 2024537854000004
 が含まれる。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成要素は、ＰＥＧまたはＰＥＧ改変された脂質など、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含み得る。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれ得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで改変された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ改変されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ改変されたホスファチジン酸、ＰＥＧ改変されたセラミド、ＰＥＧ改変されたジアルキルアミン、ＰＥＧ改変されたジアシルグリセロール、ＰＥＧ改変されたジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物が含まれる非限定的な群から選択され得る。一部の態様では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。本明細書で使用される場合、用語「ＰＥＧ脂質」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）改変された脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例には、ＰＥＧ改変されたホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣｌ４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変されたジアルキルアミンならびにＰＥＧ改変された１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。一部の態様では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の態様では、ＰＥＧ改変された脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの改変された形態である。
一部の態様では、ＰＥＧ改変された脂質は、式（ＩＶ）：
Figure 2024537854000005
 を有するＰＥＧ脂質であり、式中、Ｒ８およびＲ９は各々独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖には、１つまたは複数のエステル結合が割り込んでいてもよく；ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。
一部の態様では、ポリマーコンジュゲート化脂質は、式（ＩＶ）：
Figure 2024537854000006
 を含むポリオキサゾリン（ＰＯＺ）脂質である。
ＰＯＺは、当該分野で公知であり、２０２０年６月２９日出願のＷＯ／２０２０／２６４５０５、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４０１４０に記載されている。
一部の態様では、ＰＥＧ化脂質は、以下の構造（ＩＩ）：
Figure 2024537854000007
 またはその薬学的に許容できる塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、式中、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、１０～３０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖には、１つまたは複数のエステル結合が割り込んでいてもよく；ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有し、ただし、Ｒ１０およびＲ１１は、ｚが４２である場合には、共にｎ－オクタデシルであることはない。ＰＥＧ化脂質の一部の態様では、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、１２～１６個の炭素原子を含有する直鎖の飽和アルキル鎖である。ＰＥＧ化脂質の一部の態様では、ｚは、約４５である。
一部の態様では、ＰＥＧ化脂質は、以下の構造：
Figure 2024537854000008
 のうちの１つを有し、式中、ｎは、４０～５０の範囲の平均値を有する。好ましい態様では、組成物は、上記ＡＬＣ－３１５カチオン性脂質と、以下の構造：
Figure 2024537854000009
 のうちの１つを有するＰＥＧ化脂質とを含む。
上記ＰＥＧ化脂質の一部の態様では、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、１２個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和アルキル鎖である。上記ＰＥＧ化脂質の一部の態様では、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、１４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和アルキル鎖である。上記ＰＥＧ化脂質の一部の態様では、Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、１６個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和アルキル鎖である。さらなる例示的な脂質およびその関連の製剤は、例えば、２０１７年２月１４日出願の米国特許第９，７３７，６１９号、２０１６年１０月２８日出願の米国特許第１０，１６６，２９８号、および２０１７年１０月２６日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５８６１９に開示されており、それらの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＬ－ｌ）：
Figure 2024537854000010
 の化合物またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒｉは、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；Ｒ４は、水素、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２および未置換のＣ１～６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒｅ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２Ｊ －Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４および５から選択され；各Ｒ５は独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され；各Ｒｅは独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され；ＭおよびＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から選択され、式中、Ｍ”は、結合、Ｃ１～１３アルキルまたはＣ２～１３アルケニルであり；Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され；Ｒｅは、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され；Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され；各Ｒは独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され；各Ｒ’は独立して、Ｃ１～１５アルキル、Ｃ２～１５アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”およびＨからなる群から選択され；各Ｒ”は独立して、Ｃ３～１５アルキルおよびＣ３～１５アルケニルからなる群から選択され；各Ｒ＊は独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され；各Ｙは独立して、Ｃ３～６炭素環であり；各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択され；ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択され；Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４もしくは５である場合には、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２でなく、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２である場合には、Ｑは、５、６もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
好ましい態様では、組成物は、核酸をさらに含む。好ましい態様では、核酸は、メッセンジャーＲＮＡを含む。一部の態様では、組成物は、中性脂質およびステロイドから選択される１つまたは複数の賦形剤をさらに含む。一部の態様では、組成物は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される１つまたは複数の中性脂質を含む。好ましくは、一部の態様では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。好ましくは、一部の態様では、ステロイドは、コレステロールである。
ＬＮＰは、本明細書に記載される１つまたは複数の構成要素を含み得る。一部の態様では、本開示のＬＮＰ製剤は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成要素を含む。脂質ナノ粒子は、脂質構成要素および１つまたは複数のさらなる構成要素、例えば、治療薬および／または予防薬、例えば、核酸を含み得る。ＬＮＰは、１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計され得る。ＬＮＰの要素は、特定の適用もしくは標的に基づいて、および／または１つもしくは複数の要素の効力、毒性、費用、使用の容易さ、入手可能性もしくは他の特色に基づいて選択され得る。同様に、ＬＮＰの特定の製剤は、例えば、要素の特定の組み合わせの効力および毒性に従って、特定の適用または標的のために選択され得る。ＬＮＰ製剤の効力および忍容性は、製剤の安定性によって影響され得る。
脂質ナノ粒子は、１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計され得る。例えば、ＬＮＰは、治療薬および／または予防薬、例えば、ＲＮＡを、哺乳動物の身体中の特定の細胞、組織、臓器もしくは系またはそれらの群に送達するために設計され得る。脂質ナノ粒子の生理化学的特性は、特定の身体標的に対する選択性を増加させるために変更され得る。例えば、粒子サイズは、異なる臓器の開窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）サイズに基づいて調整され得る。ＬＮＰ中に含まれる治療薬および／または予防薬は、所望の送達標的（単数または複数）に基づいても選択され得る。例えば、治療薬および／または予防薬は、特定の適応症、状態、疾患もしくは障害のために、および／または特定の細胞、組織、臓器もしくは系またはそれらの群への送達（例えば、限局性のまたは特異的な送達）のために選択され得る。ある特定の態様では、ＬＮＰは、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することが可能な、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。かかる組成物は、特定の臓器に特異的に送達されるように設計され得る。一部の態様では、組成物は、哺乳動物の肝臓に特異的に送達されるように設計され得る。一部の態様では、組成物は、リンパ節に特異的に送達されるように設計され得る。一部の態様では、組成物は、哺乳動物の脾臓に特異的に送達されるように設計され得る。
一部の態様では、ポリマーが、ＬＮＰ中に含まれ得る、および／またはＬＮＰをカプセル封入もしくは部分的にカプセル封入するために使用され得る。ポリマーは、生分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリルおよびポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（酢酸ビニル）、ポリハロゲン化ビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロクサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、炭酸トリメチレン、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールが含まれ得る。
一部の態様では、表面変更剤が、ＬＮＰ中に含まれ得る、および／またはＬＮＰをカプセル封入もしくは部分的にカプセル封入するために使用され得る。表面変更剤には、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロクサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシンおよびエルドステイン）およびＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が含まれ得るがこれらに限定されない。表面変更剤は、ナノ粒子内および／またはＬＮＰの表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合的連結または他のプロセスによって）配置され得る。
ＬＮＰは、１つまたは複数の官能化された脂質もまた含み得る。例えば、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露された場合に付加環化反応を受け得るアルキン基で官能化され得る。特に、脂質二重層は、膜浸透、細胞認識または画像化を容易にするのに有用な１つまたは複数の基で、この方式で官能化され得る。ＬＮＰの表面はまた、１つまたは複数の有用な抗体とコンジュゲートされ得る。標的化された細胞送達、画像化および膜浸透において有用な官能基およびコンジュゲートは、当該分野で周知である。
これらの構成要素に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物において有用な任意の物質を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、例えば、１つまたは複数の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、表面活性剤、緩衝化剤、防腐剤および他の種であるがこれらに限定されない１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤またはアクセサリー成分を含み得る。
表面活性剤および／または乳化剤には、天然の乳化剤（例えば、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コレステロールおよびレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレートおよびＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムおよび／またはそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。
防腐剤の例には、抗酸化剤、キレート剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤および／または他の防腐剤が含まれ得るがこれらに限定されない。抗酸化剤の例には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび／または亜硫酸ナトリウムが含まれるがこれらに限定されない。キレート剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸および／またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。抗菌防腐剤の例には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコールおよび／またはチメロサールが含まれるがこれらに限定されない。抗真菌防腐剤の例には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸が含まれるがこれらに限定されない。アルコール防腐剤の例には、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエートおよび／またはフェニルエチルアルコールが含まれるがこれらに限定されない。酸性防腐剤の例には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸および／またはフィチン酸が含まれるがこれらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるがこれらに限定されない。例示的なフリーラジカルスカベンジャーには、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴまたはブチルヒドロキシトルエン）またはデフェロキサミンが含まれる。一部の好ましい態様では、組成物は、防腐剤を含まない。
緩衝化剤の例には、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸塩（ｃａｌｃｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノ－スルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質なしの水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、および／またはそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。一部の態様では、組成物中の緩衝液の濃度は、約１０ｍＭである。例えば、緩衝液濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭもしくは２０ｍＭのうちのいずれか１つ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭもしくは２０ｍＭのうちの少なくともいずれか１つ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭもしくは２０ｍＭのうちの多くてもいずれか１つ、または１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭもしくは２０ｍＭのうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しくすることができる。具体的な態様では、緩衝液濃度は、１０ｍＭである。緩衝液は、中性ｐＨ、ｐＨ６．５～８．５、ｐＨ７．０～ｐＨ８．０またはｐＨ７．２～ｐＨ７．６であり得る。例えば、緩衝液は、ｐＨ６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値であり得る。具体的な態様では、緩衝液は、ｐＨ７．４である。
一部の態様では、ＬＮＰを含む製剤は、塩、例えば塩化物塩をさらに含み得る。一部の態様では、ＬＮＰを含む製剤は、糖、例えば二糖をさらに含み得る。一部の態様では、製剤は、糖をさらに含むが、塩、例えば塩化物塩は含まない。一部の態様では、ＬＮＰは、１つまたは複数の小さい疎水性分子、例えば、ビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）またはステロールをさらに含み得る。炭水化物には、単糖（ｓｉｍｐｌｅ ｓｕｇａｒ）（例えば、グルコース）および多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体およびアナログ）が含まれ得る。
ＬＮＰの特徴は、その構成要素に依存し得る。例えば、コレステロールを構造脂質として含むＬＮＰは、異なる構造脂質を含むＬＮＰとは異なる特徴を有し得る。本明細書で使用される場合、用語「構造脂質」は、ステロールを指し、ステロール部分を含有する脂質もまた指す。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。一部の態様では、構造脂質は、ステロイドである。一部の態様では、構造脂質は、コレステロールである。一部の態様では、構造脂質は、コレステロールのアナログである。一部の態様では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
一部の態様では、ＬＮＰの特徴は、その構成要素の絶対量または相対量に依存し得る。例えば、より高いモル割合のリン脂質を含むＬＮＰは、より低いモル割合のリン脂質を含むＬＮＰとは異なる特徴を有し得る。特徴は、脂質ナノ粒子の調製の方法および条件に依存しても変動し得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。特定のリン脂質は、膜への融合を容易にし得る。一部の態様では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が膜を通過するのを可能にして、例えば、標的組織への１つまたは複数の要素の送達を可能にし得る。分岐、酸化、環化およびアルキンが含まれる改変および置換を有する天然の種が含まれる非天然のリン脂質種もまた企図される。一部の態様では、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化され得るまたはそれと交差連結され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露の際に、銅触媒される付加環化を受け得る。かかる反応は、膜浸透もしくは細胞認識を容易にするためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化する際に、またはナノ粒子組成物を有用な構成要素、例えば、標的化もしくは画像化部分（例えば、色素）にコンジュゲート化する際に、有用であり得る。リン脂質には、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジル－エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル（phosphatidy）グリセロールおよびホスファチジン酸が含まれるがこれらに限定されない。リン脂質には、スフィンゴリン脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含まれる。一部の態様では、本発明において有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。
両親媒性ポリマーおよび脂質ナノ粒子を含む製剤は、全体的にまたは一部、医薬組成物として製剤化され得る。医薬組成物は、１つまたは複数の両親媒性ポリマーおよび１つまたは複数の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つまたは複数の両親媒性ポリマーならびに１つもしくは複数の異なる治療薬および／もしくは予防薬を含む１つまたは複数の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤またはアクセサリー成分、例えば、本明細書に記載されるものをさらに含み得る。医薬組成物および薬剤の製剤化および製造のための一般的なガイドラインは、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６において入手可能である。任意の従来の賦形剤またはアクセサリー成分が、本開示の製剤中のＬＮＰの１つもしくは複数の構成要素または１つもしくは複数の両親媒性ポリマーと不適合であり得る場合を除き、従来の賦形剤およびアクセサリー成分が、任意の医薬組成物において使用され得る。賦形剤またはアクセサリー成分は、構成要素または両親媒性ポリマーとのその組み合わせが任意の望ましくない生物学的影響または他の有害な影響を生じ得る場合、製剤のＬＮＰの構成要素または両親媒性ポリマーと不適合であり得る。
一部の態様では、組成物は、薬学的に許容できる担体および／またはビヒクルを含み得る。一部の態様では、組成物は、発熱物質なしの水；等張食塩水または緩衝化（水性）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などの緩衝化溶液をさらに含み得る。一部の態様では、組成物は、水、ならびに／またはナトリウム塩、例えば、少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、一部の態様では、少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、および任意選択により、カリウム塩、一部の態様では、少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含有する緩衝液を含み得る。一部の態様では、ナトリウム塩、カルシウム塩、および任意選択により、カリウム塩は、それらのハロゲン化物、例えば、塩化物、ヨウ化物または臭化物の形態で、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩の形態などで存在し得る。ナトリウム塩の例には、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が含まれ、カリウム塩の例には、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が含まれ、カルシウム塩の例には、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が含まれる。一部の態様では、上述のカチオンの有機アニオンが、緩衝液中に含有され得る。一部の態様では、組成物は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含み得、さらなるアニオンが、塩化物に加えて存在し得る。ＣａＣｌ２は、ＫＣｌなどの別の塩によって置き換えることもできる。一部の態様では、注射緩衝液は、特定の参照媒体を参照して高張、等張または低張であり得る、即ち、緩衝液は、特定の参照媒体を参照してより高い、同一なまたはより低い塩含量を有し得、浸透または他の濃度効果に起因する細胞の損傷を最小化する上述の塩のかかる濃度が使用され得る。組成物中の塩の濃度は、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭであり得る。例えば、塩濃度は、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭもしくは２００ｍＭのうちのいずれか１つ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭもしくは２００ｍＭのうちの少なくともいずれか１つ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭもしくは２００ｍＭのうちの多くてもいずれか１つ、または５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭもしくは２００ｍＭのうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しくすることができる。塩は、中性ｐＨ、ｐＨ６．５～８．５、ｐＨ７．０～ｐＨ８．０またはｐＨ７．２～ｐＨ７．６であり得る。例えば、塩は、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５のうちのいずれか１つ、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５のうちの少なくともいずれか１つ、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５のうちの多くてもいずれか１つ、または６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５のうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しいｐＨであり得る。
一部の態様では、１つまたは複数の賦形剤またはアクセサリー成分は、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または体積の５０％よりも多くを構成し得る。例えば、１つまたは複数の賦形剤またはアクセサリー成分は、製薬の慣習により、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くを構成し得る。一部の態様では、薬学的に許容できる賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋である。組成物中の活性成分ではない成分を指す賦形剤の例には、担体、バインダー、希釈剤、滑沢剤、増粘剤、表面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝液、香味剤、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、コーティング、可塑剤、圧縮剤、湿式造粒剤または着色料が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で開示される組成物における使用のための防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」には、当業者に公知の、任意のおよび全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、体液および栄養補給剤などの材料ならびにそれらの組み合わせが含まれる。希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、または希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）もしくは薄め剤には、エタノール、グリセロール、水、糖、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール、ならびにコムギ、トウモロコシ、コメおよびジャガイモに由来するデンプン；ならびにセルロース、例えば、微結晶性セルロースが含まれるがこれらに限定されない。組成物中の希釈剤の量は、総組成物の約１０重量％～約９０重量％、約２５重量％～約７５重量％、約３０重量％～約６０重量％または約１２重量％～約６０重量％の範囲であり得る。
一部の態様では、賦形剤は、ヒトでの使用および獣医使用のために承認されている。一部の態様では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の態様では、賦形剤は、製薬グレードである。一部の態様では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方および／または国際薬局方の基準を満たす。本開示に従う医薬組成物中の１つもしくは複数の両親媒性ポリマー、１つもしくは複数の脂質ナノ粒子、１つもしくは複数の薬学的に許容できる賦形剤および／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の正体、サイズおよび／または状態に依存して、ならびに、組成物が投与される経路にさらに依存して、変動する。例として、医薬組成物は、０．１％（ｗｔ／ｗｔ）と１００％（ｗｔ／ｗｔ）との間の１つまたは複数の脂質ナノ粒子を含み得る。別の例として、医薬組成物は、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）と１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）との間の１つまたは複数の両親媒性ポリマー（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％または１２．５％ｗ／ｖ）を含み得る。
医薬組成物中の種々の構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整される。製薬活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除き、免疫原性組成物および治療的組成物におけるその使用が企図される。
ある特定の態様では、本開示の脂質ナノ粒子および／または医薬組成物は、貯蔵および／または出荷のために冷蔵または凍結されている（例えば、１０℃またはそれよりも低い温度、例えば、約４℃の温度、約－１５０℃と約１０℃との間の温度（例えば、約１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－８℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）または約－８０℃と約－２０℃との間の温度（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）で貯蔵される）。例えば、１つまたは複数の両親媒性ポリマーおよび１つまたは複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、貯蔵および／または出荷のために、例えば、約－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃または－９０℃で冷蔵される、溶液または固体（例えば、凍結乾燥を介した）である。
ある特定の態様では、本開示は、有効量の両親媒性ポリマーを添加すること、および脂質ナノ粒子および／またはその医薬組成物を、１０℃またはそれよりも低い温度、例えば、約４℃の温度、約－１５０℃と約１０℃との間の温度（例えば、約１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、－１℃、－２℃、－３℃、－４℃、－５℃、－６℃、－７℃、－８℃、－９℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）または約－８０℃と約－２０℃との間の温度（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）で貯蔵することによって、脂質ナノ粒子の安定性を増加させる方法にも関する。
本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の化学的特性は、種々の方法によって特徴付けられ得る。例えば、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査型電子顕微鏡）が、ＬＮＰの形態およびサイズ分布を試験するために使用され得る。動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）が、ゼータ電位を測定するために使用され得る。動的光散乱は、粒子サイズを決定するためにも利用され得る。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの機器もまた、ＬＮＰの複数の特徴、例えば、粒子サイズ、多分散指数およびゼータ電位を測定するために使用され得る。
ＬＮＰの平均サイズは、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定して、数十ｎｍと数百ｎｍとの間であり得る。例えば、平均サイズは、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍまたは１５０ｎｍであり得る。一部の態様では、ＬＮＰの平均サイズは、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍまたは約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。ある特定の態様では、ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の態様では、平均サイズは、約８０ｎｍであり得る。他の態様では、平均サイズは、約１００ｎｍであり得る。
ＬＮＰは、比較的均質であり得る。多分散指数は、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒子サイズ分布を示すために使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は一般に、狭い粒子サイズ分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５の多分散指数を有し得る。一部の態様では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すために使用され得る。例えば、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を記述し得る。正または負の比較的低い電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましいが、それは、より高度に荷電した種は、身体中の細胞、組織および他の要素と、望ましくない方法で相互作用し得るからである。一部の態様では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶまたは約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
治療薬および／または予防薬のカプセル封入の効率は、提供された初期量と比較した、調製後のＬＮＰ中にカプセル封入されたまたはさもなくばＬＮＰと会合している治療薬および／または予防薬の量を記述する。カプセル封入効率は、望ましくは高い（例えば、１００％に近い）。カプセル封入効率は、例えば、１つまたは複数の有機溶媒または洗剤で脂質ナノ粒子を壊す前および後の、脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬および／または予防薬の量を比較することによって、測定され得る。蛍光が、溶液中の遊離治療薬および／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するために使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子について、治療薬および／または予防薬のカプセル封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。一部の態様では、カプセル封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の態様では、カプセル封入効率は、少なくとも９０％であり得る。一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰカプセル封入効率は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰカプセル封入効率よりも、約５０％もしくはそれよりも高い、約５５％もしくはそれよりも高い、約６０％もしくはそれよりも高い、約６５％もしくはそれよりも高い、約７０％もしくはそれよりも高い、約７５％もしくはそれよりも高い、約８０％もしくはそれよりも高い、約８％もしくはそれよりも高い、約９０％もしくはそれよりも高い、約９１％もしくはそれよりも高い、約９２％もしくはそれよりも高い、約９３％もしくはそれよりも高い、約９４％もしくはそれよりも高い、約９５％もしくはそれよりも高い、約９６％もしくはそれよりも高い、約９７％もしくはそれよりも高い、約９８％もしくはそれよりも高い、または約９９％もしくはそれよりも高い。
一部の態様では、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、逆相液体クロマトグラフィー）が、ｍＲＮＡ完全性を試験するために使用され得る。
一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性よりも、約２０％もしくはそれよりも高い、約２５％もしくはそれよりも高い、約３０％もしくはそれよりも高い、約３５％もしくはそれよりも高い、約４０％もしくはそれよりも高い、約４５％もしくはそれよりも高い、約５０％もしくはそれよりも高い、約５５％もしくはそれよりも高い、約６０％もしくはそれよりも高い、約６５％もしくはそれよりも高い、約７０％もしくはそれよりも高い、約７５％もしくはそれよりも高い、約８０％もしくはそれよりも高い、約８５％もしくはそれよりも高い、約９０％もしくはそれよりも高い、約９５％もしくはそれよりも高い、約９６％もしくはそれよりも高い、約９７％もしくはそれよりも高い、約９８％もしくはそれよりも高い、または約９９％もしくはそれよりも高い。
一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性よりも、約５％もしくはそれよりも大きく、約１０％もしくはそれよりも大きく、約１５％もしくはそれよりも大きく、約２０％もしくはそれよりも大きく、約３０％もしくはそれよりも大きく、約４０％もしくはそれよりも大きく、約５０％もしくはそれよりも大きく、約６０％もしくはそれよりも大きく、約７０％もしくはそれよりも大きく、約８０％もしくはそれよりも大きく、約９０％もしくはそれよりも大きく、約１倍もしくはそれよりも大きく、約２倍もしくはそれよりも大きく、約３倍もしくはそれよりも大きく、約４倍もしくはそれよりも大きく、約５倍もしくはそれよりも大きく、約１０倍もしくはそれよりも大きく、約２０倍もしくはそれよりも大きく、約３０倍もしくはそれよりも大きく、約４０倍もしくはそれよりも大きく、約５０倍もしくはそれよりも大きく、約１００倍もしくはそれよりも大きく、約２００倍もしくはそれよりも大きく、約３００倍もしくはそれよりも大きく、約４００倍もしくはそれよりも大きく、約５００倍もしくはそれよりも大きく、約１０００倍もしくはそれよりも大きく、約２０００倍もしくはそれよりも大きく、約３０００倍もしくはそれよりも大きく、約４０００倍もしくはそれよりも大きく、約５０００倍もしくはそれよりも大きく、または約１００００倍もしくはそれよりも大きく高い。
一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％よりも、約１２カ月もしくはそれよりも長い、約１５カ月もしくはそれよりも長い、約１８カ月もしくはそれよりも長い、約２１カ月もしくはそれよりも長い、約２４カ月もしくはそれよりも長い、約２７カ月もしくはそれよりも長い、約３０カ月もしくはそれよりも長い、約３３カ月もしくはそれよりも長い、約３６カ月もしくはそれよりも長い、約４８カ月もしくはそれよりも長い、約６０カ月もしくはそれよりも長い、約７２カ月もしくはそれよりも長い、約８４カ月もしくはそれよりも長い、約９６カ月もしくはそれよりも長い、約１０８カ月もしくはそれよりも長い、約１２０カ月間もしくはそれよりも長い。一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴｘｏ％よりも、約５％またはそれよりも大きく、約１０％またはそれよりも大きく、約１５％またはそれよりも大きく、約２０％またはそれよりも大きく、約３０％またはそれよりも大きく、約４０％またはそれよりも大きく、約５０％またはそれよりも大きく、約６０％またはそれよりも大きく、約７０％またはそれよりも大きく、約８０％またはそれよりも大きく、約９０％またはそれよりも大きく、約１倍またはそれよりも大きく、約２倍またはそれよりも大きく、約３倍またはそれよりも大きく、約４倍またはそれよりも大きく、約５倍またはそれよりも大きく長い。
一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴ１／２よりも、約１２カ月またはそれよりも長い、約１５カ月またはそれよりも長い、約１８カ月またはそれよりも長い、約２１カ月またはそれよりも長い、約２４カ月またはそれよりも長い、約２７カ月またはそれよりも長い、約３０カ月またはそれよりも長い、約３３カ月またはそれよりも長い、約３６カ月またはそれよりも長い、約４８カ月またはそれよりも長い、約６０カ月またはそれよりも長い、約７２カ月またはそれよりも長い、約８４カ月またはそれよりも長い、約９６カ月またはそれよりも長い、約１０８カ月またはそれよりも長い、約１２０カ月間またはそれよりも長い。
一部の態様では、ブランクＬＮＰ（例えば、いずれの核酸もカプセル封入していない、本明細書に列挙された脂質を含有する脂質ナノ粒子）の存在下で産生された本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、より低い濃度のブランクＬＮＰの存在下またはブランクＬＮＰの非存在下で同等の方法によって産生されたＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤のＴ１／２よりも、約５％またはそれよりも大きく、約１０％またはそれよりも大きく、約１５％またはそれよりも大きく、約２０％またはそれよりも大きく、約３０％またはそれよりも大きく、約４０％またはそれよりも大きく、約５０％またはそれよりも大きく、約６０％またはそれよりも大きく、約７０％またはそれよりも大きく、約８０％またはそれよりも大きく、約９０％またはそれよりも大きく、約１倍またはそれよりも大きく、約２倍またはそれよりも大きく、約３倍またはそれよりも大きく、約４倍またはそれよりも大きく、約５倍またはそれよりも大きく長い。
本明細書で使用される場合、「Ｔｘ」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、そのＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約Ｘに低下するのにかかった時間の量を指す。例えば、「Ｔ８０」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、そのＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約８０％に低下するのにかかった時間の量を指す。別の例として、「Ｔ１／２」は、ＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の核酸完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、そのＬＮＰ、ＬＮＰ懸濁物、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性の約１／２に低下するのにかかった時間の量を指す。
ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、所望の標的および／もしくは適用または他の特性、ならびに治療薬および／または予防薬の特性に依存し得る。例えば、ＬＮＰ中の有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列および他の特徴に依存し得る。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬（即ち、製薬物質）ならびに他の要素（例えば、脂質）の相対量もまた変動し得る。一部の態様では、ＬＮＰ中の脂質構成要素の治療薬および／または予防薬に対するｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約６０：１、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１および６０：１であり得る。例えば、脂質構成要素の治療薬および／または予防薬に対するｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１～約４０：１であり得る。ある特定の態様では、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、例えば、吸収分光法（例えば、紫外－可視分光法）を使用して測定され得る。
一部の態様では、ＬＮＰ中のｍＲＮＡの脂質に対する比（即ち、Ｎ：Ｐ、式中、Ｎは、カチオン性脂質のモルを示し、Ｐは、核酸骨格の一部として存在するリン酸塩のモルを示す）は、２：１～３０：１、例えば、３：１～２２：１の範囲である。他の態様では、Ｎ：Ｐは、６：１～２０：１または２：１～１２：１の範囲である。例示的なＮ：Ｐ範囲には、約３：１、約６：１、約１２：１および約２２：１が含まれる。
ＩＶ．ＲＮＡ転写およびカプセル封入
一部の態様では、本明細書で開示されるＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」または「ＩＶＴ」は、転写が、例えば、タンパク質またはポリペプチドの産生が含まれる種々の適用における使用のために合成ＲＮＡ産物を産生するために非細胞系でｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる、プロセスを指す。かかる合成ＲＮＡ産物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳され得るか、または細胞中に直接導入され得、そこで翻訳され得る。かかる合成ＲＮＡ産物には、例えば、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、長鎖非コードＲＮＡ分子、リボザイム、アプタマー、ガイドＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲのため）、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡなどが含まれるがこれらに限定されない。ＩＶＴ反応は、典型的には、本明細書で記載および／または利用されるＤＮＡ鋳型（例えば、直鎖ＤＮＡ鋳型）、リボヌクレオチド（例えば、改変されていないリボヌクレオチド三リン酸または改変されたリボヌクレオチド三リン酸）、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼを利用する。
一部の態様では、ＩＶＴのための出発材料には、直鎖化されたＤＮＡ鋳型、ヌクレオチド、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼおよび／またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが含まれ得る。一部の態様では、ＩＶＴプロセスは、バイオリアクター中で実施される。バイオリアクターは、ミキサーを含み得る。一部の態様では、ヌクレオチドは、ＩＶＴプロセスを通じてバイオリアクター中に添加され得る。
一部の態様では、１つまたは複数のＩＶＴ後薬剤が、ＩＶＴプロセス後に、バイオリアクター中のＲＮＡを含むＩＶＴ混合物中に添加される。例示的なＩＶＴ後薬剤には、直鎖化されたＤＮＡ鋳型を消化するように構成されたＤＮＡｓｅ Ｉ、ならびにＤＮＡｓｅ ＩおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを消化するように構成されたプロテイナーゼＫが含まれ得る。一部の態様では、ＩＶＴ後薬剤は、ＩＶＴ後に、バイオリアクター中で混合物と共にインキュベートされる。一部の態様では、バイオリアクターは、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０および５００もしくはそれ超リットルのうちのいずれか１つ、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０および５００もしくはそれ超リットルのうちの少なくともいずれか１つ、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０および５００もしくはそれ超リットルのうちの多くてもいずれか１つ、または６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０および５００もしくはそれ超リットルのうちのいずれか２つの間のＩＶＴ混合物を含有し得る。ＩＶＴ混合物は、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか１つ、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか２つの間のＲＮＡの、ＲＮＡ濃度を有し得る。
一部の態様では、ＩＶＴ混合物は、残存スペルミジン、残存ＤＮＡ、残存タンパク質、ペプチド、ＨＥＰＥＳ、ＥＤＴＡ、硫酸アンモニウム、カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋）、ＲＮＡ断片、残存ヌクレオチド、遊離リン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
一部の態様では、ＩＶＴ混合物の少なくとも一部分は、濾過される。ＩＶＴ混合物は、濃縮されたＲＮＡ溶液を残余分として産生するために、ＩＶＴ混合物から少なくとも一部の不純物を除去するためおよび／またはＩＶＴ混合物の少なくとも一部分について緩衝溶液を交換するために、限外濾過および／または透析濾過を介して濾過され得る。
一部の態様では、「限外濾過」および「透析濾過」は共に、膜濾過プロセスを指す。限外濾過は、典型的には、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１μｍのうちのいずれか１つ、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１μｍのうちの少なくともいずれか１つ、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１μｍのうちの多くてもいずれか１つ、または０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１μｍのうちのいずれか２つの間の孔サイズを有する膜を使用する。一部の態様では、限外濾過膜は、典型的には、孔サイズではなく分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）によって分類される。例えば、ＭＷＣＯは、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３１０ｋＤａ、３２０ｋＤａ、３３０ｋＤａ、３４０ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、３７０ｋＤａ、３８０ｋＤａ、３９０ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、６００ｋＤａ、７００ｋＤａ、８００ｋＤａ、９００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、６０００ｋＤａ、７０００ｋＤａ、８０００ｋＤａ、９０００ｋＤａ、および１００００ｋＤａのうちのいずれか１つ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３１０ｋＤａ、３２０ｋＤａ、３３０ｋＤａ、３４０ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、３７０ｋＤａ、３８０ｋＤａ、３９０ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、６００ｋＤａ、７００ｋＤａ、８００ｋＤａ、９００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、６０００ｋＤａ、７０００ｋＤａ、８０００ｋＤａ、９０００ｋＤａ、および１００００ｋＤａのうちの少なくともいずれか１つ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３１０ｋＤａ、３２０ｋＤａ、３３０ｋＤａ、３４０ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、３７０ｋＤａ、３８０ｋＤａ、３９０ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、６００ｋＤａ、７００ｋＤａ、８００ｋＤａ、９００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、６０００ｋＤａ、７０００ｋＤａ、８０００ｋＤａ、９０００ｋＤａ、および１００００ｋＤａのうちの多くてもいずれか１つ、または３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３１０ｋＤａ、３２０ｋＤａ、３３０ｋＤａ、３４０ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、３７０ｋＤａ、３８０ｋＤａ、３９０ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、６００ｋＤａ、７００ｋＤａ、８００ｋＤａ、９００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、３０００ｋＤａ、４０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、６０００ｋＤａ、７０００ｋＤａ、８０００ｋＤａ、９０００ｋＤａ、および１００００ｋＤａのうちのいずれか２つの間であり得る。当業者は、濾過膜が、適用に依存して、例えば、ポリマー、セルロース、セラミックなどが含まれる異なる適切な材料のものであり得ることを理解する。一部の態様では、膜濾過は、大きい体積の精製プロセスにとってより望ましい場合がある。
一部の態様では、ＲＮＡを精製するためのＩＶＴ混合物の限外濾過および透析濾過には、（１）膜面に対して垂直な供給ストリームを適用し、膜を介して流体の１００％を通過させることを試みる、「デッドエンド」濾過としても公知のダイレクトフロー（Ｄｉｒｅｃｔ Ｆｌｏｗ）濾過（ＤＦＦ）、および／または（２）１つの部分が膜を介して通過する（浸透する）際に、供給ストリームが膜面に対して平行に通過するが、残部（残余分）は、保持されるおよび／または供給タンクに再循環されて戻される、クロスフロー濾過としても公知の接線流濾過（ＴＦＦ）が含まれ得る。
一部の態様では、ＩＶＴ混合物の濾過は、限外濾過ステップ、第１の透析濾過ステップおよび第２の透析濾過ステップを含むＴＦＦを介して実施される。一部の態様では、第１の透析濾過ステップは、硫酸アンモニウムの存在下で実施される。第１の透析濾過ステップは、不純物の大部分をＩＶＴ混合物から除去するように構成され得る。一部の態様では、第２の透析濾過ステップは、硫酸アンモニウムなしに実施される。第２の透析濾過ステップは、ＲＮＡをＤＳ緩衝液製剤中に移行させるように構成され得る。
適切なＭＷＣＯを有する濾過膜が、ＴＦＦプロセスにおける限外濾過のために選択され得る。ＴＦＦ膜のＭＷＣＯは、どの溶質が膜を介して濾液中に通過でき、どれが残余分中に保持されるかを決定する。ＴＦＦ膜のＭＷＣＯは、目的の溶質（例えば、所望の合成されたＲＮＡ種）の実質的に全てが残余分中に残留する一方で、所望されない構成要素（例えば、過剰なリボヌクレオチド、小さい核酸断片、例えば、消化もしくは加水分解されたＤＮＡ鋳型、ペプチド断片、例えば、消化されたタンパク質および／または他の不純物）が濾液中に通過するように、選択され得る。一部の態様では、所望の合成されたＲＮＡ種を含む残余分は、さらなるサイクルにおいて再濾過されるように、供給レザバーに再循環され得る。一部の態様では、ＴＦＦ膜は、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちのいずれか１つ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちのいずれか２つの間と等しいＭＷＣＯを有し得る。一部の態様では、ＴＦＦ膜は、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも３５０ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちのいずれか１つ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも３５０ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも３５０ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、少なくとも２５０ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも３５０ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａもしくはそれ超ｋＤａのうちのいずれか２つの間と等しいＭＷＣＯを有し得る。一部の態様では、ＴＦＦ膜は、約２５０～３５０ｋＤａのＭＷＣＯを有し得る。一部の態様では、ＴＦＦ膜（例えば、セルロースベースの膜）は、約３０～３００ｋＤａ；一部の態様では、約５０～３００ｋＤａ、約１００～３００ｋＤａまたは約２００～３００ｋＤａのＭＷＣＯを有し得る。
透析濾過は、非連続的に、またはあるいは、連続的に、実施され得る。例えば、連続的な透析濾過では、透析濾過溶液は、濾液が生成されるのと同じ速度で試料供給レザバーに添加され得る。この方法では、試料レザバー中の体積は、一定のままであるが、膜を介して自由に浸透することができる小分子（例えば、塩、溶媒など）は除去される。例として、溶媒除去を使用すると、各さらなる透析濾過体積（ＤＶ）は、溶媒濃度をさらに低減させる。非連続的な透析濾過では、溶液は最初に希釈され、次いで、濃縮されて出発体積に戻される。次いで、このプロセスは、レザバー中に残留する小分子（例えば、塩、溶媒など）が所望の濃度に達するまで、反復される。各さらなる透析濾過体積（ＤＶ）は、小分子（例えば、溶媒）濃度をさらに低減させる。連続的な透析濾過は、典型的には、分子の所与の低減のために最低限の体積が濾過されることを要求する。他方で、非連続的な透析濾過は、残余分の条件、例えば、ｐＨ、塩含量などの迅速な変化を許容する。一部の態様では、第１の透析濾過ステップは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０もしくはそれ超のうちのいずれか１つ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０もしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０もしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０もしくはそれ超のうちのいずれか２つの間と等しい透析体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）で実施される。一部の態様では、第２の透析濾過ステップは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０もしくはそれ超のうちのいずれか１つ、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０もしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０もしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０もしくはそれ超のうちのいずれか２つの間と等しい透析体積で実施される。一部の態様では、第１の透析濾過ステップは、５透析体積で実施され、第２の透析濾過ステップは、１０透析体積で実施される。
一部の態様では、限外濾過および／または透析濾過のために、ＩＶＴ混合物は、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、少なくとも３６０、少なくとも３７０、少なくとも３８０、少なくとも３９０、少なくとも４００、少なくとも４１０、少なくとも４２０、少なくとも４３０、少なくとも４４０、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００Ｌ／フィルター面積ｍ２／時間もしくはそれ超のうちのいずれか１つ、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、少なくとも３６０、少なくとも３７０、少なくとも３８０、少なくとも３９０、少なくとも４００、少なくとも４１０、少なくとも４２０、少なくとも４３０、少なくとも４４０、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００Ｌ／フィルター面積ｍ２／時間もしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、少なくとも３６０、少なくとも３７０、少なくとも３８０、少なくとも３９０、少なくとも４００、少なくとも４１０、少なくとも４２０、少なくとも４３０、少なくとも４４０、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００Ｌ／フィルター面積ｍ２／時間もしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、少なくとも３６０、少なくとも３７０、少なくとも３８０、少なくとも３９０、少なくとも４００、少なくとも４１０、少なくとも４２０、少なくとも４３０、少なくとも４４０、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００Ｌ／フィルター面積ｍ２／時間もしくはそれ超のうちのいずれか２つの間と等しい速度で濾過される。濃縮されたＲＮＡ溶液は、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４および２．５ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか１つ、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４および２．５ｍｇ／ｍＬのうちの少なくともいずれか１つ、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４および２．５ｍｇ／ｍＬのうちの多くてもいずれか１つ、または２．０、２．１、２．２、２．３、２．４および２．５ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか２つの間の一本鎖ＲＮＡを含み得る。
一部の態様では、濃縮されたＲＮＡ溶液のバイオバーデンもまた、ＲＮＡ産物溶液を得るための濾過を介して、低減され得る。バイオバーデンを低減させるための濾過は、１つまたは複数のフィルターを使用して実施され得る。１つまたは複数のフィルターには、０．２μｍ、０．４５μｍ、０．６５μｍ、０．８μｍの孔サイズ、またはバイオバーデンを低減させるように構成された任意の他の孔サイズを有するフィルターが含まれ得る。
一例として、バイオバーデンを低減させることは、残余分を得るための限外濾過および／または透析濾過から得られた残余分を含有する残余分タンクを排水することを含み得る。バイオバーデンを低減させることは、濾過システム中に残留する残渣ＲＮＡを含む洗浄プール溶液を得るために、洗浄緩衝溶液を使用して限外濾過および／または透析濾過のための濾過システムを洗い流すことを含み得る。残余分は、濾過された残余分を得るために濾過され得る。洗浄プール溶液は、濾過された洗浄プール溶液を得るために、第１の０．２μｍフィルターを使用して濾過され得る。残余分は、第１の０．２μｍフィルターまたは別の０．２μｍフィルターを使用して濾過され得る。
濾過された洗浄プール溶液および濾過された残余分は、組み合わされたプール溶液を形成するために組み合わされ得る。組み合わされたプール溶液は、濾過された組み合わされたプール溶液を得るために、第２の０．２μｍフィルターを使用して濾過され得、濾過された組み合わされたプール溶液は、ＲＮＡ産物溶液を産生するために、第３の０．２μｍフィルターを使用してさらに濾過される。
ＲＮＡ産物溶液中のＲＮＡは、カプセル封入され得、ＲＮＡ溶液は、少なくとも１つのカプセル封入剤をさらに含み得る。一態様では、カプセル封入剤は、脂質、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、ポリマー性粒子、ポリプレックスおよび一体型送達システム、ならびにそれらの組み合わせを含む。一態様では、カプセル封入剤は、脂質であり、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル封入されたＲＮＡが産生される。一部の態様では、ＬＮＰは、ＲＮＡ（例えば、ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を細胞外ＲＮａｓｅから保護するように設計され得、および／または標的細胞へのＲＮＡの全身送達のために操作され得る。一部の態様では、かかるＬＮＰは、ＲＮＡがそれを必要とする対象に静脈内投与される場合に、ＲＮＡ（例えば、ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を送達するために特に有用であり得る。一部の態様では、かかるＬＮＰは、ＲＮＡがそれを必要とする対象に筋肉内投与される場合に、ＲＮＡ（例えば、ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を送達するために特に有用であり得る。
一部の態様では、提供されるＲＮＡ（例えば、ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、ＬＮＰを用いて製剤化され得る。種々の態様では、かかるＬＮＰは、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０～約９０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約８０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約７０ｎｍのうちのいずれか１つ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０～約９０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約８０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約７０ｎｍのうちの少なくともいずれか１つ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０～約９０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約８０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約７０ｎｍのうちの多くてもいずれか１つ、または約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０～約９０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約８０ｎｍもしくは約６０ｎｍ～約７０ｎｍのうちのいずれか２つの間と等しい平均サイズ（例えば、平均直径）を有し得る。一部の態様では、本開示に従って有用であり得るＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１００ｎｍのうちのいずれか１つ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍのうちの少なくともいずれか１つ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍのうちの多くてもいずれか１つ、または約５０ｎｍ～約１００ｎｍのうちのいずれか２つの間と等しい平均サイズ（例えば、平均直径）を有し得る。一部の態様では、ＬＮＰは、８０ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６５ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満または４５ｎｍ未満の平均サイズ（例えば、平均直径）を有し得る。一部の態様では、本開示に従って有用であり得るＬＮＰは、約４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍのうちのいずれか１つ、約４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍのうちの少なくともいずれか１つ、約４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍのうちの多くてもいずれか１つ、または約４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍのうちのいずれか２つの間と等しい平均サイズ（例えば、平均直径）を有し得る。
ある特定の態様では、核酸（例えば、ＲＮＡ）は、提供されたＬＮＰ中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。一部の態様では、ＬＮＰは、肝臓標的化脂質ナノ粒子である。一部の態様では、ＬＮＰは、１つまたは複数のカチオン性脂質（例えば、本明細書に記載されるもの）を含むカチオン性脂質ナノ粒子である。一部の態様では、カチオン性ＬＮＰは、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのポリマーコンジュゲート化脂質、および少なくとも１つのヘルパー脂質（例えば、少なくとも１つの中性脂質）を含み得る。
一部の態様では、ＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡは、脂質をＬＮＰの形態での自己アセンブリに向けて駆動する、脂質構成要素の溶解度における突然の変化が誘発されるような条件下での、本明細書に記載されるＲＮＡ溶液（例えば、ＲＮＡ産物溶液）および本明細書に記載される脂質調製物（有機溶媒中に、例えば、少なくとも１つのカチオン性脂質および任意選択により１つまたは複数の他の脂質構成要素を含む）の迅速な混合によって産生され得る。一部の態様では、適切な緩衝化剤は、トリス、ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩またはコハク酸塩を含む。液体のＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡ製剤の調製の間のｐＨは、カプセル封入剤（例えば、カチオン性脂質）のｐＫａに関連する。酸性化緩衝液のｐＨは、カプセル封入剤（例えば、カチオン性脂質）のｐＫａよりも少なくとも半ｐＨスケール小さくてもよく、最終緩衝液のｐＨは、カプセル封入剤（例えば、カチオン性脂質）のｐＫａよりも少なくとも半ｐＨスケール大きくてもよい。一部の態様では、粒子の新生の形成が、核酸（例えば、ＲＮＡ）の反対に荷電した骨格との会合によって生じるように、カチオン性脂質の特性が選択される。この方法では、粒子が核酸の周囲に形成され、これは、例えば、一部の態様では、核酸と脂質構成要素のうちの少なくとも１つとの間での相互作用の非存在下で達成されるものよりも、さらにより高いカプセル封入効率を生じ得る。一部の態様では、ＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡの調製の間のｐＨは、ＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡの調製後のＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡのｐＨとは異なる。
一態様では、ＲＮＡ溶液中のＲＮＡは、＜１ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の態様では、ＲＮＡは、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の態様では、ＲＮＡは、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の態様では、ＲＮＡは、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の態様では、ＲＮＡ濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬである。別の態様では、ＲＮＡは、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の態様では、ＲＮＡは、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度である。一部の態様では、ＲＮＡは、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか１つ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか２つの間と等しい濃度である。
さらなる態様では、ＲＮＡ溶液および脂質調製物の混合物は、安定化剤をさらに含む。一部の態様では、安定化剤は、スクロース、マンノース、ソルビトール、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、ラクトース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrolidone）、グリシン、またはそれらの組み合わせを含む。具体的な態様では、安定化剤は、スクロースである。具体的な態様では、安定化剤は、トレハロースである。具体的な態様では、安定化剤は、スクロースおよびトレハロースの組み合わせである。一部の態様では、安定化剤の濃度には、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬまたは約１０３ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの濃度が含まれるがこれらに限定されない。一部の態様では、安定化剤の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１０３ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか１つ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１０３ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの少なくともいずれか１つ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１０３ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちの多くてもいずれか１つ、または１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１０３ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ超のうちのいずれか２つの間と等しい。一部の態様では、組成物中の安定化剤の濃度は、約１％～約３０％ｗ／ｖである。例えば、安定化剤の濃度は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％ｗ／ｖのうちのいずれか１つ、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％ｗ／ｖのうちの少なくともいずれか１つ、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％ｗ／ｖのうちの多くてもいずれか１つ、または１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％ｗ／ｖのうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しくすることができる。具体的な態様では、安定化剤（例えば、スクロース）の濃度は、１０．３％である。具体的な態様では、安定化剤（例えば、スクロース）の濃度は、１５．４％である。具体的な態様では、安定化剤（例えば、スクロース）の濃度は、２０．５％である。
さらなる態様では、安定化剤の質量およびＲＮＡの質量は、特定の比である。一態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、５０００以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、２０００以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、１０００以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、５００以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、１００以下である。別の態様では、安定化剤および製薬物質の質量の比は、５０以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、１０以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、１以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、０．５以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡの質量の比は、０．１以下である。別の態様では、安定化剤およびＲＮＡは、約２００～２０００の安定化剤：１のＲＮＡの質量比を含む。さらなる態様では、ＲＮＡは、ｓａＲＮＡであり、安定化剤は、スクロースである。
一部の態様では、ＲＮＡ溶液および脂質調製物の混合物は、塩をさらに含む。一態様では、塩は、ナトリウム塩である。具体的な態様では、塩は、ＮａＣｌである。一部の態様では、ＲＮＡ溶液および脂質調製物の混合物は、界面活性剤、防腐剤、任意の他の賦形剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む。本明細書で使用される場合、「任意の他の賦形剤」には、抗酸化剤、グルタチオン、ＥＤＴＡ、メチオニン、デスフェラール、抗酸化剤、金属スカベンジャーまたはフリーラジカルスカベンジャーが含まれるがこれらに限定されない。一態様では、界面活性剤、防腐剤、賦形剤またはそれらの組み合わせは、注射用無菌水（ｓＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、食塩水、デキストロース溶液、ポリソルベート、ポロクサマー、Ｔｒｉｔｏｎ、二価カチオン、乳酸リンゲル、アミノ酸、糖、ポリオール、ポリマーまたはシクロデキストリンから選択される。
一部の態様では、ＲＮＡ溶液および／または脂質調製物の混合物は、少なくとも１つの遊離アミノ酸をさらに含む。ある特定の例では、少なくとも１つの遊離アミノ酸が、ＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡ中に内部に充填される。例えば、一部の例では、少なくとも１つの遊離アミノ酸は、水中で可溶性であり、本明細書に記載されるＲＮＡ溶液（例えば、ＲＮＡ産物溶液）と組み合わされる。一部の例では、少なくとも１つの遊離アミノ酸は、エタノール中で可溶性であり、本明細書に記載される脂質調製物（有機溶媒中に、例えば、少なくとも１つのカチオン性脂質および任意選択により１つまたは複数の他の脂質構成要素を含む）と組み合わされる。一部の例では、少なくとも１つの遊離アミノ酸は、水および／またはエタノール中で可溶性であり、本明細書に記載されるＲＮＡ溶液（例えば、ＲＮＡ産物溶液）および本明細書に記載される脂質調製物（有機溶媒中に、例えば、少なくとも１つのカチオン性脂質および任意選択により１つまたは複数の他の脂質構成要素を含む）の両方と組み合わされる。この方法で、少なくとも１つの遊離アミノ酸が、ＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡ中に含まれる。
あるいは、またはＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡに少なくとも１つの遊離アミノ酸を内部に充填することに加えて、予め形成されたＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡには、少なくとも１つの遊離アミノ酸が外部から充填され得る。例えば、一部の例では、本明細書に記載される方法に従って産生されたＬＮＰカプセル封入されたＲＮＡは、少なくとも１つの遊離アミノ酸と組み合わされる。
一部の態様では、緩衝液、安定化剤、塩、界面活性剤、防腐剤および賦形剤の各々は、ＲＮＡ溶液および脂質調製物の混合物中に含まれる。他の態様では、緩衝液、安定化剤、塩、界面活性剤、防腐剤および賦形剤のうちのいずれか１つまたは複数は、ＲＮＡ溶液および脂質調製物の混合物から排除され得る。
Ｖ．ＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチン
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンは、感染の蔓延または満たされていない医療上の必要性の程度もしくはレベルに依存して、種々の状況で利用され得る。ＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンは、種々の遺伝子型、株および単離体のインフルエンザウイルスを処置および／または予防するために利用され得る。ＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンは、典型的には、市販の抗ウイルス性の治療的処置よりもさらに大きい抗体力価を生じ、より早期に応答を生じる点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることは望まないが、ＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンが天然の細胞機械を取り入れるので、ｍＲＮＡポリヌクレオチドとしてのＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンは、翻訳の際に適切なタンパク質コンフォメーションを生じるようにより良く設計されていると考えられる。ｅｘ ｖｉｖｏで製造され、望まれない細胞応答を誘発し得る従来のワクチンとは異なり、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンは、より天然の方式で、細胞システムに提示される。
インフルエンザウイルスの１つよりも多くの株に人が感染するリスクがある状況が存在し得る。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物、例えば、治療的ワクチンは、製造の速度、把握された地理学的脅威に適応するようにワクチンを迅速に誂える能力などが含まれるがこれらに限定されないいくつかの因子に起因して、混合ワクチン接種アプローチに特に適している。さらに、免疫原性組成物および／またはワクチンは、抗原性タンパク質を産生するためにヒト身体を利用するので、免疫原性組成物および／またはワクチンは、より大きくより複雑な抗原性タンパク質の産生に適しており、ヒト対象における適切なフォールディング、表面発現、抗原提示などを可能にする。インフルエンザの１つよりも多くの株に対する保護をもたらすために、第１のインフルエンザウイルスまたは生物の少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含み、第２のインフルエンザウイルスまたは生物の少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡをさらに含む混合ワクチンが、投与され得る。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に共製剤化され得るか、または共投与のために別々のＬＮＰ中に製剤化され得る。
本開示の一部の態様は、少なくとも１つのウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ウイルスに対する免疫応答を誘導することが可能な免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むウイルスワクチン（または組成物もしくは免疫原性組成物）を提供する。少なくとも１つのウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドが提供され得るウイルスの代表的であるが非限定的なリストには、アレナウイルス（例えば、ラッサウイルスまたはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））；アストロウイルス；ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）；カリシウイルス；コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ） － 例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、または中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス）；フィロウイルス（例えば、エボラウイルスまたはマールブルグウイルス）；フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））；ヘパドナウイルス；ヘペウイルス；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスまたはインフルエンザＣウイルス）；パラミクソウイルス（例えば、はしかウイルスまたはルブラウイルス）；ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルスまたはライノウイルス）；レオウイルス（例えば、ロタウイルス）；レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ））；ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスまたは狂犬病リッサウイルス）；トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）または風疹ウイルス）が含まれるがこれらに限定されない。
ワクチンは、例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）の種、コロナウイルス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）の種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレド（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｄ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１ ９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）もしくはネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）の種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡もしくは小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）およびエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。
本開示の一部の態様は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することが可能な免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルス（インフルエンザ）ワクチン（または組成物もしくは免疫原性組成物）を提供する。
一部の態様では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１、ＨＡ２と呼ばれるＨＡの規定された抗原性サブドメイン、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせ、ならびにノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチド、のうちの１つである。
一部の態様では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１および／またはＨＡ２由来の抗原性配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択される少なくとも１つの抗原性ポリペプチドである。
一部の態様では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＡ１および／またはＨＡ２由来の抗原性配列を含むＨＡまたはその誘導体、ならびにＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２から選択される少なくとも２つの抗原性ポリペプチドである。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、インフルエンザウイルスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、複数のインフルエンザウイルスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、または両方の組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、少なくとも１つのＨＡ１、ＨＡ２、または両方の組み合わせ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、ならびにインフルエンザウイルスから得られたＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択されるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちの少なくとも１つのいずれか１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせ）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、ならびにインフルエンザウイルスから得られたＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される２つのタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも２つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つうちの少なくとも１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせの）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、ならびにインフルエンザウイルスから得られたＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍタンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される３つのタンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも３つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つうちの少なくとも１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせの）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、ならびにインフルエンザウイルスから得られたＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される４つのタンパク質をコードする４つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも４つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つうちの少なくとも１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせの）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、ならびにインフルエンザウイルスから得られたＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質から選択される５つのタンパク質をコードする５つのオープンリーディングフレームを有する少なくとも５つの他のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、インフルエンザウイルスから得られたＨＡタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７および／もしくはＨ１８のうちのいずれか１つうちの少なくとも１つ、またはそれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせの）、ＮＰタンパク質またはその免疫原性断片、ＮＡタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ１タンパク質またはその免疫原性断片、Ｍ２タンパク質またはその免疫原性断片、ＮＳ１タンパク質またはその免疫原性断片およびＮＳ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本開示の一部の態様は、以下の新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列を提供する：Ｈ１ＨＡ１０－フォールドン（Ｆｏｌｄｏｎ）＿ΔＮｇｌｙ１；Ｈ１ＨＡ１０ＴＭ－ＰＲ８（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ）；Ｈ１ＨＡ１０－ＰＲ８－ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ ＨＡ；ｐＨ１ＨＡ１０－Ｃａｌ０４－ＤＳ（Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ ＨＡ）；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４からのＰａｎｄｅｍｉｃ Ｈ１ＨＡ１０；ｐＨ１ＨＡ１０－フェリチン；ＨＡ１０；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４からのＰａｎｄｅｍｉｃ Ｈ１ＨＡ１０；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ０４株からのＰａｎｄｅｍｉｃ Ｈ１ＨＡ１０／フォールドンなし、トリマー化に関してＫ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ変異あり；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株からのＨ１ＨＡ１０、フォールドンなし、トリマー化に関してＹ９４Ｄ／Ｎ９５Ｌ変異あり；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株からのＨ１ＨＡ１０、フォールドンなし、トリマー化に関してＫ６８Ｃ／Ｒ７６Ｃ変異あり；Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／８５０／２００９；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５；Ｈ７Ｎ９（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３）；Ｈ９Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９；Ｈ１０Ｎ８ Ａ／ＪＸ３４６／２０１３。
本開示の一部の態様は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドまたは上記新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列の免疫原性断片（例えば、インフルエンザに対する免疫応答を誘導することが可能な免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルス（インフルエンザ）免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、インフルエンザワクチンは、上記新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、７５％と１００％との間の任意の数、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％を含む）同一な改変された配列を含む少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。改変された配列は、上記新規インフルエンザウイルス配列のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、７５％と１００％との間の任意の数、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％を含む）同一であり得る。本開示の一部の態様は、上記新規インフルエンザウイルスポリペプチド配列をコードする配列を含む単離された核酸；この核酸を含む発現ベクター；およびこの核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示は、上記新規インフルエンザウイルス配列のうちのいずれかのポリペプチドを産生する方法もまた提供する。方法は、上記新規インフルエンザウイルス配列の核酸発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培地中で培養するステップ、および培養された細胞または細胞の培地から、新規インフルエンザウイルスポリペプチドを精製するステップを含み得る。本開示は、新規インフルエンザウイルス配列に対する全長抗体および抗体誘導体が含まれる抗体分子もまた提供する。
一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンのオープンリーディングフレームは、コドン最適化される。一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンは、アジュバントをさらに含む。一部の態様では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、細胞受容体に結合する少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス膜と細胞膜との融合を引き起こす少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染されている細胞へのウイルスの結合を担う少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。本開示の一部の態様は、脂質ナノ粒子内に製剤化された、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチド、少なくとも１つの５’末端キャップおよび少なくとも１つの化学的改変をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。
一部の態様では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。一部の態様では、少なくとも１つの化学的改変は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、５－メチルウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。一部の態様では、化学的改変は、ウラシルの５位にある。一部の態様では、化学的改変は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。一部の態様では、化学的改変は、Ｎ１－エチルプソイドウリジンである。
一部の態様では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変された脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の態様では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。一部の態様では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）およびＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される。
本開示の一部の態様は、少なくとも１つの抗原、例えばインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物および／またはワクチンであって、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）が、化学的改変を有し、任意選択により、免疫原性組成物および／またはワクチンが、脂質ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変された脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む）中に製剤化される、免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、化学的改変を有する。一部の態様では、化学的改変は、ウラシルの５位にある。一部の態様では、化学的改変は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。一部の態様では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、ウラシルの５位にＮ１－メチルプソイドウリジンを有する。
一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、少なくとも１つの抗原、例えばインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、オープンリーディングフレームは、少なくとも２つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０個の抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、オープンリーディングフレームは、少なくとも１００個の抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、オープンリーディングフレームは、１～１００個の抗原性ポリペプチドをコードする。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを各々が有する、少なくとも２つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを各々が有する、少なくとも５つまたは少なくとも１０個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを各々が有する、少なくとも１００個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを各々が有する、２～１００個のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に製剤化された上述の段落のうちのいずれか１つのインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンもまた、本明細書で提供される。一部の態様では、ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。一部の態様では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子である。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ改変された脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のカチオン性脂質、０．５～１５％のＰＥＧ改変された脂質、２５～５５％のステロールおよび２５％の非カチオン性脂質のモル比を含む。一部の態様では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。一部の態様では、ナノ粒子は、０．４未満（例えば、０．３、０．２または０．１未満）の多分散値を有する。一部の態様では、ナノ粒子は、中性ｐＨ値において正味の中性電荷を有する。
本開示の一部の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、本明細書で提供されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンのうちのいずれかを、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンは、インフルエンザ免疫原性組成物および／またはワクチンである。一部の態様では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、インフルエンザワクチンの組み合わせを含む混合ワクチンである（広域スペクトルインフルエンザワクチン）。一部の態様では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。一部の態様では、抗原特異的免疫応答を生じさせる方法は、本開示のインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンの単一の用量（ブースター用量なし）を対象に投与するステップを含む。一部の態様では、方法は、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの第２の（ブースター）用量を対象に投与するステップをさらに含む。インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）免疫原性組成物および／またはワクチンのさらなる用量が投与され得る。
一部の態様では、対象は、免疫原性組成物および／またはワクチンの第１の用量または第２の（ブースター）用量の後に、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）のセロコンバージョン率を示す。セロコンバージョンは、特異的抗体が発生し、血液中で検出可能になる期間である。セロコンバージョンが生じた後、ウイルスは、抗体についての血液試験において検出され得る。感染または免疫化の間、抗原は血液中に入り、免疫系が、応答して抗体を産生し始める。セロコンバージョンの前には、抗原自体は検出可能であってもなくてもよいが、抗体は存在しないとみなされる。セロコンバージョンの間、抗体は存在するが、なおも検出不能である。セロコンバージョン後にはいつでも、抗体は血液中で検出され得、以前のまたは現在の感染を示す。
本明細書に記載される免疫原性組成物、例えばワクチン、例えばインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与は、類似の実用性を提供するための薬剤の投与の受容された様式のうちのいずれかを介して実施され得る。免疫原性組成物は、固体、半固体、液体またはガス状形態での調製物、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、懸濁物、坐剤、注射、吸入剤、ゲル、ミクロスフェアおよびエアロゾルへと製剤化され得る。かかる免疫原性組成物を投与する典型的な経路には、限定なしに、経口、外用、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、腟および鼻腔内が含まれる。非経口という用語には、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射または注入技法が含まれる。本明細書に記載される免疫原性組成物は、それに含有される活性成分が、患者への組成物の投与の際に生体利用可能であるように、製剤化される。対象または患者に投与される免疫原性組成物は、１つまたは複数の投薬単位の形態をとり、例えば、錠剤は、単一の投薬単位であり得、エアロゾル形態での化合物の容器は、複数の投薬単位を保持し得る。投与される免疫原性組成物は、いずれにしろ、本明細書に記載される教示に従った目的の疾患または状態の処置または予防のために、本開示の範囲内の化合物またはその薬学的に許容できる塩の治療有効量を含有する。
本開示の範囲内の免疫原性組成物は、固体または液体の形態であり得る。一態様では、担体は、粒状であり、その結果、免疫原性組成物は、例えば、錠剤または粉末形態である。担体は、液体であり得、免疫原性組成物は、例えば、経口シロップ、注射可能な液体、または例えば吸入器投与において有用なエアロゾルである。経口投与のために意図される場合、免疫原性組成物は、好ましくは、固体形態または液体形態のいずれかであり、半固体、半液体、懸濁物およびゲル形態が、本明細書で固体または液体のいずれかとみなされる形態の範囲内に含まれる。経口投与のための固体組成物として、免疫原性組成物は、粉末、顆粒、圧縮された錠剤、丸剤、カプセル、チューインガム、ウエハースなどの形態へと製剤化され得る。かかる固体組成物は、典型的には、１つまたは複数の不活性希釈剤または食用担体を含有する。さらに、以下のうちの１つまたは複数が、存在し得るまたは排除され得る：バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン；崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン；香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料；および着色剤。免疫原性組成物は、カプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態である場合、上記の型の材料に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコールまたは油を含有し得る。免疫原性組成物は、液体、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁物の形態であり得る。液体は、２つの例として、経口投与のため、または注射による送達のためであり得る。経口投与のために意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、色素／着色料および風味増強剤のうちの１つまたは複数を含有する。注射によって投与されることを意図した免疫原性組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤および等張剤のうちの１つまたは複数が、含まれ得るまたは排除され得る。
液体免疫原性組成物は、溶液であれ、懸濁物であれ、他の同様の形態であれ、以下のアジュバントのうちの１つまたは複数を含み得るまたは排除し得る：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム、不揮発油、例えば、溶媒もしくは懸濁媒として機能し得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液；および浸透圧の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース；凍結保護剤として作用する薬剤、例えば、スクロースまたはトレハロース。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量バイアル中に封入され得る。生理的食塩水が、好ましいアジュバントである。注射可能な医薬組成物は、好ましくは無菌である。非経口または経口のいずれかの投与のために意図された液体免疫原性組成物は、適切な投薬量が得られるような化合物の量を含有すべきである。
免疫原性組成物は、製薬分野で周知の方法論によって調製され得る。例えば、注射によって投与されることが意図される医薬組成物は、溶液を形成するために、ｍＲＮＡを無菌蒸留水または他の担体と組み合わせることによって調製され得る。界面活性剤が、均一な溶液または懸濁物の形成を容易にするために添加され得る。界面活性剤は、水性送達システムにおける化合物の溶解または均一な懸濁を容易にするための、本明細書の教示と一致した化合物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
一部の態様では、免疫原性組成物、例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内注射、筋肉内注射によって、または鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、免疫原性組成物、例えば、インフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、筋肉内注射によって対象に投与される。
本開示の一部の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、免疫原性組成物、例えばインフルエンザＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせるための有効量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。対象における抗原特異的免疫応答は、一部の態様では、本開示の免疫原性組成物および／またはワクチンのうちのいずれかの対象への投与の後に、抗体力価について（インフルエンザ抗原性ポリペプチドに結合する抗体の力価について）アッセイすることによって、決定され得る。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増加する。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して１～３ｌｏｇ増加する。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して少なくとも２倍増加する。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して少なくとも５倍増加する。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して少なくとも１０倍増加する。一部の態様では、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、対照と比較して２～１０倍増加する。一部の態様では、対照は、本開示の免疫原性組成物、例えば、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが投与されていない対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価である。一部の態様では、対照は、生弱毒化もしくは不活性化インフルエンザが投与された対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価である、または対照は、組換えもしくは精製インフルエンザタンパク質ワクチンが投与された対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価である。一部の態様では、対照は、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが投与された対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価である。
本開示の免疫原性組成物、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、有効量（免疫応答を誘導するのに有効な量）で対象に投与される。一部の態様では、有効量は、標準治療免疫原性組成物、例えば組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準治療用量における多くても２分の１、多くても４分の１、多くても１０分の１、多くても１００分の１、多くても１０００分の１への低減と等価な用量であり、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、標準治療免疫原性組成物、例えば、組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、生弱毒化インフルエンザワクチン、不活性化インフルエンザワクチンまたはインフルエンザＶＬＰワクチンの標準治療用量が投与された対照対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価と等価である。一部の態様では、有効量は、標準治療免疫原性組成物、例えば、組換えインフルエンザタンパク質ワクチンの標準治療用量における２～１０００分の１への低減と等価な用量であり、対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、標準治療免疫原性組成物、例えば、組換えインフルエンザタンパク質ワクチン、精製インフルエンザタンパク質ワクチン、生弱毒化インフルエンザワクチン、不活性化インフルエンザワクチンまたはインフルエンザＶＬＰワクチンの標準治療用量が投与された対照対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価と等価である。一部の態様では、対照は、インフルエンザの構造タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが投与された対象において生じた抗抗原性ポリペプチド抗体力価である。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせるための有効量で製剤化される。一部の態様では、有効量は、２５μｇ～１０００μｇまたは５０μｇ～１０００μｇの総用量である。一部の態様では、有効量は、１００μｇの総用量である。一部の態様では、有効量は、合計２回対象に投与される２５μｇの用量である。一部の態様では、有効量は、合計２回対象に投与される１００μｇの用量である。一部の態様では、有効量は、合計２回対象に投与される４００μｇの用量である。一部の態様では、有効量は、合計２回対象に投与される５００μｇの用量である。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物および／またはワクチンの効力（または有効性）は、６０％よりも高い。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原性ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含有する。
免疫原性組成物の効力は、標準的な分析を使用して評価され得る。例えば、免疫原性組成物の効力は、二重盲検ランダム化比較臨床試験によって測定され得る。免疫原性組成物の効力は、以下の式の使用によって、ワクチン接種されていない（ＡＲＵ）研究コホートと、本開示の免疫原性組成物が投与されたワクチン接種された（ＡＲＶ）研究コホートとの間での、疾患罹患率（ＡＲ）における比例的低減として表され得、ワクチン接種された群間での疾患の相対リスク（ＲＲ）から計算され得る：効力＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００；および効力＝（１－ＲＲ）×１００。同様に、免疫原性組成物の有効性は、標準的な分析を使用して評価され得る。免疫原性組成物の有効性は、免疫原性組成物（高い効力を有すると既に証明されている場合がある）が集団において疾患をどの程度低減させるかの評価である。この尺度は、比較臨床試験においてではなく、自然のフィールドの条件下で、免疫原性組成物自体だけではなく、免疫原性組成物投与プログラムの利益と有害効果との正味のバランスを評価することができる。免疫原性組成物の有効性は、免疫原性組成物の効力（有効性）に比例するが、集団中の標的群がどの程度良好に免疫化されるかによっても、ならびに入院、歩行による通院またはコストといった「実世界での」転帰に影響を与える他の非免疫原性組成物関連因子によっても、影響される。例えば、感染症例および適切な対照のセットにおける免疫原性組成物投与の割合が比較される、後向き症例対照分析が使用され得る。免疫原性組成物の有効性は、その免疫原性組成物の投与にもかかわらず感染症を発症するオッズ比（ＯＲ）の使用により、率差として表され得る：有効性＝（１－ＯＲ）×１００。一部の態様では、本明細書で開示される免疫原性組成物の効力（または有効性）は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％である。
一部の態様では、免疫原性組成物は、抗原産生生物、ウイルスまたは細胞、例えば、インフルエンザに対して対象を最大で２年間にわたって免疫化する。一部の態様では、免疫原性組成物は、対象を２年間よりも長い時間、３年間よりも長い時間、４年間よりも長い時間、または５～１０年間にわたって免疫化する。一部の態様では、対象は、約５歳またはそれよりも若い。例えば、対象は、約１歳と約５歳との間（例えば、約１、２、３、５または５歳）、または約６カ月と約１歳との間（例えば、約６、７、８、９、１０、１１または１２カ月）であり得る。一部の態様では、対象は、約１２カ月またはそれよりも若い（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２カ月または１カ月）。一部の態様では、対象は、約６カ月またはそれよりも若い。一部の態様では、対象は、正常満期（例えば、約３７～４２週間）で誕生した。一部の態様では、対象は、未熟で、例えば、約３６週間の妊娠期間またはそれよりも早期（例えば、約３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５週間）に誕生した。例えば、対象は、約３２週間の妊娠期間またはそれよりも早期に誕生していてもよい。一部の態様では、対象は、約３２週間と約３６週間との間の妊娠期間で、未熟で誕生した。かかる対象では、免疫原性組成物は、後年、例えば、約６カ月～約５歳、またはそれよりも年長で投与され得る。一部の態様では、対象は、約２０歳と約５０歳との間（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０歳）の若い成人である。一部の態様では、対象は、約６０歳、約７０歳またはそれよりも年長（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳）の高齢対象である。
一部の態様では、ワクチンは、インフルエンザに対して対象を最大で２年間免疫化する。一部の態様では、ワクチンは、インフルエンザに対して対象を２年間よりも長い時間、３年間よりも長い時間、４年間よりも長い時間、または５～１０年間にわたって免疫化する。一部の態様では、対象は、約５歳またはそれよりも若い。例えば、対象は、約１歳と約５歳との間（例えば、約１、２、３、５または５歳）、または約６カ月と約１歳との間（例えば、約６、７、８、９、１０、１１または１２カ月）であり得る。一部の態様では、対象は、約１２カ月またはそれよりも若い（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２カ月または１カ月）。一部の態様では、対象は、約６カ月またはそれよりも若い。一部の態様では、対象は、正常満期（例えば、約３７～４２週間）で誕生した。一部の態様では、対象は、未熟で、例えば、約３６週間の妊娠期間またはそれよりも早期（例えば、約３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５週間）に誕生した。例えば、対象は、約３２週間の妊娠期間またはそれよりも早期に誕生していてもよい。一部の態様では、対象は、約３２週間と約３６週間との間の妊娠期間で、未熟で誕生した。かかる対象では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、後年、例えば、約６カ月～約５歳、またはそれよりも年長で投与され得る。一部の態様では、対象は、約２０歳と約５０歳との間（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０歳）の若い成人である。一部の態様では、対象は、約６０歳、約７０歳またはそれよりも年長（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳）の高齢対象である。
一部の態様では、対象は、インフルエンザ（例えば、Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））に曝露されている；対象は、インフルエンザ（例えば、Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））に感染している；または対象は、インフルエンザ（例えば、Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））による感染のリスクがある。一部の態様では、対象は、免疫無防備状態である（障害された免疫系を有する、例えば、免疫障害または自己免疫障害を有する）。
一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、ヒトにおけるウイルスに対する予防のための、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるウイルスポリペプチドまたはその断片をコードする。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、コロナウイルスポリペプチドを含まない。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスポリペプチドを含まない。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドを含まない。
したがって、一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるコロナウイルスポリペプチドまたはその断片をコードしない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるＳＡＲＳウイルスポリペプチドまたはその断片をコードしない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードしない。
さらなる態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、ヒトにおけるコロナウイルスに対する予防のためには使用されない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、ヒトにおけるＳＡＲＳウイルスに対する予防のためには使用されない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物のＲＮＡ分子は、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する予防のためには使用されない。
一部の態様では、本開示の免疫原性組成物、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ヒトにおけるウイルスに対する予防のための、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡを含む。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、コロナウイルスポリペプチドを含まない。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスポリペプチドを含まない。一部の態様では、ウイルスポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドを含まない。
したがって、一部の態様では、本開示の免疫原性組成物、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるコロナウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡを含まない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物は、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれる重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡを含まない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物は、その天然に存在するまたは操作されたバリアントが含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡを含まない。
さらなる態様では、本開示の免疫原性組成物は、ヒトにおけるコロナウイルスに対する予防のためには使用されない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物は、ヒトにおけるＳＡＲＳウイルスに対する予防のためには使用されない。一部の態様では、本開示の免疫原性組成物は、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する予防のためには使用されない。
一部の態様では、本明細書に記載される核酸免疫原性組成物および／またはワクチンは、化学的に改変される。他の態様では、核酸免疫原性組成物ワクチンは、未改変である。なお他の態様は、対象に投与するための組成物、および第１のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与するステップを含む、免疫原性組成物を対象に投与する方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、安定化エレメントを含まず、アジュバントが、ワクチンと共に共製剤化も共投与もされない、組成物および方法を提供する。
他の態様では、本発明は、対象をワクチン接種するための免疫原性組成物、または第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを対象に投与するステップを含む、対象をワクチン接種する方法であって、１０μｇ／ｋｇと４００μｇ／ｋｇとの間の投薬量の核酸免疫原性組成物および／またはワクチンが対象に投与される、免疫原性組成物または方法である。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量は、１用量当たり１～５μｇ、５～１０μｇ、１０～１５μｇ、１５～２０μｇ、１０～２５μｇ、２０～２５μｇ、２０～５０μｇ、３０～５０μｇ、４０～５０μｇ、４０～６０μｇ、６０～８０μｇ、６０～１００μｇ、５０～１００μｇ、８０～１２０μｇ、４０～１２０μｇ、４０～１５０μｇ、５０～１５０μｇ、５０～２００μｇ、８０～２００μｇ、１００～２００μｇ、１２０～２５０μｇ、１５０～２５０μｇ、１８０～２８０μｇ、２００～３００μｇ、５０～３００μｇ、８０～３００μｇ、１００～３００μｇ、４０～３００μｇ、５０～３５０μｇ、１００～３５０μｇ、２００～３５０μｇ、３００～３５０μｇ、３２０～４００μｇ、４０～３８０μｇ、４０～１００μｇ、１００～４００μｇ、２００～４００μｇまたは３００～４００μｇである。一部の態様では、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。一部の態様では、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンは、ゼロ日目に対象に投与される。一部の態様では、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンの第２の用量が、２１日目に対象に投与される。一部の態様では、２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、２００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量が、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中に含まれる。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節中に１００倍高いレベルで蓄積する。他の態様では、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンは、化学的に改変され、他の態様では、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンは、化学的に改変されない。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドおよび薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチン中に含まれない、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、安定化エレメントは、ヒストンステム－ループである。一部の態様では、安定化エレメントは、野生型配列と比較して増加したＧＣ含量を有する核酸配列である。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、許容できるパーセンテージのヒト対象に、第１の抗原に対する抗体保有に関する基準よりも優れた抗体力価を付与する、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のための製剤中に存在する、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、本発明のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンによって生じる抗体力価は、中和抗体力価である。一部の態様では、中和抗体力価は、タンパク質ワクチンよりも高い。他の態様では、本発明のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンによって生じる中和抗体力価は、アジュバント添加されたタンパク質ワクチンよりも高い。なお他の態様では、本発明のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンによって生じる中和抗体力価は、１，０００～１０，０００、１，２００～１０，０００、１，４００～１０，０００、１，５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１，０００～４，０００、１，８００～１０，０００、２０００～１０，０００、２，０００～５，０００、２，０００～３，０００、２，０００～４，０００、３，０００～５，０００、３，０００～４，０００または２，０００～２，５００である。中和力価は、典型的には、プラークの数における５０％の低減を達成するために要求される最も高い血清希釈として表される。
第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、安定化エレメントを有するかまたはアジュバントを用いて製剤化された、その第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンによって惹起された抗体力価よりも長く持続する高い抗体力価を惹起するために、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のための製剤中に存在する、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンもまた提供される。一部の態様では、ＲＮポリヌクレオチドは、単回投与の１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。一部の態様では、アジュバントは、カチオン性ペプチドおよび免疫刺激性核酸から選択される。一部の態様では、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
態様は、少なくとも１つの化学的改変を含むかまたは改変されたヌクレオチドを任意選択により含まないオープンリーディングフレームであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、宿主における抗原発現のレベルが、安定化エレメントを有するかまたはアジュバントを用いて製剤化された、その第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンによって生じた抗原発現のレベルを有意に超えるように、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のための製剤中に存在する、核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学的改変を含むかまたは改変されたヌクレオチドを任意選択により含まないオープンリーディングフレームであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、未改変のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンが等価な抗体力価を生じさせるために要求されるＲＮＡポリヌクレオチドの多くても１０分の１の少なさのＲＮＡポリヌクレオチドを有する、免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投薬量で存在する。
本発明の態様は、ヒト対象への送達のために製剤化された、少なくとも１つの化学的改変を含むかまたは改変されたヌクレオチドを任意選択により含まないオープンリーディングフレームであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドの１０ｕｇと４００ｕｇとの間、ならびに薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む使用単位の免疫原性組成物および／またはワクチンもまた提供する。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様は、個体または個体の集団における、抗原、例えば、ウイルス株の抗原に対する抗原記憶を創出、維持または回復する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学的改変を含むかまたは改変されたヌクレオチドを任意選択により含まない、ポリヌクレオチドと、２つまたはそれよりも多くのコドン最適化されたオープンリーディングフレームであって、参照抗原性ポリペプチドのセットをコードするオープンリーディングフレーム、ならびに（ｂ）任意選択により、薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む抗原記憶ブースター核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを、当該個体または集団に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、免疫原性組成物および／またはワクチンは、筋肉内投与、皮内投与および皮下投与からなる群から選択される経路を介して、個体に投与される。一部の態様では、投与するステップは、対象の筋肉組織を組成物の注射に適切なデバイスと接触させることを含む。一部の態様では、投与するステップは、エレクトロポレーションと組み合わせて、対象の筋肉組織を組成物の注射に適切なデバイスと接触させることを含む。
本発明の態様は、免疫原性組成物および／またはワクチンを対象に投与する（例えば、対象をワクチン接種する）方法であって、例えば、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンの２５ｕｇ／ｋｇと４００ｕｇ／ｋｇとの間の単一の投薬量を、対象に投与するまたは対象をワクチン接種するための有効量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学的改変を含むオープンリーディングフレームであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、未改変のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンが等価な抗体力価を生じさせるために要求されるＲＮＡポリヌクレオチドの多くても１０分の１の少なさのＲＮＡポリヌクレオチドを有する、免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投薬量で存在する。
他の態様は、ヌクレオチド改変を含まない（未改変の）オープンリーディングフレームであって、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＬＮＰ製剤化ＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンであって、ＬＮＰ中に製剤化されていない未改変のｍＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンが等価な抗体力価を生じさせるために要求されるＲＮＡポリヌクレオチドの多くても１０分の１の少なさのＲＮＡポリヌクレオチドを有する、免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。一部の態様では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投薬量で存在する。
実施例に示されるデータは、本発明の製剤を使用して免疫応答を生じさせ得る重要な増強された品質および性情を実証している。化学的に改変されたＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンならびに未改変のＲＮＡ免疫原性組成物および／またはワクチンは共に、本発明に従って有用である。
他の態様では、本発明は、６０歳またはそれよりも年長の高齢対象を処置する方法であって、ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを、対象をワクチン接種するための有効量で対象に投与するステップを含む方法を包含する。他の態様では、本発明は、１７歳またはそれよりも若い、若い対象を処置する方法であって、ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを、対象をワクチン接種するための有効量で対象に投与するステップを含む方法を包含する。他の態様では、本発明は、成人対象を処置する方法であって、ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸免疫原性組成物および／またはワクチンを、対象に投与するまたは対象をワクチン接種するための有効量で対象に投与するステップを含む方法を包含する。
一部の態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む組み合わせ免疫原性組成物および／またはワクチンを対象に投与する（例えば、対象をワクチン接種する）方法であって、ワクチンの投薬量が、組み合わされた治療的投薬量であり、抗原をコードする各個々の核酸の投薬量が、治療的投薬量未満である、方法に関する。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、組み合わされた投薬量は、対象に投与される核酸免疫原性組成物および／またはワクチン中４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の態様では、１つの脂質ナノ粒子にカプセル封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物は、一価であり、１μｇのｍＲＮＡ、２μｇのＲＮＡ、５μｇのＲＮＡおよび２０μｇのＲＮＡのうちのいずれか１つから選択される用量を有する。
一部の態様では、免疫原性組成物は、第１の脂質ナノ粒子にカプセル封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子、第２の脂質ナノ粒子にカプセル封入された、ＨＡをコードするｍＲＮＡ分子、第３の脂質ナノ粒子にカプセル封入された、ＮＡをコードするｍＲＮＡ分子、および第４の脂質ナノ粒子にカプセル封入された、ＮＡをコードするｍＲＮＡ分子を含み、総用量は、最大で２０μｇのＲＮＡである。
好ましい態様では、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチン（例えば、ＬＮＰカプセル封入されたｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血液または血清中に、予防的および／または治療的に有効なレベル、濃度および／または力価の抗原特異的抗体を生じさせる。本明細書で定義される場合、抗体力価という用語は、対象、例えばヒト対象において産生された抗原特異的抗体の量を指す。例示的な態様では、抗体力価は、肯定的な結果をなおも生じる（連続希釈中の）最も大きい希釈の逆数として表される。例示的な態様では、抗体力価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な態様では、抗体力価は、中和アッセイによって、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様では、抗体力価測定値は、比、例えば、１：４０、１：１００などとして表される。
本発明の例示的な態様では、有効な免疫原性組成物および／またはワクチンは、１：４０よりも高い、１：１００よりも高い、１：４００よりも高い、１：１０００よりも高い、１：２０００よりも高い、１：３０００よりも高い、１：４０００よりも高い、１：５００よりも高い、１：６０００よりも高い、１：７５００よりも高い、１：１００００よりも高い抗体力価を生じさせる。例示的な態様では、抗体力価は、ワクチン接種の１０日後までに、ワクチン接種の２０日後までに、ワクチン接種の３０日後までに、ワクチン接種の４０日後までに、またはワクチン接種の５０日もしくはそれ以降後までに、生じるまたは到達される。例示的な態様では、力価は、対象に投与された免疫原性組成物および／またはワクチンの単一の用量の後に生じるまたは到達される。他の態様では、力価は、複数の用量の後、例えば、第１および第２の用量（例えば、ブースター用量）の後に生じるまたは到達される。本発明の例示的な態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌの単位で測定される、またはＩＵ／Ｌ（１リットル当たりの国際単位）もしくはｍＩＵ／ｍｌ（１ｍｌ当たりのミリ国際単位）の単位で測定される。本発明の例示的な態様では、有効な免疫原性組成物および／またはワクチンは、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞０．１μｇ／ｍｌ、＞０．２μｇ／ｍｌ、＞０．３５μｇ／ｍｌ、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞１μｇ／ｍｌ、＞２μｇ／ｍｌ、＞５μｇ／ｍｌまたは＞１０μｇ／ｍｌを生じさせる。本発明の例示的な態様では、有効な免疫原性組成物および／またはワクチンは、＞１０ｍＩＵ／ｍｌ、＞２０ｍＩＵ／ｍｌ、＞５０ｍＩＵ／ｍｌ、＞１００ｍＩＵ／ｍｌ、＞２００ｍＩＵ／ｍｌ、＞５００ｍＩＵ／ｍｌまたは＞１０００ｍＩＵ／ｍｌを生じさせる。例示的な態様では、抗体のレベルまたは濃度は、ワクチン接種の１０日後までに、ワクチン接種の２０日後までに、ワクチン接種の３０日後までに、ワクチン接種の４０日後までに、またはワクチン接種の５０日もしくはそれ以降後までに、生じるまたは到達される。例示的な態様では、レベルまたは濃度は、対象に投与された免疫原性組成物および／またはワクチンの単一の用量の後に生じるまたは到達される。他の態様では、レベルまたは濃度は、複数の用量の後、例えば、第１および第２の用量（例えば、ブースター用量）の後に生じるまたは到達される。例示的な態様では、抗体のレベルまたは濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な態様では、抗体のレベルまたは濃度は、中和アッセイによって、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。
ＶＩ．凍結または凍結乾燥
凍結乾燥は、第１のステップで試料を凍結させ、引き続いて、昇華を介して１つまたは複数のステップで試料を乾燥させることによって、任意選択により、周囲の圧力を低減させることによって、および／または溶媒が固相から気相へ直接昇華するように試料を加熱することによって、実施され得る。一部の態様では、凍結乾燥の方法は、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した脂質ナノ粒子および少なくとも１つの凍結保護剤、ならびにブランクＬＮＰを含む組成物を提供するステップを含む。一部の態様では、この方法は、脂質または半液体製剤の凍結乾燥を可能にする機器を指すフリーズドライヤー中で、組成物をフリーズドライするステップをさらに含む。かかる機器は、当該分野で入手可能である。
本明細書で使用される場合、用語「凍結保護剤」は、典型的には、分子の周囲の水和層を部分的または全体的に置き換え、そうして、触媒および／または加水分解プロセスを防止する、賦形剤を指す。一部の態様では、凍結保護剤は、ブランクＬＮＰまたはリポソームであり、このＬＮＰまたはリポソームは、ＲＮＡをカプセル封入していない。一部の態様では、凍結保護剤は、二糖（例えば、スクロース）である。好ましい態様では、ステップａ）において提供される組成物は、ｉ）ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した脂質ナノ粒子；ｉｉ）炭水化物である、少なくとも１つの凍結保護剤；およびｉｉｉ）ＲＮＡをカプセル封入していないまたはＲＮＡと会合していない脂質ナノ粒子またはリポソームを含む。別の好ましい態様では、ステップａ）において提供される組成物は、ｉ）ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合した脂質ナノ粒子；およびｉｉ）二糖である、有効量の少なくとも１つの凍結保護剤であって、有効量の凍結保護剤が、組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０％ｗ／ｖ／、多くても２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０％ｗ／ｖ／、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０％ｗ／ｖ／のうちのいずれか２つの間、または正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０％ｗ／ｖ／）である、凍結保護剤を含む。
例示的な炭水化物は、好ましくは、単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ソルボース、マンノース（好ましくは、未結合もしくはコンジュゲート化されていないこと、例えば、マンノースが、少なくとも１つのＲＮＡに共有結合されていない、または言い換えると、マンノースが、好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡに関してコンジュゲート化されていないことを意味する）など、およびそれらの混合物など；二糖、例えば、ラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど、およびそれらの混合物など；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デキストリン、セルロース、デンプンなど、およびそれらの混合物など；ならびにアルジトール、例えば、グリセロール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなど、およびそれらの混合物であるがこれらに限定されない、医薬組成物の調製に適切な任意の炭水化物を含み得るがこれらに限定されない。組成物中に好ましくは含まれる糖の例には、ラクトース、マンノース、マンニトール、スクロースまたはトレハロースが含まれる。好ましくは、糖は、スクロースである。一部の態様では、糖は、高い水置換活性および高いガラス転移温度を有する。一部の態様では、糖は、好ましくは、親水性であるが、吸湿性ではない。一部の態様では、糖は、結晶化する傾向が低い。一部の態様では、凍結保護剤は、マンニトール、スクロース、グルコース、マンノースおよびトレハロースのうちのいずれか１つから選択される。一部の態様では、さらなる構成要素が、凍結保護剤として使用され得る。特に、アルコール、例えば、ＰＥＧ、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン、ＤＭＳＯ、アミノ酸ならびにタンパク質、例えば、プロリン、グリシン、フェニルアラニン、アルギニン、セリンならびにアルブミンおよびゼラチンが、凍結保護剤として使用され得る。さらに、以下で定義される金属イオン、界面活性剤および塩が、凍結保護剤として使用され得る。さらに、ポリマー、特にポリビニルピロリドンが、凍結保護剤として使用され得る。
一部の態様では、組成物中のＲＮＡの、当該組成物中の凍結保護剤、好ましくは炭水化物、より好ましくは糖、さらにより好ましくはスクロースに対する重量比は、好ましくは、約１：２０００～約１：１０、より好ましくは、約１：１０００～約１：１００の範囲内である。最も好ましくは、組成物中の少なくとも１つのＲＮＡの、当該液体中の凍結保護剤、好ましくは、炭水化物、より好ましくは糖、さらにより好ましくはスクロースに対する重量比は、約１：２５０～約１：１０の範囲内、より好ましくは、約１：１００～約１：１０の範囲内、最も好ましくは、約１：１００～約１：５０の範囲内である。一部の態様では、凍結保護剤は、組成物の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％ｗ／ｖもしくはそれ超、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値を構成する。
一部の態様では、組成物は、以下のうちのいずれか１つをさらに含み得る：凍結保護剤、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、増量剤、防腐剤、抗酸化剤、金属キレーター、抗菌剤、着色料、担体、フィラー、フィルム形成剤、再分散剤（ｒｅｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）および崩壊剤。さらに、一部の態様では、組成物は、以下のうちのいずれか１つをさらに含み得る：賦形剤、例えば、消泡剤、界面活性剤、粘度増強剤、力制御剤など。
一部の態様では、少なくとも１つのＲＮＡおよび少なくとも１つの凍結乾燥保護剤を含む組成物は、一部の態様では、６０℃と等しいまたはそれよりも高い、一部の態様では、７０℃と等しいまたはそれよりも高い、一部の態様では、８０℃と等しいまたはそれよりも高いガラス転移温度（Ｔｇ）によって特徴付けられる。一部の態様では、組成物のガラス転移温度は、５０℃～２００℃の範囲内、一部の態様では、６０℃～１２０℃の範囲内、一部の態様では、７０℃～１００℃の範囲内、一部の態様では、約７８℃～約８８℃の範囲内である。好ましい態様では、組成物は、一部の態様では、約０．１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の範囲内、一部の態様では、約１％（ｗ／ｗ）～約８％（ｗ／ｗ）の範囲内、一部の態様では、約２％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）の範囲内、一部の態様では、約３％（ｗ／ｗ）～４％の範囲内、例えば、３％（ｗ／ｗ）±２％（ｗ／ｗ）または３％（ｗ／ｗ）±１％（ｗ／ｗ）の残存水分含量によって特徴付けられる。一部の態様では、組成物の残存水含量は、１０％（ｗ／ｗ）と等しいまたはそれ未満、一部の態様では、７％（ｗ／ｗ）と等しいまたはそれ未満、一部の態様では、５％（ｗ／ｗ）と等しいまたはそれ未満、一部の態様では、４％（ｗ／ｗ）と等しいまたはそれ未満である。本明細書で使用される場合、用語「残存水分含量」（または「残存水分」）は、組成物中に存在する溶媒の総量を指す。組成物中の残存溶媒の当該総量は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して決定され得る。例えば、残存水分含量を決定するための方法には、カールフィッシャー滴定技法または熱重量分析（ＴＧＡ）法が含まれ得る。一部の態様では、組成物中に含まれる残存溶媒は、水または本質的に水性の溶液であり、残存水分含量は、カールフィッシャー滴定技法によって決定される。
組成物は、好ましくは、ＲＮＡをカプセル封入する脂質ナノ粒子の貯蔵安定な形態として適切である。ＲＮＡの貯蔵安定性は、例えば、時間経過ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現研究を介した、所与の貯蔵期間後の相対的（構造的）完全性および生物学的活性の決定を介して決定され得る。相対的完全性は、例えば、ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用することによって、ＲＮＡの総量（即ち、全長ＲＮＡおよび分解されたＲＮＡ断片（これは、ゲル電気泳動においてスメアとして現れ得る））に対する、好ましくは、ＬＯＤ（３×背景ノイズ）の差し引き後の、全長ＲＮＡ（即ち、分解されていないＲＮＡ）のパーセンテージとして決定され得る。一部の態様では、組成物は、ＷＦＩまたは他の注射可能な溶液中の、ブランクＬＮＰの非存在下でのＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰを含む対応する組成物よりも、－８０℃～６０℃の温度におけるより長い貯蔵を可能にする。一部の態様では、組成物は、室温で貯蔵され得る。一部の態様では、組成物は、遮蔽ガスありまたはなしで貯蔵される。一部の態様では、単一の用量の組成物が、包装および密封される。あるいは、複数の用量が、１つの包装単位中に包装され得る。
ＲＮＡをカプセル封入する脂質ナノ粒子を含む組成物は、少なくとも約２時間～２年間にわたって貯蔵され得る。一部の態様では、ＲＮＡまたはカプセル封入されたＲＮＡは、少なくとも約２時間、４時間～８週間、６時間～７週間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、１年間、２年間のうちのいずれか１つ、少なくとも約２時間、４時間～８週間、６時間～７週間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、１年間、２年間のうちの少なくともいずれか１つ、少なくとも約２時間、４時間～８週間、６時間～７週間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、１年間、２年間のうちの多くてもいずれか１つ、または少なくとも約２時間、４時間～８週間、６時間～７週間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、１年間、２年間のうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しい期間にわたって貯蔵される。ＲＮＡをカプセル封入する脂質ナノ粒子を含む組成物は、約室温～約－９０℃の温度で貯蔵され得る。例えば、ＲＮＡまたはカプセル封入されたＲＮＡは、室温よりも低い、４℃もしくはそれよりも低い、０℃もしくはそれよりも低い、－２０℃もしくはそれよりも低い、－６０℃もしくはそれよりも低い、－７０℃もしくはそれよりも低い、－８０℃もしくはそれよりも低い、または－９０℃もしくはそれよりも低い温度で貯蔵され得る。一部の態様では、ＲＮＡをカプセル封入する脂質ナノ粒子を含む組成物は、約２０℃、１５℃、１０℃、５℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃もしくは－９０℃のうちのいずれか１つ、約２０℃、１５℃、１０℃、５℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃もしくは－９０℃のうちの少なくともいずれか１つ、約２０℃、１５℃、１０℃、５℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃もしくは－９０℃のうちの多くてもいずれか１つ、または約２０℃、１５℃、１０℃、５℃、０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃もしくは－９０℃のうちのいずれか２つの間、またはその中の誘導可能な任意の範囲もしくは値と等しい温度で貯蔵される。
一部の態様では、組成物中の少なくとも１つのＲＮＡの相対的完全性は、好ましくは、少なくとも１週間、より好ましくは、少なくとも１カ月間、さらにより好ましくは、少なくとも６カ月間、最も好ましくは、少なくとも１年間にわたる室温での貯蔵後に、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。一部の態様では、室温での貯蔵後の組成物の少なくとも１つのＲＮＡの生物学的活性は、凍結乾燥前のＲＮＡの生物学的活性の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。生物学的活性は、例えば、哺乳動物細胞株中または対象中へのトランスフェクション後の、それぞれ、復元された、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰから発現されたタンパク質の量、および凍結乾燥前の、ＲＮＡをカプセル封入するまたはＲＮＡと会合したＬＮＰから発現されたタンパク質の量の分析によって決定され得る。あるいは、生物学的活性は、対象における（適応または自然）免疫応答の誘導を測定することによって決定され得る。
一部の態様では、ＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰは、ａ）ＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰおよび少なくとも１つの凍結保護剤を有する組成物を提供するステップ；ｂ）フリーズドライヤーのフリーズドライチャンバー中に組成物を充填するステップ；ｃ）組成物を凍結温度に冷却するステップ；ｄ）組成物を凍結温度で凍結させて、凍結された組成物を得るステップ；ｅ）フリーズドライチャンバー中の圧力を、大気圧よりも低い圧力に低減させるステップ；ｆ）ＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰおよび少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結乾燥された組成物を得るために、ステップｄ）で得られた凍結された組成物を乾燥させるステップ；ｇ）フリーズドライチャンバー中の圧力を大気圧とつり合わせ、ＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰおよび少なくとも１つの凍結保護剤を含む凍結乾燥された組成物をフリーズドライチャンバーから取り出すステップによって凍結乾燥されている。一部の態様では、乾燥させるステップｆ）は、約２００ｍバール未満の圧力で実施される。一部の態様では、フリーズドライチャンバー中の圧力は、３～２００ｍバールの間である。一部の態様では、フリーズドライチャンバー中の圧力は、３０～２００ｍバールの間である。一部の態様では、フリーズドライチャンバー中の圧力は、３～１００ｍバールの間である。一部の態様では、フリーズドライチャンバー中の圧力は、４５～１５０ｍバールの間である。
以下の実施例は、本開示の態様を実証するために含められる。以下の実施例に開示される技法は、本開示の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技法を示し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するとみなされ得ることが、当業者に理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示の教示の下に、多くの変化が、開示された具体的な態様においてなされ得、本開示の精神および範囲から逸脱することなしに同様のまたは類似の結果をなおも生じることを理解すべきである。
（実施例１）
インフルエンザｍｏｄＲＮＡ
実施例は、他に特定されない限り、インフルエンザｍｏｄＲＮＡに基づく。特定の構築物（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｍｏｄＲＮＡ）が、免疫原性組成物中の唯一の活性成分である。薬物物質は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中で製剤化し、－２０±５℃で貯蔵する。
抗原をコードするコドン最適化された配列に加えて、ＲＮＡは、高いＲＮＡ安定性および翻訳効率を媒介するために最適化された共通の構造的エレメント（５’－キャップ、５’ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）－テイル；以下の表および配列を参照されたい）を含有する。さらに、固有のシグナルペプチド（ｓｅｃ）がオープンリーディングフレームの一部であり、Ｎ末端ペプチドとして翻訳される。ＲＮＡは、ウリジンを全く含有しない；ウリジンの代わりに、改変されたＮ１－メチルプソイドウリジンがＲＮＡ合成において使用される。
特定の構築物は各々、以下の表１に示されるエレメントを含む：
Figure 2024537854000011
エレメントの配列：
キャップおよび５’－ＵＴＲ：ＧＡＧＡＡΨＡＡＡＣ ΨＡＧΨＡΨΨＣΨΨ ＣΨＧＧΨＣＣＣＣＡ ＣＡＧＡＣΨＣＡＧＡ ＧＡＧＡＡＣＣＣＧＣ ＣＡＣＣ（配列番号１）、式中、太字の下線付きテキストは、キャップに対応し、未修飾のテキストは、５’－ＵＴＲに対応する。
３’－ＵＴＲ：ＣΨＣＧＡＧＣΨＧＧΨ ＡＣΨＧＣＡΨＧＣＡ ＣＧＣＡＡΨＧＣΨＡ ＧＣΨＧＣＣＣＣΨΨ ΨＣＣＣＧΨＣＣΨＧ ＧＧΨＡＣＣＣＣＧＡ ＧΨＣΨＣＣＣＣＣＧ ＡＣＣΨＣＧＧＧΨＣ ＣＣＡＧＧΨＡΨＧＣ ΨＣＣＣＡＣＣΨＣＣ ＡＣＣΨＧＣＣＣＣＡ ＣΨＣＡＣＣＡＣＣΨ ＣΨＧＣΨＡＧΨΨＣ ＣＡＧＡＣＡＣＣΨＣ ＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣ ＡＧＣＡＡΨＧＣＡＧ ＣΨＣＡＡＡＡＣＧＣ ΨΨＡＧＣＣΨＡＧＣ ＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡ ＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＡＧΨＧＡΨΨＡＡ ＣＣΨΨΨＡＧＣＡＡ ΨＡＡＡＣＧＡＡＡＧ ΨΨΨＡＡＣΨＡＡＧ ＣΨＡΨＡＣΨＡＡＣ ＣＣＣＡＧＧＧΨΨＧ ＧΨＣＡＡΨΨΨＣＧ ΨＧＣＣＡＧＣＣＡＣ ＡＣＣＣΨＧＧＡＧＣ ΨＡＧＣ（配列番号２）
ポリ（Ａ）テイル：ＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＧＣＡΨＡΨ ＧＡＣΨＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡ（配列番号３）
本明細書で使用される場合、Ψは、１－メチル－３’－プソイドウリジリルを示す。
キャップ１構造を含有するＲＮＡの産生のための５’－キャップアナログ（ｍ２ ７，３’－ＯＭｅＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）は、以下に示される。
Figure 2024537854000012
上記構造は、ＴｒｉｌｉｎｋのＣｌｅａｎＣａｐ ＡＧ（３’ＯＭｅ） － ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧに対応する。この分子は、Ｎ７においてメチル化されたグアノシンで始まり、転写されたＲＮＡの最初のコードされたヌクレオチド（この場合にはアデノシン）に５’－５’三リン酸連結によって連結されるという点で、天然のＲＮＡキャップ構造と同一である。このグアノシンは、リボースの３’ヒドロキシルにおいてもメチル化されて、キャップ分子の可能な逆取込みを軽減させる。最後に、アデノシン上のリボースの２’ヒドロキシルがメチル化され、キャップ１構造を与える － 対照的に、これを２’ヒドロキシルとして残すことで、これにキャップ０構造を与える。キャップ１構造は、真核生物において、キャップ０構造を有するＲＮＡよりも優れた転写を提供するはずである。
インフルエンザｍｏｄＲＮＡワクチン候補は、北半球の２０２１～２０２２年シーズンのための細胞培養ベースのインフルエンザワクチンのための推奨ワクチン株であるＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／ｅ０８２６３６０／２０２０（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）およびＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）に由来するＨＡタンパク質をコードし得る。配列中のポリ（Ａ）－テイル中に存在するＡヌクレオチドの数は、好ましくは、ＢｓｐＱ１（またはそのアイソシゾマー）による直鎖化後に最終ＲＮＡ中にそれがどの程度存在するかを反映する：３０Ａ－リンカー－７０Ａ。キャップ１構造を有する転写されたＲＮＡでは、ｍＲＮＡ配列中の最初の２ヌクレオチド（ＡＧ）は、実際には、ＣＬＥＡＮＣＡＰ試薬によって提供され、最初のアデノシン上のリボースの２’ヒドロキシルは、メチル化される。
キャップ１構造（即ち、ＲＮＡ鎖の５’末端の最後から２番目のヌクレオシド上に２’－Ｏ－メチル基を含有する）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の間にそれぞれのキャップアナログを使用することによって、薬物物質中に取り込まれる。改変されたウリジンヌクレオチドを有するＲＮＡについて、キャップ１構造は、他のキャップ構造よりも優れているが、それは、キャップ１が、ＩＦＩＴ１などの細胞性因子によって認識されず、したがって、キャップ１依存的翻訳が、真核生物翻訳開始因子４Ｅとの競合によって阻害されないからである。ＩＦＩＴ１発現の状況下では、キャップ１構造を有するｍＲＮＡは、より高いタンパク質発現レベルを与える。
一部の好ましい実施形態では、インフルエンザワクチン薬物物質は、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５８８／２０１９ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／ｅ０８２６３６０／２０２０、Ｂ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／０２／２０１９またはＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３のいずれかのインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質に対応するそれぞれのタンパク質（コードされる抗原）へと翻訳される、一本鎖の５’－キャップされたｍＲＮＡである。抗原コードＲＮＡの一般構造は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写のための鋳型として使用されるＤＮＡのそれぞれのヌクレオチド配列によって決定される。抗原をコードするコドン最適化された配列に加えて、ＲＮＡは、高いＲＮＡ安定性および翻訳効率を媒介するために最適化された共通の構造的エレメント（５’－キャップ、５’ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）－テイル；以下を参照されたい）を含有する。ＲＮＡは、ウリジンを全く含有しない；ウリジンの代わりに、改変されたＮ１－メチルプソイドウリジンがＲＮＡ合成において使用される。
製造プロセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ステップを介したＲＮＡ合成と、その後の、ＤＮａｓｅ ＩおよびプロテイナーゼＫ消化ステップ、限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）による精製、最終濾過、適切な容器中への分配、ならびに－２０℃での貯蔵を含む。ＩＶＴ、消化および精製プロセスステップへのプラットフォームアプローチを、４つのｍｏｄＲＮＡの産生に使用した。ｍＲＮＡ臨床バッチを、ＩＶＴのために３７．６Ｌの出発体積の規模で調製した。全ての材料を単一の２段階ＵＦＤＦによって精製して、ｍＲＮＡ薬物物質を産生した。
インフルエンザｍｏｄＲＮＡ免疫原性組成物は、季節性ヒトインフルエンザ株に由来する全長ＨＡ糖タンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオシド改変されたｍＲＮＡから構成されている。ｍｏｄＲＮＡは、ｍｏｄＲＮＡを分解から保護し、ＩＭ注射後の宿主細胞中へのｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションを可能にする２つの機能脂質および２つの構造脂質を用いて製剤化する。インフルエンザＨＡは、インフルエンザＡおよびＢビリオンの表面上の最も豊富なエンベロープ糖タンパク質である。
ＬＮＰ製剤は、２つの機能脂質ＡＬＣ－０３１５およびＡＬＣ－０１５９、ならびに２つの構造脂質ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）およびコレステロールを含有する。４つの脂質の物理化学的特性および構造は、以下の表に示される。
脂質ナノ粒子を、米国特許第９７３７６１９号（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１９９９５２）および米国特許第１０１６６２９８号（ＷＯ２０１７／０７５５３１）およびＷＯ２０２０／１４６８０５に記載される一般的な手順に従って、調製および試験した。簡潔に述べると、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質を、約４７．５：１０：４０．７：１．８のモル比で、エタノール中に可溶化した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、およそ１０：１～３０：１の、好ましい総脂質のｍＲＮＡに対する重量比で調製した。ｍＲＮＡを、緩衝液中に希釈した。シリンジポンプを使用して、エタノール性脂質溶液をｍＲＮＡ水性溶液と混合した。次いで、エタノールを除去し、外部緩衝液を、透析によって別の緩衝液（例えば、トリス）で置き換えた。最後に、脂質ナノ粒子を濾過した。
Figure 2024537854000013
（実施例２）
凍結－解凍またはフリーズドライに供した組成物
例となる製剤は、（ａ）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ２０１９ヘマグルチニンをコードするインフルエンザｍｏｄＲＮＡ（即ち、インフルエンザ抗原をコードする、５’末端キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび３’ポリアデニル化テイルを含むＲＮＡポリヌクレオチドであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド、例えば、Ｎ１－メチルプソイドウリジンなどを含み、好ましくは、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである）を含有する脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ ＬＮＰ）を含むｍＲＮＡ薬物産物（ＤＰ）と、（ｂ）スクロースおよびトリス溶液（ｐＨ７．４）中に分散された、核酸を排除した脂質ナノ粒子（ブランクＬＮＰ）との混合物を含有する。本明細書の実施例で使用される場合、用語「ブランクＬＮＰ」は、核酸を全くカプセル封入していない、表２に列挙された脂質を含む脂質ナノ粒子を指す。
以下の例示的な実施例は、表５に示されるような、ブランク脂質ナノ粒子の非存在下および存在下での、１０．３％対２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有する表３に示されるｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤（０．００１～０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）を用いた複数回の凍結－解凍サイクリング実験（－８０℃←→＋２０℃）またはフリーズドライ実験を実施するための研究を例示する。
フリーズドライを、最大限に凍結濃縮された溶液のガラス転移温度（Ｔｇ’）を上回り、かつ氷の融解温度を下回る温度で、アニーリングありおよびなしで実施した。
Figure 2024537854000014
（実施例３）
例示的な凍結乾燥サイクル
ＬＮＰを凍結乾燥する例示的な方法は、当該分野で公知である。例えば、脂質ナノ粒子を含む本明細書に記載される組成物は、凍結乾燥され得、このとき、７５μΙのアリコートが、無菌２Ｒガラスバイアル（１型）中に分配され得る。バイアルを、フリーズドライゴム栓で部分的に栓をする。バイアルを、フリーズドライヤー中に投入し、以下の条件下で乾燥させる。制御された凍結（アニーリングありまたはなし）および制御された乾燥条件下での凍結乾燥サイクルを、好ましくは最適化する。例示的な凍結乾燥ステップは、以下の表４に記載される。
Figure 2024537854000015
バイアルは、バイアルの栓および首上にアルミニウムキャップを圧着させることによって密封され得る。その後、試料を、５℃、２５℃／６０％相対湿度（Ｒ．Ｈ．）または４０℃／７５％Ｒ．Ｈ．で貯蔵し、５、８、１３、２４および４０週間後に相対的完全性について分析する（各々３つの試料）。凍結乾燥された組成物中に含まれるｍＲＮＡの相対的完全性を、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。具体的には、相対的完全性を、アガロースゲルのレーン中（即ち、所与の試料中）のそれぞれ全長ｍＲＮＡおよび全ての他のシグナルに対応するシグナル強度を測定し、そのレーン中の全長ｍＲＮＡについてのシグナル強度の、全ての他のシグナルに対する比を計算することによって、決定する。
（実施例４）
Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子に対する凍結－解凍サイクリングの影響
ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）を、得られた製剤の脂質含量が、０．５および０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物のものと等価になるように、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．５、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、表２に従う脂質を含む）を含む組成物に添加した。ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）の別のバッチを調製し、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのバッチおよび製剤緩衝液と混合して、最終製剤中の標的脂質およびｍＲＮＡ濃度を達成した。５×凍結－解凍（ＦＴ）サイクリングを、－８０℃とＲＴとの間で実施した（２．２５ｍＬ充填）。
図１～１２に示されるように、ブランクＬＮＰの含有は、ブランクＬＮＰを含有しない分散物で観察された凍結－解凍後のサイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を軽減させた。ブランクＬＮＰの効果は、より希薄な組成物において明らかであった。
Figure 2024537854000016
ブランクＬＮＰの含有は、特に、より低いｍＲＮＡ用量の組成物（０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ）で、凍結－解凍の際のサイズにおける増加を軽減させた。
ブランクＬＮＰの存在下（図７～９）および非存在下（図１～３）での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤についてのサイズ（ｎｍでのＺ－平均）（図１、図７）、ＰＤＩ（図２、図８）およびカプセル封入効率（カプセル封入％）（図３、図９）について得られた値の直接的対照比較は、以下の表６に示される。
Figure 2024537854000017
同様に、図１０～１２に示されるように、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤における、ブランクＬＮＰなしの０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物を含有する製剤のものと等価な総脂質濃度まで上昇する濃度でのブランクＬＮＰの含有（Ｆ番号１４～１５）は、特に、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを含有するより希薄な製剤の場合、凍結－解凍の漸増サイクルにわたって観察されたサイズ（図１０）、ＰＤＩ（図１１）およびカプセル封入効率（図１２）における増加を軽減させた。
ブランクＬＮＰの存在下（図１０～１２）および非存在下（図４～６）での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤についてのサイズ（ｎｍでのＺ－平均）（図４、図１０）、ＰＤＩ（図５、図１１）およびカプセル封入効率（カプセル封入％）（図６、図１２）について得られた値の直接的対照比較は、以下の表７に示される。
Figure 2024537854000018
２０．５％スクロース単独の含有（Ｆ番号１０～１３、－ブランクＬＮＰ）（図４～６）は、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを使用する場合（Ｆ番号１～４、－ブランクＬＮＰ）（図１～３）と比較して、５回の凍結－解凍サイクルの過程にわたって、ｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤の化学的および物理的特徴の維持のためのさらなる利点を全く提供しなかった。さらに、ｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤におけるブランクＬＮＰの含有は、サイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を防止するに当たり、より有効であった。
（実施例５）
Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子に対するフリーズドライの影響
ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）を、得られた製剤の脂質含量が、０．５および０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物のものと等価になるように、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．５、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、表２に従う脂質を含む）を含む組成物に添加した。ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）の別のバッチを調製し、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのバッチおよび製剤緩衝液と混合して、最終製剤中の標的脂質およびｍＲＮＡ濃度を達成した。
フリーズドライを、アニーリングありおよびなしで実施し（０．３ｍＬ充填）、製剤性情を、食塩水対注射用無菌水（ｓＷＦＩ）中で復元したケーキについて測定した。
図１６～２７に示されるように、食塩水（Ｓ）または無菌水（Ｗ）中で復元したアニーリングした（Ａ）およびアニーリングしていない（ＮＡ）フリーズドライされたｍＲＮＡ含有ＬＮＰ試料におけるブランクＬＮＰの含有は、ブランクＬＮＰを含有しない分散物で観察された復元後のサイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を軽減させた。ブランクＬＮＰの効果は、より希薄な組成物（０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ）において明らかであった。
ブランクＬＮＰの存在下（図２２～２４）および非存在下（図１６～１８）での、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤についてのサイズ（ｎｍでのＺ－平均）（図１６、図２２）、ＰＤＩ（図１７、図２３）およびカプセル封入効率（カプセル封入％）（図１８、図２４）について得られた値の直接的対照比較は、以下の表８に示される。
Figure 2024537854000019
同様に、図２５～２７に示されるように、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤における、ブランクＬＮＰなしの０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物を含有する製剤のものと等価な総脂質濃度まで上昇する濃度でのブランクＬＮＰの含有（Ｆ番号１４～１５）は、特に、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを含有するより希薄な製剤の場合、復元後に観察されたサイズ（図２５）、ＰＤＩ（図２６）およびカプセル封入効率（図２７）における増加を軽減させた。ブランクＬＮＰの存在下（図２５～２７）および非存在下（図１９～２１）での、２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含有するｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤についてのサイズ（ｎｍでのＺ－平均）（図１９、図２５）、ＰＤＩ（図２０、図２６）およびカプセル封入効率（カプセル封入％）（図２１、図２７）について得られた値の直接的対照比較は、以下の表９に示される。
Figure 2024537854000020
２０．５％スクロース単独の含有（Ｆ番号１０～１３、－ブランクＬＮＰ）（図１９～２１）は、１０．３％ｗ／ｖのスクロースを使用する場合（Ｆ番号１～４、－ブランクＬＮＰ）（図１６～１８）と比較して、復元後のｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤の化学的および物理的特徴の維持のためのさらなる利点を全く提供しなかった。さらに、ｆｌｕ ｍＲＮＡ製剤におけるブランクＬＮＰの含有は、サイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を防止するに当たり、より有効であった。
（実施例６）
ブランクＬＮＰを有するｓａＲＮＡ ＬＮＰ製剤
自己増幅性ＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰ（当該ＬＮＰは、表２に従って調製した）を希釈して、凍結解凍条件前および後の粒子サイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）に対する影響を評価した。ＬＮＰ濃度が希釈によって減少するにつれて、より高いパーセンテージのＰＥＧが解離し得、凍結解凍後により大きい粒子サイズおよびＰＤＩ変化を生じることが観察された。表８、表９および表１０を参照されたい。
Figure 2024537854000021
凍結／解凍後のサイズおよびＰＤＩ変化に対処するため、ｓａＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰを、ＲＮＡをカプセル封入していない「ブランク」または「空の」ＬＮＰ（表２に従って調製した）で希釈して、１０μｇ／ｍｌを下回るｓａＲＮＡ濃度を得た。賦形剤としてのＰＳ８０、１％ＰＥＧまたは２０％スクロースは、最も低い濃度で、凍結解凍（Ｆ／Ｔ）後の粒子サイズおよびＰＤＩ変化を防止することができる。
Figure 2024537854000022
Figure 2024537854000023
Figure 2024537854000024
１０ｕｇ／ｍｌを下回るまで希釈するために空のＬＮＰを使用することは、凍結－解凍後の変化を低減させる。空のＬＮＰを使用することは、好ましくは、ＲＮＡを希釈し、製剤中の構成要素の残部は希釈しない。
（実施例７）
ＶＳＶＧ ｓａＲＮＡ ＬＮＰ凍結乾燥
１０ｍＭトリスおよび１０％スクロース製剤中６０μｇ／ｍｌのＶＳＶ－ｇ ｓａＲＮＡ ＬＮＰを、凍結乾燥した。この実現可能性評価において、２ｍＬのバイアルを、０．５ｍＬで充填し、０．４７５ｍｌで水で復元した。本明細書で使用したＶＳＶＧ ｓａＲＮＡは、５’キャップ以外の改変されたヌクレオシドを含まない。
トリス／スクロース中の凍結乾燥されたＶＳＶＧ ｓａＲＮＡ ＬＮＰ ＤＰは、５℃で８カ月間にわたって安定なようである。図１３Ａ～Ｅを参照されたい。
（実施例８）
インフルエンザｓａＲＮＡ ＬＮＰ凍結乾燥
以下のマトリックス中１０μｇ／ｍｌのインフルエンザＨＡ ｓａＲＮＡ ＬＮＰを、凍結乾燥した。本明細書で使用したＨＡ ｓａＲＮＡ分子は、５’キャップ以外の改変されたヌクレオシドを含まない。この実現可能性評価において、２ｍＬのバイアルを、０．３５ｍＬで充填し、０．３３ｍＬで水および食塩水で復元した。
Figure 2024537854000025
凍結乾燥されたマトリックスは、洗練されたケーキを生じ、復元後のサイズおよびＰＤＩは、水復元で有益であった。図１５Ａ～Ｅを参照されたい。
ＩＶＥでの凍結乾燥後％発現を、ＶＳＶＧ製剤およびＨＡ ｓａＲＮＡ製剤の両方において評価した。ＩＶＥでの凍結乾燥後％発現増加が、ＶＳＶＧ製剤およびＨＡ ｓａＲＮＡ製剤の両方において観察されている。
（実施例９）
種々のコロイド安定剤を使用した低ｍＲＮＡ濃度製剤の安定化
低ｍＲＮＡ濃度製剤の安定化に対するブランクＬＮＰまたはリポソームの影響を試験した。
ブランクＬＮＰ（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質から構成されている；以下の表１４を参照されたい）を、得られた製剤の脂質含量が、０．５、０．３および０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物のものと等価になるように、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．３、０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質を含む）を含む組成物に添加した。ブランクＬＮＰ（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質から構成されている）の別のバッチを調製し、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのバッチおよび製剤緩衝液と混合して、最終製剤中の標的脂質およびｍＲＮＡ濃度を達成した。
Figure 2024537854000026
リポソーム（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されている）を、得られた製剤の脂質含量が、０．５および０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物のものと等価になるように、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．１、０．０１および０．００１ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡＬＣ－０３１５を含むカチオン性脂質を含む）を含む組成物に添加した。リポソーム（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣおよびコレステロールから構成されている）の別のバッチを調製し、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのバッチおよび製剤緩衝液と混合して、最終製剤中の標的脂質およびｍＲＮＡ濃度を達成した。
５×凍結－解凍（ＦＴ）サイクリングを、－７０℃と２５℃との間で実施した（０．３ｍＬ充填）。図３４～３７に示されるように、ブランクＬＮＰ（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質から構成されている）の含有は、ブランクＬＮＰを含有しない分散物で観察された凍結－解凍後の、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質を含む、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰについてのサイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を軽減させた。図３８～４１に示されるように、リポソームの含有もまた、凍結－解凍の間の、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡＬＣ－０３１５を含むカチオン性脂質を含む、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰについてのサイズ／ＰＤＩにおける増加および％カプセル封入における減少を軽減させた。
凍結－解凍に加えて、フリーズドライを、アニーリングありおよびなしで実施し（０．３ｍＬ充填）、産物性情を、食塩水対注射用無菌水中で復元したケーキについて測定した。図４２～４５に示されるように、ブランクＬＮＰ（ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質から構成されている）の含有は、ブランクＬＮＰを含有しない分散物と比較して、フリーズドライ後の復元の間の、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡ９を含むカチオン性脂質を含む、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰについてのサイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を軽減させた。図４６～４９に示されるように、リポソームの含有もまた、フリーズドライ後の復元の間の、ＡＬＣ－０１５９、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＭＣ３またはＡＬＣ－０３１５を含むカチオン性脂質を含む、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰについてのサイズ／ＰＤＩにおける増加および％カプセル封入における減少を軽減させた。
結果は、例えば、ＭＣ３およびＡ９から選択される脂質のうちのいずれか１つを含むカチオン性脂質を有する試験した全てのブランクＬＮＰについて一貫していた。ｍＲＮＡ含有ＬＮＰおよびリポソームの共製剤の場合、ブランクＬＮＰによる観察と類似のサイズ／ＰＤＩにおける減少が、フリーズドライ後に観察された。リポソームは、ブランクＬＮＰよりも低い程度までではあるが、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰの％カプセル封入における減少を防止した。
（実施例１０）
ブランクＬＮＰおよび／または増加したスクロース濃度を使用した、低ｍＲＮＡ濃度製剤の安定化
低ｍＲＮＡ濃度製剤の安定化に対するブランクＬＮＰおよび／またはより高いスクロース濃度の影響を試験した。
ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）を、得られた製剤の脂質含量が、０．１および０．２ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ薬物産物のものと等価になるように、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．０１および０．００５ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、表２に従う脂質を含む）を含む組成物に添加した。ブランクＬＮＰ（表２に従う脂質から構成されている）の別のバッチを調製し、ｍＲＮＡ含有ＬＮＰのバッチおよび製剤緩衝液と混合して、最終製剤中の標的脂質およびｍＲＮＡ濃度を達成した。試験したｍｏｄＲＮＡ含有製剤は、表１５にまとめられる。
１０．３％、１５．４％または２０．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入するＬＮＰ（０．０１および０．００５ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株、Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡをカプセル封入する当該ＬＮＰは、表２に従う脂質を含む）を含む組成物に添加した。
４×凍結－解凍（ＦＴ）サイクリングを、－７０℃と２５℃との間で実施した（２．２５ｍＬ充填）。
図２８～３３に示されるように、ブランクＬＮＰまたは２０．５％スクロースの含有は、ブランクＬＮＰを含有しない分散物で観察された凍結－解凍後のサイズおよびＰＤＩにおける増加ならびに％カプセル封入における減少を軽減させた。
Figure 2024537854000027
Figure 2024537854000028
より詳細には、群１～１０の薬物産物（ＤＰ）は、凍結して供給され、用量調製の時点で４×凍結－解凍サイクルを完了している。群１～５は、０．０１ｍｇ／ｍＬのＦｌｕ ｍｏｄＲＮＡを含有するＤＰ製剤に対応する。群６～１０は、０．００５ｍｇ／ｍＬのＦｌｕ ｍｏｄＲＮＡを含有するＤＰ製剤に対応する。群１１～１２（トリス－１０．３％ｗ／ｖのスクロース中のブランクＬＮＰ）のＤＰは、凍結して供給され、用量調製の時点で１×を完了した。群１１～１２（ブランクＬＮＰ）についての希釈計画は、群７および８（０．００５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを含有し、０．２または０．１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ含有ＤＰと等価な脂質を標的化する）によって提供されるのと同じ量の脂質を標的化するように作成した。群１３～１４は、液体として供給され、２～８℃で維持される。群１５を、凍結された研究対照として使用する。以前に凍結された初期バイアルを解凍し、使い捨てチューブ中にサブアリコート化し、再凍結する。
ＨＡＩおよび中和アッセイを読み出しとして実施する。全ての中和試料を熱不活性化し、－８０℃で凍結／貯蔵する。
（実施例１１）
共製剤化したＦｌｕ ｍｏｄＲＮＡおよびブランクＬＮＰ対より高いスクロース濃度のＦｌｕ ｍｏｄＲＮＡ ＬＮＰを試験する研究（プライムおよびブースト）
このマウス研究は、ブランク脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）対より高いスクロース濃度の使用に関する製剤開発戦略の開発を可能にするｉｎ－ｖｉｖｏデータを提供する。研究の目的には、以下が含まれる：（１）ｍＲＮＡ ＬＮＰのみと比較した場合の、トリス－１０．３％ｗ／ｖのスクロース製剤を含有する低濃度Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ株）の免疫原性に対する共製剤化した（ｍＲＮＡおよびブランクＬＮＰ）の影響を調査すること；（２）ｍＲＮＡの非存在下での免疫原性に対するブランクＬＮＰの影響を調査すること；（３）低濃度Ｆｌｕ ｍｏｄＲＮＡ含有トリス－スクロース製剤の免疫原性に対するより高いスクロース濃度（１５．４％ｗ／ｖ対２０．５％ｗ／ｖ）の影響を調査すること；（４）免疫原性に対する、４×凍結－解凍サイクリングの完了後のｍＲＮＡ ＬＮＰ（トリス－１０．３％ｗ／ｖのスクロース中）を含有する未凍結対凍結された薬物産物の影響を比較すること。マウスを、表１２にまとめた異なるｍｏｄＲＮＡ含有製剤で免疫化し、試験物品および希釈剤についてのさらなる詳細は、表１３に提供される。プライムの２１日後およびブースト（２８日目に行われる）の１４日後に収集した血清を、血清学試験（ＨＡＩ、１日目の中和、Ｄ２１、４２）によって評価する。群間の統計的差異は、１群当たり１０匹のマウスを使用することによって決定され得る。マウスは、研究開始の時点で１１～１３週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスであった。表１２～１５は、それぞれ、同じ１５個の製剤および食塩水対照に言及する。
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結果：中和力価（幾何平均力価、ＧＭＴ）における大きなブーストが、ｍｏｄＲＮＡ＋ブランクＬＮＰ（例えば、群２、３、７および８を参照されたい）について、用量２の２週間後に観察された；未凍結材料（群１３および１４）は、４×Ｆ／Ｔ材料よりも５分の１（０．００５ｍｇ）～２０分の１（０．０１ｍｇ）の低さの抗体力価を惹起する。
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本明細書で開示され特許請求される方法の全てが、本開示の教示の下で過度の実験なしに構成および実行され得る。本開示の組成物および方法が、好ましい態様の観点から記載されてきたが、バリエーションが、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法に、およびかかる方法のステップまたはステップの配列において適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、同じまたは類似の結果が達成されながら、化学的かつ生理的に関連するある特定の薬剤が、本明細書に記載される薬剤を置換し得ることが明らかである。当業者に明らかな全てのかかる類似の代替および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲および概念の範囲内とみなされる。
本発明の実施形態は、以下の番号付き実施形態で、さらに記載される：
１． （ａ）第１の脂質ナノ粒子；（ｂ）第２の脂質ナノ粒子；および（ｃ）凍結保護剤を含む免疫原性組成物であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含み、前記第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入し、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドが、抗原を含み、好ましくは、前記抗原が、インフルエンザ抗原であり；前記第２の脂質ナノ粒子が、核酸をカプセル封入しない、免疫原性組成物。
２． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１に記載の組成物。
３． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１または２に記載の組成物。
４． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の組成物。
５． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
６． 前記第１の脂質ナノ粒子および前記第２の脂質ナノ粒子の合計比が、１：１～１：４９９９の範囲内である、実施形態１に記載の組成物。
７． 前記組成物中の前記ＲＮＡの少なくとも６０％が、完全に、前記第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されているまたは前記第１の脂質ナノ粒子と会合している、実施形態１から６のいずれか１つに記載の組成物。
８． 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１から７のいずれか１つに記載の組成物。
９． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８に記載の組成物。
１０． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８または９に記載の組成物。
１１． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８から１０のいずれか１つに記載の組成物。
１２． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８から１１のいずれか１つに記載の組成物。
１３． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、実施形態８から１２のいずれか１つに記載の組成物。
１４． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる、実施形態８から１２のいずれか１つに記載の組成物。
１５． 前記第２の脂質ナノ粒子がリポソームである、実施形態１から７のいずれか１つに記載の組成物。
１６． 前記リポソームが、ｉ）リン脂質および／または中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびにｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１５に記載の組成物。
１７． 前記リポソームが、カチオン性脂質をさらに含む、実施形態１５または１６に記載の組成物。
１８． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１７に記載の組成物。
１９． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１６から１８のいずれか１つに記載の組成物。
２０． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１６から１９のいずれか１つに記載の組成物。
２１． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１６から２０のいずれか１つに記載の組成物。
２２． 液体である、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の組成物。
２３． 凍結されている、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４． 前記凍結保護剤が、二糖を含む、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の組成物。
２５． 前記凍結保護剤が、スクロースを含む、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の組成物。
２６． 前記凍結保護剤が、スクロースを含み、前記組成物が、少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖのスクロースを含む、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７． 前記凍結保護剤が、スクロースを含み、前記組成物が、少なくとも約１０％ｗ／ｖ～２５％ｗ／ｖのスクロースを含む、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８． 前記凍結保護剤が、スクロースを含み、前記組成物が、少なくとも約１０．３％ｗ／ｖ～２０．５％ｗ／ｖのスクロースを含む、実施形態１から２７のいずれか１つに記載の組成物。
２９． 前記凍結保護剤の濃度が、凍結前に、前記組成物中５～６００ｍｇ／ｍＬである、実施形態１から２８のいずれか１つに記載の組成物。
３０． 前記第１および第２の脂質ナノ粒子が、前記第１および第２の脂質ナノ粒子中の全ての脂質構成要素の総モルに対して、４０モルパーセンテージと５０モルパーセンテージとの間の前記カチオン性脂質を含む、実施形態１から２９のいずれか１つに記載の組成物。
３１． 薬学的に許容できる緩衝液をさらに含む、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の組成物。
３２． 前記第２の脂質ナノ粒子が、前記第１の脂質ナノ粒子よりも５０％小さいサイズを有する、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の組成物。
３３． 前記第２の脂質ナノ粒子が、前記第１の脂質ナノ粒子よりも５０％大きいサイズを有する、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の組成物。
３４． 前記第１の脂質ナノ粒子と前記第２の脂質ナノ粒子との混合物が、凍結－解凍サイクリング後に、好ましくは、２０～１８０ｎｍの範囲内の、より好ましくは、３０～１５０ｎｍの範囲内の、最も好ましくは、４０～１２０ｎｍの範囲内の平均直径サイズを有する、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の組成物。
３５． 総組成物の約１０％未満の水含量を有する、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物。
３６． 総組成物の約０．１％と１０％との間の水含量を有する、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物。
３７． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３６のいずれか１つに記載の組成物。
３８． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも１カ月間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３７のいずれか１つに記載の組成物。
３９． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の組成物。
４０． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約４週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３９のいずれか１つに記載の組成物。
４１． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、約２週間～約１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間または２年間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から４０のいずれか１つに記載の組成物。
４２． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも約２週間後に、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４１のいずれか１つに記載の組成物。
４３． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも１カ月後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４２のいずれか１つに記載の組成物。
４４． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の約２週間～約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年または２年後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物。
４５． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての約２週間の貯蔵後に、少なくとも８０％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４４のいずれか１つに記載の組成物。
４６． 前記ＲＮＡの濃度が、約１０ｐｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは、約０．１μｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの範囲内である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の組成物。
４７． 前記ＲＮＡが、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、好ましくは、少なくとも約６０％またはそれよりも高い、より好ましくは、少なくとも約７０％またはそれよりも高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％またはそれよりも高いＲＮＡ完全性を有する、実施形態１から４６のいずれか１つに記載の組成物。
４８． 前記ＲＮＡが、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物よりも少なくとも約５０％高い、好ましくは、少なくとも約６０％高い、より好ましくは、少なくとも約７０％高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％高いＲＮＡ完全性を有する、実施形態１から４７のいずれか１つに記載の組成物。
４９． 同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、６０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％超多いカプセル封入されたＲＮＡを含む、実施形態１から４８のいずれか１つに記載の組成物。
５０． 同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、６０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡを含む、実施形態１から４９のいずれか１つに記載の組成物。
５１． 前記ＲＮＡが、少なくとも１つの精製ステップによって精製されており、前記第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの精製ステップによって、好ましくは、接線流濾過（ＴＦＦ）の少なくとも１つのステップおよび／または清澄化の少なくとも１つのステップおよび／または濾過の少なくとも１つのステップによって精製されている、実施形態１から５０のいずれか１つに記載の組成物。
５２． 前記ＲＮＡが、精製されたＲＮＡ、好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたＲＮＡおよび／または接線流濾過（ＴＦＦ）精製されたＲＮＡである、実施形態１から５１のいずれか１つに記載の組成物。
５３． 前記組成物の有効性が、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満減少する、実施形態１から５２のいずれか１つに記載の組成物。
５４． 細胞において前記目的のポリペプチドを産生するための有効量のＲＮＡを含む、実施形態１から５３のいずれか１つに記載の組成物。
５５． 前記ＲＮＡが、改変されたヌクレオチドをさらに含む、実施形態１から５４のいずれか１つに記載の組成物。
５６． 前記ＲＮＡが、Ｎ１－メチルプソイドウリジン－５’－三リン酸（ｍ１ΨＴＰ）を含む改変されたヌクレオチドを含む、実施形態１から５５のいずれか１つに記載の組成物。
５７． 前記ＲＮＡが、前記抗原をコードする翻訳可能な領域を含み、１－メチル－プソイドウリジンを含む改変されたヌクレオシドを含む、実施形態１から５６のいずれか１つに記載の組成物。
５８． 前記ＲＮＡが、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを含む、実施形態１から５７のいずれか１つに記載の組成物。
５９． 前記ＲＮＡが、５’キャップアナログをさらに含む、実施形態１から５８のいずれか１つに記載の組成物。
６０． 前記ＲＮＡが、５’キャップアナログをさらに含み、前記５’キャップアナログが、ｍ２ ７，３’－ＯＭｅＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、実施形態１から５９のいずれか１つに記載の組成物。
６１． 前記抗原が、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせである、実施形態１から６０のいずれか１つに記載の組成物。
６２． 前記ＲＮＡが、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原が、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される、実施形態１から６１のいずれか１つに記載の組成物。
６３． 前記ＲＮＡが、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原が、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、実施形態１から６２のいずれか１つに記載の組成物。
６４． 前記抗原が、アレナウイルス；アストロウイルス；ブニヤウイルス；カリシウイルス；コロナウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ヘパドナウイルス；ヘペウイルス；オルトミクソウイルス；パラミクソウイルス；ピコルナウイルス；レオウイルス；レトロウイルス；ラブドウイルス；トガウイルス；または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である、実施形態１から６０のいずれか１つに記載の組成物。
６５． 前記抗原が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）の種、コロナウイルス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）の種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレド（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｄ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１ ９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）もしくはネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）の種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡もしくは小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である、実施形態１から６０のいずれか１つに記載の組成物。
６６． 前記オープンリーディングフレームが、コドン最適化される、実施形態１から６５のいずれか１つに記載の組成物。
６７． ＡＬＣ－０３１５（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））を含む、実施形態１から６６のいずれか１つに記載の組成物。
６８． ＡＬＣ－０１５９（２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド）を含む、実施形態１から６７のいずれか１つに記載の組成物。
６９． １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む、実施形態１から６８のいずれか１つに記載の組成物。
７０． コレステロールを含む、実施形態１から６９のいずれか１つに記載の組成物。
７１． 少なくとも２回凍結－解凍されている、実施形態１から７０のいずれか１つに記載の組成物。
７２． 少なくとも３回凍結－解凍されている、実施形態１から７１のいずれか１つに記載の組成物。
７３． 少なくとも４回凍結－解凍されている、実施形態１から７２のいずれか１つに記載の組成物。
７４． 少なくとも５回凍結－解凍されている、実施形態１から７３のいずれか１つに記載の組成物。
７５． 細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、実施形態１から７４のいずれか１つに記載の組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、増加した量の前記ポリペプチドを産生する、方法。
７６． 前記組成物が、哺乳動物に投与される、実施形態７５に記載の方法。
７７． 前記組成物が、ヒトに投与される、実施形態７５から７６のいずれか１つに記載の方法。
７８． 前記組成物が、インフルエンザを有するリスクがある哺乳動物に投与される、実施形態７５から７７のいずれか１つに記載の方法。
７９． 第１の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）前記第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記方法が、前記組成物を第２の脂質ナノ粒子と接触させるステップを含み、前記第２の脂質ナノ粒子が、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入しない、方法。
８０． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態７９に記載の方法。
８１． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態７９または８０に記載の方法。
８２． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態７９から８１のいずれか１つに記載の方法。
８３． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態７９から８２のいずれか１つに記載の方法。
８４． 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態７９から８３のいずれか１つに記載の方法。
８５． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８４に記載の方法。
８６． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８４または８５に記載の方法。
８７． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８４から８６のいずれか１つに記載の方法。
８８． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態８４から８７のいずれか１つに記載の方法。
８９． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、実施形態８４から８８のいずれか１つに記載の方法。
９０． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる、実施形態８４から８８のいずれか１つに記載の方法。
９１． 前記第２の脂質ナノ粒子が、リポソームを含む、実施形態７９に記載の方法。
９２． 前記リポソームが、ｉ）リン脂質および／もしくは中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態９１に記載の方法。
９３． 前記リポソームが、カチオン性脂質をさらに含む、実施形態９２に記載の方法。
９４． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態９３に記載の方法。
９５． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態９２から９４のいずれか１つに記載の方法。
９６． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態９２から９５のいずれか１つに記載の方法。
９７． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態９２から９６のいずれか１つに記載の方法。
９８． 前記安定性の増加が、凍結された場合の前記組成物の貯蔵安定性を含む、実施形態７９から９７のいずれか１つに記載の方法。
９９． 前記安定性の増加が、凍結された後に解凍された場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態７９から９８のいずれか１つに記載の方法。
１００． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも２回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態７９から９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも３回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態７９から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも４回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態７９から１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも５回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態７９から１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４． 前記組成物を第２の脂質ナノ粒子と接触させるステップが、実施形態１から７４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を形成する、実施形態７９から１０３のいずれか１つに記載の方法。
１０５． 第１の脂質ナノ粒子および第２の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）前記第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記第２の脂質ナノ粒子が、前記第２の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを欠如し、前記方法が、凍結前に、前記組成物を精製して、複数の前記第２の脂質ナノ粒子の第１の部分を前記組成物から除去するステップを含み、前記複数の前記第２の脂質ナノ粒子の第２の部分が、前記組成物中に残留する、方法。
１０６． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１０５に記載の方法。
１０７． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１０５または１０６に記載の方法。
１０８． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１０５から１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１０５から１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０． 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１０５から１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１０に記載の方法。
１１２． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１０または１１１に記載の方法。
１１３． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１０から１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１０から１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、実施形態１１０から１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる、実施形態１１０から１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１７． 前記第２の脂質ナノ粒子が、リポソームを含む、実施形態１０５に記載の方法。
１１８． 前記リポソームが、ｉ）リン脂質および／もしくは中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１１７に記載の方法。
１１９． 前記リポソームが、カチオン性脂質をさらに含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２０． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１９に記載の方法。
１２１． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１８から１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１８から１２１のいずれか１つに記載の方法。
１２３． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１１８から１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４． 前記安定性の増加が、凍結された場合の前記組成物の貯蔵安定性を含む、実施形態１０５から１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５． 前記安定性の増加が、凍結された後に解凍された場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態１０５から１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも２回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態１０５から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも３回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態１０５から１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも４回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態１０５から１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも５回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態１０５から１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０． 凍結前に、前記組成物を精製して、複数の前記第２の脂質ナノ粒子の第１の部分を前記組成物から除去するステップが、実施形態１から７４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を形成する、実施形態１０５から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１． （ａ）第１の脂質ナノ粒子；および有効量の凍結保護剤を含む免疫原性組成物であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含み；前記第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入し、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドが、抗原を含み、好ましくは、前記抗原が、インフルエンザ抗原であり；前記凍結保護剤が、糖類を含み；前記有効量の前記凍結保護剤が、前記組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖである、免疫原性組成物。
１３２． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１３１に記載の組成物。
１３３． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１３１または１３２に記載の組成物。
１３４． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１３１から１３３のいずれか１つに記載の組成物。
１３５． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１３１から１３４のいずれか１つに記載の組成物。
１３６． 前記凍結保護剤が、二糖を含む、実施形態１３１から１３５のいずれか１つに記載の組成物。
１３７． 前記凍結保護剤が、スクロースを含む、実施形態１３１から１３６のいずれか１つに記載の組成物。
１３８． 少なくとも約１０％ｗ／ｖ～２５％ｗ／ｖの前記凍結保護剤を含む、実施形態１３１から１３７のいずれか１つに記載の組成物。
１３９． 少なくとも約１０．３％ｗ／ｖ～２０．５％ｗ／ｖの前記凍結保護剤を含む、実施形態１３１から１３８のいずれか１つに記載の組成物。
１４０． 前記凍結保護剤の濃度が、凍結前に、前記組成物中５～６００ｍｇ／ｍＬである、実施形態１３１から１３９のいずれか１つに記載の組成物。
１４１． 第２の脂質ナノ粒子をさらに含み、前記第２の脂質ナノ粒子が、ＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル封入しない、実施形態１３１から１４０のいずれか１つに記載の組成物。
１４２． 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１４１に記載の組成物。
１４３． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１４２に記載の組成物。
１４４． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１４２または１４３に記載の組成物。
１４５． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１４２から１４４のいずれか１つに記載の組成物。
１４６． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１４２から１４５のいずれか１つに記載の組成物。
１４７． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、実施形態１４２から１４６のいずれか１つに記載の組成物。
１４８． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる、実施形態１４２から１４６のいずれか１つに記載の組成物。
１４９． 前記第２の脂質ナノ粒子がリポソームである、実施形態１４１に記載の組成物。
１５０． 前記リポソームが、ｉ）リン脂質および／または中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびにｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態１４９に記載の組成物。
１５１． 前記リポソームが、カチオン性脂質をさらに含む、実施形態１５０に記載の組成物。
１５２． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１５１に記載の組成物。
１５３． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１５０または１５２のいずれか１つに記載の組成物。
１５４． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１５０から１５３のいずれか１つに記載の組成物。
１５５． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態１５０から１５４のいずれか１つに記載の組成物。
１５６． 前記第１の脂質ナノ粒子および前記第２の脂質ナノ粒子の合計比が、１：１～１：４９９９の範囲内である、実施形態１４１から１５５のいずれか１つに記載の組成物。
１５７． 前記組成物中の前記ＲＮＡの少なくとも６０％が、完全に、前記第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されているまたは前記第１の脂質ナノ粒子と会合している、実施形態１４１から１５６のいずれか１つに記載の組成物。
１５８． 第１および第２の脂質ナノ粒子が、前記第１および第２の脂質ナノ粒子中の全ての脂質構成要素の総モルに対して、４０モルパーセンテージと５０モルパーセンテージとの間の前記カチオン性脂質を含む、実施形態１４１から１５７のいずれか１つに記載の組成物。
１５９． 前記第２の脂質ナノ粒子が、前記第１の脂質ナノ粒子よりも５０％小さいサイズを有する、実施形態１４１から１５８のいずれか１つに記載の組成物。
１６０． 前記第２の脂質ナノ粒子が、前記第１の脂質ナノ粒子よりも５０％大きいサイズを有する、実施形態１４１から１５８のいずれか１つに記載の組成物。
１６１． 前記第１の脂質ナノ粒子と前記第２の脂質ナノ粒子との混合物が、凍結－解凍サイクリング後に、好ましくは、２０～１８０ｎｍの範囲内の、より好ましくは、３０～１５０ｎｍの範囲内の、最も好ましくは、４０～１２０ｎｍの範囲内の平均直径サイズを有する、実施形態１４１から１６０のいずれか１つに記載の組成物。
１６２． 前記第２の脂質ナノ粒子の含有が、同一な条件下で測定した場合に、前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、前記組成物の安定性をさらに増加させる、実施形態１４１から１６１のいずれか１つに記載の組成物。
１６３． 液体である、実施形態１３１から１６２のいずれか１つに記載の組成物。
１６４． 凍結されている、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度で凍結乾燥された組成物である、実施形態１３１から１６３のいずれか１つに記載の組成物。
１６５． 薬学的に許容できる緩衝液をさらに含む、実施形態１３１から１６４、２３５、または２５４のいずれか１つに記載の組成物。
１６６． 総組成物の約１０％未満の水含量を有する、実施形態１３１から１６５のいずれか１つに記載の組成物。
１６７． 総組成物の約０．１％と１０％との間の水含量を有する、実施形態１３１から１６６のいずれか１つに記載の組成物。
１６８． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１３１から１６７のいずれか１つに記載の組成物。
１６９． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも１カ月間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１３１から１６８のいずれか１つに記載の組成物。
１７０． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１３１から１６９のいずれか１つに記載の組成物。
１７１． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約４週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１３１から１７０のいずれか１つに記載の組成物。
１７２． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、約２週間～約１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間または２年間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１３１から１７１のいずれか１つに記載の組成物。
１７３． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも約２週間後に、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１３１から１７２のいずれか１つに記載の組成物。
１７４． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも１カ月後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記カプセル封入されたＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１３１から１７３のいずれか１つに記載の組成物。
１７５． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の約２週間～約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年または２年後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１３１から１７４のいずれか１つに記載の組成物。
１７６． 凍結された液体組成物としての、または冷蔵貯蔵未満もしくはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての約２週間の貯蔵後に、少なくとも８０％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１３１から１７５のいずれか１つに記載の組成物。
１７７． 前記ＲＮＡの濃度が、約１０ｐｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは、約０．１μｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの範囲内である、実施形態１３１から１７６のいずれか１つに記載の組成物。
１７８． 前記ＲＮＡが、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、好ましくは、少なくとも約６０％またはそれよりも高い、より好ましくは、少なくとも約７０％またはそれよりも高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％またはそれよりも高いＲＮＡ完全性を有する、実施形態１３１から１７７のいずれか１つに記載の組成物。
１７９． 前記ＲＮＡが、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物よりも少なくとも約５０％高い、好ましくは、少なくとも約６０％高い、より好ましくは、少なくとも約７０％高い、最も好ましくは、少なくとも約８０％高いＲＮＡ完全性を有する、実施形態１３１から１７８のいずれか１つに記載の組成物。
１８０． 同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物と比較して、６０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％超多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％超多いカプセル封入されたＲＮＡを含む、実施形態１３１から１７９のいずれか１つに記載の組成物。
１８１． 同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物と比較して、６０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、好ましくは、７０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、より好ましくは、８０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡ、最も好ましくは、９０％よりも多いカプセル封入されたＲＮＡを含む、実施形態１３１から１８０のいずれか１つに記載の組成物。
１８２． 前記ＲＮＡが、少なくとも１つの精製ステップによって精製されており、前記第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの精製ステップによって、好ましくは、接線流濾過（ＴＦＦ）の少なくとも１つのステップおよび／または清澄化の少なくとも１つのステップおよび／または濾過の少なくとも１つのステップによって精製されている、実施形態１３１から１８１のいずれか１つに記載の組成物。
１８３． 前記ＲＮＡが、精製されたＲＮＡ、好ましくは、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたＲＮＡおよび／または接線流濾過（ＴＦＦ）精製されたＲＮＡである、実施形態１３１から１８２のいずれか１つに記載の組成物。
１８４． 前記組成物の有効性が、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物と比較して、約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満減少する、実施形態１３１から１８３のいずれか１つに記載の組成物。
１８５． 細胞において前記目的のポリペプチドを産生するための有効量のＲＮＡを含む、実施形態１３１から１８４のいずれか１つに記載の組成物。
１８６． 前記ＲＮＡが、改変されたヌクレオチドをさらに含む、実施形態１３１から１８５のいずれか１つに記載の組成物。
１８７． 前記ＲＮＡが、Ｎ１－メチルプソイドウリジン－５’－三リン酸（ｍ１ΨＴＰ）を含む改変されたヌクレオチドを含む、実施形態１３１から１８６のいずれか１つに記載の組成物。
１８８． 前記ＲＮＡが、前記抗原をコードする翻訳可能な領域を含み、１－メチル－プソイドウリジンを含む改変されたヌクレオシドを含む、実施形態１３１から１８７のいずれか１つに記載の組成物。
１８９． 前記ＲＮＡが、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを含む、実施形態１３１から１８８のいずれか１つに記載の組成物。
１９０． 前記ＲＮＡが、５’キャップアナログをさらに含む、実施形態１３１から１８９のいずれか１つに記載の組成物。
１９１． 前記ＲＮＡが、５’キャップアナログをさらに含み、前記５’キャップアナログが、ｍ２ ７，３’－ＯＭｅＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧを含む、実施形態１３１から１９０のいずれか１つに記載の組成物。
１９２． 前記抗原が、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、ＨＡ１もしくはＨＡ２の免疫原性断片、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせである、実施形態１３１から１９１のいずれか１つに記載の組成物。
１９３． 前記ＲＮＡが、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原が、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）からなる群から選択される、実施形態１３１から１９２のいずれか１つに記載の組成物。
１９４． 前記ＲＮＡが、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードし、第１の抗原が、ＨＡ１、ＨＡ２、またはＨＡ１およびＨＡ２の組み合わせであり、第２の抗原が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、実施形態１３１から１９３のいずれか１つに記載の組成物。
１９５． 前記抗原が、アレナウイルス；アストロウイルス；ブニヤウイルス；カリシウイルス；コロナウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ヘパドナウイルス；ヘペウイルス；オルトミクソウイルス；パラミクソウイルス；ピコルナウイルス；レオウイルス；レトロウイルス；ラブドウイルス；トガウイルス；または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である、実施形態１３１から１９１のいずれか１つに記載の組成物。
１９６． 前記抗原が、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス科、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）および他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミドフィラ・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）の種、コロナウイルス、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）の種、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１ ５７：Ｈ７、０１ １ １およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）および巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア上科、フラビウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、ムンプスウイルス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレド（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｄ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１ ９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ライノウイルス、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）もしくはネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）の種、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡もしくは小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、黄熱ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、または上述のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組み合わせ由来のポリペプチドまたはその免疫原性断片である、実施形態１３１から１９１のいずれか１つに記載の組成物。
１９７． 前記オープンリーディングフレームが、コドン最適化される、実施形態１３１から１９４のいずれか１つに記載の組成物。
１９８． ＡＬＣ－０３１５（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））を含む、実施形態１３１から１９７のいずれか１つに記載の組成物。
１９９． ＡＬＣ－０１５９（２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド）を含む、実施形態１３１から１９８のいずれか１つに記載の組成物。
２００． １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含む、実施形態１３１から１９９のいずれか１つに記載の組成物。
２０１． コレステロールを含む、実施形態１３１から２００のいずれか１つに記載の組成物。
２０２． 少なくとも２回凍結－解凍されている、実施形態１３１から２０１のいずれか１つに記載の組成物。
２０３． 少なくとも３回凍結－解凍されている、実施形態１３１から２０２のいずれか１つに記載の組成物。
２０４． 少なくとも４回凍結－解凍されている、実施形態１３１から２０３のいずれか１つに記載の組成物。
２０５． 少なくとも５回凍結－解凍されている、実施形態１３１から２０４のいずれか１つに記載の組成物。
２０６． 細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、実施形態１３１から２０５のいずれか１つに記載の組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記有効量の前記凍結保護剤を含まない組成物と比較して、増加した量の前記ポリペプチドを産生する、方法。
２０７． 前記組成物が、哺乳動物に投与される、実施形態２０６に記載の方法。
２０８． 前記組成物が、ヒトに投与される、実施形態２０６から２０７のいずれか１つに記載の方法。
２０９． 前記組成物が、インフルエンザを有するリスクがある哺乳動物に投与される、実施形態２０６から２０８のいずれか１つに記載の方法。
２１０． 第１の脂質ナノ粒子を含む組成物の安定性を増加させる方法であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質、ならびにｖ）前記第１の脂質ナノ粒子中にカプセル封入されたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記方法が、前記組成物を有効量の凍結保護剤と接触させるステップを含み、前記凍結保護剤が、糖類を含み、前記有効量の前記凍結保護剤が、前記組成物の少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖである、方法。
２１１． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２１０に記載の方法。
２１２． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２１０または２１１に記載の方法。
２１３． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２１０から２１２のいずれか１つに記載の方法。
２１４． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２１０から２１３のいずれか１つに記載の方法。
２１５． 前記凍結保護剤が、二糖を含む、実施形態２１０から２１４のいずれか１つに記載の方法。
２１６． 前記凍結保護剤が、スクロースを含む、実施形態２１０から２１５のいずれか１つに記載の方法。
２１７． 前記有効量の前記凍結保護剤が、前記組成物の少なくとも約１０％ｗ／ｖ～２５％である、実施形態２１０から２１６のいずれか１つに記載の方法。
２１８． 前記有効量の前記凍結保護剤が、前記組成物の少なくとも約１０．３％ｗ／ｖ～２０．５％である、実施形態２１０から２１７のいずれか１つに記載の方法。
２１９． 前記凍結保護剤の濃度が、凍結前に、前記組成物中５～６００ｍｇ／ｍＬである、実施形態２１０から２１８のいずれか１つに記載の方法。
２２０． 前記組成物が、第２の脂質ナノ粒子をさらに含み、前記第２の脂質ナノ粒子が、ＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル封入しない、実施形態２１０から２１９のいずれか１つに記載の方法。
２２１． 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態２２０に記載の方法。
２２２． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２１に記載の方法。
２２３． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２１または２２２に記載の方法。
２２４． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２１から２２３のいずれか１つに記載の方法。
２２５． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２１から２２４のいずれか１つに記載の方法。
２２６． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、実施形態２２１から２２５のいずれか１つに記載の方法。
２２７． 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質のうちの１つまたは複数が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／もしくはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質とは異なる、実施形態２２１から２２５のいずれか１つに記載の方法。
２２８． 前記第２の脂質ナノ粒子が、リポソームを含む、実施形態２２０に記載の方法。
２２９． 前記リポソームが、ｉ）リン脂質および／もしくは中性脂質、ｉｉ）ステロイド、ならびに／またはｉｉｉ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、実施形態２２８に記載の方法。
２３０． 前記リポソームが、カチオン性脂質をさらに含む、実施形態２２９に記載の方法。
２３１． 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２３０に記載の方法。
２３２． 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２９から２２３のいずれか１つに記載の方法。
２３３． 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２９から２３２のいずれか１つに記載の方法。
２３４． 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、実施形態２２９から２３３のいずれか１つに記載の方法。
２３５． 前記安定性の増加が、凍結された場合の前記組成物の貯蔵安定性を含む、実施形態２１０から２３４のいずれか１つに記載の方法。
２３６． 前記安定性の増加が、凍結された後に解凍された場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態２１０から２３５のいずれか１つに記載の方法。
２３７． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも２回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態２１０から２３６のいずれか１つに記載の方法。
２３８． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも３回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態２１０から２３７のいずれか１つに記載の方法。
２３９． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも４回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態２１０から２３８のいずれか１つに記載の方法。
２４０． 前記安定性の増加が、前記組成物が少なくとも５回凍結－解凍されている場合の前記組成物の安定性を含む、実施形態２１０から２３９のいずれか１つに記載の方法。
２４１． 前記組成物を有効量の前記凍結保護剤と接触させるステップが、実施形態１３１から２０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を形成する、実施形態２１０から２４０のいずれか１つに記載の方法。
２４２． 凍結乾燥されている、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４３． 凍結乾燥され復元されている、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４４． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３６のいずれか１つに記載の組成物。
２４５． 凍結された液体組成物としての貯蔵後に、少なくとも１カ月間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３７のいずれか１つに記載の組成物。
２４６． 凍結された液体組成物としての貯蔵後に、少なくとも約２週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の組成物。
２４７． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、少なくとも約４週間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から３９のいずれか１つに記載の組成物。
２４８． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵後に、約２週間～約１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間または２年間にわたって安定であるように構成されている、実施形態１から４０のいずれか１つに記載の組成物。
２４９． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも約２週間後に、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４１のいずれか１つに記載の組成物。
２５０． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の少なくとも１カ月後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４２のいずれか１つに記載の組成物。
２５１． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての貯蔵の約２週間～約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年または２年後に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物。
２５２． 冷蔵貯蔵未満またはそれと等しい温度での凍結乾燥された組成物としての約２週間の貯蔵後に、少なくとも８０％のインタクトな前記ＲＮＡを有するように構成されている、実施形態１から４４のいずれか１つに記載の組成物。
２５３． 凍結乾燥されている、実施形態１３１から１６２のいずれか１つに記載の組成物。
２５４． 凍結乾燥され復元されている、実施形態１３１から１６３のいずれか１つに記載の組成物。

Claims (23)

  1. （ａ）第１の脂質ナノ粒子；（ｂ）第２の脂質ナノ粒子；および（ｃ）凍結保護剤を含む組成物であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含み；前記第１の脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをカプセル封入し、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドが、抗原を含み；前記第２の脂質ナノ粒子が、核酸をカプセル封入しない、組成物。
  2. 前記カチオン性脂質が、ＡＬＣ－０３１５、ＳＭ－１０２、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、Ａ９、Ｃ１２－２００、Ｌ５、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記中性脂質および／またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ステロイドが、コレステロール、アルファ－トコフェロール、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記ポリマーコンジュゲート化脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、またはそれらの誘導体および／もしくは組み合わせを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記第２の脂質ナノ粒子が、ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記第２の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質が、前記第１の脂質ナノ粒子の前記ｉ）カチオン性脂質、ｉｉ）中性脂質および／またはリン脂質、ｉｉｉ）ステロイド、ならびにｉｖ）ポリマーコンジュゲート化脂質と同じである、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記凍結保護剤が、スクロースを含み、前記組成物が、少なくとも約２％ｗ／ｖ～３０％ｗ／ｖのスクロースを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 液体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 凍結されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 凍結乾燥されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 凍結乾燥され復元されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記ＲＮＡが、前記抗原をコードする翻訳可能な領域を含み、１－メチル－プソイドウリジンを含む改変されたヌクレオシドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記ＲＮＡが、前記抗原をコードする翻訳可能な領域を含む自己増幅性ＲＮＡである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記ＲＮＡが、少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、７０％超多いカプセル封入されたＲＮＡを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記第２の脂質ナノ粒子が、ＲＮＡポリヌクレオチドをカプセル封入しない、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 少なくとも２回凍結－解凍されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 免疫原性である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記第１の脂質ナノ粒子が、同一な条件下で測定した場合に、前記第２の脂質ナノ粒子の非存在下での脂質ナノ粒子の直径サイズ未満である、前記第２の脂質ナノ粒子の存在下での直径サイズを有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記第１の脂質ナノ粒子が、前記第２の脂質ナノ粒子の非存在下での脂質ナノ粒子の多分散指数未満である、前記第２の脂質ナノ粒子の存在下での多分散指数を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、同一な条件下で測定した場合に、前記第１の脂質ナノ粒子を含み前記第２の脂質ナノ粒子を含まない組成物と比較して、増加した量の前記ポリペプチドを産生する、方法。
  23. 前記組成物が、哺乳動物に投与される、請求項２２に記載の方法。
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